一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用
阅读：566发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 屋尘螨 过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用。本发明屋尘螨过敏原Der p 33基因如SEQ ID NO：2所示，该重组蛋白由屋尘螨过敏原Der p 33基因经表达、纯化后得到，序列如SEQ ID NO：1所示。该重组蛋白用于制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性 疾病 的诊断 试剂 或 生物 制品方面。本发明首次发现屋尘螨Der p 33基因序列全长，并通过基因克隆、表达、纯化获得其重组蛋白，该重组蛋白用于Western blotting实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘 患儿 ，阳性率18.75％(3/16)，而对照组无阳性。，下面是一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用专利的具体信息内容。
一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 尘螨(House dust mite)泛指灰尘里滋生的所有螨类，按界、目、纲、门、科、属、种进行分类，其种类繁多，常见的为粉尘螨(Dermatophagoides farinae)屋尘螨(D.pteronyssinus)，也是我国大陆最常见的两种螨。根据我国呼吸道过敏性疾病科研及流调协作组(China Alliance of Research on Respiratory Allergic Disease,CARRAD)皮肤点刺试验结果，粉尘螨阳性率为59.0％、屋尘螨阳性率为57.6％，说明这是不同的致敏螨种，其对过敏性疾病实验诊断具有不同的临床价值。
[0003] 过敏体质者吸入尘螨分泌物、排泄物及尸体的降解产物后可发生Ⅰ型变态反应，引起哮喘、鼻炎及异位性皮炎等多种变态反应性疾病，采用药物治疗可以暂时缓解症状，但是不能根除疾病。大量临床试验表明，采用变应原特异性免疫治疗(allergen-specific immunotherapy，SIT)具有特异性、持久改善病情等优点。但是，临床采用变应原来源物质制备出的粗提浸液为多种变应原的混合物，不同批次粗提浸液含有的变应原种类不稳定，主要变应原组分的含量不稳定，并可能含有非变应原物质、某些免疫原性偏低的变应原、毒性蛋白等，用于临床治疗会引起局部和全身的不良反应，甚至危及生命。
[0004] 每种螨均可以产生上千种蛋白，有的是过敏原，有的不是。能够引起尘螨过敏性疾病患者机体内产生特异性IgE抗体、并与过敏性疾病患者血清在体内发生结合的螨虫成份称为过敏原组分(Groups)。系统地鉴定、表征这些组分，对两种螨的临床应用具有重要的价值。
[0005] 迄今，临床诊断均采用粉尘螨和/或屋尘螨粗提物为抗原建立免疫学检验方法。由于螨体粗提物中含有多种过敏原组分，同一组分在不同批次产品中含量不一致，很难实现产品的标准化。因此，了解每种螨的过敏原组分，制备过敏原单组分生物制品，基于单组分建立检验方法，精准检测过敏性疾病患者是因某种组分或是某些组分致敏，为临床制订精准脱敏治疗方案提供依据。
[0006] 国际过敏原命名委员会已经命名了粉尘螨过敏原第33组分Der f 33，但是没有公布屋尘螨第33组分Der p 33及其编码基因。粉尘螨过敏原却无法替代屋尘螨过敏原，这是因为，二者即使具有一定的序列相似，但即便只是相差1个氨基酸也会引起临床误诊，更何况是不同物种之间具有相似序列的蛋白质。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用，该重组蛋白用于精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面，旨在解决现有尘螨引起的过敏性疾病无法得到精准医学检测的问题。
[0008] 本发明是这样实现的，一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白，该基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009] 本发明进一步公开了上述屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白在精准医学检测屋尘螨引起过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用。
[0010] 优选地，所述诊断试剂或生物制品为屋尘螨过敏原Der p 33基因经表达、纯化后的重组蛋白，或者所述诊断试剂或生物制品包括屋尘螨过敏原Der p 33基因经表达、纯化后的重组蛋白。
[0011] 本发明提供一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用。本发明通过转录组测序后，进行序列比对，得到一个片段与粉尘螨第33组分Der f 33高度同源的序列，将该片段扩出来，然后通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)获得编码基因全长，然后进行基因克隆表达纯化，将纯化的蛋白质与屋尘螨过敏患者血清进行Western blotting，发现该基因编码的蛋白质具有高度的活性，并最终确定该序列为屋尘螨过敏原第33组分编码基因，如SEQ ID NO：2所示，通过该基因得到Der p 33基因重组蛋白，如SEQ ID NO：1所示。
[0012] 相比现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明首次发现屋尘螨Der p 33基因序列全长，并通过基因克隆、表达、纯化获得其重组蛋白，该重组蛋白用于Western blotting实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿，阳性率18.75％(3/16)，而对照组无阳性。附图说明
[0013] 图1是屋尘螨过敏原Der p 33已知序列验证；其中，M：DL2,000 DNA Marker；1：F1/R1第1st PCR产物；2：负对照；3：F2/R2第2nd PCR产物；4：负对照；
[0014] 图2是屋尘螨过敏原Der p 33已知基因片段经3'RACE获得的序列琼脂糖凝胶电泳；其中，M：DL2,000 DNA Marker；1：3′RACE第1次PCR产物；2：3′RACE第2次PCR产物；
[0015] 图3是屋尘螨过敏原Der p 33经3'RACE序列验证琼脂糖凝胶电泳；其中，M：DL2,000 DNA Marker；1：F1/R1扩增产物；2：负对照；3：F2/R2扩增产物；4：负对照；
[0016] 图4是屋尘螨过敏原Der p 33全长基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳；其中，M：DL2,000 DNA Marker；1：目的基因PCR扩增产物。
[0017] 图5是空质粒pET28a(+)经BamH I/Not I双酶切后电泳图；其中，M2：λ-HindⅢdigest(Code No.3403)；1：pET28a(+)质粒对照；2：pET28a(+)-BamH I/Not I；
[0018] 图6是pET28a(+)-Der p 33转化大肠杆菌表达SDS-PAGE图像；其中，M1为Protein MW marker(Broad)，1为pET28a(+)全细胞，2为pET28a(+)上清，3为pET28a(+)沉淀，4为pET28a(+)-Der p 33转化大肠杆菌的全细胞，5为pET28a(+)-Der p 33转化大肠杆菌的上清，6为pET28a(+)-Der p 33转化大肠杆菌的沉淀；
[0019] 图7SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白；其中，M为Protein MW marker(Broad)，1为pET28a(+)-Der p 33转化大肠杆菌的表达产物、8μL上样，2为pET28a(+)-Der p 33转化大肠杆菌的表达产物、12μL上样，3为BSA 200ng，4为BSA 400ng，5为BSA 600ng，6为BSA 800ng，7为BSA 1000ng；
[0020] 图8Westernblotting鉴定纯化后的重组蛋白；其中，M1为Precision Plus Protein Standards，18μL重组蛋白上样；M2为Perfect protein marker；
[0021] 图9是WB检测重组蛋白rDer p 33与过敏性疾病患者血清IgE结合率。第7、11、14号血清样本有阳性条带。
具体实施方式
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023] 一、已知序列验证
[0024] 1、引物设计与合成
[0025]名称 序列(5′-3′) 长度(mers)
F1 TCGTCGTCTATTTCATCCAG 20
R1 ACCATTACGTGTATTACATT 20
F2 TGAACAATGTTCCGGTTTAC 20
R2 AAGTACCAGTTATTTCGGCA 20
F1 TCGTCGTCTATTTCATCCAG 20
R1 ACCATTACGTGTATTACATT 20
F2 TGAACAATGTTCCGGTTTAC 20
R2 AAGTACCAGTTATTTCGGCA 20
[0026] 2、PCR扩增
[0027] 使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增。
[0028] 第1次PCR反应体系：1μL反转录反应液、25μL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)、1μL Tks Gflex DNA Polymerase(1.25units/μl)、1μL F1 Primer(20μM)、1μL R1Primer(20μM)、21μL dH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行30个循环。
[0029] 第2次PCR反应：以上述第1次PCR产物为模板，以F2/R2为引物进行第2次PCR扩增，反应体系及条件同上。PCR产物各取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
[0030] 3、PCR产物纯化
[0031] 使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收3号泳道，约0.5kbp的扩增产物条带。
[0032] 4、测序分析
[0033] 使用引物F2对上述PCR产物进行测序，测序结果经确认，继续进行RACE实验。
[0034] 二、3'RACE
[0035] 1、引物设计与合成
[0036]名称 序列(5′-3′) 长度(mers)
F3 CATTTATGGTCGATAATGAAGC 22
F4 CATCAATAACAGCATCATTACG 22
F3 CATTTATGGTCGATAATGAAGC 22
F4 CATCAATAACAGCATCATTACG 22
[0037] 2、PCR扩增
[0038] 使用Clontech的 RACE 5’/3’Kit(Cat.Nos.634860)进行实验。以上述PCR产物为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行扩增。
[0039] Outer PCR反应体系：2μL反转录的cDNA、25μL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)、1μL Tks Gflex DNA Polymerase(1.25units/ul)、1μL F3Primer(20uM)、5μL UPM(10×)Primer、16μL dH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行30个循环。
[0040] Inner PCR反应体系：1μL Outer PCR反应液、25μL 2×Gflex PCR Buffer (Mg2+，dNTP plus)、1μL Tks Gflex DNA Polymerase(1.25units/ul)、1μL F4 Primer(20uM)、1μL UPS(10μM)Primer、21μL dH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行30个循环。PCR产物各取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2。
[0041] 3、PCR产物纯化
[0042] 使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收2号泳道约0.75kbp的扩增产物条带。
[0043] 4、测序分析
[0044] 使用引物F4、Fseq对上述PCR产物(0.75kbp的扩增产物条带)进行测序，测序略套峰，需要进行TA克隆测序。引物序列如下：
[0045]名称 序列(5′-3′) 长度(mers)
Fseq GTACCTAATGGTGATCAAGC 20
Fseq GTACCTAATGGTGATCAAGC 20
[0046] 5、TA克隆测序
[0047] 将上述PCR产物(0.75kbp的扩增产物条带)使用DNA A-Tailing Kit(Code No.6109)上A处理后，使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.1(Code No.6022)中的连接酶，将PCR产物与T-Vector pMDTM 20(Code No.3270)连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒，使用RV-M、CTG0572Fseq对质粒进行测序。测序结果表明：3'RACE获得序列与已知序列密切相关。
[0048] 三、RACE后序列验证
[0049] 1、引物设计与合成
[0050]
[0051]
[0052] 2、PCR扩增
[0053] 以RACE试验前验证反转录的cDNA为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行扩增。PCR反应体系：1μL RACE前验证的反转录反应液、25μL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)、1μL Tks Gflex DNA Polymerase(1.25units/μL)、1μL F5Primer(20μM)、1μL R6 Primer (20μM)、21μL dH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、60℃15sec、68℃30sec进行35个循环。以上述1stPCR产物为模板，F3/R7为引物进行2nd扩增，反应体系及条件同上，PCR产物各取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。电泳检测结果表明：扩增出与预计长度大小一致的目的片段，验证成功。经验证得到的3′RACE序列是根据已知序列得到的。获得568bp的3'端未知序列。
[0054] 四、全长基因克隆
[0055] 以RACE结果为参考，进行目的基因CDS区扩增(1386bp)，In-Fusion克隆至pET-28a(+)质粒中(酶切位点BamH I/Not I)，提取2个质粒测序。
[0056] 1、引物设计与合成
[0057]名称 序列(5'-3') 长度(mers)
F0 TCGACTAATGTAATGGCAATCA 22
R0 TTGTTGTTGTTGTTCTATTTCG 22
InF AATGGGTCGCGGATCCATGCGTGAATGTATATCATTAC 38
InR TGCTCGAGTGCGGCCGCTCAAAATTCTTCACCATCCTG 38
P1 AAAGTAAACAACATGCCATA 20
F0 TCGACTAATGTAATGGCAATCA 22
R0 TTGTTGTTGTTGTTCTATTTCG 22
InF AATGGGTCGCGGATCCATGCGTGAATGTATATCATTAC 38
InR TGCTCGAGTGCGGCCGCTCAAAATTCTTCACCATCCTG 38
P1 AAAGTAAACAACATGCCATA 20
[0058] 2、反转录
[0059] 使用TaKaRa PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Code No.RR014A)合成cDNA。同时设立正负对照。反应体系：1μL Total RNA、1μL Random 6mers(20μM)、1μL Oligo dT Primer(2.5μM)、1μL dNTP Mixture(10mM each)，加RNase Free dH2O至1μL。反应条件：65℃5min，然后置冰上静置2min。然后加入下列组分：4μL5×PrimeScript RT Buffer、0.5μLRNase Inhibitor(40U/ul)、0.5μLPrimeScript RTase(for 2 Step)，总反应体积20μL。反应条件：30℃10min、45℃30min、70℃15min。
[0060] 3、第1次PCR扩增
[0061] 以上述反转录的cDNA为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增，以F0/R0为引物。第1次PCR反应体系：1μL上述反转录cDNA、25μL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)、1μLTks Gflex DNA Polymerase(1.25units/μL)、1μL F0(20μM)、1μL R0(20μM)、21μL dH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、58℃15sec、68℃60sec进行35个循环。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、58℃15sec、68℃60sec进行35个循环。
[0062] 4、第2次PCR扩增
[0063] 以上述第1次PCR产物为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增，以InF/InR为引物进行第2次PCR扩增。反应体系：1μL第1次PCR产物、25uL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTPplus)、1μL Tks Gflex DNAPolymerase(1.25units/uL)、1μL引物InF、1μL引物InR、21uL dH2O，总反应体积50uL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、58℃15sec、68℃60sec进行30个循环。取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。
[0064] 5、PCR产物纯化
[0065] 使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收约1.4kbp目的扩增产物条带。
[0066] 6、载体制备
[0067] 首先，将质粒pET28a(+)，使用BamH I/Not I进行酶切，反应体系如下：20μL pET28a(+)(约50ng/μL)、5μL 10×Quick Cut Buffer、1μL BamH I(10U/μL)、1uLNot I(10U/μL)、加dH2O至50μL。酶切产物取10μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收约5.3kbp的DNA片段，命名为Vector DNA。
[0068] 7、In-Fusion、转化、阳性克隆筛选及质粒测序
[0069] 使用In- HD Cloning Kit(Clontech Code No.639648)，将PCR产物与载体进行In-Fusion反应，连接反应体系如下：2uL Vector DNA(约50ng/μL)、2μLPCR产物(约60ng/μL)、2μL 5×In- HD Enzyme Premix，加dH2O至10μL。反应条件：50℃15min。
[0070] 取此In-Fusion产物反应液各2.5μL热转化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒，使用引物T7、T7terminator、P1进行测序，两个质粒测序结果比对完全一致，挑选其中1个质粒进行后续蛋白表达实验。
[0071] 五、蛋白表达
[0072] 将质粒pET28a(+)-Der p 33转入Rosetta2(DE3)plysS感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达，同时进行pET28a(+)空载体对照。
[0073] 1、转化
[0074] 取pET28a(+)-Der p 33质粒1μl转入Competent cell Rosetta2(DE3)plysS中；使用LB抗生素Kana(50μg/ml)+Cm(34ug/ml)平板，100μl转化液涂布，37℃O/N培养。pET28a(+)进行同样操作。
[0075] 2、培养及诱导
[0076] 2.1种培养
[0077] 挑取单菌落至2mL LB/Kana(50μLg/mL)+Cm(34uLg/mL)培养基中，37℃O/N培养。
[0078] 2.2主培养诱导
[0079] 主培养时在Glass tube中添加5mL LB/Kana(50μg/mL)+Cm(34μg/mL)培养基，添加种培养菌液100μL。37℃培养至OD600nm值约为0.6。添加150mM IPTG 33μl(final 1mM IPTG)进行诱导，37℃培养4小时。测定吸光度值：pET28a(+)诱导前吸光度值为0.6，集菌前吸光度值为1.15，pET28a(+)-Der p 33诱导前吸光度值为0.60，集菌前吸光度值为1.90。
[0080] 3、蛋白质抽提
[0082] 4、抽提液电泳
[0083] 取抽提液(全蛋白、上清、沉淀)各8μL(0.05OD相当)，加入加入2μl 4×SDS Loading Buffer，95℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件；(c.c.)25mA/枚、约70分使用gel；15％/和10％polyacrylamide gel，电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色。SDS-PAGE/CBB染色结果如图6所示。
[0084] 六、500mL纯培养
[0085] 使用pET28a(+)-Der p 33甘油菌保进行500mL培养，以从菌体中进行目的蛋白纯化。
[0086] 1、种培养
[0087] 将甘油菌保样品分别取50μL植入10ml LB/Kana(50ug/ml)+Cm(34ug/ml)培养基中，37℃O/N培养。
[0088] 2、主培养及诱导
[0089] 将10mL种培养菌液植入500ml LB/2L Flask中，37℃、200rpm培养至OD600≈0.6时，添加100mM IPTG 5ml(final 1mM IPTG)进行诱导，继续培养4小时。培养后离心，收集菌体。使用PBS清洗菌体后离心，称量菌体湿重。
[0090] 吸光度测定值
[0091]
[0092]
[0093] 3、SDS-PAGE电泳
[0094] 3.1、蛋白质抽提
[0095] 取2.0OD相当的菌体加入320μL PBS悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12,000×rpm、5min)。
[0096] 3.2、抽提液电泳
[0097] 取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μL(0.05OD相当)，加入2μL 5×SDS Loading Buffer，95℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。
[0098] 电泳条件：(c.c.)25mA/枚、约80分；
[0099] 使用gel：12.5％polyacrylamide gel；
[0100] 电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色。
[0101] SDS-PAGE/CBB染色结果如图7所示；目的蛋白以箭头指示。
[0102] 七、重组蛋白纯化
[0103] 1、缓冲液配制
[0104] Buffer A pH 8.0(4℃):50mM Sodium phosphate(pH 8.0)，300mM NaCl，5mM Imidazole；Sonication buffer/Wash buffer/4M Urea Buffer A:4M Urea，50mMSodium phosphate(pH 8.0)，300mM NaCl，5 mMImidazole；4M UreaBuffer B pH 8.0(4℃):4MUrea，50mMSodium phosphate(pH 8.0)，300mM NaCl，300mM Imidazole；透析Buffer：
TaKaRa PBS(Code No.T900)，4M Urea。
TaKaRa PBS(Code No.T900)，4M Urea。
[0105] 2、菌体破碎
[0106] (1)培养后菌体湿重2.23g
[0107] (2)加入BufferA 40ml。
[0108] (3)4℃充分悬浊，Sonication 180w，10min。获得破碎液40ml。
[0109] (4)S18,000rpm，30min，4℃离心，得到上清40ml，沉淀0.41g。
[0110] (5)使用40ml 4M Urea Buffer A重新悬浊沉淀，得到40ml。
[0111] (6)S2 8,000rpm，30min，4℃离心，得到上清40ml，沉淀0.39g。
[0112] (7)S3使用0.45μm 1000ml Vacuum filter/Storage bottle system进行过滤，得到样品40ml。
[0113] 3、柱层析纯化
[0114] 3.1、使用GE HiTrap TALON crude，5ml TALON Superflow(Code No.28-9537-66)柱层析操作。
[0115] 3.2、树脂的平衡化
[0116] 使用10倍柱体积的灭菌MilliQ H2O 50ml和10倍柱体积的4M Urea BufferA 50ml平衡树脂。流速1ml/min。
[0117] 3.3、上样
[0118] 4M Urea Buffer A平衡化后上样，流速0.5ml/min；
[0119] 树脂wash及蛋白溶出：
[0120] (1)树脂wash
[0121] 蛋白吸附后，使用20倍柱体积的4M Urea BufferA 100ml清洗树脂。
[0122] 流速2ml/min W1:30ml W2:30ml W3:40ml。
[0123] (2)蛋白溶出
[0124] Elution：4M Urea Buffer A:50ml、4M Urea BufferB:50ml梯度溶出。流速2ml/min，Fraction 1.1ml/tube×90tubes。
[0125] 4、收集与透析
[0126] 收集目的蛋白，使用透析Buffer进行透析，反复进行3次，透析后样品10.3ml。透析Buffer：1M Urea PBS；置换率：1:1000；透析膜：SnakeSkin Dialysis Tubing 10000MWCO(Cat No.68035LotNo.MH160055)；电泳胶：12.5％SDS PAGE/考马斯亮蓝染色液染色；取透析后样品进行SDS-PAGE电泳，见图7。使用ImageMaster 1D version 3.0解析软件对浓缩后样品进行定量分析，10ml目的蛋白，其浓度为0.01mg/ml，总量0.1mg，纯度>95％。
[0127] 5、Western Blotting
[0128] 将PVDF膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，开始转膜，设置转膜仪参数如下：电流25mA、转印时间80min。
[0129] 将PVDF膜置于含1.5％BSA的10ml Blockingbuffer中，37℃平放1小时。使用稀释后的Penta-HisAntibody溶液5ml，进行一次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20ml)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。使用稀释后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗体溶液5ml，进行二次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20ml)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。1ml TrueBlue Peroxidase Substrate显色1min。显色后PVDF膜、对照如图8所示。
[0130] 八、Westernblotting检测纯化后的重组蛋白与血清特异性结合
[0131] 取纯化后的蛋白样品约1μg，加入PBS Buffer将体积补足至16μl，加入4μl 4×SDS Loading Buffer，95℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件；(c.c.)25mA/枚、约70分；使用gel；12.5％polyacrylamide gel；电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色。将PVDF膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，设置转膜仪参数如下：电流42mA，转印时间70min。
将PVDF膜置于含1.5％BSA的12ml Blocking buffer中，37℃平放1小时封闭。使用1:10稀释后的血清溶液6ml，进行一次抗体反应1小时。TBST缓冲液(25ml)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。使用1：4000稀释后的Ms mAb to Hu IgE(HRP)抗体溶液6ml，进行二次抗体反应1小时。TBST缓冲液(25ml)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。1ml TrueBlue Peroxidase Substrate显色1min。显色后PVDF膜如图9所示，阳性率18.75％(3/16)，而对照组无阳性。
将PVDF膜置于含1.5％BSA的12ml Blocking buffer中，37℃平放1小时封闭。使用1:10稀释后的血清溶液6ml，进行一次抗体反应1小时。TBST缓冲液(25ml)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。使用1：4000稀释后的Ms mAb to Hu IgE(HRP)抗体溶液6ml，进行二次抗体反应1小时。TBST缓冲液(25ml)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。1ml TrueBlue Peroxidase Substrate显色1min。显色后PVDF膜如图9所示，阳性率18.75％(3/16)，而对照组无阳性。
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