屋尘螨变应原Der p 32及其制备方法和应用
阅读：982发布：2020-05-13
专利汇可以提供屋尘螨变应原Der p 32及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 屋尘螨 变应原Der p 32，所述屋尘螨变应原Der p 32包括如SEQ ID NO:1所示的 氨 基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列中的一种或多种。所述屋尘螨变应原Der p 32具有纯度高、无杂蛋白，在过敏性 疾病 领域具有广泛的应用前景；在研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用于诊断及 治疗 尘螨过敏的 试剂 具有重要意义。本发明还提供了屋尘螨变应原Der p 32的制备方法和应用。，下面是屋尘螨变应原Der p 32及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种屋尘螨变应原Der p 32，其特征在于，所述屋尘螨变应原Der p 32包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的屋尘螨变应原Der p 32，其特征在于，所述屋尘螨变应原Der p
32的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的屋尘螨变应原Der p 32，其特征在于，所述屋尘螨变应原Der p
32的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4.一种诊断尘螨过敏性疾病的组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的屋尘螨变应原Der p 32。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括其它药学上可接受的载体。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码如权利要求1所述的屋尘螨变应原Der p 32的基因表达盒。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重表达载体包括如SEQ ID NO：
2所示的核苷酸序列。
8.一种屋尘螨变应原Der p 32的制备方法，其特征在于，包括：
(1)制备并获得屋尘螨变应原Der p 32的编码基因，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(2)将所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因插入到pET-32a(+)载体中，得到pET32a-Der p 32重组质粒；
(3)将所述pET32a-Der p 32重组质粒转化至表达宿主细胞中，进行蛋白质表达、纯化，获得屋尘螨变应原Der p 32。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备并获得屋尘螨变应原Der p 32的编码基因的过程包括：提取屋尘螨组分蛋白，分离并鉴定得到屋尘螨变应原Der p 32，通过PCR方法扩增获取所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因。
10.如权利要求1-3任一项所述的屋尘螨变应原Der p 32、如权利要求6-7任一项所述的重组表达载体或如权利要求8-9任一项所述的制备方法在尘螨变应原疫苗以及制备诊断、预防、治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
屋尘螨变应原Der p 32及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 尘螨是一种全球性过敏性疾病中的的首要过敏原，研究证实尘螨与过敏性疾病关系密切。尘螨种类繁多，其中屋尘螨(Dermato-phayoides pteronyssinus，Der p)和粉尘螨(Der-matophagoides farinae，Der f)是与人类过敏反应相关的两种重要致敏物种。
[0003] 由于尘螨系医学节肢动物，结构和成分复杂，尽管人们从数百种蛋白中已初步鉴定出20多种过敏原成分，而研究显示尘螨还含有其他多种过敏原成分；且这些过敏原成分对于研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用于诊断及治疗尘螨过敏的试剂具有重要意义。
发明内容
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种屋尘螨变应原Der p 32及其制备方法和应用，可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是屋尘螨过敏性疾病，尤其特别的，是用于屋尘螨变应原第32组分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预防。
[0005] 第一方面，本发明提供了一种屋尘螨变应原Der p 32，所述屋尘螨变应原Der p 32包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少
95％同源性的氨基酸序列中的一种或多种。
95％同源性的氨基酸序列中的一种或多种。
[0006] 可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0007] 可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0008] 可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
[0009] 可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32还包含与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有免疫交叉反应性的尘螨变应原。如本发明所述的，术语“免疫交叉反应性”为行业内常规理解，当一种抗体可以与分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应，称为免疫交叉反应；不同抗原之间具有免疫交叉反应性。
[0010] 本发明所述屋尘螨变应原Der p 32为屋尘螨第32组分蛋白，所述屋尘螨变应原Der p 32是从屋尘螨匀浆中分离纯化得到的一种新的过敏原蛋白，具有纯度高、无杂蛋白，在过敏性疾病领域具有广泛的应用前景；在研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用以诊断及治疗尘螨过敏的试剂具有重要意义。
[0011] 第二方面，本发明还提供了一种诊断尘螨过敏性疾病的组合物，包括本发明第一方面所述的屋尘螨变应原Der p 32。其中，所述组合物中的过敏原组分可以但不限于为所述屋尘螨变应原Der p 32。例如，所述组合物中的过敏原组分中还包括其它屋尘螨变应原或其他粉尘螨变应原。本发明所述组合物还包括且不限于行业内在诊断尘螨过敏性疾病时采用的其他常规成分，比如稀释剂、免疫佐剂。
[0012] 可选地，所述组合物还包括其它药学上可接受的载体。
[0013] 可选地，所述载体包括缓释载体、赋形剂和常规制剂的辅料中的一种或多种。进一步地，可选地，所述载体包括溶剂、非水溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种，但不限于此。更进一步可选的，所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其他非水性溶剂。具体的，所述聚合物可以但不限于为聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶和环糊精中的一种或多种。具体地，所述脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂中的一种或多种。可选地，所述稀释剂包括淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐中的一种或多种。所述赋形剂包括片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，和液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、着色剂中的至少一种。
[0014] 具体地，所述组合物可以是点刺液、皮下注射剂、片剂、胶囊、气雾剂、鼻腔剂、贴剂、滴丸剂或喷雾剂等。
[0015] 第三方面，本发明还提供了一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码如权利要求1所述的屋尘螨变应原Der p 32的基因表达盒。其中，所述基因表盒能够用于表达获得屋尘螨变应原Der p 32。
[0016] 可选地，所述重表达载体包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0017] 可选地，所述重组表达载体的载体质粒可以是现有技术中的常用载体质粒。例如一些可用于原核表达的载体质粒之中。
[0018] 第四方面，本发明还提供了一种屋尘螨变应原Der p 32的的制备方法，包括：
[0019] (1)制备并获得屋尘螨变应原Der p 32的编码基因，所述屋尘螨变应原Derp 32的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0020] (2)将所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因插入到pET-32a(+)载体中，得到pET32a-Der p 32重组质粒；
[0021] (3)将所述pET32a-Der p 32重组质粒转化至表达宿主细胞中，进行蛋白质表达、纯化，获得屋尘螨变应原Der p 32。
[0022] 可选地，所述制备并获得屋尘螨变应原Der p 32的编码基因的过程包括：提取屋尘螨组分蛋白，分离并鉴定得到屋尘螨变应原Der p 32，通过PCR方法扩增获取所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因。本发明所述制备并获得尘螨变应原Der p 32的编码基因的过程不限于所述通过PCR方法扩增获取所述尘螨变应原Der p 32的编码基因。
[0023] 可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0024] 可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因插入至pET-32a(+)载体的BamH I与Xho I酶切位点之间。可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因插入到pET-32a(+)载体时，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pET-32a(+)载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pET-32a(+)载体中Xho I酶切位点相连。
[0025] 可选地，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因的核苷酸序列上还可以增设His标签(组氨酸标签)的核苷酸序列，所述His标签的核苷酸序列能使表达后的蛋白带上His标签，所述His标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。
[0026] 可选地，所述表达宿主细胞可以为原核表达宿主细胞，例如原核微生物等。具体地，所述表达宿主细胞包括大肠杆菌Orgami(DE3)。所述大肠杆菌Orgami(DE3)表达获得的屋尘螨变应原Der p 32产量高，效率高。
[0027] 本发明所述pET32a-Der p 32重组质粒能够良好地将屋尘螨变应原Der p 32的编码基因通过转化或转导的方法导进所述表达宿主细胞中，进行扩增或进行转录及翻译。
[0028] 本发明第四方面所述的制备方法，简便高效，成本低，可用于大规模工业化生产；由所述制备方法制得的屋尘螨变应原Der p 32纯度高，生物活性好，可用于研究尘螨过敏之免疫发病机制，特别是屋尘螨变应原第32组分引起的过敏反应；以及研发用以诊断及治疗尘螨过敏的试剂具有重要意义。
[0029] 由于天然变应原提取液的组分非常复杂，恒定其组分非常困难，且容易受外源性有毒物质、病原微生物的污染，影响其重复性与安全性。同时，现有技术提纯尘螨变应原具有耗时长、过程繁琐、成本较高等特点，而且很难从根本上提高变应原的纯度。相比于现有技术，本发明所述制备方法简便高效，成本低，绿色环保，制备得到的屋尘螨变应原Der p 32具有纯度高、无杂蛋白、易标准化、无外源性毒性物质和病原微生物污染等优势；所述制备得到的屋尘螨变应原Der p 32在用于临床治疗变态反应疾病的药物中具有广泛的应用前景。
[0030] 第五方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的屋尘螨变应原Der p 32、如本发明第三方面所述的重组表达载体或如本发明第四方面所述的制备方法在尘螨变应原疫苗以及制备诊断、预防、治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0031] 优选地，所述应用包括在制备诊断、预防、治疗屋尘螨变应原(优选为屋尘螨第32组分引起的)过敏性疾病的试剂中的应用。所述试剂包括化学药物试剂和生物药物试剂中的一种或多种。具体地，所述试剂可以为过敏性检测试剂盒或其他医学试剂。
[0032] 本发明的有益效果：
[0033] (1)本发明首次发现并得到屋尘螨变应原Der p 32，所述Der p 32可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是屋尘螨过敏性疾病；同时，所述屋尘螨变应原Der p 32在研究尘螨过敏之免疫发病机制方面具有重要意义；
[0034] (2)本发明制备得到的屋尘螨变应原Der p 32具有蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富的特点；
[0035] (3)本发明提供的屋尘螨变应原Der p 32用于制备诊断、预防或治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂具有特异性高、成本低的特点；特别地，可高效用于尘螨变应原疫苗以及屋尘螨变应原第32组分引起的过敏性疾病的诊断、预防、治疗。附图说明
[0036] 图1为本发明实施例提供的屋尘螨背面扫描电镜照片；
[0037] 图2为本发明实施例提供的屋尘螨腹面扫描电镜照片；其中，图2中A是雌性屋尘螨腹面扫描电镜照片；图2中B是雄性屋尘螨腹面扫描电镜照片；
[0038] 图3为本发明实施例提供的pET32a(+)-Der p 32重组质粒的双酶切胶图；
[0039] 图4为本发明实施例提供的屋尘螨变应原Der p 32蛋白的SDS-PAGE胶图；其中，图4中A是屋尘螨变应原Der p 32蛋白纯化前的SDS-PAGE胶图；图4中B是屋尘螨变应原Der p
32蛋白纯化后的SDS-PAGE胶图；
32蛋白纯化后的SDS-PAGE胶图；
[0040] 图5为本发明实施例提供的屋尘螨变应原Der p 32与尘螨过敏病人血清IgE作用的Elisa检测图。
具体实施方式
[0041] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0042] 若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。
[0043] 实施例1
[0044] 一、屋尘螨的培养
[0045] (1)培养条件：发育温度为尘螨25℃，湿度(RH)为70％-75％。
[0046] (2)屋尘螨扩配
[0048] ②取出培养基，加入碾磨均匀的维生素1片，混匀；
[0049] ③新培养基分别加入空锥形瓶中，然后观察选取生长旺盛的屋尘螨的锥形瓶，每个新锥形瓶加入适量含有屋尘螨的之前培养的培养基(3-4勺)；
[0050] ④进出培养房前后用房间和自身用酒精消毒。
[0051] (3)屋尘螨分离
[0052] 粗分离：选取一屋尘螨生长旺盛的锥形瓶，把培养基均匀铺在滤网上面，在其上方用灯泡照射，由于屋尘螨的避光性，大部分屋尘螨会从滤网上掉下来，在滤网下有大的玻璃培养皿接收，大约1h-2h；
[0053] 细分离：由于下面收集的屋尘螨中还是有部分豆粉的存在，因此获得的屋尘螨还需进一步分离，将粗分的屋尘螨倒入300mL-400mL水中，搅匀，不要使底部有过多沉淀，倒入过滤的装置，其原理通过泵抽滤来分离，连接好装置，开打泵，缓慢倒入混有屋尘螨的水，屋尘螨由于大于滤网孔径而在滤网之上，而豆粉随着水滤过滤网。当滤网上屋尘螨过多以至于溶液不能通过滤网，则拿出滤网，收集滤网上的屋尘螨，清理滤网后再次抽滤。当所有收集之后重新用水融之后再重复一次之前的过程，以确保豆粉彻底滤掉。最后屋尘螨是呈块状，再用PBS冲洗一次便可用枪头挑入50mL离心管中-80℃保存或液氮保存。
[0054] 通过扫描电镜的观察活的屋尘螨的外部形态超微结构，参见图1和图2。
[0055] 二、屋尘螨组分蛋白的分离鉴定
[0056] 提取屋尘螨组分蛋白，分离并鉴定得到屋尘螨变应原Der p 32，并获取所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0057] 三、屋尘螨变应原Der p 32表达纯化及过敏原性鉴定
[0058] (1)构建pET32a-Der p 32重组质粒
[0059] 将经测序无误的屋尘螨变应原Der p 32的编码基因，插入至插入至pET-32a(+)载体的BamH I与Xho I酶切位点之间。所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因插入到pET-32a(+)载体时，所述屋尘螨变应原Der p 32的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pET-32a(+)载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pET-32a(+)载体中Xho I酶切位点相连。将实验得到的重组质粒转化大肠杆菌Top10克隆菌，经氨苄青霉素筛选后提取质粒，进行双酶切鉴定。鉴定成功后，得到pET32a-Der p 32重组质粒。所述pET32a-Der p 32重组质粒的双酶切胶图如图3所示，结果显示在约1188bp处有目的基因条带，与Der p 32理论分子量相符。
[0060] (2)屋尘螨变应原Der p 32的表达及蛋白纯化
[0061] 将测序正确的pET32a-Der p 32重组质粒转化经氯化钙感受态处理的Orgami表达菌，经氨苄平板筛选，挑取阳性菌落过夜培养。二次摇菌后，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，37℃、200r/min诱导4h后收集菌体，超声破碎分别取上清沉淀进行SDS-PAGE分析，以确定蛋白可溶性。再用FPLC进行Ni2+亲和层析纯化。实验纯化后得到的屋尘螨变应原Der p 32也可称为重组屋尘螨新过敏原Der p 32，所述Der p 32蛋白的相对分子质量约为63KD，等电点为5.0。
[0062] 实验过程中，对整个纯化过程进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示，其中图4中A为纯化前的SDS-PAGE胶图；图4中B为纯化后的SDS-PAGE胶图。其中，图4的A中，“M”代表蛋白分子量Marker，“1”代表诱导前组分，“2”代表诱导后组分，“3”代表上清组分，“4”代表沉淀组分；图4的B中，“M”代表蛋白分子量Marker，“1”代表纯化后的Der p 32。结果表明屋尘螨变应原Der p 32成功诱导表达，在63kDa处有目的条带出现，与预测的Der p 32理论结果相符，且目的蛋白为不可溶蛋白。
[0063] 效果实施例1
[0064] 屋尘螨变应原Der p 32的过敏原性检测(ELISA)
[0065] 采用ELISA方法检测制备得到的屋尘螨变应原Der p 32的过敏原性。96孔板中每孔包被1μg/mL的Der p 32蛋白100μL，同时包被对照，采用3％BSA(牛血清白蛋白)封闭液在4℃下封闭过夜。用26份屋尘螨过敏病人的血清和4份正常人血清(阴性对照)(1:50的比例稀释)为一抗，37℃孵育2h。之后每孔加入100μL生物素标记的抗人IgE(1:2000比例稀释)，
37℃孵育2h。清洗5次，每孔加入100μL HRP标记的链霉亲和素(1:5000比例稀释)，37℃孵育
1h。显色后37℃孵育10min，然后用2mol/L的浓硫酸终止反应。用自动酶标仪检测其在450nm处的吸光度，分析数据，当患者血清IgE检测吸光度值高于正常人血清IgE检测吸光度值的
2.5倍为阳性。结果参见图5，其中1-26表示屋尘螨过敏患者血清，N1-N4表示正常人血清；在
26份屋尘螨过敏患者中有12份与Der p32呈现阳性，即Der p 32的IgE结合率为46.2％。
37℃孵育2h。清洗5次，每孔加入100μL HRP标记的链霉亲和素(1:5000比例稀释)，37℃孵育
1h。显色后37℃孵育10min，然后用2mol/L的浓硫酸终止反应。用自动酶标仪检测其在450nm处的吸光度，分析数据，当患者血清IgE检测吸光度值高于正常人血清IgE检测吸光度值的
2.5倍为阳性。结果参见图5，其中1-26表示屋尘螨过敏患者血清，N1-N4表示正常人血清；在
26份屋尘螨过敏患者中有12份与Der p32呈现阳性，即Der p 32的IgE结合率为46.2％。
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