屋尘螨过敏原
阅读：984发布：2020-05-11
专利汇可以提供屋尘螨过敏原专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种多肽，其包含 氨 基酸序列，该多肽具有与氨基酸序列SEQ ID No.1至少60％的同源性，或包含氨基酸序列SEQ ID No.1的至少6个连续氨基酸残基的至少一个氨基酸 片段 ，或与氨基酸序列SEQ ID No.1或其片段具有免疫交叉 反应性 ，其中，氨基酸序列SEQ IDNo.1编码一种过敏原，该多肽包含被具有氨基酸序列SEQ ID No.1的分子的特异性T细胞受体所识别的至少一个T细胞表位。，下面是屋尘螨过敏原专利的具体信息内容。
1.一种多肽，其由SEQ ID No.1的氨基酸序列组成，其中，氨基酸序列SEQ ID No.1编码一种过敏原，该多肽包含至少一个T细胞表位。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征为所述多肽为低致敏性。
3.编码根据权利要求1或2所述的多肽的DNA分子。
4.包含根据权利要求3所述的DNA分子的载体。
5.经过根据权利要求4所述的载体转化的细胞。
6.与根据权利要求1或2所述的多肽相结合的IgG抗体。
7.包含根据权利要求1或2所述的多肽或根据权利要求6所述的IgG抗体的疫苗制剂。
8.根据权利要求1或2所述的多肽或根据权利要求6所述的IgG抗体在制备用于螨虫过敏症的免疫治疗的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中过敏症是屋尘螨过敏症。
10.根据权利要求1或2所述的多肽或根据权利要求6所述的IgG抗体在制备用于预防螨虫过敏原致敏的药物中的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中所述的过敏原是屋尘螨过敏原。
12.根据权利要求8至11任一项所述的用途，其特征为所述药物进一步包括佐剂、稀释剂、防腐剂或其混合物。
13.根据权利要求8至11任一项所述的用途，其特征为所述药物包含10ng至1g所述多肽。
14.根据权利要求13的用途，其中所述药物包含100ng至10mg所述多肽。
15.根据权利要求14的用途，其中所述药物包含0.5μg至200μg所述多肽。
屋尘螨过敏原
[0001] 本发明涉及一种具有致敏性的多肽。
[0002] 在工业化国家，超过25％的人口受到IgE介导的过敏症的困扰。过敏性患者的特征在于体内具有增高的针对本身无害的抗原(例如：过敏原)的IgE抗体。I型过敏症(变应性鼻结膜炎、哮喘、皮炎、过敏性休克)的最直接症状是由过敏原诱导的与肥大细胞结合的IgE抗体的交联，和生物活性调节子(如：组织胺、白细胞三烯)的释放所引起的。
[0003] 屋尘螨(HDM)是世界上最重要的过敏原之一。几乎10％的人口和超过50％的过敏患者对螨虫过敏原敏感。屋尘螨的一种，屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus，Der p)在中欧普遍分布。Der p的过敏原由包含多于30种蛋白或糖蛋白，其中，已有21种过敏原被鉴别。1类和2类过敏原(Der p1和Der p2)代表HDM的最重要的过敏原，其由超过80％的Der p患者识别，但也有其它HDM过敏原(例如：Der p5和Der p7)被表明代表重要的Der p过敏原，虽然其与IgE的结合频率相当低。
[0004] Weghofer M.等人(Clin Exp Allergy35(2005)：1384-1391)表明重组尘螨过敏原可抑制IgE的反应活性，从而可被用于屋尘螨过敏症的诊断测试和治疗。
[0005] Pittner G.等人(Clin Exp Allergy34(2004)：597-603)描述了诊断测试方法，包括利用主要屋尘螨过敏原Der p1和Der p2以及具有高交叉反应性的尘螨过敏原(如Der p10)来选择以Der p提取物进行免疫治疗的病人。
[0007] EP1 612 219A1涉及源自屋尘螨(Der p)的过敏原。
[0008] 现今用于屋尘螨患者诊断治疗的屋尘螨粗提物仅对Der p1和Derp2做了标准化，然而，其他重要的过敏原在屋尘螨提取物中仅以少量存在。
[0009] 本发明的目标是提供新型具有致敏性和低致敏性特征的多肽，可用于过敏症的诊疗、治疗和预防，特别是屋尘螨过敏症。
[0010] 因此，本发明涉及了一种多肽，包含具有与氨基酸序列SEQ ID No.1至少60％的同源性的氨基酸序列，或包含氨基酸序列SEQ ID No.1的至少6个连续氨基酸残基的至少一个氨基酸片段，或与氨基酸序列SEQ ID No.1或其片段具有免疫交叉反应性，其中，氨基酸序列SEQ IDNo.1编码一种过敏原，且该多肽包含被具有氨基酸序列SEQ ID No.1的分子的特异性T细胞受体所识别的至少一个T细胞表位。
[0011] 氨 基 酸 序 列 SEQ ID No.1 的 多 肽 (MKFNIIIVFI SLAILVHSSYAANDNDDDPT TTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDPHKFYICSNWE AVHKDCPGNT RWNEDEETCT)是新的主要Der p过敏原，可用于诊断和治疗Der p过敏性患者。该新Der p过敏原的分子量约为8kDa，并与超过50％的螨虫过敏患者的IgE结合。
[0012] 过敏原与氨基酸序列SEQ ID No.1的高IgE结合频率，以及对此过敏原生物活性的观察，使之成为用以诊断个体中屋尘螨过敏症的重要分子。
[0013] 不仅如此，此种新螨虫过敏原对屋尘螨过敏症的治疗和预防也有作用。根据本发明所述的多肽可以在哺乳动物中引起高效价的特异的IgG抗体。如果这种特异性IgG抗体被施用到患者体内，将显示出的屋尘螨过敏原加入到样品，优选为血清中，所述样品获自屋尘螨过敏性个体，该样品包含所述个体的IgE分子，则IgE与此新过敏原的结合被抑制。这显示出利用此种新过敏原的特异性免疫治疗可引起人体内IgG抗体的阻断。近来，在使用确定的过敏原及过敏原衍生物进行免疫治疗的试验中(Gafvelin，G.，等人(2005)Int Arch Allergy Immunol138：59；Jutel，M.，等人(2005)J Allergy Clin Immunol116：608)，这种为成功的免疫治疗而引起IgG抗体的阻断已显示出重要性。被引发的高水平过敏原特异性IgG抗体抑制了过敏原引起的嗜碱粒细胞失粒(Niederberger，V.，等人(2004)PNAS USA101Suppl2：14677)。根据本发明，将表现出致敏性特征的多肽修饰形成具有降低的致敏性和保留有免疫原性低致敏性的衍生物，可能通过减少过敏副作用而进一步改善免疫治疗(Valenta，R.，等人(2004)Adv Immunol82：105)。低致敏性的衍生物可用分子生物学的技术生产，或通过合成从过敏原的T-细胞或B-细胞表位得到的肽来生产(Kyte，J.，和R.F.Doolittle.(1982)J MolBiol157：105)。
[0014] 这里所用的“多肽”是指包含至少6个氨基酸残基，优选为至少8个氨基酸残基的分子。
[0015] 这里所用的术语“同源性”表明是否任何两个(或两个以上)肽、多肽或蛋白序列具有在一定程度上(“％同源”)与彼此“相同”的氨基酸序列。这种程度可使用已知的计算机程序例如“FAST A”程序来确定，使用例如Pearson等人(1988)PNAS USA85：2444中所用的默认参数(其它的程序包括GCG程序包(Devereux，J.，等人，Nucleic AcidsResearch(1984)Nucleic Acids Res.，12，387-395)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，等 人，J Molec Biol215：403(1990)；Guide to HugeComputers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，和Carilloet al，(1988)SIAM J Applied Math48：1073)。例如，NCBI数据库的BLAST工具可被用于确定同源性。其它的商业上或公开可获得的程序包括DNAstar“MegAlign”程序(Madison，WI)和the University ofWisconsin Genetics Computer Group(UWG)＂Gap＂程序(Madison，WI))。蛋白分子的百分率同源性可进一步被确定，例如，通过使用GAP计算机程序(例如Needleman等人，(1970)J.Mol.Biol.48：443，如Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482所修改)来比较序列信息。简单来说，GAP程序定义同源性为经排列的相同的符号(例如核苷酸或氨基酸)的数目，除以两个序列中较短者的符号的总数目。GAP程序的默认参数包括：(1)一元比较矩阵(包含对于同源和非同源为1的值)和加权的比较矩阵，Gribskov等人14：6745，如Schwartz和Dayhoff，eds.，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)中所描述；(2)每个缺口3.0的罚分和每个缺口中每个符号0.10的附加罚分；和(3)末端缺口无罚分。
[0016] 根据本发明的优选实施方式，氨基酸序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％，最优选为至少95％，特别是100％的与氨基酸序列SEQ ID No.1相同。
[0017] 这里所用的“交叉反应性”涉及一种抗体临近结合至抗原(例如，肽、蛋白、多肽)的能力，其在体内系统、其它抗原中确实刺激其产生。这意味着为特异性地与具有氨基酸序列SEQ ID No.1的多肽或其片段结合而生产的抗体可能表现出与SEQ ID No.1非同源多肽的结合亲和力。一个抗体与多肽的结合特异性可通过本领域已知的方法来确定，例如ELISA、RIA、免疫杂交等，如Valenta等人.J Exp Med.(1992)175：377-385所描述。
[0018] 根据本发明所述的多肽优选为通过本领域已知的任何方法重组产生。生产所述多肽的宿主可以是使用相应载体和质粒的任何种类(例如，真核细胞，优选为酵母、哺乳细胞、植物细胞和昆虫细胞，以及原核细胞，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。当然，也可能通过本领域已知的方法化学生产本发明的多肽。
[0019] 根据本发明的另一个优选的实施方式，所述多肽是低致敏性的。
[0020] 这里所用的术语“低致敏性”是指源于具有致敏性特征的过敏原的肽、多肽或蛋白诱导抗体产生的能力，所述抗体特异性结合所述过敏原并且在向一个个体施用时，表现出减少的或没有过敏反应。像SEQID No.1过敏原的“低致敏性”衍生物的减少的或失去的诱导个体中过敏反应的能力是通过除去或破坏所述过敏原的IgE结合表位，但是，保留所述过敏原上存在的T细胞表位来获得的。这可以通过例如将过敏原分裂成带有减少的或没有IgE结合能力的片段，并以和野生型过敏原中片段的顺序不相对应的顺序来融合所述片段的一些或全部(参见例如EP1 440 979)。另外一种从过敏原生产“低致敏性”分子的方法包括野生型过敏原的C-和/或N-末端的缺失(参见例如EP1 224215)。
[0021] 根据本发明的另外一个优选实施方式，所述氨基酸片段以和SEQID No.1中所述片段顺序不同的顺序融合。
[0022] 根据本发明所述的多肽可以包含源自SEQ ID No.1的氨基酸片段，其优选为以和SEQ ID No.1中顺序不同的顺序融合在一起。这个“搅乱”会产生一个多肽，该多肽相对于具有氨基酸序列SEQ ID No.1的野生型过敏原来说，具有改变的特征。例如，这个搅乱将产生一个包含完整的T细胞表位和破坏了的B细胞表位的多肽。这样一个分子可能具有低致敏性特征。
[0023] 所述基本上由T细胞表位组成的至少一个氨基酸片段优选地选自包含SEQ ID No.1的5至13，9至17，10至18，11至19，12至20，16至24，17至25，43至51，44至52，45至53，47至55，51至59或60至68氨基酸的氨基酸分子。
[0024] 当在一个个体中施用根据本发明所述的多肽时，为了激发T细胞免疫反应，所述多肽需要包含T细胞表位。T细胞表位包含至少6个，优选为至少7个，更优选为至少8个SEQ ID No.1的连续氨基酸残基。所述T细胞表位也可以通过或不通过一个连接子与载体结合。所述载体可以是微阵列(microarray)技术中所用的固体载体。多肽中T细胞表位的存在可通过技术领域中已知的方法确定(参见例如“EpitopeMapping：A practical approach”Ed.O.Westwood and F.Hay，2001，Oxford University Press)。一个特别优选的方法是ELISpot(Tobey TW和Caulfield MJ(2004)，Methods Mol.Med.94：121-132)。
[0025] 经鉴定T细胞表位可能经N-或C-末端与其它分子像蛋白融合，或作为从SEQ ID No.1通过片段化获得的较大片段的一部分。
[0026] 本发明的另一个方面涉及编码本发明所述的多肽的DNA分子。
[0027] 本发明的另外一个方面涉及包含本发明所述的DNA分子的载体。
[0028] 根据本发明所用的优选的载体(例如质粒)为克隆载体以及表达载体，其包含启动子、复制起点、调节模块、选择性标记和/或其它载体模块。如果该载体是能够整合到宿主细胞基因组的整合载体，在所述载体上可提供相应的方法(例如插入序列模块)。所用载体和所述载体上存在的调节模块的类型取决于所述载体将被插入何种宿主细胞。如果使用表达载体，根据本发明所述并编码如上所述的多肽的DNA分子则可操作地与启动子区域连接。
[0029] 本发明的另一个方面涉及经本发明所述的载体转化的细胞。
[0030] 这里所用的细胞可以是真核细胞和原核细胞。优选的真核细胞为酵母细胞特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)和多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)，植物细胞特别是烟草植物细胞，昆虫细胞和哺乳细胞，像人类和动物细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞。优选的原核细胞为，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)。包含本发明所述的载体或DNA分子的细胞可用于生产本发明所述的多肽。
[0031] 本发明另外一个方面涉及与本发明所述的多肽相结合的抗体。
[0032] 根据本发明所述的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人源或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段和以上任何一个的表位结合片段。而且，抗体被认为是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原免疫特异结合的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子优选为IgG、IgM、IgD、IgA和IgY型，免疫球蛋白分子的类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
[0033] 可通过，优选使用佐剂，向非人类的动物施用本发明所述的多肽，并收集所产生的抗血清制备多克隆抗体。可通过一段时间的重复注射获得改善的效价。对于可用来引起抗体的哺乳动物的种类没有特别限制；大致上优选使用兔子或天竺鼠，但是也可使用马、猫、狗、山羊、猪、大鼠、牛、绵羊、骆驼等。在生产抗体时，定量的本发明的免疫原以例如生理盐水溶液稀释至合适的浓度，产生的稀释的溶液以例如完全弗氏佐剂混合以制备悬浮液，或与矿物质凝胶例如氢氧化铝混合，表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类(pluronicpolyols)、聚阴离子、肽、油乳状液、钥孔虫戚血兰素(keyhole limpethemocyanins)、二硝基酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG(bacilleCalmette-Guerin，卡介苗)和短小棒状杆菌菌苗(corynebacteriumparvum)。悬浮液和混合物通过例如腹腔内，施用于哺乳动物，例如兔子，每次施药使用大约50μg至大约2500μg本发明所述的多肽。悬浮液优选为大约每两个星期施用一次，持续大约2-3个月优选为大约1个月的时间，来达到免疫。这样来重新获得抗体：在最后一次施药经过1至2周后，收集免疫的动物的血液，离心血液并从血液中分离血清。
[0034] 单克隆抗体可能是例如人源或鼠源的。鼠单克隆抗体可通过 和Milstein的方法( G.和Milstein，C.，Nature256(1975)495)来制备，例如通过将超免疫的鼠的脾细胞与合适的鼠骨髓瘤细胞系融合。
[0035] 嵌合抗体是其中该抗体的不同部分源自不同的动物种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的的抗体。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison，Science229:1202(1985)；Oi等人，BioTechniques4：214(1986)；Gillies 等 人，(1989)J.Immunol.Methods125：191-202；US5,807,715；US4,816,567and US4,816,397。
[0036] 人源化抗体是来自与所需抗原结合的非人物种抗体中的抗体分子，所述抗原具有来自非人物种的一个或多个互补决定区和人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区的框架残基被相应的CDR供体抗体取代以改变，优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法鉴别，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用来鉴定对抗原结合重要的框架残基，和模拟序列比较来鉴定在特定位置上的不寻常的框架残基(参见，例如Queen等人，US5,585,089；Riechmann等人，Nature332:323(1988))。抗体可使用技术领域中已知的众多技术来人源化，包括例如，CDR-接枝(EP239,400；WO91/09967；US5,225,539；US5,530,101；和US5,585,089)，镶饰(veneering)或重铺(resurfacing)(EP592,106；
EP519,596；Padlan，Molecular Immunology28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka 等 人，Protein Engineering7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS91：969-913(1994))，和链穿梭(chain shuffling)(US5,565,332)。
EP519,596；Padlan，Molecular Immunology28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka 等 人，Protein Engineering7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS91：969-913(1994))，和链穿梭(chain shuffling)(US5,565,332)。
[0037] 根据本发明所述的抗体可有利地用于遭受过敏症特别是屋尘螨过敏症的个体的被动免疫。对于被动免疫，抗体优选为IgG或其衍生物(例如嵌合的或人源的抗体)。而且，此抗体也可被用于个体的脱敏。
[0038] 本发明的另一个方面涉及包含本发明所述的多肽或抗体的疫苗制剂。
[0039] 根据本发明所述的制剂中临近多肽或抗体也可包含其它的取代物像稳定剂、佐剂、药学上可接受的载体等。合适的生产疫苗制剂的程序对本领域技术人员来说是已知的，可以在例如“Vaccine Protocols”(A.Robinson，M.P Cranage，M.Hudson；Humana Press Inc.，U.S.；2003年第二版)中找到。
[0040] 本发明的另外一个方面涉及使用本发明所述的多肽来诊断个体中的过敏症，特别是屋尘螨过敏症。
[0041] 所述多肽可通过将一个个体的包含组胺释放细胞的样品暴露于所述多肽来用于诊断过敏症，特别是屋尘螨过敏症(参见例如Purohit等人，Clin.Exp.Allergy35(2005)：186-192)。而且，根据本发明所述的多肽可被固定于一个表面以形成多肽阵列/芯片。这样的阵列可用于例如高通量筛选以诊断取自一些个体的一些样品中的过敏症。
[0042] 本发明的另外一个方面涉及本发明所述的多肽或抗体用于制备用于过敏症特别是屋尘螨过敏症免疫治疗的药物的用途。
[0043] 根据本发明所述的多肽或抗体可分别用于主动接种和被动接种。二者均可应用，因为当向一个个体施用本发明的多肽时，保护性IgG的形成被诱导，针对所述多肽使用免疫球蛋白将导致IgE和所施用的保护性抗体之间的竞争，这又减轻了过敏症的症状。
[0045] 用于接种个体的多肽优选为低致敏性的。使用这样的多肽可预防IgE与所述多肽的结合从而预防过敏性反应。
[0046] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述药物进一步含有佐剂、载体、稀释剂、防腐剂或其混合物。
[0047] 药物优选地包含10ng至1g，更优选100ng至10mg，特别是0.5μg至200μg所述多肽。
[0049] 图1显示了源自克隆30的过敏原的cDNA和氨基酸序列。起始密码子和终止密码子以下划线标出。信号序列包含氨基酸残基1至21，在氨基酸残基21(A)和22(A)之间粗体标出预测切割位点。序列左侧的数字表明核苷酸的位置，序列右侧的数字表明氨基酸的位置。
[0050] 图2显色了源自克隆30的过敏原的考马斯蓝染色和质谱(MS)。A，考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示出分子量标记(M)和3μg的纯化的源自克隆30的过敏原(30)。B，纯化的源自克隆30的过敏原的MS分析显示出x轴上的质量/电荷比，以及y轴上的信号强度，该信号强度以所研究质量范围内所获得的最强信号的百分比表示。在7979.20处的峰对应于源自克隆30的过敏原的推导的氨基酸序列的经计算的质量。
[0051] 图3显示了源自克隆30的过敏原的免疫杂交。纯化的源自克隆30的过敏原的样品经SDS-PAGE分离，在硝化纤维上杂交然后以来自两个螨虫过敏病人(1，2)的血清和来自125
一个非过敏性个体(3)的血清温育。特异性结合源自克隆30的过敏原的IgE抗体以 I标记的抗人类IgE抗体检测。
一个非过敏性个体(3)的血清温育。特异性结合源自克隆30的过敏原的IgE抗体以 I标记的抗人类IgE抗体检测。
[0052] 图4显示了兔抗-源自克隆30的过敏原的抗血清的IgG反应活性。源自克隆30的过敏原和主要螨虫过敏原Der p2被打点至硝化纤维条，并以1:1000-1:1,000,000稀释的兔预免疫血清(A)或者兔抗-源自克隆30的过敏原的抗血清(B)温育。结合的IgG抗125
体以 I标记的来自驴的抗兔子全抗体检测。
体以 I标记的来自驴的抗兔子全抗体检测。
[0053] 图5显示了源自克隆30的过敏原的生物活性。来自一个螨虫过敏患者的血液样品被暴露于10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的源自克隆30的过敏原，1μg/ml的抗-IgE抗体或PBS作为缓冲对照(Co)(x-轴)。通过FACS分析测定CD203c表达，以平均荧光指数(MFI)(y-轴)表示。
[0054] 图6显示了使用ProtScale对成熟的源自克隆30的过敏原的疏水性分析(Kyte&Doolittle)。包括N末端蛋氨酸的成熟蛋白的氨基酸位置被显示于x-轴。B，以基于网络的计算系统MULTIPRED对源自克隆30的过敏原的可能的T细胞表位的预测。序列的每一测上的数字表明成熟的源自克隆30的过敏原的氨基酸位置。
[0055] 实施例
[0056] 本实施例描述了一种新的主要Der p过敏原的鉴别，其可用于derP过敏性病人的诊断和治疗。
[0057] 编码此新的螨虫过敏原的cDNA分离自表达Der p的cDNA文库，在大肠杆菌(E.Coli)中以重组过敏原表达。该新过敏原具有大约8kDa的分子量，与超过50％的过敏性病人的IgE结合，因此代表一种主要过敏原。
[0058] 实施例1：源自克隆30的过敏原的表达和纯化
[0059] 编码预测的成熟的源自克隆30的过敏原(在N末端具有另外ATG的核苷酸89-295)的克隆30的cDNA序列(图1)被亚克隆至表达载体pET-17b(Novagene，WI)并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达(Stratagene，CA)。细菌细胞在27℃下在含有100mg/L的氨比西林的LB培养基上生长过夜，通过加入异丙基-1-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至0.5mM的终浓度来诱导重组蛋白的表达。在27℃下继续培养6小时后，通过离心收取1升大肠杆菌培养物(15分钟，3000rpm，4℃，Sorvall RC5C)，沉淀重悬于30ml25mM的咪唑pH7.4/0.1％(v/v)Triton X100。然后细菌细胞以300μg溶菌酶在室温处理20分钟。细菌细胞溶菌液在液氮冷冻三次然后在50℃水浴解冻。通过加入3μgDNase在室温下降解基因组DNA10分钟，然后加入600μl5M的NaCl。这些裂解的细菌细胞在4℃下18,000rpm离心
20分钟，以60％的硫酸铵在4℃下处理含有源自克隆30的过敏原的可溶性片段的蛋白1.5小时。沉淀的蛋白通过离心(18,000rpm，20分钟，4℃)来分离，含有源自克隆30的过敏原的可溶性片段以2M硫酸铵/50mM磷酸钠pH7.0/10mg/L苯基甲基硫酰基氯化物(PMSF)透析，然后应用于HiTrapPhenyl FF(high sub)柱(Amersham Biosciences AB，Sweden)。源自克隆30的过敏原以500-0mM的硫酸铵梯度洗脱，含有源自克隆30的过敏原的片段被汇聚。
源自克隆30的过敏原以20mM Tris-Cl在pH8.0/10mg/L PMSF透析后，应用于HiTrap DEAE Sepharose FF柱(AmershamBiosciences)。源自克隆30的过敏原以0-500mM的NaCl梯度洗脱，含有90％以上的纯的源自克隆30的过敏原的片段被汇聚。源自克隆30的过敏原以
20mM Tris-Cl在pH8.0透析并存贮于-20℃。以14％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝蛋白质染色分析一个蛋白样品的纯度(图2A)。成熟蛋白的分子量分析显示
7.98kDa(图2B)的质量，其对应于源自克隆30的过敏原的推导的氨基酸序列的经计算的质量，虽然在SDS-PAGE中该蛋白以大约14kDa运动(图2A)。
20分钟，以60％的硫酸铵在4℃下处理含有源自克隆30的过敏原的可溶性片段的蛋白1.5小时。沉淀的蛋白通过离心(18,000rpm，20分钟，4℃)来分离，含有源自克隆30的过敏原的可溶性片段以2M硫酸铵/50mM磷酸钠pH7.0/10mg/L苯基甲基硫酰基氯化物(PMSF)透析，然后应用于HiTrapPhenyl FF(high sub)柱(Amersham Biosciences AB，Sweden)。源自克隆30的过敏原以500-0mM的硫酸铵梯度洗脱，含有源自克隆30的过敏原的片段被汇聚。
源自克隆30的过敏原以20mM Tris-Cl在pH8.0/10mg/L PMSF透析后，应用于HiTrap DEAE Sepharose FF柱(AmershamBiosciences)。源自克隆30的过敏原以0-500mM的NaCl梯度洗脱，含有90％以上的纯的源自克隆30的过敏原的片段被汇聚。源自克隆30的过敏原以
20mM Tris-Cl在pH8.0透析并存贮于-20℃。以14％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝蛋白质染色分析一个蛋白样品的纯度(图2A)。成熟蛋白的分子量分析显示
7.98kDa(图2B)的质量，其对应于源自克隆30的过敏原的推导的氨基酸序列的经计算的质量，虽然在SDS-PAGE中该蛋白以大约14kDa运动(图2A)。
[0060] 实施例2：源自克隆30的过敏原的IgE反应活性
[0061] 源自克隆30的过敏原的IgE结合能力使用两个屋尘螨致敏个体的血清通过免疫杂交分析(图3)。源自克隆30的过敏原的样品通过SDS-PAGE分离然后杂交至硝化纤维。125
硝化纤维条以1:10稀释的人血清(1-3)温育，结合的IgE抗体以1:10稀释的 I标记的抗-人IgE抗体检测。螨虫过敏性病人(1，2)的血清与源自克隆30的过敏原特异性反应。
来自非过敏性病人(3)的对照血清不与源自克隆30的过敏原反应。
硝化纤维条以1:10稀释的人血清(1-3)温育，结合的IgE抗体以1:10稀释的 I标记的抗-人IgE抗体检测。螨虫过敏性病人(1，2)的血清与源自克隆30的过敏原特异性反应。
来自非过敏性病人(3)的对照血清不与源自克隆30的过敏原反应。
[0062] IgE结合频率以53个螨虫过敏性个体的血清通过ELISA检测，所述个体具有指示螨虫过敏症的长期的症状、阳性SPT和屋尘螨特异性IgE-RAST。以5μg/ml源自克隆30的过敏原包被ELISA板(Nunc，Denmark)并以1:10稀释的来自螨虫过敏性病人的血清温育。人IgE结合以1:1000稀释的AKP偶联的抗-人IgE抗体(BDBiosciences-Pharmingen，NJ)检测。
[0063] 来自53个螨虫过敏性个体中的29个(55％)显示了对于源自克隆30的过敏原的IgE反应活性(表I)。
[0064] 表I源自克隆30的过敏原的IgE结合频率
[0065]具有IgE反应活性的
重组蛋白 IgE反应活性的百分率
病人数目
源自克隆30的过敏原 29(n＝53) 55
重组蛋白 IgE反应活性的百分率
病人数目
源自克隆30的过敏原 29(n＝53) 55
[0066] 实施例3：在兔子中以源自克隆30的过敏原免疫诱导IgG抗体
[0067] 为了测试源自克隆30的过敏原是否为免疫原性的，使用弗氏佐剂以新过敏原免疫兔子。使用1次完全弗氏佐剂和2次不完全佐剂(Charles River，Germany)以200μg蛋白/注射来免疫兔子3次。
[0068] 通过点杂交实验来研究IgG抗体的诱导。重组Der p2和源自克隆30的过敏原被打点至硝化纤维条(0.5μg/点)，条以1:1000、1:10,000、1:100,000和1:1,000,000稀释125
的兔子预免疫血清和抗-源自克隆30的过敏原抗血清温育。结合的IgG以来自驴的 I标记的抗兔子全抗体(Amersham)检测。
的兔子预免疫血清和抗-源自克隆30的过敏原抗血清温育。结合的IgG以来自驴的 I标记的抗兔子全抗体(Amersham)检测。
[0069] 以源自克隆30的过敏原诱导高效价的特异性IgG抗体(图4)。抗-源自克隆30的过敏原抗血清与源自克隆30的过敏原以1:100,000的稀释度特异性反应，而未观察到与Der p2的反应(图4B)。预免疫血清不与源自克隆30的过敏原和Der p2反应(图4A)。
[0070] 实施例4：兔子中以源自克隆30的过敏原诱导的IgG抗体阻断螨虫过敏性病人IgE与源自克隆30的过敏原的结合。
[0071] 兔子的源自克隆30的过敏原的特异性抗体阻断病人的IgE与过敏原结合的能力通过ELISA-抑制检测来测定。结合至ELISA板的源自克隆30的过敏原以1:100稀释的PBST/0.5％(w/v)BSA中的兔子抗-源自克隆30的过敏原抗体或预免疫血清来预温育，在4℃温育过夜。然后，将该板暴露于1:5稀释的PBST/0.5％(w/v)BSA中的来自14个螨虫过敏性病人的血清，在4℃过夜。结合的IgE抗体以1:2500稀释的PBST/0.5％(w/v)BSA中的HRP-偶联的羊抗-人IgE抗体(Kirkegaard&PerryGaithersbury，MD)来检测。抑制度通过以下计算：IgE结合的％抑制＝100-OD抗-源自克隆30的过敏原x100/OD预免疫血清。
[0072] 对于大多数病人，可以观察到IgE结合的强烈抑制，介于25-97％(平均：82％)(表II)。在一半血清中，IgE与源自克隆30的过敏原的结合被抑制90％或90％以上。
[0073] 表II.兔子抗-源自克隆30的IgG抗体抑制来自螨虫过敏性病人的血清的IgE与源自克隆30的过敏原的结合
[0074] 表II.兔子抗-源自克隆30的IgG抗体抑制来自螨虫过敏性病人的血清的IgE与源自克隆30的过敏原的结合
[0075]
[0076] 实施例5：源自克隆30的过敏原是生物活性的
[0077] 嗜碱粒细胞上CD203c的上调可用作诱导的激活和随后的嗜碱粒细胞脱粒的标记，因此可确定过敏原的致敏性活性。来自一个螨虫过敏性病人的肝素化的血液样品(100μl)与各种浓度的源自克隆30的过敏原、单克隆抗-IgE抗体(Immunotech，France)或PBS在37℃温育15分钟。通过双色流式细胞术在FACScan(Becton Dickinson，CA)上检测CD203c的表达。
[0078] 源自克隆30的过敏原在10μg/ml的浓度诱导螨虫过敏性病人的嗜碱粒细胞上CD203c表达的上调(图5)。抗-人IgE抗体(阳性对照)在1μg/ml的浓度诱导CD203c表达的上调，而阴性对照(单独的PBS)未得到上调。
[0079] 实施例6：源自克隆30的过敏原的表面暴露区域和可能的T细胞表位[0080] 一个蛋白的亲水性区域可能暴露于分子的表面并可能潜在地有抗原性。因此，源自克隆30的过敏原的表面的亲水区域可代表潜在的B细胞表位。ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)允许进行由源自蛋白30的过敏原的任何氨基酸范围所产生的疏水性图谱的计算和表达(Kyte & Doolittle)。选择窗口大小为7进行结构研究。成熟的源自克隆30的过敏原的ProtScale输出表示了一个带有很多代表亲水部分的阴性峰的蛋白(图6A)。源自克隆30的过敏原的B细胞表位位于成熟蛋白的氨基酸3-12、15-28、34-43和49-68之间。
[0081] 人免疫系统的T细胞以源自过敏原降解的短肽片段(T-细胞表位)来识别过敏原。MULTIPRED(http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/multipred/)是基于网络的计算系统，用于预测结合至属于人白细胞抗原(HLAs；人类MHC，主要组织相容性复合物)的多样的分子的多肽。在图6B中显示了“总和”超过40(单独肽与MHC分子结合分数的总和)的单独9体肽的预测结果。T细胞表位位于成熟的源自克隆30的过敏原的N-和C-末端。
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