一种表达并纯化可溶性屋尘螨主要过敏原Der p 2蛋白的方法
阅读：1010发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种表达并纯化可溶性屋尘螨主要过敏原Der p 2蛋白的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种在大肠杆菌中高可溶性表达并纯化 屋尘螨 主要过敏原Derp2蛋白的方法。本方法以大肠杆菌伴侣蛋白触发因子(TriggerFactor，TF)作为融合标签实现了Derp2的高可溶性表达并优化出高效的纯化工艺，用该方法获得的样品纯度高于98％。经验证，纯化的重组Derp2蛋白与天然提取的Derp2蛋白具有一致的二级结构折叠状态，并具有相同的屋尘螨过敏患者血清中特异性IgE结合活性。本发明所使用的融合表达方法能够实现Derp2蛋的可溶性表达，具有融合标签易于 切除 ，重组蛋白表达量高，纯化工艺简单，适合于大规模工业化生产，产物保持天然活性的优点。，下面是一种表达并纯化可溶性屋尘螨主要过敏原Der p 2蛋白的方法专利的具体信息内容。
一种表达并纯化可溶性屋尘螨主要过敏原Der p 2蛋白的
方法
技术领域
背景技术
[0002] 过敏被定义为一种对环境中无害的物质即过敏原产生不利的免疫过度反应。过敏性疾病（也称为“特应性疾病”），如花粉症，过敏性支气管哮喘，过敏性皮炎，湿疹，荨麻疹，血管神经性水肿和过敏性反应，是全球性的健康问题，影响着超过全球25％的人口。自1960年以来，全球哮喘和过敏性鼻炎的患病率有着显著的上涨。过敏性疾病仍是最常见的慢性疾病，大大影响患者的健康和生活质量，加重了社会经济负担和医疗费用。室外和室内来源的很多物质均可能导致过敏。花粉是主要的室外过敏原，室内过敏原主要由屋尘螨，动物皮屑，蟑螂和真菌孢子组成。此外，一些常见的食品例如花生、坚果、大豆、牛奶、鱼虾等也含有已确定的过敏原成分。
[0003] 过敏原进入机体后，诱发B细胞产生IgE抗体，后者以其Fc段与靶细胞（肥大细胞、碱性粒细胞）表面IgE受体FcεRI结合。IgE一旦与靶细胞结合，机体即呈致敏状态。当相同的过敏原再次进入体内，与已结合在靶细胞表面的IgE发生特异性反应，导致其产生交联并引起FcεRI构象改变而聚集，激活下游通路，启动I型超敏反应相关的细胞因子、趋化因子和粘附分子等的合成和分泌，此过程即发敏阶段。靶细胞致敏后最终会引起脱颗粒并释放炎症介质的反应，这些炎症介质包括组胺、白三烯、血小板活化因子以及前列腺素D2等，能够导致毛细血管扩张、通透性增加、平滑肌收缩以及腺体分泌增多，引起全身反应、呼吸道反应、胃肠道反应以及皮肤反应。
[0004] 尽管人们对过敏性疾病的认识已经有久的历史，但现行的过敏性疾病诊断和治疗仍存在很大的局限性。目前常用的过敏原检测方式包过敏原皮肤试验、过敏原激发试验和血清特异性IgE抗体浓度测定等，这些方法主要使用过敏原的提取物作为抗原，把过敏原提取物用于诊断过敏性疾病准确性较高，但存在明显的问题如下：（1）过敏原提取成分复杂，含有蛋白质、糖类以及核酸等成分，难以实现标准化；
（2）由于提取物中蛋白水解酶的存在导致过敏原的降解，或者降解产生不必要的有害物质带来稳定性问题；
（3）难以在总提取物中检测少量的过敏分子；
（4）难以检测患者是对单一物质过敏或是对一系列的不相关的物质过敏；
（5）由于糖抗原表位交叉反应造成的假阳性；
世界卫生组织（WHO） 对过敏性疾病的治疗提出了包含避免接触过敏原、对症治疗、脱敏治疗、患者教育四个方面的综合性方案，作为过敏性疾病治疗的基本原则。2006 年，欧洲变态反应与临床免疫学学会（EAACI）指出，脱敏治疗是唯一可能改变疾病自然进程的对因疗法，应该尽早使用，以防止受累器官的黏膜发生不可逆损伤。但是目前免疫治疗方法中使用的过敏原提取物存在比较明显的缺点：
（1）无法确定粗提取物中各过敏原成分的具体量；
（2）从各来源提取的过敏原不一致而且衡量过敏原提取物能力的单位也不一致；
（3）提取物中主要过敏原量的变化导致过敏原成分的变化和过敏强度的不同；
（4）给定的提取物中批次之间也有变化；
（5）很难标准化有效的免疫治疗过敏原的量，尤其是提取物中的次要过敏原；
（6）目前的免疫治疗在一些患者身上产生局部的、系统的、甚至致命的反应；
鉴于过敏原提取物在过敏性疾病诊断与治疗中存在的问题，因此迫切需要发展新一代的诊疗方法与技术。分子克隆与基因工程技术的出现，使得研究人员可以更加准确的鉴定、研究过敏原蛋白，并且促进重组过敏原蛋白应用在过敏性疾病诊断和治疗方面。这些重组过敏原蛋白大部分已经被证明在生化、生物、结构和免疫学方面具有和天然过敏原同等的效力。与传统的过敏原提取物相比，经过人工改造的重组过敏原具有无可比拟的优势，可以克服上述提取物的种种缺陷，并且生产成本更低。
（2）由于提取物中蛋白水解酶的存在导致过敏原的降解，或者降解产生不必要的有害物质带来稳定性问题；
（3）难以在总提取物中检测少量的过敏分子；
（4）难以检测患者是对单一物质过敏或是对一系列的不相关的物质过敏；
（5）由于糖抗原表位交叉反应造成的假阳性；
世界卫生组织（WHO） 对过敏性疾病的治疗提出了包含避免接触过敏原、对症治疗、脱敏治疗、患者教育四个方面的综合性方案，作为过敏性疾病治疗的基本原则。2006 年，欧洲变态反应与临床免疫学学会（EAACI）指出，脱敏治疗是唯一可能改变疾病自然进程的对因疗法，应该尽早使用，以防止受累器官的黏膜发生不可逆损伤。但是目前免疫治疗方法中使用的过敏原提取物存在比较明显的缺点：
（1）无法确定粗提取物中各过敏原成分的具体量；
（2）从各来源提取的过敏原不一致而且衡量过敏原提取物能力的单位也不一致；
（3）提取物中主要过敏原量的变化导致过敏原成分的变化和过敏强度的不同；
（4）给定的提取物中批次之间也有变化；
（5）很难标准化有效的免疫治疗过敏原的量，尤其是提取物中的次要过敏原；
（6）目前的免疫治疗在一些患者身上产生局部的、系统的、甚至致命的反应；
鉴于过敏原提取物在过敏性疾病诊断与治疗中存在的问题，因此迫切需要发展新一代的诊疗方法与技术。分子克隆与基因工程技术的出现，使得研究人员可以更加准确的鉴定、研究过敏原蛋白，并且促进重组过敏原蛋白应用在过敏性疾病诊断和治疗方面。这些重组过敏原蛋白大部分已经被证明在生化、生物、结构和免疫学方面具有和天然过敏原同等的效力。与传统的过敏原提取物相比，经过人工改造的重组过敏原具有无可比拟的优势，可以克服上述提取物的种种缺陷，并且生产成本更低。
[0005] 尘螨过敏原是最重要的吸入性过敏原来源之一，普遍存在于室内，户尘螨和粉尘螨是最主要的两种螨，同属于尘螨属，它们是一种普通存在的生物，肉眼一般看不见。国际上一致认为在不同的地理位置和生活环境，优势螨种分布也有不同，但是在全世界范围内，居室内最优势的螨是粉尘螨和屋尘螨。研究表明，在所有过敏患者中约有一半的人对尘螨过敏，因此国内外多家知名公司开发并上市了以尘螨提取物为主要组分的脱敏治疗产品。
[0006] 屋尘螨过敏原是引发过敏性反应最常见的过敏原之一。在已经被分离到的23种屋尘螨过敏原当中，组群1（group 1）和组群2（group 2）是极具临床意义与价值的。屋尘螨过敏原组群2（Der p 2）作为非常重要的屋尘螨过敏原，能被超过90%的屋尘螨过敏病人的血清特异性IgE (sIgE) 识别。Der p 2的分子量约为14kDa，含有3个二硫键，是一种非糖基化蛋白。它与其他屋尘螨过敏原产生于屋尘螨的消化道内，其以尘埃颗粒的形式飞扬于空气中，过敏体质者吸入后引发Ⅰ型超敏反应，从而引发特应性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、荨麻疹等过敏性疾病。目前临床上针对此类过敏性疾病的唯一对因治疗是采用尘螨过敏原疫苗进行脱敏治疗，也称过敏原特异性免疫治疗（SIT）。SIT是基于连续、反复、梯度地给予过敏患者引发过敏反应的特定过敏原，以达到改变患者对过敏原的免疫应答、对较高剂量过敏原产生免疫耐受的目的。通过基因工程技术，获得纯度高、性质单一的过敏原以应用于临床诊断及免疫治疗，是当今过敏性疾病诊疗的发展趋势。自从Der p 2 cDNA被分离和鉴定出来之后，表达重组Der p 2以应用于诊断和免疫治疗就成为可能。但是，在此之前，以细菌原核表达的Der p 2都以包涵体的形式存在，因此阻碍了重组Der p 2在实际中的应用。
[0007] 大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统，具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强，生产成本低等显著优点。在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。异源蛋白质在大肠杆菌中表达产生不溶性的包涵体经常发生，其产生原因也异常复杂。以包涵体形式产生的蛋白质因为丧失正确的空间折叠而缺乏生物活性。从包涵体中获得有生物活性的蛋白必须经过繁琐复杂的蛋白质复性过程处理，一般说来，蛋白质的复性效率极低，因此在工业中，重组蛋白的生产应该尽量避免以包涵体的形式表达。
[0008] 分子伴侣蛋白广泛存在于细菌、酵母、哺乳动物中，能够参与到多种细胞生理过程中，例如帮助蛋白质进行折叠；参与蛋白复合体的组装；参与蛋白质转运、分泌等过程。不同分子伴侣之间的相互协调共同作用，可以保证细胞内的蛋白质处于稳定平衡的状态。 触发因子(Trigger Factor，TF)是原核分子伴侣网络中的重要成员。TF具有分子伴侣活性的同时又有折叠酶活性，还能够调节蛋白折叠速度，协助蛋白质翻译之后的组装。诸多的研究表明，在TF的作用下，绝大部分蛋白质能够快速高效地完成正确的折叠，这使得TF在协助新生肽链折叠方面具有重要的作用和应用价值。
发明内容
[0009] 本发明针对目前尘螨主要过敏原Der p 2在大肠杆菌中以包涵体表达的技术不足，提供一种以TF作为标签融合可溶性表达Der p 2以及其纯化制备的方法。
[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：合成Der p 2成熟体基因序列（GenBank登录号FM177223.1，如SEQ ID NO:1所示），克隆到pCold-TFM大肠杆菌表达载体（在Der p 2 氨基端融合TF标签）。将重组质粒pCold-TFM-Der p 2转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑选单克隆菌落，16℃ IPTG诱导胞内表达，融合蛋白呈可溶性。收集菌体经超声破碎后采用Ni柱亲和层析，凝胶过滤层析，HRV-3C蛋白酶消化，和离子交换层析的方法进行纯化，最终得到与天然产物相近的高纯度Der p 2蛋白。
[0011] 与现有的技术相比较，本发明的优良效果主要表现在以下几个方面：1. 本发明所使用大肠杆菌融合表达系统实现了尘螨主要过敏原Der p 2的可溶性表达，具有表达量高，易于纯化，适用于大规模工业化生产的优点；
2. 本发明应用的Der p 2纯化工艺简单且重复性好，生产成本低，终产物纯度高；
3. 本发明方法制备的重组Der p 2具有与天然Der p 2相同的二级结构；
4. 本发明方法制备的重组Der p 2具有与天然Der p 2相同的血清特异性IgE结合能力。
附图说明
2. 本发明应用的Der p 2纯化工艺简单且重复性好，生产成本低，终产物纯度高；
3. 本发明方法制备的重组Der p 2具有与天然Der p 2相同的二级结构；
4. 本发明方法制备的重组Der p 2具有与天然Der p 2相同的血清特异性IgE结合能力。
附图说明
[0012] 图１为本发明实施条例提供的TF-Der p 2表达与Ni亲和层析SDS-PAGE电泳结果图，图最左边的为蛋白Marker条带，第１条带样品为菌体裂解物，第２条带样品为菌体裂解物上清，第２条带样品为菌体裂解物上清经过Ni亲和层析介质的穿过组分，第４条带样品为高浓度咪唑洗脱下来的TF-Der p 2融合蛋白。
[0013] 图２为本发明实施条例提供的TF-Der p 2融合蛋白经 HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75凝胶过滤层析柱纯化后的SDS-PAGE电泳结果图，图最左边的为蛋白Marker条带，第１条带样品为图１所示的Ni亲和层析柱上面洗脱下来的TF-Der p 2融合蛋白，第２条带样品为经过HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75凝胶过滤层析柱纯化后的TF-Der p 2融合蛋白。
[0014] 图3为本发明实施条例提供的HRV-3C蛋白酶切后的TF-Der p 2融合蛋白经Mono TMS 5/50 GL离子交换层析柱纯化结果，随着盐浓度的梯度增加，从层析柱上面洗脱出来两个主要的吸收峰。
[0015] 图4为本发明实施条例提供的TF-Der p 2融合蛋白经HRV-3C蛋白酶切后再经过阳离子交换层析柱纯化后的SDS-PAGE电泳结果图，图最左边的为蛋白Marker条带，第１条带样品为图２所示的凝胶过滤层析柱纯化后的TF-Der p 2融合蛋白，第２条带样品为经HRV-3C蛋白酶切消化后的TF-Der p 2融合蛋白，第３条带样品为HRV-3C蛋白酶切后的TMTF-Der p 2融合蛋白经Mono S 5/50 GL离子交换层析柱纯化收集到的第一个主峰，为含TM
有Der p 2蛋白的峰，第４条带样品为Mono S 5/50 GL离子交换层析柱纯化收集到的第二个主峰，为含有TF标签的峰。
有Der p 2蛋白的峰，第４条带样品为Mono S 5/50 GL离子交换层析柱纯化收集到的第二个主峰，为含有TF标签的峰。
[0016] 图5为本发明实施条例提供的图４中收集的Der p 2蛋白经过最后的SuperdexTM200 Increase 10/300 GL凝胶过滤层析柱纯化结果。
[0017] 图６为本发明实施条例提供的图5中收集的最终纯化Der p 2蛋白SDS-PAGE电泳结果图，图最左边的为蛋白Marker条带，第１条带样品为天然Der p 2蛋白，第２条带样品为最终纯化得到的重组Der p 2蛋白。
[0018] 图７为本发明实施条例提供的纯化重组Der p 2蛋白与天然Der p 2蛋白通过圆二色谱对其二级结构进行比较的结果。
[0019] 图８为本发明实施条例提供的纯化重组Der p 2蛋白与天然Der p 2蛋白屋在尘螨过敏病人血清中特异性IgE结合活性方面比较的结果。
具体实施方式
[0020] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0021] 1.所用材料1.1 主要试剂 DNA限制性核酸内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，Phusion超保真DNA聚合酶以及T4 DNA连接酶均为NEB公司产品；HRV-3C蛋白酶为本研究组表达纯化；质粒小量抽TM
提试剂盒及胶回收试剂盒：大连宝生物公司产品；镍琼脂糖凝胶（Ni Sepharose 6 Fast Flow）: 美国通用电气公司产品；天然Der p 2：英国Indoor Biotech公司产品；生物素标记的抗人IgE Fc 段单克隆抗体：美国Abcam公司产品；HRP标记的链霉亲和素：美国Southern Biotech公司产品；牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司产品；硝酸纤维素膜：美国颇尔公司产品；其他均为进口分装或国产分析纯试剂
1.2 主要仪器
TM TM
HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 层析柱，Mono S 5/50 GL层析柱，Superdex 200 Increase 10/300 GL柱，ÄKTA蛋白纯化仪：美国通用电气公司产品；圆二色谱仪：英国Applied Photophysics 公司产品；冷冻高速离心机：美国贝克曼库尔特有限公司产品。
提试剂盒及胶回收试剂盒：大连宝生物公司产品；镍琼脂糖凝胶（Ni Sepharose 6 Fast Flow）: 美国通用电气公司产品；天然Der p 2：英国Indoor Biotech公司产品；生物素标记的抗人IgE Fc 段单克隆抗体：美国Abcam公司产品；HRP标记的链霉亲和素：美国Southern Biotech公司产品；牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司产品；硝酸纤维素膜：美国颇尔公司产品；其他均为进口分装或国产分析纯试剂
1.2 主要仪器
TM TM
HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 层析柱，Mono S 5/50 GL层析柱，Superdex 200 Increase 10/300 GL柱，ÄKTA蛋白纯化仪：美国通用电气公司产品；圆二色谱仪：英国Applied Photophysics 公司产品；冷冻高速离心机：美国贝克曼库尔特有限公司产品。
[0022] 2. 实施方法2.1 表达质粒的构建与鉴定
检索已知的Der p 2基因序列（GenBank登录号FM177223.1）并通过人工合成的途径获得，设计上游引物（如SEQ ID NO:2所示），引入BamHⅠ酶切位点；设计下游引物（如SEQ ID NO:3所示），引入EcoRⅠ酶切位点。 以50ul的体系进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，接着94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，切胶回收纯化后进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，连接到pCold-TFM(专利申请人基于Takara公司的pCold-TF改造，将pCold-TF载体上的凝血酶以及Xa因子蛋白酶切位点删除，在HRV-3C蛋白酶切位点后加上BamHⅠ、EcoR酶切位点)表达载体，构建pCold-TFM-Der p2表达质粒，重组表达质粒经菌落PCR鉴定后测序验证。
检索已知的Der p 2基因序列（GenBank登录号FM177223.1）并通过人工合成的途径获得，设计上游引物（如SEQ ID NO:2所示），引入BamHⅠ酶切位点；设计下游引物（如SEQ ID NO:3所示），引入EcoRⅠ酶切位点。 以50ul的体系进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，接着94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，切胶回收纯化后进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，连接到pCold-TFM(专利申请人基于Takara公司的pCold-TF改造，将pCold-TF载体上的凝血酶以及Xa因子蛋白酶切位点删除，在HRV-3C蛋白酶切位点后加上BamHⅠ、EcoR酶切位点)表达载体，构建pCold-TFM-Der p2表达质粒，重组表达质粒经菌落PCR鉴定后测序验证。
[0023] 2.2 重组融合蛋白TF-Der p 2的表达将重组质粒pCold-TFM-Der p 2转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。挑单菌落接种于含100ug/ml 氨苄青霉素的LB液体培养基中，过夜培养，次日按照1%的接种量接种于新鲜LB液体培养基中，于37℃摇床中以220转/分钟摇菌至OD600为0.6到0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2 mM/L，16℃诱导表达约20小时。4℃离心（4000转/分钟，20分钟）收集菌体。细菌沉淀用30ml重悬缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，
5mM 咪唑 ，PH 8.0）重悬后冻存于-80℃备用。
5mM 咪唑 ，PH 8.0）重悬后冻存于-80℃备用。
[0024] 2.3 融合蛋白TF-Der p 2的纯化细菌沉淀重悬液于冰上解冻后经超声破碎、离心（20000转/分钟，20分钟），收集上TM
清。将上清液上样于已用重悬缓冲液平衡好的镍琼脂糖凝胶柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow），在4℃环境下结合15分钟，再用洗涤缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，
20mM 咪唑，PH 8.0）洗涤3个柱体积，去除非特异性结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，5mM 咪唑 ，PH 8.0）竞争洗脱下与镍离子结合的融合蛋白TF-Der p 2。经过镍柱初步纯化后的融合蛋白溶液上样于凝胶过滤层析色谱柱（HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 column）进一步纯化，去除分子量偏小的微量杂蛋白。
清。将上清液上样于已用重悬缓冲液平衡好的镍琼脂糖凝胶柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow），在4℃环境下结合15分钟，再用洗涤缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，
20mM 咪唑，PH 8.0）洗涤3个柱体积，去除非特异性结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，5mM 咪唑 ，PH 8.0）竞争洗脱下与镍离子结合的融合蛋白TF-Der p 2。经过镍柱初步纯化后的融合蛋白溶液上样于凝胶过滤层析色谱柱（HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 column）进一步纯化，去除分子量偏小的微量杂蛋白。
[0025] 2.4 融合标签TF的去除及Der p 2 蛋白的纯化经过镍柱、凝胶过滤层析纯化后的TF-Der p 2融合蛋白进行HRV-3C蛋白酶酶切，酶切后的蛋白液置换缓冲液为离子柱上样缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4，20mM NaCl，1mM TM
EDTA，PH 6.4），然后上样于阳离子交换柱（Mono S 5/50 GL column），采用离子柱洗脱缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4，1M NaCl，1mM EDTA，PH 6.4）进行线性梯度（在20个洗脱柱体积内，洗脱缓冲液的比例由0增加到50%）洗脱。洗脱下来的Der p 2蛋白纯度进行SDS-PAGETM
分析。该步骤获得的Der p 2蛋白经过Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进一步纯化，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析纯度。
EDTA，PH 6.4），然后上样于阳离子交换柱（Mono S 5/50 GL column），采用离子柱洗脱缓冲液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4，1M NaCl，1mM EDTA，PH 6.4）进行线性梯度（在20个洗脱柱体积内，洗脱缓冲液的比例由0增加到50%）洗脱。洗脱下来的Der p 2蛋白纯度进行SDS-PAGETM
分析。该步骤获得的Der p 2蛋白经过Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进一步纯化，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析纯度。
[0026] 2.5 重组Der p 2蛋白二级结构分析将纯化好的重组Der p 2蛋白置换缓冲液为1×PBS，与购买的天然Der p 2(溶于PBS当中)同时稀释至终浓度为20 uM，进行圆二色谱分析。光谱分析在购于应用光物理公司（英国）的圆二色分析仪上进行，以PBS为空白对照，设定分辨率为1nm/min，光径为10mm，以
100nm/min的扫描速度，记录200nm到280nm段的圆二色光谱，比较重组Der p 2、天然Der p 2在二级结构上的差异。
100nm/min的扫描速度，记录200nm到280nm段的圆二色光谱，比较重组Der p 2、天然Der p 2在二级结构上的差异。
[0027] 2.6 重组蛋白重组Der p 2与屋尘螨过敏病人血清中特异性结合活性分析含有0.2ug的等体积（2 ul）重组Der p 2、天然Der p 2蛋白点样于硝酸纤维素膜上，同时以BSA作为阴性对照。待样品干燥后，以5%BSA-TBST室温下封闭1小时，接着以1：10稀释的尘螨过敏病人的血清室温下孵育30分钟，同时以非过敏健康者1：10稀释血清及
5%BSA-TBST为阴性对照，按照等同条件孵育。孵育完成后，以1%TBST洗膜，每次10分钟，连续3次。接着以1：3000稀释好的生物素标记的抗人IgE Fc段单克隆抗体室温下孵育30分钟，孵育完成后洗膜（同上）。最后以1：5000稀释的HRP标记链霉亲和素室温下孵育30分钟，洗膜，加底物显色曝光成像。
5%BSA-TBST为阴性对照，按照等同条件孵育。孵育完成后，以1%TBST洗膜，每次10分钟，连续3次。接着以1：3000稀释好的生物素标记的抗人IgE Fc段单克隆抗体室温下孵育30分钟，孵育完成后洗膜（同上）。最后以1：5000稀释的HRP标记链霉亲和素室温下孵育30分钟，洗膜，加底物显色曝光成像。
[0028] 3 结果与分析3.1 重组pCold-TFM-Der p 2表达质粒的鉴定
重组质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定及菌落PCR鉴定，均能在400bp左右的位置见到条带，大小与理论值相符；表达质粒经过测序验证，序列与已知Der p 2序列（GenBank登录号FM177223.1）一致。
重组质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定及菌落PCR鉴定，均能在400bp左右的位置见到条带，大小与理论值相符；表达质粒经过测序验证，序列与已知Der p 2序列（GenBank登录号FM177223.1）一致。
[0029] 3.2 重组融合蛋白TF-Der p 2的诱导表达与纯化含有表达质粒的BL21（DE3）菌株诱导20小时后超声破碎提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果显示，全部的融合蛋白以可溶性的形式存在于离心后上清液中。
经过镍柱亲和层析后能捕获大部分的融合蛋白，将与镍离子结合的融合蛋白用250mmol/L的咪唑溶液洗脱下来，进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色分析，结果显示大部分杂蛋白被去除（如图1所示）。经过镍柱纯化后的融合蛋白再经分子筛纯化（HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 column），结果显示融合蛋白的纯度进一步提高（如图2所示）。
经过镍柱亲和层析后能捕获大部分的融合蛋白，将与镍离子结合的融合蛋白用250mmol/L的咪唑溶液洗脱下来，进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色分析，结果显示大部分杂蛋白被去除（如图1所示）。经过镍柱纯化后的融合蛋白再经分子筛纯化（HiLoad™ 16/600 Superdex™ 75 column），结果显示融合蛋白的纯度进一步提高（如图2所示）。
[0030] 3.3 融合标签的去除及Der p 2蛋白的纯化在由步骤2.2得到的TF-Der p 2蛋白溶液中加入适量HRV-3C蛋白酶进行酶切，酶切后SDS-PAGE结果显示，在分子量14000左右的位置处有蛋白条带出现，与Der p 2分子量的理论值相符。酶切后蛋白液经过阳离子柱线性洗脱后，出现两个蛋白主峰，将两个主峰样品进行SDS-PAGE电泳分析，显示第一个主峰（如图3所示箭头所指）就是重组Der p 2，考马斯亮蓝染色分析显示纯化后的重组Der p 2纯度在90%以上（如图4所示）。该步骤获得TM
的Der p 2蛋白经过Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进一步纯化（如图5所示），经SDS-PAGE电泳分析纯度大于98%（如图6所示）。
的Der p 2蛋白经过Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进一步纯化（如图5所示），经SDS-PAGE电泳分析纯度大于98%（如图6所示）。
[0031] 3.4 重组Der p 2的二级结构分析圆二色谱分析显示，重组Der p 2与天然Der p 2的图谱几乎完全重合，证明大肠杆菌重组表达的可溶性重组Der p 2能够正确折叠，其二级结构与天然Der p 2无明显差异（如图7所示）。
[0032] 3.5 重组蛋白重组Der p 2的免疫活性测定Dot-blot实验结果显示，重组Der p 2与11例屋尘螨过敏病人血清中特异性IgE结合活性同天然Der p 2无明显差异（如图8所示），且具有一致的趋势，信号的强弱与血清特异性IgE的含量变化一致，证明大肠杆菌重组表达的可溶性重组Der p 2具备完好的免疫活性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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