疫苗载体
阅读：662发布：2020-05-25
专利汇可以提供疫苗载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 疫苗 载体。进一步地，本发明涉及低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性分子组成，该低变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其 片段 融合或结合。，下面是疫苗载体专利的具体信息内容。
1.一种低变应原性蛋白，其由至少一个源自主要屋尘螨变应原的低变应原性分子和至少一个另一种源自病原体的非变应原性蛋白组成，其中所述低变应原性分子与所述至少一个另一种源自病原体的非变应原性蛋白融合，其中至少一个源自主要屋尘螨变应原的低变应原性分子呈现出与野生型变应原相比至少降低50%的Ig-E结合能力和至少降低30%的T-细胞反应性，其中，至少一个另一种蛋白是病毒蛋白。
2.根据权利要求1所述的低变应原性蛋白，其特征为该病毒蛋白是RNA或DNA病毒蛋白。
3.根据权利要求2所述的低变应原性蛋白，其特征为该病毒蛋白是衣壳蛋白。
4.根据权利要求2或3所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个病毒蛋白源自人类致病性病毒。
5.根据权利要求4所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个病毒蛋白源自微小核糖核酸病毒科家族的病毒。
6.根据权利要求5所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个病毒蛋白源自鼻病毒种。
7.根据权利要求6所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个病毒蛋白源自人类鼻病毒种。
8.根据权利要求7所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个病毒蛋白源自人类鼻病毒89或14。
9.根据权利要求1至3或5至8任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为所述的主要屋尘螨变应原选自Der p1、Der p2、Der p5、Der p7、Der p10、Der p21和克隆30。
10.根据权利要求9所述的低变应原性蛋白，其特征为至少一个源自主要屋尘螨变应原的低变应原分子是由下列氨基酸组成的变应原片段：Der p 2的1至33、21至51、42至
73、62至103或98至129位氨基酸，Der p 7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Der p 10的1至35、36至70、71至110、111至145、140至
170、175至205、210至250或250至284位氨基酸，Der p 21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸。
11.根据权利要求1至3、5至8或10任一项所述的低变应原性蛋白在制备用于治疗或预防人类或动物中病毒感染和/或过敏症的药物的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征为该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg体重的数量向个体使用。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征为该药物以0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的数量向个体使用。
14.一种编码如权利要求1至3、5至8或10任一项所述的融合的低变应原性蛋白的核酸分子。
15.一种包含如权利要求14所述核酸分子的载体。
16.一种包含如权利要求14所述核酸分子或如权利要求15所述载体的宿主细胞。
17.一种包含如权利要求1至3、5至8或10任一项所述低变应原性蛋白的疫苗制剂。
18.根据权利要求1至3、5至8或10任一项所述低变应原性蛋白在制备用于诊断个体中过敏症和/或病毒感染的药物的用途。
疫苗载体
技术领域
[0002] 本发明涉及新型低变应原性分子及其用途。
背景技术
[0003] I型过敏症是IgE介导的超敏性疾病，其影响大约25%的人口。它是基于特异性免疫球蛋白E对无害的空中传播的、昆虫、毒液、食物变应原和接触变应原抗原（源自本身无害的抗原来源，例如花粉、昆虫、霉菌和动物蛋白）的识别。与效应细胞结合的IgE抗体的交联引起炎性调节子（例如组胺，白细胞三烯（leucotrienes））的释放并因此引起过敏症的即刻症状（例如，鼻结膜炎、哮喘、皮炎、过敏反应）。通过IgE依赖性和IgE非依赖性机制进行的T细胞激活有助于慢性过敏性炎症。
[0004] 过敏症治疗的可能的唯一致使形式为变应原特异性免疫治疗，其基于反复使用渐增数量的大多数来源的变应原提取物。很多临床研究证明了注射免疫治疗的临床功效，并有这种治疗下的几种免疫机理的证据。由于制备来自某些变应原来源的高质量变应原提取物的困难，以及向病人使用变应原会引起严重的副作用的事实，只能够向某些病人组和疾病表现来推荐变应原特异性免疫治疗。治疗对几种不同变应原来源共同敏感的病人以及遭受严重疾病表现例如过敏性哮喘的病人是特别困难的。过敏性哮喘是过敏症最严重的表现之一，因为它严重影响日常生活质量，引起高入院率，其表现为严重的、威胁生命的形式，需要对病人的深切关注。
[0005] 从天然变应原来源制备的变应原提取物性质上是粗糙的，不可能通过技术手段影响这种制备物中的个别变应原的质量和数量。它们也含有各种不明确的非变应原性成分，几项最近的研究表明了这种提取物的劣质并证明了它们的高异质性。
[0006] 在过去的十年中，使用重组DNA技术在分子变应原鉴定领域取得了巨大进步。很大数量的引起疾病的最重要的变应原已被鉴定至分子水平，已经生产出模拟天然变应原提取物表位复杂性的重组变应原。而且，几个研究小组已经使用已知的关于变应原结构的知识发展了确定的新的过敏症疫苗。已经使用遗传工程、合成肽化学和变应原与免疫刺激DNA序列的结合来减少新疫苗的变应原性活性，并因此减少治疗诱导的副作用率。以这种变应原衍生物进行了第一个有前景的临床研究。有趣的是，虽然可以强烈减少或甚至消除遗传工程化重组变应原和源自变应原的合成的包含T细胞表位的肽的IgE反应活性，但是这些衍生物仍然可以诱导全身性副作用（出现于注射几小时后）。例如，有报道指出，在皮内注射几个小时以后，主要猫变应原Fel d1的T细胞表位肽诱导了哮喘和支气管的高反应性，且有力证据表明，这种效应是T细胞介导的和MHC限制性的。
[0007] 这些结果表明，除去IgE反应活性可减少IgE介导的副作用，因为在这些免疫治疗研究的过程中未记录到即现反应。但是，变应原特异性T细胞表位（被保留在重组变应原衍生物以及肽混合物中）是造成延迟的副作用（例如非常有问题的或过敏性皮炎，慢性T细胞介导的过敏性皮肤表现）的原因。在重组变应原衍生物的情况下，所引起的副作用相对轻微，在T细胞肽疫苗的情况下可通过足够的剂量来克服。因此这两种新方法似乎对过敏性鼻结膜炎的免疫治疗都是有前景的，但对于治疗严重形式的过敏性哮喘（其中肺中的延迟副作用的诱导可能是非常有问题的）可能具有局限性。
[0008] 为了使用并因此激发针对肽、多肽和蛋白的有效免疫反应，通常使用佐剂和/或载体。例如，完全氟氏佐剂，是一种可获得的最有力的佐剂。但是，由于其副作用，不允许用于人类。因此，需要能够诱导针对肽和多肽（源自变应原，当然，和其他抗原）的强烈免疫反应的疫苗组合物，以避免使用完全氟氏佐剂。而且，虽然在一个动物模型中已成功使用BSA作为载体，它可能不适宜用于人类疫苗组合物，因为具有有害反应的风险，例如传播朊病毒病（变异型克雅氏病，（variant Creutzfeldt-Jakob disease））的风险。发展有效的针对变应原疫苗的一个进一步挑战是需要能够迅速降低个体或动物中变应原的免疫反应。因此，需要血液中高浓度的变应原特异性抗体（主要是IgG亚型）。在粘膜表面IgA抗体是主要的亚型。
[0009] 霍乱毒素（一个现有技术中已知的载体蛋白），通常也用作佐剂，减少疫苗组合物中完全氟氏佐剂的需要。但是，霍乱毒素增加总的和特异性的IgE抗体水平，并引起IgE相关的炎性反应。
[0010] 由于大多数用于疫苗的载体蛋白所激发的副作用，需要能够刺激针对变应原或其他抗原免疫反应的载体系统，而不使用毒性佐剂，不使用较差耐受的载体蛋白，并且，在一些情况下，不刺激潜在的致病性免疫反应。满足这些特性的新型载体系统可被用于形成适合于治疗或预防疾病（例如过敏性疾病）的新型佐剂和组合物。
[0011] Bohle B.等人（J.Immunol.172（11）（2004）:6642-6648）描述了一种包含S-层蛋白（S-layer protein）半体和Bet v1半体的重组融合蛋白。这个分子包含天然的高变应原性Bet v1蛋白。
[0012] WO2004/004761涉及融合至免疫原的病毒样颗粒，可用于免疫。
[0013] 在WO2004/003143中揭示了一种融合蛋白（包含病毒样颗粒和高变应原性分子）作为免疫原用于接种疫苗的用途。
发明内容
[0015] 因此，本发明涉及低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性分子组成，该低变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其片段融合或结合。
[0016] 为了激发针对分子，特别是本发明所述的低变应原性分子的加强的免疫反应，所述分子被融合至（通过遗传工程）或结合至（通过化学反应）载体。常规和通常使用的载体为例如KLH（钥孔戚血蓝素，keyhole limpet hemocyanin）。KLH（分离自巨大海洋软体动物Megathura crenulata）是最常见的用于产生用来注射的免疫原的载体蛋白之一。由于具有高质量并且为非哺乳动物蛋白，KLH诱导强烈的抗体反应。
[0017] 融合至或结合至本发明的低变应原性分子的另一个蛋白（“载体”或“载体蛋白”）是非源自变应原的（“非变应原性”）。但是，当向动物或人体使用时，本发明中所用的载体蛋白可表现出T细胞反应活性，和/或激发针对其自身以及与其融合或结合的低变应原性分子的免疫反应。因此，如果载体蛋白源自病原体（例如病毒，细菌等），则产生针对所述抗体和病原体的（保护性）抗体。
[0018] 如这里所用的“低变应原性蛋白”意思是非变应原性来源的载体与低变应原性分子的融合蛋白/多肽。而且，“低变应原性蛋白”也指载体与低变应原性分子的结合产物（例如，化学偶联，吸附）。
[0019] 如这里所用的“低变应原性”是指具有减少的变应原性潜力的分子。这样的分子与野生型蛋白（即这些分子所源自的蛋白）相比，在个体中具有降低的激发过敏性反应的能力。
[0020] 优选地，至少一个源自变应原的并与另一个蛋白融合/结合的低变应原性分子为C-和/或N-末端截尾。如这里所用的“C-和/或N-末端截尾”意思是来自野生型变应原的N-末端或C末端-或N-和C-末端的氨基酸残基通过删除至少1、2、3、4、5、7、10、15、20、30个氨基酸残基被除去。
[0021] 低变应原性分子，即肽/多肽，优选为包含10至50个氨基酸，更优选为15至40个氨基酸，特别地，20-30个氨基酸，并且表现出减少的IgE反应活性。将这些分子设计为不包含T细胞表位（其可能引起T细胞介导的副作用）。T细胞表位和表现出减少的T细胞反应的分子可通过本领域技术人员已知的方法确定和鉴别（例如,Bercovici N.等人Clin Diagn Lab Immunol.（2000）7:859-864）。
[0022] 发现可能使用表面暴露肽来设计源自变应原（如主要草花粉变应原例如Phl p1和主要桦树花粉变应原，Bet v1）的肽疫苗。获得的数据表明可针对任何变应原（根据IgE表位制图，三维结构数据或电脑辅助的表面暴露结构域预测，这些变应原的主要结构是已知的）来生产这些肽疫苗。但是，选择可用于疫苗的合适的肽仍然是关键的，因为不是所有的经过这些方法鉴定的肽都可用于疫苗。适合于疫苗目的的肽需要表现出减少的IgE结合能力，以及为了减少或避免延迟的副作用而需要表现出减少的T细胞反应活性。
[0023] 如这里所用的术语“源自变应原”意思是根据本发明所述的低变应原性分子通过裂解或截断从变应原直接获得。优选地，本发明的低变应原性分子的氨基酸序列与野生型变应原（这些低变应原性分子所源自的）的氨基酸序列的一段（stretch）至少80%是同源的，更优选为至少90%同源，最优选为至少95%同源，特别地为100%同源。但是，不与野生型变应原片段100%同源的分子需要能够以至少60%，优选为至少70%，更优选为至少80%，最优选为至少90%的能力结合至抗体（antibody）或抗体（antibodies），优选为针对所述野生型变应原片段的IgG抗体。
[0024] 一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同源度可通过使用一定的算法直接对比两个氨基酸序列来确定。这样的算法为例如，嵌合在各种计算机程序中（例如 "BLAST2SEQUENCES（blastp）"（Tatusova 等 人 .（1999）FEMS Microbiol.Lett.174:247-25;Corpet F,Nucl.Acids Res.（1988）16:10881-10890）。
[0025] 根据本发明所述的截尾分子可被定义为完全变应原的一部分，其比完全野生型变应原引起较少的变应原特异性T细胞激活（优选为至少30%，更优选为至少50%，最优选至少70%的减少），表现出减少超过50%的变应原性活性（优选为超过70%，按照IgE结合测试所估计）和诱导IgE介导的细胞激活的能力，并且当与所描述的载体偶联时，诱导产生IgG抗体，该IgG抗体抑制来自过敏性病人的多克隆IgE与完全野生型变应原的结合。
[0026] 该肽应该含有来自变应原的序列以避免与模拟位（mimotope）的重叠。但是，模拟位（抗原碎片的小的肽模拟物，小于15个氨基酸，从随机肽文库中获得）不代表如此处所定义的原始的、源自变应原的分子。根据本发明不能使用它们，因为它们太小以致于不能诱导强有力的阻断IgG反应。
[0027] 根据本发明所述的低变应原性分子可通过重组方法或化学合成来获得。或者，当然也可能通过酶法或化学切割野生型变应原或容纳（harbour）感兴趣分子的多肽/蛋白来获得。
[0028] 优选地，低变应原性分子可包含至少两个截尾的变应原分子（源自至少一个变应原），其中，如果该至少两个分子源自相同变应原的话，截尾的变应原片段的顺序与野生型变应原中片段的顺序不同。
[0029] 根据本发明所述的低变应原性分子可包含一个或一个以上（优选为至少2个，更优选为至少3个）如此处所定义的低变应原性分子，因此，形成融合蛋白。该融合蛋白中的单个低变应原性分子（当然也缺少IgE结合能力并缺少T细胞表位），可源自相同和/或不同来源的变应原。如果分子源自相同的变应原，低变应原性融合蛋白中的顺序应与野生型变应原中的顺序不同（这防止了IgE结合位点的还原和形成）（参见例如WO2004/065414,Linhart B和Valenta R（Int Arch AllergyImmunol.（2004）134:324-31））。
[0030] 根据本发明的一个优选具体实施方式，至少一个低变应原性分子融合至所述至少一个另一个蛋白或其片段的N-末端和/或C-末端。
[0031] 变应原或其片段可通过化学或重组方法与彼此结合。如果变应原或其片段与载体以化学方式结合，应该给所述变应原或其片段提供一个末端半胱氨酸残基（形成一个自由巯基基团）。任何马来酰亚胺激活的载体蛋白可结合至所述末端（N-或C-末端）半胱氨酸残基，因此产生一个免疫原/载体复合物。如果变应原或其片段在末端没有巯基基团，可应用EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐）化学以把胺（赖氨酸）或羧基酸（谷氨酸、天冬氨酸或5’-磷酸盐）结合至载体蛋白。
[0032] 如果低变应原性分子融合至载体的N-或C-末端，则使用重组方法。
[0034] 至少一个另一个蛋白（“载体”）可以是任何以上提及的来源。但是，特别优选为使用激发免疫反应的蛋白，所述免疫反应为针对该蛋白本身及低变应原性分子所融合或结合的。由于也针对至少一个另一个蛋白的（保护性）抗体形成的诱导，根据本发明所述的低变应原性蛋白可也可用作针对所述另一个蛋白和其发生起源（例如病毒、细菌、真菌）的疫苗。当然，也可能使用本领域熟知的载体蛋白（例如KLH）作为至少一个另一个蛋白。
[0035] 根据本发明所述的病毒蛋白优选为衣壳蛋白。
[0036] 病毒衣壳蛋白是特别合适的，因为它们诱导抗病毒活性，激发抗体（阻断病毒例如鼻病毒吸附至内皮细胞）的形成，表现出针对Th1反应的免疫调节活性，增加肽的免疫原性（例如，较高的抗-肽，由此较高水平的保护性IgG抗体），是被证实适合于预防性疫苗（病毒疫苗），并且是安全的（当衣壳蛋白用于持续暴露的人（例如鼻病毒）时）。
[0037] 根据本发明的另一个优选具体实施方式，至少一个病毒衣壳蛋白源自人类致病性病毒，优选为微小核糖核酸病毒科家族的病毒。
[0038] 微小核糖核酸病毒科家族的病毒优选为鼻病毒属，优选为人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89和14。衣壳蛋白可以是VP1、VP2、VP3和/或VP4。
[0039] 融合至病毒衣壳蛋白的变应原优选为选自主要桦树花粉变应原（特别是Bet v1和Bet v4）、主要牧草花粉变应原（特别是Phl p1、Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7）、主要屋尘螨变应原（特别是Der p1和Der p2）、主要猫变应原Fel d1、主要蜜蜂变应原、主要黄蜂变应原、前纤维蛋白（特别是Phl p12）或储藏室尘螨变应原（特别是Lep d2）。
[0040] 其他根据本发明所用的合适变应原可源自下表。
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[0281] 根据本发明的一个优选具体实施方式，低变应原性分子表现出减少的IgE结合能力。
[0282] 根据本发明的另一个优选具体实施方式，低变应原性分子表现出减少的T细胞反应活性。
[0283] 但是，在根据本发明所述的低变应原性分子中也可使用包含至少一个T细胞表位的变应原片段。
[0284] 如这里所用的“表现出减少的IgE结合能力”意思是，根据本发明所述的分子显示出显著减少的IgE结合能力或活性（与野生型变应原相比，结合能力至少减少50%，优选为至少减少70%，更优选为至少减少80%，再更优选为至少减少90%，最优选为至少减少95%）或甚至完全缺失。
[0285] 分子（像肽和蛋白）的IgE结合活性/能力可通过例如酶联免疫吸附测试（ELISA）使用例如从曾经暴露于野生型变应原的个体（例如过敏性个体）获得的血清来确定。简单来说，将待测肽包被至微量滴定板的孔中。洗涤并封闭孔后，以抗体溶液（由过敏性个体的血浆组成，该个体曾暴露于所测肽或由其制备的蛋白）在孔中温育。向孔中加入标记的二抗并温育。然后IgE结合的数量被定量并与纯化的野生型变应原的IgE结合相比较。
[0286] 或者，肽的结合能力可通过Western杂交分析确定。例如，使用SDS-PAGE将所测肽在聚丙烯酰胺凝胶中分析。然后将该肽转移至硝化纤维，接下来以来自过敏性个体的血清温育。经标记的二抗温育后，所结合的IgE数量被确定和定量。
[0287] 另外一个可用于确定肽的IgE结合活性的测试为ELISA竞争测试。简单来说，通过混合来自过敏性个体（通过直接ELISA表明其与野生型变应原有IgE反应活性）的血浆产生一个IgE抗体库。在ELISA竞争测试中使用这个库将野生型变应原的IgE结合与所测肽相比较。野生型变应原和所测肽的IgE结合被确定并定量。
[0288] “T细胞表位”意思是蛋白（例如变应原）或其片段，对于它T细胞具有抗原特异性结合位点，结合至所述结合位点的结果为激活该T细胞。如这里所用的术语“表现出减少的T细胞反应活性”是指分子表现出T细胞反应活性，使用本领域已知的标准测试中的等摩尔量，与野生型变应原（低变应原性分子源自该野生型变应原）所诱导的刺激相比，所述反应活性显著性减少（减少的T细胞反应活性意味着，在等摩尔数量下，与野生型变应原相比，低变应原性分子的刺激减少至少30%，优选为至少50%，更优选为至少70%，最优选为至少90%）。在本发明的一个特别具体实施方式中，该分子可“缺少”T细胞表位，因此在待处理的个体（即，将接受表位呈递价态分子）中分子显示出减少的T细胞反应活性。例如可能是，源于变应原的分子相对于一个个体或一组个体为缺少T细胞表位，但相对于其他个体则具有T细胞表位。检测T细胞表位存在的方法在本领域是已知的，包括检测T细胞增殖的测试（例如胸苷摄入）。不能诱导统计学上显著高于背景（即，使用标准的统计学方法，通常p小于0.05）的胸苷摄入的免疫原通常被认为是缺少T细胞表位，虽然将意识到，胸苷摄入的定量数量可依赖于所测的免疫原而变化（参见例如,Zhen L.等人（Infect Immun.（2003）71:3920-3926））。通常，低于大约2-3的刺激指数（更优选为低于大约1）表明缺少T细胞反应活性和表位。也可根据标准方法通过测定源自T细胞的淋巴因子的分泌来确定T细胞表位的存在。可通过将受刺激细胞的增殖率（胸苷摄入）除以只在培养液中的未刺激细胞的增值率来计算刺激系数（SI）。SI=1意味着无刺激，SI<1意味着毒性效应，SI>1意味着对细胞的刺激。可通过经验确定T细胞表位的位置和内容（如果存在的话）。
[0289] 除了T细胞的刺激，还可确定细胞因子的分泌。例如，IFN-γ已被识别为有害细胞因子。其他的例子可以是TNF-α、IL-5、IL-4、IL-8等。
[0290] 优选地，变应原片段由下列组成：Phl p1的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，Phl p5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸，Fel d1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Fel d1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸，Bet v1的30至59、50至79或75至104位氨基酸，Der p2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Der p10的1-35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸，Der p21的
1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alt a1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至
60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、
373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、
303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至
145或135-174位氨基酸，Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的
31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至
333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alt a1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至
60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、
373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、
303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至
145或135-174位氨基酸，Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的
31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至
333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
[0291] 以上所列源自变应原的分子的具体氨基酸序列为：
[0292]
[0293]
[0294]
[0295]
[0296] 术语“其片段”和“其序列变体”是指从此处披露的源自变应原分子所导出的肽，其表现出与所述源自变应原分子相当的或相同的生物化学特性（例如，防止IgE与变应原（那些分子所源自的变应原）结合的能力）。本发明所述的片段包含至少5个，优选为至少7个，更优选为至少10个连续的，和/或最大为95%，优选的最大为90%，更优选的最大为80%的源自变应原的分子的氨基酸残基。术语“序列变体”包括对肽进行的修饰例如片段化（参上）、氨基酸取代（例如以其他天然或非天然的氨基酸或氨基酸衍生物）、去除或加入。“序列变体”也指上表中的所述源自变应原的分子，其中至少1个，优选为至少2个，更优选为至少3个，再更优选为至少4个（5、6、7、8、9、10、15、20）个氨基酸残基被加入到C-和/或N-末端。
[0297] 注意到克隆30变应原是源自屋尘螨Dermatophagoides pteronyssinus的变应原，由以下序列组成：MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT（SEQ ID No.140;也参见AT A733/2006）。
[0298] 根据本发明，肽也是环绕的（encompassed），其与以上所披露的氨基酸序列为至少80%，优选为90%同源。
[0299] 本发明的另一个方面涉及编码根据本发明所述的融合的低变应原性蛋白的核酸分子。
[0300] 本发明的另一个方面涉及包含本发明所述的核酸分子的载体。
[0301] 所述载体优选为表达载体。
[0302] 容纳本发明所述核酸分子的载体可用于克隆目的或用于生产表达载体。所述载体可以是质粒、粘粒（cosmid）、病毒、噬菌体或任何其他遗传工程中通常使用的载体，并且，除了本发明所述的核酸分子外，还可包括控制表达的真核或原核元件，例如用于转录和/或翻译启动和终止的调节序列、增强子、启动子、信号序列等。
[0303] 根据本发明的一个优选具体实施方式，该载体是细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。
[0304] 优选地，本发明所述的载体可用于在各种宿主中克隆和表达的目的。因此，所述载体除了编码本发明所述的低变应原性分子或融合蛋白之外，还包含宿主特异性调节序列。
[0305] 本发明的另一个方面涉及包含本发明所述核酸分子或载体的宿主。
[0306] 根据本发明所述的核酸分子和载体可被引入合适的宿主。所述分子可被引入该宿主的基因组。该载体可在胞质中以染色体外的形式存在或被引入宿主的染色体。
[0307] 本发明的另一个方面涉及针对本发明所述低变应原性分子、低变应原性融合蛋白或融合蛋白的抗体。
[0308] 根据本发明的一个优选具体实施方式，抗体是单克隆或多克隆抗体。
[0309] 根据本发明所述的抗体包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段和任何以上的表位结合片段。而且，抗体被认为是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点(与抗原免疫特异性地结合)的分子。优选地，本发明所述的免疫球蛋白分子为IgG、IgM、IgD、IgA和IgY型，免疫球蛋白分子的类（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。
[0310] 多克隆抗体可通过向非人类的哺乳动物使用本发明所述多肽（优选为使用佐剂）并收集所产生的抗血清来制备。可通过一段时间的重复注射来获得改善的效价。对于引起抗体的哺乳动物种没有特别限制；通常优选使用兔子或天竺鼠，但是也可使用马、猫、狗、山羊、猪、大鼠、母牛、绵羊、骆驼等。在制备抗体时，将确定数量的本发明所述免疫原用例如生理盐水溶液稀释至合适的浓度，将得到的稀释溶液与例如完全弗氏佐剂混合以制备悬浮液，或与矿物胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类（pluronic polyols）、聚阴离子、肽、油乳状液、钥孔戚血蓝素、二硝基酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG（卡介苗，bacille Calmette-Guerin）和短小棒状杆菌（corynebacterium parvum）混合。每次使用大约50μg至大约2500μg的本发明所述多肽通过例如腹膜内方式向哺乳动物例如兔子使用悬浮液和混合物。优选地，在大约2-3个月的时间内，优选大约1个月每2周使用一次悬浮液以引起免疫。在最后一次施药1至2周后，通过从免疫的动物中收集血液，离心血液并从血液中分离血清来重新获得抗体。
[0311] 单克隆抗体可以是例如人源或鼠源的。鼠单克隆抗体可由 和Milstein的方法（ G.和Milstein,C.,Nature256（1975）495）来制备，例如通过将超免疫小鼠的脾细胞与合适的鼠骨髓瘤细胞系融合。
[0312] 嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物种的分子，这样的抗体具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区。产生嵌合抗体的方法在本领域是已知的。参见例如Morrison,Science229:1202（1985）;Oi等人,BioTechniques4:214（1986）;Gillies等人,（1989）J.Immunol.Methods125:191-202;US5,807,715;US4,816,567和US4,816,397。
[0313] 人源化抗体是与所需的抗原结合的来自非人物种抗体的抗体分子，其具有来自该非人物种的一个或一个以上补体决定区（CDR）和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区的框架残基被来自CDR供体抗体的相应残基替代，以改变（优选为改善）抗原的结合。这些框架取代物通过本领域熟知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基之间的相互作用来鉴定对抗原结合重要的框架残基，通过序列比对来鉴定特定位置不正常的框架残基（参见例如,Queen等人,US5,585,089;Riechmann等人,Nature332:323（1988））。可使用本领域已知的众多方法将抗体人源化，例如，CDR-移植（CDR-grafting）（EP239,400;WO91/09967;US5,225,539;US5,530,101;和US5,585,089）,镶饰（veneering）或重塑（resurfacing）,（EP592,106;EP519,596;Padlan,Molecular Immunology28（4/5）:489-498（1991）;Studnicka 等 人 ,Protein Engineering7（6）:805-814（1994）;Roguska. 等人,PNAS91:969-913（1994））,和链穿梭（chain shuffling）（US5,565,332）。
[0314] 根据本发明所述的抗体可有利地用于遭受过敏症（特别是遭受屋尘螨过敏症）个体的脱敏（desensitization）。对于被动免疫，抗体优选为IgG或其衍生物（例如嵌合或人源化抗体）。而且，抗体也可被用于个体的脱敏（desensibilisation）。
[0315] 本发明的另一个方面涉及包含本发明所述低变应原性蛋白或抗体的疫苗制剂。
[0316] 根据本发明所述的疫苗制剂可以本领域已知的方式制成，并必要地适应于所述疫苗制剂的使用方式。
[0317] （本发明的）疫苗制剂的优选使用方式包括通常的为疫苗接种所描述和建议的所有标准使用制度以及特异的过敏症免疫治疗（口服、经皮、静脉内、鼻内、经粘膜、直肠等）。但是，特别优选为经皮下或肌内使用本发明所述的分子和蛋白。
[0318] 本发明所述的疫苗制剂可只包含鼻病毒属成员的病毒衣壳蛋白或其片段。
[0319] 优选地所述制剂进一步包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
[0320] 为了增加本发明所述的低变应原性分子的免疫原性，可在本发明所述的药物中使用例如佐剂。根据本发明所述的佐剂为辅助性试剂，当与抗原一起或平行使用时，增加其免疫原性和/或影响免疫反应的质量。因此，佐剂可例如相当地影响体液或细胞免疫反应的程度。通常的佐剂为例如铝化合物、含脂化合物或灭活的分支杆菌。
[0321] 通常，佐剂可以是不同的形式，只要它们适合于向人类使用。这些佐剂的其他例子为矿物或植物来源的油乳状液、矿物化合物例如磷酸铝或氢氧化铝，或磷酸钙、细菌产物和衍生物，例如P40（源自肉芽肿棒状杆菌（Corynebacterium granulosum）的细胞壁）、单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A,MPL,LPS的衍生物）和胞壁酰肽（muramyl peptide）衍生物及其结合物（衍生自分支杆菌成分）、明矾、不完全氟氏佐剂、静脉脂肪乳剂（liposyn）、皂角苷、鲨烯等（参见例如GuptaR.K.等人（Vaccine11:293-306（1993））和Johnson A.G.（Clin.Microbiol.Rev.7:277-289）。
[0322] 根据本发明的另外一个优选具体实施方式，所述疫苗制剂包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述低变应原性分子或抗体。
[0323] 本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性蛋白或抗体在制备用于治疗或预防人类或动物中病毒感染和/或过敏症的药物的用途。
[0324] 所述药物优选为进一步包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
[0325] 根据本发明所述的药物可用于主动（使用本发明的低变应原性蛋白和/或分子）以及被动（针对本发明所述低变应原性蛋白和/或分子的抗体）免疫。
[0326] 根据本发明的一个优选具体实施方式，所述药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述低变应原性分子、核酸分子、载体、宿主或抗体。
[0327] 优选地，该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的数量向个体使用。
[0329] 优选地，向其使用本发明所述药物的个体为具有成为过敏症风险的个体或动物。
[0330] 患有或具有患过敏性病状、紊乱或疾病风险的个体包括已存在过敏性病状或者已知的或怀疑趋势（朝着与过敏性病状相连或由过敏性病状引起的征状发展的趋势）的个体。因此，该个体可具有主动的慢性过敏性病状、紊乱或疾病，急性过敏性发作，或潜伏的过敏性病状、紊乱或疾病。某些过敏性病状与季节性或地理性环境因素相关。因此，有风险的个体包括那些具有遭受病状风险的（该病状基于既往个人或家庭史，以及季节或物理位置）的个体，但该病状或与该病状相关的症状可能不在个体中表现其自身。
[0331] 根据本发明所述的向个体使用的药物（其包括至少一个如此处描述的低变应原性分子）可预防所述个体的致敏或诱导针对变应原的合适的免疫反应。如果本发明的药物用于预防致敏，则它应该在个体与所述变应原首次接触前使用。因此，优选为向婴儿和儿童使用本发明所述的药物。向怀孕个体使用本发明所述的药物将在未出生子女中诱导针对变应原的抗体的形成。对这种治疗使用本发明所述低变应原性分子是特别有益的，这是因为，由于缺少T细胞表位，在变应原免疫治疗过程中发生的副作用可被显著减少甚至完全避免。
[0332] 本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性蛋白或抗体在诊断个体中过敏症和/或病毒感染中的用途。
[0333] 本发明的另一个方面涉及来自微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣壳蛋白作为载体在药物或疫苗中的用途或用于诊断病毒感染，特别是普通感冒的用途。
[0334] 作为广泛传播的KLH载体蛋白的有价值的替代物，可使用微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣壳蛋白。载体可通过化学方式结合至或通过重组技术融合至肽、蛋白和多肽或其他抗原。而且，病毒衣壳蛋白可用于检测例如针对个体血清中所述衣壳蛋白的抗体。
[0335] 这样的载体的一个优点为，不仅所融合或结合的抗原可暴露于免疫系统，而且诱导了针对鼻病毒的衣壳蛋白的免疫反应。因此，这样的疫苗引起对鼻病毒引起的疾病的预防和/或治疗。该病毒优选为人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89和14。
[0336] 本发明的另一个方面涉及源自Phl p5（Genbank Nr.X7435）的低变应原性分子，具有C-和/或N-末端截尾并实质上缺乏IgE结合能力。
[0337] 草花粉是空气传播过敏原（对干草热和过敏性哮喘负责）的最有力的室外季节性来源之一。
[0338] 超过40%的过敏性个体表现出对草花粉变应原的IgE反应活性，其被分成超过11个组。超过80%的草花粉过敏性病人与第5组变应原反应。
[0339] 第5组变应原为非糖基化的，高度同源蛋白，具有介于25-33kD的分子量。几个第5组变应原已被克隆和/或免疫鉴定。
[0340] 通过引入点突变、行中几个氨基酸的突变或缺失来降低变应原性活性的试验表明没有效果（Schramm G,等人J Immunol1999;162:2406-1435）。已经描述了Phl p5的IgE结合区域（Flicker S,等人J Immunol2000;165:3849-3859），已经解决了其三维结构（Maglio O,等人2002.Protein Eng.15:635-642）。
[0341] 特别地，根据本发明所述的Phl p5肽（其为C-和/或N-末端截尾的并缺少IgE结合能力），可用于个体的主动疫苗接种。
[0342] 根据本发明的一个优选具体实施方式，经截尾的分子缺少T细胞表位。
[0343] 如上所述，如果低变应原性分子实质上缺少T细胞表位，变应原免疫治疗的延迟副作用可被显著降低甚至是避免。
[0344] 缺少T细胞表位的经截尾的Phl p5分子由Phl p5的93至128、98至128、26至53、26至58或252至283位氨基酸或其片段或其序列变体组成。
[0345] 特别地，这些经截尾的分子实质上表现出无T细胞表位，但是，能够激发针对野生型变应原的合适的免疫反应。
[0346] 根据本发明的另一个优选的具体实施方式，低变应原性经截尾的Phl p5由Phlp5的132至162、217至246或176至212位氨基酸或其序列变体组成。
[0347] 这些低变应原性分子包含一个或一个以上T细胞表位但缺少IgE结合能力。
[0348] 本发明的另一个方面涉及源自Fel d1的低变应原性分子（Genbank Nr.X62477和X62478），其具有C-和/或N-末端截尾并缺少IgE结合能力。
[0349] 对动物的过敏症影响多达40%的过敏性病人。在国内环境中，对主要流行宠物，猫和狗的过敏症占特别主导并与长年的症状相连。动物变应原存在于皮屑、上皮细胞、唾液、血清或尿液中。既可通过直接的皮肤接触也可通过吸入携带变应原的颗粒而暴露于变应原。已表明主要猫和狗变应原普遍存在，甚至可在不拥有宠物的家庭和公共地方例如学校被检测到。这是由于工业化国家养宠物的家庭数目较高并在增长（大约50%）以及变应原（其被得到并分散）的高度稳定性。
[0350] Fel d1被鉴定为主要猫变应原，其被超过90%的猫过敏性病人所识别。Fel d1代表生物功能未知的38kDa的酸性糖蛋白。它由两个相同的非共价连接的异二聚物组成，所述异二聚物又由两个反平行的由3个二硫键连接的多肽链组成。链1和链2在不同的基因上编码，每个由3个外显子组成。已经在大肠杆菌（E.coli）中作为链2-链1融合蛋白而表达了重组Fel d1（rFel d1）。这个重组Fel d1能够完全模拟野生型变应原的免疫特性。
[0351] 源自主要猫变应原Fel d1并缺少IgE结合能力的肽适合于例如免疫治疗和预防性的过敏症疫苗接种。这些肽可包含在一个较大的多肽中或与合适的载体蛋白（例如钥孔戚血蓝素，KLH）偶联。源自Fel d1的合成肽（像Phl p5和这里所揭露的源自变应原的肽）能够诱导IgG反应，即产生所谓的“阻断抗体”或“保护性抗体”。这些抗体防止IgE与变应原Fel d1的结合。因此可达到过敏性症状的显著性降低。
[0352] 根据本发明的一个优选具体实施方式，经截尾的分子表现出减少的T细胞反应活性。
[0353] 为了避免或显著降低延迟的副作用，源自Fel d1的低变应原性分子表现出如本发明所定义的减少的T细胞反应活性。
[0354] 优选地，经截尾的Fel d1由Fel d1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Fel d1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸或其序列变体组成。
[0355] 本发明的另一个方面涉及低变应原性分子，其由下列氨基酸组成或包含下列氨基酸：Der p2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Der p21的1至35、35至
72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alt a1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f2的19至58、52至91、82至119、106至
144或139至180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的31至70、80至
120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alt a1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f2的19至58、52至91、82至119、106至
144或139至180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的31至70、80至
120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
[0356] 本发明的另一个方面涉及低变应原性融合蛋白，其包含至少两个本发明所述的低变应原性分子，所述低变应原性分子表现出减少的IgE结合能力并表现出任选减少的T细胞反应活性。
[0357] 本发明所述的源自变应原并缺少IgE结合能力的低变应原性分子可重组地与彼此融合或化学地与彼此结合。作为融合蛋白/多肽的单一成分（变应原片段），所述融合蛋白/多肽也缺少IgE结合能力。
[0358] 根据本发明所述的融合蛋白可包含至少两个，优选为至少3个，更优选为至少4个，再更优选为至少5个本发明所述的低变应原性分子。当然，也可能将低变应原性分子与其他非源自变应原的肽、多肽和蛋白融合。当向个体使用时，这些肽、多肽和蛋白也可诱导免疫反应或者作为载体或表现出酶学活性。根据本发明所述的融合蛋白中的低变应原性分子可直接或通过一个连接子（优选为由氨基酸残基组成）与彼此相连。
[0359] 制备融合蛋白的方法在本领域中是熟知的，可在标准的分子生物学参考书例如 Sambrook 等 人（Molecular Cloning,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）和Ausubel等人（Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed;Wiley and Sons,1995）中找到。通常，通过首先构建融合基因（被插入到合适的表达载体中），然后，用于转染合适的宿主细胞来产生融合蛋白。通常，通过一系列限制性酶消化和连接反应（这导致产生所需要的插入到质粒中的序列）来产生重组融合构建体。如果不能得到合适的限制性位点，则可使用本领域技术人员已知的和以上所列参考书中的合成低聚核苷酸接头或连接子。编码变应原和天然蛋白的多聚核苷酸序列可在被插入到合适的载体之前被组装，或者编码变应原的序列可被插入到编码载体中已经存在的天然序列的序列附近。将序列插入到载体中应该符合读码框（in frame）以使该序列能被转录成蛋白。所需要的精确的限制性酶、连接子和/或接头以及精确的反应条件将根据所用的序列和克隆载体而变化，这对于本领域普通技术人员来说将是明显的。但是DNA构建体的组装在本领域是常规的，可由本领域技术人员容易地完成。
[0360] 根据本发明的一个优选具体实施方式，如果至少两个分子源自相同的变应原，则这些分子以不同于野生型变应原中片段顺序的顺序与彼此相融合。
[0361] 根据本发明所述的融合蛋白可包含至少两个源自相同野生型变应原的低变应原性分子。在这样的情况下，单一的分子（变应原片段）以不同于野生型变应原中顺序的顺序与彼此相融合。这样的方法防止了低变应原性融合蛋白中潜在的IgE结合位点/表位的重新形成。
[0362] 本发明的另一个方面涉及编码本发明所述的低变应原性分子和融合蛋白的核酸分子。
[0363] 本发明的核酸分子可用于例如重组地生产所述分子。
[0364] 根据本发明的另一个方面，所述核酸分子可包含在载体中。
[0365] 该载体优选为表达载体。
[0366] 本发明的另一个方面涉及疫苗制剂，其包含本发明所述的低变应原性分子、融合蛋白或抗体。
[0367] 优选地，该制剂进一步包含至少一个佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
[0368] 现今最新的增加免疫反应的方法中也有使用特别的载体物质例如KLH（钥孔戚血蓝素）。本发明所述的低变应原性分子也可融合或结合至病毒衣壳蛋白，该病毒衣壳蛋白也可用作载体（参见以上）。
[0369] 根据本发明的一个优选具体实施方式，所述制剂包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别为0.5μg至200μg的所述低变应原性分子或抗体。
[0370] 疫苗制剂实质上可由本发明所述的药物组成（参见以上）。
[0371] 本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体在制备用于治疗或预防个体中过敏症的药物中的用途。
[0372] 根据本发明所述的低变应原性分子、融合蛋白和抗体可用于个体的疫苗接种。此疫苗接种可降低或防止由野生型变应原所引起的过敏性反应。
[0373] 根据本发明的一个优选具体实施方式，所述药物进一步包含至少一个佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
[0374] 优选地，根据本发明所述的药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别为0.5μg至200μg的所述免疫原性分子、核酸分子、载体、宿主或抗体。
[0375] 根据本发明的另一个优选具体实施方式，该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的量向个体使用。
[0376] 根据本发明的一个优选具体实施方式，所述个体具有获得过敏症的风险。
[0377] 本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体在诊断个体中的过敏症或监视过敏症治疗过程中的用途。
[0378] 根据本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体不仅可用于药物也可合适地用于各种诊断目的。例如，这些分子和融合蛋白可通过例如将个体的样品（包含组胺释放细胞）暴露于所述多肽而用于诊断过敏症（参见例如,Purohit等人,Clin.Exp.Allergy35（2005）:186-192）。而且，这些分子、融合蛋白和抗体可被固定于表面以形成多肽阵列/芯片。这样的阵列可用于例如高通量筛选以诊断取自许多个体的许多样品中的过敏症。附图说明
[0379] 本发明通过以下图示和实施例进一步解释，但是，并不限制于此。
[0380] 图1A显示了载体p89VP1的示意性综述。
[0381] 图1B显示了pET-17b载体的多克隆位点和89VP1编码基因的DNA序列。
[0382] 图1C显示了产生核酸融合体三种可能性的示意性代表。
[0383] 图2显示了含有经纯化的89VP1his-标签化蛋白的经考马斯蓝染色的12%的SDS-PAGE凝胶（第1道：5μg分子标记；第2-5道：10μl89VP1洗脱样品）。
[0384] 图3显示了对14VP1的IgG识别：14VP1和对照的免疫杂交。点通过放射自显影来显示（第1-6道：以1:500-1:16000稀释的兔子抗-14VP1抗血清温育；第7-12道：以1:500-1:16000稀释的免疫前血清温育）。
[0385] 图4显示了小鼠中89VP1特异性IgG1反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠，如每个箱顶部所示。89VP1特异性IgG1的效价通过ELISA测定，以y-轴上的OD值来表达。结果显示为箱线图（box plot），其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。
[0386] 图5显示了小鼠中Phl p1特异性IgG反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠，如每个箱顶部所示。rPhl p1特异性IgG1的效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值（OD405nm）来表达。光学值对应于小鼠血清中的IgG1抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。
[0387] 图6显示了经免疫小鼠中牧草花粉提取物特异性IgG1反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠，如每个箱顶部所示。牧草花粉提取物特异性IgG1的效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值（OD405nm）来表达。光学值对应于小鼠血清中的IgG1抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。
[0388] 图7显示了通过以所有19个病人的针对rPhl p1、r89P5和KLHP5的抗血清预温育而对病人的IgE与rPhl p1结合的%抑制的平均值。%抑制显示于y-轴。结果以柱形图显示。
[0389] 图8显示了经免疫小鼠的脾细胞的增殖。用肽5、89VP1（89）和KLH来刺激经不同抗原（如每个箱顶部所示）免疫的小鼠的T细胞。培养液用作参考。在y-轴显示了刺激指数。结果以柱形图显示。
[0390] 图9显示了在人血清中通过ELISA测定而检测的IgG1、IgG2、IgG4和IgA对14VP1、89VP1和rPhl p1的反应。对于4个89VP1、14VP1及rPhl p1特异性抗体测试了10个病人的血清（如每个箱顶部所示）。在左手边和右手边的每个“柱形图配对”分别显示了秋季和冬季所取的血清。效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值（OD405nm）来表达。光学值对应于人血清中的抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。
[0391] 图10显示了过敏性病人的血清中抗-89VP1和抗-rPhl p1抗体的检测。对于7个89VP1特异性抗体（每对的左侧柱形图）和rPhl p1特异性抗体（每对的右侧柱形图）测试了5个Phl p1过敏性病人的血清。效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值（OD405nm）来表达。光学值对应于人血清中的抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。
[0392] 图11显示了抗-14VP1IgG与HRV14蛋白提取物和纯化的14VP1的结合（第1和4道：5μg的标记；第2和4道：病毒提取物；第2和5道：5μg的14VP1）。用抗-14VP1免疫血清和免疫前血清分别温育A杂交和B杂交。通过Western杂交来检测所结合的IgG，通过放射自显影来显示。
[0393] 图12显示了HRV14的中和（第A道（细胞对照）：以1:102-1:108稀释的抗-14VP12 8
免疫血清预温育HRV14之后的细胞（A1-A6行）；第B道：以1:10-1:10 稀释的免疫前血清
6
预温育HRV14之后的细胞（B1-B6行）；第C道：以HRV1410TCD50-10TCD50温育之后的细胞（C1-C6行）；D5：以免疫前血清温育之后的细胞；D6：以免疫血清温育之后的细胞）。细胞植板于所有的孔，在三天后以结晶紫染色。
免疫血清预温育HRV14之后的细胞（A1-A6行）；第B道：以1:10-1:10 稀释的免疫前血清
6
预温育HRV14之后的细胞（B1-B6行）；第C道：以HRV1410TCD50-10TCD50温育之后的细胞（C1-C6行）；D5：以免疫前血清温育之后的细胞；D6：以免疫血清温育之后的细胞）。细胞植板于所有的孔，在三天后以结晶紫染色。
[0394] 图13显示了抗-肽抗血清与完全Phl p5变应原的IgG反应活性。显示了从6只兔子（每个均以一种KLH偶联的肽来免疫）获得的3个血清样品（取血1：免疫前血清；取血2-3：月间隔收集的血清样品）对Phl p5的IgG反应活性（OD值）。
[0395] 图14显示了rPhl p5的变应原性活性，以及由CD203c表达所检测的肽混合物。-4
来自三个Phl p5过敏性病人的肝素化血液样品以10 至10μg/mL系列稀释的重组变应原、源自Phl p5的肽的等摩尔混合物、抗-IgE或对照缓冲液（co，x-轴）进行温育。然后以CD203c mAb将细胞染色，并在FACScan上分析CD203c的表达。在y-轴上显示了刺激指数（SI）。
来自三个Phl p5过敏性病人的肝素化血液样品以10 至10μg/mL系列稀释的重组变应原、源自Phl p5的肽的等摩尔混合物、抗-IgE或对照缓冲液（co，x-轴）进行温育。然后以CD203c mAb将细胞染色，并在FACScan上分析CD203c的表达。在y-轴上显示了刺激指数（SI）。
[0396] 图15显示了对源自Phl p5的肽的鉴定，该肽诱导低淋巴增殖反应。以不同浓度的肽和用于对照目的的白细胞介素-2（x-轴）刺激来自牧草花粉过敏性病人的PBMC。在y-轴上显示了刺激指数（SI）。
[0397] 图16显示了源自Fel d1的合成肽（其在兔子中诱导Fel d1特异性IgG免疫反应）。以KLH偶联的源自Fel d1的合成肽或未偶联的rFel d1来免疫6只兔子，在月间隔进行取血3-4次。免疫前血清和抗血清针对ELISA板上所结合的rFel d1的IgG反应活性表示为光学密度（O.D.值，y-轴）。
[0398] 图17显示了通过敏性病人嗜碱细胞上CD63和CD203c的表达而确定的源自Fel d1的合成肽的低变应原性活性。以系列稀释的Fel d1（实心框）或源自Fel d1的合成肽的混合物（空心框）（x-轴）温育来自5个猫过敏性病人的PBMC。对于病人RR，也用系列稀释的源自Fel d1的合成肽作为单一成分对PBMC进行探测。表面标记CD203c和CD63表达的诱导以平均荧光强度测定，经计算的刺激指数显示于y-轴。
[0399] 图18显示了以KLH偶联的源自Bet v1的肽处理在致敏小鼠中减少了针对rBet v1的淋巴增殖反应。在体外以重组桦树花粉变应原Bet v1（白色条形柱）、KLH（黑色条形柱）或肽混合物（灰色条形柱）刺激后培养的脾细胞中测定了T细胞增殖。条形柱代表不同小鼠组别的平均刺激指数（SI±SD）。
[0400] 图19显示了以KLH偶联的源自Bet v1的肽对初次接受试验小鼠进行预防性疫苗接种，在致敏后该肽减少针对rBet v1的淋巴增殖反应。
[0401] 图20显示了以KLH偶联的源自Bet v1的肽对初次接受试验小鼠进行预防性疫苗接种诱导了Bet v1特异性IgG反应并为由完全变应原诱导的变应原特异性IgG反应作好了准备。在不同的时间点（x-轴）测定了4个处理组中的针对Bet v1的IgG反应（OD值：y-轴）。
[0402] 图21显示了源自Phl p5的肽（1，2）和变体（1a，2b）的IgE反应活性：IgE结合能力的对比，使用来自7个草花粉过敏性病人（p1-p7）和来自一个非过敏性个体（NHS）的血清通过使用0.20g/点的点杂交测验来确定。rPhl p5用作阳性对照，HSA用作阴性对照。以125I标记的抗-人IgE来检测所结合的IgE。
[0403] 图22显示了源自Phl p5的肽（1，2）和变体（1a，2b）的淋巴增殖反应。以不同浓度的肽和用于对照目的的等摩尔浓度的rPhl p5刺激来自草花粉过敏性病人的PBMC。在y-轴显示了刺激指数（SI）。
[0404] 图23显示了抗VP1抗体的交叉保护。
具体实施方式
[0405] 实施例
[0406] 实施例1：载体p89VP1的构建
[0407] 使用QIAamp病毒RNA试剂盒（Qiagen,Germany）从细胞培养物上清液中提取RNA，然后加入1μl的RNase抑制剂（Boehringer GmbH,Germany）至最终浓度0.01U/μl，这样来制备用于RT-PCR的病毒贮存样品。
[0408] 通过用编码人类鼻病毒株89（89VP1）的VP1蛋白的cDNA序列替代pET-17b的多克隆位点的NdeI/EcoRI片段来构建质粒p89VP1（图1A）。NdeI和EcoRI限制性位点（在pET-17b中）用于插入AseI/EcoRI连接的89VP1，该89VP1在5’末端带有ATG，在3’末端带有6个组氨酸，接着是终止密码子TGA（图1B）。
[0409] 通过核苷酸测序来确定在pET-17b中插入了89VP1。
[0410] 在NdeI/AseI融合代替NdeI位点后产生了CATAAT，其不能被任何已有酶切割。因此，该位点突变为CTTAAG，即Afl II的限制性位点。为了再插入一个变应原片段，ACCGTT序列在3’末端被突变为ACCGGT，即AgeI的限制性位点。89VP1的核苷酸序列下面显示了氨基酸序列。在图1B中以下划线显示了限制性位点。
[0411] 所述Afl II和AgeI限制性位点以快速改变位点形成突变试剂盒（Quick change site mutagenesis Kit（Stratagene））产生。
[0412] 因此，如图1C所示，可在89VP1的5’末端（使用Afl II）或3’末端（使用AgeI）的剩余限制性位点或同时两个位点插入基因片段的cDNA，以便于容易纯化。因此重组变应原片段将在89VP1的N-末端和/或C-末端表达。
[0413] 表1：克隆和突变形成的引物（5’至3’）
[0414]
[0415] 实施例2：表达89VP1-变应原片段融合蛋白的构建体的克隆
[0416] 将以上所描述的方法示例于C-末端Phl p1变应原片段，即肽5（CVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTAYESK;M.Focke 等 人 FASEB J（2001）15:2042-4）。 用 Phl p1cDNA（GenBank:X78813）作为模板通过PCR扩增肽5的DNA序列（引物：Phl p1正向5’-CGCGCTTAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3’（SEQ ID No.7）;Phl p1反向5’-CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAGGCGGTGTCGGC-3’（SEQ ID No.8））。将PCR产物插入p89VP1载体的Afl II限制性位点，得到的构建体被称为载体p89P5和基因产物r89P5。
[0417] 实施例3：89VP1肽5融合蛋白和89VP1的表达和纯化
[0418] 为了达到89VP1或r89P5（重组89VP1-肽5融合蛋白），将质粒转化至E.coliBL21（DE3）。经转化的E.coli在37℃下生长于250ml含有100mg/l氨比西林的LB培养基，生长至0.4的光密度（600nm），通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至1mM的最终浓度来诱导蛋白表达。4小时后，通过在4℃和3500rpm下离心10分钟来收集E.coli细胞。使用Qiagen Ni-NTA和柱以Qiagen程序来进行纯化。将细胞沉淀在变性条件下重悬于5ml的6M盐酸胍1个小时。离心（20分钟，10000x g）后，以1ml的Ni-NTA再温育上清液1个小时。然后将悬浮液装柱，以5ml的洗涤缓冲液（8M的尿素，pH6.3）洗涤两次，然后以4ml的洗脱缓冲液（8M的尿素，pH3.5）洗脱。通过降低尿素的摩尔浓度透析后达到复原。
[0419] 如图2所示以SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度和大小。蛋白带对应于经计算的33.6kD的蛋白大小。也通过Western杂交分析（使用抗-组氨酸标签抗体）确定了蛋白的完整性。
[0420] 实施例4：通过免疫杂交检测14VP1特异性兔子抗体
[0421] 将5μg的14VP1（人类鼻病毒株14的VP1蛋白）和对照（Bet v1、Phl p5、BSA）点膜至硝化纤维膜带。将这些带暴露于兔子抗-14VP1抗血清（第1-6道）和免疫前血清（第8-12道）的稀释液。以1:1000稀释的125I标记的驴抗-兔子IgG检测所结合的兔子IgG抗体，并以放射自显影显示（图3）。
[0422] 兔子抗-14VP1血清的点杂交分析表明14VP1有强烈的免疫原性。与免疫前血清和Bet v1、Phl p5和BSA对照相反，以1:16000稀释的抗血清仍能检测到IgG抗体。
[0423] 实施例5：通过ELISA确定免疫小鼠中89VP1特异性抗体反应
[0424] 为了确定89VP1的免疫原性及其作为肽5的载体的能力，以下列抗原免疫六周龄的雌性balb/c小鼠组（Charles River）：KLH、KLH马来酰亚胺偶联的肽5（KLHP5）和KLH EDC偶联的肽5（KLHP5edc）。通过Imject马来酰亚胺激活的mcKLH和Imject Immunogen EDC Kit（Pierce）进行化学偶联。马来酰亚胺基团与SH基团反应，EDC与羧基和氨基基团反应以形成稳定的键。每组4只的小鼠以89VP1、r89P5和89P5edc进行免疫，2只以单独的肽5进行免疫（每只5μg，与氢氧化铝1:2混合）。在大约三周间隔内通过皮下来免疫小鼠，在尾静脉取血。通过ELISA确定89VP1特异性IgG1抗体的水平。
[0425] 以5μg/ml的89VP1包被ELISA板（Nunc）。以1:500稀释小鼠抗-89VP1、抗-r89P5和肽5血清。以1:1000的大鼠抗-小鼠IgG1（BD Pharmingen），然后以1:2000的POX偶联的山羊抗大鼠IgG（Amersham Bioscience）检测所结合的IgG1。在y-轴显示了光学值（OD405nm），对应于小鼠血清的IgG1抗体水平（图4）。
[0426] KLHP5、KLHP5edc、KLH和肽5用作对照。以89VP1（89VP1、89P5edc和r89P5）注射的小鼠的免疫过程中以增加的效价检测到了IgG1抗体。以89VP1、r89P5和KLHP5免疫的兔子显示了相同的结果。
[0427] 实施例6：通过ELISA确定免疫小鼠中rPhl p1特异性抗体反应
[0428] 为了评估以r89P5免疫是否诱导与完全Phl p1反应的IgG抗体，使用了如实施例5中描述的同样的方法和同样的小鼠血清。以5μg/ml的rPhl p1包被ELISA板并测定了IgG1抗体的效价（图5）。
[0429] 所有的与KLH或89VP1偶联的源自Phl p1的肽都在免疫过程中以渐增的反应来诱导rPhl p1特异性IgG1抗体。以r89P5和KLHP5免疫的兔子显示了相同的结果。
[0430] 实施例7：通过ELISA测定牧草花粉提取物特异性IgG1抗体
[0431] 如第5部分所述进行了小鼠免疫和ELISA分析。将全牧草花粉提取物包被于ELISA板（100μg/ml），并确定了IgG1抗体的效价（图6）。
[0432] 三次免疫后可在以肽5免疫的小鼠中检测到提取物特异性IgG1抗体。
[0433] 实施例8：兔子抗-r89P5抗体阻断病人的IgE与rPhl p1的结合
[0434] 为了确定肽诱导的兔子Ig的抑制过敏性病人的IgE抗体与rPhl p1结合的能力，以1μg/ml的rPhl p1包被ELISA板，洗涤并封闭。板以1:100稀释的兔子抗-肽（89P5,KLHP5）、兔子抗rPhl p1以及用于对照目的的相应的免疫前血清进行预温育。洗涤以后，板以来自Phl p1过敏性病人的（1:3稀释的）人血清进行温育，以小鼠抗-人IgE（Pharmingen1:1000），然后以1:2000的POX偶联的绵羊抗-小鼠IgG（Amersham Bioscience）来检测所结合的IgE。按照如下计算经抗-肽抗血清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率：100-ODi/ODp x100。
[0435] ODi和ODp分别代表以兔子免疫血清和免疫前血清预温育后的消光度。表2显示了抗-Phl p1肽抗体抑制19个过敏性病人的IgE与完全rPhl p1结合的能力。图7显示了所有的抗-rPhl p1、抗-r89P5和抗-KLHP5免疫血清的平均抑制（以%表示）。抗-肽血清比rPhl p1更好的阻断了IgE的结合。抑制能力与89P5和KLHP5几乎一样。表2显示了所有19个病人的抑制（以%表示）。
[0436] 表2：以兔子抗-rPhl p1、r89P5和抗-KLHP5抗血清温育后19个病人的IgE与rPhl p1结合的%抑制
[0437]
[0438]
[0439] 实施例9：抗原刺激小鼠脾细胞后的T细胞增殖
[0440] 以KLH、KLHP5和KLHP5edc免疫每组三只小鼠。以89VP1、r89P5和89P5edc免疫每组4只小鼠四次，以单独的肽5免疫2只小鼠（每只5μg）。最后一次免疫10天后取出脾细胞，在96孔板中以三次重复用肽5（P5）、89VP1、KLH和分别作为阳性对照和阴性对照的Con3
A和培养液来刺激单独的细胞培养物。四天后向每个孔中加入放射性[H]胸苷0.5μCi。
然后在15小时后用Packard细胞收集器收集细胞至unifilter板。用β计数器测定细胞相连的放射活性。计算了刺激指数并显示于y-轴。在x-轴上显示了用于刺激的抗原。每个框代表用于免疫小鼠的抗原的数据（图8）。所有超过2的值作为阳性。经KLH和KLHP5免疫的小鼠只有当以KLH刺激时是阳性的，肽5小鼠是完全阴性的。对应于ELISA结果，KLHP5edc组也是阴性的。来自经r89P5、89P5edc和89VP1免疫小鼠的细胞只有当以89VP1刺激后增殖。初次接受试验的对照小鼠在所有的情况下没有表现出增殖。这些结果表明T细胞表位是由载体89VP1而不是由肽5提供的。
A和培养液来刺激单独的细胞培养物。四天后向每个孔中加入放射性[H]胸苷0.5μCi。
然后在15小时后用Packard细胞收集器收集细胞至unifilter板。用β计数器测定细胞相连的放射活性。计算了刺激指数并显示于y-轴。在x-轴上显示了用于刺激的抗原。每个框代表用于免疫小鼠的抗原的数据（图8）。所有超过2的值作为阳性。经KLH和KLHP5免疫的小鼠只有当以KLH刺激时是阳性的，肽5小鼠是完全阴性的。对应于ELISA结果，KLHP5edc组也是阴性的。来自经r89P5、89P5edc和89VP1免疫小鼠的细胞只有当以89VP1刺激后增殖。初次接受试验的对照小鼠在所有的情况下没有表现出增殖。这些结果表明T细胞表位是由载体89VP1而不是由肽5提供的。
[0441] 实施例10：通过ELISA检测秋季和冬季获得的人血清中的14VP1-、89VP1-和rPhl p1特异性抗体
[0442] 在秋季从五个随机选取的个体中取血清，冬季五个。通过ELISA确定了针对14VP1、89VP1和rPhl p1的IgG1、IgG2、IgG4和IgA抗体水平，如实施例5中所述。以1:1000用1:2000POX偶联的绵羊抗小鼠IgG（Amersham Bioscience）来检测人IgG1、IgG2、IgG4和IgA（BD Pharmingen）。在取自秋季和冬季的血清中可检测到抗-14VP1和89VP1IgG1高效价（图9）。抗-rPhl p1IgG1抗体效价相比较很低。IgG2、IgG4和IgA抗体可在所有的情况下检测到，水平非常低。不同HRV株的VP1蛋白紧密相关，在其他的研究中已表现出交叉反应性。
[0443] 实施例11：Phl p1过敏性病人的抗-89VP1和抗-rPhl p1抗体
[0444] 获取了五个Phl p1过敏性病人的血清，如实施例5所述进行了ELISA实验。以rPhl p1和89VP1包被ELISA板，确定了特异性IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgE抗体效价（图10）。可检测到比抗-rPhl p1IgG1抗体更多的抗-89VP1IgG1抗体。
[0445] 实施例12：通过Western杂交分析检测抗-14VP1抗体与全病毒的结合
[0446] 通过使用全HRV14病毒（第2和5道）和作为对照的5μg的纯化的14VP1（第3和6道）来确定经14VP1注射兔子血清中的IgG抗体与全病毒的结合。以12%的SDS-Page分离病毒提取物并点膜至硝化纤维膜。测试了1:500的兔子抗-14VP1抗血清（第1-3道）和
1:500的免疫前血清（第4-6道）与HRV14和14VP1的结合。以125I标记的驴抗-兔子抗体检测了所结合的IgG，通过放射自显影显示（图11）。
1:500的免疫前血清（第4-6道）与HRV14和14VP1的结合。以125I标记的驴抗-兔子抗体检测了所结合的IgG，通过放射自显影显示（图11）。
[0447] 可在与14VP1相同的大小处（33.6kD）检测到14VP1-抗血清的结合。
[0448] 实施例13：抗-14VP1抗体对完整的人类鼻病毒14的中和
[0449] 确定了HRV14的组织培养半剂量50（TCD50）。因此，在MEM-Eagle，1%FCS和2 8
40mMMgCl2中进行了1:10 至1:10 的病毒稀释，在24孔板于34℃下5%CO2加湿的空气中和HeLa Ohio细胞一起温育三天。也展开了无病毒的对照。
40mMMgCl2中进行了1:10 至1:10 的病毒稀释，在24孔板于34℃下5%CO2加湿的空气中和HeLa Ohio细胞一起温育三天。也展开了无病毒的对照。
[0450] 三天后通过结晶紫显示病毒的毒性效应，计算了TCD50（引起50%细胞死亡的稀释）。
[0451] 在34℃下温育行A和B中的血清稀释液和病毒（100TCD50）。两小时后在所有的孔中展开细胞。D5和D6是血清对照。在图12中显示了实验计划。三天后以结晶紫检测了抗体的中和效应（图12）。
[0452] 实施例14：源自Phl p5的合成肽的特性
[0453] 使用HBTU-激活（0.1mmol小级别循环）以Fmoc策略在Applied Biosystems肽合成器Model433A上合成了肽，如Focke等人Faseb J（2001）15:2042所述。在对Phl p5变应原进行了深度分析后，制备了六个源自Phl p5的肽，这些肽在长度上介于31（P1：3026道尔顿）至38（P6：3853道尔顿）个氨基酸，富含暴露于溶剂的氨基酸（表3）。
[0454] 这些肽具有介于4.32至8.98的等电点，其中三个（肽3、4和6）可含有人T细胞表位。
[0455] 表3.非变应原性的源自Phl p5的合成肽的特性。显示了位置（相对于Phl p5分子）、序列、长度、分子量（MW），等电点（pI）和源自Phl p5肽的T细胞表位的存在性。以黑体和下划线标示了所加入的半胱氨酸残基（为了促进偶联）。
[0456]
[0457]
[0458] 实施例15：源自Phl p5的肽缺少IgE反应活性和变应原性活性
[0459] 15.1缺少IgE反应活性
[0460] 为了分析六个源自Phl p5的肽的IgE反应活性，使用来自29个草花粉过敏性病人的血清通过ELISA对分离的和KLH偶联的源自Phl p5的肽的IgE结合能力与完全rPhl p5的IgE结合能力进行了比较（表4）。
[0461] 表4：29个草花粉过敏性病人和1个非变应原性对照的血清学特性。性别、年龄、总血清IgE水平（kU/L）、牧草提取物特异性IgE（kUA/L）、对rPhl p5特异性的IgE抗体和6个分离的（P1至P6）和KLH偶联的（KLH-P1至KLh-P6）肽（通过ELISA测定），显示了OD（光密度）。破折号表示对分离的和KLH偶联的肽缺少IgE反应活性。
[0462]
[0463] 以源自Phl p5的肽（5μg/ml）或作为对照的rPhl p5（5μg/ml）包被ELISA板（Nunc Maxisorp,Denmark），洗涤并封闭。随后，在4℃下，板以1:3稀释的来自29个草花粉过敏性病人和1个非过敏性个体的血清进行温育过夜。根据季节性花粉病病历显示来选择遭受过敏性鼻结膜炎和/或哮喘的草花粉过敏性病人，并使用牧草花粉提取物和血清学CAP-FEIA（Pharmacia Diagnostics,Uppsala,Sweden）测试通过刺皮试验来鉴定。通过CAP测试来确定血清中的总IgE水平（Pharmacia）。通过ELISA确定对rPhl p5特异性的IgE抗体。来自29个草花粉过敏性病人和1个非过敏性个体的血清用于IgE竞争研究。草花粉过敏性病人组由13个男性和16个女性组成，平均年龄为35岁（介于25-51岁）（表4）。
[0464] 以1:1000稀释的碱性磷酸酶偶联的小鼠单克隆抗-人IgE抗体（Pharmingen,CA）来检测所结合的IgE抗体。
[0465] 总IgE水平和草花粉提取物特异性IgE分别介于24.9至2000kU/L（平均：262.7）和2.2至100kUA/L（平均：41.5）。所有的病人都含有rPhl p5特异性IgE抗体，介于0.157至2.530OD单位（平均：1.082OD单位），但是29个病人中没有一个显示出对任何肽（P1-P6）或肽的等摩尔混合物的IgE反应活性（OD≤0.08）。这个结果证明没有血清是含有可检测的对六个源自Phl p5肽中任一个有特异性的IgE抗体。
[0466] 15.2.由嗜碱细胞上CD203c表达所检测的减少的变应原性活性：嗜碱细胞的激活和流式细胞术：
[0467] CD203c的上调已被描述为变应原诱导的嗜碱细胞激活和脱粒的代理标志（Hauswirth等人,J Allergy Clin Immunol2002;110:102）。因此，通过测定草花粉过敏性病人的嗜碱细胞上CD203c的上调比较了完全rPhl p5变应原和肽的等摩尔混合物的变应原性活性。
[0468] 在获得知会同意之后，从三个过敏性捐赠人取得了外周血细胞。以系列稀释的重-4组变应原（10 至10μg/ml）、抗-IgE抗体（1μg/ml）或对照缓冲液（磷酸盐缓冲盐水=PBS）在37℃下温育肝素化血液等分试样（100μl）15分钟。温育后，以含有20mM EDTA的PBS洗涤细胞。然后以10μl PE偶联的CD203c mAb97A6在室温（RT）下温育细胞15分钟。然后，TM
以2mL的FACS 裂解溶液将红血球裂解。然后洗涤细胞，重悬于PBS，并在FACScan（Becton Dickinson）上用二色流式细胞术使用Paint-a-Gate软件分析。变应原诱导的CD203c的上调通过平均荧光强度（MFI）（由经刺激的（MFIstim）和未刺激的（MFIcontrol）细胞获得）来计算，并表达为刺激指数（MFIstim：MFIcontrol）。SI≥2.0（≥2倍上调）被认为是特异性反应的指征。
以2mL的FACS 裂解溶液将红血球裂解。然后洗涤细胞，重悬于PBS，并在FACScan（Becton Dickinson）上用二色流式细胞术使用Paint-a-Gate软件分析。变应原诱导的CD203c的上调通过平均荧光强度（MFI）（由经刺激的（MFIstim）和未刺激的（MFIcontrol）细胞获得）来计算，并表达为刺激指数（MFIstim：MFIcontrol）。SI≥2.0（≥2倍上调）被认为是特异性反应的指征。
[0469] 如图14中所示，发现：在致敏个体中完全rPhl p5表现出外周血嗜碱细胞上-4CD203c的表达的剂量依赖性（10 至10μg/ml）增长，而肽的等摩尔混合物没有表现出效应。
[0470] 对来自草花粉过敏性病人的嗜碱细胞上CD203c表达的确定表明：以源自Phlp5的肽观察不到变应原性活性。
[0471] 实施例16：以源自Phl p5的肽免疫诱导了与rPhl p5和来自不同草种的天然变应原反应的IgG抗体
[0472] 16.1.重组变应原和变应原提取物
[0473] 在E.Coli中表达了纯化的重组Phl p5，如Vrtala等人（J of Immunol（1993）151:4773-4781）所描述。
[0474] 从Allergon Pharmacia（Sweden）获得了来自梯牧草（Phleum pratense）、多年生黑麦草（Lolium perenne）、草地早熟禾（Poa pratensis）、鸭茅（Dactylis glomerata）、黑麦（Secale cereale）、小麦（Triticum aestivum）、燕麦（Avena sativa）、大麦（Hordeum vulgare）、黄花茅（Anthoxanthum odoratum）的草花粉，制备了水性花粉提取物，如Vrtala等人（Int Arch Allergy Immunol（1993）102:160-9.）所描述。
[0475] 16.2.兔子的免疫
[0476] 根据生产商的建议，将HPLC纯化的肽偶联至KLH（钥孔戚血蓝素，3 7
MW4.5x10-1.3x10，Pierce，USA），使用Conjugation Kit（Sigma,USA）进行纯化。
MW4.5x10-1.3x10，Pierce，USA），使用Conjugation Kit（Sigma,USA）进行纯化。
[0477] 以每个KLH偶联的肽（200μg/注射）和用于对照目的的完全rPhl p5使用弗氏完全佐剂和不完全佐剂（Charles River）将兔子免疫。在四周间隔内取得血清样品。
[0478] 16.3.兔子抗体与完全rPhl p5和来自不同草种的天然变应原的反应活性[0479] 为了研究以KLH偶联的肽免疫之后所诱导的抗体是否能够识别rPhl p5、天然Phl p5和来自其他草花粉种的Phl p5相关草花粉变应原，进行了ELISA实验。为了进行ELISA检测，板（Nunc Maxisorp,Denmark）以花粉变应原提取物（100μg/ml：梯牧草、多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦、小麦、燕麦、大麦、黄花茅）或纯化的重组变应原（5μg/ml：rPhl p5）进行包被。洗涤ELISA板并封闭，接下来以兔子抗-肽抗血清和1:2500稀释的相应的免疫前血清进行温育。以HRP偶联的山羊抗-兔子Ig抗血清（Jackson Immunresearch,Pennsylvania）检测所结合的兔子IgG。结果代表两次重复测定的平均，其误差<5%（图13，表5）。
[0480] 表5：抗-Phl p5肽抗血清与rPhl p5和来自梯牧草、多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦、小麦、燕麦、大麦、黄花茅的天然第5组变应原的交叉反应活性。显示了经过KLH偶联的源自Phl p5的肽（P1至P6）免疫的六只兔子中肽抗血清（抗-P1至抗-P6）与Phl p5和来自草花粉的花粉提取物的IgG反应活性（OD值）。
[0481] 抗-肽抗血清与rPhl p5和草花粉提取物的交叉反应活性
[0482]
[0483] 16.4.以源自Phl p5的肽免疫诱导了交叉反应性IgG抗体
[0484] 以每个肽免疫诱导了有力的Phl p5特异性IgG反应，其在第一次免疫四周后可检测到，在第二次免疫后增加（图13）。以肽2免疫诱导了最高的Phl p5特异性IgG反应，接下来是肽6、4、5和1，肽1诱导了最低的反应。除了抗-肽1抗体（其缺少与第5组变应原中多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦和大麦的反应活性）之外，其他的肽抗血清均与每个所测的草花粉提取物有交叉反应（表5）。
[0485] 实施例17：以源自Phl p5的肽免疫诱导了可抑制草花粉过敏性病人的IgE与Phl p5结合的IgG抗体
[0486] 17.1.肽特异性IgG对过敏性病人的IgE与rPhl p5a结合的抑制
[0487] 关于肽诱导阻断抗体的能力的信息是重要的，因为已表明阻断抗体在免疫治疗中扮演重要角色。
[0488] 为了检测肽诱导的兔子Ig的抑制过敏性病人的IgE与完全rPhl p5结合的能力，使用来自29个草过敏性病人的血清进行了竞争性ELISA实验。
[0489] 以rPhl p5（1μg/ml）包被ELISA板，并以1:250稀释的每个抗-肽抗血清（抗-P1至抗-P6）、抗-肽抗血清混合物、抗-rPhl p5抗血清或者用于对照目的的相应的免疫前血清或免疫前血清混合物进行预温育。洗涤后，板以1:3稀释的来自29个草花粉过敏性病人的血清温育，以碱性磷酸酶偶联的小鼠单克隆抗-人IgE抗体（Pharmingen）来检测所结合的IgE抗体。按照如下计算经抗-肽抗血清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率：IgE结合的%抑制=100-ODI/ODP x100。ODI和ODP分别代表以兔子免疫血清和免疫前血清预温育后的消光度。以肽诱导的兔子IgG预温育Phl p5在不同程度上抑制了过敏性病人IgE反应活性。对IgE结合的平均抑制程度介于19.3%（抗-肽6IgG）至28.5%（抗-肽1IgG）。针对完全Phl p5获得的兔子抗体诱导了对IgE结合平均43.6%的抑制。
[0490] 表6：兔子抗-Phl p5抗血清抑制牧草花粉过敏性病人的血清IgE与Phl p5的结合。显示了对Phl p5用抗-肽抗血清（抗-P1至抗-P6）、六个抗-肽抗血清（抗-P1-P6）的混合物或抗-rPhl p5抗血清进行预温育之后，每个病人的IgE与Phl p5结合的抑制百分率。在最底行显示了平均抑制百分率。N.d.：未做。
[0491]
[0492] 实施例18：源自Phl p5的肽诱导低特异性的淋巴增殖反应
[0493] 18.1.淋巴增殖测试
[0494] 为了鉴定具有最低可能的T细胞反应活性的肽（为了使治疗相关的副作用最小化），通过淋巴增殖测试检测了T细胞反应活性。从两个草花粉过敏性病人中通过Ficoll（Amersham Pharmacia Biotech,UK）密度梯度离心分离了外周血单核细胞（PBMC）。以三次重复方式在96孔板（Nunclone;Nalge Nunc International,Denmark）中在37℃下5%CO2加湿的空气中以200μl的无血清Ultra Culture培养液（BioWhittaker,Rockland,ME，培养液以2mM L-谷氨酸（SIGMA,USA）,50μMβ-巯基乙醇（SIGMA）和每毫升0.1mg的庆大霉5
素（Sigma）补充）来培养PBMC（2x10）。用不同浓度的合成肽（每孔1.25、0.6和0.3μg）和用于对比的每孔4U白细胞介素-2（Boehringer Mannheim,Germany）以及单独的培养液
3
来刺激细胞。培养6天后每孔加入0.5μCi的[H]胸苷（Amersham Pharmacia Biotech），
16小时后使用微贝塔闪烁计数器（Wallac ADL,Germany）通过液体闪烁计数来测定所引入的放射活性。从三次重复计算出平均cpm，从抗原或白细胞介素-2刺激与未刺激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数（SI）。
素（Sigma）补充）来培养PBMC（2x10）。用不同浓度的合成肽（每孔1.25、0.6和0.3μg）和用于对比的每孔4U白细胞介素-2（Boehringer Mannheim,Germany）以及单独的培养液
3
来刺激细胞。培养6天后每孔加入0.5μCi的[H]胸苷（Amersham Pharmacia Biotech），
16小时后使用微贝塔闪烁计数器（Wallac ADL,Germany）通过液体闪烁计数来测定所引入的放射活性。从三次重复计算出平均cpm，从抗原或白细胞介素-2刺激与未刺激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数（SI）。
[0495] 以不同浓度的合成肽刺激来自牧草花粉过敏性病人的PBMC。以肽刺激的刺激指数显著性低于以IL2刺激的。源自Phl p5的肽诱导了低特异性淋巴增殖反应。最低的反应出现于肽5，然后是肽4。
[0496] 实施例19：源自Fel d1的合成肽的特性
[0497] 为了获得适合于猫过敏症疫苗接种的肽，根据Fel d1的已知氨基酸序列设计了五个肽，这五个肽长度为30至36个氨基酸，并且覆盖了全分子。
[0498] 使用HBTU[2-（1H-苯并三唑-1-基）1,1,3,3四甲基脲六氟磷酸]-激活（0.1mmol小级别循环）以Fmoc（9-芴甲氧羰基）策略在Applied Biosystems肽合成器Model433A（USA）上合成了肽。预装的PEG-PS（聚乙烯乙二醇聚苯乙烯）树脂（0.15-0.2mmol/g装载）（PerSeptive Biosystems,UK）用作固相以建立起肽。化学物质从Applied Biosystems购买。通过在反馈控制系统中监视传导性来确定氨基酸的结合。向肽1、3、4和5加入一个半胱氨酸残基以促进其与载体的偶联（表7）。用250μl蒸馏水、250μl triisopropylsilan（Fluka,Switzerland）、9.5mlTFA的混合物从树脂中切割肽2小时，在叔丁基甲基醚（Fluka,Switzerland）中进行沉淀（Focke2001）。通过质谱检测肽的特性，通过制备性HPLC（PiChem,Austria）将肽纯化至>90%的纯度。
[0499] 表7：源自Fel d1的合成肽的分子特性。显示了源自Fel d1的合成肽在天然Fel d1分子内的位置、氨基酸序列、氨基酸数目、经计算的分子量（MW）和理论等电点（pI）。所有的肽在水中可溶。
[0500]
[0501] 五个源自Fel d1的合成肽具有介于3246至4083道尔顿的分子量，具有4.30至4.93的经计算的等电点。所有的五个肽均为水溶性的，肽1、2和3可能含有人T细胞表位（表7）。
[0502] 表8.与rFel d1相比源自Fel d1的合成肽具有减少的IgE反应活性
[0503]
[0504] 实施例20：与rFel d1相比源自Fel d1的合成肽具有减少的IgE反应活性并且源自Fel d1的合成肽缺少变应原性活性
[0505] 为了鉴定适合于疫苗接种的低变应原性肽，研究了血清IgE对源自Fel d1的合成肽的反应活性。
[0506] 对IgE 介 导 的 猫 过 敏 症 的 诊 断 是 基 于 既 往 病 历、刺 皮 测 试（Allergopharma,Reinbek,Germany）和对血清总IgE以及猫皮屑特异性血清IgE的测定（CAP-FEIA,Pharmacia Diagnostics,Sweden）。包括了用于对照目的的非过敏性人员。
[0507] 20.1.在ELISA测试中检测的IgE结合能力
[0508] 使用来自14个猫过敏性病人的血清对五个源自Fel d1的合成肽的IgE结合能力与完全rFel d1变应原进行了比较。ELISA板（Nunc Maxisorb,Denmark）以源自Fel d1的合成肽或作为对照的rFel d1（0.5μg/孔）进行包被，洗涤然后封闭。然后以1:5稀释的来自猫过敏性病人和非过敏性个体的血清在4℃下进行温育过夜。所结合的IgE抗体用1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的抗-人IgE抗体（KPL,USA）进行检测。
[0509] 对来自7个女性和7个男性猫过敏性病人（年龄为22至75岁）的血清进行CAP-FEIA确定。所测的总IgE水平介于122至>4000kU/l，猫皮屑特异性IgE水平介于1.99至>100kUA/l（表7）。在ELISA测试中，确定了所测的所有14个血清对主要猫变应原Fel d1的IgE反应活性。以光密度（OD）获得结果，其介于0.178至2.838OD单位。在相同的ELISA测试中测定了14个血清对源自Fel d1的合成肽的IgE反应活性。发现：肽1、2、3和5保留了IgE结合。对于肽1来说观察到的IgE结合为6/14血清，对于肽2为3/14血清，对于肽3为1/14血清，对于肽5为10/14血清。所测的OD单位对于肽1来说介于0.051至1.998之间，对于肽2来说介于0.060至0.123，对于肽3为0.186，对于肽5来说介于
0.056至0.677。总之，所测的所有OD单位均显著性低于各自的相对于完全Fel d1变应原所测的值。
0.056至0.677。总之，所测的所有OD单位均显著性低于各自的相对于完全Fel d1变应原所测的值。
[0510] 这证明了与完全Fel d1变应原相比，源自Fel d1的合成肽具有减少的IgE反应活性。因此，源自Fel d1的合成肽可认为是低变应原性的，当在SIT中使用时，其提供了减少的IgE介导的副作用的优点。
[0511] 20.1.对人嗜碱细胞上的表面标记CD203c和CD63表达的特异性诱导（图17）[0512] 由于IgE结合是诱导1型过敏性反应的先决条件，但不足以诱导1型过敏性反应，1型过敏性反应还需要与效应细胞结合的特异性IgE的交联，所以在嗜碱细胞激活测试中研究了源自Fel d1的合成肽的实际变应原性活性。这些测试检测到表面标记CD203c和CD63的变应原特异性上调，CD203c和CD63二者均被识别为嗜碱细胞激活的标记（Hauswirth等人J Allergy Clin Immunol.（2002）110:102-109）。
[0513] 在获得知会同意之后，从5个猫过敏性病人取得了肝素化血液样品。以系列稀释的rFel d1、源自Fel d1的合成肽作为单独成分或作为等摩尔混合物、抗-IgE抗体或缓冲液（PBS）在37℃下对血液等分试样（100μl）进行温育15分钟。温育之后，在含有20mM EDTA的PBS中洗涤细胞。然后以10μl PE偶联的CD203cmAb97A6和20μl的FITC偶联的TMCD63mAb CLB-gran12在室温下对细胞进行温育15分钟。然后，将样品以2ml FACS 裂解溶液进行红血球裂解。然后洗涤细胞，重悬于PBS，并在FACScan（Becton Dickinson）上用二色流式细胞术使用Paint-a-Gate软件分析。变应原诱导的CD203c和CD63的上调通过平均荧光强度（MFI）（由经刺激的（MFIstim）和未刺激的（MFIcontrol）细胞获得）来计算，并表达为刺激指数（MFIstim：MFIcontrol）。SI大于2.0（即大于2倍上调）被认为是特异性（诊断性）反应的指征。
[0514] 在所研究的所有五个猫过敏性病人（RR、EB、KC、MG和SM）的嗜碱细胞上，以rFel d1刺激均诱导了表面标记CD203c和CD63的变应原特异性上调。在5个病人中的4个（RR、KC、MG和SM）中观察到CD203c和CD63的上调为剂量依赖性的。对于这些病人来说：对于所测的最低浓度（0.001μg rFel d1/ml）,CD203c刺激指数为1.1（SM）至3.2（RR）；对于所测的最高浓度（10μg的rFel d1/ml），CD203c刺激指数为3.6（KC）至6.2（RR）。在同样的测试中所确定的CD63的刺激指数：对于所测的rFel d1的最低浓度（0.001μg rFel d1/ml）为介于1.1（RR）至2.0（MG）；对于所测的rFel d1的最高浓度（10μg的rFel d1/ml）为介于3.9（RR）至7.3（MG）。对于病人EB来说，0.001μg/ml的Fel d1已经足以诱导表面标记CD203c和CD63的高水平的上调，从而防止观察到表面标记上调的剂量依赖性。
[0515] 以五个渐增的浓度（0.005、0.05、0.5、5和50μg/ml）的五个源自Fel d1的合成肽的等摩尔混合物对来自所有的五个猫过敏性病人的嗜碱细胞进行探测。另外以五个渐增浓度（0.001、0.01、0.1、1和10μg/ml）的五个单独的源自Fel d1的合成肽对病人RR的嗜碱细胞进行探测。发现肽在上调表面标记CD203c和CD63上是缺陷的。肽不能够诱导病人RR、KC和SM的CD203c和CD63表达的任何增加。对于病人MG可检测到CD203c（SI=2.3）和CD63（SI=2.5）轻微的上调，但是仅限于所测的最高浓度（50μg肽混合物/ml），而所用的最低浓度也没有刺激效应。对于病人EB观察到更为有力的CD203c（SI=4.2）和CD63（SI=4.3）的上调，但是，仍然是只对所测肽混合物的最高浓度。在这两种情况下（病人MG和EB），以肽刺激后的上调率均比相应的以完全Fel d1变应原刺激后的显著性降低。
[0516] 这证明了源自Fel d1的合成肽提供了比完全Fel d1变应原具有较低的变应原性活性的优点。当在SIT中使用源自Fel d1的合成肽时，这与减少IgE介导的副作用风险相关。
[0517] 实施例21：以源自Fel d1的合成肽免疫诱导了与完全rFel d1反应的IgG抗体[0518] 源自Fel d1的合成肽在IgE结合方面表现为缺陷的。作为疫苗接种（目的是诱导变应原特异性IgG抗体）的候选分子，肽必须保持特异性的变应原结构并且必须仍然能够诱导对完全变应原特异性的IgG免疫反应。为了找出源自Fel d1的合成肽是否满足这些要求，在兔子中进行了免疫实验。
[0519] 以未经偶联的rFel d1和KLH偶联的源自Fel d1的合成肽对兔子进行免疫。使用Imject马来酰亚胺激活免疫原偶联试剂盒（Imject Maleimide Activated Immunogen Conjugation Kit）（Pierce,USA），通过它们的半胱氨酸残基将经HPLC纯化的肽偶联至KLH。
[0520] 使用CFA（第一次免疫）和IFA（4周后第一次推进性注射；7周后进行带有不完全佐剂的第二次推进性注射）（Charles River Breeding Laboratories,Germany）以免疫原（200μg/注射）对兔子（New Zealand White rabbits）进行免疫。在第一次免疫8周后然后在4周间隔内对兔子进行取血。
[0521] 在ELISA测试中监视肽特异性和rFel d1特异性抗体的诱导。ELISA板（Nunc Maxisorb,Denmark）以rFel d1（0.5μg/孔）进行包被，洗涤并封闭。然后用1:1000稀释的兔子抗血清和相应的兔子免疫前血清以两次重复的方式对板上所结合的rFel d1进行探测，以1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗-兔子抗血清（Jackson ImmunoResearch Inc.,USA）对所结合的IgG进行探测。计算两次重复的平均值，显示出小于5%的误差。
[0522] 以源自Fel d1的合成肽进行的免疫诱导了与Fel d1反应的IgG抗体。以五个源自Fel d1的合成肽中的每个进行第一次免疫八周之后，可在五个兔子抗血清中的每个里面检测到与完全Fel d1变应原反应的IgG抗体。在接下来的取血中IgG抗体水平保持了相当的水平（图16）。
[0523] 抗-肽1、抗-肽2、抗-肽4和抗-肽5兔子抗血清在与抗-Fel d1兔子抗血清大约相同的程度上表现出对Fel d1的IgG反应活性。抗-肽3兔子抗血清也表现出明显的但有些低的对Fel d1的IgG反应活性。
[0524] 这表明所有的5个源自Fel d1的合成肽均为诱导Fel d1特异性IgG抗体反应的候选分子。
[0525] 实施例22：源自Fel d1的合成肽诱导比Fel d1较弱的淋巴增殖反应
[0526] 所需要的用于改善的SIT的候选分子不仅提供减少的IgE介导的副作用的优点，而且有减少的T细胞介导的副作用的优点。为了研究源自Fel d1的合成肽的T细胞激活特性，进行了淋巴增殖测试。
[0527] 通过Ficoll（Amersham Pharmacia Biotech,UK）密度梯度离心从7个猫过敏性病人中分离了PBMC。以三次重复方式在96孔板（Nunclone,Nalgene Nunc International,Denmark）中在37℃下5%CO2加湿的空气中以200μl的无血清Ultra Culture培养液（Cambrex,Belgium，培养液以2mM L-谷氨酸（Sigma,USA）,50μMβ-巯基5
乙醇（Sigma）和每毫升0.1mg的庆大霉素（SIGMA）补充）来培养PBMC（2x10）。以不同浓度（5、2.5、1.25和0.6μg/孔）的rFel d1和源自Fel d1的合成肽作为单独成分或作为等摩尔混合物以及用作对照目的的4U白细胞介素-2或单独的培养液来刺激细胞。培养6天
3
后每孔加入0.5μCi的 H-胸苷（Amersham Pharmacia Biotech），16小时后使用微贝塔闪烁计数器（Wallac ADL,Germany）通过液体闪烁计数来测定所引入的放射活性，从三次重复计算出平均cpm。从抗原或白细胞介素-2刺激与未刺激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数（SI）。
乙醇（Sigma）和每毫升0.1mg的庆大霉素（SIGMA）补充）来培养PBMC（2x10）。以不同浓度（5、2.5、1.25和0.6μg/孔）的rFel d1和源自Fel d1的合成肽作为单独成分或作为等摩尔混合物以及用作对照目的的4U白细胞介素-2或单独的培养液来刺激细胞。培养6天
3
后每孔加入0.5μCi的 H-胸苷（Amersham Pharmacia Biotech），16小时后使用微贝塔闪烁计数器（Wallac ADL,Germany）通过液体闪烁计数来测定所引入的放射活性，从三次重复计算出平均cpm。从抗原或白细胞介素-2刺激与未刺激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数（SI）。
[0528] IL-2刺激了来自所测的所有7个猫过敏性病人的PBMC的增殖，产生的刺激指数对RR为9.8，对EB为5.2，对KC为3.2，对MG为6.7，对SM为6.3，对RA为15.7以及对AR为13.9。
[0529] 源自Fel d1的合成肽诱导了较低的刺激指数（表9）。
[0530] 表9：可鉴定源自Fel d1的合成肽（基于等摩尔）诱导了比Fel d1较弱的淋巴增殖反应。以系列稀释的rFel d1或源自Fel d1的合成肽作为单独成分对来自7个猫过敏性病人的PBMC进行刺激。以刺激指数显示特异性淋巴增殖反应。
[0531]
[0532]
[0533] 实施例23：以源自Fel d1的合成肽免疫而诱导的IgG抗体抑制猫过敏性病人的IgE与完全Fel d1变应原的结合
[0534] 在ELISA竞争测试中检测了肽诱导的兔子Ig抑制过敏性病人的IgE抗体与完全rFel d1结合的能力。ELISA板（Nunc Maxisorb,Denmark）以rFel d1（0.05μg/孔）进行包被，洗涤并封闭。然后以1:100稀释的兔子抗-肽抗血清（使用了单独的抗-肽抗血清以及抗-肽抗血清的混合物）、兔子抗-rFel d1抗血清和用于对照目的的相应的兔子免疫前血清对板上所结合的rFel d1进行预温育。在对板进行洗涤后，以1:5稀释的来自猫过敏性病人的人血清对它们进行温育。以1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的抗-人IgE抗体（KPL,USA）来检测所结合的IgE。按照如下计算经抗-肽抗血清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率：IgE结合的%抑制=100-O.D.I/O.D.P x100，其中O.D.I为以兔子免疫血清预温育后所测的光密度，O.D.P为兔子免疫前血清预温育后所测的光密度。
[0535] 以5个抗-肽兔子抗血清预温育ELISA板上所结合的Fel d1产生的抑制图谱在所测的来自猫过敏性病人的14个不同血清中有差别。抗-肽1兔子抗血清阻断了所测的13/14个病人的血清IgE与Fel d1的结合，抗-肽2兔子抗血清阻断了8/14个，抗-肽3兔子抗血清阻断了13/14个，抗-肽4兔子抗血清阻断了9/14个，抗-肽5兔子抗血清阻断了5/14个。
[0536] 在不同的抗血清中也显示出抑制程度的差异。在所测的单一的抗-肽兔子抗血清中，抗-肽1兔子抗血清表现出最好的抑制率（从0-55%，平均为29%）。抗-肽2兔子抗血清抑制率可达到0-18%（平均为5%），抗-肽3兔子抗血清为0-29%（平均为11%），抗-肽4兔子抗血清为0-24%（平均为8%），抗-肽5兔子抗血清为0-18%（平均为5%）。
[0537] 所有5个抗-肽兔子抗血清的混合物对所有病人的血清最有效地达到了对病人的IgE与Fel d1的结合的抑制，其抑制率为25-84%（平均为59%）。这些抑制甚至比通过用抗-Fel d1兔子抗血清预温育而达到的抑制还要显著（表10）。
[0538] 表10：针对源自Fel d1的合成肽产生的兔子抗血清抑制人IgE与Fel d1的结合。显示了14个病人中通过用兔子抗血清预温育Fel d1而达到的对IgE与Fel d1结合的抑制百分率（作为平均值）。预温育以5个针对源自五个Fel d1的合成肽产生的兔子抗血清（抗-肽1至5）、5个抗-肽抗血清的混合物（Mix）和一个针对Feld1产生的抗血清（抗-rFeld1）进行。
[0539]
[0540] 当把抗-肽1兔子抗血清与每个其他的抗-肽抗血清组合起来时，对过敏性病人的IgE结合的抑制显著性增高，几乎达到（例如，抗-肽1+4：41%，抗-肽1+5：42%）用抗-rFeld1抗体所得到的值（67%）（表11）。
[0541] 表11：
[0542]病人 抗-肽1+抗-肽2 抗-肽1+抗-肽3 抗-肽1+抗-肽4抗-肽1+抗-肽5抗-rFeIdl
1 61 49 61 63 75
2 24 17 28 28 74
3 60 52 62 57 86
4 43 33 43 40 68
5 17 9 27 30 67
6 37 24 42 46 73
7 26 21 36 34 74
8 51 46 53 55 72
9 40 28 46 43 61
10 16 11 30 34 40
11 45 35 47 45 78
12 52 40 56 59 76
13 29 17 29 32 62
14 7 10 14 16 28
平均 36 28 41 42 67
1 61 49 61 63 75
2 24 17 28 28 74
3 60 52 62 57 86
4 43 33 43 40 68
5 17 9 27 30 67
6 37 24 42 46 73
7 26 21 36 34 74
8 51 46 53 55 72
9 40 28 46 43 61
10 16 11 30 34 40
11 45 35 47 45 78
12 52 40 56 59 76
13 29 17 29 32 62
14 7 10 14 16 28
平均 36 28 41 42 67
[0543] 实施例24：接收到来自源自载体的T细胞表位的T细胞帮助的源自Bet v 1的肽诱导Bet v1特异性IgG反应并减少Bet v1特异性T细胞增殖
[0544] 已经表明源自Bet v1的、表面暴露的B细胞肽在小鼠治疗和预防性疫苗接种模型中诱导保护性的Bet v1特异性IgG反应（Focke M等人Clin Exp Allergy（2004）34:1525-1533）。在Focke M等人（2004）中，在免疫小鼠前将6个源自Bet v1的肽偶联至载体分子KLH。在本实施例中表明：这些肽所诱导的Bet v1特异性IgG反应（表1）是由源自载体的而不是源自Bet v1变应原的T细胞表位的帮助所驱动。令人惊奇地发现：任何一个具有以下序列的源自Bet v1的肽均未诱导相关的T细胞反应：
LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF（SEQ ID No.20）,GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN（SEQ ID No.21）和VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK（SEQ ID No.22）。这可以证明：大多数T细胞反应为针对载体分子KLH（图18和19）。这个发现对于减少治疗性疫苗接种中的副作用和减少预防性疫苗接种中潜在的致敏风险具有重要意义。过去已经证明：源自变应原的肽缺少任何IgE反应活性，但是由于T细胞激活而含有源自变应原的T细胞表位诱导的副作用。源自变应原的肽缺少IgE和T细胞反应活性，如Bet v1肽所例示，在治疗性疫苗接种中既没有诱导IgE介导的也没有诱导T细胞介导的副作用。当用于预防性疫苗接种时，该肽将诱导Bet v1特异性的保护性IgG反应而不预先准备好Bet v1特异性T细胞。这将最小化通过疫苗接种而预先准备好免疫反应（其可为接下来的过敏性致敏铺好道路）的风险。
LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF（SEQ ID No.20）,GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN（SEQ ID No.21）和VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK（SEQ ID No.22）。这可以证明：大多数T细胞反应为针对载体分子KLH（图18和19）。这个发现对于减少治疗性疫苗接种中的副作用和减少预防性疫苗接种中潜在的致敏风险具有重要意义。过去已经证明：源自变应原的肽缺少任何IgE反应活性，但是由于T细胞激活而含有源自变应原的T细胞表位诱导的副作用。源自变应原的肽缺少IgE和T细胞反应活性，如Bet v1肽所例示，在治疗性疫苗接种中既没有诱导IgE介导的也没有诱导T细胞介导的副作用。当用于预防性疫苗接种时，该肽将诱导Bet v1特异性的保护性IgG反应而不预先准备好Bet v1特异性T细胞。这将最小化通过疫苗接种而预先准备好免疫反应（其可为接下来的过敏性致敏铺好道路）的风险。
[0545] 在本实施例中，在治疗性和预防性变应原疫苗接种小鼠模型中变应原性和载体特异性T细胞反应是分开的。选取了源自Bet v1的肽2、3和6（Focke M等人（2004））并且在BALB/c小鼠中测试了它们是否含有任何已知的Bet v1特异性T细胞表位。按照如下对小鼠进行免疫（表10显示了致敏和处理程序）：以10μg重组Bet v1（Biomay,Austria）和/或合成的源自Bet v1的肽2、3和6的混合物（每个10μg）来免疫BALB/c小鼠组（n=5）。如前所述将肽偶联至KLH（Focke M等人（2004））。为了进行免疫，把Bet v1和肽混合物吸附至氢氧化铝（Alu-Gel-S,Serva,Germany），总体积为150μl/小鼠。
[0546] 表12：致敏和处理程序
[0547]
[0548] 在T细胞增殖测试中分析了变应原特异性、肽特异性和载体特异性淋巴增殖。在无菌条件下取出脾脏并匀浆。对红血球进行裂解后，洗涤细胞并重悬于完全培养液
5
（RPMI,10%胎牛血清,0.1mg/ml庆大霉素,2mM谷氨酸）。将单细胞悬浮液以2x10 细胞/孔植板于96孔圆底板并以作为阳性对照的concavalin A（0.5μg/孔）、rBet v1（2μg/孔）、KLH（2μg/孔）、肽混合物（0.34μg每种肽/孔）或单独的培养液刺激4天。以0.5μCi/孔含氚胸苷进行脉冲16小时并收集。由闪烁计数来测定增殖反应。计算了抗原和培养液对照刺激后的平均增殖比率值，即刺激指数（SI）。
5
（RPMI,10%胎牛血清,0.1mg/ml庆大霉素,2mM谷氨酸）。将单细胞悬浮液以2x10 细胞/孔植板于96孔圆底板并以作为阳性对照的concavalin A（0.5μg/孔）、rBet v1（2μg/孔）、KLH（2μg/孔）、肽混合物（0.34μg每种肽/孔）或单独的培养液刺激4天。以0.5μCi/孔含氚胸苷进行脉冲16小时并收集。由闪烁计数来测定增殖反应。计算了抗原和培养液对照刺激后的平均增殖比率值，即刺激指数（SI）。
[0549] 有趣的是，可以显示出：与致敏但未治疗的组S+/T-相比，Bet v1致敏小鼠（S+/T+组）中以源自Bet v1的肽进行的治疗性疫苗接种能够减少Bet v1特异性增殖。在致敏和处理组中，未检测到肽特异性增殖，但是根据载体效应，观察到了KLH特异性增殖。单独的肽疫苗（S-/T+组）主要诱导了KLH特异性T细胞，但几乎没有Bet v1特异性T细胞反应（图18）。
[0550] 与Bet v1致敏组P-/S+相比，以肽进行的预防性疫苗接种几乎没有诱导Bet v1特异性增殖（P+/S-组），但是有KLH特异性增殖。在进行预防性疫苗接种然后致敏的小鼠（P+/S+组）中，Bet v1特异性增殖显著地减少，而且，没有在任何小鼠组中观察到肽特异性反应（图19）。
[0551] 因此，可以显示：在过敏症小鼠模型中，以结合至载体的源自变应原的B细胞肽进行的预防性疫苗接种没有预先预备肽特异性T细胞，几乎没有变应原特异性而只有载体特异性T细胞。在过敏性致敏以及治疗性疫苗接种之前对小鼠进行的预防性疫苗接种减少了变应原特异性T细胞增殖。
[0552] 以源自Bet v1的肽进行的预防性处理（而无Bet v1特异性T细胞的帮助）诱导了Bet v1特异性IgG反应。而且，预防性处理增加了Bet v1特异性IgG反应（已经由Bet v1变应原在第一次致敏20和40天诱导）（图20）。
[0553] 这些结果证明：肽疫苗诱导了可被变应原暴露所推进的Bet v1特异性IgG反应。
[0554] 实施例25：表现出减少的IgE结合能力的源自Der p2的肽
[0555] 使用根据表13所述的肽和遭受屋尘螨过敏症个体的血清按照实施例15.1和20.1对源自Der p2的肽的IgE结合能力进行了确定。
[0556] 表13：源自Der p2的肽
[0557]
[0558] 结果清晰地显示：本发明的源自Der p2的肽表现出显著性减少IgE结合的能力。
[0559] 表14：结果
[0560]
[0561] 实施例26：肽长度的变异对肽的IgE结合能力、T细胞反应活性和免疫原性没有效应
[0562] 26.1.肽的设计
[0563] 为了研究肽长度变异对IgE结合能力、T细胞反应活性和免疫原性的效应，通过几个氨基酸来增加肽1（P1）的长度和减少肽2（P2）的长度而设计了源自Phl p5的肽的变体（表15）。
[0564] 表15：合成的源自Phl p5的肽（1，2）及其变体（1a，2b）的位置、序列、氨基酸数目的长度和分子量
[0565] 表15：源自PHL p5的合成肽的变体
[0566]
[0567] 26.2.缺少IgE反应活性
[0568] 为了分析源自Phl p5的肽1、2及其变体1a、2b的IgE反应活性，使用0.2μg的肽/点和来自7个草花粉过敏性病人（p1-p7）和1个来自非过敏性个体（NHS）的血清进行了点杂交测试。所结合的IgE以125I标记的抗-人IgE（Phadia,Uppsala,Sweden）进行检测。rPhl p5用作阳性对照，HSA用作阴性对照。病人与rPhl p5但不与肽和肽变体（图21）反应。
[0569] 26.3.淋巴增殖反应
[0570] 以不同浓度的源自Phl p5的肽1、2及其变体1a、2b和用于对照的rPhl p5刺激来自2个草花粉过敏性病人的PBMC。由肽所获得的刺激指数显著性较低于由rPhl p5所获得的（图22）。
[0571] 26.4.肽变体的免疫原性
[0572] 以KLH偶联的源自Phl p5的肽及其变体对兔子进行免疫。使用ELISA实验来测定所获得的兔子抗血清对肽及其变体的IgG反应活性（表16）。以肽及其变体进行免疫诱导了交叉反应性的能识别肽及其相应变体的IgG抗体。
[0573] 表16：在兔子中经以KLH偶联的肽免疫而产生的抗-Phl p5肽抗血清的交叉反应活性。显示了肽抗血清对肽（1，2）和变体（1a,2b）的IgG反应活性。用免疫前血清未观察到反应活性（pre P1,pre P1a,pre P2,pre P2b）。
[0574] a.抗肽1抗血清（抗P1）与肽1变体（1a）交叉反应，抗肽1a抗血清（抗P1a）与肽1交叉反应。
[0575] b.抗肽2抗血清（抗P2）与肽2变体（2b）交叉反应，抗肽2b抗血清（抗P2b）与肽2交叉反应。
[0576] 表16：兔子抗血清的交叉反应活性
[0577] a）
[0578]
[0579] b）
[0580]
[0581] 26.5.肽诱导的兔子抗血清抑制草花粉过敏性病人的IgE与rPhl p5的结合[0582] 在竞争性ELISA中研究了兔子抗-肽2和2b IgG的抑制人IgE与rPhl p5结合的能力。ELISA板以抗P2、抗P2b和用于对照目的的抗Phl p5抗血清进行预温育。然后将板暴露于来自12个草花粉过敏性病人的血清。在表17中显示了对IgE与rPhl p5结合的抑制百分率。抗肽2和抗肽2b抗血清在相同程度上抑制病人的IgE与rPhl p5的结合。
[0583] 也以兔子抗肽1和1a抗血清进行了竞争性ELISA。在实施例17中（以源自Phl p5的肽进行免疫诱导了IgG抗体，其抑制了草花粉过敏性病人的IgE与Phl p5的结合）抗肽1（P1）抗体抑制了病人的IgE与Phl p5的结合（其平均抑制率为28.5%）。使用抗肽1a抗血清获得了相似的结果（其抑制百分率为23.7%）。
[0584] 表17：抗肽抗血清对病人的IgE与rPhl p5结合的抑制。抗肽2和抗肽2b抗血清在相同程度上抑制病人的IgE与rPhl p5的结合。ELISA板上所结合的rPhl p5以抗P2、抗P2b和用于对照目的的抗Phl p5抗血清进行预温育。然后将板暴露于来自12个草花粉过敏性病人的血清。显示了对IgE与rPhl p5结合的抑制百分率。
[0585] 表17：对IgE结合的%抑制
[0586]
[0587] 实施例27：抗-VP1抗体的交叉保护
[0588] 人类鼻病毒包含超过一百种不同的株。在这个中和测试中显示：一种株的鼻病毒感染也可被另一种株的VP1特异性抗体所抑制。以等密度将HeLa细胞铺种于孔中。100TCD50HRV14以抗-14VP1和抗-89VP1抗体（未稀释的；1:2-1:32孔1-6）进行预温育并分别加入到行A和D的孔中。把用抗-14VP1和抗-89VP1分别预温育的100TCD50HRV89加入到行B和C的孔中。3天后活细胞染成紫色。抗-89VP1抗体和抗-14VP1抗体以相互可比较的方式阻断了HRV14的感染。针对14VP1和89VP1产生的抗体也在相同浓度上抑制了HRV89的感染。
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