一种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株及应用
阅读：232发布：2020-05-21
专利汇可以提供一种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 对 屋尘螨 （Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2进行基因调整后得到修饰性过敏原基因xderp2，并构建了含有xderp2基因的重组质粒和重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD（保藏号为CGMCC No.8220）。Western blot结果显示，修饰性过敏原XDerp2蛋白可以在重组乳酸乳球菌中表达；同时，动物实验结果显示，口服表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌可以明显抑制尘螨过敏反应。，下面是一种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株及应用专利的具体信息内容。
1.一种屋尘螨修饰性过敏原XDerp2，该修饰性过敏原的基因序列为SEQ ID No.1。
2.如权利要求1所述的屋尘螨修饰性过敏原XDerp2，其特征在于该修饰性过敏原是通过对来源于屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID No.2进行基因调整后获得的。
3.一株表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis XD，于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8220。
4.如权利要求3所述的表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD，其特征在于所述菌株是通过将修饰性过敏原基因xderp2克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-XD，再将其电转入宿主乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000中而获得的。
5.将权利要求1或2所述修饰性过敏原用于预防尘螨过敏疾病的用途。
6.将权利要求3或4所述重组乳酸乳球菌菌株用于预防尘螨过敏疾病的用途。
一种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌
株及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及遗传资源工程，特别涉及一种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.lactisXD及应用。
背景技术
[0002] 过敏性哮喘是一类临床常见病、多发病，其诱发因素很多，包括花粉、毛发、尘螨等。其中，尘螨是一类最为主要的过敏原，人们已初步鉴定出几十种过敏原；80%-90%的尘螨过敏患者对Derp2产生过敏反应。目前，特异性免疫治疗（SIT）被认为是最为有效的治疗过敏的方法，但成功的免疫治疗取决于高质量的变应原。目前用于临床治疗的尘螨过敏原制剂，多为从自然界中分离获得的天然过敏原混合物，用于SIT治疗存在着不可避免的副作用：首先，对某一过敏患者而言，其存在着大量非过敏原成分，而这些非过敏原成分有时会造成新的过敏反应；其次，特异性免疫治疗的原理是使过敏机体不断接触逐渐增加剂量的过敏原，从而使机体产生耐受反应，而在治疗过程中，过敏机体与相应的过敏原接触会产生轻微的炎症反应，因此会对机体造成一定的损伤。
[0003] 目前，已有研究报道指出通过构建天然过敏原的衍生物，在保留天然过敏原免疫原性的基础上消除其反应原性，可以增加特异性免疫治疗的安全性。由于过敏原的衍生物无法通过分离纯化的方法从自然界中获得，通过人为加工的方法成为获得过敏原衍生物的唯一方法。过敏原衍生物在体外的化学合成或在传统的表达系统大肠杆菌内表达，存在着安全性不高、成本较高、批次重复性差等缺点。乳酸菌作为肠道固有菌群的一部分，已被证明对人体的免疫起着非常重要的作用，包括维持肠道平衡和促进人体免疫系统的成熟。以乳酸菌作为表达系统在特定部位表达功能蛋白，对于某些肠道疾病及自身免疫性疾病具有很好的预防及治疗效果，其优势在于：可以选择性的表达单一抗原或几种抗原；由于乳酸菌的可食用性，避免了后续过敏原的纯化问题；其次，乳酸菌可以采用口服的方式进入机体，从接受程度上更为病人所接受。综上，我们构建了一株可以表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌，并通过动物实验对其预防尘螨过敏疾病的特性进行了研究。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种修饰性过敏原XDerp2，提供一种表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株Lactococcus lactis XD（保藏号CGMCC No.8220），提供将所述修饰性过敏原用于预防尘螨过敏疾病的用途，以及提供将所述重组乳酸乳球菌菌株用于预防尘螨过敏疾病的用途。
[0005] 一方面，本发明提供了一种修饰性过敏原XDerp2，该修饰性过敏原的基因序列为SEQ ID No.1。
[0006] 所述屋尘螨修饰性过敏原XDerp2是对来源于屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID No.2（genebank：AF276239.1）进行基因调整后获得的。
[0007] 另一方面，本发明提供了一种表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD（保藏号CGMCC No.8220）。
[0008] 所述表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD是通过将修饰性过敏原基因xderp2克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-XD，再将其电转入宿主乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000中而获得的。
[0009] 另一方面，本发明提供了将所述修饰性过敏原XDerp2用于预防尘螨过敏疾病的用途。
[0010] 再一方面，本发明提供了将所述重组乳酸乳球菌菌株用于预防尘螨过敏疾病的用途。
[0011] 本发明的优点是：在保留天然过敏原免疫原性的基础上消除其反应原性，可以增加特异性免疫治疗的安全性。由于过敏原XDerp2去除了反应原性，可以避免治疗过敏时带来的炎症反应，因此可以缩短尘螨过敏疾病的治疗时间。相比传统的疫苗，本发明所用的乳酸菌疫苗可以被制作成粉状制剂、胶囊等形式的药品，通过口服的方式用于尘螨过敏疾病的预防和替代现有的尘螨疫苗，更好的用于尘螨过敏疾病的治疗。由于微生物的培养具有操作简单、成本较低等特点，可以大大降低过敏疾病治疗的费用。此外，相比传统疫苗的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更容易使机体产生耐受反应。
[0012] 本发明涉及的菌种包括：乳酸乳球菌Lactococcus lactis XD，于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究中心，保藏编号为CGMCC No.8220。附图说明
[0013] 图1.表示重组乳酸乳球菌L.lactis XD表达XDerp2的Western blot检测结果。
[0014] 其中：
[0015] Y：阳性对照:纯化的Derp2蛋白；
[0016] XD：菌株L.lactis XD培养基的上清成分；
[0017] C：阴性对照:L.lactis 8148(含空质粒)培养基的上清成分。
[0018] 图2.表示小鼠免疫过程示意图。
[0019] 其中，进行小鼠尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段：首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理（200μl菌体或生理盐水）；在第17、24、31天进行腹腔注射Derp2/Alum（Pierce，美国）（200μl）的混合物，使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将溶解在PBS溶液中的Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。
[0020] 图3.表示口服重组乳酸乳球菌对小鼠体内过敏原特异性抗体的影响。
[0021] 其中：
[0022] Positive:阳性对照组小鼠模型，
[0023] XD：口服重组乳酸菌L.lactis XD组小鼠模型，
[0024] Control：阴性对照组小鼠模型（口服生理盐水）。
[0025] 图4.表示肺部的组织形态观察。
[0026] 其中：
[0027] Positive:阳性对照组小鼠模型，
[0028] XD：口服重组乳酸菌L.lactis XD组小鼠模型，
[0029] Control：阴性对照组小鼠模型（口服生理盐水）。实施例
[0030] 下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
[0031] 1、根据乳酸乳球菌基因组数据，分析乳酸乳球菌的密码子偏好性、GC含量等参数，将来源于屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID No.2（genebank：AF276239.1）进行基因调整，得到修饰性过敏原基因xderp2的序列SEQ ID No.1；
[0032] 2、将修饰性过敏原基因xderp2克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148（中国科学院钟瑾研究员惠赠）上，获得重组质粒pNZ8148-XD，再将其电转入宿主乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000中，得到重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD（保藏号CGMCC No.8220），该菌株已于2013年9月18日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；
[0033] 3、用Western blot检测重组乳酸乳球菌L.lactis XD中重组过敏原XDerp2的表达情况，发现过敏原XDerp2可在重组乳酸乳球菌内成功表达；
[0034] 4、动物实验结果说明，口服重组乳酸乳球菌L.lactis XD可明显降低小鼠体内Derp2特异性IgE的水平；此外，实验小鼠肺部组织学的分析结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis XD可明显抑制尘螨过敏原Derp2所引起的肺部炎症反应。
[0035] 具体技术细节如下：
[0036] 1、尘螨过敏原Derp2的基因调整
[0037] 参照derp2基因序列SEQ ID No.2（genebank：AF276239.1），基于乳酸乳球菌基因组的特点，根据GC含量、稀有密码子使用情况等对其进行基因优化，得到优化后的基因序列mderp2，人工合成后克隆到质粒pUC57（生工生物工程（上海）有限公司）上，得到pUC57-mderp2质粒；然后根据已有的文献报道和实验数据进行分析，对所述序列进行调整和重排，在保留过敏原Derp2免疫原性的基础上，消除其反应原性，基因调整后的序列命名为xderp2。
[0038] 尘螨过敏原修饰后的基因序列xderp2：SEQ ID No.1。
[0039] 尘螨过敏原Derp2的原始序列AF276239.1：SEQ ID No.2。
[0040] 尘螨过敏原Derp2的修饰后氨基酸序列XDerp2：SEQ ID No.3
[0041] 尘螨过敏原Derp2的原始氨基酸序列：SEQ ID No.4
[0042] 2、重组表达质粒的构建
[0043] 以 人 工 合 成 的 质 粒 pUC57-mderp2为 模 板，采 用 融 合 PCR（PCR 程序 为：95 ℃ 30s，57 ℃ 30s,72 ℃ 30s,30 个 循 环；PCR反 应 体 系 (50μl)：5μl dNTPs(2mM),5μl10×Buffer,1μl Taq E,3对融合引物（表1）各1μl,模板1μl）的方法扩增基因xderp2，并通过1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段，然后经内切酶KpnI和XbaI处理后得到目的片段-xderp2；以乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000（中国科学院钟瑾研究员惠赠）的基因组为模板，以SPusp45-F和SPusp45-R（表1）为引物，采用PCR的方法扩增信号肽序列SPusp4（5 GeneBank:EU382094.1）（PCR程序为：95℃30s，57℃30s,72℃30s,30个循环；PCR反应体系：5μl dNTPs(2mM),5μl10×Buffer,1μl Taq E,上下游引物各1μl,模板1μl），目的产物经PCR产物纯化试剂盒回收得到目的片段后，以内切酶NcoI和KpnI在37℃条件下反应3小时，再经PCR产物纯化试剂盒回收目的片段-SPusp45；然后与酶切处理的质粒pNZ8148片段进行连接得到表达质粒pNZ8148-XD，电转入乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000中，得到重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD。
[0044] 表1（如SEQ ID No.5-12）
[0045]
[0046] 3、重组乳酸乳球菌L.lactis XD中重组蛋白XDerp2的检测
[0047] 重组乳酸乳球菌L.lactis XD菌株过夜活化（挑取单菌落至5ml GM17培养基中（1000mlGM17培养基：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉2.5g，β-磷酸甘油二钠19g，维生素C0.5g，1MMgSO4 1ml，葡萄糖5g）（终浓度为10μg/ml氯霉素））后，30℃条件下培养至OD600=0.5，加入Nisin（Sigma-Aldrich）至终浓度10ng/ml，培养6小时；8000rpm离心，5min，收集上清液，采用三氯乙酸（TCA）浓缩蛋白的方法进行浓缩：取1.7ml上清液加入2ml EP管中，然后加入300μl100%TCA混合均匀后，冰浴2h，然后13000rpm4℃，离心10min；弃上清，加入1ml预冷的丙酮，将沉淀重悬并离心，重复两次，然后室温下晾干，加入
100μl50mMNaOH重悬，最后加入100μl 2x loading buffer（250mM Tris-HCl，10%(w/v)SDS,50%(w/v)甘油,5%(w/v)β-巯基乙醇），在沸水中煮10min。
100μl50mMNaOH重悬，最后加入100μl 2x loading buffer（250mM Tris-HCl，10%(w/v)SDS,50%(w/v)甘油,5%(w/v)β-巯基乙醇），在沸水中煮10min。
[0048] 取15μl处理后 的样品 上样，经5-12%SDS-PAGE电 泳分离 后，转移 至PVDF(Millipore，美国)膜上，分别用Derp2特异性多克隆抗体（一抗）（京天成生物技术(北京)有限公司）及HRP标记的羊抗兔lgG抗体（二抗）(Thermo,美国)杂交后，加入新鲜配置的eECL显色液（北京康为世纪生物科技有限公司）避光显色。
[0049] 经Western blot检测，证实重组乳酸乳球菌L.lactis XD可表达XDerp2蛋白，结果参见图1。如图1所示，在阴性对照菌株的上清部分没有为检测出信号（标号为C的泳道），在阳性对照（标号为Y的泳道）及重组菌株的上清部分（标号为XD的泳道）均检测到信号，其中重组菌株L.lactis XD上清液中信号所代表的蛋白大小要小与阳性对照组，这与修饰性蛋白XDerp2切除了部分基因导致蛋白变小结果一致，说明重组乳酸乳球菌可成功表达修饰性过敏原XDerp2蛋白。
[0050] 4、动物实验
[0051] 参见图2，首先，进行小鼠尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段：首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理（200μl菌体或生理盐水）；在第17、24、31天进行腹腔注射Derp2/Alum（Pierce，美国）（200μl）的混合物，使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将溶解在PBS溶液中的Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。
[0052] 小鼠灌胃重组乳酸乳球菌的准备：重组乳酸乳球菌L.lactis XD活化后，按照1:50的比例接入GM17培养基中进行培养，至OD600=0.5左右，然后加入nisin至终浓度
10ng/ml,30℃培养6h后，8000rpm，5min离心收集菌体，用预冷的灭菌的生理盐水洗涤2遍
10
后，加入一定体积的生理盐水，调整菌落数为1x10 CFU/ml，取200μl进行小鼠灌胃。
10ng/ml,30℃培养6h后，8000rpm，5min离心收集菌体，用预冷的灭菌的生理盐水洗涤2遍
10
后，加入一定体积的生理盐水，调整菌落数为1x10 CFU/ml，取200μl进行小鼠灌胃。
[0053] 5、过敏原特异性抗体的测定
[0054] 在实验结束处死小鼠时，收集小鼠血液，室温静置2h，4000rpm离心10min，取上层血清，测定其中Derp2特异性抗体的浓度，测定方法为文献中所提及的ELISA方法。实验结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis XD通过提高Derp2特异性IgG2a浓度降低Derp2特异性IgE的浓度，抑制尘螨过敏反应。
[0055] 血清中特异性抗体的测定方法：
[0056] （1）包被：用包被缓冲液（1000ml含Na2CO3 1.59g；NaHCO3 2.93g，ph调至9.6）将提取的Derp2蛋白稀释到10μg/ml，每孔加入100μl后4℃包被过夜。次日弃去孔内液体，用PBST（1000ml0.1M的PBS缓冲液中加入1ml Tween 20）洗涤3次，每次3min。
[0057] （2）封闭：酶标板加样孔干燥后每孔加入100μl封闭液（1g牛血清蛋白溶解到100ml的0.1M PBS缓冲液中），37℃封闭2h，然后用同样方法洗涤3次。
[0058] （3）加样：加100μl适度稀释的小鼠血清于已包被的反应孔中，分别设置空白对照和阴性对照（PBS对照组血清），37℃保温1h后同样方法洗涤。
[0059] （4）加酶标二抗：每孔加入100μl新鲜稀释的酶标二抗（IgE和IgG2a）（SouthernBiotech，美国），37℃保温1h，用PBST洗涤2次，最后用不含Tween-20的PBS洗涤一次。
[0060] （5）加底物液显色：向每孔中加入新鲜配置的TMB底物溶液（北京康为世纪生物科技有限公司），每孔100μl，室温暗处静置反应15min。
[0061] （6）终止反应及检测：向各反应孔中加入2MH2SO450μl，轻敲酶标板使其均匀混合以终止反应，然后在15min内将酶标板置于酶标仪（Thermo，美国）上，于450nm处读取各孔的OD值。
[0062] 如图3所示，相比阳性对照组小鼠，口服重组乳酸乳球菌明显降低小鼠血清中特异性IgE的浓度，增加特异性IgG2a的分泌表达。结果说明，口服重组乳酸乳球菌可以通过特异性IgG2a抗体表达水平的升高降低血清中特异性IgE抗体的表达，达到抑制过敏反应的目的
[0063] 6、肺部的组织切片
[0064] 取新鲜的小鼠肺部，用生理盐水冲洗掉多余的血液，然后放入10%的多聚甲醛中保存过夜，然后用大量的清水冲洗，将多聚甲醛冲洗干净，然后用75%的乙醇保存，然后经脱水、包埋及切片染色后，在光学显微镜下观察肺部的组织形态。参见图4，结果显示，口服重组菌株的实验组小鼠，肺部的细胞浸润反应要明显低于阳性对照组，但要高于阴性对照组，说明口服重组菌株对过敏反应有一定的抑制。
[0065] 结论：
[0066] 通过动物实验结果发现，口服表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌L.lactis XD可明显抑制过敏反应发生，证实了天然过敏原Derp2的衍生物XDerp2具有同天然过敏原Derp2类似的免疫原性，具有较好的应用前景和更好的研究价值。
[0067] 应用前景：
[0068] 经动物实验证实，修饰后的过敏原Derp2确实可以起到明显的预防尘螨过敏疾病的作用。通过基因工程的手段，可以使XDerp2蛋白在体外合成表达，经处理纯化后可代替传统的尘螨制剂用于尘螨过敏疾病的治疗；因其消除了反应原性，可以降低治疗时带来的轻微炎症反应，并可有效的减少治疗时间和治疗的费用。除此之外，通过分子学技术使xderp2基因在可食用中的食物中表达，如大米，蔬菜等，可通过口服的方式用于治疗和预防尘螨过敏疾病。
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