过敏性
疾病(如哮喘、过敏性鼻炎等)是临床上的常见病、多 发病,据2000年WHO/IAACI报告指出近些年来哮喘的发病率和死亡 率呈上升趋势。全国部分城市对青少年哮喘流行病学统计(ISSAC 调查)哮喘发病率为3.3%-5.1%,远较10年前(约1%)升高;目前 全国至少有一千万以上儿童患哮喘。
过敏性疾病是由于各种
接触或吸入变应原引起的,变应原大部分 为
蛋白质,也可为多肽或糖类以及人工合成的物质如药物等。最常见 的变应原是尘螨。尘螨是强烈的变应原之一,可引起的全身性变态反 应疾病包括变应性哮喘、变应性鼻球结膜炎、特应性湿疹/皮炎、变 应性荨麻疹等。螨性变应疾病占各种变态反应疾病的70%左右。在 我国和世界的大部分地区,分布最广泛的、研究最深入的两种引起全 身性变态反应疾病的尘螨包括户尘螨和粉尘螨。它们喜好在温暖、潮 湿环境中繁衍,经调查空调过滤网也是它们嗜好的栖居场所之一。人 们在密封空调室内工作、生活和学习时间越来越多,因而室内空调过 滤网灰尘中尘螨变应原可成为室内主要的致敏因素之一。
螨体虽小,但生理器官系统俱全,成分非常复杂,含有数十种变 应原,已经确定的尘螨变应原有十余类,每一类别的分子量、酶的功 能、IgE的结合率和结合
力,以及含量等,大部分已测得。其中I 类变应原(户尘螨的Der p1和粉尘螨的Der f1)是尘螨变应原重要的 组成部分。该成份于尘螨
粪便颗粒中含量最高(每颗0.1ng),具有巯 基蛋白酶的活性。Der pl、Der f1理化性质相似,
氨基酸序列高度同 源,Mr为25×103,pI为4.5~7.2,最佳
温度条件为37℃,pH6.0。与 过敏者血清IgE结合率为80%~100%。其氨基酸序列为一种与木瓜蛋 白酶相似的半胱氨酸蛋白酶。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发 展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简 便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的 目的基因或某一DNA
片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,能直 接观察和判断。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退 火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经 加热至93--95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形 成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反 应作准备;②模板DNA与引物的
退火(复性):模板DNA经加热变性 成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按
碱基
配对与半保 留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
运用PCR的方法检测尘螨特异的DNA序列具有简单、实用、灵 敏度和特异性高等优点。只需要少量的样品即可检测出
屋尘螨和粉尘 螨变应原基因的存在。本研究为研制防螨和杀螨新型空调设备提供了 技术
基础。同时,为居家环境中的尘螨检测提供了一种技术手段。
本发明的内容,通过以下的
实施例作具体说明: 实施例1:提取空调过滤网灰尘中的总的
微生物基因组DNA
采用玻璃颗粒吸附法提取空调过滤网灰尘中的总的微生物基因 组DNA,先配制下列溶液:
灰尘裂解液
5mol/L异硫氰酸胍
0.1mol/L EDTA(pH8.0)
玻璃颗粒-DNA结合缓冲液(含50mg/ml玻璃颗粒5~25u):
6mol/L高氯酸钠
50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10mmol/L TDTA(Trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N’,N’, -tetracetic acid)
洗脱缓冲液:
0.2mol/L高氯酸钠
50mmol/L Tris-Cl,pH8.0
10mmol/L TDTA
操作步骤:
(1)称取空调过滤网灰尘100mg悬浮于500ul灰尘裂解液中,混 匀,55℃放置2小时,离心12000rpm 15min,取上清。
(2)在上清中加入2.5ml玻璃颗粒-DNA结合缓冲液,室温摇荡混 匀20分钟。
(3)离心30秒种沉淀结合DNA的玻璃颗粒。
(4)用500ul结合缓冲液再悬
浮漂洗沉淀1次,离心30秒,弃 上清。
(5)加入1ml洗脱液悬浮玻璃颗粒,室温摇荡混匀20分钟。
(6)离心30秒种,吸出上清转移至1个新Eppendorf管中。
(7)加入2倍容积100%的
乙醇,反复颠倒Eppendorf管数次, 12000g离心5分钟沉淀DNA。
(8)弃上清,加入500ul 90%乙醇悬浮漂洗DNA沉淀,1000g离 心3分钟,弃上清,室温
蒸发乙醇20分钟或
真空干燥10分钟, DNA可直接溶解于200ul TE中,供下面的PCR反应模板之 用。
实施例2:空调过滤网灰尘中粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测
本发明采用套式PCR技术对空调过滤网灰尘中粉尘螨主要变应 原Der f1基因的检测。可以采用两套引物放在一起进行套式PCR反 应,也可以采用下面分两步进行PCR的方法。具体操作如下:
(1)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测正向外引物Der fp1,其序列为5’atc aat tcg gtt aac gtt aac 3’
(2)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测反向外引物Der fr1,其序列为5’ttg gtc gtc ggc att gtt gtt 3’
(3)先将引物离心,然后分别用灭菌
水稀释,终浓度均为50pmol/ul。 PCR反应体积为20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物分别加0.5ul; Taq酶1ul;实施例1提供模板1ul;灭菌水13.4ul。
(4)PCR反应程序为:
95℃,3分30秒
94℃,40秒
55℃,50秒 30cycles
72℃,50秒
72℃,10min。 按上述条件进行PCR反应。
(5)PCR产物
电泳:琼脂糖胶浓度为2%,每个样品上样8ul,120V电 泳40min,Marker为DNA 100bp ladder。
(6)从琼脂糖胶中回收目的DNA片段,其大小约为360bp,按照胶回 收
试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit试剂盒的方法进行 提取。回收的DNA溶解于400ul TE中,供第二次的PCR反应模板 之用。
(7)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测正向内引物Der f p2,其序列为5’gaa att gga ttt acg atc act gc 3’
(8)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测反向内引物Der f r2,其序列为5’gta tgg ata gct tct ttc ttc aac 3’
(9)先将合成的引物离心,然后分别用灭菌水稀释,终浓度均为 50pmol/ul。PCR反应体积为20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物 分别加0.5ul;Taq酶1ul;第一次的PCR反应产物为模板取1ul;灭 菌水13.4ul。
(10)PCR反应程序为:
95℃,3分30秒
94℃,40秒
55℃,50秒 30cycles
72℃,50秒
72℃,10min。
按上述条件进行PCR反应。
(11)PCR产物电泳:琼脂糖胶浓度为2%,每个样品上样8ul,120V 电泳40min,Marker为DNA 100bp ladder。有大小约为300bp。目 的DNA片段即为检测阳性。
(12)可以按照胶回收试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit 试剂盒的方法进行目的DNA回收并进行克隆和DNA序列分析与 GENEBANK进行比较分析。
实施例3:空调过滤网灰尘中屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测实
本发明采用套式PCR技术对空调过滤网灰尘中屋尘螨主要变应 原Der p1基因的检测。可以采用两套引物放在一起进行套式PCR反 应,也可以采用下面分两步进行PCR的方法。具体操作如下:
(1)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测正向外引物 Der p p1,其序列为5’gaa act aac gcc tgc agt atc 3’
(2)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测反向外引物 Der pr1,其序列为5’att tgg tcg tcg gca tga ttg 3’
(3)先将引物离心,然后分别用灭菌水稀释,终浓度均为50pmol/ul。 PCR反应体积为20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物分别加0.5ul; Taq酶1ul;实施例1提供模板1ul;灭菌水13.4ul。
(4)PCR反应程序为:
95℃,3分30秒
94℃,40秒
55℃,50秒 30cycles
72℃,50秒
72℃,10min。
按上述条件进行PCR反应。
(5)PCR产物电泳:琼脂糖胶浓度为2%,每个样品上样8ul,120V电 泳40min,Marker为DNA 100bp ladder。
(6)从琼脂糖胶中回收目的DNA片段,其大小约为360bp,按照胶回 收试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit试剂盒的方法进行 提取。回收的DNA溶解于400ul TE中,供第二次的PCR反应模板 之用。
(7)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测正向内引物Der pp2,其序列为5’gaa atg ctc cag ctg aaa tcg at 3’
(8)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测反向内引物Der p r2,其序列为5’t cga tag tag ctt tct tgg acg 3’
(9)先将合成的引物离心,然后分别用灭菌水稀释,终浓度均为 50pmol/ul。PCR反应体积为20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物 分别加0.5ul;Taq酶1ul;第一次的PCR反应产物为模板取1ul;灭 菌水13.4ul。
(10)PCR反应程序为:
95℃,3分30秒
94℃,40秒
55℃,50秒 30cycles
72℃,50秒
72℃,10min。
按上述条件进行PCR反应。
(11)PCR产物电泳:琼脂糖胶浓度为2%,每个样品上样8ul,120V 电泳40min,Marker为DNA 100bp ladder。有大小约为300bp。目 的DNA片段即为检测阳性。
(12)可以按照胶回收试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit 试剂盒的方法进行目的DNA回收并进行克隆和DNA序列分析与 GENEBANK进行比较分析。
一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法.seq
一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法
<110>深圳大学
<120>一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法
<160>8
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测粉尘螨主要变应原Der f1基因的正向外引物Der f p1
<400>1
atcaattcgg ttaacgttcc a 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测粉尘螨主要变应原Der f1基因的反向外引物Der f r1
<400>1
ttggtcgtcg gcattgttgt t 21
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测粉尘螨主要变应原Der f1基因的正向内引物Der f p2
<400>1
ggaattggat ttacgatcac tgc 23
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测粉尘螨主要变应原Der f1基因的反向内引物Der f R2
<400>1
gtatggatag cttctttctt caac 24
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测屋尘螨主要变应原Der p1基因的正向外引物Der p p1
<400>1
gaaactaacg cctgcagtat c 21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测屋尘螨主要变应原Der p1基因的反向外引物Der p r1
<400>1
atttggtcgt cggcatgatt g 21
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测屋尘螨主要变应原Der p1基因的正向内引物Der p p2
<400>1
gaaatgctcc agctgaaatc gat 23
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测屋尘螨主要变应原Der p1基因的反向内引物Der p R2
<400>1
tcgatagtag ctttcttgga cg 22