一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用途
阅读：731发布：2020-05-30
专利汇可以提供一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种新的 治疗 肺 癌的Der p1纳米 疫苗 及其制备方法和用途，其方法是：先采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备Der p1蛋白，然后应用 生物 可降解的PGLA 纳米粒子 作为包裹材料制备PLGA‑尘螨应变原Der p1﹙PLGA‑Der p1﹚纳米疫苗，即为本 发明 产品。本发明所揭示的一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，具有良好的抗癌功能，对肺癌有着显著的治疗效果，既对人体无毒害作用，还能增加 机体 免疫能 力 ，且制备工艺简单。，下面是一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种Der p1纳米疫苗在制备治疗肺癌药物上的应用，其特征是所述Der p1纳米疫苗采用如下方法制备：
步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：
（1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的LB中，35 37℃，160 240rpm摇菌过夜，按1 4%的接种量将基因工程菌菌落~ ~ ~
接种于LB/kam培养液中，200 300rpm摇菌至OD600为0.5 0.7时，加入IPTG使其终浓度为0.1~ ~
0.4mM，诱导4 6小时后，2000 4000g在2 6℃离心5 15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，将细~ ~ ~ ~ ~
菌重悬于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌酶至终浓度0.4 0.6mg/ml，DTT至终浓度5~ ~
15mM，PMSF至终浓度0.8 1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8 1.2%，并于室温中振荡20~ ~ ~
40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
（2）将裂解液置于冰浴下40W超声5 15遍，超声20 40s、停20 40s，直至菌体不粘为止，~ ~ ~
10000 12000g3 5℃离心10 20min，去上清，得基因工程菌包涵体；
~ ~ ~
（3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀，并磁力搅拌20 40min，10000 12000g3 5~ ~ ~
℃离心10 20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬，冰浴磁力搅拌，离心~
去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000 12000g离心30min，弃沉淀，得包涵~
体；
由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；
步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：
称50mg PLGA溶于二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min，40w超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化1 2 min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室温下搅~
拌3 5h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸水洗涤，~
最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存；
所述步骤一（1）中的基因工程菌菌落接种量为2%；摇菌至终浓度为0.2mM；PMSF至终浓度为1mmol/L；Triton X-100至终浓度为1%；
其特征是：所述步骤一（3）中的包涵体洗液1为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，
5mmol/L EDTA；包涵体洗液2为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X-100；包涵体洗液3为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，4mol/L尿素；包涵体溶解液为50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素；
所述步骤二中的所述的PLGA为LA:GA=65:35，Mw=40000-75000。
一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及新型疫苗发明领域，具体地说是一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用途。
背景技术
[0002] 肺癌已经成为全球范围内所有癌症发病率的首位，其五年存活率大约为15％，约30-40%的肺癌患者发生骨转移，一旦发生骨转移，其中位生存时间只有7个月。美国2012年肺癌有超过163万新发病例及57万死亡病例。肺癌同时也超过肝癌成为了我国第一大高发癌症，且发病率及死亡率增长最为迅速，每年以13%的速度增长。目前，肺癌占据癌症发病率排行（男女综合）的首位，其中在男性发病率中排第一，在女性癌症发病率中也始终排在前三位。预计到2025年，中国每年新增肺癌病例将超过100万例。肺癌患者还呈现年轻化趋势，尤其是近几年来，45岁以下的肺癌患者多有出现。因此，肺癌已经严重影响威胁我国人民的生命健康。
[0003] 目前治疗方法主要有手术治疗、化疗、放疗等方法。纵观目前的疗法，手术治疗主要适合早中期（I II期）肺癌和肿瘤局限在一侧胸腔的部分选择性的IIIb期肺癌，和放疗同~属局部治疗，从肿瘤生物学角度看，癌症是全身性疾病，存在转移和扩散的特性；常规的放疗和化疗等治疗方式，在杀死肿瘤细胞的同时也损伤机体正常细胞和免疫系统，降低免疫力，毒副作用大。因此，开展新的抗癌药物的研发重要且必要，寻找对抗癌效果好且对正常组织毒害小、不损害机体免疫的药物的确迫切需求。经过我们发明人前期研究表明，屋尘螨Der p1疫苗对肺癌的治疗有着显著的作用，且能增强机体免疫能力，具有抗癌功能。
[0004] 本发明采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备重组Der p1蛋白，克服了从螨体中大量提取的困难。同时采用PLGA纳米佐剂制备尘螨重组变应原Der p1疫苗，用于治疗肺癌。本发明国内外尚未见报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一是克服现有技术的上述不足，而提供一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗。
[0006] 实现本发明上述发明目的的技术方案是：一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，其是采用如下步骤制备而成的：
[0007] 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：
[0008] （1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的LB中，35 37℃，160 240rpm摇菌过夜，按1 4%的接种量将基因工程菌菌~ ~ ~
落接种于LB/kam培养液中，200 300rpm摇菌至OD600为0.5 0.7时，加入IPTG使其终浓度为~ ~
0.1 0.4mM，诱导4 6小时后，2000 4000g在2 6℃离心5 15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，~ ~ ~ ~ ~
将细菌重悬于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4 0.6mg/ml，DTT至终浓度5~
15mM，PMSF至终浓度0.8 1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8 1.2%，并于室温中振荡20~ ~ ~
40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
~
落接种于LB/kam培养液中，200 300rpm摇菌至OD600为0.5 0.7时，加入IPTG使其终浓度为~ ~
0.1 0.4mM，诱导4 6小时后，2000 4000g在2 6℃离心5 15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，~ ~ ~ ~ ~
将细菌重悬于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4 0.6mg/ml，DTT至终浓度5~
15mM，PMSF至终浓度0.8 1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8 1.2%，并于室温中振荡20~ ~ ~
40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
~
[0009] （2）将裂解液置于冰浴下40W超声5 15遍，超声20 40s、停20 40s，直至菌体不粘为~ ~ ~止，10000 12000g3 5℃离心10 20min，去上清，得基因工程菌包涵体；
~ ~ ~
~ ~ ~
[0010] （3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀，并磁力搅拌20 40min，10000~ ~12000g3 5℃离心10 20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬，冰浴磁力~ ~
搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000 12000g离心30min，弃沉~
淀，得包涵体；
搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000 12000g离心30min，弃沉~
淀，得包涵体；
[0011] 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；
[0012] 步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：
[0013] 称50mg PLGA溶于二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min，40w，超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化1 2 min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室~温下搅拌3 5h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸~
水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
[0014] 优选地，所述步骤一（1）中的基因工程菌菌落接种量为2%；摇菌至终浓度为0.2mM；PMSF至终浓度为1mmol/L；Triton X-100至终浓度为1%。
[0015] 优选地，所述步骤一（3）中的包涵体洗液1为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA；包涵体洗液2为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X-100；包涵体洗液3为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，
4mol/L尿素；包涵体溶解液为50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素。
4mol/L尿素；包涵体溶解液为50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素。
[0016] 优选地，所述步骤二中的PLAG为LA:GA=65:35，Mw=40000-75000。
[0017] 本发明的目的之二是克服现有技术的上述不足，而提供一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗的制备方法。
[0018] 实现本发明上述发明目的的技术方案是：一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗的制备方法，其步骤如下：
[0019] 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：
[0020] （1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的LB中，35 37℃，160 240rpm摇菌过夜，按1 4%的接种量将基因工程菌菌~ ~ ~
落接种于LB/kam培养液中，200 300rpm摇菌至OD600为0.5 0.7时，加入IPTG使其终浓度为~ ~
0.1 0.4mM，诱导4 6小时后，2000 4000g在2 6℃离心5 15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，~ ~ ~ ~ ~
将细菌重悬于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4 0.6mg/ml，DTT至终浓度5~
15mM，PMSF至终浓度0.8 1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8 1.2%，并于室温中振荡20~ ~ ~
40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
~
落接种于LB/kam培养液中，200 300rpm摇菌至OD600为0.5 0.7时，加入IPTG使其终浓度为~ ~
0.1 0.4mM，诱导4 6小时后，2000 4000g在2 6℃离心5 15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，~ ~ ~ ~ ~
将细菌重悬于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4 0.6mg/ml，DTT至终浓度5~
15mM，PMSF至终浓度0.8 1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8 1.2%，并于室温中振荡20~ ~ ~
40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
~
[0021] （2）将裂解液置于冰浴下40W超声5 15遍，超声20 40s、停20 40s，直至菌体不粘为~ ~ ~止，10000 12000g3 5℃离心10 20min，去上清，得基因工程菌包涵体；
~ ~ ~
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[0022] （3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀，并磁力搅拌20 40min，10000~ ~12000g3 5℃离心10 20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬，冰浴磁力~ ~
搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000 12000g离心30min，弃沉~
淀，得包涵体；
搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000 12000g离心30min，弃沉~
淀，得包涵体；
[0023] 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；
[0024] 步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：
[0025] 称50mg PLGA溶于二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min，40w，超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化1 2 min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室~温下搅拌3 5h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸~
水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
[0026] 优选地，所述步骤一（1）中的基因工程菌菌落接种量为2%；摇菌至终浓度为0.2mM；PMSF至终浓度为1mmol/L；Triton X-100至终浓度为1%。
[0027] 优选地，所述步骤一（3）中的包涵体洗液1为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA；包涵体洗液2为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X-100；包涵体洗液3为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，
4mol/L尿素；包涵体溶解液为50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素。
4mol/L尿素；包涵体溶解液为50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素。
[0028] 优选地，所述步骤二中的PLAG为LA:GA=65:35，Mw=40000-75000。
[0029] 本发明的目的之三是克服现有技术的上述不足，而提供一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗的用途。
[0030] 实现本发明上述发明目的的技术方案是：一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，用于治疗肺癌。
[0031] 本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明的一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，具有良好的抗癌功能，对肺癌有着显著的治疗效果，既对人体无毒害作用，还能增加机体免疫能力，且制备工艺简单。
[0032] 以下通过具体实施例对本发明作进一步描述。
具体实施方式
[0033] 实施例1：
[0034] 一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，其是采用如下步骤制备而成的：
[0035] 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：
[0036] （1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于20ml含50μg/ml卡那霉素的LB中，35℃，160rpm摇菌过夜，按1%的接种量将基因工程菌菌落接种于1L LB/kam培养液中，200rpm摇菌至OD600为0.5时，加入IPTG使其终浓度为0.1mM，诱导4小时后，2000g在2℃离心5min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤一遍，将细菌重悬于40ml
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4mg/ml，DTT至终浓度5mM，PMSF至终浓度
0.8mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8%，并于室温中振荡20分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4mg/ml，DTT至终浓度5mM，PMSF至终浓度
0.8mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8%，并于室温中振荡20分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
[0037] （2）将裂解液置于冰浴下40W超声5遍，超声20s、停20s，直至菌体不粘为止，10000g3℃离心10min，去上清，得基因工程菌包涵体；
[0038] （3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA）重悬沉淀，并磁力搅拌20min，10000g3℃离心10min，去上清，再依次用包涵体洗液2（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X-100）和包涵体洗液3（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，4mol/L尿素）重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液（50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素）中，10000g离心30min，弃沉淀，得包涵体；
[0039] 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；
[0040] 步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：
[0041] 称50mg PLGA(LA:GA=65:35，Mw=40000-75000)溶于1ml的二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min40w，超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化1min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室温下搅拌3h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸水洗涤3 遍，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
[0042] 实施例2
[0043] 一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，其是采用如下步骤制备而成的：
[0044] 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：
[0045] （1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于20ml含50μg/ml卡那霉素的LB中，37℃，240rpm摇菌过夜，按4%的接种量将基因工程菌菌落接种于1L LB/kam培养液中，300rpm摇菌至OD600为0.7时，加入IPTG使其终浓度为0.4mM，诱导6小时后，4000g在6℃离心15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤一遍，将细菌重悬于40ml
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.6mg/ml，DTT至终浓度15mM，PMSF至终浓度
1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度1.2%，并于室温中振荡40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.6mg/ml，DTT至终浓度15mM，PMSF至终浓度
1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度1.2%，并于室温中振荡40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
[0046] （2）将裂解液置于冰浴下40W超声15遍，超声40s、停40s，直至菌体不粘为止，12000g5℃离心20min，去上清，得基因工程菌包涵体；
[0047] （3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA）重悬沉淀，并磁力搅拌40min， 12000g5℃离心20min，去上清，再依次用包涵体洗液2（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X-100）和包涵体洗液3（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，4mol/L尿素）重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液（50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素）中，12000g离心30min，弃沉淀，得包涵体；
[0048] 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；
[0049] 第二步，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：
[0050] 称50mg PLGA(LA:GA=65:35，Mw=40000-75000)溶于1ml的二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min40w，超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化2 min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室温下搅拌5h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸水洗涤3 遍，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
[0051] 实施例3：
[0052] 一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗的制备方法，其步骤如下：
[0053] 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：
[0054] （1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于20ml含50μg/ml卡那霉素的LB中，35℃，160rpm摇菌过夜，按1%的接种量将基因工程菌菌落接种于1L LB/kam培养液中，200rpm摇菌至OD600为0.5时，加入IPTG使其终浓度为0.1mM，诱导4小时后，2000g在2℃离心5min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤一遍，将细菌重悬于40ml
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4mg/ml，DTT至终浓度5mM，PMSF至终浓度
0.8mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8%，并于室温中振荡20分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4mg/ml，DTT至终浓度5mM，PMSF至终浓度
0.8mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8%，并于室温中振荡20分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
[0055] （2）将裂解液置于冰浴下40W超声5遍，超声20s、停20s，直至菌体不粘为止，10000g3℃离心10min，去上清，得基因工程菌包涵体；
[0056] （3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA）重悬沉淀，并磁力搅拌20min，10000g3℃离心10min，去上清，再依次用包涵体洗液2（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X-100）和包涵体洗液3（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，4mol/L尿素）重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液（50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素）中，10000g离心30min，弃沉淀，得包涵体；
[0057] 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；
[0058] 步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：
[0059] 称50mg PLGA(LA:GA=65:35，Mw=40000-75000)溶于1ml的二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min40w，超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化1min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室温下搅拌3h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸水洗涤3 遍，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
[0060] 实施例4
[0061] 一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗的制备方法，其步骤如下：
[0062] 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：
[0063] （1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于20ml含50μg/ml卡那霉素的LB中，37℃，240rpm摇菌过夜，按4%的接种量将基因工程菌菌落接种于1L LB/kam培养液中，300rpm摇菌至OD600为0.7时，加入IPTG使其终浓度为0.4mM，诱导6小时后，4000g在6℃离心15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤一遍，将细菌重悬于40ml
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.6mg/ml，DTT至终浓度15mM，PMSF至终浓度
1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度1.2%，并于室温中振荡40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.6mg/ml，DTT至终浓度15mM，PMSF至终浓度
1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度1.2%，并于室温中振荡40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；
[0064] （2）将裂解液置于冰浴下40W超声15遍，超声40s、停40s，直至菌体不粘为止，12000g5℃离心20min，去上清，得基因工程菌包涵体；
[0065] （3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA）重悬沉淀，并磁力搅拌40min， 12000g5℃离心20min，去上清，再依次用包涵体洗液2（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X-100）和包涵体洗液3（50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，4mol/L尿素）重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液（50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素）中，12000g离心30min，弃沉淀，得包涵体；
[0066] 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；
[0067] 第二步，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：
[0068] 称50mg PLGA(LA:GA=65:35，Mw=40000-75000)溶于1ml的二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min40w，超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化2 min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室温下搅拌5h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸水洗涤3 遍，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。
[0069] PLGA-Der p1纳米疫苗的载药量、包封率测定及纳米表征观察：
[0070] 用BCA蛋白定量测定法PLGA-Der p1纳米疫苗中蛋白浓度，称取5mg冻干的PLGA-Der p1纳米粉末于2ml含0.05mol/L NaOH和1%SDS的水溶液中，37℃恒温振荡仪振荡24小时，然后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。根据PLGA-Der p1蛋白浓度计算出纳米疫苗的载药量和包封率：
[0071] 载药量（LC）=（总蛋白－游离蛋白）/总纳米粒重量*100%
[0072] 包封率（EE）=（总蛋白－游离蛋白）/总蛋白*100%
[0073] 将冻干的PLGA-Der p1纳米粉末送深圳大学光电子学研究所进行扫描电镜（SEM）观测。首先将导电胶粘在样品台上，再轻轻将纳米粉末均匀撒在导电胶上，然后用吸耳球吹去未粘附的粒子，再金属镀膜（喷金），喷金后即可上电镜观测纳米粒的粒径与形态。结果如下：
[0074] 纳米疫苗冻干后称得纳米粒的质量为63.8mg；
[0075] 用BCA蛋白定量测定法测得5mg纳米疫苗中Der p1蛋白0.524mg；
[0076] 疫苗载药量（LC）=（0.524/5）*100%=10.5%（即1mg干粉纳米疫苗的载药105μg）；
[0077] 包封率（EE）=[（0.105*63.8）/10]*100%=67.0%；
[0078] 在扫描电镜下观测Der p1纳米疫苗粒颗粒圆满、大小均一、分散性好，纳米颗粒直径在200nm 500nm范围内。~
[0079] 利用本发明Der p1纳米疫苗免疫治疗肺癌的对照实验：
[0080] （1）肺癌的移植瘤动物模型的建立
[0081] 利用LLC肺癌细胞株在C57Bl/6鼠建立肺癌的移植瘤动物模型：体外培养LLC细胞系，分别将细胞接种于8周龄左右的C57Bl/6鼠腋部皮下，接种细胞的数目为：3x106个细胞，接种后随机将小鼠分为对照组和治疗组，建立LLC细胞系的鼠移植瘤。
[0082] （2）研究Der p1纳米疫苗对肺癌细胞移植瘤的影响
[0083] 以建立的移植瘤动物模型为研究对象，在小鼠皮下注射细胞10天后，对治疗组开始使用Der p1纳米疫苗治疗，用Der p1纳米疫苗注射（100μg）免疫10 次，每次间隔1 天，对照组不进行疫苗注射。测量移植瘤的重量，比较对照组和治疗组之间的差异，见表1。
[0084] 表1. 对照组和治疗组小鼠移植瘤重量比较（g）
[0085] 对照组 治疗组
1 2.92 1.45
2 3.90 0.13
3 2.07 1.35
4 2.02 1.63
5 3.78 0.21
x±s 2.938±0.9 0.954±0.72
1 2.92 1.45
2 3.90 0.13
3 2.07 1.35
4 2.02 1.63
5 3.78 0.21
x±s 2.938±0.9 0.954±0.72
[0086] 由上表可知，本发明一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗对肿瘤生长的抑制率可达67.53%。
[0087] 注：抑瘤率=（对照组平均肿瘤重量－治疗组平均肿瘤重量）/ 对照组平均肿瘤重量 * 100% 。
[0088] （3）分析Der p1纳米疫苗对肺癌Th1/Th2状态的影响，证实Der p1纳米疫苗能通过逆转Th1/Th2达到免疫治疗肺癌的作用。分析Der p1纳米疫苗治疗后，检测上述实验动物外周血中和脾细胞培养液中Th1/Th2细胞相关细胞因子的变化。
[0089] 1、血液样本：均来自上述实验动物。
[0090] 2、Th1/Th2细胞相关细胞因子的检测：采用ELISA方法测定IFN-γ和IL-4水平。
[0091] 实验结果表明：Der p1纳米疫苗能有效抑制肺肿瘤的生长扩散，起到良好的治疗作用。
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