屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的制备方法及其使用方法
专利汇可以提供屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的制备方法及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种或数种过敏原特异性IgE 抗体 定量检测 试剂 盒 、制备和检测方法，包括磁分离试剂的制备、过敏原试剂的制备、酶反应物的制备、校准品和质控品的制备、浓缩清洗液的制备、底物A液和底物B液的制备六个步骤。本发明过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒所采用的检测方法，通过过敏原特异性IgE抗体捕获过敏原的方法来实现的，同时采用 化学发光 免疫技术和磁分离技术相结合的方法，大大提高了过敏原特异性抗体的检测灵敏度和特异性，使得检测结果更真实可信；同时优化了反应时间和反应步骤，使操作更简单。，下面是屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的制备方法及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述试剂盒含有如下组分：磁分离试剂，过敏原试剂，酶反应物，校准品、质控品，浓缩清洗液，底物A液和底物B液；其中，过敏原试剂含有生物素标记的特异性过敏原，磁分离试剂含有包被有抗人IgE抗体的磁微粒，所述底物A液为含鲁米诺试剂，底物B液为含过氧化物试剂，所述酶反应物为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素试剂；
所述方法包括如下步骤：
步骤一、磁分离试剂的制备
一、磁微粒缓冲液配制
（1）、称取TRIS 4.58g/L，NaCl 6.81g/L，TRITON X-100 0.5mL/L于1L容器中；（2）、量取防腐剂Proclin300 0.5-1mL于1L容器中；量取800mL纯化水于上述容器，充分搅拌（；3）、调节pH值到7.95-8.05之间；（4）、称取牛血清白蛋白BSA 3-5g至上述1L容器中；（5）、最后定容至 1000mL，0.22μm 微孔滤器过滤；做好标记于2-8℃冷库贮存；
二、磁分离试剂的制备
（1）、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50μL二甲基亚砜中，取2mg抗人IgE抗体溶于pH 9.0-9.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中至总体积为1mL（；2）、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述抗人IgE抗体溶液中，置室温
90min；（3）、然后将抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在
3000g下浓缩30min至体积为0.5mL；（4）、取0.5mL磁珠加入5mL反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清（；5）、每次加入1.5mL pH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；（6）、加入0.3mL 1mol/L的TRIS溶液 37℃ 15分钟；（7）、每次加入1.5mL pH7.2的
0.1mol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；（8）、用
100mL磁珠保存液将磁珠转入125mL玻璃瓶，即为 0.05％的IgE磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％ BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存；（9）、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；
步骤二、过敏原试剂的制备
一、过敏原稀释液的配置
（1）、称取TRIS 4.58g/L，NaCl 6.81g/L，TRITON X-100 0.5mL/L于1L容器中；（2）、量取Proclin-300 0.5-1mL于1L容器中；量取800mL纯化水于上述容器，充分搅拌；（3）、调节pH值到7.95-8.05之间；（4）、称取BSA 3-5g至上述1L容器中；（5）、最后定容至 1000mL，0.22μm微孔滤器过滤；做好标记于2-8℃冷库贮存；
二、生物素偶联的过敏原的配置
将生物素标记的屋尘螨过敏原按照0.1-1.0μg/mL的浓度，使用过敏原稀释液进行稀释；
步骤三、酶反应物的制备
一、酶反应物稀释液配置
（1）、取TRIS 4.846g、HCl 2847μL于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800mL纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解（；2）、调pH，控制在 7.35-7.45；（3）、称取BSA 4g至上述烧瓶中；（4）、最后烧杯定容至1000mL，用0.22μm微孔滤器过滤即得；
二、酶反应物的配置
按照1:2000-1:5000的稀释体积比例，使用酶反应物稀释液对辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素进行稀释，混合均匀即得酶反应物；
步骤四、校准品、质控品的制备
一、校准品、质控品稀释液的配置
（1）、称取Tris 7.268g和HCl 4270μL于1L的容器中，定容至600mL；（2）、用量筒量取小牛血清300mL，加入上述溶液中，即为校准品稀释液，2-8℃储存备用；
二、校准品、质控品的配置
校准品的浓度为0、0.35、0.7、3.5、17.5、100KU/L，质控品的浓度分别为0.35、17.5KU/L；使用校准品、质控品稀释液按照以上浓度进行稀释。校准品、质控品所含物质为纯化的人IgE抗体；
步骤五、浓缩清洗液的配制
（1）、称取KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖 10g于1L容器中（；2）、称取0.225g Tween-20于100mL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；（3）、量取Proclin-300 0.225mL 至上述1L容器中；（4）、用量筒量取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解；
（5）、调pH至7.35-7.45之间；（6）、最后定容至1000mL，完全溶解后用0.22μm微孔滤器过滤即得；
步骤六、底物液的制备
一、底物A液的配置
（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于1L烧杯中；（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调节pH值至7.95-8.05之间；
（3）、用0.22μm微孔滤器过滤，收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得；
二、底物B液的配置
（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、过氧化脲0.1g和Proclin-300 250ul于1L烧杯中；
（2）、用量筒量取400mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调 pH值至7.95-8.05之间；（3）、用0.22μm微孔滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500mL，混匀后即得。
2.根据权利要求1所述的一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述浓缩清洗液为含有吐温的磷酸盐缓冲液浓缩清洗试剂。
3.一种屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒为权利要求1方法制备的试剂盒，其使用方法包括检测步骤如下：
（1）、加入50μL磁分离试剂至化学发光反应管底；
（2）、加入50μL标准品、质控品、待检血清至化学发光反应管底；
（3）、用多功能均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37℃恒温箱反应15分钟；
（4）、反应管放至磁分离器上，确保每个管底都与分离器表面接触，沉淀2-3分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，用力在吸水纸上将反应管内的液体拍干，以除去粘在反应管中的液滴；
（5）、浓缩清洗液用纯化水稀释20倍后，加300-500μL稀释后的清洗液至每一反应管中，置多功能均匀混合器上轻轻振荡混匀30s；
（6）、重复步骤（4）、（5）、（4）一遍；
（7）、加入50μL过敏原试剂至反应管底；
（8）、加入50μL酶反应物至反应管底；
（9）、用多管均匀混合器轻轻振荡反应管30s后，置37℃恒温箱反应15分钟；
（10）、重复步骤（4）、（5）、（6）一遍；
（11）、加入50μL底物液A和50μL底物液B至反应管底手动混匀或放置在多管均匀混合器上轻轻震荡5-10s，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；
（12）、根据校准品采用四参数拟合方式拟合一条曲线，通过曲线计算待检样本所含的屋尘螨过敏原特异性IgE抗体的浓度。
屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的制备方法及
其使用方法
技术领域
背景技术
发明内容
0.225ml 至上述1L容器中；（4）、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解；（5）、调pH至7.35-7.45之间；（6）、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.22μm微孔滤器过滤即得。
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