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预防过敏的方法

阅读：510发布：2020-05-25

专利汇可以提供预防过敏的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及在对象体内预防过敏的组合物和方法。特别地，本发明涉及表皮预防儿童体内过敏。本发明还涉及用于此类方法的组合物，以及它们的制造。本发明可用于引起对任何过敏的防护，特别是食物和呼吸道过敏。，下面是预防过敏的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于治疗具有检测到的过敏的儿童以防止所述儿童发展进一步过敏的包含变应原的组合物，其中该组合物包含造成所述检测到的过敏的变应原，并表皮施用于所述儿童，所述施用保护儿童免受对另一变应原的至少一种进一步过敏的发展。
2.用于权利要求1的组合物，其中该儿童是婴儿或学步期儿童。
3.用于权利要求1或2的组合物，其中检测到的过敏是在所述儿童体内首次检测到的过敏，并且其中在检测或检验所述第一过敏反应时施用该变应原。
4.用于权利要求1至3任一项的组合物，其中检测到的过敏反应是对食物的过敏、呼吸道或接触变应原。
5.用于权利要求4的组合物，其中检测到的过敏是对牛奶、屋尘螨或花生的过敏。
6.用于权利要求1至5任一项的组合物，其中该变应原重复施加。
7.用于权利要求1至6任一项的组合物，其中该变应原在不存在佐剂的情况下施加。
8.用于权利要求1至7任一项的组合物，其中该变应原施加到皮肤的完好区域上。
9.用于权利要求1至8任一项的组合物，其中该变应原使用非侵入性封闭贴剂装置施加。
10.用于权利要求1至9任一项的组合物，其中该变应原在3至36个月期间重复施加。
11.用于在具有检测到的对牛奶或屋尘螨的过敏反应的婴儿体内预防过敏的组合物，该组合物包含牛奶或屋尘螨变应原并在检测该过敏反应时表皮施用于该婴儿。
12.用于保护具有检测到的首次过敏反应的婴儿或学步期儿童免受多种过敏发展的组合物，该组合物包含造成所述首次过敏反应的一种变应原，并在检测所述首次过敏反应时表皮施加于所述婴儿或学步期儿童，所述表皮施用保护该婴儿或学步期儿童免受多种过敏的发展。

说明书全文

预防过敏的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及预防对象过敏的组合物与方法。特别地，本发明涉及表皮预防儿童过敏。本发明还涉及用于此类方法的组合物，及其制造。本发明可用于引起对任何过敏症的保护，特别是食物或呼吸道过敏。

[0002] 发明背景

[0003] 过敏在日常医疗实践中所占空间越来越大。过敏是被WHO列为全球第四大危害的世界性公共健康现象。在法国，三个法国人中就有一个是过敏的，并且呼吸道和食物过敏影响越来越高人口比例的成人与儿童。

[0004] 脱敏(或免疫疗法)是一项技术，根据该技术，通过施用最小量的变应原，可能或多或少地抑制对这些变应原的过敏反应。通过以恒定或变化的剂量逐步施用变应原，对象变得耐受变应原。免疫疗法已经证实对受严重的IgE-依赖性过敏影响的患者(对有限数量的变应原敏感)有效。脱敏可以减少与短期过敏性反应相关的症状以及向更严重临床症状的进展，例如由过敏性鼻炎转变为哮喘(Tij等人,2004)。自2000年起，其被WHO承认为基础治疗过敏的唯一方法。

[0005] 尽管免疫疗法的作用机理尚未公知，它们似乎涉及(i)在IgG方面且特别是在IgG4部分方面的提高，这些抗体在体外阻断IgEs的生物效应；(ii)改变TH1和TH2的免疫应答，促进更平衡的TH1/TH2响应；和/或(iii)制造产生白细胞介素10(IL-10)的T细胞，这显示针对肥大细胞、某些T淋巴细胞和嗜伊红性粒细胞的抗过敏性质并还促进了IgG4的制造。

[0006] 免疫疗法可以通过各种方案或途径来实现，包括皮下、舌下、经鼻或表皮。广泛采用皮下免疫疗法。尽管昂贵并且在每次注射时需要专业医师的介入，其目前仍被认为是标准的儿童脱敏途径(Pajno等人,2005)。但是其并非全无风险，因为死亡的频率估计为二百五十万次注射1例死亡，每年平均3.4例死亡。此外，潜在的具有高反应风险的过敏性变应原，如树坚果和大多数食物变应原，不用于皮下脱敏治疗。

[0007] 舌下免疫疗法被WHO认为是一种对皮下免疫疗法的令人满意的替代方法。更好地为患者承认，舌下免疫疗法被许多作者认为提供了比其它给药途径更好的成本效益比，因为其不需要医生的干预，并可以由患者自行服用(Pajno等,2005)。另外，在经由舌下路线治疗过程中的不良反应微乎其微，估计为每1,000给药剂量0.1至0.2例反应。此类反应主要是轻微的，影响口腔或舌下区或肠道球(La Rosa等人,1999)。

[0008] 但是，在效力方面，舌下途径被认为不及皮下途径有效：其需要使用更大量的变应原并且不适用于所有变应原。尽管经由该途径对花生和对牛奶的脱敏正在进行中。用其它食物变应原使用这项技术的安全性有待评估。

[0009] 鼻内免疫疗法已经在18项对照研究的17项中证明有效。因此这是一种对治疗至少过敏性鼻炎有效和安全的途径。但是，该方法通常难以为患者所忍受，这越来越限制了其临床应用。在比较不同脱敏途径的研究中，经由鼻内途径的治疗在大约50％的一年前的案例中被过早打断，而在经由皮下或舌下途径治疗的儿童中只有少于10％发生早期放弃(Pajno等人,2005)。

[0010] 表皮免疫疗法基于皮肤应用。该方法通常包括重复施加已知在对象皮肤上引起现有过敏的变应原，通常导致变应原在皮肤表层中的扩散。由发明人进行的试验已经显示，通过表皮免疫疗法产生的免疫应答类型可以通过治疗条件进行控制。例如，共同转让的国际申请WO2009/080934公开了可以通过使用施加在皮肤完好区域上的无佐剂的变应原的表皮疗法，可以获得对变应原的强效脱敏。类似地，共同转让的国际申请WO2009/071599公开了通过表皮免疫疗法获得对花生的强力脱敏。

[0011] 在上面的试验和出版物中，发明人研究了表皮免疫疗法的变应原特异性效应。继续进行该研究，发明人令人惊讶地发现，取决于试验条件，表皮免疫疗法可以用作防止过敏患者的过敏发展的预防性治疗。这种出乎意料的结果因此允许设计预防性治疗以防止患者过敏。

发明内容

[0012] 本申请提供了通过预防性表皮施用变应原来预防哺乳动物对象过敏的方法。更优选地，本发明涉及预防儿童过敏的方法，其中该方法包括向所述儿童表皮施用变应原，变应原在检测对相同变应原或不同变应原的过敏反应时施用于该儿童。

[0013] 本发明的再一目的还在于一种预防儿童过敏的方法，包括向儿童表皮施用至少一种变应原，其中该儿童在6岁以下并具有对至少一种变应原的检测过敏反应。该儿童优选是婴儿或学步期儿童。

[0014] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防儿童过敏的方法，其中该儿童对牛奶或屋尘螨过敏并在6岁以下，并且其中该方法包括向所述儿童表皮施用至少一种牛奶或屋尘螨蛋白。如本申请中将要公开的那样，此类表皮施用防止所述儿童对其它变应原的过敏的开始或发展。

[0015] 根据本发明的再一方面，提供一种预防儿童过敏的方法，该方法包括检测或检验在该儿童体内第一过敏反应的发生，并在检测或检验所述第一过敏反应的同时，向所述儿童表皮施用至少一种导致所述第一过敏反应的变应原，所述表皮施用保护该儿童免受对另一变应原的至少一种其它过敏的发展。

[0016] 在本发明的又一方面，提供了一种用于保护儿童免受多种过敏的发展的方法，该方法包括检测或检验儿童体内过敏反应的发生，在检测或检验所述过敏反应的同时，向所述儿童表皮施用至少一种导致所述过敏反应的变应原，所述表皮施用在所述儿童体内诱发免疫响应，保护该儿童免受多种过敏的发展。

[0017] 本发明还涉及用于预防对象过敏的组合物，其中该组合物包含一种变应原并表皮施加于过敏儿童。更优选地，该儿童在6岁以下，更优选该儿童是婴儿或学步期儿童。甚至更优选地，该儿童对牛奶或屋尘螨过敏。最优选地，在检测其第一过敏时治疗该儿童。

[0018] 本发明可用于预防受治对象体内其它过敏的发展，包括食物、呼吸道或接触过敏。其特别适于治疗对第一变应原表现出第一过敏事件的婴儿或学步期儿童，适于令该儿童对第一变态原脱敏，并适于预防对其它不同变应原的其它过敏的发展。
附图说明

[0019] 图1：研究设计。使BALB/c小鼠对牛奶致敏并分为两组，其中一组得到治疗(EPIT)，另一组未得到治疗(Sham)。治疗进行8周。在此之后，所有小鼠用通常用于令小鼠对花生蛋白提取物(PPE)致敏的相同程序接受花生。小鼠随后暴露于花生10天。通过测量向食道中的嗜酸性粒细胞浸润来评价食管炎症，如通过组织学测定的那样。还对血清学反应和细胞反应进行了研究。

[0020] 图2：在第43天(D43)、在EPIT过程中在第78天(D78)和在治疗结束时，第99天和第127天(D99和D127)时在致敏后对牛奶的特异性IgE(图2a)和IgG2(图2b)响应。结果显示为平均值±SD。**p<0.01。

[0021] 图3：在EPIT之后但在暴露于PPE之前(D99)和暴露于PPE之后(D127)对PPE的特异性IgE(图3a)和IgG2(图3b)响应。结果显示为平均值±SD。*p<0.05，***p<0.001。

[0022] 图4：通过IL-A(图4a)和IL-5(图4b)测得的通过牛奶(CMP)或PPE的体外再活化脾细胞的细胞反应。结果显示为平均值±SD。*p<0.05。

[0023] 图5：诱导来自体外再活化脾细胞的Foxp3+CD25+CD4+T细胞(Treg)。在试验结束时，收获脾细胞并在牛奶(图的左侧部分)和或PPE(图的右侧部分)的存在下在体外再活化3天。Treg/总CD4+T细胞群落的百分比显示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01。

[0024] 图6：通过组织学分析评估的进入食管的嗜酸性粒细胞浸润。结果显示为平均值±SD。**p<0.01。

具体实施方式

[0025] 本发明提供一种新的过敏的预防性治疗。该方法特别适于治疗对一种变应原表现出过敏的儿童，保护他们免受对其它不同变应原的进一步过敏的发展。特别有效的是治疗对牛奶或屋尘螨表现出过敏的幼儿，由此保护他们发展对其它变应原的进一步过敏。事实上，发展对第一变应原的过敏反应的幼儿，如婴儿或学步期儿童，非常容易对其它物质产生过敏。本发明能够治疗此类过敏对象，并减少进一步过敏的发生。

[0026] 参照下列定义将最好地理解本公开：

[0027] 定义

[0028] “表皮施用”指的是在允许与皮肤表面接触的条件下在对象皮肤上施加物质(例如变应原)。皮肤施加优选在没有任何皮肤穿孔或预处理的情况下实施。皮肤施加优选保持在允许变应原在皮肤浅层中渗透的条件下和/或持续足以令变应原与免疫细胞接触的时间。表皮施用优选用皮肤装置如贴剂来实施。

[0029] 在本发明的上下文中，术语“预防”过敏理解为包括保护对象免受进一步过敏的发展，预防对其它变应原出现敏感，延迟此类对其它变应原的敏感或过敏的出现或发生，或抑制或减少任何进一步过敏反应的幅度。

[0030] 在本发明的上下文中，术语“完整皮肤“指的是角质层的完整性应基本保持不变。对于本发明的性能，事实上最优选的是在完整(即未经预处理)的皮肤上施加抗原，例如在其中角质层完整性基本保持完好的皮肤或部分皮肤表面上。保持角质层完整性和位于角质层下方的角质形成细胞与朗格汉斯细胞的天然活化状态对避免向Th2偏倚的免疫响应是重要的。通过保持这种完整性，获得的响应从耐受性的意义上来说是高度取向的。因此，尽管在施加位置处可以对皮肤表面进行温和的清洁，例如水合、水洗或非常温和的单次剥离以去除例如角质细胞，该皮肤应当未经预处理，由此保持角质层的基本完整性。特别地，胶带剥离或强烈磨损皮肤不应进行，因此此类预处理会破坏或除去全部或部分角质层，并对角质形成细胞造成刺激。类似地，应避免角质层穿孔。

[0031] 术语“变应原”指的是涉及过敏反应的免疫分子。该变应原可以具有各种性质，如脂质、蛋白质、肽、多肽、金属、塑料等等。在特定实施方案中，该变应原是蛋白质、多肽和/或肽。该变应原可以处于自然状态，或者是人工制造的(例如通过例如重组体和/或酶技术)。该变应原可以在结构上改变或修饰以改善其稳定性、免疫原性等等。该变应原可以是纯净的或与其它成分混合。该变应原可以是集中分子的混合物(例如提取物)。如下面进一步讨论的那样，该变应原可以以不同状态使用，如液体或干燥。

[0032] 预防过敏的方法

[0033] 根据本发明的一个方面，公开了用于预防性治疗过敏的组合物和方法。特别地，发明人已经预料不到地发现，表皮施用变应原可以在对象体内诱导或刺激非变应原特异性免疫响应，从而保护对象免受对其它不同的变应原的进一步过敏的发展。通过在具有过敏背景的对象体内应用表皮免疫疗法，有可能不仅会对现有过敏脱敏，还可能预防进一步过敏的发展。如下面详细讨论的那样，本发明人的体内试验证明，向对牛奶过敏的哺乳动物表皮施用牛乳蛋白质针对牛奶脱敏，并还保护免受其它变应原(包括花生和尘螨)的挑战。这些结果特别令人惊讶和显著，因为采用食物变应原，有可能引起针对对其它食物变应原以及呼吸道或接触变应原的进一步过敏的发展的保护性免疫力。本发明特别适于保护表现出第一过敏响应的儿童，其存在发展进一步过敏的危险。本发明特别适于治疗婴幼儿，如婴儿(0-1岁大)和学步期儿童(1-3岁大)。不希望被理论束缚，发明人相信，可能通过表皮疗法刺激产生Treg细胞，导致在对象体内更好地控制产生IgE的细胞和其它过敏免疫细胞，由此造成该反应。

[0034] 在本发明的一个方面，提供一种方法用于预防具有检测到的过敏反应的儿童的进一步过敏，包括向所述儿童表皮施用至少一种变应原，优选一种造成所述检测到的过敏反应的变应原。

[0035] 发明人已经发现，一旦至少第一过敏反应已经在对象体内发生，会发生此类保护效果。本申请中给出的结果证实，在此类对象中表皮施加变应原可以诱导或刺激Tregs。表皮上诱导Tregs的能力之前在现有技术中从未被报道。给出的结果进一步显示，当表皮施用的变应原是造成在对象体内检测到的过敏反应的变应原时，在这些对象体内诱导Tregs。因此可能的是，需要至少第一过敏反应(例如对一变应原敏感)以诱导Treg细胞产生，并且施用该变应原的表皮处理可以放大该Treg群落，从而作用于随后的过敏响应。目前的治疗能够产生非变应原特异性免疫响应，这抑制了随后对新的变应原的过敏的发展。

[0036] 本发明因此特别适于治疗儿童，特别是6岁以下的婴幼儿。在这样的儿童体内，免疫系统尚未暴露于多种变应原。特别是在此类儿童中，食物变应原仍然有限。因此，当检测第一过敏反应时，本发明的预防性表皮治疗特别有效。此外，由于过敏症的早期发展，通过治疗这些儿童，有可能预防多种过敏的发展。

[0037] 该治疗因此优选应用于表现出过敏响应的6岁以下儿童。本发明特别适于治疗婴儿和学步期儿童。在所述儿童体内检测到的过敏响应通常是牛奶过敏或尘螨过敏。因此，该方法特别适于治疗对牛奶或尘螨过敏的6岁以下儿童。通过向这些对象表皮施用预防量的牛奶或屋尘螨变应原，有可能有效地保护该儿童抵御进一步过敏的发展。

[0038] 优选在检测或检验对象中存在过敏反应后不久进行该治疗。事实上，通过早期作用(即在患者暴露于多种变应原之前)，有可能诱导强有力和有效的免疫响应，这预期可以防止多种过敏的发展。在这方面最优选的是在检测或检验第一过敏反应时治疗该儿童，以便可以设想针对所有其它变应原的保护效果。

[0039] 在一个优选实施方案中，在治疗过的儿童体内检测对第二变应原的第二过敏反应之前施用该变应原。可以使用本身在本领域中已知的技术进行过敏反应的检测或检验。合适的方法的实例包括使用点刺试验、IgE的剂量和/或特异性斑贴试验。检测过敏反应包括检测对变应原的敏感性，即使不存在过敏的临床症状。通常，该检测首先来自于出现经典过敏症状(炎症、吞咽等)。随后可以例如采用任意上述技术(如果需要的话)由医生再次检测或检验。已经对于对象已经检测或检验到过敏反应，可以开始本发明的治疗。如果在过敏响应的检测或检验后不久(例如立即进行或在数周内，例如少于4周)即开始治疗，将提高治疗效力。事实上，通过早期作用，产生对任何其它过敏的预防效果。为此目的，最好的是在检测对象中第一过敏响应时，并在检测进一步过敏之前(例如，在所述儿童体内出现可检测的对第二变应原的IgE特异性之前)进行该治疗。但是，在显示出数种过敏反应的对象中治疗仍然有效，因为其仍然产生对额外过敏的一般性保护。

[0040] 该方法因此对于治疗具有第一过敏反应的婴儿(1岁以下)或学步期儿童(1岁至3岁)特别有效。

[0041] 在一个优选实施方案中，该方法用于治疗具有检测到的对牛奶或屋尘螨的过敏反应的6岁以下儿童。

[0042] 根据本发明的一个方面，提供一种方法，包括向对象表皮施加至少一种变应原。最优选地，施加的至少一种变应原是造成对象体内检测到的过敏反应的变应原。事实上，使用此类变应原，获得保护效果，并且该对象还可以对该变应原脱敏。此外，发明人已经令人惊讶地展示了致病变应原能够在对象体内诱导Tregs，而无关的变应原不能。

[0043] “造成”检测到的过敏反应的变应原(或“致病”变应原)指的是衍生自该对象对其过敏的物质的任何变应原。该变应原可以是过敏物质的组分(例如牛奶或屋尘螨的蛋白质)或具有免疫表位的此类组分的片段(例如蛋白质片段)。如上所述，该变应原可以是整个提取物、纯化的混合物、分离的免疫原等等。

[0044] 在本发明的一个实施方案中，检测到的过敏反应是牛奶过敏，施用的变应原包括牛奶蛋白质或其具有免疫表位的片段。

[0045] 在本发明的另一个实施方案中，检测到的过敏反应是屋尘螨过敏，施用的变应原包括屋尘螨蛋白质或其具有免疫表位的片段。

[0046] 该表皮治疗方案可以由医生进行调整。通常，该变应原重复(即数次)施加足以造成保护性免疫响应的时间。在一个优选实施方案中，治疗在至少3个月、优选至少6个月、更优选6至36个月的期间进行。在此治疗器件，该变应原可以以不同频率施用，例如每周、每隔一天或每天。用于各次施加的变应原剂量可以由技术人员进行调整。通常，其包括0.1至10000微克，优选20至1000微克。可以在任何时候通过常规检查来检验对象体内的保护性免疫。特别地，保护性免疫响应在治疗对象中的存在可以通过过敏的临床症状的减轻或消失或不存在来检验，所述过敏临床症状例如消化系统紊乱、皮肤症状(例如湿疹或特应性皮肤病)、鼻炎或哮喘。也可以在对象体内进行免疫细胞或介质(例如IgE)的给药，尽管缺乏临床症状是足够的。一旦已经生成保护性免疫，就可以减少治疗(剂量、施加频率、施加时间)或甚至停止治疗。如上所述，治疗通常保持至少3个月的时间，在不同时间间隔重复施加。

[0047] 在一个优选实施方案中，在没有佐剂的情况下施加该变应原。但是，尽管并非优选，该变应原可以与佐剂结合，即例如活化或加速免疫系统以造成提高的免疫响应的任何物质。佐剂的实例包括矿物盐，如磷酸钙、磷酸铝和氢氧化铝；免疫刺激性DNA或RNA，如CpG寡核苷酸；蛋白质，如抗体或Toll样受体结合蛋白；皂角甙类，例如QS21；细胞因子；胞壁酰二肽衍生物；LPS；MPL和衍生物，包括3D-MPL；GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；咪喹莫特；胶体粒子；完全或不完全的弗氏佐剂；Ribi佐剂或细菌毒素，例如霍乱毒素或肠毒素(LT)。

[0048] 在进一步优选的实施方案中，该变应原施加在皮肤的完好区域上。

[0049] 特别优选的是在无佐剂情况下并在完好皮肤上施加该变应原。

[0050] 该变应原可以使用适于保持变应原与对象皮肤之间接触的不同技术或装置施加。此类装置包括但不限于贴剂、胶带、敷料、片材或本领域技术人员已知的任何其它形式。优选地，该皮肤装置是贴剂，更优选封闭贴剂。优选的贴剂装置不会改变皮肤的完整性，即它们是非穿透性的。在最优选的实施方案中，本发明的方法使用国际专利申请WO2002/071950和WO2007/122226中描述的皮肤贴剂装置。此类装置是封闭性的，并构造为使用干燥形式的变应原，该变应原通过静电力和/或范德华力保持在贴剂上，不加入粘合剂。此类装置(称为 )的制备和特性详细公开在上述申请中，其全部内容经此引用并入本文。

[0051] 对本发明的性能来说，其特别适于使用包含背衬的装置，所述背衬适于与皮肤一起创造密闭的室，该背衬在该室内在其面向皮肤一侧具有通过静电力和/或范德华力粘接的干燥抗原。在施加到皮肤上时，室内的水分增加，导致变应原溶解并与皮肤接触。

[0052] 在本发明的另一优选实施方案中，使用封闭性贴剂装置将该抗原施加到对象皮肤上，所述封闭性贴剂装置包括变应原粘接于其上的载体。优选地，该变应原通过静电力或范德华力粘接到该贴剂的载体上，而没有外加的粘合剂。在特殊实施方案中，该贴剂的载体可以包含玻璃或聚合物，所述聚合物选自纤维素塑料(CA、CP)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸、聚烯烃、聚酯、聚乙烯和乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)。该贴剂可以通过粘性边缘固定到皮肤上。

[0053] 在最优选的实施方案中，使用干燥变应原制剂实施该方法，该干燥的变应原制剂优选使用静电皮肤装置施加在皮肤上。在这方面，干燥指的是这样的事实——该变应原基本为粉末状，例如为个体化或团聚的粒子形式。

[0054] 尽管不那么优选，该变应原可以为也提醒是并使用已知装置施加，如具有储器或穿孔膜的封闭性装置。

[0055] 根据本发明的一个方面，提供一种预防儿童过敏的方法，该方法包括向对牛奶或屋尘螨具有检测到的过敏反应的6岁以下儿童表皮施用至少一种牛奶或屋尘螨蛋白，所述表皮施用防止所述儿童体内发生对其它变应原的过敏。

[0056] 本发明还涉及保护儿童免受多种过敏的发展的方法，该方法包括在儿童体内检测或检验第一过敏反应的发生，在检测所述第一过敏反应时，向所述儿童表皮施用一种导致所述第一过敏反应的变应原，所述表皮施用在所述儿童体内诱发免疫响应，保护该儿童免受多种过敏的发展。

[0057] 本发明还涉及用于防止对象过敏的组合物，其中该组合物包含变应原并经表皮施加至具有检测到的过敏反应的儿童。更优选地，该儿童在6岁以下。甚至更优选地，该儿童对牛奶或屋尘螨过敏。最优选地，该儿童在检测其第一过敏时接受治疗。

[0058] 本发明的又一目的是用于在过敏对象体内诱导Tregs的方法，该方法包括向该对象表皮施加一种致病变应原。

[0059] 本发明的其它方面与优点将在下面的试验部分中公开，其应当理解为是说明性的。

[0060] 实施例

[0061] 方法

[0062] 小鼠

[0063] 在该研究中使用三周龄的雌性 BALB/c 小鼠 (Charles River Laboratories,France)。所有试验根据动物护理的欧洲共同体规则进行。

[0064] 对牛奶致敏的方案

[0065] 通过接受每周六次的混有10微克作为佐剂的霍乱毒素的牛奶灌胃令三周龄BALB/c小鼠对牛奶致敏。在致敏期之前和结束时从眶后静脉丛收集血清。在同一天将首次接受试验的小鼠放血。

[0066] 对牛奶的表皮免疫疗法的方案

[0067] 在连续八周内每周进行一次表皮免疫疗法(EPIT)。首先，用氯胺酮和甲苯噻嗪对小鼠进行腹腔内麻醉，并用电动理发推子和脱毛霜剃毛。一天后，在背部放置10微米牛奶蛋白质，并通过粘性绷带保持48小时。

[0068] 对花生致敏的方案

[0069] 表皮免疫疗法结束两周后，通过经口服用仅一剂(80毫克)花生蛋白，令小鼠经受验证的花生致敏程序。对照小鼠(未对牛奶致敏，未对牛奶进行治疗)经受相同的花生致敏程序作为阳性对照物。包括首次接受试验的小鼠作为阴性对照物。

[0070] 持续的花生口服免疫试验

[0071] 重新将花生引入其疗程。这包括连续4天仅用花生喂养，代替标准鼠类食物。动物随后在接下来的6天中接收混合到标准食物中的花生，并在第二阶段的最后3天中每天用含有10毫克花生蛋白的溶液灌胃。在结束时，将小鼠深度麻醉后处死，并取样以检查食管的组织、食管黏膜中的细胞因子和再活化脾细胞分泌的细胞因子的mRNA表达。还采取血样以测量对花生的血清学响应。

[0072] 血浆样品中特异性IgE、IgG1和IgG2a的分析

[0073] 在麻醉下从眶后经脉丛收集血样，血浆样品储存在-20℃下直到进一步分析。使用定量ELISA测定特异性抗体，这本身是已开发的。简而言之，用每孔100微升牛奶或花生变应原材料以5微克/毫升的浓度涂布微量滴定板。各种血清的50微升的连续稀释液分配到每个孔中并在+4℃下培育24小时。用碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgE、IgG1或IgG2a抗体(Serotec,Oxford,England)用作示踪剂。对硝基苯基磷酸酯(pNPP–Sigma,France)用作酶底物。通过与浓度响应曲线进行比较将特异性IgE、IgG1和IgG2a定量，所述曲线用相同条件下用涂有抗小鼠IgE、IgG1或IgG2a抗体(Serotec,Oxford,England)(其与示踪剂互补，取代变应原蛋白质)的固相进行总IgE、IgG1或IgG2a分析获得的。小鼠免疫球蛋白标样获自Serotec(Oxford,England)。

[0074] 细胞反应

[0075] 在处死小鼠后，将脾脏加工成单细胞悬浮液并在RPMI-1640(Gibco,France)中洗6
涤三次。对细胞进行计数并调节至4×10 个细胞/毫升的培养密度，并将500微升细胞悬浮液与500微升培养基或牛奶或PPE(100微克/毫升)一起放置到24孔微量滴定板(Nunc)的每个孔中。在72小时后，收获上清液并使用BioPlex cytokine Assay(BioRad,marnes-la-Coquette,France)根据制造商说明书对细胞因子的存在进行分析。细胞计数和CD4、lo lo
CD25与Foxp3染色用特异性抗体(BD Pharmingen)进行。通过以预定FSC /SSC 门值采集5000个事件在Canto II流式细胞仪上进行采集。随后用FlowJo 软件评估在CD4+群落中CD25和Foxp3阳性细胞的百分比。

[0076] 结果

[0077] 血清学反应(图2和图3)

[0078] 由第1天到43天进行对牛奶致敏，接着通过牛奶EPIT进行治疗(参见图1的方案)。

[0079] 如图2a中所示，通过产生特异性IgE在小鼠中标识对牛奶的致敏(图2a：第43天)。

[0080] 在牛奶致敏小鼠中，牛奶EPIT治疗(图2a：由第44天至第127天)诱导：

[0081] ●首先，在8周治疗期间，特异性IgE增加(图2a：由第78天至第98天)，[0082] ●随后如在临床研究中观察到的那样，在EPIT结束后一个月特异性IgE降低(图2a：由第99天至第127天)；

[0083] ●最终，特异性IgG2a(一种Th1生物标记物)显著增加(图2b：由第78天至第127天)。在第127天，特异性IgG2a超过特异性IgE的实现率表明免疫响应形式由Th2类型转变为更显著的Th1类型，由此表明该EPIT功效。

[0084] 在该方案的第二阶段，将小鼠暴露于PPE。结果表明，在第99天(对花生致敏的方案)，在暴露于花生的小鼠中，仅仅假治疗的和对照物小鼠表现出对花生的特异性IgE的提高(图3a)。与之相反，在预先通过表皮牛奶免疫疗法治疗过的小鼠中，观察到对花生的特异性IgG2a的显著提高(图3b)，这是对花生耐受性响应的特征。这些结果表明，EPIT治疗保护小鼠免受随后的PPE过敏。

[0085] 细胞反应(图4和图5)

[0086] i)细胞因子(图4)

[0087] 图4显示了通过IL-4(图4a)和IL-5(图4b)测得的通过牛奶蛋白(CMP)或通过花生蛋白提取物(PPE)在体外再活化的脾细胞的细胞反应。结果显示为平均值±SD。

[0088] 图4左侧部分和图4b左侧部分：假性组的脾细胞体外再活化通过产生IL-4和IL-5来标记，所述IL-4和IL-5是Th2细胞因子，与对照物和EPIT进行比较(p<0.05)。这种现象表明施加到牛奶EPIT小鼠上的EPIT的保护效果。

[0089] 图5右侧部分和图5b右侧部分(花生蛋白质暴露方案对EPIT/假性/对照组的效果)：在牛奶致敏假性治疗和对照物小鼠中暴露于花生由高IL-4和IL-5制造来标记，所述IL-4和IL-5是Th2细胞因子，与牛奶致敏-EPIT治疗过的小鼠进行比较(p<0.05)。这种现象表明施加到牛奶蛋白质致敏小鼠上的EPIT的全面保护效果。

[0090] ii)Treg(图5)

[0091] 在以下步骤后分析Treg细胞的特异性诱导：

[0092] -致敏(图5-牛奶/左侧部分)，

[0093] -Milk EPIT(图5-牛奶/右侧部分)，

[0094] -在假性小鼠上的PPE暴露(图5-PPE/左侧部分)，

[0095] -在牛奶EPIT治疗的小鼠上的PPE暴露(图5-PPE/右侧部分)。

[0096] 我们的结果表明，在牛奶EPIT治疗组中，在牛奶致敏后诱导了高水平的+ + +Treg(CD4CD25Foxp3)细胞。该Treg群落是通过免疫疗法特异性诱导的。相反，在PPE的存在下通过体外再活化，Treg细胞数量并未增加。不希望被理论束缚，这很有可能是通过EPIT-牛奶(图5-牛奶/右侧部分)诱导的Treg细胞的存在引导对PPE的免疫响应朝向耐受类型，而不会产生Th2细胞因子。

[0097] 食管中嗜酸性粒细胞浸润(图6)

[0098] 持续口服花生暴露于花生主要触发食道并对花生敏化的小鼠诱导嗜酸性粒细胞的高浸润(对照物，图6)。

[0099] 在致敏并且没有对牛奶进行治疗和随后采用PPE致敏方案暴露于花生的小鼠中观察到更高的嗜酸性粒细胞浸润(假性，图6)。

[0100] 当致敏并对牛奶进行EPIT治疗的小鼠暴露于花生以诱导食管炎症时，在食管中没有观察到嗜酸性粒细胞浸润(EPIT，图6)，与首次接受试验的小鼠(为对牛奶和花生致敏的小鼠：首次接受试验，图6)水平接近。

[0101] 讨论

[0102] 本研究令人惊讶地在体内显示，早期对牛奶脱敏显著影响了对其它变应原的免疫响应。这首次证实了表皮疗法造成的对过敏的保护性效果。事实上，对牛奶的EPIT治疗诱导了调节性T细胞(Treg)的特异性产生。经由Treg诱导对牛奶的耐受性预防了对其它变应原(如花生或HEM)的致敏。研究表明，在通过EPIT对牛奶的有效脱敏过程后，收到治疗的动物收到保护，免受PPE的致敏，并获得耐受性响应，大量产生特异性IgG2a和由再活化脾细胞分泌的低水平Th2细胞椅子。此外，对花生脱敏的方案诱导了在食管中的非常低的嗜酸性粒细胞浸润。

[0103] 因此，这些结果表明，EPIT治疗可以在对象体内诱发针对进一步过敏的有效防护。

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