预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和DNA疫苗
阅读：335发布：2020-05-26
专利汇可以提供预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和DNA疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供含有包括Na/K 泵 抑制剂 的 疫苗 促进剂、 抗原 和编码所述抗原的DNA的联合疫苗，其可用于 治疗 和 预防 变态反应、哮喘、自身免疫性 疾病 和移植排斥的症状。，下面是预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和DNA疫苗专利的具体信息内容。
1.一种包含疫苗促进剂、抗原肽和编码所述肽的DNA的疫苗，其中所述抗原肽能够结合II类MHC分子，其中所述抗原肽/DNA刺激iTreg细胞并且其中所述疫苗促进剂为Na/K泵抑制剂，所述疫苗促进剂选自5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利，其中所述抗原肽与选自变态反应和自身免疫性疾病的病症相关，其中载体包含所述DNA，载体为pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA并使得细胞能够将序列翻译为由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中抗原肽与哮喘相关。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗促进剂为阿米洛利。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原肽是屋尘螨1肽。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原肽与自身免疫性疾病相关并选自胰岛素肽、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、透明带蛋白肽、屋尘螨1肽、α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌Μ5蛋白肽、(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、乙酰胆碱受体肽和人S抗原。
6.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述载体和抗原肽的质量比选自5:1和1:5，以及1:
1和2:1。
7.一种疫苗接种试剂盒，包含疫苗施用装置和根据权利要求1所述的疫苗。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述疫苗施用装置选自疫苗枪、针和电穿孔装置。
9.权利要求1所述的疫苗在制备用于治疗患者中自身免疫性疾病的试剂盒中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为I型糖尿病。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述抗原肽是胰岛素肽。
12.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为多发性硬化。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述抗原肽选自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞特异性蛋白。
14.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为自身免疫性卵巢疾病。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述抗原肽是透明带蛋白肽。
16.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为尘螨变态反应。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述抗原肽是屋尘螨1肽。
18.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为心肌炎。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述抗原肽选自α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽和A群链球菌Μ5蛋白肽。
20.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述抗原肽选自肽(Q/R)(K/R)RAA和II型胶原蛋白肽。
22.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为甲状腺炎。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述抗原肽选自甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白和pendrin肽。
24.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为重症肌无力。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述抗原肽是乙酰胆碱受体肽。
26.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为自身免疫性葡萄膜炎。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述抗原肽是人S抗原。
28.根据权利要求9所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为哮喘。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述抗原肽是屋尘螨1肽。
预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和DNA疫苗
[0002] 本申请包含已按ASCII格式提交并通过引用方式据此整体并入的序列表。2011年9月21日创建的所述ASCII拷贝命名为VGX-0128.txt。
技术领域
[0004] 发明背景
[0005] 调节性T(Treg)细胞是耐受性的重要调节因子，其在自身免疫性疾病治疗中起着重要作用。具体地讲，诱导靶向变态反应、哮喘和自身免疫性疾病抗原的抗原特异性T细胞
或诱导型调节性T(iTreg)细胞为相关病症提供了有前景的免疫调节治疗策略。用于提供
Treg细胞的已知方法是过继转移天然存在的胸腺源CD4+CD25+Treg(nTreg)细胞。然而，这种
方法在nTreg细胞之中产生低水平的胰岛特异性Treg细胞，因此抑制效率低下。
或诱导型调节性T(iTreg)细胞为相关病症提供了有前景的免疫调节治疗策略。用于提供
Treg细胞的已知方法是过继转移天然存在的胸腺源CD4+CD25+Treg(nTreg)细胞。然而，这种
方法在nTreg细胞之中产生低水平的胰岛特异性Treg细胞，因此抑制效率低下。
[0006] 通过外周中的致耐受性抗原呈递由常规CD4+T细胞产生iTreg细胞。与天然存在的调节性T(nTreg)细胞相反，可使用蛋白抗原和编码相同抗原的DNA疫苗进行联合免疫来诱
导致耐受性抗原呈递。同时暴露于基于蛋白和基于DNA的抗原的组合产生CD40low IL-10high
树突细胞，这些树突细胞以抗原特异性方式介导CD4+CD25-Foxp3+iTreg细胞的诱导。这些
iTreg会对抑制Th1-和Th2-诱导的免疫途径(诸如变态反应、自身免疫性疾病、哮喘和移植排
斥)有用。然而，DNA疫苗通过基于注射器的递送长期存在对宿主细胞的转导效率低下的问
题。提高的转导效率可通过使用电穿孔装置(或)基因枪技术实现；然而，此类技术通常会使
接种者不适。
导致耐受性抗原呈递。同时暴露于基于蛋白和基于DNA的抗原的组合产生CD40low IL-10high
树突细胞，这些树突细胞以抗原特异性方式介导CD4+CD25-Foxp3+iTreg细胞的诱导。这些
iTreg会对抑制Th1-和Th2-诱导的免疫途径(诸如变态反应、自身免疫性疾病、哮喘和移植排
斥)有用。然而，DNA疫苗通过基于注射器的递送长期存在对宿主细胞的转导效率低下的问
题。提高的转导效率可通过使用电穿孔装置(或)基因枪技术实现；然而，此类技术通常会使
接种者不适。
[0007] 由于DNA疫苗转导方法的现有局限以及疫苗(无论是预防性的还是治疗性的)的缺乏，对于对抗自身免疫性疾病的疫苗和有效接种的递送方法存在强烈的需要。另外，尚不清
楚如何设计用于抗原呈递的抗原表位或疫苗，以便使iTreg的诱导最大化。因此，在本领域
中对用于抗原类疫苗(antigen-based vaccine)的抗原选择和设计的更好方法存在需要，
这些疫苗可有效转导宿主靶细胞并有效对抗自身免疫性疾病。
发明概要
楚如何设计用于抗原呈递的抗原表位或疫苗，以便使iTreg的诱导最大化。因此，在本领域
中对用于抗原类疫苗(antigen-based vaccine)的抗原选择和设计的更好方法存在需要，
这些疫苗可有效转导宿主靶细胞并有效对抗自身免疫性疾病。
发明概要
[0008] 本文提供了包含疫苗促进剂化合物、抗原肽和编码该肽的DNA的疫苗。疫苗促进剂可以是Na/K泵抑制剂，其为5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利(benzamil)
或阿米洛利。抗原肽/DNA刺激iTreg细胞。本文提供了包含抗原肽和编码该肽的DNA的疫苗。
抗原肽和DNA刺激iTreg细胞。抗原可与诸如变态反应、哮喘或自身免疫性疾病的病症相关。
抗原可以为屋尘螨(dermatophagoides pteronyssinus)1肽、其片段或其变体，并且可与变
态反应或哮喘相关。抗原可以为胰岛素肽、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突
胶质细胞特异性蛋白、透明带蛋白肽、屋尘螨1肽、α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白
肽、A群链球菌M5蛋白肽、(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、乙酰胆碱受体肽、人S抗原、其片段或其变体，并且可与自身免疫性疾病相
关。载体可包含编码肽的DNA。载体可以为pVAX、pcDNA3.0或provax载体。载体和抗原肽的质量比可以为5∶1和1∶5或1∶1和2∶1。
或阿米洛利。抗原肽/DNA刺激iTreg细胞。本文提供了包含抗原肽和编码该肽的DNA的疫苗。
抗原肽和DNA刺激iTreg细胞。抗原可与诸如变态反应、哮喘或自身免疫性疾病的病症相关。
抗原可以为屋尘螨(dermatophagoides pteronyssinus)1肽、其片段或其变体，并且可与变
态反应或哮喘相关。抗原可以为胰岛素肽、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突
胶质细胞特异性蛋白、透明带蛋白肽、屋尘螨1肽、α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白
肽、A群链球菌M5蛋白肽、(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、乙酰胆碱受体肽、人S抗原、其片段或其变体，并且可与自身免疫性疾病相
关。载体可包含编码肽的DNA。载体可以为pVAX、pcDNA3.0或provax载体。载体和抗原肽的质量比可以为5∶1和1∶5或1∶1和2∶1。
[0010] 本文还提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法。该方法可包括向对其有需要的患者施用本文所述的疫苗。自身免疫性疾病可以为I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性卵巢
疾病、尘螨变态反应、心肌炎、类风湿性关节炎、甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性葡萄膜炎或哮喘。如果要将疫苗用于治疗I型糖尿病，则疫苗的抗原可以为胰岛素肽、其片段或其
变体。如果要将疫苗用于治疗多发性硬化，则疫苗的抗原可以为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、
髓鞘碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗自身免
疫性卵巢疾病，则疫苗的抗原可以为透明带蛋白肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治
疗心肌炎，则疫苗的抗原可以为屋尘螨1肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于心肌炎，则疫苗的抗原可以为α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌M5蛋白肽、其片段
或其变体。如果要将疫苗用于治疗类风湿性关节炎，则疫苗的抗原可以为肽(Q/R)(K/R)
RAA、II型胶原蛋白肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗甲状腺炎，则疫苗的抗原可以为甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗重症肌无力，则疫苗的抗原可以为乙酰胆碱受体肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于
治疗自身免疫性葡萄膜炎，则疫苗的抗原可以为人S抗原、其片段或其变体。
疾病、尘螨变态反应、心肌炎、类风湿性关节炎、甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性葡萄膜炎或哮喘。如果要将疫苗用于治疗I型糖尿病，则疫苗的抗原可以为胰岛素肽、其片段或其
变体。如果要将疫苗用于治疗多发性硬化，则疫苗的抗原可以为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、
髓鞘碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗自身免
疫性卵巢疾病，则疫苗的抗原可以为透明带蛋白肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治
疗心肌炎，则疫苗的抗原可以为屋尘螨1肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于心肌炎，则疫苗的抗原可以为α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌M5蛋白肽、其片段
或其变体。如果要将疫苗用于治疗类风湿性关节炎，则疫苗的抗原可以为肽(Q/R)(K/R)
RAA、II型胶原蛋白肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗甲状腺炎，则疫苗的抗原可以为甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗重症肌无力，则疫苗的抗原可以为乙酰胆碱受体肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于
治疗自身免疫性葡萄膜炎，则疫苗的抗原可以为人S抗原、其片段或其变体。
[0012] 图1显示了MHC-II阻断降低了CD25-iTreg诱导。在存在或不存在抗MHC-II阻断性mAb的情况下，与从得自联合免疫Balb/c小鼠的纯化致耐受性树突细胞(DC)一起培养得自
Balb/c DO11.10小鼠或OVA323-339-致敏Balb/c小鼠的纯化CD4+T细胞。在第7天计数CD25-
iTreg细胞(CD4+CD25-Foxp3+)占CD4+CD25-T细胞的百分比，*，p＜0.05。示出了有相似结果的三次独立实验之一。每个点表示一只小鼠。
Balb/c DO11.10小鼠或OVA323-339-致敏Balb/c小鼠的纯化CD4+T细胞。在第7天计数CD25-
iTreg细胞(CD4+CD25-Foxp3+)占CD4+CD25-T细胞的百分比，*，p＜0.05。示出了有相似结果的三次独立实验之一。每个点表示一只小鼠。
[0013] 图2显示了OVA323-339突变降低了T细胞的抗原性。图2A.OVA323-339突变、其预测的MHC-II结合亲和力以及得自四聚物竞争测定的实验结果的汇总。如下计算了四聚物结合的
百分比：在存在竞争肽表位的情况下四聚物阳性T细胞的数量/在不存在竞争肽表位的情况
下四聚物阳性T细胞的数量×100％。图2B.与呈递指定表位的致耐受性树突细胞(DC)一起
共同培养了4天的CFSE标记的DO11.10CD4+T细胞的增殖。线性图汇总了得自三次独立实验
的结果。**，p＜0.01。
百分比：在存在竞争肽表位的情况下四聚物阳性T细胞的数量/在不存在竞争肽表位的情况
下四聚物阳性T细胞的数量×100％。图2B.与呈递指定表位的致耐受性树突细胞(DC)一起
共同培养了4天的CFSE标记的DO11.10CD4+T细胞的增殖。线性图汇总了得自三次独立实验
的结果。**，p＜0.01。
[0014] 图3显示了经联合免疫诱导CD25-iTreg细胞取决于表位亲和力。图A.通过流式细+ - +
胞术计数联合免疫后在Balb/c小鼠中诱导的CD25-iTreg(CD4 CD25Foxp3 (叉头框P3)和
nTreg(CD4+CD25+Foxp3+)并分别计算在CD4+CD25-和CD4+CD25+T细胞中Foxp3+细胞的百分比。
首次接受试验的 非免疫小鼠。**，p＜0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结
果的三次独立实验之一。图3B.经联合免疫诱导高度抑制性CD25-iTreg细胞取决于表位抗
原性。在存在OVA323-339的情况下，与联合免疫诱导的CD25-iTreg一起共同培养CFSE标记的
DO11.10CD4+T细胞。通过流式细胞术，根据分裂的KJl-26+细胞与总KJl-26+细胞之比测定增
殖。**，p＜0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
胞术计数联合免疫后在Balb/c小鼠中诱导的CD25-iTreg(CD4 CD25Foxp3 (叉头框P3)和
nTreg(CD4+CD25+Foxp3+)并分别计算在CD4+CD25-和CD4+CD25+T细胞中Foxp3+细胞的百分比。
首次接受试验的 非免疫小鼠。**，p＜0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结
果的三次独立实验之一。图3B.经联合免疫诱导高度抑制性CD25-iTreg细胞取决于表位抗
原性。在存在OVA323-339的情况下，与联合免疫诱导的CD25-iTreg一起共同培养CFSE标记的
DO11.10CD4+T细胞。通过流式细胞术，根据分裂的KJl-26+细胞与总KJl-26+细胞之比测定增
殖。**，p＜0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
[0015] 图4显示了过继转移CD25-iTreg细胞抑制受体小鼠中的T细胞应答。将得自经OVA323-339、MT1或MT2联合免疫的Balb/c或首次接受试验的Balb/c的CD4+CD25-T细胞过继转
移至首次接受试验的Balb/c。通过用IFA中的OVA323-339使受体致敏而评估供体CD25-iTreg的活性。图4A.致敏后从受体中分离出CD4+T细胞。将细胞用羟基荧光素琥珀酰亚胺脂(CFSE)
标记，并在培养物中用OVA323-339再刺激。通过CFSE稀释鉴定了分裂的细胞，并通过流式细胞术计数。将结果表示为占总CFSE+T细胞的百分比。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
图4B.致敏后从受体中分离出CD4+T细胞，并在细胞内针对IFN-γ进行免疫染色。通过流式
+ + +
细胞术计数IFN-γCD4T细胞并计算占总CD4T细胞的百分比。示出了有相似结果的三次独
立实验之一。图4C和D.再刺激T细胞的上清液中的IFN-γ和IL-10分泌。在阳性对照中使用
抗CD3mAb(KT3)或KT3+IL-2+IL-4诱导指定的细胞因子。示出了有相似结果的三次独立实验
之一。*，p＜0.05，**，p＜0.01。
移至首次接受试验的Balb/c。通过用IFA中的OVA323-339使受体致敏而评估供体CD25-iTreg的活性。图4A.致敏后从受体中分离出CD4+T细胞。将细胞用羟基荧光素琥珀酰亚胺脂(CFSE)
标记，并在培养物中用OVA323-339再刺激。通过CFSE稀释鉴定了分裂的细胞，并通过流式细胞术计数。将结果表示为占总CFSE+T细胞的百分比。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
图4B.致敏后从受体中分离出CD4+T细胞，并在细胞内针对IFN-γ进行免疫染色。通过流式
+ + +
细胞术计数IFN-γCD4T细胞并计算占总CD4T细胞的百分比。示出了有相似结果的三次独
立实验之一。图4C和D.再刺激T细胞的上清液中的IFN-γ和IL-10分泌。在阳性对照中使用
抗CD3mAb(KT3)或KT3+IL-2+IL-4诱导指定的细胞因子。示出了有相似结果的三次独立实验
之一。*，p＜0.05，**，p＜0.01。
[0016] 图5显示了P100对T细胞的刺激比P66更强。在培养物中用P100或P66(5ug/ml)再刺激得自经蚤抗原免疫的C57BL/6小鼠的脾CD4+T细胞。通过基于3-(4，5--二甲基噻唑-2-
基)-2，5-联苯四唑溴化物(MTT，黄色四唑)的测定法测定T细胞增殖。分别使用伴刀豆球蛋
白A(1ug/ml)和BSA(1ug/ml)作为阳性和阴性对照。*，p＜0.05。示出了有相似结果的三次独
立实验之一。
基)-2，5-联苯四唑溴化物(MTT，黄色四唑)的测定法测定T细胞增殖。分别使用伴刀豆球蛋
白A(1ug/ml)和BSA(1ug/ml)作为阳性和阴性对照。*，p＜0.05。示出了有相似结果的三次独
立实验之一。
[0017] 图6显示了经联合免疫诱导的CD25-iTreg对皮肤反应的减弱。图6A.经蚤抗原刺激的T细胞增殖。图6B.蚤特异性皮内试验诱导的体内T细胞应答。图6C.皮肤切片的H&E染色。
黑色箭头指示浸润T细胞。图6D.肥大细胞数和通过甲苯胺蓝染色的脱粒(黑色箭头)。图6E.
联合免疫后七天，计数CD25-iTreg细胞占CD4+CD25-T细胞的百分比。示出了有相似结果的三
次独立实验之一。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
黑色箭头指示浸润T细胞。图6D.肥大细胞数和通过甲苯胺蓝染色的脱粒(黑色箭头)。图6E.
联合免疫后七天，计数CD25-iTreg细胞占CD4+CD25-T细胞的百分比。示出了有相似结果的三
次独立实验之一。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
[0018] 图7显示了过继转移CD25-iTreg体内抑制皮肤反应。将得自经Co100或Co66免疫的小鼠的CD25-iTreg过继转移进FSAl致敏小鼠。然后用蚤抗原激发受体(皮肤试验)。分别使
用组胺和PBS作为皮肤试验的阳性和阴性对照。*，p＜0.05。示出了有相似结果的三次独立
实验之一。
用组胺和PBS作为皮肤试验的阳性和阴性对照。*，p＜0.05。示出了有相似结果的三次独立
实验之一。
[0019] 图8.联合免疫抑制屋尘螨(HDM)介导的哮喘的发展。(A)在用尘螨提取物最后一次激发后24h通过H&E染色对肺组织进行组织学检查。箭头示出了不同的细胞浸润(白色箭
头)。(B)在最后一次激发后24h通过ELlSA测试对Der-p1特异的IgE的水平。(C)用Flex set
检查最后一次激发后24h小鼠血清中的不同细胞因子水平。与模型组相比，*，p＜0.05；**，p＜0.01，n＝6只小鼠/组。
头)。(B)在最后一次激发后24h通过ELlSA测试对Der-p1特异的IgE的水平。(C)用Flex set
检查最后一次激发后24h小鼠血清中的不同细胞因子水平。与模型组相比，*，p＜0.05；**，p＜0.01，n＝6只小鼠/组。
[0020] 图9.联合免疫诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg。(A)通过FACS分析第二次联合免疫后第7天CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达。(B-C)通过在存在APC和刺激物的情况下与应答T细胞
+
(从经Der-p1刺激预处理的WT小鼠纯化的CD4T细胞)一起按1∶5或1∶10的比率共同培养72h
检查对iTreg(从经联合免疫预处理的Foxp3gfp小鼠中纯化)的抑制。通过MTT法分析增殖水
平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
+
(从经Der-p1刺激预处理的WT小鼠纯化的CD4T细胞)一起按1∶5或1∶10的比率共同培养72h
检查对iTreg(从经联合免疫预处理的Foxp3gfp小鼠中纯化)的抑制。通过MTT法分析增殖水
平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
[0021] 图10.iTreg的抑制能力由IL-10而非细胞与细胞的接触介导。(A)在第二次联合免疫后第7天通过荧光活化细胞分选(FACS)分析iTreg和nTreg的抑制性受体的表达。(B)在
transwell板中，在上部腔室中用Derpl抗原(10j g/ml)刺激2×105个新分离的CD4+CD25-
GFP+(绿色荧光蛋白)T细胞以分泌细胞因子。用Derp1抗原(10ug/ml)刺激1×106个应答CD4+
T细胞以在下部腔室中扩增。如所示在下部腔室中添加10jg/mL的对照IgG、抗IL-10或抗
TGF-β。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜
0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
transwell板中，在上部腔室中用Derpl抗原(10j g/ml)刺激2×105个新分离的CD4+CD25-
GFP+(绿色荧光蛋白)T细胞以分泌细胞因子。用Derp1抗原(10ug/ml)刺激1×106个应答CD4+
T细胞以在下部腔室中扩增。如所示在下部腔室中添加10jg/mL的对照IgG、抗IL-10或抗
TGF-β。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜
0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
[0022] 图11.TGF-β1对于诱导iTreg中的Foxp3表达是必需的。(A)通过RT-PCR检查在首次联合免疫后第3天得自小鼠脾脏的CDllC+树突细胞中的细胞因子生成。甘油醛3-磷酸脱氢
酶(GAPDH)的表达作为样品的内部对照。(B)体内阻断TGF-β1时CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表
达。连续三天在每次联合免疫后在病灶内为小鼠注射单独的抗TGF-βAb(400μg/注射)或单
独的同种型对照抗体小鼠免疫球蛋白G1(IgGl)3次。在第二次联合免疫后7天通过FACS分析
GFP表达。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
酶(GAPDH)的表达作为样品的内部对照。(B)体内阻断TGF-β1时CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表
达。连续三天在每次联合免疫后在病灶内为小鼠注射单独的抗TGF-βAb(400μg/注射)或单
独的同种型对照抗体小鼠免疫球蛋白G1(IgGl)3次。在第二次联合免疫后7天通过FACS分析
GFP表达。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
[0023] 图12.IL-10对于iTreg的抑制能力具有重要意义。(A)当体内阻断IL-10时也可诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg。通过FACS分析了CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达。(B)在IL-10不足时诱导的iTreg抑制能力受损。与应答T细胞一起共同培养从经抗IL-10mAb预处理的小鼠中
分离的iTreg。通过MTT法分析增殖水平。(C)通过FACS评估了在用抗TGF-b或抗IL-10mAb处
理后iTreg分泌的IL-10的水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜
0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
分离的iTreg。通过MTT法分析增殖水平。(C)通过FACS评估了在用抗TGF-b或抗IL-10mAb处
理后iTreg分泌的IL-10的水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜
0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
[0024] 图13.TGF-β1在体外诱导CD4+CD25-初始T细胞中的Foxp3表达。(A)Dcreg中的TGF-β和IL-10模型诱导iTreg。(B)与用DNA和Der-p1蛋白共同处理的DCreg一起共同培养初始T细
胞7天，通过FACS评估了Foxp3-GFP。(C)从Foxp3gfp小鼠中纯化的初始CD4+CD25-T细胞在存在不同剂量的TGF-β1的情况下用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28刺激72h，然后通过FACS评估
GFP的表达。(D)将CD4+CD25-T细胞在存在TGF-β1或IL-10的情况下如(C)刺激并培养72h，然
后通过FACS评估GFP的表达。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
胞7天，通过FACS评估了Foxp3-GFP。(C)从Foxp3gfp小鼠中纯化的初始CD4+CD25-T细胞在存在不同剂量的TGF-β1的情况下用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28刺激72h，然后通过FACS评估
GFP的表达。(D)将CD4+CD25-T细胞在存在TGF-β1或IL-10的情况下如(C)刺激并培养72h，然
后通过FACS评估GFP的表达。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
[0025] 图14.自分泌IL-10对iTreg抑制能力有影响。(A)与分别用DNA和Der-p1蛋白两者或单抗原预处理的DC一起共同培养初始T细胞7天。然后通过FACS评估了Foxp3-GFP。(B)如
(A)从培养基中分离iTreg并与效应T细胞一起共同培养以评估其抑制能力。(C)在用DNA和
蛋白疫苗预处理后的不同天数通过FACS检测了CD1l+DC表面的IL-10R表达。(D)与用DNA、
Der-p1蛋白两者和IL-10R siRNA预处理的DC一起共同培养初始T细胞。通过FACS评估了
iTreg诱导。(E)如(D)从培养基中分离iTreg细胞并与效应T细胞一起共同培养以评估其抑
制能力。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜
0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
(A)从培养基中分离iTreg并与效应T细胞一起共同培养以评估其抑制能力。(C)在用DNA和
蛋白疫苗预处理后的不同天数通过FACS检测了CD1l+DC表面的IL-10R表达。(D)与用DNA、
Der-p1蛋白两者和IL-10R siRNA预处理的DC一起共同培养初始T细胞。通过FACS评估了
iTreg诱导。(E)如(D)从培养基中分离iTreg细胞并与效应T细胞一起共同培养以评估其抑
制能力。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，p＜0.05，**，p＜
0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，n＝6只小鼠/组。
[0026] 图15.研究了TGF-b和IL-10功能的模型并且其涉及通过联合免疫对iTreg进行诱导。图15A通过Western印迹显示了纯化的CD4+CD25-GFp+iTreg和CD4+CD25+GFP+nTreg中活
化的T细胞1和2(NFAT1和NFAT2)的核或细胞质核因子。将组蛋白或GAPDH分别用作核或细胞
质蛋白的上样对照。(B)TGF-β和IL-10对联合免疫的不同阶段有影响。
化的T细胞1和2(NFAT1和NFAT2)的核或细胞质核因子。将组蛋白或GAPDH分别用作核或细胞
质蛋白的上样对照。(B)TGF-β和IL-10对联合免疫的不同阶段有影响。
[0027] 图16.对真核和原核表达构建体中pVAX-Der-p1表达的分析。(A)通过用Der-p1特异性引物进行的RT-PCR分析从用pVAX-Der-p1转染的幼仓鼠肾(BHK21)细胞分离的RNA。泳
道1，DNA分子量标准；泳道2，得自经转染的BHK21细胞的RNA；泳道3，得自经转染的pVAX载体BHK21细胞的RNA；泳道4，得自非转染的BHK21细胞的RNA。通过SDS PAGE(B)和Western印迹
(C)进行了对大肠杆菌(E.coli)系统中Der-p1蛋白表达的测定。SDS PAGE结果1：未诱导的
pET28a-Der-p1；2：用0.1mM IPTG诱导的pET28a-Der-p1；3：用0.5mM IPTG诱导的pET28a-
Der-p1；4：用1.5mM IPTG诱导的pET28a-Der-p1；5：蛋白分子量标准。箭头指向目标条带。
(C)Western印迹结果1：未诱导的pET28a-Der-p1；2：诱导的pET28a-Der-p1。
道1，DNA分子量标准；泳道2，得自经转染的BHK21细胞的RNA；泳道3，得自经转染的pVAX载体BHK21细胞的RNA；泳道4，得自非转染的BHK21细胞的RNA。通过SDS PAGE(B)和Western印迹
(C)进行了对大肠杆菌(E.coli)系统中Der-p1蛋白表达的测定。SDS PAGE结果1：未诱导的
pET28a-Der-p1；2：用0.1mM IPTG诱导的pET28a-Der-p1；3：用0.5mM IPTG诱导的pET28a-
Der-p1；4：用1.5mM IPTG诱导的pET28a-Der-p1；5：蛋白分子量标准。箭头指向目标条带。
(C)Western印迹结果1：未诱导的pET28a-Der-p1；2：诱导的pET28a-Der-p1。
[0028] 图17.对支气管肺泡灌洗液(BAL)中不同细胞的分析。最后一次激发后24h，收集BAL并通过CELL-DYN评估了浸润细胞(总数)和嗜酸性细胞的数量。结果代表三次实验。与模
型组相比，*，p＜0.05，**，p＜0.01。(n＝6只猫/组)。
型组相比，*，p＜0.05，**，p＜0.01。(n＝6只猫/组)。
[0029] 图18.联合免疫上调源自Foxp3gfp小鼠的CD4+CD25-T细胞中的GFP表达。通过FACS分析在第二次联合免疫后第7天CD4+CD25-T细胞中的GFP表达。结果代表至少三次独立实验。
[0030] 图19.用mAb处理后小鼠血清中TGF-β1或IL-10的水平。(A)用ELISA试剂盒检查在第二次联合免疫后第3天小鼠血清中的TGF-β1水平。(B)用Flex Set检查在第二次联合免疫
后第3天小鼠血清中的IL-10水平。结果代表至少三次独立实验。与模型组相比，*，p＜
0.05，**，p＜0.01，n＝6只小鼠/组。
后第3天小鼠血清中的IL-10水平。结果代表至少三次独立实验。与模型组相比，*，p＜
0.05，**，p＜0.01，n＝6只小鼠/组。
[0031] 图20.TGF-β受体抑制剂抑制Foxp3诱导。与用DNA、Der-p1蛋白两者和TGF-β受体预处理的DC一起共同培养初始T细胞。通过FACS评估了iTreg诱导。结果代表至少三次独立实
验。
验。
[0032] 图21.IL-10对由DCreg引起的Treg诱导的阶段无影响。用抗IL-10通过DCreg诱导了iTreg，然后在7天之后分离。通过效应T细胞的增殖水平评估了这些iTreg的抑制功能。通
过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。
过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。
[0033] 图22.研究了IL-10R siRNA对DC的影响。在用IL-10R siRNA或对照siRNA处理后第2天测定了DC表面上的IL-10R水平。结果代表至少三次独立实验。
[0034] 图23.阿米洛利在体外加速质粒进入。对RAW264.7(A，B，C)、JAWSII(D，E)和DC2.4(F，G)监测了含或不含1mM阿米洛利时Cy5-pEGFP进入细胞系的情况，作为2h Cy5+％和第3
天的EGFP+Cy5+％。添加LipofactamineTM2000(Lipo2000)作为阳性对照。示出了有相似结
果的三次独立实验之一。
天的EGFP+Cy5+％。添加LipofactamineTM2000(Lipo2000)作为阳性对照。示出了有相似结
果的三次独立实验之一。
[0035] 图24.阿米洛利在体内加速质粒进入。在含或不含阿米洛利时，将首次接受试验的C57小鼠用Cy5-pEGFP在后足垫部位经皮下免疫。4小时后，采集淋巴结以测试Cy5+细胞的比
例(B)和亚型(C)。n＝3。B中的*，在所有组之中具有统计显著性。
例(B)和亚型(C)。n＝3。B中的*，在所有组之中具有统计显著性。
[0036] 图25.阿米洛利加速脂筏和小窝依赖性质粒进入。与阿米洛利一起添加脂筏抑制剂MβCD或小窝抑制剂菲律平(fillipin)，以阻断细胞系RAW264.7(A，B)、JAWSII(C，D)和
DC2.4(E，F)上的内吞途径。然后添加Cy5-pEGFP以在2h内进入并在3天内表达。示出了有相
似结果的三次独立实验之一。
DC2.4(E，F)上的内吞途径。然后添加Cy5-pEGFP以在2h内进入并在3天内表达。示出了有相
似结果的三次独立实验之一。
[0037] 图26.阿米洛利增强DC的成熟和固有细胞因子分泌。在细胞培养物中添加了含或不含1mM阿米洛利的10μg/ml的pcD-S2以进行刺激。对RAW264.7(A，B，C)、JAWSII(D，E)、
DC2.4(F，G)、腹腔巨噬细胞(H，I)和脾DC(J，K)在第3天测试了表面成熟标记CD40、CD80、
CD83、CD86、MHC I、MHC-II和分泌进上清液的固有细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ。示出了有相似结果的三次独立实验之一。对于腹腔巨噬细胞和脾DC，n＝3。*和**，在+/-阿米
洛利之间具有统计显著性。
DC2.4(F，G)、腹腔巨噬细胞(H，I)和脾DC(J，K)在第3天测试了表面成熟标记CD40、CD80、
CD83、CD86、MHC I、MHC-II和分泌进上清液的固有细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ。示出了有相似结果的三次独立实验之一。对于腹腔巨噬细胞和脾DC，n＝3。*和**，在+/-阿米
洛利之间具有统计显著性。
[0038] 图27.阿米洛利增强针对HBV S2的适应性免疫。A，免疫途径。B，抗S2IgG抗体滴度。C，在后足垫部位中经皮下用1μg sAg再刺激24h后的迟发型超敏(DTH)反应。添加PBS作为阴
性对照。*，在所有组之中具有统计显著性。D和E，体外(D)和体内(E)HBVS208-215特异性裂
解，*，在+/-阿米洛利之间具有统计显著性。F和G，体外(F)和体内(G)HBVAlbl转基因小鼠肝脏裂解。A-G，n＝3。
性对照。*，在所有组之中具有统计显著性。D和E，体外(D)和体内(E)HBVS208-215特异性裂
解，*，在+/-阿米洛利之间具有统计显著性。F和G，体外(F)和体内(G)HBVAlbl转基因小鼠肝脏裂解。A-G，n＝3。
[0039] 图28.阿米洛利提高IFN-γ+穿孔素+颗粒酶B+CD8T细胞的比例。将得自pcD-S2+/-阿米洛利免疫小鼠的脾细胞在体外通过10μg/ml的S208-215再刺激12h(A-C)或通过10μg/
ml的sAg再刺激24h(D)，然后用多色细胞内染料染色。添加PMA与离子霉素(Ionmycin)作为
阳性对照。A，计算了CD8T细胞中的IFN-γ、穿孔素或颗粒酶B阳性细胞作为应答细胞。B，+/-阿米洛利之间应答CD8T细胞中的细胞因子表达模式。C，阿米洛利剂量对IFN-γ+穿孔素+颗
粒酶B+细胞比例的影响。D，响应sAg再刺激的IFN-γ+穿孔素+颗粒酶B+细胞比例。E和F，与
腹腔巨噬细胞(E)或脾DC(F)共同培养然后通过S208-215再刺激并染色的CD8T细胞中的
IFN-γ+穿孔素+颗粒酶B+。n＞3。
ml的sAg再刺激24h(D)，然后用多色细胞内染料染色。添加PMA与离子霉素(Ionmycin)作为
阳性对照。A，计算了CD8T细胞中的IFN-γ、穿孔素或颗粒酶B阳性细胞作为应答细胞。B，+/-阿米洛利之间应答CD8T细胞中的细胞因子表达模式。C，阿米洛利剂量对IFN-γ+穿孔素+颗
粒酶B+细胞比例的影响。D，响应sAg再刺激的IFN-γ+穿孔素+颗粒酶B+细胞比例。E和F，与
腹腔巨噬细胞(E)或脾DC(F)共同培养然后通过S208-215再刺激并染色的CD8T细胞中的
IFN-γ+穿孔素+颗粒酶B+。n＞3。
[0040] 图29.IFN-γ-/-损害了CTL，但阿米洛利仍增加了双阳性细胞和CTL。将特异性裂解计算为在体外(A)和体内(B)S208-215包被的初始脾细胞(靶细胞)与初始脾细胞(对照细
胞)的比，或在体外(C)和体内(D)Albl肝细胞(靶细胞)与初始C57肝细胞(对照细胞)的比，
其中用pcD-S2+/-阿米洛利免疫的WT或IFN-γ-/-小鼠作为效应CTL。计算了所有组之中或
+/-阿米洛利之间的差异。n＝3。E，WT和IFN-γ-/-之间的应答CD8T细胞比例。F，S208-215再刺激后IFN-γ-/-小鼠的细胞因子谱(cytokine pattern)。G，HBsAg再刺激后穿孔素+颗粒
酶B+双阳性细胞比例。n＝3。
胞)的比，或在体外(C)和体内(D)Albl肝细胞(靶细胞)与初始C57肝细胞(对照细胞)的比，
其中用pcD-S2+/-阿米洛利免疫的WT或IFN-γ-/-小鼠作为效应CTL。计算了所有组之中或
+/-阿米洛利之间的差异。n＝3。E，WT和IFN-γ-/-之间的应答CD8T细胞比例。F，S208-215再刺激后IFN-γ-/-小鼠的细胞因子谱(cytokine pattern)。G，HBsAg再刺激后穿孔素+颗粒
酶B+双阳性细胞比例。n＝3。
[0041] 图30.CD401ow是联合免疫诱导的DCreg的标志。A)为小鼠肌肉注射指定的免疫原。第二天通过针对CDllc和CD40-PE的双染，接着进行流式细胞术检查了脾脏DC。为CD11c+细
胞分类。将首次接受试验的小鼠用作阴性对照。示出了有相似结果的独立实验。B)为纯化的
CDllc+DC和JAWS II细胞供给指定的免疫原24h，并通过流式细胞术检查CD40的表达。未经
处理的DC或JAWS II细胞用作阴性对照。C)为JAWS II细胞供给pOVA323+OVA323或pVAX+
OVA32324h，然后与从已使其对OVA敏感的小鼠制备的CFSE-CD4+T细胞一起共同培养5天。通
过FACS分析了Foxp3和IL-10的表达。为CD4+细胞分类(gate)。将Foxp3+或IL-10+细胞的数
量计算为分类细胞的百分比。D)为JAWS II细胞供给所示的荧光标记免疫原24h，然后针对
CD40进行免疫染色。通过共聚焦显微术分析了免疫原摄取和CD40表达的相关性(上图)。使
用Nikon EZ-C13.00FreeViewer软件分析了平均PE荧光(下图)。细胞数为10个/组。
胞分类。将首次接受试验的小鼠用作阴性对照。示出了有相似结果的独立实验。B)为纯化的
CDllc+DC和JAWS II细胞供给指定的免疫原24h，并通过流式细胞术检查CD40的表达。未经
处理的DC或JAWS II细胞用作阴性对照。C)为JAWS II细胞供给pOVA323+OVA323或pVAX+
OVA32324h，然后与从已使其对OVA敏感的小鼠制备的CFSE-CD4+T细胞一起共同培养5天。通
过FACS分析了Foxp3和IL-10的表达。为CD4+细胞分类(gate)。将Foxp3+或IL-10+细胞的数
量计算为分类细胞的百分比。D)为JAWS II细胞供给所示的荧光标记免疫原24h，然后针对
CD40进行免疫染色。通过共聚焦显微术分析了免疫原摄取和CD40表达的相关性(上图)。使
用Nikon EZ-C13.00FreeViewer软件分析了平均PE荧光(下图)。细胞数为10个/组。
[0042] 图31.DC通过网格蛋白和小窝介导的内吞作用同时摄取DNA和蛋白免疫原。A)在37℃下用PBS、MDC(50μM)或菲律平(10μg/ml)预处理JAWS II细胞30分钟，然后供给Cy5-
pOVA323+FITC-OVA323或Cy5-pVAX+FITC-OVA32324h。用抗CD40-PE对细胞染色并通过流式
细胞术分析。示出了Cy5/FITC双阳性细胞(分类)的CD40染色。B)在A中所示的重复实验的汇
总。
pOVA323+FITC-OVA323或Cy5-pVAX+FITC-OVA32324h。用抗CD40-PE对细胞染色并通过流式
细胞术分析。示出了Cy5/FITC双阳性细胞(分类)的CD40染色。B)在A中所示的重复实验的汇
总。
[0043] 图32.联合免疫活化由Cav-1介导的负向途径。在分析前2天从首次接受试验的小鼠或用指定免疫原免疫的小鼠的脾脏DC中提取总蛋白或RNA。对指定的蛋白和基因进行了
Western印迹(A、C和D)和RT-PCR分析。
Western印迹(A、C和D)和RT-PCR分析。
[0044] 图33.使Cav-1和Tollip沉默防止了DCreg的诱导。A)为WT和Cav-1和/或Tollip敲低DC供给pOVA323+OVA323或pVAX+OVA32324h并分析了CD40和IL-10的表达。使用未供给任
何免疫原的WT DC作为对照(未经处理)。B)与得自对OVA敏感的小鼠的CFSE-CD4+T细胞一起
共同培养供给了pOVA323+OVA323或pVAX+OVA32324h的DC。测定了T细胞增殖和Foxp3+和IL-
10+T细胞的数量。
何免疫原的WT DC作为对照(未经处理)。B)与得自对OVA敏感的小鼠的CFSE-CD4+T细胞一起
共同培养供给了pOVA323+OVA323或pVAX+OVA32324h的DC。测定了T细胞增殖和Foxp3+和IL-
10+T细胞的数量。
[0045] 图34.缺乏Cav-1和/或Tollip的DC在体内不是致耐受性的。将缺乏Cav-1和/或Tollip的JAWS II细胞过继转移到同基因小鼠中(第0天)。然后在第0和7天用IFA中的OVA使
小鼠免疫。在第14天，测试了DTH反应。在第15天，测定T细胞增殖、T细胞中Foxp3的表达和上清液中的IL10水平。
小鼠免疫。在第14天，测试了DTH反应。在第15天，测定T细胞增殖、T细胞中Foxp3的表达和上清液中的IL10水平。
[0046] 图35.联合免疫诱导的DCreg改善炎症性支气管炎。A)实验设计：在第0和7天经腹膜内为Balb/c小鼠注射0.1ml PBS中的1mg/ml的OVA/明矾复合物，随后在第14、16和18天在
气管内用100g OVA激发以建立“模型”。在第14、16和18天使对照小鼠经气管内接受PBS并且指定为“虚假(shame)”对照。在第21天，将5×105个得自同基因供体小鼠的CDllc+细胞经静
脉转移进模型小鼠，每天一次，连续3天。(n＝3只/组)。转移之前，用或不用菲律平预处理从首次接受试验的小鼠的脾脏纯化的供体CDllc+细胞，随后用pOVA+OVA或pVAX+OVA共同处理
24h。在最终转移后第14天，取血清样品以分析IgE或细胞因子生成的水平。制作肺组织切片
以评估疾病严重程度。B)在过继转移指定的DC后通过ELISA分析了抗原特异性IgE的水平。
C)在转移指定的DC之前通过CBA检查了IL-4和IL-5的生成。D)通过H&E染色检查了肺部切
片，并在光学显微镜下以x100和x200放大倍数进行记录。
气管内用100g OVA激发以建立“模型”。在第14、16和18天使对照小鼠经气管内接受PBS并且指定为“虚假(shame)”对照。在第21天，将5×105个得自同基因供体小鼠的CDllc+细胞经静
脉转移进模型小鼠，每天一次，连续3天。(n＝3只/组)。转移之前，用或不用菲律平预处理从首次接受试验的小鼠的脾脏纯化的供体CDllc+细胞，随后用pOVA+OVA或pVAX+OVA共同处理
24h。在最终转移后第14天，取血清样品以分析IgE或细胞因子生成的水平。制作肺组织切片
以评估疾病严重程度。B)在过继转移指定的DC后通过ELISA分析了抗原特异性IgE的水平。
C)在转移指定的DC之前通过CBA检查了IL-4和IL-5的生成。D)通过H&E染色检查了肺部切
片，并在光学显微镜下以x100和x200放大倍数进行记录。
[0047] 图36.联合免疫诱导的DCreg改善自身免疫性卵巢疾病。A)实验设计：在足垫部位为C57BL/6小鼠注射在CFA中乳化的mZP3蛋白以诱导AOD。14天后，将5×105个JAWS II细胞
经静脉转移进这些经诱导的AOD小鼠中，每天一次，连续3天。(n＝6只/组)。转移之前，为
JAWS II细胞供给pcD-mZP3+mZP3或pcD-OVA+mZP324h，接着在37℃下用丝裂霉素C处理(50μ
g/ml)20分钟。在最终转移后第14天，取血清以分析细胞因子生成，固定卵巢并切片用于评
估疾病严重程度。B)通过CBA分析了IFN-γ、TNF-α和IL-5的生成。示出了有相似结果的独立实验。C)通过对得自每只动物的组织切片的病理学分析评估了疾病的程度。图中的每个点
表示一只动物。D)在最终转移后第14天，针对CD4、Foxp3和IL-10对每个受体组的脾细胞进
行三重染色，并通过流式细胞术分析。为CD4+细胞分类。
经静脉转移进这些经诱导的AOD小鼠中，每天一次，连续3天。(n＝6只/组)。转移之前，为
JAWS II细胞供给pcD-mZP3+mZP3或pcD-OVA+mZP324h，接着在37℃下用丝裂霉素C处理(50μ
g/ml)20分钟。在最终转移后第14天，取血清以分析细胞因子生成，固定卵巢并切片用于评
估疾病严重程度。B)通过CBA分析了IFN-γ、TNF-α和IL-5的生成。示出了有相似结果的独立实验。C)通过对得自每只动物的组织切片的病理学分析评估了疾病的程度。图中的每个点
表示一只动物。D)在最终转移后第14天，针对CD4、Foxp3和IL-10对每个受体组的脾细胞进
行三重染色，并通过流式细胞术分析。为CD4+细胞分类。
[0048] 图37.阿米洛利对JAWS II细胞中CD40表达的影响。在37℃下用阿米洛利(5mM)预处理JAWS II细胞10分钟，然后用Cy5-pOVA323+FITC-OVA323或Cy5-pVAX+FITC-OVA323共同
处理24h。用抗CD40-PE对细胞染色并通过流式细胞术分析。
处理24h。用抗CD40-PE对细胞染色并通过流式细胞术分析。
[0049] 图38.对JAWSII细胞中Cav-1和Tollip的调节。为JAWSII细胞供给指定的免疫原24h。然后提取总蛋白或RNA并通过Western印迹(A)或RT-PCR(B)分析。
[0050] 图39.通过RNAi对Cav-1和Tollip的沉默。A)用Cav-1或Tollip特异性siRNA转染JAWS II细胞。在24h时，通过实时RT-PCR检测了Cav-1和Tollip的mRNA水平。B)为WT和Cav-1
敲低DC供给pOVA+OVA或pVAX+OVA24h。通过Westem印迹检测了NF-κB的易位。
敲低DC供给pOVA+OVA或pVAX+OVA24h。通过Westem印迹检测了NF-κB的易位。
[0052] 图41显示了编码流感核蛋白(“NP”)和M2抗原的质粒表达载体和相应的线性表达盒的图谱。线性表达盒pcrNP或pcrM2含有CMV启动子、用于剪接的内含子、具有终止密码子
和多聚腺苷酸化信号的NP或M2的全长基因。
和多聚腺苷酸化信号的NP或M2的全长基因。
具体实施方式
[0053] 本发明涉及这样的发现，通过施用疫苗促进剂、抗原和编码抗原的DNA的组合有效诱导了抗特异性抗原的iTreg细胞。疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂，其为5-(N-乙基-N-异丙
基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利并优选阿米洛利。这种诱导比单独的抗原、单
独的DNA、单独的疫苗促进剂、或单独的抗原和DNA好很多。本发明还涉及这样的发现，如果
抗原对致耐受性树突细胞(DC)上表达的II类MHC具有高亲和力，则可进一步提高iTreg细胞
诱导的效率。含有对II类MHC具有高亲和力的肽抗原和表达相同肽的DNA的组合的疫苗诱导
能够抑制自身免疫性疾病和变态反应的iTreg群。本发明还涉及具有疫苗促进剂的疫苗。疫
苗中存在疫苗促进剂促进DNA进入靶细胞。因为iTreg细胞为抗原特异性的并因此更有效抑
制抗原特异性T细胞功能以及TH1和Tm细胞刺激，所以iTreg诱导处理伴有比其他处理方法远
远更少的副作用。
基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利并优选阿米洛利。这种诱导比单独的抗原、单
独的DNA、单独的疫苗促进剂、或单独的抗原和DNA好很多。本发明还涉及这样的发现，如果
抗原对致耐受性树突细胞(DC)上表达的II类MHC具有高亲和力，则可进一步提高iTreg细胞
诱导的效率。含有对II类MHC具有高亲和力的肽抗原和表达相同肽的DNA的组合的疫苗诱导
能够抑制自身免疫性疾病和变态反应的iTreg群。本发明还涉及具有疫苗促进剂的疫苗。疫
苗中存在疫苗促进剂促进DNA进入靶细胞。因为iTreg细胞为抗原特异性的并因此更有效抑
制抗原特异性T细胞功能以及TH1和Tm细胞刺激，所以iTreg诱导处理伴有比其他处理方法远
远更少的副作用。
[0054] 本文提供了包含疫苗促进剂、抗原肽和编码肽的DNA的疫苗。抗原肽/DNA刺激iTreg细胞。在一些实施方案中，该肽具有100nM的IC50，并且对于II类MHC可具有50nM或更低的IC50。II类MHC可在致耐受性树突细胞上表达。DNA可包含能够表达该肽的表达载体。载体
可选自本领域中的可用载体，并且可以包括pVAX、pcDNA3.0或provax。在一些实施方案中，
该肽可以为选自以下的蛋白中所含的氨基酸序列：胰岛素、FSAl、Der-p1、髓鞘少突胶质细
胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性
蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、葡萄糖-6-磷酸酶、透明带1、2或3、人肌球蛋白、柯萨奇病毒B4结构蛋白VP1、VP2、VP3或VP4、A群链球菌M5蛋白、II型胶原蛋白、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、Pendrin、乙酰胆碱受体α亚基、人S抗原和人IRBP。胰岛素肽可包含氨基酸序列MRLLPLLALLA(S EQ ID NO：5)或SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO：191)。MOG肽可
包含选自HPIRALVGDEVELP(SEQ ID NO：36)、VGWYRPPF SR VVHLYRNGKD(SEQ ID NO：37)、
LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVL PVLLL(SEQ ID NO：38)、MOG1-22(SEQ ID NO：17)、MOG34-56(SEQ ID NO：18)和MOG64-96(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列。甲状腺球蛋白肽可包含选自
NIFEXQVDAQPL(SEQ ID NO：155)、YSLE HSTDDXASFSRALENATR(SEQ ID NO：156)、
RALENATRDXFIIC PIIDMA(SEQ ID NO：157)、LLSLQEPGSKTXSK(SEQ ID NO：158)和
EHSTDDXASFSRALEN(SEQ ID NO：159)的氨基酸序列，其中X为3，5，3，5-四碘甲腺原氨酸(甲状腺素)。TPO肽可包含选自LKKR GILSPAQLLS(SEQ ID NO：160)、SGVIARAAEIMETSIQ(SEQ ID NO：161)、PPVREVTRHVIQVS(SEQ ID NO：162)、PRQQMNGLTS FLDAS(SEQ ID NO：163)、
LTALHTLWLREHNRL(SEQ ID NO：16 4)、HNRLAAALKALNAHW(SEQ ID NO：165)、ARKVVGALHQII
TL(SEQ ID NO：166)、LPGLWLHQAFFSPWTL(SEQ ID NO：167)、MNEELTERLFVLSNS ST(SEQ ID
NO：168)、LDLASINLQRG(SEQ ID NO：169)、RSVADKILDLYKHpDN(SEQ ID NO：170)和IDVWL
GGLAENFLP(SEQ ID NO：171)的氨基酸序列。Pendrin肽可包含选自QQQHERRKQERK(SEQ ID
NO：172)和PTKEIEIQVDWNSE(SE Q ID NO：173)的氨基酸序列。葡萄糖-6-磷酸酶肽可包含选
自IGRP1325(QHLQKDYRAYYTF)(SEQ ID NO：8)、IGRP2335(YTFLNFMS NVGDP)(SEQ ID NO：9)、IGRP226238(RVLNIDLLWSVPI)(SEQ I D NO：10)、IGRP247259(DWIHIDTTPFAGL)(SEQ ID NO：11)、G6Pa se-α228240(KGLGVDLLWTLEK)(SEQ ID NO：12)、G6Pase-α249261(EWVHIDTTPFASL)(SEQ ID NO：13)、UGRP218230(FTLGLDLSWS ISL)(SEQ ID NO：14)和UGRP239251(EWIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列。PLP肽可包含选自PLP30-49(SEQ ID NO：28)、PLP40-60(SEQ ID NO：
29)、PLP180-199(SEQ ID NO：30)、P LP184-199(SEQ ID NO：31)和PLP190-209(SEQ ID NO：
32)的氨基酸序列。MBP肽可包含选自MBP66-88(SEQ ID NO：21)、MBP85-99(SEQ ID NO：22)、MBP86-105(SEQ ID NO：23)、MBP143-168(S EQ ID NO：24)、MBP83-97(SEQ ID NO：25)和
MBP85-96(SEQ ID NO：26)的氨基酸序列。透明带3肽可包含选自ZP3330342(NSSS
SQFQIHGPR)(SEQ ID NO：42)、ZP3335342(QFQIHGPR)(SEQ ID NO：43)和ZP3330340
(NSSSSQFQIHG)(SEQ ID NO：44)的氨基酸序列。人肌球蛋白肽可包含选自
SLKLMATLFSTYASADTGDSG KGKGGKKKG(氨基酸614643；其中Ac为乙酰基)(SEQ ID NO：46)、
GQFIDSGKAGAEKL(氨基酸735-747)(SEQ ID NO：47)和DE CSELKKDIDDLE(氨基酸947-960)
(SEQ ID NO：48)的α-肌球蛋白肽。柯萨奇病毒B4结构蛋白肽选自表1。群链球菌M5肽可包含选自NT4(GLKTENEGLKTENEGLKTE)(SEQ ID NO：94)、NT5(KK EHEAENDKLKQQRDTL)(SEQ ID
NO：95)、B1B2(VKDKIAKEQE NKETIGTL)(SEQ IDNO：96)、B2(TIGTLKKILDETVKDKIA)(SE Q ID NO：97)、B3A(IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ ID NO：98)和C3(KGLRRDLDASREAKKQ)(SEQ ID NO：
99)的氨基酸序列和选自表2的M5肽。该肽可包含氨基酸序列(Q/R)(K/R)RAA(SEQ I D NO：
190)。II型胶原蛋白肽可包含选自II型胶原蛋白的残基263-270(SEQ ID NO：152)、184-198
(SEQ ID NO：153)和359369(SEQID NO：154)的氨基酸序列。AChR肽可包含选自人AChRα亚基的氨基酸37-429、149-156、138-167、149-163、143-156、1-181和1-437的氨基酸序列。人S抗原可包含选自肽19(181-VQHAPLEMGPQPRAEATWQF-200)(SEQ ID NO：183)、肽35(341-
GFLGELTSSEVATE VPFRLM-356)(SEQ ID NO：184)和肽36(351-VATEVPFRLMHPQP EDPAKE-370
(SEQ ID NO：185)的氨基酸序列。DNA可包含能够表达肽的表达载体。
可选自本领域中的可用载体，并且可以包括pVAX、pcDNA3.0或provax。在一些实施方案中，
该肽可以为选自以下的蛋白中所含的氨基酸序列：胰岛素、FSAl、Der-p1、髓鞘少突胶质细
胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性
蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、葡萄糖-6-磷酸酶、透明带1、2或3、人肌球蛋白、柯萨奇病毒B4结构蛋白VP1、VP2、VP3或VP4、A群链球菌M5蛋白、II型胶原蛋白、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、Pendrin、乙酰胆碱受体α亚基、人S抗原和人IRBP。胰岛素肽可包含氨基酸序列MRLLPLLALLA(S EQ ID NO：5)或SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO：191)。MOG肽可
包含选自HPIRALVGDEVELP(SEQ ID NO：36)、VGWYRPPF SR VVHLYRNGKD(SEQ ID NO：37)、
LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVL PVLLL(SEQ ID NO：38)、MOG1-22(SEQ ID NO：17)、MOG34-56(SEQ ID NO：18)和MOG64-96(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列。甲状腺球蛋白肽可包含选自
NIFEXQVDAQPL(SEQ ID NO：155)、YSLE HSTDDXASFSRALENATR(SEQ ID NO：156)、
RALENATRDXFIIC PIIDMA(SEQ ID NO：157)、LLSLQEPGSKTXSK(SEQ ID NO：158)和
EHSTDDXASFSRALEN(SEQ ID NO：159)的氨基酸序列，其中X为3，5，3，5-四碘甲腺原氨酸(甲状腺素)。TPO肽可包含选自LKKR GILSPAQLLS(SEQ ID NO：160)、SGVIARAAEIMETSIQ(SEQ ID NO：161)、PPVREVTRHVIQVS(SEQ ID NO：162)、PRQQMNGLTS FLDAS(SEQ ID NO：163)、
LTALHTLWLREHNRL(SEQ ID NO：16 4)、HNRLAAALKALNAHW(SEQ ID NO：165)、ARKVVGALHQII
TL(SEQ ID NO：166)、LPGLWLHQAFFSPWTL(SEQ ID NO：167)、MNEELTERLFVLSNS ST(SEQ ID
NO：168)、LDLASINLQRG(SEQ ID NO：169)、RSVADKILDLYKHpDN(SEQ ID NO：170)和IDVWL
GGLAENFLP(SEQ ID NO：171)的氨基酸序列。Pendrin肽可包含选自QQQHERRKQERK(SEQ ID
NO：172)和PTKEIEIQVDWNSE(SE Q ID NO：173)的氨基酸序列。葡萄糖-6-磷酸酶肽可包含选
自IGRP1325(QHLQKDYRAYYTF)(SEQ ID NO：8)、IGRP2335(YTFLNFMS NVGDP)(SEQ ID NO：9)、IGRP226238(RVLNIDLLWSVPI)(SEQ I D NO：10)、IGRP247259(DWIHIDTTPFAGL)(SEQ ID NO：11)、G6Pa se-α228240(KGLGVDLLWTLEK)(SEQ ID NO：12)、G6Pase-α249261(EWVHIDTTPFASL)(SEQ ID NO：13)、UGRP218230(FTLGLDLSWS ISL)(SEQ ID NO：14)和UGRP239251(EWIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列。PLP肽可包含选自PLP30-49(SEQ ID NO：28)、PLP40-60(SEQ ID NO：
29)、PLP180-199(SEQ ID NO：30)、P LP184-199(SEQ ID NO：31)和PLP190-209(SEQ ID NO：
32)的氨基酸序列。MBP肽可包含选自MBP66-88(SEQ ID NO：21)、MBP85-99(SEQ ID NO：22)、MBP86-105(SEQ ID NO：23)、MBP143-168(S EQ ID NO：24)、MBP83-97(SEQ ID NO：25)和
MBP85-96(SEQ ID NO：26)的氨基酸序列。透明带3肽可包含选自ZP3330342(NSSS
SQFQIHGPR)(SEQ ID NO：42)、ZP3335342(QFQIHGPR)(SEQ ID NO：43)和ZP3330340
(NSSSSQFQIHG)(SEQ ID NO：44)的氨基酸序列。人肌球蛋白肽可包含选自
SLKLMATLFSTYASADTGDSG KGKGGKKKG(氨基酸614643；其中Ac为乙酰基)(SEQ ID NO：46)、
GQFIDSGKAGAEKL(氨基酸735-747)(SEQ ID NO：47)和DE CSELKKDIDDLE(氨基酸947-960)
(SEQ ID NO：48)的α-肌球蛋白肽。柯萨奇病毒B4结构蛋白肽选自表1。群链球菌M5肽可包含选自NT4(GLKTENEGLKTENEGLKTE)(SEQ ID NO：94)、NT5(KK EHEAENDKLKQQRDTL)(SEQ ID
NO：95)、B1B2(VKDKIAKEQE NKETIGTL)(SEQ IDNO：96)、B2(TIGTLKKILDETVKDKIA)(SE Q ID NO：97)、B3A(IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ ID NO：98)和C3(KGLRRDLDASREAKKQ)(SEQ ID NO：
99)的氨基酸序列和选自表2的M5肽。该肽可包含氨基酸序列(Q/R)(K/R)RAA(SEQ I D NO：
190)。II型胶原蛋白肽可包含选自II型胶原蛋白的残基263-270(SEQ ID NO：152)、184-198
(SEQ ID NO：153)和359369(SEQID NO：154)的氨基酸序列。AChR肽可包含选自人AChRα亚基的氨基酸37-429、149-156、138-167、149-163、143-156、1-181和1-437的氨基酸序列。人S抗原可包含选自肽19(181-VQHAPLEMGPQPRAEATWQF-200)(SEQ ID NO：183)、肽35(341-
GFLGELTSSEVATE VPFRLM-356)(SEQ ID NO：184)和肽36(351-VATEVPFRLMHPQP EDPAKE-370
(SEQ ID NO：185)的氨基酸序列。DNA可包含能够表达肽的表达载体。
[0055] 在一些实施方案中，载体选自pVAX、pcDNA30和provax。
[0056] 本文还提供了治疗I型糖尿病的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含胰岛素肽。治疗I型糖尿病的方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中
疫苗可包含疫苗促进剂、抗原胰岛素肽和编码胰岛素肽的DNA，并且其中肽对II类MHC的IC50
为50nM或更低。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基阿米洛利(EIPA)、
苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。在一些实施方案中，II类MHC在致耐受性树
突细胞上表达。肽由氨基酸序列MRLLPLLALLA(SEQ ID NO：5)或SHLVEALYLV CGERG(SFQ ID
NO：191)组成。
疫苗可包含疫苗促进剂、抗原胰岛素肽和编码胰岛素肽的DNA，并且其中肽对II类MHC的IC50
为50nM或更低。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基阿米洛利(EIPA)、
苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。在一些实施方案中，II类MHC在致耐受性树
突细胞上表达。肽由氨基酸序列MRLLPLLALLA(SEQ ID NO：5)或SHLVEALYLV CGERG(SFQ ID
NO：191)组成。
[0057] 本文进一步提供了治疗多发性硬化的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含疫苗促进剂、多发性硬化自身抗原肽和编码肽的DNA，并且其中肽对
II类MHC的IC50为50nM或更低。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基阿
米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。在一些实施方案中，疫苗可
包含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相
关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)或少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)；以及MOG的肽。另外，肽
可由选自HPIRALVGDEVELP、VGWYRPPFSRVVHLYRN GKD和LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL的氨
基酸序列组成。
II类MHC的IC50为50nM或更低。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基阿
米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。在一些实施方案中，疫苗可
包含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相
关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)或少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)；以及MOG的肽。另外，肽
可由选自HPIRALVGDEVELP、VGWYRPPFSRVVHLYRN GKD和LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL的氨
基酸序列组成。
[0058] 本文还提供了治疗自身免疫性卵巢疾病的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含透明带蛋白肽。本文进一步提供了治疗屋尘螨变态反应的方法，
该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含抗原性屋尘螨1肽。
该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含抗原性屋尘螨1肽。
[0059] 本文还提供了治疗哮喘的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗包含Der-p1、卵清蛋白或其他变应原。
[0060] 本文进一步提供了治疗心肌炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽或A群链球菌M5蛋白肽。本文
还提供了治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫
苗可包含肽(Q/R)(K/R)RAA(SEQ ID NO：190)或II型胶原蛋白肽。本文进一步提供了治疗甲
状腺炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含甲状腺过氧化
物酶(TPO)、甲状腺球蛋白或Pendrin肽。本文还提供了治疗重症肌无力的方法，该方法包括
向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含乙酰胆碱受体肽。本文进一步提供了治疗
自身免疫性葡萄膜炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含
人S抗原肽。
还提供了治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫
苗可包含肽(Q/R)(K/R)RAA(SEQ ID NO：190)或II型胶原蛋白肽。本文进一步提供了治疗甲
状腺炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含甲状腺过氧化
物酶(TPO)、甲状腺球蛋白或Pendrin肽。本文还提供了治疗重症肌无力的方法，该方法包括
向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含乙酰胆碱受体肽。本文进一步提供了治疗
自身免疫性葡萄膜炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含
人S抗原肽。
[0061] 本文还提供了治疗屋尘螨变态反应的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含抗原性屋尘螨1肽和编码肽的DNA，并且其中肽对II类MHC的IC50为
50nM或更低。
50nM或更低。
[0062] 1.定义.
[0064] 对于本文数值范围的叙述，明确涵盖了其间有相同精确度的每个居间值。例如，对于6-9的范围而言，除6和9外还涵盖数值7和8，并且对于范围6.0-7.0而言，明确涵盖了数值
6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
[0066] 当提到保护动物免遭疾病时，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指预防、抑制、压制或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。抑制疾病涉及在诱发疾病后但是在其临床表现之前向动物施用本发明的组合物。压制疾病涉
及在疾病的临床表现之后向动物施用本发明的组合物。
及在疾病的临床表现之后向动物施用本发明的组合物。
[0067] “基本上相同的”可意指第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个氨基酸的区域上至少60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个氨基酸的区域上至少60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0068] “变体”可意指因氨基酸的插入、缺失或保守取代而使氨基酸序列不同但是保持至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫
应答的能力。变体也可以意指氨基酸序列与具有保持至少一种生物活性的氨基酸序列的参
考蛋白基本上相同的蛋白。在本领域中认为氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，
亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸置换一种氨基酸，通常涉及微小的变化。可通
过考虑氨基酸的亲疏水性指数部分地鉴定这些微小变化。Kyte等，J.Mol.Biol.157：105-
132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，
可取代具有相似亲疏水性指数的氨基酸并仍保持蛋白功能。在一个方面，取代亲疏水性指
数为±2的氨基酸。氨基酸的亲水性也可用于揭露将会产生保持生物功能的蛋白的取代。在
肽的背景下对氨基酸亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，该性质据报道是
与抗原性和免疫原性密切关联的有用量度，美国专利号4,554,101，通过引用方式全部并入
本文。正如本领域中所了解，取代具有相似亲水性值的氨基酸可产生保持生物活性(例如免
疫原性)的肽。可用亲水性值在彼此的±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数
和亲水性值均受该氨基酸的特定侧链影响。与观测一致，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭露，了解到可与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对相似性，尤其
是那些氨基酸的侧链的相对相似性。
应答的能力。变体也可以意指氨基酸序列与具有保持至少一种生物活性的氨基酸序列的参
考蛋白基本上相同的蛋白。在本领域中认为氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，
亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸置换一种氨基酸，通常涉及微小的变化。可通
过考虑氨基酸的亲疏水性指数部分地鉴定这些微小变化。Kyte等，J.Mol.Biol.157：105-
132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，
可取代具有相似亲疏水性指数的氨基酸并仍保持蛋白功能。在一个方面，取代亲疏水性指
数为±2的氨基酸。氨基酸的亲水性也可用于揭露将会产生保持生物功能的蛋白的取代。在
肽的背景下对氨基酸亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，该性质据报道是
与抗原性和免疫原性密切关联的有用量度，美国专利号4,554,101，通过引用方式全部并入
本文。正如本领域中所了解，取代具有相似亲水性值的氨基酸可产生保持生物活性(例如免
疫原性)的肽。可用亲水性值在彼此的±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数
和亲水性值均受该氨基酸的特定侧链影响。与观测一致，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭露，了解到可与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对相似性，尤其
是那些氨基酸的侧链的相对相似性。
[0069] 2.疫苗
[0070] 本文提供了由疫苗促进剂、抗原和编码抗原的DNA组成的疫苗。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利，并且更
优选阿米洛利。该疫苗可诱导抑制抗原特异性T细胞功能的抗原特异性iTreg细胞。疫苗中
抗原和编码抗原的DNA的组合有效诱导抗特异性抗原的iTreg细胞，比包含单独的抗原或其
相应DNA的疫苗有效得多。该疫苗还增强II类MHC呈递和表达以进行iTreg细胞诱导。
优选阿米洛利。该疫苗可诱导抑制抗原特异性T细胞功能的抗原特异性iTreg细胞。疫苗中
抗原和编码抗原的DNA的组合有效诱导抗特异性抗原的iTreg细胞，比包含单独的抗原或其
相应DNA的疫苗有效得多。该疫苗还增强II类MHC呈递和表达以进行iTreg细胞诱导。
[0071] 用序列匹配的DNA和蛋白抗原联合免疫在体外和体内诱导CDllc+CD40lowIL-10+表型的调节性DC(DCreg)，其转而介导抗原特异性耐受。
[0072] 常规DC(DC)为可大致分为CD1lc+CD8a+和CDllc+CD8a-亚型的特化抗原呈递细胞(APC)，两者在免疫性或耐受性的诱导中均有明显的功能可塑性，这具体取决于其成熟状
态。未成熟的DC(iDC)可通过将初始T细胞转化成CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)而促进耐
受。得自疫苗的DNA构建体和序列匹配蛋白的信号可以按协调方式发挥作用以激活将正常
DC转化成DCreg的调节性信号。
态。未成熟的DC(iDC)可通过将初始T细胞转化成CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)而促进耐
受。得自疫苗的DNA构建体和序列匹配蛋白的信号可以按协调方式发挥作用以激活将正常
DC转化成DCreg的调节性信号。
[0073] DNA和蛋白抗原联合免疫通过使同一DC主要经小窝介导的内吞作用同时摄取DNA和蛋白免疫原而诱导DCreg。这一事件下调Cav-1的磷酸化而上调Tollip，其转而引发上调
SOCSl而下调NF-κB和STAT-1α的下游信号转导。NF-κB的下调解释了联合免疫诱导的DCreg
的CD40loW和IL-10+表型。可在体外在原代DC和DC系中通过为其供给DNA和蛋白免疫原短至
24h来产生DCreg。体外产生的DCreg可能通过诱导抗原特异性CD25-iTreg而对治疗炎症性
和自身免疫性疾病有效。
SOCSl而下调NF-κB和STAT-1α的下游信号转导。NF-κB的下调解释了联合免疫诱导的DCreg
的CD40loW和IL-10+表型。可在体外在原代DC和DC系中通过为其供给DNA和蛋白免疫原短至
24h来产生DCreg。体外产生的DCreg可能通过诱导抗原特异性CD25-iTreg而对治疗炎症性
和自身免疫性疾病有效。
[0074] Cav-1是形成小窝的关键蛋白。它还通过区室化许多信号转导分子来调节信号转导。Cav-1、Tollip和IRAK-1形成复合物以抑制静息状态期间IRAK-1的激酶活性。一旦磷酸
化，Cav-1就从复合物中解离，导致细胞溶质中的IRAK-1磷酸化和下游信号转导级联的活
化，包括NF-κB25的易位。DNA和蛋白的同时摄取下调Cav-1的磷酸化，从而防止NF-κB活化。
因此，DNA抗原和序列匹配的蛋白抗原可将正常DC转化成DCreg。为获得DCreg表型和功能需
要相同的DC，并且同时摄取事件触发上调SOCSl而下调NF-κB和STAT-1α的Cav-1和Tollip相
互依赖性信号转导。
化，Cav-1就从复合物中解离，导致细胞溶质中的IRAK-1磷酸化和下游信号转导级联的活
化，包括NF-κB25的易位。DNA和蛋白的同时摄取下调Cav-1的磷酸化，从而防止NF-κB活化。
因此，DNA抗原和序列匹配的蛋白抗原可将正常DC转化成DCreg。为获得DCreg表型和功能需
要相同的DC，并且同时摄取事件触发上调SOCSl而下调NF-κB和STAT-1α的Cav-1和Tollip相
互依赖性信号转导。
[0075] iTreg细胞引起炎症性T辅助性细胞(THelper)和杀伤T细胞(TKiller)减少。iTreg抑制可通过与抗原呈递细胞(包括例如在肺或其他器官中的DC和上皮细胞)相互作用而发生，其中通过降低其迁出分子(egress molecule)S1P1的表达而保持抗原特异性iTreg细胞。相互
作用上调了抗原特异性APC的趋化IP-10的表达，其将CXCR3+炎症性T细胞捕获到上皮细胞
(即TH1、TK1等)中。这些捕获的T细胞的20％经历细胞凋亡，然后少数转化成表达IL10和TGF-β的Treg细胞。因此，炎症性T细胞在比如肺的器官中减少，而诸如哮喘的病症得以改善。
作用上调了抗原特异性APC的趋化IP-10的表达，其将CXCR3+炎症性T细胞捕获到上皮细胞
(即TH1、TK1等)中。这些捕获的T细胞的20％经历细胞凋亡，然后少数转化成表达IL10和TGF-β的Treg细胞。因此，炎症性T细胞在比如肺的器官中减少，而诸如哮喘的病症得以改善。
[0076] a.疫苗促进剂(“Na/K泵抑制剂”)
[0077] 本文提供了在体外和体内促进DNA进入细胞的化合物。该化合物可以是钠(Na)/钾(K)泵抑制剂。Na/K泵抑制剂可以是5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或
阿米洛利。该化合物优选地为阿米洛利，其通常用于管理高血压和充血性心力衰竭。阿米洛
利具有以下结构：
阿米洛利。该化合物优选地为阿米洛利，其通常用于管理高血压和充血性心力衰竭。阿米洛
利具有以下结构：
[0078]
[0079] 阿米洛利可按能够促进DNA摄入细胞的量存在。与不含任何阿米洛利的相同疫苗组合物相比，细胞对DNA的摄取的适当有效的增加包括增加5％以上、25％以上或50％以上。
[0080] b.抗原
[0081] 本文提供了自身免疫性疾病抗原、其片段及其变体。抗原可以为自身抗原，并且可以诱导抑制抗原特异性T细胞功能的抗原特异性iTreg细胞。iTreg细胞可以为CD4+CD25+并
且还表现出Foxp3的高表达。iTreg细胞能够在不存在全身免疫抑制的情况下特异性防止并
干扰不期望的免疫。可通过高剂量的白介素2(IL-2)诱导iTreg细胞的增殖。iTreg细胞能够
凭借活化的CD4+效应T细胞上CD80和CD86配体的存在而抑制效应T细胞。一旦iTreg细胞被T
细胞受体配体活化，抗原呈递细胞的存在在效应T细胞的抑制中就可以是必要或不必要的。
抗原刺激后，iTreg细胞可回到排出抗原的淋巴结，并可以按与初始T细胞相同的速率通过
细胞分裂而聚集。
且还表现出Foxp3的高表达。iTreg细胞能够在不存在全身免疫抑制的情况下特异性防止并
干扰不期望的免疫。可通过高剂量的白介素2(IL-2)诱导iTreg细胞的增殖。iTreg细胞能够
凭借活化的CD4+效应T细胞上CD80和CD86配体的存在而抑制效应T细胞。一旦iTreg细胞被T
细胞受体配体活化，抗原呈递细胞的存在在效应T细胞的抑制中就可以是必要或不必要的。
抗原刺激后，iTreg细胞可回到排出抗原的淋巴结，并可以按与初始T细胞相同的速率通过
细胞分裂而聚集。
[0082] iTreg细胞的产生可能需要在皮质上皮细胞上表达II类MHC。受体可受MHC限制，并且iTreg细胞可以为抗原特异性的。可能的是，通过基于IL-10的机制诱导iTreg细胞参与旁
观者介导的调节(bystander-mediated regulation)，从而调节TH1和TH2细胞。
观者介导的调节(bystander-mediated regulation)，从而调节TH1和TH2细胞。
[0083] 抗原可与变态反应、哮喘或自身免疫性疾病相关。抗原可影响哺乳动物，哺乳动物可以为人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。抗原可包含于得自哺乳动物的蛋白中，哺乳动物可以为人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、小鼠或大鼠。
[0084] (1)FSA1
[0085] 抗原可以为蚤变应原FSA1的肽、其片段或其变体，其可以具有FSA1的氨基酸66-80(SEQ ID NO：1)或氨基酸100-114(SEQ ID NO：2)。
[0086] (2)Der-p1
[0087] 抗原也可以为Der-p1的肽、其片段或其变体。Der-p1可具有GeneBank登录号EU092644(SEQ ID NO：3)的序列，其内容通过引用方式并入本文。这种抗原可与哮喘有关。
[0088] (3)1型糖尿病
[0089] 抗原可以为1型糖尿病中涉及的自身抗原、其片段或其变体。抗原可以为胰岛素的肽 ，并 且 可 以 为 胰 岛 素 原 。胰 岛 素 原 抗 原 可 以 具 有 序 列
M A L W M R L L P L L A L L A L W G P D P A A A F V N Q H L C G S H L V E A L Y L VCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGS LQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID
NO：4)，其可由GenB ank登录号NM_000207中所含的序列编码，其内容通过引用方式并入本
文。抗原可以为人B9-23。胰岛素抗原也可以具有序列MRLLP LLALLA(SEQ ID NO：5)、
SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO：191)或LYLVCGERG(SEQ ID NO：6)。抗原也可以为Wong SF，
TREND S in Molecular Medicine，2005；11(10)中公开的胰岛素抗原，其内容通过引用方
式并入本文。胰岛素抗原可具有氨基酸序列GIVEQCCTS ICSLYQ(SEQ ID NO：7)。
M A L W M R L L P L L A L L A L W G P D P A A A F V N Q H L C G S H L V E A L Y L VCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGS LQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID
NO：4)，其可由GenB ank登录号NM_000207中所含的序列编码，其内容通过引用方式并入本
文。抗原可以为人B9-23。胰岛素抗原也可以具有序列MRLLP LLALLA(SEQ ID NO：5)、
SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO：191)或LYLVCGERG(SEQ ID NO：6)。抗原也可以为Wong SF，
TREND S in Molecular Medicine，2005；11(10)中公开的胰岛素抗原，其内容通过引用方
式并入本文。胰岛素抗原可具有氨基酸序列GIVEQCCTS ICSLYQ(SEQ ID NO：7)。
[0090] 抗原可以为葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)的序列，如The Journal of Im munology，2006；176：2781-9中所述，其内容通过引用方式并入本文。G6P抗原可具有IGRP1325
(QHLQKDYRAYYTF)(SEQ ID NO：8)、IGRP2335(YTFLNFMSNVGDP)(SEQ ID NO：9)、IGRP226238
(RVLNIDLLWSVPI)(SEQ ID NO：10)、IGRP247259(DWIHIDTTPFAGL)(SEQ ID NO：11)、G6Pase-α228240(KGLGVDLLWTLEK)(SEQ ID NO：12)、G6Pase-α249261(EWVHIDTTPFASL)(SEQ ID NO：13)、UGRP218230(FTLGLDLSWSISL(SEQ ID NO：14)和UGRP239251(EWIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO：15)的序列。
(QHLQKDYRAYYTF)(SEQ ID NO：8)、IGRP2335(YTFLNFMSNVGDP)(SEQ ID NO：9)、IGRP226238
(RVLNIDLLWSVPI)(SEQ ID NO：10)、IGRP247259(DWIHIDTTPFAGL)(SEQ ID NO：11)、G6Pase-α228240(KGLGVDLLWTLEK)(SEQ ID NO：12)、G6Pase-α249261(EWVHIDTTPFASL)(SEQ ID NO：13)、UGRP218230(FTLGLDLSWSISL(SEQ ID NO：14)和UGRP239251(EWIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO：15)的序列。
[0091] 抗原也可以为谷氨酸脱羧酶或热休克蛋白的肽。
[0092] (4)多发性硬化
[0093] 抗原可以为多发性硬化(MS)中涉及的自身抗原。抗原可以为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白
(MOBP)或少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)的肽、其片段或其变体。MBP抗原可以为MBP66-88
(SEQ ID NO：21)、MBP85-99(SEQ ID NO：22)、MBP86-105(SEQ ID NO：23)、MBP143-168(SEQ ID NO：24)、MBP83-97(SEQ ID NO：25)或MBP85-96(SEQ ID NO：26)。PLP抗原可以为PLP30-
49(SEQ ID NO：28)、PLP40-60(SEQ ID NO：29)、PLP180-199(SEQ ID NO：30)、PLP184-199(SEQ ID NO：31)或PLP190-209(SEQ ID NO：32)。MOG抗原可以为MOG1-22(SEQ ID NO：17)、MOG34-56(SEQ ID NO：18)或MOG64-96(SEQ ID NO：19)。MOG抗原也可具有序列
HPIRALVGDEVELP、VGWYRPPFSRVVHLYRNGKD(SEQ ID NO：37)或LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL
(SEQ ID NO：38)。MS抗原也可具有Schmidt S，Mult Scler.，1999；5(3)：147-60中所述的序列，其内容通过引用方式并入本文。
(MOBP)或少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)的肽、其片段或其变体。MBP抗原可以为MBP66-88
(SEQ ID NO：21)、MBP85-99(SEQ ID NO：22)、MBP86-105(SEQ ID NO：23)、MBP143-168(SEQ ID NO：24)、MBP83-97(SEQ ID NO：25)或MBP85-96(SEQ ID NO：26)。PLP抗原可以为PLP30-
49(SEQ ID NO：28)、PLP40-60(SEQ ID NO：29)、PLP180-199(SEQ ID NO：30)、PLP184-199(SEQ ID NO：31)或PLP190-209(SEQ ID NO：32)。MOG抗原可以为MOG1-22(SEQ ID NO：17)、MOG34-56(SEQ ID NO：18)或MOG64-96(SEQ ID NO：19)。MOG抗原也可具有序列
HPIRALVGDEVELP、VGWYRPPFSRVVHLYRNGKD(SEQ ID NO：37)或LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL
(SEQ ID NO：38)。MS抗原也可具有Schmidt S，Mult Scler.，1999；5(3)：147-60中所述的序列，其内容通过引用方式并入本文。
[0094] (5)自身免疫性卵巢疾病
[0095] 抗原可以为自身免疫性卵巢疾病中涉及的自身抗原。抗原可以为透明带(ZP)1、2或3中所含的肽、或其片段或变体。ZP肽可具有NCBI参考序列NP_003451.1(SEQ ID NO：39)、NP_009086.4(SEQ ID NO：40)或NP_997224.2(SEQ ID NO：41)的序列。ZP抗原可以为具有序
列ZP3330342(NSSSSQFQIHGPR)(SEQ ID NO：42)、ZP3335342(QFQIHGPR)(SEQ ID NO：43)或
ZP3330340(NSSSSQFQIHG)(SEQ ID NO：44)的ZP3肽。ZP抗原可以为LouY，The Journal of
Immunology，2000；164：52517中所公开的肽，其内容通过引用方式并入本文。
列ZP3330342(NSSSSQFQIHGPR)(SEQ ID NO：42)、ZP3335342(QFQIHGPR)(SEQ ID NO：43)或
ZP3330340(NSSSSQFQIHG)(SEQ ID NO：44)的ZP3肽。ZP抗原可以为LouY，The Journal of
Immunology，2000；164：52517中所公开的肽，其内容通过引用方式并入本文。
[0096] (6)心肌炎
[0097] 抗原可以为心肌炎中涉及的自身抗原。抗原可以为Smith SC，J ournal of Immunology，1991；147(7)：2141-7中所述的肽，其内容通过引用方式并入本文。抗原可以为人肌球蛋白中所含的肽，其可具有GeneBank登录号No.CAA86293.1(SEQ ID NO：45)的序列。
抗原可以为α-肌球蛋白内所含的肽，并且可具有序列Ac-SLKLMATLFSTY
ASADTGDSGKGKGGKKKG(氨基酸614643；其中Ac为乙酰基)(SEQ ID NO：46)、GQFIDSGKAGAEKL
(氨基酸735-747)(SEQ I D NO：47)或DECSELKKDIDDLE(氨基酸947-960)(SEQ ID NO：48)，
如Pummerer，CL，J.Clin.Invest.1996；97：2057-62中所公开，其内容通过引用方式并入本文。抗原也可以为具有下列序列之一的柯萨奇病毒B4结构蛋白肽。
抗原可以为α-肌球蛋白内所含的肽，并且可具有序列Ac-SLKLMATLFSTY
ASADTGDSGKGKGGKKKG(氨基酸614643；其中Ac为乙酰基)(SEQ ID NO：46)、GQFIDSGKAGAEKL
(氨基酸735-747)(SEQ I D NO：47)或DECSELKKDIDDLE(氨基酸947-960)(SEQ ID NO：48)，
如Pummerer，CL，J.Clin.Invest.1996；97：2057-62中所公开，其内容通过引用方式并入本文。抗原也可以为具有下列序列之一的柯萨奇病毒B4结构蛋白肽。
[0098] 表1
[0099]
[0100]
[0101] 抗原可以为柯萨奇病毒B4结构蛋白中所含的肽，如Marttila J，Virology，2000；293：21724中所公开，其内容通过引用方式整体并入本文。
[0102] 抗原也可以为得自A群链球菌M5蛋白的肽。M5肽可具有下列序列之一：NT4(GLKTENEGLKTENEGLKTE)(SEQ ID NO：94)、N T5(KKEHEAENDKLKQQRDTL)(SEQ ID NO：95)、
B1B2(VKDKI AKEQENKETIGTL)(SEQ ID NO：96)、B2(TIGTLKKILDETVKDKI A)(SEQ ID NO：
97)、B3A(IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ ID NO：98)和C3(KGLRRDLDASREAKKQ)(SEQ ID NO：
99)。抗原也可以为得自下表的M5肽。
B1B2(VKDKI AKEQENKETIGTL)(SEQ ID NO：96)、B2(TIGTLKKILDETVKDKI A)(SEQ ID NO：
97)、B3A(IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ ID NO：98)和C3(KGLRRDLDASREAKKQ)(SEQ ID NO：
99)。抗原也可以为得自下表的M5肽。
[0103] 表2
[0104]
[0105] 肽也可以为Cunningham MW，INFECTION AND IMMUNITY，1997；65(9)：391323中所公开的序列，其内容通过引用方式整体并入本文。
[0106] (7)类风湿性关节炎
[0107] 抗原可以为类风湿性关节炎(RA)中涉及的自身抗原。抗原可以为Fox DA，Arthritis and Rheumatism，1997；40(4)：598-609，Mackay IR，J Rheumatol，2008；35；
731-733或Hill JA，The Journal of Immunology，2003；171：538-41中所述的具有序列Q/
R、K/R、R、A和A的肽，它们的内容通过引用方式整体并入本文。抗原可以为II型胶原蛋白的肽，其可具有II型胶原蛋白的氨基酸263-270(SEQ ID NO：152)或184-198(SEQ ID NO：153)
的序列。II型胶原蛋白抗原可以为Staines NA，Clin.Exp.Immunol.，1996；103：368-75或
Backlund J，PNAS，2002；99(15)：9960-5中所公开的肽，它们的内容通过引用方式整体并入本文。II型胶原蛋白抗原也可具有II型胶原蛋白的氨基酸残基359369(SEQ ID NO：154)
III
[C1 ]的序列，如Burkhardt，H，ARTHRITIS&RHEUMATISM，2002；46(9)：2339-48中所公开，其内容通过引用方式整体并入本文。
731-733或Hill JA，The Journal of Immunology，2003；171：538-41中所述的具有序列Q/
R、K/R、R、A和A的肽，它们的内容通过引用方式整体并入本文。抗原可以为II型胶原蛋白的肽，其可具有II型胶原蛋白的氨基酸263-270(SEQ ID NO：152)或184-198(SEQ ID NO：153)
的序列。II型胶原蛋白抗原可以为Staines NA，Clin.Exp.Immunol.，1996；103：368-75或
Backlund J，PNAS，2002；99(15)：9960-5中所公开的肽，它们的内容通过引用方式整体并入本文。II型胶原蛋白抗原也可具有II型胶原蛋白的氨基酸残基359369(SEQ ID NO：154)
III
[C1 ]的序列，如Burkhardt，H，ARTHRITIS&RHEUMATISM，2002；46(9)：2339-48中所公开，其内容通过引用方式整体并入本文。
[0108] (8)甲状腺炎
[0109] 抗原可以为甲状腺炎中涉及的自身抗原，并且可以为甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白或Pendrin中所含的肽。抗原可在Daw K，Springer SeminImmunopathol，1993，
14：285-307；“Autoantigens in autoimmune thyroid diseases，The Japanese Journal of Clinical Pathology，1989；37(8)：868-74；Fukuma N，Clin.Exp.Immunol.，1990；82(2)：27583或Yoshida A，The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，2009；94(2)：442-8有描述，它们的内容通过引用方式整体并入本文。
14：285-307；“Autoantigens in autoimmune thyroid diseases，The Japanese Journal of Clinical Pathology，1989；37(8)：868-74；Fukuma N，Clin.Exp.Immunol.，1990；82(2)：27583或Yoshida A，The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，2009；94(2)：442-8有描述，它们的内容通过引用方式整体并入本文。
[0110] 甲状腺球蛋白抗原可具有序列NIFET4QVDAQPL(SEQ ID NO：155)、YSLEHSTDDT4ASFSRALENATR(SEQ ID NO：156)、RALE NATRDT4FIICPIIDMA(SEQ ID NO：157)、LLSLQEPGSKTT4SK(SEQ ID NO：158)或EHSTDDT4ASFSRALEN(SEQ ID NO：159)，其中T4为3，5，
3’，5’-四碘甲腺原氨酸(甲状腺素)。TPO抗原可具有序列LKKRGILSPAQLLS(SEQ ID NO：
160)、SGVIARAAEIMETSIQ(SE Q ID NO：161)、PPVREVTRHVIQVS(SEQ ID NO：162)、PRQQMN
GLTSFLDAS(SEQ ID NO：163)、LfALHTLWLREHNRL(SEQ ID NO：164)、HNRLAAALKALNAHW(SEQ
ID NO：165)、ARKVVGA LHQIITL(SEQ ID NO：166)、LPGLWLHQAFFSPWTL(SEQ ID NO：167)、
MNEELTERLFVLSNSST(SEQ ID NO：168)、LDLASINLQRG(SEQ ID NO：169)、RSVADKILDLYKHPDN
(SEQ ID NO：170)或I DVWLGGLAENFLP(SEQ ID NO：171)。Pendrin抗原可具有序列Q
QQHERRKQERK[人pendrin中的氨基酸3444(GenBank AF030880)](SEQ ID NO：172)、
PTKEIEIQVDWNSE[人pendrin中的氨基酸630643](SEQ ID NO：173)或NCBI GenBank登录号
NP_000432.1(SEQ ID NO：174)。
3’，5’-四碘甲腺原氨酸(甲状腺素)。TPO抗原可具有序列LKKRGILSPAQLLS(SEQ ID NO：
160)、SGVIARAAEIMETSIQ(SE Q ID NO：161)、PPVREVTRHVIQVS(SEQ ID NO：162)、PRQQMN
GLTSFLDAS(SEQ ID NO：163)、LfALHTLWLREHNRL(SEQ ID NO：164)、HNRLAAALKALNAHW(SEQ
ID NO：165)、ARKVVGA LHQIITL(SEQ ID NO：166)、LPGLWLHQAFFSPWTL(SEQ ID NO：167)、
MNEELTERLFVLSNSST(SEQ ID NO：168)、LDLASINLQRG(SEQ ID NO：169)、RSVADKILDLYKHPDN
(SEQ ID NO：170)或I DVWLGGLAENFLP(SEQ ID NO：171)。Pendrin抗原可具有序列Q
QQHERRKQERK[人pendrin中的氨基酸3444(GenBank AF030880)](SEQ ID NO：172)、
PTKEIEIQVDWNSE[人pendrin中的氨基酸630643](SEQ ID NO：173)或NCBI GenBank登录号
NP_000432.1(SEQ ID NO：174)。
[0111] (9)重症肌无力
[0112] 抗原可以为重症肌无力(MG)中涉及的自身抗原，并且可包含于乙酰胆碱受体(AChR)中。抗原可以为Protti MA，Immunology Today，1993；14(7)：363-8；Hawke S，
Immunology T)day，1996；17(7)：307-11中所述的肽，其内容通过引用方式并入本文。AChR抗原可以为人AChRa亚基的氨基酸37-429(SEQ ID NO：176)、149-156(SEQ ID NO：177)、
138-167(SEQ ID NO：178)、149-163(SEQ ID NO：179)、143-156(SEQ ID NO：180)、1-181
(SEQ ID NO：181)或1-437(SEQ ID NO：182)。
Immunology T)day，1996；17(7)：307-11中所述的肽，其内容通过引用方式并入本文。AChR抗原可以为人AChRa亚基的氨基酸37-429(SEQ ID NO：176)、149-156(SEQ ID NO：177)、
138-167(SEQ ID NO：178)、149-163(SEQ ID NO：179)、143-156(SEQ ID NO：180)、1-181
(SEQ ID NO：181)或1-437(SEQ ID NO：182)。
[0113] (10)自身免疫性葡萄膜炎
[0114] 抗原可以为自身免疫性葡萄膜炎(AU)中涉及的自身抗原，并且可包含于人S抗原中。抗原可具有肽19(181-VQHAPLEMGPQPRAEA TWQF-200)(SEQ ID NO：183)、肽35(341-
GFLGELTSSEVATEVPF RLM-356)(SEQ ID NO：184)或肽36(351-VATEVPFRLMHPQPEDP AKE-
370)(SEQ ID NO：185)的序列。抗原可在de Smet MD，J Aut oimmun.1993；6(5)：587-99中有描述，其内容通过引用方式并入本文。抗原也可包含于人IRBP中，并且可具有序列521-
YLLTSHRTATAAE EFAFLMQ-540(SEQ ID NO：186)。抗原可在Donoso LA，J Immun ol.，1989；
143(1)：79-83中有描述，其内容通过引用方式整体并入本文。
GFLGELTSSEVATEVPF RLM-356)(SEQ ID NO：184)或肽36(351-VATEVPFRLMHPQPEDP AKE-
370)(SEQ ID NO：185)的序列。抗原可在de Smet MD，J Aut oimmun.1993；6(5)：587-99中有描述，其内容通过引用方式并入本文。抗原也可包含于人IRBP中，并且可具有序列521-
YLLTSHRTATAAE EFAFLMQ-540(SEQ ID NO：186)。抗原可在Donoso LA，J Immun ol.，1989；
143(1)：79-83中有描述，其内容通过引用方式整体并入本文。
[0115] (11)其他抗原
[0116] 抗原也可以为美国专利申请公布号20100143401中所公开的抗原，其内容通过引用方式整体并入本文。
[0117] (12)II类MHC结合亲和力
[0118] 抗原可对II类MHC(MHC-II)具有高亲和力，这可增强对iTreg细胞的诱导。抗原的MHC-II亲和力可以为小于或等于50nM的IC50。亲和力也可以为小于或等于100、95、90、85、
80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、
0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM的IC50。
80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、
0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM的IC50。
[0119] 可使用计算机算法预测抗原对MCH-II的亲和力。算法可以为M HCPred，如由GuanP，Doytchinova IA，Zygouri C，Flower DR，MH CPred：bringing a quantitatiVe
dimension to the online prediction of MHC binding，Appl Bioinformatics.20032：
63-66；GuanP，Doytch inova IA，Zygouri C，Flower DR，MHCPred：A server for
quantitati Ve prediction of peptide-MHC binding，Nucleic Acids Res.200331：
3621-3624和Hattotuwagama CK，GuanP，Doytchinova IA，Zygouri C，Flower DR，
Quantitative online prediction of peptide binding to the major
histocompatibility complex，J Mol Graph Model.200422：195-207所述，它们的内容通
过引用方式整体并入本文。算法也可以为NN-align或SMM-align，如由Nielsen M和Lund O，
NN-align，A neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptid e
binding prediction，BMC Bioinformatics.2009；10：296和Nielsen M，Lundegaard C，
Lund O，Prediction of MHC class II binding affinit y using SMM-align，or a
novel stabilization matrix alignment metho d，BMC Bioinformatics.2007；8：238所
述，它们的内容通过引用方式整体并入本文。
dimension to the online prediction of MHC binding，Appl Bioinformatics.20032：
63-66；GuanP，Doytch inova IA，Zygouri C，Flower DR，MHCPred：A server for
quantitati Ve prediction of peptide-MHC binding，Nucleic Acids Res.200331：
3621-3624和Hattotuwagama CK，GuanP，Doytchinova IA，Zygouri C，Flower DR，
Quantitative online prediction of peptide binding to the major
histocompatibility complex，J Mol Graph Model.200422：195-207所述，它们的内容通
过引用方式整体并入本文。算法也可以为NN-align或SMM-align，如由Nielsen M和Lund O，
NN-align，A neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptid e
binding prediction，BMC Bioinformatics.2009；10：296和Nielsen M，Lundegaard C，
Lund O，Prediction of MHC class II binding affinit y using SMM-align，or a
novel stabilization matrix alignment metho d，BMC Bioinformatics.2007；8：238所
述，它们的内容通过引用方式整体并入本文。
[0120] c.DNA
[0121] 本文还提供了编码抗原的DNA。DNA可包含编码抗原的编码序列。DNA也可以包含编码连接子的附加序列或通过肽键与抗原连接的标签序列。
[0122] d.载体
[0123] 本文进一步提供了包含DNA的载体。载体能够表达抗原。载体可以为表达构建体，其通常为用于将特定基因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体处于细胞内部，就通过细胞转
录和翻译机制核糖体复合物生成由基因编码的蛋白。通常对质粒进行工程改造以含有用作
增强子和启动子区并导致表达载体上所携带的基因有效转录的调节序列。本发明的载体表
达大量的稳定信使RNA，并因此表达蛋白。
录和翻译机制核糖体复合物生成由基因编码的蛋白。通常对质粒进行工程改造以含有用作
增强子和启动子区并导致表达载体上所携带的基因有效转录的调节序列。本发明的载体表
达大量的稳定信使RNA，并因此表达蛋白。
[0124] 载体可具有表达信号，诸如强启动子，强终止密码子，启动子和克隆基因之间距离的调节，以及转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)的插入。
[0125] i.表达载体
[0126] 载体可以为环形质粒或线性核酸疫苗。环形质粒和线性核酸能够在适当的受试细胞中指导特定核苷酸序列的表达。载体可具有可操作地连接到编码抗原的核苷酸序列的启
动子，核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体也可以含有核苷酸序列适当翻译所
需的序列。包含所关注的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种
相对于其其他组分中的至少一种为异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可受组成型启动
子或诱导型启动子的控制，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时引发转
录。就多细胞生物体而言，启动子也可以为特定组织或器官或发育阶段特异性的。
动子，核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体也可以含有核苷酸序列适当翻译所
需的序列。包含所关注的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种
相对于其其他组分中的至少一种为异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可受组成型启动
子或诱导型启动子的控制，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时引发转
录。就多细胞生物体而言，启动子也可以为特定组织或器官或发育阶段特异性的。
[0127] ii环形和线性载体
[0128] 载体可以为环形质粒，其可以通过整合到细胞基因组中而转化靶细胞或可以在染色体外存在(例如具有复制起点的自主复制质粒)。
[0129] 载体可以为pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA并使得细胞能够将序列翻译为由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。载体可与抗原按5∶1与1∶5之间或1∶1与2∶1之间的质量比结合。
[0130] 本文还提供了能够通过电穿孔有效递送至受试者并表达一种或多种所需抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以为无任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可编
码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可不含与所需的抗
原基因表达无关的其他核酸序列。
码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可不含与所需的抗
原基因表达无关的其他核酸序列。
[0131] LEC可源自能够被线性化的任何质粒。质粒能够表达抗原。质粒可以为PNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。参见图1。质粒可以为pVAX、pcDNA3.0或provax，或能
够表达DNA并使得细胞能够将序列翻译为由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。
够表达DNA并使得细胞能够将序列翻译为由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。
[0132] LEC可以为pcrM2。LEC可以为pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别源自pNP(Puerto Rico/34)和pM2(New Caledonia/99)。参见图41。LEC可与抗原按5∶1与1∶5之间或1∶1与2∶1之间的质量比结合。
[0133] ii.启动子、内含子、终止密码子和多聚腺苷酸化信号
[0134] 载体可具有启动子。启动子可以为能够驱动基因表达并调节分离核酸的表达的任何启动子。这样的启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录(其转录本文所述的抗原序
列)所需的顺式作用序列元件。对用于指导异源核酸的表达的启动子的选择取决于特定的
应用。启动子在载体中可位于与其在自然环境中距转录起始位点大约相同的距离。然而，该
距离可以存在变化而不丧失启动子功能。
列)所需的顺式作用序列元件。对用于指导异源核酸的表达的启动子的选择取决于特定的
应用。启动子在载体中可位于与其在自然环境中距转录起始位点大约相同的距离。然而，该
距离可以存在变化而不丧失启动子功能。
[0135] 启动子可以可操作地连接到编码抗原的核酸序列以及转录物的有效多聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。启动子可以为CMV启动子、SV40早期启动子、
SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多
角体蛋白启动子或经证实对于在真核细胞中表达有效的另一启动子。
SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多
角体蛋白启动子或经证实对于在真核细胞中表达有效的另一启动子。
[0136] 载体可包含增强子和具有功能剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可从与启动子序列相同的基因获得或可从不
同的基因获得。
同的基因获得。
[0137] e.疫苗的其他组分-佐剂、赋形剂
[0138] 疫苗可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以为功能性分子，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以为转染促进剂，其可以包括表面活性剂(诸如免疫刺激复合物(ISCOMS))、弗氏不完全佐剂、包括单磷酰脂A的LPS类
似物、胞壁肽、醌类似物、囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。
似物、胞壁肽、醌类似物、囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。
[0139] 转染促进剂可以为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染促进剂可以为聚-L-谷氨酸盐。聚-L-谷氨酸盐可以按低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转
染促进剂也可以包括表面活性剂(诸如免疫刺激复合物(ISCOMS))、弗氏不完全佐剂、包括
单磷酰脂A的LPS类似物、胞壁肽、醌类似物和囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)；并且透明质酸也
可连同基因构建体一起施用而使用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗也可以包含转染促进
剂，诸如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其他脂质体，如DNA-脂质体混
合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。转柒促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。疫苗
中转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
染促进剂也可以包括表面活性剂(诸如免疫刺激复合物(ISCOMS))、弗氏不完全佐剂、包括
单磷酰脂A的LPS类似物、胞壁肽、醌类似物和囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)；并且透明质酸也
可连同基因构建体一起施用而使用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗也可以包含转染促进
剂，诸如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其他脂质体，如DNA-脂质体混
合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。转柒促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。疫苗
中转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
[0140] 药学上可接受的赋形剂可以为佐剂。佐剂可以为在替代性质粒中表达的或作为蛋白与疫苗中的上述质粒结合递送的其他基因。佐剂可选自：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素
(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋
化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列缺失并任选地包含得自IgE的信号肽的IL-15。佐剂可以为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋
化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列缺失并任选地包含得自IgE的信号肽的IL-15。佐剂可以为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
[0141] 可以为有用佐剂的其他基因包括编码以下物质的那些基因：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、R ANK、R ANK LIGAND、Ox40、Ox4OLIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
[0142] 疫苗可进一步包含1994年4月1日提交的美国专利序列号021,579中所述的基因疫苗促进剂，其通过引用方式全部并入。
[0143] 可根据待使用的施用模式配制疫苗。注射用疫苗药物组合物可以为无菌、无热原且无微粒的。可使用等渗制剂或溶液。等渗性添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可进一步包含
稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使制剂在室温或环境温度下稳定更长的时间，包括
LGS或聚阳离子或聚阴离子。
稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使制剂在室温或环境温度下稳定更长的时间，包括
LGS或聚阳离子或聚阴离子。
[0144] 3.治疗或预防用接种方法
[0145] 本文提供了使用疫苗为患者接种以治疗或预防变态反应、哮喘、自身免疫性疾病或移植排斥症状的方法。变态反应可以为蚤过敏性皮炎或屋尘螨变态反应。自身免疫性疾
病可以为I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性卵巢疾病、心肌炎、类风湿性关节炎、甲状腺炎、重症肌无力或自身免疫性葡萄膜炎。
病可以为I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性卵巢疾病、心肌炎、类风湿性关节炎、甲状腺炎、重症肌无力或自身免疫性葡萄膜炎。
[0146] 疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/次，并且可以为20μg至10mg组分/kg体重/次。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30或31天施用一次疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可以为1、2、3、4、5、
6、7、8、9或10剂。
25、26、27、28、29、30或31天施用一次疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可以为1、2、3、4、5、
6、7、8、9或10剂。
[0147] a.施用
[0148] 可根据制药领域的技术人员熟知的标准技术配制疫苗。可考虑诸如特定受试者的年龄、性别、体重和病症以及施用途径等因素，按医学领域中技术人员熟知的剂量和技术施
用此类组合物。受试者可以为哺乳动物，诸如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
用此类组合物。受试者可以为哺乳动物，诸如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
[0149] 可预防性或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可按足以诱导iTreg应答的量施用疫苗。在治疗性应用中，可按足以引起治疗效果的量向对其有需要的受试者施用疫苗。将
足以实现这一目的的量定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的量将取决于(例如)所施用
的疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况和处方医
师的判断。
足以实现这一目的的量定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的量将取决于(例如)所施用
的疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况和处方医
师的判断。
[0150] 可通过如Donnelly等(Ann.Rev.Immunol.15：617-648(1997))；Felgner等(美国专利号5,580,859，1996年12月3日公布)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日公
布)和Carson等(美国专利号5,679,647，1997年10月21日公布)中所述的本领域熟知的方法
施用疫苗，它们的内容通过引用方式整体并入本文。疫苗的DNA可复合到可(例如)使用疫苗
枪施用给个体的粒子或小珠。本领域的技术人员将了解，药学上可接受的载体(包括生理学
上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。
布)和Carson等(美国专利号5,679,647，1997年10月21日公布)中所述的本领域熟知的方法
施用疫苗，它们的内容通过引用方式整体并入本文。疫苗的DNA可复合到可(例如)使用疫苗
枪施用给个体的粒子或小珠。本领域的技术人员将了解，药学上可接受的载体(包括生理学
上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。
[0151] 可通过多种途径递送疫苗。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括经口施用、鼻内和阴道内途径。尤其对于疫苗的DNA而言，可将疫苗递送到个体组织的胞间隙(Felgner等人，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有专利的内
容均通过引用方式整体并入本文)。也可将疫苗施用至肌肉，或可通过皮内或皮下注射或经
皮(诸如通过离子电渗疗法)施用。也可采用疫苗的表皮施用。表皮施用可涉及机械或化学
刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利号5,679,647，其内
容通过引用方式整体并入本文)。
容均通过引用方式整体并入本文)。也可将疫苗施用至肌肉，或可通过皮内或皮下注射或经
皮(诸如通过离子电渗疗法)施用。也可采用疫苗的表皮施用。表皮施用可涉及机械或化学
刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利号5,679,647，其内
容通过引用方式整体并入本文)。
[0152] 也可配制用于通过鼻通道施用的疫苗。其中载体为固体的适合鼻腔施用的制剂可包括粒度(例如)在约10至约500微米范围内的粗粉，其以吸入鼻烟的方式施用，即通过鼻通
道从接近鼻子的粉末容器中迅速吸入而施用。制剂可以为鼻喷剂、滴鼻剂，或通过喷雾器经
气溶胶施用。制剂可包括疫苗的水溶液或油溶液。
道从接近鼻子的粉末容器中迅速吸入而施用。制剂可以为鼻喷剂、滴鼻剂，或通过喷雾器经
气溶胶施用。制剂可包括疫苗的水溶液或油溶液。
[0153] 疫苗可以为液体制剂，诸如混悬剂、糖浆或酏剂。疫苗也可以为供肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，注射施用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。
[0154] 可将疫苗并入脂质体、微球或其他聚合物基质中(Felgner等人，美国专利号5,703，055；Gregoriadis，Liposome Technology，第I至III卷(第2版1993)，它们的内容通过引用方式整体并入本文)。脂质体可由磷脂或其他脂质组成，并且可以为制备和施用相对简
单的无毒、生理学上可接受并且可代谢的载体。
单的无毒、生理学上可接受并且可代谢的载体。
[0155] 可通过电穿孔，诸如通过其内容通过引用方式并入本文的美国专利号7，664，545中所述的方法施周疫苗。电穿孔可通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,
233,482、6,216,034、6,208,893、6，192,270、6，181,964、6，150,148、6，120,493、6,096,
020、6,068,650和5,702,359中所述的方法和/或设备进行，它们的内容通过引用方式整体
并入本文。可通过微创装置进行电穿孔。
233,482、6,216,034、6,208,893、6，192,270、6，181,964、6，150,148、6，120,493、6,096,
020、6,068,650和5,702,359中所述的方法和/或设备进行，它们的内容通过引用方式整体
并入本文。可通过微创装置进行电穿孔。
[0156] 微创电穿孔装置(“MID”)可以为用于将上述疫苗和相关流体注射进机体组织的设备。装置可包括空心针、DNA盒和流体递送机构，其中装置适于致动使用中的流体递送机构
以便在将针插入所述机体组织的过程中同时地(例如，自动)将DNA注射进机体组织。这样的
优点在于，在插入针的同时能够逐渐注射DNA和相关流体，导致流体在机体组织中更均匀的
分布。由于注射的DNA在更大的区域分布，因此注射时经受的疼痛可以减轻。
以便在将针插入所述机体组织的过程中同时地(例如，自动)将DNA注射进机体组织。这样的
优点在于，在插入针的同时能够逐渐注射DNA和相关流体，导致流体在机体组织中更均匀的
分布。由于注射的DNA在更大的区域分布，因此注射时经受的疼痛可以减轻。
[0157] MID可将疫苗注射进组织而无需使用针。MID可注射作为细流或射流的疫苗，以这种力使得疫苗刺入组织表面并进入下层组织和/或肌肉。细流或射流后面的力可通过压缩
气体(诸如二氧化碳)在一瞬间通过微型孔的膨胀提供。已公开的美国专利申请号
20080234655、美国专利号6,520,950、美国专利号7，171,264、美国专利号6,208,893、美国专利号6，009，347、美国专利号6，120，493、美国专利号7，245，963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中描述了微创电穿孔装置的实例及其使用方法，它们各自的内容通
过引用方式并入本文。
气体(诸如二氧化碳)在一瞬间通过微型孔的膨胀提供。已公开的美国专利申请号
20080234655、美国专利号6,520,950、美国专利号7，171,264、美国专利号6,208,893、美国专利号6，009，347、美国专利号6，120，493、美国专利号7，245，963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中描述了微创电穿孔装置的实例及其使用方法，它们各自的内容通
过引用方式并入本文。
[0158] MID可包括产生无痛刺入组织的高速液体射流的注射器。此类无针注射器可商购获得。本文可用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783、4,447,223、5,505,697和
4,342,310中所述的那些注射器，它们各自的内容通过引用方式并入本文。
4,342,310中所述的那些注射器，它们各自的内容通过引用方式并入本文。
[0159] 可使用无针注射器，通常通过使组织表面与注射器接触，以便用足以使疫苗穿透进组织的力致动药剂射流的递送，将呈适于直接或间接电迁移形式的所需疫苗引入(例如，
注射)进待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织为粘膜、皮肤或肌肉，则用足够的力将药剂射向粘膜或皮肤表面以使药剂穿透角质层并进入真皮层，或分别进入下层组织和肌肉。
注射)进待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织为粘膜、皮肤或肌肉，则用足够的力将药剂射向粘膜或皮肤表面以使药剂穿透角质层并进入真皮层，或分别进入下层组织和肌肉。
[0160] 无针注射器很适合将疫苗递送到所有类型的组织，尤其是皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可用于将含有疫苗的液体推至表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可
使用本发明方法治疗的各类组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、喉咽、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
使用本发明方法治疗的各类组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、喉咽、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
[0161] MID可具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如呈矩形或正方形图案的设置)中的多对电极之间产生脉冲，提供了比在一对电极之间产生脉冲改善的结果。例
如，在标题为″Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes″的美国
专利号5,702,359中公开了针的阵列，其中在治疗期间可使多对针产生脉冲。在如同全面阐
述地通过引用方式并入本文的所述申请中，将针布置成圆形阵列，但是具有使得能够在相
对的针电极对之间产生脉冲的连接器和转换设备。可使用用于将重组表达载体递送到细胞
的一对针电极。在美国专利号6,763,264中描述了这样的装置和系统，其内容通过引用方式
并入本文。作为另外一种选择，可使用单针装置，它允许用类似于普通注射针的单针注射
DNA和电穿孔并且施加比目前使用的装置递送的脉冲电压低的脉冲，从而减轻患者经受的
电感觉。
如，在标题为″Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes″的美国
专利号5,702,359中公开了针的阵列，其中在治疗期间可使多对针产生脉冲。在如同全面阐
述地通过引用方式并入本文的所述申请中，将针布置成圆形阵列，但是具有使得能够在相
对的针电极对之间产生脉冲的连接器和转换设备。可使用用于将重组表达载体递送到细胞
的一对针电极。在美国专利号6,763,264中描述了这样的装置和系统，其内容通过引用方式
并入本文。作为另外一种选择，可使用单针装置，它允许用类似于普通注射针的单针注射
DNA和电穿孔并且施加比目前使用的装置递送的脉冲电压低的脉冲，从而减轻患者经受的
电感觉。
[0162] MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括两根或更多根具有相同直径或不同直径的针。针均匀或不均匀地间隔开。针可在0.005英寸和0.03英寸之间，在0.01英寸和
0.025英寸之间；或在0.015英寸和0.020英寸之间。针的直径可以为0.0175英寸。针可间隔
0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
0.025英寸之间；或在0.015英寸和0.020英寸之间。针的直径可以为0.0175英寸。针可间隔
0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
[0163] MID可由脉冲发生器和一步递送疫苗和电穿孔脉冲的双针或多针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许通过闪存卡操作的个人计算机灵活编程脉冲和注射参数，以及全面
记录并存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可在短时间内递送多种电压脉冲。例如，脉冲发
生器可在持续期间递送三个100ms的15v脉冲。这样的MID的实例为Inovio Biomedical
Corporation的Elgen1000系统，其在内容通过引用方式并入本文的美国专利号7,328,064
中有描述。
记录并存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可在短时间内递送多种电压脉冲。例如，脉冲发
生器可在持续期间递送三个100ms的15v脉冲。这样的MID的实例为Inovio Biomedical
Corporation的Elgen1000系统，其在内容通过引用方式并入本文的美国专利号7,328,064
中有描述。
[0164] MID可以为CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)装置和系统，这是一种促进将大分子(诸如DNA)引入机体或植物的选定组织的细胞中的模块化电极系统。
模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针
电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可紧握安装在支撑结构上的多个针电极并将
它们牢牢插入机体或植物中的选定组织内。然后通过皮下注射针将大分子递送进选定的组
织中。激活可编程恒流脉冲控制器并将恒流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲
促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。通过借助恒流脉冲限制组织中的功率耗散将由
于细胞过热导致的细胞死亡减到最少。美国专利号7,245,963中描述了Cellectra装置和系
统，其内容通过引用方式并入本文。
模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针
电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可紧握安装在支撑结构上的多个针电极并将
它们牢牢插入机体或植物中的选定组织内。然后通过皮下注射针将大分子递送进选定的组
织中。激活可编程恒流脉冲控制器并将恒流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲
促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。通过借助恒流脉冲限制组织中的功率耗散将由
于细胞过热导致的细胞死亡减到最少。美国专利号7,245,963中描述了Cellectra装置和系
统，其内容通过引用方式并入本文。
[0165] MID可以为Elgen1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen1000系统可包括提供空心针的装置；和流体递送机构，其中设备适于致动使用中的流体递送机构以便在将针
插入所述机体组织的过程中同时地(例如自动)将流体(本文所述的疫苗)注射进机体组织。
优点是在插入针的同时能够逐渐注射流体，导致流体在机体组织中更均匀的分布。另据信，
由于注射的流体体积在更大的区域分布，注射时经受的疼痛得以减轻。
插入所述机体组织的过程中同时地(例如自动)将流体(本文所述的疫苗)注射进机体组织。
优点是在插入针的同时能够逐渐注射流体，导致流体在机体组织中更均匀的分布。另据信，
由于注射的流体体积在更大的区域分布，注射时经受的疼痛得以减轻。
[0166] 另外，自动注射流体有利于自动监测并记录所注射的实际流体剂量。若需要，可通过控制单元存储该数据以用于文件记录目的。
[0167] 应当理解，注射速率可以为线性或非线性的，并且注射可以在将针插入待治疗的受试者的皮肤后以及将它们进一步插入机体组织的同时进行。
[0168] 可通过本发明的设备将流体注入其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但是可以为肌肉组织。
[0169] 设备可进一步包括用于引导将针插入机体组织中的针插入机构。流体注射的速率受针插入速率的控制。这样的优点在于，可同时控制针插入和流体的注射，使得可使插入速
率与所需的注射速率匹配。还使得使用者易于操作设备。若需要，可提供用于自动将针插入
机体组织中的机构。
率与所需的注射速率匹配。还使得使用者易于操作设备。若需要，可提供用于自动将针插入
机体组织中的机构。
[0170] 使用者可选择何时开始流体注射。然而理想的是，当针尖到达肌肉组织时开始注射，并且设备可包括用于感测针已经插入可开始流体注射的足够深度的机构。这意味着，当
针已到达所需的深度(通常为肌肉组织开始的深度)时可自动提示开始流体注射。例如可取
肌肉组织开始的深度为预设针插入深度，诸如将认为足以使针通过皮肤层的4mm的值。
针已到达所需的深度(通常为肌肉组织开始的深度)时可自动提示开始流体注射。例如可取
肌肉组织开始的深度为预设针插入深度，诸如将认为足以使针通过皮肤层的4mm的值。
[0171] 感测机构可包括超声探针。感测机构可包括用于感测阻抗或电阻变化的机构。在这种情况下，该机构可能不会同样记录针在机体组织中的深度，但是将更适于感测当针从
不同类型的机体组织移进肌肉中时阻抗或电阻的变化。这些替代方案的任一种提供了相对
精确和操作简单的感测可开始注射的机构。若需要，可进一步记录针的插入深度，并可用于
控制流体的注射，使得在记录针插入的深度时确定待注射的流体体积。
不同类型的机体组织移进肌肉中时阻抗或电阻的变化。这些替代方案的任一种提供了相对
精确和操作简单的感测可开始注射的机构。若需要，可进一步记录针的插入深度，并可用于
控制流体的注射，使得在记录针插入的深度时确定待注射的流体体积。
[0172] 设备可进一步包括：支撑针的基座；和在其中接纳基座的壳体，其中基座相对于壳体可移动，使得当基座相对于壳体处于第一向后位置时针缩回在壳体内，并当基座处于壳
体内的第二向前位置时针伸出壳体外。这对于使用者而言是有利的，因为可在患者的皮肤
上将壳体对准，然后可通过相对于基座移动壳体将针插入患者的皮肤内。
体内的第二向前位置时针伸出壳体外。这对于使用者而言是有利的，因为可在患者的皮肤
上将壳体对准，然后可通过相对于基座移动壳体将针插入患者的皮肤内。
[0173] 如上所述，可取的是实现受控的流体注射速率，使得当将针插入皮肤时使流体在针的长度上均匀地分布。流体递送机构包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动机构。可
例如通过伺服电机激活活塞驱动机构。可通过相对于壳体在轴向移动的基座致动活塞驱动
机构。应当理解，可提供用于流体递送的替代机构。因此，例如，可提供可被挤压以接受控或非受控的速率进行流体递送的密闭容器代替注射器和活塞系统。
例如通过伺服电机激活活塞驱动机构。可通过相对于壳体在轴向移动的基座致动活塞驱动
机构。应当理解，可提供用于流体递送的替代机构。因此，例如，可提供可被挤压以接受控或非受控的速率进行流体递送的密闭容器代替注射器和活塞系统。
[0174] 上述设备可用于任何类型的注射。然而，设想在电穿孔领域中尤其有用，所以其可进一步包括用于向针施加电压的机构。这允许针不仅用于注射，而且还在电穿孔期间用作
电极。这是特别有利的，因为这意味着向与注射流体相同的区域施加电场。电穿孔一直存在
的问题在于，很难使电极与先前注射的流体精确对准，所以使用者往往在更大的区域注射
大于所需体积的流体并向更大的区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间的重叠。使
用本发明，在实现电场和流体之间的良好切合的同时可减小注射流体的体积和施加电场的
大小。
电极。这是特别有利的，因为这意味着向与注射流体相同的区域施加电场。电穿孔一直存在
的问题在于，很难使电极与先前注射的流体精确对准，所以使用者往往在更大的区域注射
大于所需体积的流体并向更大的区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间的重叠。使
用本发明，在实现电场和流体之间的良好切合的同时可减小注射流体的体积和施加电场的
大小。
[0175] 4.试剂盒
[0176] 本文提供了可用于接种受试者的试剂盒。该试剂盒可包含疫苗促进剂、抗原肽和编码肽的DNA。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基阿米洛利(EIPA)、
苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。试剂盒还可以包含一个或多个容器，诸如小
瓶或瓶子，而每个容器容纳单独的试剂。试剂盒还可以包含书面说明，其可以描述如何使用
试剂盒。
苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。试剂盒还可以包含一个或多个容器，诸如小
瓶或瓶子，而每个容器容纳单独的试剂。试剂盒还可以包含书面说明，其可以描述如何使用
试剂盒。
[0177] 本发明具有通过以下非限制性实施例示出的多个方面。
[0178] 实施例1
[0179] 材料和方法
[0180] 以下是用于下文所确定的实施例2-6的材料的方法的说明。
[0181] 对于动物、细胞系和试剂，成年雌性C57BL/6小鼠(810周龄)得自北京维通实验动物技术有限公司(中国北京)并保持在SPF条件下。HBV sAg转基因小鼠A1b1-HBV和IFN-
γ-/-小鼠(B6.129S7-I(hgtmlTs/J)购自Jackson实验室(JaX，USA)。所有动物实验均得到
中国农业大学实验动物委员会的批准。RAW264.7、JAWSII和DC2.4购自ATCC(VA，USA)。
LipofactamineTM2000购自Invitrogen(CA，USA)。HBV sAg购自华北制药公司(中国河北)。
S208-215肽由科肽有限公司(中国上海)合成。pcD-S2在实验室[46]克隆和保存。用于DC成
熟(抗CD40-PE、抗CD80-PE、抗CD83-PE、抗CD86-PE、抗MHC I-PE、抗MHC-II-PE)、细胞亚群鉴定(抗CDllc-FITC、抗CDllb-FITC、抗B220-PE、抗CD3-FITC)和多色流式细胞术(抗CD3-APC-
Cy7、抗CD8-FITC、抗IFN-γ-PerCP-Cy5.5、抗穿孔素-PE和抗颗粒酶B-PE-Cy7)的所有抗体
均购自eBioscience(CA，USA)。用于IL-6、TNF、IL-1β和IFN-γ的Flexset试剂盒购自BD
Biosciences(USA)。
γ-/-小鼠(B6.129S7-I(hgtmlTs/J)购自Jackson实验室(JaX，USA)。所有动物实验均得到
中国农业大学实验动物委员会的批准。RAW264.7、JAWSII和DC2.4购自ATCC(VA，USA)。
LipofactamineTM2000购自Invitrogen(CA，USA)。HBV sAg购自华北制药公司(中国河北)。
S208-215肽由科肽有限公司(中国上海)合成。pcD-S2在实验室[46]克隆和保存。用于DC成
熟(抗CD40-PE、抗CD80-PE、抗CD83-PE、抗CD86-PE、抗MHC I-PE、抗MHC-II-PE)、细胞亚群鉴定(抗CDllc-FITC、抗CDllb-FITC、抗B220-PE、抗CD3-FITC)和多色流式细胞术(抗CD3-APC-
Cy7、抗CD8-FITC、抗IFN-γ-PerCP-Cy5.5、抗穿孔素-PE和抗颗粒酶B-PE-Cy7)的所有抗体
均购自eBioscience(CA，USA)。用于IL-6、TNF、IL-1β和IFN-γ的Flexset试剂盒购自BD
Biosciences(USA)。
[0182] 对于细胞培养和抑制剂处理，将RAW264.7和DC2.4在DMEM/10％FCS中培养，并将JAWSII在含有GMCSF(1000U/ml，Peprotech，USA)的DMEM/10％FCS中培养。将阿米洛利
(Sigma-Aldrich，USA)配制成10mM的溶液，在处理前在DMEM培养基中稀释到1mM、100uM、
10uM。移除培养基后，将细胞用阿米洛利、MβCD(5mM，Sigma)或菲律平(10μg/ml，sigma)在37℃下处理1h。在37℃下添加DMEM中的LPS(10ng/ml，sigma)或10μg/ml DNA保持0.5h，洗涤
后，添加培养基，并培养细胞。通过10ml PBS洗涤从腹腔制备了腹腔巨噬细胞，纯度通常为
约50-70％F4/80。脾树突细胞由贴板细胞制备，并通过Miltenyi DC纯化试剂盒(Miltenyi
Biotec，Gladbach，Germany)纯化。对细胞进行处理并培养3天以发生固有应答。
(Sigma-Aldrich，USA)配制成10mM的溶液，在处理前在DMEM培养基中稀释到1mM、100uM、
10uM。移除培养基后，将细胞用阿米洛利、MβCD(5mM，Sigma)或菲律平(10μg/ml，sigma)在37℃下处理1h。在37℃下添加DMEM中的LPS(10ng/ml，sigma)或10μg/ml DNA保持0.5h，洗涤
后，添加培养基，并培养细胞。通过10ml PBS洗涤从腹腔制备了腹腔巨噬细胞，纯度通常为
约50-70％F4/80。脾树突细胞由贴板细胞制备，并通过Miltenyi DC纯化试剂盒(Miltenyi
Biotec，Gladbach，Germany)纯化。对细胞进行处理并培养3天以发生固有应答。
[0183] 对于质粒制备和荧光偶联，从DH5α培养物制备了pEGFP(Clontech，USA)和pcD-S2质粒，通过EndoFree质粒大提试剂盒(Qiagen，Germany)进行了纯化，并且LAL测试表明内毒
素低于10EU/mg。通过Mirus LabelIT试剂盒(Mirus，USA)根据手册中的说明将Cy5偶联到质
粒。
素低于10EU/mg。通过Mirus LabelIT试剂盒(Mirus，USA)根据手册中的说明将Cy5偶联到质
粒。
[0184] 对于DNA免疫，在含或不含阿米洛利时，将PBS中的20μgCy5-pEGFP注射进C57/B6小鼠右后足垫部位。4h后，采集了双侧腹股沟淋巴结。每两周，在含或不含阿米洛利时，将PBS中的20ugpcD-S2注射进后足垫，持续4次。
[0185] 对于体外和体内CTL，如报道[47]进行了体外CTL测定。简而言之，用试剂盒(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany)纯化得自免疫小鼠脾细胞的CD8T细胞作为效应细
胞。将得自初始C57BL/6小鼠的脾细胞用10-6M HBsAg CTL肽S208-215冲击[48]，并用30μM
CFSE标记作为靶细胞。将没有肽冲击的相同初始脾细胞用10μM CFSE标记作为对照。将效应
细胞和靶细胞按10∶1、1∶1和1∶10的比率混合。培养3天后，通过FACSCalibur(BD
Biosciences，USA)分析了靶细胞裂解。将特异性裂解计算为(1-靶细胞/对照细胞)×
100％。
胞。将得自初始C57BL/6小鼠的脾细胞用10-6M HBsAg CTL肽S208-215冲击[48]，并用30μM
CFSE标记作为靶细胞。将没有肽冲击的相同初始脾细胞用10μM CFSE标记作为对照。将效应
细胞和靶细胞按10∶1、1∶1和1∶10的比率混合。培养3天后，通过FACSCalibur(BD
Biosciences，USA)分析了靶细胞裂解。将特异性裂解计算为(1-靶细胞/对照细胞)×
100％。
[0186] 如之前所述[46]，以含有S208-215并用30μM CFSE标记的得自首次接受实验的C57BL/6小鼠的脾细胞作为靶细胞，进行了体内CTL测定。将不含肽的相同脾细胞用10μM
CFSE标记作为对照。将靶细胞和对照细胞按1∶1的比率混合，然后以每只小鼠2×107个总细
胞数通过静脉注射进免疫小鼠。12h后，采集注射小鼠的脾细胞，并进行分析。对于Albl-HBV小鼠，采集肝脏，并制备了单细胞悬液。进行CFSE标记以作为靶细胞后，与对照细胞按1∶1混合，将Albl-HBV肝细胞与纯化的CD8效应T细胞共同培养，或经静脉转移到免疫小鼠。
CFSE标记作为对照。将靶细胞和对照细胞按1∶1的比率混合，然后以每只小鼠2×107个总细
胞数通过静脉注射进免疫小鼠。12h后，采集注射小鼠的脾细胞，并进行分析。对于Albl-HBV小鼠，采集肝脏，并制备了单细胞悬液。进行CFSE标记以作为靶细胞后，与对照细胞按1∶1混合，将Albl-HBV肝细胞与纯化的CD8效应T细胞共同培养，或经静脉转移到免疫小鼠。
[0187] 对于多色流式细胞术，通过抗CD3、抗CD8、抗IFN-γ、抗穿孔素和抗颗粒酶B建立了多色板。在通过sAg体外再刺激24h或通过S208-215体外再刺激12h后，用莫能菌素阻断6h，
然后固定脾细胞、穿透并染色。通过BD Aria收集数据，并通过Flowjo(Tree Star，Ashland，USA)进行分析。
然后固定脾细胞、穿透并染色。通过BD Aria收集数据，并通过Flowjo(Tree Star，Ashland，USA)进行分析。
[0188] 对于共同培养，将用含有或不含100μM阿米洛利的pcD-S2(10μg/ml)处理的APC、腹腔巨噬细胞或脾树突细胞培养2天。在第3天，将纯化的CD8T细胞(R&D systems，USA)按1∶5、
1∶2、1∶1的APC：T比率加入培养物。在第8天，收集细胞，用S208-215(10μg/nl)再刺激。添加PMA+离子霉素作为再刺激的阳性对照。
1∶2、1∶1的APC：T比率加入培养物。在第8天，收集细胞，用S208-215(10μg/nl)再刺激。添加PMA+离子霉素作为再刺激的阳性对照。
[0189] 使用单尾学生t检验(图3、4E、4G、5D-F、6A-D、6G)、针对多于2组的单因素方差分析(图1、2B、4C、5C、6A-D、6E、补充图1)或双因素方差分析(图4D、4F)分析数据。将p＜0.05(*)和p＜0.01(**)的差异视为具有统计显著性。
[0190] 实施例2
[0191] 阿米洛利加速DNA进入抗原呈递细胞
[0192] 最初在内吞抑制测定(未示出数据)过程中观察到了阿米洛利增强DNA进入JAWSII DC细胞系。这种现象在巨噬细胞系(RAW264.7)和树突细胞系(JAWSII和DC24)上重现。将这
些细胞系用1mM阿米洛利预处理1h，随后Cy5标记的pEGFP质粒在2小时内被大量摄取，并与
未处理的细胞相比在培养3天后表达了明显更高水平的GFP。这种高水平的表达与用脂质体
处理的细胞相当。参见图23。
些细胞系用1mM阿米洛利预处理1h，随后Cy5标记的pEGFP质粒在2小时内被大量摄取，并与
未处理的细胞相比在培养3天后表达了明显更高水平的GFP。这种高水平的表达与用脂质体
处理的细胞相当。参见图23。
[0193] 为了探究阿米洛利是否会克服低体内转柒效率，将含或不含阿米洛利的Cy5标记pEFGP质粒注射进C57B/6小鼠的后足垫部位。4小时后，采集引流淋巴结，并通过FACS分析法
对Cy5+细胞进行了分析。参见图24A。也采集了得自未注射侧的腹股沟淋巴结作为阴性对
照。数据表明淋巴结(LN)中Cy5-质粒+细胞的百分比在10μM下升高并在100μM下达到峰值，
但在1mM下降低。参见图24B。大部分Cy5+细胞为CDllc+和CDllb+，表明为树突细胞和巨噬细
胞。其他约10％为B220+(B细胞标志)。少量T细胞显示CD3+细胞的背景信号。参见图24C。
对Cy5+细胞进行了分析。参见图24A。也采集了得自未注射侧的腹股沟淋巴结作为阴性对
照。数据表明淋巴结(LN)中Cy5-质粒+细胞的百分比在10μM下升高并在100μM下达到峰值，
但在1mM下降低。参见图24B。大部分Cy5+细胞为CDllc+和CDllb+，表明为树突细胞和巨噬细
胞。其他约10％为B220+(B细胞标志)。少量T细胞显示CD3+细胞的背景信号。参见图24C。
[0194] MβCD(脂筏依赖性内吞抑制剂)或菲律平(小窝依赖性内吞抑制剂)可影响阿米洛利介导的DNA进入和基因表达。阿米洛利介导的DNA进入在RAW264.7中可被MβCD+菲律平完
全消除。参见图25A和B。在JAWSII和DC2.4两种细胞系中也观察到了相似的抑制。参见图
25C-F。这些结果表明，阿米洛利介导的DNA进入在体内通过脂筏或小窝依赖性内吞而实现。
全消除。参见图25A和B。在JAWSII和DC2.4两种细胞系中也观察到了相似的抑制。参见图
25C-F。这些结果表明，阿米洛利介导的DNA进入在体内通过脂筏或小窝依赖性内吞而实现。
[0195] 实施例3
[0196] 阿米洛利增强固有免疫
[0197] 将与Cy5偶联的编码HBsAg的乙型肝炎病毒DNA疫苗(pcD-S2)用于测试阿米洛利促进DNA进入抗原呈递细胞是否会对固有免疫应答产生积极影响。通过阿米洛利处理，pcD-S2
质粒在体外刺激了RAW264.7上更高水平的CD40、CD80和CD86表达，表明阿米洛利处理可提
高该巨噬细胞的成熟水平。参见图26A和B。与巨噬细胞成熟一致，与没有阿米洛利处理的相
同细胞相比，通过阿米洛利处理诱导了更高水平的TNF和IFN-γ表达。参见图26C。在两种树
突细胞系DC2.4和JAWSII中均达到了这种相似的成熟状态，但是在促炎性细胞因子的表达
水平方面存在一些差异。参见图26D-G。
质粒在体外刺激了RAW264.7上更高水平的CD40、CD80和CD86表达，表明阿米洛利处理可提
高该巨噬细胞的成熟水平。参见图26A和B。与巨噬细胞成熟一致，与没有阿米洛利处理的相
同细胞相比，通过阿米洛利处理诱导了更高水平的TNF和IFN-γ表达。参见图26C。在两种树
突细胞系DC2.4和JAWSII中均达到了这种相似的成熟状态，但是在促炎性细胞因子的表达
水平方面存在一些差异。参见图26D-G。
[0198] 对得自腹腔巨噬细胞或脾树突细胞的新分离的抗原呈递细胞进行处理，然后对细胞因子谱进行了分析。两组均显示出与单独的pcD-S2相比在用pcD-S2+阿米洛利处理的细
胞中更高的成熟标志表达和更多的促炎性细胞因子分泌。参见图26H-K。
胞中更高的成熟标志表达和更多的促炎性细胞因子分泌。参见图26H-K。
[0199] 实施例4
[0200] 阿米洛利作为pcD-S2DNA疫苗的CTL佐剂
[0201] 将C57B/6小鼠通过它们的足垫部位在含或不含阿米洛利时用表达HBV表面抗原(HBsAg)的pcD-S2免疫。参见图27A。结果表明针对HBsAg的抗体的水平在阿米洛利组中与单
独的pcD-S2相比以剂量依赖性方式升高。参见图27B。与单独的pcD-S2相比，在pcD-S2+阿米
洛利组中针对HBsAg的迟发型超敏(“DTH”)反应也增加。参见图27C。两实验均表明了1mM的
阿米洛利是体内处理的最有效剂量。
独的pcD-S2相比以剂量依赖性方式升高。参见图27B。与单独的pcD-S2相比，在pcD-S2+阿米
洛利组中针对HBsAg的迟发型超敏(“DTH”)反应也增加。参见图27C。两实验均表明了1mM的
阿米洛利是体内处理的最有效剂量。
[0202] DTH反映细胞介导的免疫(CMI)的效力，其中CD8+溶细胞T淋巴细胞(CTL)是重要的因素。为了探究阿米洛利是否会影响CTL，作为效应细胞纯化了得自免疫小鼠的CD8+T细胞。
将初始C57脾细胞用HBsAg肽S208-215处理，随后用CFSE进行标记，作为按不同比率混合的
靶细胞。培养3天后，在阿米洛利+pcD-S2组中裂解了60％的靶细胞，这明显高于得自单独的
pcD-S2组的约30％。参见图27D。另外，将经肽处理的CFSE标记的靶细胞经静脉转移到经免
疫的同基因小鼠(synergeneic mice)中以检测体内CTL。与未处理的对应物相比，在pcD-S2
与阿米洛利中观察到了更强的细胞毒性。参见图27E。通过使用得自Albl-HBV小鼠(为肝特
异性HBsAg转基因小鼠)的肝细胞进一步证实了这种抗原特异性杀灭。将这些肝细胞在体外
和体内用在靶细胞处。参见图27F和G。与对照相比，在阿米洛利+pcD-S2组中实现了更高水
平的CTL。
将初始C57脾细胞用HBsAg肽S208-215处理，随后用CFSE进行标记，作为按不同比率混合的
靶细胞。培养3天后，在阿米洛利+pcD-S2组中裂解了60％的靶细胞，这明显高于得自单独的
pcD-S2组的约30％。参见图27D。另外，将经肽处理的CFSE标记的靶细胞经静脉转移到经免
疫的同基因小鼠(synergeneic mice)中以检测体内CTL。与未处理的对应物相比，在pcD-S2
与阿米洛利中观察到了更强的细胞毒性。参见图27E。通过使用得自Albl-HBV小鼠(为肝特
异性HBsAg转基因小鼠)的肝细胞进一步证实了这种抗原特异性杀灭。将这些肝细胞在体外
和体内用在靶细胞处。参见图27F和G。与对照相比，在阿米洛利+pcD-S2组中实现了更高水
平的CTL。
[0203] 实施例5
[0204] 阿米洛利增加三阳性CD8T细胞
[0205] IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B是有助于病毒清除的CTL中的基本成分。将包含IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B的多功能板用于分化溶细胞CD8+T效应细胞。与单独的pcD-S2免疫相比，
阿米洛利+pcD-S2的免疫未增加对这些CD8+T效应细胞的特异性抗原的响应频率。参见图
28A。然而，其确实提高了应答CD8+群中三阳性CD8+T效应细胞的比例。参见图28B和C。另外，在HBsAg刺激的CD8响应中也可观察到三阳性细胞，表明阿米洛利通常增强针对HBV的CD8T
细胞毒性。参见图28D。这些结果表明通过阿米洛利提高的三阳性CD8T细胞的比例可以获得
更强且更有效的靶细胞杀灭。
阿米洛利+pcD-S2的免疫未增加对这些CD8+T效应细胞的特异性抗原的响应频率。参见图
28A。然而，其确实提高了应答CD8+群中三阳性CD8+T效应细胞的比例。参见图28B和C。另外，在HBsAg刺激的CD8响应中也可观察到三阳性细胞，表明阿米洛利通常增强针对HBV的CD8T
细胞毒性。参见图28D。这些结果表明通过阿米洛利提高的三阳性CD8T细胞的比例可以获得
更强且更有效的靶细胞杀灭。
[0206] 为了进一步证明三阳性CD8T效应细胞的增加是因阿米洛利处理的APS的后续作用所致，采集了腹腔巨噬细胞和脾树突细胞，并在含或不含阿米洛利时用pcD-S2处理，然后与
得自HBsAg免疫小鼠的纯化CD8T细胞共同培养5天。在共同培养期间，使用HBsAg衍生的肽
S208-215(ILSPFLPL；H-2Kb-限制的)进行再刺激。对应答T细胞的比例进行了分析。阿米洛
利显著增加了共同培养系统中S208-215特异性三阳性CD8T效应细胞在巨噬细胞和DC中的
百分比。参见图28E和F。
得自HBsAg免疫小鼠的纯化CD8T细胞共同培养5天。在共同培养期间，使用HBsAg衍生的肽
S208-215(ILSPFLPL；H-2Kb-限制的)进行再刺激。对应答T细胞的比例进行了分析。阿米洛
利显著增加了共同培养系统中S208-215特异性三阳性CD8T效应细胞在巨噬细胞和DC中的
百分比。参见图28E和F。
[0207] 实施例6
[0208] 在CTL受损背景中阿米洛利增加穿孔素和颗粒酶B比例
[0209] 为了检查多功能CD8T细胞和CTL功能之间的关联，在含或不含阿米洛利时用pcD--/- -/-
S2对IFN-γ敲除小鼠(IFN-γ )进行了免疫。结果显示，在野生型或IFN-γ 敲除小鼠中，
阿米洛利+pcD-S2比单独的pcD-S2提供了更高水平的CTL。参见图29。针对S208-215包被的
体外或体内的脾细胞或体外或体内的A1b1肝细胞，与野生型小鼠相比，在IFN-γ-/-敲除小
鼠中观察到了更低的CTL响应。参见图29A-D。与较低的CTL响应一致，当在敲除小鼠中用
S208-215刺激时，与野生型小鼠相比，表现出了更低数量的应答CD8T细胞。参见图29E。尽管CTL的水平降低，但是针对S208-215或HBsAg，与单独的pcD-S2组相比，在阿米洛利+pcD-S2
处理组中证实了更高频率的穿孔素+颗粒酶B+CD8T细胞。参见图29F和G。
S2对IFN-γ敲除小鼠(IFN-γ )进行了免疫。结果显示，在野生型或IFN-γ 敲除小鼠中，
阿米洛利+pcD-S2比单独的pcD-S2提供了更高水平的CTL。参见图29。针对S208-215包被的
体外或体内的脾细胞或体外或体内的A1b1肝细胞，与野生型小鼠相比，在IFN-γ-/-敲除小
鼠中观察到了更低的CTL响应。参见图29A-D。与较低的CTL响应一致，当在敲除小鼠中用
S208-215刺激时，与野生型小鼠相比，表现出了更低数量的应答CD8T细胞。参见图29E。尽管CTL的水平降低，但是针对S208-215或HBsAg，与单独的pcD-S2组相比，在阿米洛利+pcD-S2
处理组中证实了更高频率的穿孔素+颗粒酶B+CD8T细胞。参见图29F和G。
[0210] 实施例7
[0211] 使用组合肽/DNA疫苗治疗皮炎
[0212] 该实施例证明了CD25-iTreg的高抗原性表位的特征，包括用抗MHC-II抗体阻断致耐受性DC对CD25-iTreg的诱导的能力。进一步地，CD25-iTreg的数量和抑制活性与表位对活
性T细胞的明显抗原性正相关。最后，在皮炎的小鼠模型中，得自蚤变应原的高抗原性表位
不但诱导更多CD25-iTreg，而且比弱抗原性表位更有效地防止对变应原的变态反应。同时，
CD25-iTreg的有效诱导需要高抗原肽表位。这些结果证明，对MHC-II具有较高亲和力的高
抗原性表位应用于有效诱导iTreg细胞以供临床应用。
性T细胞的明显抗原性正相关。最后，在皮炎的小鼠模型中，得自蚤变应原的高抗原性表位
不但诱导更多CD25-iTreg，而且比弱抗原性表位更有效地防止对变应原的变态反应。同时，
CD25-iTreg的有效诱导需要高抗原肽表位。这些结果证明，对MHC-II具有较高亲和力的高
抗原性表位应用于有效诱导iTreg细胞以供临床应用。
[0213] 诱导调节性T细胞或iTreg与天然调节性T细胞(nTreg)的不同之处在于，前者在外周通过遇到环境抗原而生成。还认为，在调节外周耐受性中，iTreg相对于nTreg起非重叠作
用。迄今报道的大多数iTreg为CD25+细胞(CD4+CD25+Foxp3+)，并且明确确定其诱导需要次
+
优刺激T细胞受体(TCR)和细胞因子TGF-β和IL-2。因此CD25 iTreg似乎主要源自经弱刺激
的CD4+T细胞。
用。迄今报道的大多数iTreg为CD25+细胞(CD4+CD25+Foxp3+)，并且明确确定其诱导需要次
+
优刺激T细胞受体(TCR)和细胞因子TGF-β和IL-2。因此CD25 iTreg似乎主要源自经弱刺激
的CD4+T细胞。
[0214] 已经鉴定了为CD25-(CD4+CD25-Foxp3+)的不同亚群的iTreg。在使用蛋白抗原和编码所述相同抗原的DNA疫苗联合免疫后诱导了CD25-iTreg。与CD25+iTreg的诱导不同，CD25-
low high
iTreg的诱导涉及CD40 IL-10 致耐受性树突细胞(DC)的生成，其依次以抗原特异性方
式介导CD25-iTreg的诱导。在小鼠模型中，这一亚群的iTreg可能用作对变应性疾病和自身
免疫性疾病，例如哮喘、蚤过敏性皮炎(FAD)和1型糖尿病(T1D)的治疗剂。
low high
iTreg的诱导涉及CD40 IL-10 致耐受性树突细胞(DC)的生成，其依次以抗原特异性方
式介导CD25-iTreg的诱导。在小鼠模型中，这一亚群的iTreg可能用作对变应性疾病和自身
免疫性疾病，例如哮喘、蚤过敏性皮炎(FAD)和1型糖尿病(T1D)的治疗剂。
[0215] 虽然明确确定对于CD25+iTreg的诱导需要弱抗原刺激，但是尚不清楚对于CD25-iTreg的诱导而言是否同样如此。解决这一问题将不但使两个亚群的iTreg进一步分化，而
且通过选择适当抗原性的T细胞表位使联合免疫的致耐受性最大化。
且通过选择适当抗原性的T细胞表位使联合免疫的致耐受性最大化。
[0216] 实施例8
[0217] CD25-iTreg的诱导需要MHC-Ag：TCR相互作用
[0218] 为测试CD25-iTreg的诱导是否需要MHC-Ag：TCR相互作用，采用体外iTreg诱导系统。其涉及培养CD4+T细胞与呈递鸡卵清蛋白OVA323-339(SEQ ID NO；187)的优势表位的经联合免疫诱导的致耐受性DC。使用得自DO11.10Balb/c小鼠的克隆型CD4+T细胞或得自卵清蛋
白致敏Balb/c小鼠的多克隆CD4+T细胞，发现在任何情况下CD25-iTreg的诱导均可受抗MHC-
II抗体阻断，并因此依赖于MHC-II。因此，对于CD25-iTreg的诱导而言抗原刺激是必需的
(图1)。
白致敏Balb/c小鼠的多克隆CD4+T细胞，发现在任何情况下CD25-iTreg的诱导均可受抗MHC-
II抗体阻断，并因此依赖于MHC-II。因此，对于CD25-iTreg的诱导而言抗原刺激是必需的
(图1)。
[0219] 实施例9
[0220] 高活性CD25-iTreg的有效诱导需要高抗原性表位
[0221] 为进一步确定抗原性如何影响CD25-iTreg诱导，由OVA323-339(SEQ ID NO：187)生成一系列突变表位。使用基于四聚物染色的表位竞争测定，评估每个突变表位对MHC-II的亲和力。结果显示亲和力的顺序为OVA323-339＞MT1＞MT2＝MT3(图2A)(SEQ ID NO：187)。与该结果一致，使用DO11.10CD4+T细胞的体外T细胞增殖测定显示了T细胞刺激活性的相似顺序
(图2B)。因此选择所选表位OVA323-339、MT1和MT2作为抗原性研究的探针。
(图2B)。因此选择所选表位OVA323-339、MT1和MT2作为抗原性研究的探针。
[0222] 为了达到这个目的，通过使用与OVA323-339(SEQ ID NO：187)、MT1或MT2表位(指定为Co323、CoMT1或CoMT2)相应的DNA和蛋白组合的联合免疫来处理Balb/c小鼠(I-Ad+)。处
理七天后，分离脾细胞并分析CD25-iTreg诱导。当与未处理的对照小鼠(图3A)比较时，处理
小鼠显示在CD4+CD25-(CD25-iTreg)而非CD4+CD25+(nTreg)细胞群中有增加频率的Foxp3+细
胞。重要的是，增长幅度按顺序Co323＞CoMT1＞CoMT2，表明通过联合免疫有效诱导CD25-
iTreg需要高抗原性表位。
理七天后，分离脾细胞并分析CD25-iTreg诱导。当与未处理的对照小鼠(图3A)比较时，处理
小鼠显示在CD4+CD25-(CD25-iTreg)而非CD4+CD25+(nTreg)细胞群中有增加频率的Foxp3+细
胞。重要的是，增长幅度按顺序Co323＞CoMT1＞CoMT2，表明通过联合免疫有效诱导CD25-
iTreg需要高抗原性表位。
[0223] 为进一步确定抗原性对CD25-iTreg功能的影响，使用体外抑制测定比较Co323、CoMT1和CoMT2诱导的CD25-iTreg的抑制活性。正如预期，所有CD25-iTreg细胞均抑制共同培
养物中报告CD4+T细胞的OVA323-339特异性增殖。然而，其相对抑制活性按相同顺序Co323＞
CoMT1＞CoMT2(图3B)，表明更强抗原表位也功能性诱导了更具活性的CD25-iTreg细胞。
养物中报告CD4+T细胞的OVA323-339特异性增殖。然而，其相对抑制活性按相同顺序Co323＞
CoMT1＞CoMT2(图3B)，表明更强抗原表位也功能性诱导了更具活性的CD25-iTreg细胞。
[0224] 为在体内重复这种观察，将用不同表位诱导的CD25-iTreg过继转移至Balb/c小鼠体内，然后尝试用弗氏不完全佐剂(IFA)中的OVA323-339使动物致敏。一周后，从致敏小鼠分离出脾CD4+T细胞并通过体外再刺激测定测量CD4+T效应细胞的活化恢复。虽然所有转化的
CD25-iTreg均一定程度上阻断了T细胞的增殖恢复，但其相对有效性随诱导表位变化，顺序
为Co323＞CoMT1＞CoMT2(图4A)。这些结果与在体外所见的结果相似。而且，从受体分离的
脾CD4+T细胞显示IFN-γ表达减少而IL-10表达增加，其程度也按相同顺序(图4，B-D)。总
之，这些结果显示，为了更有效的诱导高抑制性CD25-iTreg需要高抗原性表位。
CD25-iTreg均一定程度上阻断了T细胞的增殖恢复，但其相对有效性随诱导表位变化，顺序
为Co323＞CoMT1＞CoMT2(图4A)。这些结果与在体外所见的结果相似。而且，从受体分离的
脾CD4+T细胞显示IFN-γ表达减少而IL-10表达增加，其程度也按相同顺序(图4，B-D)。总
之，这些结果显示，为了更有效的诱导高抑制性CD25-iTreg需要高抗原性表位。
[0225] 实施例10
[0226] 更有效预防蚤过敏性皮炎也需要高抗原性表位
[0227] 蚤过敏性皮炎是由CD4+T效应细胞介导的对蚤变应原的变态反应。对于疾病模型的以上发现，选择得自蚤变应原FSA1的两个抗原表位，即P66(氨基酸66-80)(SEQ ID NO：
189)和P100(氨基酸100-114)(SEQ ID NO：188)。预测P100对MHC-II(I-Ab)的亲和力比P66
高。通过用全长FSA1致敏C57BL/6小鼠(I-Ab+)，接着使用表位之一进行体外再刺激测定确
认这种预测。P100确实明显诱导了比P66更强的T细胞增殖(图5)。
189)和P100(氨基酸100-114)(SEQ ID NO：188)。预测P100对MHC-II(I-Ab)的亲和力比P66
高。通过用全长FSA1致敏C57BL/6小鼠(I-Ab+)，接着使用表位之一进行体外再刺激测定确
认这种预测。P100确实明显诱导了比P66更强的T细胞增殖(图5)。
[0228] 为了解抗原性的差异是否影响这两种表位对CD25-iTreg细胞的诱导，使用DNA和靶向每种表位(指定为Co100或Co66)的蛋白疫苗的组合经联合免疫预防性治疗C57BL/6小
鼠。联合免疫七天后，用蚤唾液提取物使动物致敏，接着通过迟发型超敏测定以确定预防联
合免疫防止变态反应发展的程度。粒度分析和组织学检查显示Co100的保护作用比Co66强，
如反应部位的疹块直径较小(图6B)和单核细胞浸润较少(图6C)所示。经Co100处理的小鼠
在反应部位也具有较少肥大细胞和较低水平的脱粒(图6D)。体外活化恢复也确认了Co100
组中的较弱T细胞应答(6A)。重要的是，P100也比P66诱导了更多的CD25-iTreg(图6E)，表明
P100通过诱导更多CD25-iTreg更有效地保护动物。
鼠。联合免疫七天后，用蚤唾液提取物使动物致敏，接着通过迟发型超敏测定以确定预防联
合免疫防止变态反应发展的程度。粒度分析和组织学检查显示Co100的保护作用比Co66强，
如反应部位的疹块直径较小(图6B)和单核细胞浸润较少(图6C)所示。经Co100处理的小鼠
在反应部位也具有较少肥大细胞和较低水平的脱粒(图6D)。体外活化恢复也确认了Co100
组中的较弱T细胞应答(6A)。重要的是，P100也比P66诱导了更多的CD25-iTreg(图6E)，表明
P100通过诱导更多CD25-iTreg更有效地保护动物。
[0229] 为确定是否事实的确如此，将由Co100或Co66诱导的CD25-iTreg细胞过继转移至FSA1致敏小鼠体内并用蚤抗原激发受体激发。同样，接受了经Co100诱导的CD25-iTreg细胞
的受体显示DTH应答比接受了经Co66诱导的对应物的受体显著减少(图7)。总之，这些结果
-
确认，在该疾病模型中，为了更有效诱导治疗性CD25iTreg需要高抗原表位。
的受体显示DTH应答比接受了经Co66诱导的对应物的受体显著减少(图7)。总之，这些结果
-
确认，在该疾病模型中，为了更有效诱导治疗性CD25iTreg需要高抗原表位。
[0230] 以上结果确定，高活性CD25-iTreg细胞的有效诱导需要对T细胞的高抗原表位。结论基于1)抗MHC-II mAb阻断了体外CD25-iTreg细胞的诱导(图1)；2)对T细胞的抗原性降低
的OVA323-339突变体显示诱导活性CD25-iTreg细胞的能力降低(图2-4)；和3)在蚤过敏性皮炎-
的小鼠模型中获得相似观察，其中在防止疾病的发展中，由更强抗原表位诱导的CD25
iTreg细胞也更有效(图5-7)。
的OVA323-339突变体显示诱导活性CD25-iTreg细胞的能力降低(图2-4)；和3)在蚤过敏性皮炎-
的小鼠模型中获得相似观察，其中在防止疾病的发展中，由更强抗原表位诱导的CD25
iTreg细胞也更有效(图5-7)。
[0231] iTreg细胞可能用作变态反应、自身免疫性疾病和移植排斥的治疗剂。因此本研究通过揭露需要选择用于有效诱导CD25-iTreg的高抗原表位，具有转化重要性。目前，免疫抑
制剂治疗是控制免疫失调和病理学的唯一方式，不幸的是伴有许多副作用，包括感染和癌
症的风险升高。体外诱导具抗原特异性的CD25-iTreg细胞提供了在避免全面免疫抑制的同
时控制免疫性疾病的方式。可通过靶向一种或多种疾病相关或特异性抗原的联合免疫，并
通过选择对T细胞的抗原性最高的抗原表位作为免疫原来诱导高度治疗有效性CD25-
iTreg。
制剂治疗是控制免疫失调和病理学的唯一方式，不幸的是伴有许多副作用，包括感染和癌
症的风险升高。体外诱导具抗原特异性的CD25-iTreg细胞提供了在避免全面免疫抑制的同
时控制免疫性疾病的方式。可通过靶向一种或多种疾病相关或特异性抗原的联合免疫，并
通过选择对T细胞的抗原性最高的抗原表位作为免疫原来诱导高度治疗有效性CD25-
iTreg。
[0232] 实施例11
[0233] 方法
[0234] 以下是用于下文所确定的实施例7-10的材料和方法的说明。
[0235] 对于动物和试剂，Balb/c和C57/B6小鼠购自北京维通实验动物技术有限公司(中国北京)，Balb/c、DO11.10得自斯莱克实验动物公司(中国上海)并养在无病原体的条件下。
肽由科肽有限公司(中国上海)合成。用于流式细胞术的抗体购自BD Biosciences(CA，
USA)。蚤唾液提取物购自中国医药公司(中国北京)。
肽由科肽有限公司(中国上海)合成。用于流式细胞术的抗体购自BD Biosciences(CA，
USA)。蚤唾液提取物购自中国医药公司(中国北京)。
[0236] 如用在线服务器MHCPred和NetMHCII所报道和预测，使鸡卵清蛋白对I-Ad(OVA323-339：ISQAVHAAHAEINEAGR)(SEQ ID NO：187)的优势表位发生突变，MHCPred和
NetMHCII在本领域中是熟知的。使用MHCPred选择蚤唾液抗原1(FSAl，Swiss-Prot：
Q94424.3)对I-Ab(P100：GPDWKVSKECKDPNN(SEQ ID NO：188))和P66：QEKEKCMKFCKKVCK(SEQ ID NO：189))的表位。用pVAX1载体构造编码OVA323-339、MT1、MT2、P100和P66的相应DNA疫苗，指定为pVAX1-OVA、pVAX1-MT1、pVAX1-MT2、D100和D66。
NetMHCII在本领域中是熟知的。使用MHCPred选择蚤唾液抗原1(FSAl，Swiss-Prot：
Q94424.3)对I-Ab(P100：GPDWKVSKECKDPNN(SEQ ID NO：188))和P66：QEKEKCMKFCKKVCK(SEQ ID NO：189))的表位。用pVAX1载体构造编码OVA323-339、MT1、MT2、P100和P66的相应DNA疫苗，指定为pVAX1-OVA、pVAX1-MT1、pVAX1-MT2、D100和D66。
[0237] 对于抗原致敏，通过在第0和7天皮下注射100ug在100ul IFA(Sigma-Aldridge Inc.San Louis，USA)中乳化的肽两次使小鼠免疫。
[0238] 对于致耐受性联合免疫，第0和14天为Balb/c小鼠肌肉内注射各100ug的OVA323-339和pVAX1-OVA、MT1和pVAX1-MT1或MT2和pVAX1-MT2。类似地为C57BL/6小鼠注射P100和D100
或P66和D66。
或P66和D66。
[0239] 对于MHC-II阻断，与从经联合免疫的(pVAX1-OVA+OVA323-339)Balb/c小鼠纯化的DC(1×105，Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany，130-052-001)一起培养从Balb/c DO11.10
小鼠或OVA323-339致敏Balb/c小鼠纯化的CD4+T细胞(5×105，R&D System，Minneapolis，USA，MAGM202)。用或不用抗MHC-II mAb(M5/114.15.2，eBioscience，San Diego，USA)培养细胞7天。
小鼠或OVA323-339致敏Balb/c小鼠纯化的CD4+T细胞(5×105，R&D System，Minneapolis，USA，MAGM202)。用或不用抗MHC-II mAb(M5/114.15.2，eBioscience，San Diego，USA)培养细胞7天。
[0240] 对于流式细胞术，通过用抗CD4-FITC、抗CD25-APC和抗Foxp3-PE mAb免疫染色来检测CD4+CD25-Foxp3+iTreg。通过用抗IFN-γ-PE mAb在细胞内染色在经莫能菌素阻断和经
抗CD3和抗CD28刺激的T细胞中检测到细胞内IFN-γ。用BD FACSCalibur收集数据并用
Flowjo(Tree Star，Ashland，USA)分析。还使用FlexSet Beads测定(BD Biosciences)分析
了培养的T细胞上清液的IFN-γ和IL-10。
抗CD3和抗CD28刺激的T细胞中检测到细胞内IFN-γ。用BD FACSCalibur收集数据并用
Flowjo(Tree Star，Ashland，USA)分析。还使用FlexSet Beads测定(BD Biosciences)分析
了培养的T细胞上清液的IFN-γ和IL-10。
[0241] 对于四聚物竞争测定，通过一起培育2×105个DO11.10T细胞、OVA323-339四聚物和竞争肽5分钟，使载有PE偶联的OVA323-339的I-Ad四聚物(NIH Tetramer Core Facility)与
OVA323-339或突变肽竞争。添加五倍体积含10％FCS的培养基以终止竞争。洗涤细胞3次并立
即用流式细胞仪分析PE阳性T细胞。
OVA323-339或突变肽竞争。添加五倍体积含10％FCS的培养基以终止竞争。洗涤细胞3次并立
即用流式细胞仪分析PE阳性T细胞。
[0242] 对于T细胞增殖，如前所述进行基于MTT和基于CFSE的T细胞增殖测定。
[0243] 对于体外抑制测定，用CFSE(应答细胞)标记得自DO11.10小鼠脾脏的OVA323-339特异性CD4+T细胞并按1：1比例(各2×105个)与经联合免疫诱导的CD4+CD25-T细胞一起共同培
养。在第4天通过CFSE稀释，使用FACScalibur分析应答细胞的OVA323-339特异性增殖。为阻断体内nTreg，在CD25-iTreg分离前-48h和-24h向联合免疫小鼠静脉内注射两个10ug剂量的
抗CD25mAb(克隆3c7，eBioscience)。
养。在第4天通过CFSE稀释，使用FACScalibur分析应答细胞的OVA323-339特异性增殖。为阻断体内nTreg，在CD25-iTreg分离前-48h和-24h向联合免疫小鼠静脉内注射两个10ug剂量的
抗CD25mAb(克隆3c7，eBioscience)。
[0244] 对于体内抑制测定，在第0天为Balb/c小鼠注射经联合免疫诱导的CD25-iTreg(2×106)。在第1和8天，重复使小鼠对相同抗原致敏。在第15天，处死小鼠并分离脾T细胞并通
过T细胞增殖测定分析活化恢复。
过T细胞增殖测定分析活化恢复。
[0245] 对于皮内试验和组织学，在非病灶性侧胸部皮肤用10ug的FSA(Greer Laboratories)经皮内激发抗原致敏的C57BL/6小鼠。PBS用作虚假对照而组胺用作阳性对
照。在激发后30分钟内使用校准千分尺测量皮肤反应的直径。在抗原激发30分钟内采集皮
肤样品，在4％多聚甲醛中固定，包埋在石蜡中并切片。通过在0.01M柠檬酸盐缓冲液
(pH6.0)中煮沸载玻片，接着用H&E为T细胞染色或用甲苯胺蓝为肥大细胞染色实现抗原修
复。
照。在激发后30分钟内使用校准千分尺测量皮肤反应的直径。在抗原激发30分钟内采集皮
肤样品，在4％多聚甲醛中固定，包埋在石蜡中并切片。通过在0.01M柠檬酸盐缓冲液
(pH6.0)中煮沸载玻片，接着用H&E为T细胞染色或用甲苯胺蓝为肥大细胞染色实现抗原修
复。
[0246] 对于统计分析，使用学生t检验进行成对比较。通过ANOVA检验进行三个或更多个组之间的比较。如果p＜0.05，则认为差异在统计上显著。
[0247] 实施例12
[0248] TGF-β和IL-10在抗哮喘的DNA和蛋白疫苗诱导的CD4+CD25-Foxp3+iTreg的发育和抑制功能中的不同作用
[0249] DNA疫苗和同源蛋白一起联合免疫可诱导致耐受性树突细胞，致耐受性树突细胞可进一步诱导在CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达并在鼠模型中预防多种变应性或自身免疫
性疾病。该实施例证明了通过共同接种编码Derp1抗原和Derp1蛋白的DNA对尘螨诱导的变
应性哮喘的经联合免疫诱导和iTreg介导的抑制的免疫调节作用。结果显示，联合免疫不但
有助于显著限制肺部的炎症反应，而且有助于抑制Th2细胞因子和生成IgE。此外，可通过抑
制细胞因子，例如IL-10而非细胞与细胞接触，诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg来介导抑制。另
外，联合免疫3天后，可由从致耐受性DC分泌的TGF-β1发起由初始T细胞转化iTreg。TGF-β1阻断后可破坏在初始T细胞中对Foxp3表达的这种诱导。同时，自分泌IL-10可通过DC上的
IL-10R增强TGF-β介导的iTreg的抑制能力。在体外，TGF-β1也可在抗CD3/抗CD28存在下诱
导CD4+CD25-初始T细胞中的Foxp3表达。因此，这种联合免疫方案诱导将初始T细胞进一步转
化为iTreg的分泌TGF-β1和IL-10的致耐受性DC。
性疾病。该实施例证明了通过共同接种编码Derp1抗原和Derp1蛋白的DNA对尘螨诱导的变
应性哮喘的经联合免疫诱导和iTreg介导的抑制的免疫调节作用。结果显示，联合免疫不但
有助于显著限制肺部的炎症反应，而且有助于抑制Th2细胞因子和生成IgE。此外，可通过抑
制细胞因子，例如IL-10而非细胞与细胞接触，诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg来介导抑制。另
外，联合免疫3天后，可由从致耐受性DC分泌的TGF-β1发起由初始T细胞转化iTreg。TGF-β1阻断后可破坏在初始T细胞中对Foxp3表达的这种诱导。同时，自分泌IL-10可通过DC上的
IL-10R增强TGF-β介导的iTreg的抑制能力。在体外，TGF-β1也可在抗CD3/抗CD28存在下诱
导CD4+CD25-初始T细胞中的Foxp3表达。因此，这种联合免疫方案诱导将初始T细胞进一步转
化为iTreg的分泌TGF-β1和IL-10的致耐受性DC。
[0250] 气道高反应性是可由环境气源性变应原引起的支气管哮喘的主要病理生理学特征。主要气源性变应原之一为已经证实有助于肺部的速发型过敏反应和慢性哮喘的屋尘螨
(HDM)。最重要的变应原是屋尘螨(Der-p1)，一种源自螨肠道的半胱氨酸蛋白酶。已经证明
对Der-p1过敏的患者的变应原特异性IgE的血清水平升高并引起炎性细胞的局部浸润。近
年来，关于T调节细胞(Treg)对哮喘和变应原免疫疗法调整的常识已迅速发展。
(HDM)。最重要的变应原是屋尘螨(Der-p1)，一种源自螨肠道的半胱氨酸蛋白酶。已经证明
对Der-p1过敏的患者的变应原特异性IgE的血清水平升高并引起炎性细胞的局部浸润。近
年来，关于T调节细胞(Treg)对哮喘和变应原免疫疗法调整的常识已迅速发展。
[0251] T调节细胞(Treg)是免疫系统中的关键抑制性和稳态组分之一并保持对各种免疫病症，例如自身免疫性疾病、慢性病毒感染和癌症中的自身抗原的免疫耐受性。已经提出将
T调节细胞(Treg)，包括天然胸腺源CD4+CD25+Treg细胞、适应性Tr1和粘膜诱导Th3细胞用于
临床试验。最近已经在老龄小鼠或全身性红斑狼疮(SLE)患者体内发现以CD4+CD25-Foxp3+
表征的新型Treg亚群。在先前的研究中，已经证明，将用蛋白抗原和编码所述抗原的质粒
DNA联合免疫接种至小鼠体内可诱导在CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达。然而，该亚型的
iTreg如何发挥作用的机制未知。Treg通过几种制剂控制免疫应答，包括生成抑制细胞因子
例如IL-10和TGF-β；由CTLA-4、GITR和PD-1的阴性调节因子介导的依赖于细胞与细胞接触
的抑制；诱导半成熟DC。在该实施例中表明，这些iTreg的抑制能力需要IL-10，而非TGF-β或细胞与细胞接触以抑制效应T细胞应答。
T调节细胞(Treg)，包括天然胸腺源CD4+CD25+Treg细胞、适应性Tr1和粘膜诱导Th3细胞用于
临床试验。最近已经在老龄小鼠或全身性红斑狼疮(SLE)患者体内发现以CD4+CD25-Foxp3+
表征的新型Treg亚群。在先前的研究中，已经证明，将用蛋白抗原和编码所述抗原的质粒
DNA联合免疫接种至小鼠体内可诱导在CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达。然而，该亚型的
iTreg如何发挥作用的机制未知。Treg通过几种制剂控制免疫应答，包括生成抑制细胞因子
例如IL-10和TGF-β；由CTLA-4、GITR和PD-1的阴性调节因子介导的依赖于细胞与细胞接触
的抑制；诱导半成熟DC。在该实施例中表明，这些iTreg的抑制能力需要IL-10，而非TGF-β或细胞与细胞接触以抑制效应T细胞应答。
[0252] TGF-β1和IL-10不但是免疫耐受性诱导中涉及的关键性抑制细胞因子，而且可在抗CD3/抗CD28的存在下将外周初始T细胞转化为Treg。在该实施例中，确定了联合免疫将未
成熟树突细胞(DC)诱导为也可分泌IL-10和TGF-β，并且在体内将初始T细胞转化为iTreg的
DCreg。通过中和DC分泌的TGF-β破坏对这些iTreg的诱导并且当抗争IL-10信号时抑制能力
降低。
成熟树突细胞(DC)诱导为也可分泌IL-10和TGF-β，并且在体内将初始T细胞转化为iTreg的
DCreg。通过中和DC分泌的TGF-β破坏对这些iTreg的诱导并且当抗争IL-10信号时抑制能力
降低。
[0253] 因此，证明在啮齿动物由尘螨介导的哮喘模型中，通过Der-p1DNA疫苗和Der-p1蛋白的联合免疫显著改善了临床发作和变态反应。还用抗原特异性CD4+CD25-Foxp3+iTreg证
明了对抑制的介导。此外，TGF-β1和IL-10在CD4+CD25-Foxp3+iTreg的诱导和抑制能力中起
着不同的作用。
明了对抑制的介导。此外，TGF-β1和IL-10在CD4+CD25-Foxp3+iTreg的诱导和抑制能力中起
着不同的作用。
[0254] 实施例13
[0255] 材料和方法
[0256] 以下是用于下文所确定的实施例12和14的材料的方法的说明。
[0257] 疫苗制剂。合成得自全长屋尘螨1(Der-p1，GeneBank登录号EU092644)的DNA序列并克隆至pVAX1载体(Invitrogen Inc.USA)。将重组Der-p1蛋白克隆至pET28a中并在大肠
杆菌系统中表达。72h后通过由转染BHK21细胞的总RNA进行RT-PCR分析来鉴定pVAX-Der-p1
表达。根据先前的方案从pET28a-FSA1转化的大肠杆菌BL21(DE3)中纯化Der-p1蛋白。按
1mg/ml将质粒和重组蛋白溶于盐水并在使用前储存在-80℃下。
杆菌系统中表达。72h后通过由转染BHK21细胞的总RNA进行RT-PCR分析来鉴定pVAX-Der-p1
表达。根据先前的方案从pET28a-FSA1转化的大肠杆菌BL21(DE3)中纯化Der-p1蛋白。按
1mg/ml将质粒和重组蛋白溶于盐水并在使用前储存在-80℃下。
[0258] 小鼠和免疫。从中国医学科学院动物研究所(中国北京)购买6-8周龄的雌性C57BL/6和BALB/C小鼠。从Jackson实验室购买Balb/c.Foxp3gfp小鼠。所有小鼠均接受无病
原体的水和食物。在第0和14天，按疫苗方案分别为C57BL/6、BALB/C.Foxp3gfp小鼠向胫骨前肌免疫接种质粒DNA(100μg/只动物)或蛋白(100μg/只动物)或其组合(各100μg/只动物)。
原体的水和食物。在第0和14天，按疫苗方案分别为C57BL/6、BALB/C.Foxp3gfp小鼠向胫骨前肌免疫接种质粒DNA(100μg/只动物)或蛋白(100μg/只动物)或其组合(各100μg/只动物)。
[0259] HIDM诱导的变应性发病机制。可如先前所述诱导变应原诱导的哮喘。在第1和7天，通过腹膜内注射为C57BL/6小鼠免疫接种4000U在0.1ml PBS中的HDM抗原(Greer
Laboratories，Lenoir，NC)或单独的PBS，接着在第14、16、18、20和22天用2000U在100μl PBS中的HDM抗原或等体积PBS作为对照在气管内激发。在最后一次激发后一天，收集BAL，并
收获组织用于免疫组织病理学分析或体外培养。
Laboratories，Lenoir，NC)或单独的PBS，接着在第14、16、18、20和22天用2000U在100μl PBS中的HDM抗原或等体积PBS作为对照在气管内激发。在最后一次激发后一天，收集BAL，并
收获组织用于免疫组织病理学分析或体外培养。
[0260] 组织学分析。最后一次气管内激发后二十四小时，从每一组采集得自小鼠的肺样品并在4％多聚甲醛中固定且包埋在石蜡块中。然后切片并固定。通过在0.01M柠檬酸盐缓
冲液(pH6.0)中煮沸载玻片，接着用苏木精和伊红(H&E)染色实现抗原修复并在光学显微镜
下分析以测定组织学变化。
冲液(pH6.0)中煮沸载玻片，接着用苏木精和伊红(H&E)染色实现抗原修复并在光学显微镜
下分析以测定组织学变化。
[0261] Der-p1特异性IgE的测量。采集血清样品并通过ELISA检查Der-p1特异性抗体的水平。在4℃下为96孔板包被重组Der-p1蛋白过夜。用PBST洗涤后，添加血清并在37℃下培育
1h，然后用特异性辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgE抗体(SouthernBiotech，Birmingham，
USA)检测。使用ELISA酶标仪(Magellan，Tecan Austria GmbH)测量450nm下的吸光度。
1h，然后用特异性辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgE抗体(SouthernBiotech，Birmingham，
USA)检测。使用ELISA酶标仪(Magellan，Tecan Austria GmbH)测量450nm下的吸光度。
[0262] 流式细胞术(FACS)分析。对于细胞内染色，用Der-p1蛋白(10μg/ml)刺激T细胞8h，随后在体外用莫能菌素(3μM)处理2h。在用4％多聚甲醛固定和用皂甙渗透化之前，在4℃下
用PBS中的Fc块(BD Phamingen，San Diego，USA)阻断细胞30分钟。在4℃下分别用适当浓度
的抗体，包括APC标记的抗Foxp3、PECy5标记的抗CD25、FITC标记的抗CD4、PE标记的抗IL-
10、PE标记的抗GITR、PE标记的抗CTLA4、PE标记的抗PD-1抗体为细胞在细胞内染色30分钟。
使用Cell QuestPro软件(BD Bioscience)用FAC Scalibur分析细胞。
用PBS中的Fc块(BD Phamingen，San Diego，USA)阻断细胞30分钟。在4℃下分别用适当浓度
的抗体，包括APC标记的抗Foxp3、PECy5标记的抗CD25、FITC标记的抗CD4、PE标记的抗IL-
10、PE标记的抗GITR、PE标记的抗CTLA4、PE标记的抗PD-1抗体为细胞在细胞内染色30分钟。
使用Cell QuestPro软件(BD Bioscience)用FAC Scalibur分析细胞。
[0263] 体外增殖/抑制测定。在增殖测定中，在第二次免疫后第7天从每一组的脾脏中获得单淋巴细胞悬液。在Der-p1(10μg/ml)或PMA(50ng/ml)/离子霉素(500ng/ml)体外刺激
后，通过MTT方法进行T细胞增殖48h。对于悬液测定，用高速细胞分选仪(MoFlo Cell
Sorter，Beckman Coulter，USA)用PE标记的抗CD4和APC标记的抗CD25纯化CD4+CD25-GFp+、
+ + + + - -
CD4 CD25GFP 和CD4 CD25GFPT细胞。检查分选细胞纯度并达到97％以上。与从先前用在
CFA(弗氏完全佐剂)中乳化的重组Der-p1初敏化的BALB/C小鼠获得的CD4+CD25-应答细胞(2
×105个)一起共同培养纯化的抑制T细胞(4×104或2×104个)，并用在IFA(弗氏不完全佐
剂)中乳化的重组Der-p1增强一次。在96孔板中用Der-pl(10μg/ml)和APC(1×104个)刺激
应答T细胞72h。刺激后，在添加20μl的MTT-PMS(Pormaga，USA)溶液后通过比色反应4h评估
细胞增殖。在添加100μl DMSO(AMRESCO，USA)5分钟后，在595nm下用96孔酶标仪(Magellan，Tecan Austria GmbH)测定其色密度。
后，通过MTT方法进行T细胞增殖48h。对于悬液测定，用高速细胞分选仪(MoFlo Cell
Sorter，Beckman Coulter，USA)用PE标记的抗CD4和APC标记的抗CD25纯化CD4+CD25-GFp+、
+ + + + - -
CD4 CD25GFP 和CD4 CD25GFPT细胞。检查分选细胞纯度并达到97％以上。与从先前用在
CFA(弗氏完全佐剂)中乳化的重组Der-p1初敏化的BALB/C小鼠获得的CD4+CD25-应答细胞(2
×105个)一起共同培养纯化的抑制T细胞(4×104或2×104个)，并用在IFA(弗氏不完全佐
剂)中乳化的重组Der-p1增强一次。在96孔板中用Der-pl(10μg/ml)和APC(1×104个)刺激
应答T细胞72h。刺激后，在添加20μl的MTT-PMS(Pormaga，USA)溶液后通过比色反应4h评估
细胞增殖。在添加100μl DMSO(AMRESCO，USA)5分钟后，在595nm下用96孔酶标仪(Magellan，Tecan Austria GmbH)测定其色密度。
[0264] Transwell实验。在24孔板中进行Transwell实验。在不存在或存在抗IL-10和抗TGF-β的情况下，在下部transwell中用Der-p1(10μg/ml)和APC(2×105个)刺激如以上分离
的CD4+CD25-应答T细胞(1×106个)。在上部transwell腔(0.4μm；Millipore，USA)中与APC(4×104个)一起共同培养纯化的CD4+CD25-GFp+iTreg(2×105个)、CD4+CD25+GFp+nTreg(2×105
个)和CD4+CD25-GFP-T细胞。3天后如以上通过MTT方法评估细胞增殖。
的CD4+CD25-应答T细胞(1×106个)。在上部transwell腔(0.4μm；Millipore，USA)中与APC(4×104个)一起共同培养纯化的CD4+CD25-GFp+iTreg(2×105个)、CD4+CD25+GFp+nTreg(2×105
个)和CD4+CD25-GFP-T细胞。3天后如以上通过MTT方法评估细胞增殖。
[0265] 细胞因子生成的分析。通过RT-PCR检测由CDllC+树突细胞表达的抑制细胞因子。使用TRIzol试剂(Promega)首次联合免疫3天后从C57BL/6小鼠脾脏的CDllC+细胞分离总
RNA。合成cDNA并用以下各种引物进行PCR：GAPDH、TGF-β1、IL10、RALDH1、RALDH2、RALDH3。根据生产商的说明(TaKaRa RNAPCR试剂盒)用每种引物进行RT-PCR。根据生产商的说明，用
IL-4、IL-5、IL-10和IL-13细胞计数微球测定Flex Set(BD Bioscience)测量得自经处理或
未处理小鼠诱导哮喘模型的血清中的细胞因子。
RNA。合成cDNA并用以下各种引物进行PCR：GAPDH、TGF-β1、IL10、RALDH1、RALDH2、RALDH3。根据生产商的说明(TaKaRa RNAPCR试剂盒)用每种引物进行RT-PCR。根据生产商的说明，用
IL-4、IL-5、IL-10和IL-13细胞计数微球测定Flex Set(BD Bioscience)测量得自经处理或
未处理小鼠诱导哮喘模型的血清中的细胞因子。
[0266] 体内阻断TGF-β1或IL-10。为测量TGF-β1对体内iTreg诱导的影响，在每次联合免疫后为C57BL/6小鼠腹膜内注射抗TGF-β1mAb(2G7)、抗IL-10mAb(JES-2A5)或0.5ml磷酸盐
缓冲盐水(PBS)中作为对照的同种型匹配小鼠免疫球蛋白G1(IgG1)连续三天，每次注射400
μg。根据生产商的方法使用Emax免疫测定系统(Promega，Madison，WI)或IL-10细胞计数微
球测定Flex Set(BD Bioscience)测量血清中抗TGF-β1mAb和抗IL-10mAb的中和功能。
缓冲盐水(PBS)中作为对照的同种型匹配小鼠免疫球蛋白G1(IgG1)连续三天，每次注射400
μg。根据生产商的方法使用Emax免疫测定系统(Promega，Madison，WI)或IL-10细胞计数微
球测定Flex Set(BD Bioscience)测量血清中抗TGF-β1mAb和抗IL-10mAb的中和功能。
[0267] 体外T细胞初敏测定。为在体外生成CD4+CD25-Foxp3+细胞，在6孔板中培养初始CDllc+树突细胞(2×105个)，并在抗IL10或TGF-β存在下用pVAX-Derp1(10μg/ml)加Derp1蛋
+ - 6
白(10μg/ml)刺激48h。向RPMI1640中有初始CD4CD25 T细胞(1×10个)的培养基中添加三
组预处理树突细胞3次，每次48h。然后通过FACS分析CD4+CD25-T细胞中的GFP表达。为检验
DCreg诱导iTreg期间细胞因子的作用，我们共同培养了经pVAX-Derp1(10μg/ml)加Derp1蛋
白(10μg/ml)预处理的CDllc+DC和初始T细胞，同时加上抗IL-10、抗TGF-β或TGF-β受体抑制剂、SB-525334(14.3nM)3次，每次48h。为了检测TGF-β和IL-10诱导CD4+CD25-Foxp3+Treg的能力，在存在或不存在滴定rhTGF-β1或rmIL10(PeproTech，USA)的情况下，用板结合的抗
CD3(3μg/ml)/抗CD28(1μg/ml)刺激初始CD4+CD25-T细胞(1×106个)。
+ - 6
白(10μg/ml)刺激48h。向RPMI1640中有初始CD4CD25 T细胞(1×10个)的培养基中添加三
组预处理树突细胞3次，每次48h。然后通过FACS分析CD4+CD25-T细胞中的GFP表达。为检验
DCreg诱导iTreg期间细胞因子的作用，我们共同培养了经pVAX-Derp1(10μg/ml)加Derp1蛋
白(10μg/ml)预处理的CDllc+DC和初始T细胞，同时加上抗IL-10、抗TGF-β或TGF-β受体抑制剂、SB-525334(14.3nM)3次，每次48h。为了检测TGF-β和IL-10诱导CD4+CD25-Foxp3+Treg的能力，在存在或不存在滴定rhTGF-β1或rmIL10(PeproTech，USA)的情况下，用板结合的抗
CD3(3μg/ml)/抗CD28(1μg/ml)刺激初始CD4+CD25-T细胞(1×106个)。
[0268] NFAT1和NFAT2的Western印迹。用NE-PER核或细胞质试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)将RPMI中的纯化CD4+CD25-GFP+、CD4+CD25+GFP+Treg或CD4+CD25-GFP-T细胞(5×106个)分成几个部分。使溶解产物在8.0％SDS-PAGE凝胶上
进行试验，转移到硝化纤维素膜上，然后用有0.1％Tween的TBS中的5.0％乳液阻断。然后用
抗小鼠NFAT1、NFAT2、GADPH和组蛋白(全部得自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，
CA，USA)探查膜。
进行试验，转移到硝化纤维素膜上，然后用有0.1％Tween的TBS中的5.0％乳液阻断。然后用
抗小鼠NFAT1、NFAT2、GADPH和组蛋白(全部得自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，
CA，USA)探查膜。
[0269] 统计分析。使用学生t检验进行统计分析。在这些分析中，将数据转化为对数。如果P＜0.05，数据表示差异显著。
[0270] 实施例14
[0271] 联合免疫抑制HDM诱导的变应性哮喘的发展
[0272] 为证明用DNA和重组蛋白疫苗联合免疫对预防哮喘的功效，克隆并构造基于尘螨变应原、屋尘螨1(Derp1，图16A-C)的序列的DNA和蛋白疫苗，然后在小鼠的尘螨介导的哮喘
或AHR中试验。用与联合免疫组一样的pVAX-Derp1DNA疫苗和重组Der-p1蛋白(PVAX-Derp1+
Derp1)或其他免疫原以两周一次的间隔经肌肉内预处理C57BL/6小鼠两次。为了消除无关
载体和蛋白对反应的影响，与不匹配的联合免疫对照一样，用pVAX-Derp1+BSA或Derp1蛋白
+pVAX载体联合免疫小鼠。随后，诱导除阴性对照外的所有动物并用HDM在气管内激发以诱
导如先前所述的哮喘。组织学分析揭示，与注射了PBS的阴性对照小鼠的肺组织相比，如AHR
的成功诱导所示，在未处理小鼠的肺部(图8A)有大量炎性细胞浸润。经联合免疫预处理的
小鼠表现出炎性细胞浸润和正常肺部结构显著减少(图8A)。最后一次激发24h后分析支气
管肺泡灌洗(BAL)中不同细胞亚型的百分比。在联合免疫小鼠体内嗜酸性细胞、嗜中性粒细
胞和淋巴细胞显著减少并与以上观察一致(图17)。
或AHR中试验。用与联合免疫组一样的pVAX-Derp1DNA疫苗和重组Der-p1蛋白(PVAX-Derp1+
Derp1)或其他免疫原以两周一次的间隔经肌肉内预处理C57BL/6小鼠两次。为了消除无关
载体和蛋白对反应的影响，与不匹配的联合免疫对照一样，用pVAX-Derp1+BSA或Derp1蛋白
+pVAX载体联合免疫小鼠。随后，诱导除阴性对照外的所有动物并用HDM在气管内激发以诱
导如先前所述的哮喘。组织学分析揭示，与注射了PBS的阴性对照小鼠的肺组织相比，如AHR
的成功诱导所示，在未处理小鼠的肺部(图8A)有大量炎性细胞浸润。经联合免疫预处理的
小鼠表现出炎性细胞浸润和正常肺部结构显著减少(图8A)。最后一次激发24h后分析支气
管肺泡灌洗(BAL)中不同细胞亚型的百分比。在联合免疫小鼠体内嗜酸性细胞、嗜中性粒细
胞和淋巴细胞显著减少并与以上观察一致(图17)。
[0273] 因为变应性抗原引发可介导AHR的IgE，所以研究了pVAX-Derp1+Derp1是否可抑制抗Der-p1IgE的诱导。因此在最后一次气管内激发24h后测量了抗Der-p1特异性IgE的水平。
与模型组相比，在联合免疫小鼠体内其水平显著降低(图8B)。
与模型组相比，在联合免疫小鼠体内其水平显著降低(图8B)。
[0274] 已经证明高水平的Th2相关细胞因子生成，包括IL-4、IL-5和IL-13与变态反应的严重程度相关，通过Flex set测量这些细胞因子在血清中的水平。诱导得自模型组、不匹配
组的小鼠生成较高水平的IL-5和IL-13(图8C)；然而，经pVAX-Derp1+Derp1预处理的小鼠生
成相对较低水平的这些细胞因，但是高水平的IL-10，表明联合免疫诱导对变态反应的预防
作用。因此，联合免疫诱导的抑制可减弱炎症及其疾病相关的体内细胞因子生成。
组的小鼠生成较高水平的IL-5和IL-13(图8C)；然而，经pVAX-Derp1+Derp1预处理的小鼠生
成相对较低水平的这些细胞因，但是高水平的IL-10，表明联合免疫诱导对变态反应的预防
作用。因此，联合免疫诱导的抑制可减弱炎症及其疾病相关的体内细胞因子生成。
[0275] 实施例15
[0276] CD4+CD25-Foxp3+iTreg有助于经联合免疫诱导的免疫耐受
[0277] 为检查pVAX-Derp1+Derp1联合免疫是否可上调Foxp3表达，在第二次联合免疫7天+ - + + + +
后通过FACS分析CD4CD25Foxp3或CD4CD25Foxp3T细胞的百分比。如图9A所示，与其他组
相比，在经pVAX-Derp1+Derp1联合免疫的小鼠体内CD4+CD25-Foxp3+T细胞群增多，表明产生
了诱导型Treg细胞。与先前的结论一致，尽管在高水平下，在各组中观察到CD4+CD25+nTreg
细胞变化，但是未观察到Foxp3表达变化，这反驳了nTreg细胞可能也有助于抑制的看法。
后通过FACS分析CD4CD25Foxp3或CD4CD25Foxp3T细胞的百分比。如图9A所示，与其他组
相比，在经pVAX-Derp1+Derp1联合免疫的小鼠体内CD4+CD25-Foxp3+T细胞群增多，表明产生
了诱导型Treg细胞。与先前的结论一致，尽管在高水平下，在各组中观察到CD4+CD25+nTreg
细胞变化，但是未观察到Foxp3表达变化，这反驳了nTreg细胞可能也有助于抑制的看法。
[0278] 为了检查CD4+CD25-Foxp3+iTreg是否有助于对联合免疫的抑制，纯化CD4+CD25-细胞，然后在MoFlo分选仪中通过使用经各种方案(包括联合免疫)免疫后的Foxp3gfp小鼠，分
选Foxp3+iTreg细胞。使分选的T细胞与从先前用重组Derp1+IFA初敏化并用重组Derp1+IFA
增强的BALB/c小鼠分离的应答CD4+T细胞混合(图9B)。如图9C所描绘，CD4+CD25-GFP-T细胞
未表现出任何体外抑制功能，然而CD4+CD25-GFP+和CD4+CD25+GFP+T细胞在1∶5或1∶10的
Treg：Teff细胞比例下均削弱了应答T细胞的增殖反应。结果表明，免疫抑制仅源自CD4+
- + + - -
CD25Foxp3Treg细胞，而未源自其他CD4CD25Foxp3 T细胞。进一步表明，经联合免疫诱导
的CD4+CD25-Foxp3+iTreg有助于免疫耐受。
选Foxp3+iTreg细胞。使分选的T细胞与从先前用重组Derp1+IFA初敏化并用重组Derp1+IFA
增强的BALB/c小鼠分离的应答CD4+T细胞混合(图9B)。如图9C所描绘，CD4+CD25-GFP-T细胞
未表现出任何体外抑制功能，然而CD4+CD25-GFP+和CD4+CD25+GFP+T细胞在1∶5或1∶10的
Treg：Teff细胞比例下均削弱了应答T细胞的增殖反应。结果表明，免疫抑制仅源自CD4+
- + + - -
CD25Foxp3Treg细胞，而未源自其他CD4CD25Foxp3 T细胞。进一步表明，经联合免疫诱导
的CD4+CD25-Foxp3+iTreg有助于免疫耐受。
[0279] 实施例16
[0280] IL-10保持经联合免疫诱导的iTreg的抑制功能
[0281] 值得注意的是，经联合免疫在CD4+CD25-T细胞中获得抑制活性伴有Foxp3上调。但是仍然不知道iTreg抑制功能是否通过细胞与细胞接触产生或是否依赖于细胞因子。首先，
表征具有先前用于鉴定Treg群的一系列特异性阴性受体的CD4+CD25-Foxp3+iTreg细胞。观
察到，表达IL-10的CD4+CD25-Foxp3+iTreg细胞表现出CTLA4、GITR和PD-1在表面上的低表达
(图10A)，这可区别于先前鉴定的nTreg和Tr1细胞。这表明，iTreg的抑制功能不依赖于细胞
与细胞的接触机制。为了确认这种假设，在transwell板中将CD4+CD25-GFp+iTreg与应答T细
胞分开，然后检测抗原特异性应答T细胞的增殖水平。如图10B所示，T效应子也不能增殖，表明非接触抑制有助于iTreg介导的免疫耐受。另外，在该体系中IL-10的阻断可显著逆转其
抑制能力，并且TGF-β对抑制功能几乎无影响。缺乏细胞与细胞的接触逆转了nTreg介导的
抑制，暗示nTreg抑制功能依赖于细胞因子信号转导和细胞与细胞的接触。总之，iTreg主要
通过分泌IL-10的DC，而非TGF-β和阴性受体抑制应答T细胞。
表征具有先前用于鉴定Treg群的一系列特异性阴性受体的CD4+CD25-Foxp3+iTreg细胞。观
察到，表达IL-10的CD4+CD25-Foxp3+iTreg细胞表现出CTLA4、GITR和PD-1在表面上的低表达
(图10A)，这可区别于先前鉴定的nTreg和Tr1细胞。这表明，iTreg的抑制功能不依赖于细胞
与细胞的接触机制。为了确认这种假设，在transwell板中将CD4+CD25-GFp+iTreg与应答T细
胞分开，然后检测抗原特异性应答T细胞的增殖水平。如图10B所示，T效应子也不能增殖，表明非接触抑制有助于iTreg介导的免疫耐受。另外，在该体系中IL-10的阻断可显著逆转其
抑制能力，并且TGF-β对抑制功能几乎无影响。缺乏细胞与细胞的接触逆转了nTreg介导的
抑制，暗示nTreg抑制功能依赖于细胞因子信号转导和细胞与细胞的接触。总之，iTreg主要
通过分泌IL-10的DC，而非TGF-β和阴性受体抑制应答T细胞。
[0282] 实施例17
[0283] TGF-β和IL-10在CD4+CD25-Foxp3+iTreg发育中的不同作用
[0284] 据报道，IL-10，而非TGF-β为iTreg抑制功能的关键调节因子。但是，是TGF-β还是IL-10参与了iTreg的生成仍然未知。一些新近报道已表明，TGF-β1可通过调节Foxp3表达促进Treg的发育，并且在自身免疫性或变应性疾病中，树突细胞自分泌的IL-10可诱导长效抗
原特异耐受性。已经证实在首次联合免疫3天后可检测到iTreg，所以使用GAPDH(甘油醛-3-
磷酸脱氢酶)作为对RNA水平的内部对照，通过RT-PCR测定测量CDllc+树突细胞中的TGF-β1
和IL-10表达。如图11A所示，在pVAX-Derp1+Derp1联合免疫组中TGF-β1和IL-10的高表达水
平升高。如先前所报道，视黄酸可直接促进初始T细胞经TGF-β1-介导的Foxp3+Treg转化。从而通过RT-PCR检测RALDH1、RALDH2、RALDH3的表达水平，并且结果显示，在每一组中均未能
检测到这三种视黄醛脱氢酶(数据未示出)，表明可能并非由这些RA转化酶引起对iTreg的
诱导。
原特异耐受性。已经证实在首次联合免疫3天后可检测到iTreg，所以使用GAPDH(甘油醛-3-
磷酸脱氢酶)作为对RNA水平的内部对照，通过RT-PCR测定测量CDllc+树突细胞中的TGF-β1
和IL-10表达。如图11A所示，在pVAX-Derp1+Derp1联合免疫组中TGF-β1和IL-10的高表达水
平升高。如先前所报道，视黄酸可直接促进初始T细胞经TGF-β1-介导的Foxp3+Treg转化。从而通过RT-PCR检测RALDH1、RALDH2、RALDH3的表达水平，并且结果显示，在每一组中均未能
检测到这三种视黄醛脱氢酶(数据未示出)，表明可能并非由这些RA转化酶引起对iTreg的
诱导。
[0285] 令人感兴趣的是确定中和内源性生成的TGF-β1或IL-10是否会降低对联合免疫小鼠体内iTreg的诱导。在按本领域已知的方式进行两次联合免疫的每一次后第0-3天，为小
鼠重复注射抗TGF-β1mAb(2G7)、抗IL-10(2A5)或同种型对照抗体(IgG1)。通过经ELISA测量
血清中的TGF-β1水平(图19A)和用F1ex Set测量IL-10水平(图19B)分析各组中受抗TGF-β
1mAb的中和作用。注射了对照抗体的小鼠并未影响iTreg发育。相反，在注射了抗TGF-β1mAb的小鼠体内，iTreg的发育和免疫抑制均被逆转(图11B)，表明在联合免疫期间，TGF-β1是诱导CD4+CD25-iTreg中的Foxp3表达所必需的。为评估与IL-10的关系，将IL-10于iTreg的初期
阻断。结果显示，缺乏IL-10信号不能破坏CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达(图12A)。然后检查这些iTreg是否保持了其抑制功能。为此，从经抗IL10mAb预处理的小鼠纯化CD4+CD25-GFp+
iTreg并与应答CD4+T细胞一起共同培养。结果显示，IL-10信号的阻断可部分破坏iTreg功
能(图12B)，并且这种下调与iTreg分泌的IL-10减少有关(图12C)。
鼠重复注射抗TGF-β1mAb(2G7)、抗IL-10(2A5)或同种型对照抗体(IgG1)。通过经ELISA测量
血清中的TGF-β1水平(图19A)和用F1ex Set测量IL-10水平(图19B)分析各组中受抗TGF-β
1mAb的中和作用。注射了对照抗体的小鼠并未影响iTreg发育。相反，在注射了抗TGF-β1mAb的小鼠体内，iTreg的发育和免疫抑制均被逆转(图11B)，表明在联合免疫期间，TGF-β1是诱导CD4+CD25-iTreg中的Foxp3表达所必需的。为评估与IL-10的关系，将IL-10于iTreg的初期
阻断。结果显示，缺乏IL-10信号不能破坏CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达(图12A)。然后检查这些iTreg是否保持了其抑制功能。为此，从经抗IL10mAb预处理的小鼠纯化CD4+CD25-GFp+
iTreg并与应答CD4+T细胞一起共同培养。结果显示，IL-10信号的阻断可部分破坏iTreg功
能(图12B)，并且这种下调与iTreg分泌的IL-10减少有关(图12C)。
[0286] 实施例18
[0287] DC分泌的TGF-β1直接将初始T细胞转化为iTreg
[0288] 据报道，TGF-β和IL-10的阻断可破坏iTreg的发育和抑制功能。另外，探究了这些细胞因子发挥其作用的阶段。用DCreg诱导iTreg，并如图6a所示在不同阶段阻断了TGF-β和
IL-10。在DCreg体外诱导iTreg期间检测了TGF-β和IL-10的作用。如图13A中的阶段1，与
+ + -
CD11C DCreg共同培养72h后，在抗IL-10或抗TGF-β存在下每两天检测CD4CD25T细胞中的
GFP表达3次。用DNA和同源蛋白预处理这些DCreg48h。如图13B所示，TGF-β而非IL-10的阻断可减少CD4+CD25-GFP+iTreg的生成。为确认TGF-b在Foxp3诱导中的重要作用，使用SB-
525334(一种强效的TGFβ受体激酶抑制剂)阻断TGF-β信号途径。如图20所示，TGF-β受体的阻断可降低iTreg诱导。为了检测中和IL-10时iTreg的抑制作用，在抗IL-10的存在下诱导
与iTreg共同培养的应答T细胞的增殖。中和IL-10对iTreg功能没有影响(图21)。
IL-10。在DCreg体外诱导iTreg期间检测了TGF-β和IL-10的作用。如图13A中的阶段1，与
+ + -
CD11C DCreg共同培养72h后，在抗IL-10或抗TGF-β存在下每两天检测CD4CD25T细胞中的
GFP表达3次。用DNA和同源蛋白预处理这些DCreg48h。如图13B所示，TGF-β而非IL-10的阻断可减少CD4+CD25-GFP+iTreg的生成。为确认TGF-b在Foxp3诱导中的重要作用，使用SB-
525334(一种强效的TGFβ受体激酶抑制剂)阻断TGF-β信号途径。如图20所示，TGF-β受体的阻断可降低iTreg诱导。为了检测中和IL-10时iTreg的抑制作用，在抗IL-10的存在下诱导
与iTreg共同培养的应答T细胞的增殖。中和IL-10对iTreg功能没有影响(图21)。
[0289] 虽然已经证明TGF-β1将外周初始CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+Treg，但是其对单独CD4+CD25-T细胞中Foxp3表达的诱导在很大程度上未知。为研究在抗原刺激存在下，单
独的TGF-β1是否能够诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg，分别在TGF-β1存在或不存在时用抗CD3和抗CD28处理从Foxp3gfp小鼠分离的CD4+CD25-初始T细胞。如图13C所示，在TGF-β1的存在下，在CD25-T细胞中，GFP表达以剂量依赖方式上调。为测试IL-10对Foxp3表达是否具有与TGF-
β1的相似或协同作用，在上述体系中添加IL-10。如图13D所描绘，IL-10既不单独影响Foxp3的表达，也不具有与TGF-β1的协同作用。总之，由TGF-β而非树突细胞分泌的IL-10直接诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg。
独的TGF-β1是否能够诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg，分别在TGF-β1存在或不存在时用抗CD3和抗CD28处理从Foxp3gfp小鼠分离的CD4+CD25-初始T细胞。如图13C所示，在TGF-β1的存在下，在CD25-T细胞中，GFP表达以剂量依赖方式上调。为测试IL-10对Foxp3表达是否具有与TGF-
β1的相似或协同作用，在上述体系中添加IL-10。如图13D所描绘，IL-10既不单独影响Foxp3的表达，也不具有与TGF-β1的协同作用。总之，由TGF-β而非树突细胞分泌的IL-10直接诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg。
[0290] 实施例19
[0291] 自分泌IL-10调节联合免疫中DCreg的功能
[0292] 基于以上结果，IL-10有助于诱导联合免疫中iTreg的抑制功能，但是并不直接对CD4+CD25-初始T细胞发挥其作用。因此，进一步检查了自分泌IL-10与DC功能的相关性。为
此，如图13A所示，在阶段2检查了经抗IL-10或抗TGF-β预处理的DC指导初始T细胞分化的能
力。在抗IL-10或抗TGF-β存在下用Derp1质粒和重组蛋白刺激初始CDllC+树突细胞，然后分
3次将这些DCreg添加到初始CD4+CD25-T细胞中。如图14A所示，不阻断内源IL-10或TGF-β可
+ - +
使DCreg诱导CD4 CD25 Foxp3 iTreg的能力变化。通过与应答T细胞一起共同培养来测试由
不同树突细胞诱导的iTreg的功能结果。由结果发现，经抗IL-10预处理的树突细胞生成的
iTreg的抑制能力显著降低(图14B)。自分泌IL-10可上调IL-10R表达，并因此在联合免疫后
的不同天数检查IL-10R表达。如图14C所示，结果证明，联合免疫后细胞表面IL-10R的量增
加，并在第3天达到峰值水平。为确认IL-10R的功能，通过经siRNA进行IL-10R的树突细胞敲
低测定iTreg诱导功能。通过FACS评估对IL-10R表达的抑制作用(图22)。如图14D和E所示，
在不存在IL-10R的情况下，树突细胞降低了增强iTreg抑制功能的能力，但是不影响Foxp3
诱导。IL-10与其受体的结合导致JAK1和酪氨酸激酶2的活化，然后导致STAT-1和STAT-3的
募集和磷酸化。对Dcreg中的蛋白表达进行Western印迹分析，并发现通过DNA和蛋白同时刺
激后抑制了STAT-1的磷酸化，接着CD40下调。概括地说，自分泌IL-10和IL-10R作为DCreg发
育的相关调节环。
此，如图13A所示，在阶段2检查了经抗IL-10或抗TGF-β预处理的DC指导初始T细胞分化的能
力。在抗IL-10或抗TGF-β存在下用Derp1质粒和重组蛋白刺激初始CDllC+树突细胞，然后分
3次将这些DCreg添加到初始CD4+CD25-T细胞中。如图14A所示，不阻断内源IL-10或TGF-β可
+ - +
使DCreg诱导CD4 CD25 Foxp3 iTreg的能力变化。通过与应答T细胞一起共同培养来测试由
不同树突细胞诱导的iTreg的功能结果。由结果发现，经抗IL-10预处理的树突细胞生成的
iTreg的抑制能力显著降低(图14B)。自分泌IL-10可上调IL-10R表达，并因此在联合免疫后
的不同天数检查IL-10R表达。如图14C所示，结果证明，联合免疫后细胞表面IL-10R的量增
加，并在第3天达到峰值水平。为确认IL-10R的功能，通过经siRNA进行IL-10R的树突细胞敲
低测定iTreg诱导功能。通过FACS评估对IL-10R表达的抑制作用(图22)。如图14D和E所示，
在不存在IL-10R的情况下，树突细胞降低了增强iTreg抑制功能的能力，但是不影响Foxp3
诱导。IL-10与其受体的结合导致JAK1和酪氨酸激酶2的活化，然后导致STAT-1和STAT-3的
募集和磷酸化。对Dcreg中的蛋白表达进行Western印迹分析，并发现通过DNA和蛋白同时刺
激后抑制了STAT-1的磷酸化，接着CD40下调。概括地说，自分泌IL-10和IL-10R作为DCreg发
育的相关调节环。
[0293] 该实施例证明，用DNA和蛋白疫苗同时联合免疫诱导了展现出CD4+CD25-Foxp3+表型的抑制CD4T细胞亚群。在肺部由HDM诱导的变应性免疫应答中，评估了联合免疫的免疫调
节作用。结果表明，联合免疫可能不仅有助于显著限制肺部的炎症反应，而且有助于Th2细
胞因子的抑制和IgE的生成。
节作用。结果表明，联合免疫可能不仅有助于显著限制肺部的炎症反应，而且有助于Th2细
胞因子的抑制和IgE的生成。
[0294] 在功能上，当与CD4+CD25-应答T细胞一起共同培养时，CD4+CD25-GFp+和CD4+CD25+GFp+Treg均可抑制靶T细胞的增殖。因为CD4+CD25+T细胞的百分比和Foxp3表达无明显上调，
所以这种抑制活性可能主要归因于赋能细胞的CD25-亚群。另外，用抗CD25mAb阻断CD4+CD25
+
T细胞不可逆转经联合免疫诱导的免疫耐受。
所以这种抑制活性可能主要归因于赋能细胞的CD25-亚群。另外，用抗CD25mAb阻断CD4+CD25
+
T细胞不可逆转经联合免疫诱导的免疫耐受。
[0295] 通过FACS分析，iTreg表型为CD4+CD25-Foxp3+CTLA4-GITR-PD-1-。在表面存在这些熟知的nTreg标记的低表达，表明iTreg主要通过抑制细胞因子，而非细胞与细胞的接触发
挥其作用。为确认这种结论，在transwell板中培养iTreg和应答T细胞，并添加IL-10或TGF-
βmAb。结果证明，iTreg的抑制功能不依赖于IL-10。
挥其作用。为确认这种结论，在transwell板中培养iTreg和应答T细胞，并添加IL-10或TGF-
βmAb。结果证明，iTreg的抑制功能不依赖于IL-10。
[0296] Foxp3通过形成与CD25、CTLA-4和GITR靶基因的启动子结合的NFAT：Foxp3复合物而调节小鼠体内CD25的表达。另外，ChIP分析还显示，当NFAT活化时稳定了Foxp3与IL-2R
(CD25)、CTLA-4和Treg中其他靶基因的结合。因此，假设在Foxp3的存在下，在NFAT1减少中
涉及CD25、GITR和CTLA-4的下调。可将NFAT活化评估为NFAT的核易位。为测试在CD4+CD25-
GFP+和CD4+CD25+GFP+T细胞中NFAT活化不同的假设，对得自这些细胞的分离核和细胞质溶
解产物进行免疫印迹分析。在存在刺激的情况下，在CD4+CD25-GFP-和CD4+CD25-GFP+T细胞中仅发现低水平的核NFAT1。相反，在CD4+CD25+GFp+nTreg中检测到较高水平的核NFAT1。相应
地，在CD4+CD25+GFP+的细胞质部分中看到比CD4+CD25-GFP+和CD4+CD25-GFP-T细胞中水平更
低的NFAT1(图14D)，表明在T细胞或CD4+CD25-GFP+iTreg中保持NFAT1呈其非活性状态。另一
方面，在CD4+CD25+nTreg发育中通过Smad3和NFAT2的协作来诱导Foxp3表达。因此分析了核
NFAT2的水平。正如预期，不论CD25是否表达，在得自CD4+GFP+T细胞的核部分中NFAT2的水平可检测。在所有这三种亚型的T细胞中不可检测到细胞质溶解产物中的NFAT2。总之，这些数
据说明了与CD4+CD25+Foxp3+nTreg和CD25-Th细胞相比，对CD4+CD25-Foxp3+iTreg中NFAT活
化的差异性调节。
(CD25)、CTLA-4和Treg中其他靶基因的结合。因此，假设在Foxp3的存在下，在NFAT1减少中
涉及CD25、GITR和CTLA-4的下调。可将NFAT活化评估为NFAT的核易位。为测试在CD4+CD25-
GFP+和CD4+CD25+GFP+T细胞中NFAT活化不同的假设，对得自这些细胞的分离核和细胞质溶
解产物进行免疫印迹分析。在存在刺激的情况下，在CD4+CD25-GFP-和CD4+CD25-GFP+T细胞中仅发现低水平的核NFAT1。相反，在CD4+CD25+GFp+nTreg中检测到较高水平的核NFAT1。相应
地，在CD4+CD25+GFP+的细胞质部分中看到比CD4+CD25-GFP+和CD4+CD25-GFP-T细胞中水平更
低的NFAT1(图14D)，表明在T细胞或CD4+CD25-GFP+iTreg中保持NFAT1呈其非活性状态。另一
方面，在CD4+CD25+nTreg发育中通过Smad3和NFAT2的协作来诱导Foxp3表达。因此分析了核
NFAT2的水平。正如预期，不论CD25是否表达，在得自CD4+GFP+T细胞的核部分中NFAT2的水平可检测。在所有这三种亚型的T细胞中不可检测到细胞质溶解产物中的NFAT2。总之，这些数
据说明了与CD4+CD25+Foxp3+nTreg和CD25-Th细胞相比，对CD4+CD25-Foxp3+iTreg中NFAT活
化的差异性调节。
[0297] 上述结果说明，TGF-β1有助于联合免疫中CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达。当存在抗TGF-β1中和抗体时影响了iTreg的生成。在体外DCreg诱导的iTreg的引发期间在不同阶
+ +
段阻断了TGF-β1。结果证明，分泌TGF-β1的DC直接诱导CD4CD25-Foxp3iTreg。另外，在涉及抗CD3和抗CD28刺激的条件下，TGF-β1也可诱导在单独CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达。与
TGF-β1不同，在CD4+CD25-T细胞中IL-10不能诱导Foxp3，但是IL-10的阻断可破坏iTreg的抑制功能。结果证明，IL-10有助于引发iTreg的抑制能力。自分泌IL-10削弱树突细胞DC源免
疫应答。分别在初始T细胞和DC上阻断IL-10作用。结果显示，IL-10有助于诱导未成熟的树
突细胞，然后增强iTreg的抑制能力，而不直接影响iTreg。
+ +
段阻断了TGF-β1。结果证明，分泌TGF-β1的DC直接诱导CD4CD25-Foxp3iTreg。另外，在涉及抗CD3和抗CD28刺激的条件下，TGF-β1也可诱导在单独CD4+CD25-T细胞中的Foxp3表达。与
TGF-β1不同，在CD4+CD25-T细胞中IL-10不能诱导Foxp3，但是IL-10的阻断可破坏iTreg的抑制功能。结果证明，IL-10有助于引发iTreg的抑制能力。自分泌IL-10削弱树突细胞DC源免
疫应答。分别在初始T细胞和DC上阻断IL-10作用。结果显示，IL-10有助于诱导未成熟的树
突细胞，然后增强iTreg的抑制能力，而不直接影响iTreg。
[0298] 概括地说，该实施例证明，用Der-p1DNA疫苗及其同源重组蛋白的联合免疫方法诱导了CD4+CD25-Foxp3+iTreg。在联合免疫中，TGF-β1和IL-10均是这些iTreg发育的关键因
素。另外，TGF-β1和IL-10对CD4+CD25-Foxp3+iTreg的发育和抑制功能发挥其作用。因为联合免疫通过TGF-β1和IL-10诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg，这公开了用于治疗自身免疫性、慢性
炎症和变应性疾病的新型治疗方案。
素。另外，TGF-β1和IL-10对CD4+CD25-Foxp3+iTreg的发育和抑制功能发挥其作用。因为联合免疫通过TGF-β1和IL-10诱导CD4+CD25-Foxp3+iTreg，这公开了用于治疗自身免疫性、慢性
炎症和变应性疾病的新型治疗方案。
[0299] 实施例20
[0300] 用于实施例21-26的方法和材料
[0301] 小鼠和试剂。
[0302] 雌性BALB/c和C57BL/6小鼠(8-10周龄)得自中国医学科学院动物研究所(中国北京)。所有动物均接受无病原体的水和食物。
[0303] 从BD Biosciences(San Diego，CA，USA)购买F1exset IL-10和荧光标记的抗小鼠单克隆抗体，包括抗IL-10-藻红蛋白(PE)、抗FoxP3-别藻蓝蛋白(APC)、抗IL-10-APC、抗
CD40-APC、抗CD11c-APC、抗CD11c-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗CD40-PE和同种型对照。从
Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)购买Alexa Fluor546(AF)标记的山羊抗兔IgG。从
Molecular Probes(Eugene，OR，USA)获得羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)。从Santa Cruz
Biotechnology(Santa CruZ，CA，USA)购买抗IRAK-1、小窝蛋白-1、磷酸-小窝蛋白-1Tyr14、ser536 Tyr701
Tollip、SOCS-1、NF-κB p65、磷酸-NF-κB p65 、STAT-1α、磷酸-STAT-1α 和-STAT-1
αSer727、CD40、GAPDH和组蛋白的抗体。从Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo，USA)购买大肠杆菌LPS、5-(N，N-二甲基)阿米洛利盐酸盐、单丹磺酰尸胺(MDC)和菲律平。
CD40-APC、抗CD11c-APC、抗CD11c-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗CD40-PE和同种型对照。从
Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)购买Alexa Fluor546(AF)标记的山羊抗兔IgG。从
Molecular Probes(Eugene，OR，USA)获得羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)。从Santa Cruz
Biotechnology(Santa CruZ，CA，USA)购买抗IRAK-1、小窝蛋白-1、磷酸-小窝蛋白-1Tyr14、ser536 Tyr701
Tollip、SOCS-1、NF-κB p65、磷酸-NF-κB p65 、STAT-1α、磷酸-STAT-1α 和-STAT-1
αSer727、CD40、GAPDH和组蛋白的抗体。从Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo，USA)购买大肠杆菌LPS、5-(N，N-二甲基)阿米洛利盐酸盐、单丹磺酰尸胺(MDC)和菲律平。
[0304] 疫苗制剂。
[0305] 通过消化分别将完整鸡卵清蛋白(OVA)的编码DNA序列或其优势表位(在aa323339区)插入pVAX1(Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA，USA)的Xba I和Hind III位点来获得DNA疫
苗、pVAX-OVA(指定为pOVA)和pVAX-OVA323(指定为pOVA323)。将OVA编码序列的反向链克隆
至pVAX中并获得非表达pVAX-OVArev(指定为pOVArev)。制备编码小鼠透明带3(ZP3)的pcD-
mZP3和在大肠杆菌中表达的mZP3重组蛋白并在我们先前的报道13中有描述。从Sigma-
Aldrich购买OVA并由吉尔生化有限公司(中国上海)合成OVA肽(aa323-339，命名为OVA323)
或FITC标记的OVA323。用无内毒素质粒大量提取试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)
(QIAGEN，Tokyo，Japan)纯化全部质粒以去除内毒素并通过按2mg/ml溶于PBS中用作DNA疫
苗。按2mg/ml将重组蛋白和肽溶于PBS中并通过过滤除菌。
苗、pVAX-OVA(指定为pOVA)和pVAX-OVA323(指定为pOVA323)。将OVA编码序列的反向链克隆
至pVAX中并获得非表达pVAX-OVArev(指定为pOVArev)。制备编码小鼠透明带3(ZP3)的pcD-
mZP3和在大肠杆菌中表达的mZP3重组蛋白并在我们先前的报道13中有描述。从Sigma-
Aldrich购买OVA并由吉尔生化有限公司(中国上海)合成OVA肽(aa323-339，命名为OVA323)
或FITC标记的OVA323。用无内毒素质粒大量提取试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)
(QIAGEN，Tokyo，Japan)纯化全部质粒以去除内毒素并通过按2mg/ml溶于PBS中用作DNA疫
苗。按2mg/ml将重组蛋白和肽溶于PBS中并通过过滤除菌。
[0306] JAWS II树突细胞的培养和刺激。
[0307] 从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)购买JAWS II小鼠DC系并保持于含有具有核糖核苷、脱氧核糖核苷、4mML-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠(Invitrogen Inc.，
Carlsbad，CA，USA)的最低必需培养基(MEM)α并且补充了20％胎牛血清(ATCC)和5ng/ml鼠
重组GM-CSF(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)的完全生长培养基中。在37℃、5％CO2下培育细胞并用不同抗原(10μg/ml)，例如pVAX、pOVA、OVA、pOVA323和OVA323处理24h。对于抑制剂处理，在37℃下分别用菲律平(10μg/ml)、MDC(50μM)预处理JAWSII细胞30分钟，或在37℃下用阿米洛利(5mM)预处理JAWS II细胞10分钟，并用培养基洗涤，然后用抗原刺激。
Carlsbad，CA，USA)的最低必需培养基(MEM)α并且补充了20％胎牛血清(ATCC)和5ng/ml鼠
重组GM-CSF(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)的完全生长培养基中。在37℃、5％CO2下培育细胞并用不同抗原(10μg/ml)，例如pVAX、pOVA、OVA、pOVA323和OVA323处理24h。对于抑制剂处理，在37℃下分别用菲律平(10μg/ml)、MDC(50μM)预处理JAWSII细胞30分钟，或在37℃下用阿米洛利(5mM)预处理JAWS II细胞10分钟，并用培养基洗涤，然后用抗原刺激。
[0308] JAWS II中Cav-1和Tollip的沉默和用DNA和蛋白处理
[0309] 用10μg/ml pOVA323和OVA323或pVAX和OVA323共同处理野生型(WT)或Cav-1和/或Tollip缺陷型DC24h。对于DCreg的体外功能，从通过弗氏不完全佐剂(IFA)中的OVA免疫的
小鼠脾脏中纯化CD4+T细胞并用CFSE标记。CFSE-CD4+T细胞与经共同处理的DC一起共同培
养5天，然后检测T细胞增殖和Foxp3和IL-10表达。对于DCreg的体内功能，将2×106个经共
同处理的DC转移至同基因C57BL/6小鼠体内并在第0和7天用IFA中的OVA使这些小鼠免疫。
在第14天，向足垫部位为小鼠注射25μg OVA以测试迟发型超敏(DTH)反应。在第15天，处死
小鼠以检测T细胞增殖和Foxp3和IL-10表达。
小鼠脾脏中纯化CD4+T细胞并用CFSE标记。CFSE-CD4+T细胞与经共同处理的DC一起共同培
养5天，然后检测T细胞增殖和Foxp3和IL-10表达。对于DCreg的体内功能，将2×106个经共
同处理的DC转移至同基因C57BL/6小鼠体内并在第0和7天用IFA中的OVA使这些小鼠免疫。
在第14天，向足垫部位为小鼠注射25μg OVA以测试迟发型超敏(DTH)反应。在第15天，处死
小鼠以检测T细胞增殖和Foxp3和IL-10表达。
[0310] 对细胞因子的半定量RT-PCR分析。
[0311] 使用TRIzol试剂(Promega，Wisconsin，USA)从约5×106个细胞分离出总RNA。通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞因子特异性mRNA的量。使用次黄嘌呤磷酸核
糖基转移酶(HPRT)、管家基因或细胞因子基因的引物。表S1中列出了引物的序列和PCR条
件。
糖基转移酶(HPRT)、管家基因或细胞因子基因的引物。表S1中列出了引物的序列和PCR条
件。
[0312] Western印迹。
[0313] 通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品，接着转移至硝化纤维素膜上并用作为上样参考的特异性抗体和抗肌动蛋白Ab检测。对于NF-κ3
的检测，如所述14提取了细胞质和核蛋白。通过免疫印迹分析核和细胞质提取物。用ECL
(GEHealthcare Europe，Uppsala，Sweden)方法进行蛋白检测。
的检测，如所述14提取了细胞质和核蛋白。通过免疫印迹分析核和细胞质提取物。用ECL
(GEHealthcare Europe，Uppsala，Sweden)方法进行蛋白检测。
[0314] 对小鼠炎症性支气管炎和自身免疫性卵巢疾病(AOD)的诱导
[0315] 如先前所述并做一些修改12，15对BALB/c小鼠诱导炎症性支气管炎。简言之，在第0和7天经腹膜内为小鼠注射100μg OVA(0.1ml在PBS中的1mg/ml OVA/明矾复合物)。接着在
第14、16和18天经气管内向每只动物递送100μg(100ul，1mg/ml)OVA。对照小鼠接受PBS。如先前所述11对C57BL/6小鼠诱导AOD。
第14、16和18天经气管内向每只动物递送100μg(100ul，1mg/ml)OVA。对照小鼠接受PBS。如先前所述11对C57BL/6小鼠诱导AOD。
[0316] 组织学分析。
[0317] 将肺部或卵巢在4％多聚甲醛或布安溶液(Bouin's solution)中固定并包埋在石蜡块中。切片并用苏木精和伊红(H&E)染色。在光学显微镜下评估肺部或卵巢的组织病理
学。
学。
[0318] 流式细胞术(FACS)分析。
[0319] 根据先前的研究，在4℃下用PBS中的适当PE、FITC或APC偶联mAb对DC或T细胞染色30分钟。用FlowJo分析细胞。
[0320] 如之前所述16，17，使用多重流式细胞测定(Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒，BDBiosciences)测试免疫小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF)-γ、IL-4、IL-5和干扰素(IFN)-
γ的生成。
γ的生成。
[0321] 统计学。
[0322] 用学生t检验进行数据分析。如果p＜0.05，则认为差异具有统计显著性。
[0323] 实施例21
[0324] CD40low是联合免疫诱导DCreg的标志
[0325] 我们之前证明了在序列匹配DNA和蛋白免疫原8联合免疫后在体内诱导了CDllc+CD401owIL-10high DCreg。为测试低CD40表达是否是联合免疫诱导DCreg的可靠表型，构造
编码全长鸡卵清蛋白(pOVA)的真核表达构建体并与蛋白(OVA)组合使用。我们向一组小鼠
经肌肉内共同注射pOVA和OVA(pOVA+OVA)。作为基因特异性的对照，向另一组小鼠共同注射
含有OVA非编码链的DNA构建体(pOVArev)和OVA(pOVArev+OVA)。在第2天，从两个组和一组
未注射小鼠(首次接受实验)分离DC，并通过FACS比较其CD40的表达。pOVA+OVA组中CD40的
表达比首次接受实验的组高，但是比pOVArev+OVA组低(图30A)，确认了CD40l哺表型。我们还测试了DNA和蛋白免疫原的另外组合，其由编码鼠ZP3的DNA构建体和ZP3蛋白组成，并观察
到了相似结果(图30A)。这些结果表明，低CD40表达是经序列匹配DNA和蛋白免疫原联合免
疫诱导的一致表型。
编码全长鸡卵清蛋白(pOVA)的真核表达构建体并与蛋白(OVA)组合使用。我们向一组小鼠
经肌肉内共同注射pOVA和OVA(pOVA+OVA)。作为基因特异性的对照，向另一组小鼠共同注射
含有OVA非编码链的DNA构建体(pOVArev)和OVA(pOVArev+OVA)。在第2天，从两个组和一组
未注射小鼠(首次接受实验)分离DC，并通过FACS比较其CD40的表达。pOVA+OVA组中CD40的
表达比首次接受实验的组高，但是比pOVArev+OVA组低(图30A)，确认了CD40l哺表型。我们还测试了DNA和蛋白免疫原的另外组合，其由编码鼠ZP3的DNA构建体和ZP3蛋白组成，并观察
到了相似结果(图30A)。这些结果表明，低CD40表达是经序列匹配DNA和蛋白免疫原联合免
疫诱导的一致表型。
[0326] 我们接下来在培养物中用原代DC和DC系JAWS II重复实验。我们将pOVA和OVA或pVAX和OVA(对照)直接添加到新分离的CDllc+细胞和JAWS II细胞中24h。结果显示，在两种
细胞类型中，在pOVA+OVA处理后CD40表达比在对照处理后低(图30B)，表明也可在培养的原
代DC和DC系中体外诱导CD40low表型。
细胞类型中，在pOVA+OVA处理后CD40表达比在对照处理后低(图30B)，表明也可在培养的原
代DC和DC系中体外诱导CD40low表型。
[0327] 我们先前的研究显示，经联合免疫在体内诱导的DCreg可在体内和体外将初始T细胞转化为Treg8。为确定体外诱导的CD40low DC是否也可一样，我们通过使其与得自OVA致敏
low
的CFSE标记同基因CD4+T细胞共同培养测试了CD40 JAWS II细胞的活性。共同培养5天
后，分析CFSE+细胞中Foxp3和IL-10的表达。结果显示，CD40lowJAWS II细胞引起Foxp3+和
IL-10+T细胞扩增(图30C)，确认了体外生成的CD40low DC实际上是DCreg。
low
的CFSE标记同基因CD4+T细胞共同培养测试了CD40 JAWS II细胞的活性。共同培养5天
后，分析CFSE+细胞中Foxp3和IL-10的表达。结果显示，CD40lowJAWS II细胞引起Foxp3+和
IL-10+T细胞扩增(图30C)，确认了体外生成的CD40low DC实际上是DCreg。
[0328] 因为CD40low表型的出现需要DNA和蛋白之间序列匹配，所以推测可能需要由相同DC摄取DNA和蛋白。为测试这一假设，用具有FITC的Cv5和OVA323(OVA323-339肽)标记
POVA323(编码OVA323-339优势表位的DNA构建体)和pVAX(空载体)。如图30D所描绘，如通过
共聚焦显微镜术所观察到的，仅在摄取Cy5-POVA323和FITC-OVA323的单独DC中观察到CD40
的低表达。总之，这些结果表明，CD40low是由联合免疫生成的DCreg的可靠标志，因为这种标志的呈现需要共同摄取序列匹配DNA和蛋白免疫原。
POVA323(编码OVA323-339优势表位的DNA构建体)和pVAX(空载体)。如图30D所描绘，如通过
共聚焦显微镜术所观察到的，仅在摄取Cy5-POVA323和FITC-OVA323的单独DC中观察到CD40
的低表达。总之，这些结果表明，CD40low是由联合免疫生成的DCreg的可靠标志，因为这种标志的呈现需要共同摄取序列匹配DNA和蛋白免疫原。
[0329] 实施例22
[0330] DC通过网格蛋白和小窝介导的内吞作用共同摄取DNA和蛋白免疫原
[0331] DC通过各种机制，包括网格蛋白介导的内吞作用、小窝介导的内吞作用和巨胞饮作用摄取外源性抗原。为明确DNA和蛋白免疫原的共同摄取涉及哪些途径，在用pOVA323+
OVA323处理之前，用MDC(网格蛋白形成的特异性抑制剂)或菲律平(小窝运输的抑制剂)预处
理JAWS II细胞。使用CD40low作为标志，我们发现，虽然MIDC和菲律平均可防止CD40low表型，但是菲律平比MDC更有效。这表明，CD40low表型主要是小窝介导的内吞作用的结果(图31，A
和B)。另一种抑制剂阿米洛利(巨胞饮作用的抑制剂)对CD40表达没有影响(图37)。
OVA323处理之前，用MDC(网格蛋白形成的特异性抑制剂)或菲律平(小窝运输的抑制剂)预处
理JAWS II细胞。使用CD40low作为标志，我们发现，虽然MIDC和菲律平均可防止CD40low表型，但是菲律平比MDC更有效。这表明，CD40low表型主要是小窝介导的内吞作用的结果(图31，A
和B)。另一种抑制剂阿米洛利(巨胞饮作用的抑制剂)对CD40表达没有影响(图37)。
[0332] 实施例23
[0333] 联合免疫通过活化负信号转导途径下调NF-KB和STAT-1α
[0334] 转录因子NF-κB调节CD40的表达，而IRAK-1调节NF-κB的活化。有趣的是，先前经证实小窝的一种组分小窝蛋白-1(Cav-1)与Tollip形成复合物以抑制在稳态条件下的IRAK-1s激酶活性。我们发现，与从经pOVA、OVA或pVAX+OVA处理的小鼠分离的脾脏DC相比，在从经pOVA+OVA处理的小鼠分离的脾脏DC中Cav-1Tyr14的磷酸化受强烈抑制(图32A)。在培养物
中供给了pOVA+OVA的JAWS II细胞中也看到缺乏磷酸化的Cav-1(图38A)。
中供给了pOVA+OVA的JAWS II细胞中也看到缺乏磷酸化的Cav-1(图38A)。
[0335] 之后，我们研究了响应于pOVA+OVA联合免疫在脾脏DC中Tollip的表达和IRAK-1的活化。我们观察到，在联合免疫小鼠中Tollip、TGF-γ和IL-10的转录也上调；然而CD40和
TNF-γ的转录下调(图32B)。在培养物中供给了pOVA+OVA的JAWS II细胞中也观察到相似结
果(图38B)。联合免疫小鼠中IRAK-1的磷酸化也受显著抑制(图32A)，这与Cav-1磷酸化抑制
和Tollip增多很好吻合。
TNF-γ的转录下调(图32B)。在培养物中供给了pOVA+OVA的JAWS II细胞中也观察到相似结
果(图38B)。联合免疫小鼠中IRAK-1的磷酸化也受显著抑制(图32A)，这与Cav-1磷酸化抑制
和Tollip增多很好吻合。
[0336] 因为SOCS负向调节IRAK和JAK-STAT途径的活化，所以分析了SOCSl蛋白的水平。响应于pOVA+OVA联合免疫，SOCSl显著增多(图32A)。总之，这些结果表明，联合免疫改变了
Cav-1的磷酸化和Tollip和SOCSl的表达以活化负信号转导。
Cav-1的磷酸化和Tollip和SOCSl的表达以活化负信号转导。
[0337] 接下来，分析了转录因子NF-κ3和STAT-1α的活化。在pOVA+OVA联合免疫小鼠中NF-KB p65Ser536和STAT-1αTyr701的磷酸化受强烈抑制(图32C)。因为在联合免疫组中，核中NF-κB p65和STAT-1α的浓度降低，所以NF-KB和STAT-1α的易位也受到抑制(图32D)，表明联合免疫后NF-KB和STAT-1o的活化下调。
[0338] 总之，这些结果证明，联合免疫活化了Cav-1介导的负向途径，导致NF-κ3和STAT-1α的活性下调并且CD40表达减少。
[0339] 实施例24
[0340] 使Cav-1和Tollip沉默防止了DCreg的诱导
[0341] 为了确定Cav-1和Tollip在DCreg诱导中的作用，我们使用RNA干扰(RNAi)使Cav-1和Tollip的表达沉默。对于JAWS II细胞中的两种基因而言，RNAi效率达到约80％(图39A)。
当供给pOVA323+OVA323时，通过依据沉默后CD40表达增加和IL-10生成减少判断，Cav-1和
Tollip的沉默彻底防止了JAWS II细胞分化为DCreg，然而单独的Cav-1或Tollip的沉默部
分有效(图33a)。进一步地，Cav-1沉默后，NF-KB的易位增强而Tollip的生成减少(图39B)。
当供给pOVA323+OVA323时，通过依据沉默后CD40表达增加和IL-10生成减少判断，Cav-1和
Tollip的沉默彻底防止了JAWS II细胞分化为DCreg，然而单独的Cav-1或Tollip的沉默部
分有效(图33a)。进一步地，Cav-1沉默后，NF-KB的易位增强而Tollip的生成减少(图39B)。
[0342] 在功能上，在共同培养测定中Cav-1和/或Tollip缺陷型和经pOVA323+OVA323处理的JAWS II细胞不能抑制应答T细胞的增殖，或诱导iTreg转化或IL-10表达(图33B)。这些数
据显示，联合免疫后Cav-1和Tollip均在DCreg表型的诱导和功能上起关键作用。
据显示，联合免疫后Cav-1和Tollip均在DCreg表型的诱导和功能上起关键作用。
[0343] 实施例25
[0344] Cav-1和/或Tollip缺陷型DC在体内并无致耐受性
[0345] 为确定Cav-1和/或Tollip缺陷型JAWS II细胞是否已经失去其在体内促进耐受性的能力，在用pOVA323+OVA323处理后我们将其转化至同基因小鼠体内。然后用IFA中的OVA通
过免疫激发受体小鼠。虽然用经pOVA323+OVA323处理的野生型JAWS II细胞转化的对照小鼠
抑制了DTH和OVA反应性T细胞的诱导并增强了CD4+CD25-T细胞(CD25-iTreg)中Foxp3的表
达和IL-10的生成，但是沉默JAWS II并不如此(图34)。该结果确认了沉默JAWS II细胞无致
耐受性。
过免疫激发受体小鼠。虽然用经pOVA323+OVA323处理的野生型JAWS II细胞转化的对照小鼠
抑制了DTH和OVA反应性T细胞的诱导并增强了CD4+CD25-T细胞(CD25-iTreg)中Foxp3的表
达和IL-10的生成，但是沉默JAWS II并不如此(图34)。该结果确认了沉默JAWS II细胞无致
耐受性。
[0346] 实施例26
[0347] 联合免疫诱导的DCreg改善了小鼠的炎症性支气管炎和自身免疫性卵巢疾病
[0348] 为评估联合免疫诱导的DCreg作为炎症性和自身免疫性疾病的治疗剂的可能性，我们为培养的原代DC供给pOVA+OVA并使用所得DCreg治疗患有OVA诱导型炎症性支气管炎
的BALB/c小鼠(图35A)。过继转移DCreg使受体小鼠体内IgE的水平显著降低(图35B)。虽然
并未达到统计显著性，但是在受体小鼠体内IL-4和IL-5的水平也降低(图35C)。对得自小鼠
的肺部切片的组织学分析揭示出无细胞浸润的近正常肺部形态(图35D)。正如预期，如果用
菲律平预处理DC，则经pOVA+OVA处理的DC没有抗炎作用。
的BALB/c小鼠(图35A)。过继转移DCreg使受体小鼠体内IgE的水平显著降低(图35B)。虽然
并未达到统计显著性，但是在受体小鼠体内IL-4和IL-5的水平也降低(图35C)。对得自小鼠
的肺部切片的组织学分析揭示出无细胞浸润的近正常肺部形态(图35D)。正如预期，如果用
菲律平预处理DC，则经pOVA+OVA处理的DC没有抗炎作用。
[0349] 为确定是否可用DC系重现相似治疗效果，我们为培养的JAWSII细胞供给pcD-mZP3、编码小鼠ZP3蛋白的DNA构建体和mZP3蛋白(pcD-mZP3+mZP3)。将所得的DCreg过继转
移至患有mZP3诱导的自身免疫性卵巢疾病(AOD)的C57BL/6小鼠体内29(图36A)。随后，我们
观察到受体小鼠体内IFN-γ、IL-5和TNF-α生成减少(图36B)和AOD严重程度降低(图36C)。
对卵巢切片的组织学分析揭示无明显细胞浸润的近正常组织结构(图40)。对脾脏的FACS分
析进一步显示IL-10+和FoXp3+CD4+T细胞的频率增加(图36D)。总之，这些结果表明，通过为
原代DC或DC系供给序列匹配的DNA和蛋白免疫原在培养物中生成的DCreg可能对过继性免
疫疗法有用。
移至患有mZP3诱导的自身免疫性卵巢疾病(AOD)的C57BL/6小鼠体内29(图36A)。随后，我们
观察到受体小鼠体内IFN-γ、IL-5和TNF-α生成减少(图36B)和AOD严重程度降低(图36C)。
对卵巢切片的组织学分析揭示无明显细胞浸润的近正常组织结构(图40)。对脾脏的FACS分
析进一步显示IL-10+和FoXp3+CD4+T细胞的频率增加(图36D)。总之，这些结果表明，通过为
原代DC或DC系供给序列匹配的DNA和蛋白免疫原在培养物中生成的DCreg可能对过继性免
疫疗法有用。
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