生产过敏原提取物的方法
阅读：820发布：2020-07-04
专利汇可以提供生产过敏原提取物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 披露了用于生产天然的、脱色的以及聚合的过敏原提取物的多种方法。本发明进一步披露了经由这些方法所生产的多种提取物，以及用于诊断和 治疗 过敏症的包括这些提取物的多种药物和 疫苗 组合物。，下面是生产过敏原提取物的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于生产过敏原提取物的方法，包括：
a)使包括过敏原的一种源材料与一种液体提取剂接触以产生一种混合物，该混合物含有溶解在液相中的多种脂质和由包括多种过敏原和蛋白的源材料残余物组成的一种固相，b)使该混合物经历一个第一分离步骤以分离该源材料残余物，
c)使该源材料残余物与一种过敏原提取剂接触以产生溶解在液相中的多种过敏原与由非过敏原性残余物组成的一种固相的一种混合物，
d)使该混合物经历一个第二分离步骤以分离溶解在液相中的这些过敏原，从而产生一种粗过敏原提取物，
e)使该粗过敏原提取物经历一个低分子量部分去除步骤，以去除具有小于3.5kDa的分子大小的多种分子，
f)进行步骤e)，直至该过敏原提取物在3℃-5℃下的导电率低于1000μS/cm，从而获得一种纯化的天然过敏原提取物，
g)酸化该天然过敏原提取物至pH2到4.0，并且维持该酸化了的提取物5到30分钟，接着使该提取物经历一个低分子量部分去除步骤，以去除具有小于3.5kDa的分子大小的多种分子，并且调节该pH值至7.0-8.0，从而产生一种脱色的过敏原提取物，h)使一种脱色的过敏原提取物与戊二醛或甲醛接触，
i)使该脱色的过敏原提取物经历一个分子部分去除步骤，以去除具有小于100kDa的分子大小的多种分子，并且
j)进行步骤i)直至该过敏原提取物在3℃-5℃下的导电率低于210μS/cm和/或如通过UV或可见光扫描法所测定，该过敏原提取物中不存在戊二醛，以获得一种脱色的聚合过敏原提取物。
2.如权利要求1所述的一种方法，其中持续进行步骤e)和/或步骤g)中的所述低分子量部分去除步骤直至该导电率在3℃-5℃下低于500μS/cm。
3.如权利要求1所述的一种方法，其中酸化该天然过敏原提取物至pH 2到2.1。
4.如权利要求1所述的一种方法，其中酸化该天然过敏原提取物至pH2.0到3.0。
5.如权利要求1-4中任一项所述的一种方法，其中，以每分钟0.001-0.5ml的添加速率将所述醛添加至所述提取物。
6.如权利要求1-4中任一项所述的一种方法，其中，持续进行所述分子部分去除步骤直至所述导电率在3℃-5℃下在50至200μS/cm之间。
7.如权利要求1-4中任一项所述的一种方法，其中，所述低分子量部分去除步骤e)或g)包括超滤步骤或透滤步骤。
8.一种脱色的聚合过敏原提取物，根据如权利要求1-7所述的方法获得。
9.根据权利要求8所述的一种过敏原提取物，其中该源材料选自食物过敏原、通过空气传播的过敏原、真菌、螨、上皮过敏原以及昆虫过敏原。
10.根据权利要求9所述的一种过敏原提取物，其中，所述食物过敏原为花生。
11.根据权利要求9所述的一种过敏原提取物，其中，所述通过空气传播的过敏原为花粉。
12.根据权利要求9所述的一种过敏原提取物，其中，所述螨为尘螨。
13.根据权利要求9所述的一种过敏原提取物，其中，所述上皮过敏原为动物毛发或动物皮屑。
14.根据权利要求9所述的一种过敏原提取物，其中，所述真菌为霉菌。
15.根据权利要求9所述的一种过敏原提取物，其中，所述昆虫过敏原选自蟑螂毒液、蚤毒液、蜜蜂毒液以及胡蜂毒液。
16.根据权利要求11所述的一种过敏原提取物，其中，所述花粉选自树木的花粉、草的花粉和谷类植物的花粉。
17.根据权利要求16所述的一种过敏原提取物，其中，所述草的花粉为野草的花粉。
18.根据权利要求13所述的一种过敏原提取物，其中，所述动物毛发为猫的毛发或狗的毛发，所述动物皮屑为猫的皮屑或狗的皮屑。
19.如权利要求9所述的过敏原提取物，其中该源材料选自花生、花粉、螨以及上皮过敏原。
20.根据权利要求19所述的过敏原提取物，其中，所述花粉为齐墩果的花粉、欧蓍草的花粉、普通芦苇的花粉以及梯牧草的花粉。
21.根据权利要求19所述的过敏原提取物，其中，所述螨为屋尘螨。
22.根据权利要求19所述的过敏原提取物，其中，所述上皮过敏原为猫的皮屑。
23.一种根据权利要求8-22中任一项所述的过敏原提取物在制造用于治疗过敏症的药物中的应用。
24.一种药物组合物，包括根据权利要求8-22中任一项所述的过敏原提取物。
25.如权利要求24所述的药物组合物，进一步包括一种或多种佐剂、稀释剂、防腐剂或其混合物。
26.一种疫苗，包括根据权利要求8-22中任一项所述的过敏原提取物。
27.如权利要求26所述的疫苗，进一步包括一种或多种佐剂、稀释剂、防腐剂或其混合物。
生产过敏原提取物的方法
技术领域
背景技术
[0002] 过敏是免疫系统的一种获得性超敏失调并且由暴露于被称为过敏原的无害环境物质所引发。I型超敏反应是过敏反应的特征并且会引起过量的IgE抗体产生，这些IgE抗体反过来会使嗜碱细胞和肥大细胞活化，从而引起炎性反应。这些效应可能是全身性的，如血管舒张、粘液分泌、神经刺激以及平滑肌收缩，从而引起一种过敏反应(anaphylaxis reaction)，或者可能局限于身体的某一特定区域，例如呼吸系统。
[0003] 食物过敏是一个日益显现的主要公共健康问题，影响了约6％的学龄期儿童和约4％的成人，并且可能会造成严重的后果，包括致命的过敏反应(anaphylactic reaction)(1)
。因此，过敏可能会显著影响生活品质的诸多社会心理方面，超出了患者的过敏性症状的(2)
直接临床效果 和家庭的诸多日常活动。目前，针对这一类过敏的护理标准包括了严格避免诸多攻击性过敏原以及用肾上腺素进行治疗。
。因此，过敏可能会显著影响生活品质的诸多社会心理方面，超出了患者的过敏性症状的(2)
直接临床效果 和家庭的诸多日常活动。目前，针对这一类过敏的护理标准包括了严格避免诸多攻击性过敏原以及用肾上腺素进行治疗。
[0004] 花生过敏是一种因花生中的膳食物质引起免疫系统过度反应，而出现的I型超敏性(由IgE介导的)免疫反应。美国的哮喘和过敏基金会估计，在美国，花生过敏是最常见的与食物相关的死亡原因，且据估计，它影响着0.4％-0.6％的人口。树坚果(如美洲山核桃、开心果、松子以及核桃)也是常见的坚果过敏原。
[0005] 至今已从花生(落花生(Arachis hypogea))鉴别出十一种过敏原(Ara h1到Ara h 11)并且这些过敏原中有许多已被测序并且克隆。基于国际免疫学会联合会(International Union of Immunological Societies，IUIS)命名法，这些过敏原包括：Ara h 1，一个64kDa的Cupin蛋白(豌豆球蛋白型，7S球蛋白)；Ara h 2，一个17kDa的蓝豆蛋白(2S白蛋白)；Ara h 3，一个60kDa的Cupin蛋白(豆球蛋白型，11S球蛋白，大豆球蛋白)；Ara h 4，一个37kDa的Cupin蛋白(豆球蛋白型，11S，大豆球蛋白)；Ara h 5，一个
15kDa的肌动蛋白抑制蛋白(Profilin)；Ara h 6，一个15kDa的蓝豆蛋白(2S白蛋白)；Ara h 7，一个15kDa的蓝豆蛋白(2S白蛋白)；Ara h 8，一个17kDa的病程相关蛋白PR-10；Ara h 9，一个9.8kDa的非特异性脂质转运蛋白1；Ara h 10，一个16kDa的油体蛋白；以及Ara h 11，一个14kDa油体蛋白。
15kDa的肌动蛋白抑制蛋白(Profilin)；Ara h 6，一个15kDa的蓝豆蛋白(2S白蛋白)；Ara h 7，一个15kDa的蓝豆蛋白(2S白蛋白)；Ara h 8，一个17kDa的病程相关蛋白PR-10；Ara h 9，一个9.8kDa的非特异性脂质转运蛋白1；Ara h 10，一个16kDa的油体蛋白；以及Ara h 11，一个14kDa油体蛋白。
[0006] 对猫过敏是极为常见的，见于高达25％的患有过敏的人。对猫过敏比对狗的皮屑过敏更为常见，这可能涉及猫的毛发和皮屑作为过敏原的潜在性，以及一般不给猫洗澡的事实。产生大量猫过敏原，特别是雄性未被阉割过的猫，因为这个过敏原部分受到激素控制。皮屑常通过空气传播，有粘性，并且见于公共场所，甚至在没有猫时也有。这是因为皮屑被携带在有猫的人的衣服上，然后在公共场所中脱落。因此，猫过敏原是房屋粉尘的一种组分，甚至在从未有猫生活过的家中。猫皮屑颗粒的大小是极小的，并且会被深深地吸入肺中。因此，猫皮屑是过敏性哮喘的一种常见病因，并且对猫过敏的猫主人更倾向于发展诸多(8，9)哮喘症状 。
[0007] 主要的猫和狗的过敏原可以在毛发/皮屑提取物和唾液中见到，并且因此被认为是上皮过敏原。已在猫中鉴别出八种不同的过敏原，并且这些过敏原中有许多已被测序并i且克隆。基于IUIS网站 ，这些过敏原包括：Fel d 1，一个14kDa和4kDa的子宫珠蛋白；Fel d 2，一个69kDa的白蛋白；Fel d 3，一个11kDa的胱抑素；Fel d 4，一个22kDa的脂质运载蛋白；Fel d 5，一个400kDa的免疫球蛋白A；Fel d 6，一个800kDa-1000kDa的免疫球蛋白M；Fel d 7，一个17,5kDa的冯埃布纳腺(von Ebner gland)蛋白；Fel d 8，一个24kDa的Latherin样蛋白。主要的猫过敏原Fel d 1已通过蛋白和免疫化学技术来广泛地进行了表征，并且最近被表达为一种重组过敏原。Fel d 1代表一种约36kDa的二聚体，它是由(10)
两个17kd的亚基组成 。
两个17kd的亚基组成 。
[0008] 草过敏是最常见并且普遍的过敏形式之一，它在某些季节影响着具有该过敏病史的人。它在晚春和初夏的几个月内在空气中存在，此可能引起过敏性鼻炎、过敏性结膜炎以及哮喘。因坐在草地上或修剪草坪而使皮肤与草直接接触可能会引起皮肤瘙痒、荨麻疹以及特异性皮炎。最有代表性的物种之一是梯牧草(Phleum pratense)，被选为草组的主导品i种。已鉴别出这个物种梯牧草的九种不同的过敏原。基于过敏原网站 ，这些过敏原包括：
Phl p 1，一个27kDa的β-扩展蛋白；Phl p 2，一个10kDa-12kDa的草组II/III；Phl p 4，一个55kDa的蛋白；32kDa的Phl p 5；11kDa的Phl p 6；Phl p 7，一个6kDa的钙结合蛋白；Phl p 11，一个20kDa的Ole e 1相关蛋白；Phl p 12，一个14kDa的肌动蛋白抑制蛋白；以及Phl p 13，一个55kDa的聚半乳糖醛酸酶。
Phl p 1，一个27kDa的β-扩展蛋白；Phl p 2，一个10kDa-12kDa的草组II/III；Phl p 4，一个55kDa的蛋白；32kDa的Phl p 5；11kDa的Phl p 6；Phl p 7，一个6kDa的钙结合蛋白；Phl p 11，一个20kDa的Ole e 1相关蛋白；Phl p 12，一个14kDa的肌动蛋白抑制蛋白；以及Phl p 13，一个55kDa的聚半乳糖醛酸酶。
[0009] 芦苇属(Phragmites)是一种属于草组的属。已描述了若干物种，包括芦苇(P.australis)或普通芦苇(P.communis)。据报导，普通芦苇的花粉在不同地区是致敏的。授粉发生在夏秋之间，取决于纬度和海拔。
[0010] 已在芦苇属中鉴别出具有IgE结合能力的五种不同的蛋白。基于Allergome网i站 ，这些过敏原包括：30kDa的扩展蛋白；60kDa的属于第4草组的蛋白；35kDa的核糖核酸酶；14kDa的肌动蛋白抑制蛋白(profilun)；以及最后的聚半乳糖醛酸酶。
[0011] 豚草(豚草属(Ambrosia))是主要生长在中欧的野草。一株植物仅存活一季，但该植物会产生高达上千个花粉粒。日出之后的暧度、湿度以及微风会有助于释放这些花粉粒。直到现在，三个不同的物种已与过敏症状有关(豚草(Amborsia artemisiifolia)(短豚草)、多年生豚草(A.psilostachya)(西方豚草)、以及三裂叶豚草(A.trifida)(巨豚草))。已在短豚草中鉴别出十种不同的过敏原，并且这些过敏原中有许多已被测序并且克隆。在豚草的情况下，根据过敏原的国际命名法，这些过敏原被称为Amb a 1到Amb a i10。基于IUIS网站 ，这些过敏原包括：Amb a 1，一个38kDa的果胶裂解酶；Amb a 2，一个38kDa的果胶裂解酶；Amb a 3，一个11kDa的质体蓝素(plastocyanine)；Amb a 4，一个
30kDa的防御素样蛋白；5kDa的Amb a 5；Amb a 6，一个10kDa的脂质转运蛋白；Amb a 7，一个12kDa的质体蓝素；Amb a 8，一个14kDa的肌动蛋白抑制蛋白；Amb a 9，一个10kDa的Polcalcin(Polcancin)；以及Amb a 10，一个18kDa的Polcalcin样蛋白。对于多年生豚草，仅已描述了具有未知生物功能的过敏原Amb p 5。也仅已描述了三裂叶豚草中的一种
5kDa的过敏原。
30kDa的防御素样蛋白；5kDa的Amb a 5；Amb a 6，一个10kDa的脂质转运蛋白；Amb a 7，一个12kDa的质体蓝素；Amb a 8，一个14kDa的肌动蛋白抑制蛋白；Amb a 9，一个10kDa的Polcalcin(Polcancin)；以及Amb a 10，一个18kDa的Polcalcin样蛋白。对于多年生豚草，仅已描述了具有未知生物功能的过敏原Amb p 5。也仅已描述了三裂叶豚草中的一种
5kDa的过敏原。
[0012] 野草可以根据其分类的过敏原性提取物而被分成多个同源组。豚草属被选为这一组植物的主导品种之一。由于这个原因，由这种花粉提取物所获得的结果可以被外推到其i他野草 。
[0013] 过敏可以通过多种已知的方法来进行治疗，这些方法包括过敏原免疫疗法、特异性免疫疗法(SIT)、或特异性过敏疫苗接种(SAV)，该特异性过敏疫苗接种是一种用于过敏性失调的免疫疗法形式，其中用剂量逐渐增大的一种过敏原提取物对患者进行疫苗接种，目的在于诱导免疫耐受性。过敏原免疫疗法调节针对过敏原的免疫反应，而不是减轻由一种过敏反应所诱发的症状，并且可以减少对药物的需求，降低症状的严重程度亦或完全消除超敏。
[0014] 虽然大量证据表明，除了避开过敏原以外，过敏原免疫疗法是仅有的用于在病因上治疗由吸入了的过敏原和由膜翅目(Hymenoptera)组的有刺昆虫所引起的、IgE介导的过敏性失调的手段，但是用过敏原提取物进行的免疫疗法并不典型地用于食物过敏治疗。仅有两项最近的研究已证明，在分别用榛子和桃敏化的个体中，使用舌下免疫疗法有适度(3，4)
的临床疗效 。
的临床疗效 。
[0015] 在先前的研究中，已尝试了通过先用极少量的花生对儿童进行喂食，接着使喂食(4，6)量逐渐变得越来越大，来诱导低剂量耐受性，以建立免疫系统 。虽然早期的临床试验数(7)
据表明，花生过敏可以使用免疫疗法来减轻 ，但目前不存在确定的可用于预防或治愈对花生的过敏反应的治疗，其中仅有的用于特应性个体的有效选项是避开包含或沾染有完整花生、花生颗粒以及花生油的食物并且提供可自行注射的肾上腺素的快捷途径。
据表明，花生过敏可以使用免疫疗法来减轻 ，但目前不存在确定的可用于预防或治愈对花生的过敏反应的治疗，其中仅有的用于特应性个体的有效选项是避开包含或沾染有完整花生、花生颗粒以及花生油的食物并且提供可自行注射的肾上腺素的快捷途径。
[0016] 免疫疗法的风险之一是注射敏原到敏化的患者体内可能会引起严重的过敏反应或过敏症。因为首先在20世纪初使用了过敏原免疫疗法，所以已作出很多努力来进一步改进它的安全性和疗效。一种方法是使用过敏原性已被降低，但维持免疫原性的过敏原疫苗。
[0017] US 5,770,698和EP0662080披露了一种用于去除物质和其他低分子量材料，以便纯化过敏原提取物并且增加最终的过敏原/蛋白含量的方法。该方法由以下步骤组成：在一定条件下破坏静电力、疏水力或其他物理力，以致使非过敏原性化合物从过敏原活性蛋白脱粘附。该方法可以由以下步骤组成：通过使pH值降低到相应过敏原蛋白的pI值以下来进行一种温和酸处理。
[0018] 降低过敏原性的不同方式之一由以下步骤组成：使用醛，主要是使用甲醛和戊二醛对天然过敏原提取物进行改性化学改性，从而产生类过敏原。这种醛处理会导致反应产物(主要是聚合物)(这些产物已失去了它们的部分过敏原性(即展现出IgE反应性B细胞表位的减少))减少过敏性副作用。同时，过敏原的天然免疫原性因T细胞表位没有发生变化而被保留下来。这一过敏原改性途径已经由一些过敏原疫苗制造商进行了选择，以基于这一原理来开发出可商购的产品。总的来说，有一种趋向是进一步纯化过敏原提取物，从而小心地选择最重要并且临床上相关的过敏原。
[0019] EP1834649和EP1834648披露了多种用于生产过敏原提取物的方法；然而，这些方法并没有充分地去除污染性的低分子量蛋白。
[0020] 对于通过优化过敏原纯化方法以确保消除污染性的低分子量蛋白、刺激物以及毒性组分来进一步改进用于过敏性失调的免疫疗法中的药物的安全性和疗效存在需要。
发明内容
[0021] 诸位发明人已开发了在聚合之前进行的一个中间步骤，来进一步改进聚合过程并且在使用戊二醛进行处理之前降低某些提取物(例如螨、花粉(包括草、野草以及树木)、上皮过敏原以及食物过敏原)的过敏原性。
[0022] 本发明的一个目的在于提供一种用于制备包括过敏原的提取物的方法，以及用于治疗过敏的多种药物组合物和疫苗。另一个目的是提供一种最佳有效的过敏原提取物，该过敏原提取物具有降低的IgE结合能力，但保留了它的免疫原性能力。
[0023] 根据本发明的一个第一方面，提供了一种用于生产过敏原提取物的方法，包括：
[0024] a)使包括过敏原的一种源材料与一种液体提取剂接触，以产生一种混合物，该混合物含有溶解在液相中的多种脂质和由包括多种过敏原和蛋白的源材料残余物组成的一种固相。
[0025] b)使该混合物经历一个第一分离步骤，以分离该源材料残余物，
[0026] c)使该源材料残余物与一种过敏原提取剂接触，以产生溶解在液相中的多种过敏原与由非过敏原性残余物组成的一种固相的一种混合物。
[0027] d)使该混合物经历一个第二分离步骤，以分离溶解在液相中的这些过敏原，从而产生一种粗过敏原提取物，
[0028] e)使该粗过敏原提取物经历一个去除低分子量部分的步骤，以去除具有小于3.5kDa的分子大小的多种分子，并且
[0029] f)进行步骤e)，直至该过敏原提取物在3℃-5℃下的导电率低于1000μS/cm为止，从而获得一种纯化的天然过敏原提取物。
[0030] 一个进一步处理步骤可以包括
[0032] 该方法可以进一步包括一个聚合步骤，该聚合步骤包括：
[0033] h)使一种天然过敏原提取物或一种脱色的过敏原提取物与一种醛接触，并且[0034] i)去除具有小于100kDa的分子大小的多种分子。
[0035] 根据本发明的一个第二方面，提供了一种过敏原提取物，该过敏原提取物根据本发明的第一方面的方法是可获得的。
[0036] 根据本发明的一个第三方面，提供了一种纯化的过敏原提取物，该过敏原提取物在治疗过敏中用作一种活性治疗性物质。
[0037] 定义
[0038] “过敏原”可以被定义为一种能够诱导IgE反应和/或I型过敏反应的分子。
[0039] 在此提及的术语“脱色的”可以被定义为一种半纯化的过敏原提取物，该过敏原提取物是从一种天然提取物中通过去除它可能包含的多种无关物质(包括吸附的多种色素)而获得的。
具体实施方式
[0040] 本发明的过敏原提取物可以来源于包括已知在个体中引起一种IgE介导的免疫反应的多种天然过敏原的任何源材料。这些过敏原可以包括食物过敏原(例如花生)、通过空气传播的过敏原(例如来自草、树木、草本植物以及野草的花粉，尘螨，真菌以及霉菌)、昆虫过敏原(例如蟑螂、蚤、蜜蜂以及胡蜂毒液)以及上皮过敏原(动物毛发、动物皮屑，例如猫和狗的皮屑)。
[0041] 来自树木、草以及野草的花粉过敏原源自于以下分类学目类组：壳斗目(Fagales)(例如桤木属(Alnus)和桦木属(Betula))、唇形目(Lamiales)(例如木犀榄属(Olea)和车前草属(Plantago))、禾本目(Poales)(例如梯牧草(Phleum pratense))、菊目(Asterales)(例如豚草属(Ambrosia)和蒿属(Artemisia))、石竹目(Cayophyllales)(例如藜属(Chenopodium)和猪毛菜属(Salsola))、蔷薇目(Rosales)(例如墙草属(Parietaria))、睡莲目(Proteales)(例如悬铃木属(Platanus))等。尘螨属于无气门亚目(Astigmata)组(例如表皮螨属(Dermatophagoides)和嗜霉螨属(Euroglyphus))。通过空气传播的过敏原源自于属于格孢腔目(Pleosporales)(例如交链孢霉属(Alternaria))、煤炱目(Capnodiales)(例如分支孢子菌属(Cladosporium))等的霉菌和真菌。
[0042] 根据本发明的源材料可以是任何过敏原，包括食物过敏原、花生、完整花生、通过空气传播的过敏原(例如花粉(树木的花粉、野草的花粉、草的花粉、谷类植物的花粉)、尘螨、真菌、霉菌)、螨、草、树木以及野草过敏原、上皮过敏原(动物毛发、动物皮屑，例如猫的毛发和皮屑以及狗的毛发和皮屑)以及昆虫过敏原(例如蟑螂、蚤、蜜蜂以及胡蜂毒液)。
[0043] 一种优选的食物过敏原是花生。更优选的是，该花生过敏原是落花生。
[0044] 通过空气传播的过敏原可以选自以下各项/或选自以下各项的组：树木的花粉(欧洲桤木(Alnus glutinosa)、白桦(Betula alba)、欧洲榛(Corylus avellana)、绿干柏(Cupressus arizonica)、齐墩果(Olea europea)、悬铃木属(Platanus sp))、草的花粉(狗牙根(Cynodon dactylon)、鸭茅(Dactylis glomerata)、草地羊茅(Festuca elatior)、绒毛草(Holcus lanatus)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、梯牧草(Phleum pratense)、普通芦苇(Phragmites communis)、草地早熟禾(Poa pratensis))、野草的花粉(美洲艾(Ambrosia elatior)、北艾(Artemisia vulgaris)、藜(Chenopodium album)、欧蓍草(Parietaria judaica)、长叶车前(Plantago lanceolata)、钾猪毛菜(Salsola kali))以及谷类植物的花粉(燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereal)、普通小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays))、尘螨(粗脚粉螨(Acarus siro)、热带无爪螨(Blomia tropicalis)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、微角尘螨(Dermatophagoides microceras)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)、害鳞嗜螨(lepidoglyphus destructor)、腐食酪螨(Tyrophagas putrescentiae))、真菌以及霉菌(交链格孢菌(Alternaria alternate)、蜡叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus))。
[0046] 昆虫过敏原可以选自蚂蚁、蚤、螨(粗脚粉螨、热带无爪螨、粉尘螨、微角尘螨、屋尘螨、梅氏嗜霉螨、害鳞嗜螨、腐食酪螨)、蟑螂、胡蜂毒液以及蜜蜂毒液。
[0047] 优选地，该源材料是选自食物过敏原(落花生)、花粉(欧洲桤木、白桦、欧洲榛、绿干柏、齐墩果、悬铃木属、狗牙根、鸭茅、草地羊茅、绒毛草、多年生黑麦草、梯牧草、普通芦苇、草地早熟禾、美洲艾、北艾、藜、欧蓍草、长叶车前、钾猪毛菜、燕麦、大麦、黑麦、普通小麦、玉米)、尘螨(粗脚粉螨、热带无爪螨、粉尘螨、微角尘螨、屋尘螨、梅氏嗜霉螨、害鳞嗜螨、腐食酪螨)、真菌和霉菌(交链格孢菌、蜡叶芽枝霉、烟曲霉)、上皮过敏原(猫的毛发和皮屑、狗的毛发和皮屑、马的毛发和皮屑、人的毛发和皮屑、兔的毛发和皮屑、以及羽毛)、昆虫过敏原(蚂蚁、蚤、螨、蟑螂、胡蜂毒液以及蜜蜂毒液)。
[0048] 更优选的是，该源材料是选自花生(落花生)、花粉(齐墩果、欧蓍草、普通芦苇以及梯牧草)、螨(屋尘螨)以及上皮(猫的皮屑)。
[0049] 在本发明的一个优选的实施方案中，该源材料是选自落花生、齐墩果、欧蓍草、梯牧草、屋尘螨、普通芦苇、欧蓍草以及猫的皮屑。
[0050] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，该源材料是选自落花生、梯牧草、普通芦苇、欧蓍草以及猫的皮屑。
[0051] 在本发明的一个更优选实施方案中，该过敏原是落花生。
[0053] 可以对该源材料进行处理以造成一个与液体提取剂进行接触的最大的表面积。可以对该源材料进行均质化、掺混、碾碎或者使它变成粉末以产生一种用于液体提取的均质浆料。该液体提取步骤是一个脱脂”步骤，以去除来自源材料的亲脂性化合物，例如脂质和脂肪酸。
[0054] 该液体提取剂可以是丙酮，它可以是冷的。该液体提取步骤可能以1∶1(源材料的重量/液体提取剂的重量)的比率，或在该液体提取剂重量超过该源材料重量的情况下的任何比率(例如1∶2、1∶3、1∶5、1∶10)来进行。该液体提取步骤优选地以1kg源材料对应2L液体提取剂的比率进行。优选地，进行该液体提取步骤持续足够的时间，以使该源材料中的脂质溶解于该液体提取剂中，该步骤可以持续超过1分钟，优选地超过5min，更优选地超过30分钟，以及最优选地持续1小时或更长。该液体提取步骤可以在20℃-25℃下进行，但优选地在2℃-6℃的冷的情况下进行，并且最优选地在3℃-5℃之间进行。在该液体提取步骤期间，优选地将该源材料与该液体提取剂一起搅拌或搅动。
[0055] 该第一分离步骤可以是过滤。
[0056] 在第一分离步骤之后，可以用该液体提取剂洗涤源材料残余物。任选地，可以用该液体提取剂进一步提取该源材料残余物，然后分离。优选地，另外进行一次、两次或更多次液体提取步骤。优选地，对源材料残余物持续进行液体提取，直到至该液体提取剂在与该源材料残余物接触后仍保持透明。
[0057] 在液体提取之后，可以干燥源材料残余物。可以在2℃-25℃下干燥源材料残余物，并且优选地在室温下进行干燥。优选地，持续进行该干燥步骤，持续足够的时间以允许从源材料残余物中去除液体提取剂，该步骤可以持续1-24小时、6-18小时、10-14小时并且优选地持续约12小时。
[0058] 通过使用一种过敏原提取剂进行提取，以产生一种粗过敏原提取物，过敏原可以得自“脱脂的”源材料残余物，，该粗过敏原提取物包括溶解在液相中的过敏原和由“不要的”非过敏原性残余物组成的固相。该过敏原提取剂可以是水溶液，并且优选地包括一种缓冲剂。该过敏原提取剂可以包括PBS和/或NaCl，例如0.01M PBS/0.15M NaCl的溶液。可以按任何比率，在该过敏原提取剂中提取源材料残余物，其中该过敏原提取剂重量超过该源材料残余物重量，例如1∶2、1∶3、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50。优选地，以1∶10源材料残余物∶过敏原提取剂(wt/wt)的比率，在该过敏原提取剂中提取源材料残余物。虽然在该提取步骤中，源材料残余物与过敏原提取剂的比率可以变化，但应使得源材料残余物中的过敏原能够溶解在过敏原提取剂中。优选地，用过敏原提取剂对源材料残余物进行提取，持续足够的时间，以使得源材料残余物中的过敏原溶解在过敏原提取剂中，该步骤可以持续30分钟至12小时，优选地持续1-6小时，更优选地持续2-5小时，并且最优选地持续约4小时。该过敏原提取步骤可以在20℃-25℃下进行，但优选地在2℃-6℃的冷的情况下进行，并且最优选地在3℃-5℃下进行。在该过敏原提取步骤期间，优选地将该源材料残余物与该过敏原提取剂一起搅拌或搅动。
[0059] 在该过敏原提取步骤之后，可以将溶解在液相中的过敏原与非过敏原性残余物分离，以产生一种粗过敏原提取物。该分离步骤优选地是离心，虽然用于从液体分离固体的很多技术是可适用的，这些技术为本领域技术人员所熟知。优选地，在2℃-6℃下，并且优选地，在3℃-5℃下对溶解在液相中的过敏原进行离心，持续足够的时间，以使非过敏原性残余物沉降为团块，例如持续1分钟至1小时，或超过1小时。可以将粗过敏原提取物(即包含溶解了的过敏原的上清液)储存在2℃-6℃下。可以用该过敏原提取剂，使用与第一过敏原提取步骤相同的条件，进一步提取非过敏原性残余物团块，并且优选地持续更长的提取时段，例如4-8小时、8-12小时、或超过12小时。在该第二过敏原提取步骤之后，可以从非过敏原性残余物分离溶解在液相中的过敏原，以产生一种粗过敏原提取物。优选地，合并来自第一和第二过敏原提取步骤的粗过敏原提取物用于进一步处理。
[0060] 可以过滤该粗过敏原提取物，例如使用0.45μm孔径。可以使该粗过敏原提取物经历一个低分子量部分去除步骤，从而去除具有低分子大小的分子，例如盐和其他非过敏原性化合物。本申请人已经以实验方式测定出花生提取物的蛋白和过敏原组合物是8kDa与150kDa之间，并且这些过敏原需要在分子部分去除步骤期间被保留下来。例如，花生脂质转运蛋白(LTP)——一种重要的过敏原，是8kDa并且它需要在去除低分子量部分的步骤期间被保留下来。在步骤e)中，具有小于8kDa、或7kDa、或6kDa、或5kDa、4kDa或3.5kDa的分子大小的分子可以被去除。优选地，持续进行该低分子量部分去除步骤，直至过敏原提取物在3℃-5℃下的导电率小于900μS/cm，或小于800μS/cm，或小于700μS/cm，或小于600μS/cm，或更优选地小于500μS/cm。优选地，持续进行该低分子量部分去除步骤，直至过敏原提取物在3℃-5℃下的导电率在200至1000μS/cm至，或在300至900μS/cm之间，并且最优选地在400至800μS/cm之间。
[0061] 可以过滤生成的纯化的天然过敏原提取物，例如使用0.45μm和/或0.22μm孔径。
[0062] 该天然过敏原提取物可以被用于制备一种用于标准化、诊断、合成以及疫苗接种目标的药物组合物或疫苗。
[0063] 该方法可以另外包括进一步处理步骤，其中使用破坏负责粘附非过敏原性化合物到蛋白的静电力、疏水力或其他物理力的手段，来去除粘附到过敏原蛋白的非过敏原性化合物。用于破坏静电力、疏水力或其他物理力的手段可以选自化学手段的下组，该组由以下各项组成：酸性和碱性材料(包括阴离子和阳离子交换材料)、盐类以及电流。可以使用酸性和碱性化学手段，用量会使得超过这些蛋白的等电点。生成自该进一步处理步骤的过敏原提取物在下文中被称为脱色的过敏原提取物。
[0064] 该进一步处理步骤可以包括
[0065] g)酸化该天然过敏原提取物，去除具有小于3.5kDa的分子大小的分子，并且中和pH值，从而产生一种脱色的过敏原提取物。
[0066] 该进一步处理步骤优选地包括温和酸处理。在该温和酸处理中，可以降低这些过敏原蛋白的pH值至小于pH 3，例如2.0至2.5之间的pH值。这些过敏原蛋白的pH值可以在2.0至6.0之间。本申请人已经以实验方式鉴别出，用于使粘附到过敏原蛋白的非过敏原性化合物脱粘附的最佳pH值是在pH 2.0至2.1之间。pH值低于2.0会导致脱色的过敏原提取物的蛋白曲线(protein profile)不完全，而不够低的pH值，例如高于3.0，导致在生成的脱色的过敏原提取物中的非过敏原性化合物的不完全消除。
[0067] 可以使用合适的酸，例如HCl，来降低该天然过敏原提取物的pH值。酸化的提取物可以被维持在低pH值下1-60分钟，优选地5-30分钟，更优选地10-20分钟，并且最优选地持续约15分钟。具有小于3.5kDa的分子大小的分子可以在低分子量部分去除步骤中被去除。
[0068] 在该进一步处理步骤之后，可以收集生成的脱色的提取物，并且可以使用合适的碱，例如NaOH，来中和过敏原提取物的pH值。可以将pH值调节到能够避免蛋白沉淀的值，例如高于pH 7.0，优选地在pH 7.0至8.0之间，更优选地在pH 7.0至7.5之间，并且最优选地在pH 7.3至7.4之间。
[0069] 该进一步处理步骤可以包括：
[0070] g)酸化该天然过敏原提取物至pH 2-2.1，并且将该酸化的提取物维持5-30分钟，接着使该提取物经历一个低分子量部分去除步骤，以去除具有小于3.5kDa的分子大小的分子，并且调节pH值至7.3-7.4，从而产生一种脱色的过敏原提取物。
[0071] 该进一步处理步骤可以包括酸化该天然过敏原提取物到pH 2.0至4.0。
[0072] 用于破坏静电力的手段可以包括电泳形式的电流。非过敏原性化合物可能具有小于8,000Da、5,000Da并且优选地小于3,500的分子量，并且可以包括类黄酮和/或其糖苷。
[0073] 该低分子量部分去除步骤可以是一个透析步骤，其中针对一种透析液(如纯水或一种缓冲液)，透析该提取物。该低分子量部分去除步骤可以在20℃-25℃下进行，但优选地在2℃-6℃的冷的情况下进行，并且最优选地在3℃-5℃下进行。该低分子量部分去除步骤可以进行12-24小时，其中定期更换溶剂，或在透析的情况下，定期更换透析液，从而维持反应。
[0074] 可以过滤生成的脱色的过敏原提取物，例如使用0.45μm和/或0.22μm孔径，并且可以冷冻或冷冻干燥用于储存。
[0075] 可以对使用本发明方法所产生的任一种提取物进行进一步处理。该方法可以另外包括一个聚合步骤，包括：
[0076] h)使一种天然过敏原提取物或一种脱色的过敏原提取物与一种醛接触，并且[0077] i)去除具有小于100kDa的分子大小的分子。
[0078] 该醛可以是任何合适的醛，例如戊二醛或甲醛。
[0079] 该聚合步骤可以包括：
[0080] h)使一种天然过敏原提取物或一种脱色的过敏原提取物与戊二醛或甲醛接触，[0081] i)使该提取物经历一个分子部分去除步骤，以去除具有小于100kDa的分子大小的分子，并且
[0082] j)进行步骤i)，直至该过敏原提取物具有3℃-5℃下低于210μS/cm的导电率和/或不具有戊二醛，以获得一种聚合过敏原提取物或一种脱色的聚合过敏原提取物。
[0083] 在冷冻干燥用于聚合的提取物的情况下，可以使它在缓冲液(例如0.01MPBS/0.15M NaCl)中复原至0.1-500mg/ml，优选地1-100mg/ml，并且最优选地
10-50mg/ml的最终浓度。
10-50mg/ml的最终浓度。
[0084] 优选地进行该聚合反应至完成，以使得在聚合提取物中，＜100kDa(例如14-25kDa)的蛋白条带不是通过非还原性SDS-PAGE可检测的。本申请人已经以实验方式测定出(参见表2)，两种参数影响用于聚合的最佳条件。
[0085] 首先，戊二醛的最终浓度是重要的，由此增加戊二醛的浓度降低聚合物产率并且增加在透析之前通过离心获得的残余物产率。与采用约5mg/ml的戊二醛浓度(即每ml过敏原提取物0.009ml戊二醛)的先前已知的聚合条件对比，通过实验方式被测定最佳戊二醛浓度为已知量的约两倍，即10mg/ml(每ml过敏原提取物0.02ml戊二醛)。可以添加1-20mg/ml范围内的醛。同时采用先前已知量的最终浓度的戊二醛会导致过敏原的某种程度的聚合，优选的是，添加该醛至10mg/ml的最终浓度，或以每ml提取物0.02ml戊二醛的比率添加该醛，从而实现最佳聚合。
[0086] 其次，本申请人已测定出降低戊二醛的添加速率降低聚合物产率并且增加残余物产率。可以按恒定速度，例如每分钟0.001-0.5ml(1-500μl/min、60-3000μl/小时)，添加该醛至提取物。
[0087] 聚合反应可以在室温下维持1-12h，优选地7小时。可以按40mg每ml聚合的提取物溶液的比例使用甘氨酸，以停止该聚合反应。停止的反应可以在3℃-5℃下，优选地在搅拌下维持过夜。可以从不溶性残余物分离液相中的聚合过敏原，从而产生一种聚合过敏原提取物或一种经过脱色的聚合过敏原提取物。该分离步骤优选地是离心，虽然很多分离技术是可适用的，这些为本领域的技术人员所熟知。优选地在2℃-6℃之间，并且优选地在3℃-5℃之间，离心提取物持续足够的时间，以沉降不溶性残余物为团块，例如持续1分钟至1小时，或超过1小时。可以收集上清液(包含可溶性过敏原)，并且使其经历分子部分去除步骤(i)。
[0088] 在步骤i)中，可以去除具有小于150kDa的分子大小的分子。已发现具有高于3MDa的分子量的分子沉淀，而这些分子也可以在聚合步骤期间被去除。
[0089] 优选地，该分子部分去除步骤是一个透析步骤，其中在3℃-5℃下，针对一种透析液(例如纯水或一种缓冲液)透析提取物。可以持续进行该分子部分去除步骤，直至在3℃-5℃下所测量到的导电率小于200μS/cm，更优选地小于175μS/cm，更优选地小于150μS/cm，更优选地小于125μS/cm，更优选地小于100μS/cm，更优选地在50至200μS/cm之间，并且最优选地在100至150μS/cm之间。
[0090] 可以过滤生成的过敏原提取物，例如使用0.45μm和/或0.22μm孔径，并且可以冷冻或冷冻干燥以进行储存。
[0091] 任何低分子量部分去除步骤c)、e)、或g)可以包括超滤步骤、透滤步骤、透析步骤、或过滤。
[0092] 在本发明方法的最简单的形式中，可以包括制备一种天然可溶性过敏原提取物，任选地例如经由温和酸处理来进一步处理该提取物，以去除具有低分子大小的非过敏原性化合物，并且使用一种醛聚合该提取物。该天然可溶性过敏原提取物可能是花生、花粉、草、上皮、霉菌、真菌、昆虫或螨过敏原。本发明的方法会产生一种展现出已降低了的IgE结合能力，但保留了免疫原性能力的过敏原提取物。
[0093] 本发明进一步包括一种过敏症的治疗和一种过敏症的诊断性药物，这两者均包括通过本发明方法所产生的过敏原提取物作为活性成分。过敏症可能与暴露于在此讨论的会引发IgE介导的过敏反应的不同过敏原有关。
[0094] 根据本发明的第二方面，提供了一种过敏原提取物，该过敏原提取物是根据本发明的第一方面的方法可获得的。提供了一种用作活性治疗性物质的纯化的过敏原提取物。提供了一种天然过敏原提取物、一种聚合天然过敏原提取物、一种脱色的过敏原提取物、一种脱色的并且聚合过敏原提取物，以上各项根据本发明的第一方面的方法都是可获得的。
优选地，该提取物是一种聚合天然过敏原提取物，并且更优选地，是一种脱色的聚合过敏原提取物。
优选地，该提取物是一种聚合天然过敏原提取物，并且更优选地，是一种脱色的聚合过敏原提取物。
[0095] 该过敏原提取物可以选自花生(落花生)、花粉(齐墩果、欧蓍草、普通芦苇、欧蓍草以及梯牧草)、螨(屋尘螨)、以及上皮(猫的皮屑)。
[0096] 该过敏原提取物可以用于治疗过敏症。在一个优选的实施方案中，过敏原提取物落花生可以用于治疗花生过敏症。
[0097] 该脱色的聚合过敏原提取物可以特征在于以下物理化学和生物学特性：
[0098] i.可溶于水中，
[0099] ii.不存在分子量低于100kDa的未聚合过敏原/蛋白(通过在非还原性条件下的SDS-PAGE鉴别为条带)
[0100] iii.不存在分子量低于100kDa的IgE识别条带(通过非还原性条件下的免疫印迹法鉴别)
[0101] iv.不存在分子量低于100kDa的聚合分子(通过尺寸排阻色谱法与HPLC一起测定)。
[0102] v.相对于天然提取物，游离氨基减少了75％(通过荧光胺法测定)。
[0103] vi.相对于天然过敏原提取物，生物学效能降低(95％)(通过使用来自敏个体的特定血清池进行IgE ELISA抑制实验测定)，以及
[0104] vii.在小鼠中不存在异常毒性。
[0105] 本发明的过敏原提取物可以用作一种用于治疗过敏性个体的药物中的一种活性组分，目的在于诱导对某些过敏原的耐受性。
[0106] 提供了根据本发明的过敏原提取物在对免疫失调的诊断中的用途，优选地用于检测过敏性疾病。提供了根据本发明的过敏原提取物的用途，用于治疗过敏症或用于制造一种用于治疗过敏症的药物。该用途可以是用于免疫疗法。该用途可以是用于标准化、诊断、合成以及疫苗接种的目的。该用途可以在患者的治疗性治疗中，优选地在免疫疗法中。该用途可以在免疫疗法期间监控患者。
[0107] 根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，包含根据本发明的过敏原提取物。提供了一种用于治疗过敏症的药物组合物，它包括作为活性成分的一种药学有效量的根据本发明的过敏原提取物，和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。提供了一种用于过敏症的诊断性组合物，它包括作为活性成分的一种诊断有效量的根据本发明的过敏原提取物。
[0108] 根据本发明的另一个方面，提供了一种疫苗，该疫苗包括根据本发明的过敏原提取物。该药物组合物和疫苗可以进一步包括一种或多种佐剂、稀释剂、防腐剂或其混合物。该药物组合物或疫苗可以包括一种生理学上可接受的载体。如在此使用，短语“药学上可接受的”优选地是由政府管理机构批准，或列于欧洲或美国药典或另一种用于人类的公认药典中。
[0109] 这类药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，动物、植物或合成源性油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油以及类似物中的那些。还可以使用生理盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液作为液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括甘露醇、人血清白蛋白(HSA)、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、碳酸镁、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇以及类似物。
[0110] 根据本发明的另一个方面，提供了一种用于生产过敏原疫苗的方法，包括配制根据本发明的过敏原提取物与一种或多种佐剂、稀释剂、防腐剂或其混合物。
[0111] 提供了一种根据本发明的另一个方面的方法可获得的疫苗。该疫苗可以用于皮下或舌下使用。
[0112] 提供了根据本发明的疫苗在治疗过敏症中，或在制造一种用于治疗过敏症的药物中的用途或用于。
[0113] 根据本发明的另一个方面，提供了一种预防过敏原致敏的方法，包括以下步骤：使个体暴露于有效量的本发明的过敏原提取物、药物组合物或疫苗。
[0114] 根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗敏化个体的过敏症的方法，包括给予该个体有效量的本发明的过敏原提取物、药物组合物或疫苗。该过敏原提取物、该药物组合物或该疫苗可以皮下或舌下给予，并且可以按递增或恒定的剂量给予。
[0116] 图1：概述了用于生产过敏原提取物的方法。
[0117] 图2：天然花生过敏原提取物的HPLC分析：BioRad低范围标准品(泳道1)、天然提取物(泳道2)、沉淀物(泳道3)、部分部分20(泳道4)、部分部分21(泳道5)、部分部分40(泳道6)、部分部分78(泳道7)、部分部分96(泳道8)、
[0118] 部分111(泳道9)；
[0119] 图3：脱色的聚合花生过敏原提取物的HPLC分析；
[0120] 图4：脱色的聚合花生过敏原提取物残余物的HPLC分析：BioRad低范围标准品(泳道1)、脱色的聚合提取物残余物(泳道2)、沉淀物(泳道3)、部分21(泳道4)、部分51(泳道5)、部分74(泳道6)、部分75(泳道7)、部分120(泳道8)；
[0121] 图5：40μg花生过敏原提取物的SDS PAGE分析：STD(Bio-Rad低范围标准品)、泳道1-4(在还原性条件下)、泳道5-8(在非还原性条件下)、花生230209/LN天然提取物(泳道1)、花生230209/LD脱色的提取物(泳道2)、花生030309/LP脱色/聚合的提取物(泳道3)、花生030309/LP脱色/聚合了的残余物(泳道4)、花生230209/LN天然提取物(泳道5)、花生230209/LD脱色的提取物(泳道6)、花生030309/LP脱色/聚合了的提取物(泳道7)、以及花生030309/LP脱色/聚合的残余物(泳道8)；
[0122] 图6：40μg花生过敏原提取物的IEF分析；标准Bio-Rad IEF标记(pI4.45-9.6(泳道1和2))、花生230209/LN天然提取物(泳道3)、花生230209/LD脱色的提取物(泳道4)、花生030309/LP脱色/聚合的提取物(泳道5)、花生030309/LP脱色/聚合了的残余物(泳道6)；
[0123] 图7：在还原性条件(图7a)和非还原性条件(图7b)下使用花生过敏性供体的血清池(1/20稀释)和α-IgE-PO(120705，1/500稀释)对40μg花生过敏原提取物进行的免疫印迹分析，其中在各图中：花生230209/LN天然提取物(泳道1)、花生230209/LD脱色的提取物(泳道2)、花生030309/LP脱色/聚合的提取物(泳道3)、花生030309/LP脱色/聚合的残余物(泳道4)；
[0124] 图8：在还原性条件下使用花生过敏性供体的血清池(1/20稀释)和α-IgE-PO(120705，1/500稀释)对花生过敏原提取物进行的免疫印迹抑制分析，其中泳道
1是对照(仅血清)，并且泳道2-4使用成池的血清与800μg脱色/聚合的花生过敏原提取物、400μg提取物(泳道3)以及200μg提取物(泳道4)一起；
1是对照(仅血清)，并且泳道2-4使用成池的血清与800μg脱色/聚合的花生过敏原提取物、400μg提取物(泳道3)以及200μg提取物(泳道4)一起；
[0125] 图9：花生过敏原提取物的基于ELISA的IgE抑制作用分析；
[0126] 本发明通过以下实例来说明，这些实例详述了包括过敏原的提取物的制备、纯化、进一步处理以及聚合的方法。
[0127] 方法A-D详述了用于制造过敏原提取物的方法，而实例1-8描述了脱色的聚合过敏原提取物或脱色的过敏原提取物的实验性表征。
[0128] 方法
[0129] A.原始过敏原材料的脱脂方法
[0130] 通过不同方法获得了脱脂提取物，取决于原料的性质。各实例中定义了用于各过敏原的方法。
[0131] 总体而言，在3℃-5℃下在丙酮中将已均质化的材料脱脂，并且过滤。重复这一步骤直至丙酮是透明的。回收脱脂的材料并且在室温下干燥直至已去除所有丙酮。
[0132] B.天然过敏原提取物的制备
[0133] 称重干燥的脱脂材料，并且在3℃-5℃下，在磁性搅拌下，在0.01MPBS/0.15M NaCl中按1∶10比例提取4小时。然后，在4℃下以10.000r.p.m.离心溶液30分钟。收集生成的上清液并且储存在3℃-5℃下，并且在0.01M/NaCl0.15M(1∶10)中复原团块，并且在3℃-5℃下，在磁性搅拌下提取过夜。在3℃-5℃下，以10.000r.p.m离心溶液30分钟，并且收集上清液，并且与先前获得的部分混合。使用0.45μm孔径过滤结合的提取物，并且在3kDa截留透析膜中充分透析直至导电率低于1000μS/cm。然后使用0.22μm孔径无菌过滤提取物。
[0134] C.脱色的过敏原提取物的制备
[0135] 使用以下程序对处于水溶液中并且维持在3℃-5℃下的天然提取物进行进一步处理。在磁性搅拌下，通过添加0.1M HCl将该溶液的pH值调节到2-2.1，并且在这些条件下维持15分钟。然后，在3℃-5℃下，在3.5kDa截留透析膜中，用纯水(相对于10体积纯水)透析提取物17小时。在这一期间将纯水更换4次。在温和酸处理后，收集提取物并且使用0.1M NaOH调节pH值至7.3-7.4。最后，无菌过滤提取物直至0.22μm，冷冻并且冷冻干燥。
[0136] D.聚合的脱色的过敏原提取物的制备
[0137] 在磁性搅拌下，将冷冻干燥的脱色的提取物在0.01M PBS/0.15M NaCl中复原至15mg/ml的最终浓度，直至完全稀释。聚合方法由以下步骤组成：使用0.02ml戊二醛每毫升脱色的提取物来添加戊二醛。使用自动注射器以恒定速度(36毫升/小时)添加戊二醛至脱色的提取物中。在室温下维持聚合反应7小时。以40mg甘氨酸每ml溶液的比例添加甘氨酸来停止反应。在3℃-5℃下，在连续磁性搅拌下维持反应过夜。然后，在3℃-5℃下，以
10.000r.p.m离心溶液30分钟。去除团块，并且收集上清液并且在冷却条件下，在100kDa截留透析膜中用纯水(16.67ml水每毫升提取物)充分透析。当导电率低于210μS/cm并且通过UV/可见光扫描确认不存在戊二醛时，认为该方法完成。最后，使用0.22μm孔径无菌过滤提取物，冷冻并且冷冻干燥。
10.000r.p.m离心溶液30分钟。去除团块，并且收集上清液并且在冷却条件下，在100kDa截留透析膜中用纯水(16.67ml水每毫升提取物)充分透析。当导电率低于210μS/cm并且通过UV/可见光扫描确认不存在戊二醛时，认为该方法完成。最后，使用0.22μm孔径无菌过滤提取物，冷冻并且冷冻干燥。
[0138] 最终产物由冷冻干燥了的脱色的聚合提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。
[0139] 免疫学表征
[0140] 蛋白含量
[0142] 表1中示出了实例1的一批实验的结果。
[0143] 尺寸排阻色谱法(HPLC)
[0144] 将冻干了的提取物样品在高纯水中再悬浮，达到1mg/ml的最终浓度，并且搅拌10-15分钟。以13000r.p.m.将离心样品10分钟，并且转移上清液到用于自动注入的小瓶中。用于HPLC分析的色谱柱是先前用水平衡了的PL-水凝胶-OH 608μm(PolymerLabs)，其中分级分离是基于大小的差异。以1ml/min的流速运行样品(遵循制造商的建议)。检测254nm和280nm下的UV信号以获得色谱图。图2-4示出了HPLC分析的结果。
[0145] 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0146] 使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析来测定提取物的蛋白/抗原曲线。使样品在具有2.67％C、15％T丙烯酰胺的SDS-PAGE凝胶中，在天然或变性(缓冲溶液包含β-巯基乙醇并且在95℃下加热10分钟)的条件下跑胶。将各提取物的四十微克冻干了的材料加载在凝胶上。使具有已知分子量的参照标记(美国加利福尼亚州赫告斯市的伯乐生命医学产品公司(BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA))在同一块凝胶上跑胶。用考马斯亮蓝R-250(伯乐生命医学产品公司)对凝胶进行染色。使用扫描仪(Sharp JX-330；新泽西州莫瓦市的夏普电子公司(Sharp Electronics Corp，Mahwah，NJ))研究抗原曲线，并且使用Image Master 1-D Elite v 4.00(瑞典乌普萨拉市的法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden))进行分析。图5示出了考马斯蓝染色的凝胶，其中脱色/聚合的过敏原提取物在非还原性条件下(泳道7)示出不存在分子量低于100kDa的未聚合的过敏原/蛋白。
[0147] 等电聚焦
[0148] 使用等电聚焦(IEF)分析来根据蛋白的等电点测定提取物的蛋白/抗原曲线。使样品在聚丙烯酰胺电泳凝胶中，在天然条件下跑胶。将各提取物的四十微克冻干了的材料加载到凝胶上。使具有已知等电点的参照标记(美国加利福尼亚州赫告斯市的伯乐生命医学产品公司)，在同一块凝胶上跑胶。用考马斯亮蓝R-250(伯乐生命医学产品公司)对凝胶进行染色，并且使用扫描仪(Sharp JX-330；新泽西州莫瓦市的夏普电子公司)研究抗原曲线并且使用Image Master 1-D Elite v 4.00(瑞典乌普萨拉市的法玛西亚生物技术公司)进行分析。图6的泳道3-6示出了天然提取物(泳道3)、脱色的提取物(泳道4)、脱色/聚合的提取物(泳道5)以及脱色/聚合的残余物(泳道6)的结果。
[0149] 免疫印迹法
[0150] 转移电泳分离的蛋白到P-Immobilon膜(马萨诸塞州贝德福德市的密理博公司(Millipore，Bedford，MA))上。在转移后，在室温下干燥这些膜4小时。将这些膜与在0.01M磷酸盐缓冲生理盐水溶液(2％吐温(Tween))中稀释的血清池一起孵育过夜。使用结合了过氧化物酶的单克隆抗-人IgE(马德里的雅雷萨公司(Ingenasa，Madrid))检测特异性IgE结合，持续2小时。使用Sharp JX-330研究过敏原曲线并且使用Image Master
1-D Elite v 4.00进行分析。图7b的泳道1-4示出了在非还原性条件下天然提取物(泳道1)、脱色的提取物(泳道2)、脱色/聚合的提取物(泳道3)以及脱色/聚合的残余物(泳道4)的结果。脱色/聚合的过敏原提取物在100kDa处没有展现出IgE识别条带。在图8中，使用聚合的花生过敏原提取物的稀释液与成池的花生过敏性供体的血清相比较来观察IgE抑制作用。
1-D Elite v 4.00进行分析。图7b的泳道1-4示出了在非还原性条件下天然提取物(泳道1)、脱色的提取物(泳道2)、脱色/聚合的提取物(泳道3)以及脱色/聚合的残余物(泳道4)的结果。脱色/聚合的过敏原提取物在100kDa处没有展现出IgE识别条带。在图8中，使用聚合的花生过敏原提取物的稀释液与成池的花生过敏性供体的血清相比较来观察IgE抑制作用。
[0151] IgE抑制作用
[0152] 借助ELISA抑制法，建立50％抑制点，使用天然提取物作为参照物，来测试多种提取物(天然、脱色以及聚合的提取物)的体外过敏原性活性。用天然提取物(10μg蛋白/毫升)涂覆塑料微量滴定板(Immulon IV；弗吉尼亚州尚蒂利市的达耐斯技术公司(Dynex Technologies，Chantilly，VA))过夜。由天然、脱色以及聚合的提取物制成若干稀释液。在室温下，将各稀释液与血清池一起孵育2小时。然后，转移这些提取物的稀释液到天然提取物涂覆的板中并且孵育2小时。在洗涤后，添加100μl的抗人IgE过氧化物酶，并且在室温下静置30分钟。在洗涤后，将这些板显影30分钟并且用硫酸(1N)来停止。使用脱色/聚合的过敏原提取物观察到IgE结合的最大抑制作用(图9)。
[0153] IgG抑制作用
[0154] 借助于ELISA抑制法，建立50％抑制点，使用天然提取物作为参照物来测试多种提取物(天然、脱色以及聚合的提取物)的体外过敏原性活性。用天然提取物(10μg蛋白/毫升)涂覆塑料微量滴定板(Immulon II；弗吉尼亚州尚蒂利市的达耐斯技术公司)过夜。由天然、脱色以及聚合的提取物制成若干稀释液。在室温下将各稀释液与血清池一起孵育2小时。然后，转移这些提取物的稀释液到天然提取物涂覆的板中并且孵育2小时。在洗涤后，添加100μl抗人IgG过氧化物酶并且在室温下静置30分钟。在洗涤后，将这些板显影30分钟并且使用硫酸(1N)来停止。
[0155] 荧光胺法
[0156] 在天然提取物、脱色的提取物以及脱色的聚合提取物中检测游离氨基的测定值。聚合减少游离氨基的数目，因为过敏原之间的交联是由这一反应性基团介导的。制备25μg/ml的天然提取物和脱色的提取物以及1000μg/ml的脱色的聚合提取物。使用2-10mg/ml的6-氨基己酸作为标准。添加Evans溶液(Evans solution)到所有样品中。
在这种缓冲液中稀释氨基。然后，添加硼酸钠缓冲液(0.2M)到所有样品中并且均质化。最后，添加先前在丙酮中稀释的荧光胺到混合物中并且在荧光计中用在390nm和480nm发射来激发，对溶液进行测量。
在这种缓冲液中稀释氨基。然后，添加硼酸钠缓冲液(0.2M)到所有样品中并且均质化。最后，添加先前在丙酮中稀释的荧光胺到混合物中并且在荧光计中用在390nm和480nm发射来激发，对溶液进行测量。
[0157] UV/可见光扫描分光光度测定法
[0158] 在0.01M PBS中稀释天然过敏原性提取物、脱色的过敏原性提取物以及经过脱色的聚合过敏原性提取物到1mg/ml。在稀释后，在200nm至600nm之间的λ下分析样品。
[0159] 通过HEP测定的生物学效能
[0160] 通过REINA竞争法来测量多种提取物(天然提取物以及脱色的提取物)的生物活性。用抗IgE涂覆塑料微量滴定板。将来自过敏性个体的血清池添加到这些微量培养板中且孵育30分钟。先前已稀释样品和内部参照物(IHR)，并且与过氧化物酶标记的IHR一起孵育。然后，洗涤微量培养板，并且添加孵育的样品到这些微量培养板中，并且孵育30分钟。最后，充分地洗涤微量培养板，并且与色原体(cromogen)一起孵育。在450nm下读取这些板。
[0161] 在小鼠体内的异常毒性
[0162] 遵循欧洲药典的建议，用1ml脱色的聚合花生提取物以0.1mg/ml和1mg/ml的浓度注射雌性小鼠(品系NMRI)。使用腹膜内注射进行给药。观测时段是7天，在7天后，在动物中未观察到体重或行为方面的显著变化。
[0163] 实例
[0164] 实例1-花生过敏原提取物
[0165] 步骤A.原始花生材料的脱脂方法
[0166] 将去皮的花生在掺混机中均质化以获得一种经过均质化的浆料。在3℃-5℃下，在连续磁性搅拌下，用冷丙酮以1kg浆料∶2L丙酮的比例将均质化的材料脱脂，持续1小时，以提取出脂质、脂肪酸以及游离类黄酮。在布氏漏斗(Buchner funnel)中过滤生成的溶液。去除丙酮并且在过滤器中收集提取物，并且用新鲜的丙酮洗涤两次。再重复整个过程两次，直至所收集到的丙酮是透明的。在完成该方法后，收集脱脂的花生提取物并且在室温下，在层流净化罩下干燥12小时，直至该材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。
[0167] 根据方法步骤B-D获得脱色的聚合花生过敏原提取物。
[0168] 花生过敏原提取物的表征
[0169] 这一脱色的聚合花生过敏原提取物产物必须满足以下规范：
[0170] a.在水中可溶的产物
[0171] b.不存在分子量低于100kDa的未聚合过敏原/蛋白(通过在非还原性条件下进行SDS-PAGE而鉴别为条带)
[0172] c.不存在分子量低于100kDa的IgE识别条带(通过免疫印迹法在非还原性条件下鉴别)
[0173] d.不存在分子量低于100kDa的聚合分子(通过尺寸排阻色谱法与HPLC一起测定)
[0174] e.相对于天然提取物，游离氨基的减少(75％)(通过荧光胺法测定)
[0175] f.相对于天然提取物，生物学效能降低(95％)(通过使用来自敏化个体的特定血清池进行IgE ELISA抑制实验测定)
[0176] g.在小鼠中不存在异常毒性。
[0177] 在对天然提取物、脱色的提取物以及脱色/聚合的提取物进行表征时，使用包括脱色/聚合的残余物的团块作为对照(参看表1和2)。
[0178]
[0179] 表1.用一批实验获得的结果的概述
[0180] 实例2-豚草过敏原提取物(豚草)
[0181] 步骤A.原始过敏原材料的脱脂方法
[0182] 在3℃-5℃下，在连续搅拌下，将从授粉之后的植物采集来的豚草花粉用冷丙酮以1∶4(w/v)的比例脱脂3小时。在布氏漏斗中过滤生成的溶液并且用新鲜的丙酮洗涤至少三次。在完成该方法后，收集脱脂的提取物，并且在室温下，在层流净化罩下干燥12小时，直至该材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。
[0183] 根据方法步骤B-D获得经过脱色的聚合豚草(豚草)。通过在步骤3中添加0.1M HCl调节溶液的pH值到4-4.1。
[0184] 最终产物由冷冻干燥的脱色并且聚合的豚草提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。生成的产物必须满足以下规范：
[0185] a.在水中可溶的产物
[0186] b.不存在分子量低于100kDa的未聚合的过敏原/蛋白(通过在非还原性条件下进行SDS-PAGE，鉴别为条带所)
[0187] c.不存在分子量低于100kDa的IgE识别条带(通过免疫印迹法在非还原性条件下鉴别)
[0188] d.不存在分子量低于100kDa的聚合分子(通过尺寸排阻色谱法与HPLC一起测定)
[0189] e.相对于天然提取物，游离氨基的减少(75％)(通过荧光胺法测定)
[0190] f.相对于天然提取物，生物学效能的显著降低(通过使用来自敏化个体的特定血清池进行IgE ELISA抑制实验测定)
[0191] g.主要过敏原Amb a 1的检测。单克隆抗体
[0192] h.中小鼠中不存在异常毒性。
[0193] 主要过敏原含量
[0194] 使用Indoor Biotech试剂盒(美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔市的英拓生物技术有限公司(INDOOR Biotechnologies Inc.Charlottesville，Virginia，USA))来测量主要过敏原的含量(Amb a 1)。涂覆抗Amb a 1多克隆IgG抗体(1∶1000，来自小瓶，以1mg/ml制备)。使用针对US FDA(Amb a 1的放射免疫扩散参照物C14-RAS，包含30U Amb a 1/ml)定量并且标准化的包含活性2.5U/ml Amb a 1的豚草提取物来制备标准曲线。二抗由针对短豚草过敏原而产生的兔多克隆IgG生物素化的抗体组成。将天然的和脱色的样品稀释到500ng/ml。使用这些值计算聚合提取物中的主要过敏原含量。
[0195] 在天然提取物、脱色的提取物以及脱色/聚合的提取物的表征中使用包括脱色/聚合的残余物的团块作为对照(参看表3a和3b)。
[0196]
[0197] 表3a-实例2(豚草，豚草)获得的结果的概述
[0198]
[0199]
[0200] 表3b-实例2(豚草，豚草)获得的结果的概述
[0201] 实例3-花粉过敏原提取物(齐墩果)
[0202] 在3℃-5℃下，在连续搅拌下，将从授粉之后的树木采集来的齐墩果花粉用冷丙酮以1∶4(w/v)的比例脱脂3小时。在布氏漏斗中过滤生成的溶液并且用新鲜的丙酮洗涤至少三次。在完成该方法后，收集脱脂的提取物并且将它在室温下，在层流净化罩下干燥12小时，直至该材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。
[0203] 根据方法步骤B-C获得脱色的花粉过敏原提取物。
[0204] 最终产物由冷冻干燥了的经过脱色的提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。生成的产物必须满足以下规范：
[0205] a.在水中可溶的产物
[0206] b.蛋白曲线与天然提取物类似，通过SDS-PAGE和2-D所测定
[0207] c.过敏原曲线与天然提取物类似，通过免疫印迹法所测定
[0208] d.蛋白含量与天然提取物类似
[0209] e.主要过敏原含量与天然提取物类似
[0210] f.生物活性与天然提取物类似
[0211]
[0212]
[0213] 表4-实例3(齐墩果)获得的结果的概述
[0214] 实例4-花粉过敏原提取物(欧蓍草)
[0215] 在3℃-5℃下，在连续搅拌下，将从授粉之后的植物采集来的欧蓍草花粉用冷丙酮以1∶4(w/v)的比例脱脂3小时。在布氏漏斗中过滤生成的溶液并且用新鲜的丙酮洗涤至少三次。在完成该方法后，收集脱脂的提取物并且在室温下，在层流净化罩下干燥12小时，直至该材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。
[0216] 根据方法步骤B获得脱色的花粉过敏原提取物。
[0217] 最终产物由冷冻干燥了的经过脱色的提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。所得到的产物必须满足以下规范：
[0218] a.在水中可溶的产物
[0219] b.蛋白曲线与天然提取物类似，通过SDS-PAGE和2-D测定
[0220] c.过敏原曲线与天然提取物类似，通过免疫印迹法测定
[0221] d.蛋白含量与天然提取物类似
[0222] e.主要过敏原含量与天然提取物类似
[0223] f.生物活性与天然提取物类似
[0224]
[0225]
[0226] 表5-实例5(欧蓍草)获得的结果的概述
[0227] 实例5-螨过敏原提取物(屋尘螨)
[0228] 遵循方法步骤B，由发育完全的屋尘螨培养物获得螨过敏原提取物。
[0229] 最终产物由冷冻干燥了的脱色的提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。所得到的产物必须满足以下规范：
[0230] a.在水中可溶的产物
[0231] b.蛋白曲线与天然提取物类似，通过SDS-PAGE和2-D所测定
[0232] c.过敏原图谱与天然提取物类似，通过免疫印迹法所测定
[0233] d.蛋白含量与天然提取物类似
[0234] e.主要过敏原含量与天然提取物类似
[0235] f.生物活性与天然提取物类似
[0236] 主要过敏原含量
[0237] 使用Indoor Biotech试剂盒测量屋尘螨中主要过敏原的含量(Der p 1和Der p2)。在聚苯乙烯微量滴定板的孔(NUNC Maxisorp)中涂覆抗Der p 1和/或抗Der p 2单克隆IgG抗体(1∶1000，来自小瓶，以1mg/ml(Der p 1)和2mg/ml(Der p 2)制备)。使用经过定量并且标准化的通用标准品(针对包含2500ng/ml Der p 1和1000ng/ml Der p
2的WHO/IUIS屋尘螨参照物进行次级标准化的)来制备标准曲线：Der p 1的对照曲线稀释液是250-0.49ng/ml，而Der p 2的对照曲线稀释液是100-0.2ng/ml。常规地将螨样品稀释两倍。在洗涤该板后，添加100μl稀释过的过敏原标准品和样品并且在室温下孵育
1小时。在洗涤该板后，添加经过1/1000稀释的100μl二抗(生物素化的单克隆IgG抗体)并且在室温下孵育1小时。在洗涤该板后，添加经过1/1000稀释的100μl抗生蛋白链菌素-过氧化物酶并且在室温下孵育30分钟。最后，洗涤该板，通过添加70mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(pH 4.2)中的100μl 1mM ABTS(包含30％H2O2的1/1000稀释液(即
10μl/10ml ABTS))使它显影，并且当在405nm下的光学密度达到2.0-2.4时进行读取。
2的WHO/IUIS屋尘螨参照物进行次级标准化的)来制备标准曲线：Der p 1的对照曲线稀释液是250-0.49ng/ml，而Der p 2的对照曲线稀释液是100-0.2ng/ml。常规地将螨样品稀释两倍。在洗涤该板后，添加100μl稀释过的过敏原标准品和样品并且在室温下孵育
1小时。在洗涤该板后，添加经过1/1000稀释的100μl二抗(生物素化的单克隆IgG抗体)并且在室温下孵育1小时。在洗涤该板后，添加经过1/1000稀释的100μl抗生蛋白链菌素-过氧化物酶并且在室温下孵育30分钟。最后，洗涤该板，通过添加70mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(pH 4.2)中的100μl 1mM ABTS(包含30％H2O2的1/1000稀释液(即
10μl/10ml ABTS))使它显影，并且当在405nm下的光学密度达到2.0-2.4时进行读取。
[0238]
[0239] 表6-关于实例5(屋尘螨)获得的结果的概述
[0240] 实例6-豚草过敏原提取物(普通芦苇)
[0241] 在3℃-5℃下，在连续搅拌下，将从授粉之后的植物采集来的普通芦苇花粉用冷丙酮以1∶4(w/v)的比例脱脂3小时。在布氏漏斗中过滤所得到的溶液并且用新鲜的丙酮洗涤至少三次。在完成该方法后，收集脱脂的提取物并且将它在室温下，在层流净化罩下干燥12小时，直至该材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。
[0242] 根据方法步骤B-D获得脱色的聚合芦苇过敏原提取物。
[0243] 在步骤D中，聚合方法由以下步骤组成：使用0.015ml的戊二醛/ml的提取物的系数添加戊二醛。
[0244] 最终产物由冷冻干燥的脱色并且聚合的芦苇提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。所得到的产物必须满足以下规范：
[0245] a.在水中可溶的产物
[0246] b.不存在分子量低于100kDa的未聚合的过敏原/蛋白(通过在非还原性条件下进行SDS-PAGE而鉴别为条带)
[0247] c.不存在分子量低于100kDa的IgE识别条带(通过免疫印迹法在非还原性条件下鉴别)
[0248] d.不存在分子量低于100kDa的聚合了的分子(通过尺寸排阻色谱法与HPLC一起测定)
[0249] e.相对于天然提取物，游离氨基减少(75％)(通过荧光胺法所测定)
[0250] f.相对于天然提取物，生物学效能显著降低(通过使用来自敏化个体的特定血清池进行IgE ELISA抑制实验测定)
[0251] g.在小鼠中不存在异常毒性。
[0252] 在天然提取物、脱色的提取物以及脱色/聚合的提取物的表征时，使用包括脱色/聚合了的残余物的团块作为对照(参看表7a和7b)。
[0253]
[0254]
[0255] 表7a-关于实例6(普通芦苇)所获得的结果的概述
[0256]
[0257] 表7b-关于实例6(普通芦苇)所获得的结果的概述
[0258] 实例7猫上皮过敏原提取物
[0259] 在3℃-5℃下，在每一小时搅拌5分钟后将，猫的毛发用冷丙酮以1∶40(w/v)的比例脱脂7小时。在不搅拌的情况下，脱脂至少16小时。在布氏漏斗中过滤生成的溶液并且保留碎片状物。在室温下再将猫的毛发用相同的丙酮脱脂1小时并且重复两次。收集获得的碎片状物，并且在室温下，在层流净化罩下干燥15小时，直至该材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。
[0260] 在步骤B中，称重由猫的毛发获得的干燥了的经过脱脂的皮肤碎片材料，并且在3℃-5℃下，并且在磁性搅拌下，将它在0.01M PBS/0.15M NaCl中以1∶40的比例进行提取4小时。
[0261] 根据方法步骤B-D获得脱色的并且聚合猫过敏原提取物。
[0262] 最终产物由冷冻干燥的脱色并且聚合的猫上皮提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。所得到的产物必须满足以下规范：
[0263] a.在水中可溶的产物
[0264] b.相对于天然提取物，游离氨基减少(75％)(通过荧光胺法所测定)
[0265] c.相对于天然提取物，生物学效能显著降低(通过使用来自敏化个体的特定血清池进行IgE REINA竞争实验测定)
[0266] d.检测到主要过敏原Fel d 1。单克隆抗体
[0267] e.在小鼠中不存在异常毒性。
[0268] 主要过敏原含量
[0269] 使用Indoor Biotech试剂盒测量主要过敏原的含量(Fel d 1)。涂覆抗Amb a 1单克隆IgG1抗体(1∶1000，来自小瓶，以1mg/ml制备)。使用包含1000ng Fel d 1/ml的通用过敏原标准品来制备标准曲线。二抗由针对猫上皮过敏原而产生的单克隆抗体IgG1生物素化的抗体组成。将天然样品和脱色的样品稀释到250ng/ml。使用这些值计算聚合提取物中的主要过敏原含量。
[0270] 在天然提取物、脱色的提取物以及脱色/聚合的提取物的表征时，使用包含脱色/聚合的残余物的团块作为对照(参看表8)。
[0271]
[0272] 表8-关于实例7(猫上皮)所获得的结果的概述
[0273] 实例8梯牧草过敏原提取物
[0274] 在3℃-5℃下，在连续搅拌下，将从授粉之后的植物采集来的梯牧草花粉用冷丙酮以1∶4(w/v)的比例脱脂3小时。在布氏漏斗中过滤所得到的溶液并且用新鲜的丙酮洗涤至少三次。在完成该方法后，收集经过脱脂的花生提取物并且将它在室温下，在层流净化罩下干燥12小时，直至该材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。
[0275] 根据方法步骤B-D获得脱色的聚合梯牧草过敏原提取物。
[0276] 在步骤D中，聚合方法由以下步骤组成：使用0.009ml戊二醛/ml提取物的系数添加戊二醛。
[0277] 最终产物由冷冻干燥了的脱色并且聚合的梯牧草提取物组成，将该最终产物在冷冻干燥条件下储存在4℃下。所得到的产物必须满足以下规范：
[0278] a.在水中可溶的产物
[0279] b.不存在分子量低于100kDa的未聚合了的过敏原/蛋白(通过在非还原性条件下进行SDS-PAGE而鉴别为条带所)
[0280] c.不存在分子量低于100kDa的IgE识别条带(通过免疫印迹法在非还原性条件下鉴别)
[0281] d.不存在分子量低于100kDa的聚合了的分子(通过尺寸排阻色谱法与HPLC一起测定)
[0282] e.相对于天然提取物，游离氨基减少(75％)(通过荧光胺法所测定)
[0283] f.相对于天然提取物，生物学效能显著降低(通过使用来自敏化个体的特定血清池进行IgE ELISA抑制实验测定)
[0284] g.在小鼠中不存在异常毒性。
[0285] 主要过敏原含量
[0286] 使用Indoor Biotech试剂盒测量主要过敏原的含量(Phl p 5)。涂覆抗Phlp 5单克隆IgG1抗体(1∶1000，来自小瓶，以2mg/ml制备)。使用一种重组Phl p 5a制备标准曲线。二抗由针对梯牧草过敏原而产生的单克隆抗体IgG1生物素化的抗体组成。将天然样品和经过脱色的样品稀释到250ng/ml。使用这些值计算聚合提取物中的主要过敏原含量。
[0287] 在天然提取物、脱色的提取物以及脱色/聚合的提取物的表征时，使用包括脱色/聚合的残余物的团块作为对照(参看表9)。
[0288]
[0289] 表9-关于实例8(梯牧草)所获得的结果的概述
[0290] 参考文献
[0291] 1.维克利B.(Vickery，B.)，博科思W.(Burks，W)，用于治疗食物过敏症的免疫疗法：聚焦于口服耐受性(Immunotherapy in the treatment of food allergy：focus oral tolerance).过敏与临床免疫学新见(Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.)，2009；9：364-370。
[0292] 2. 金 R.M.(King，R.M.)， 尼 波 R.C.(Knibb，R.C.) 以 及 霍 里 哈 内J.O.B.(Hourihane，J.O.B.)，花生过敏症对家庭生活品质、压力以及焦虑的影响(Impact of peanut allergy on quality of life，stress and anxiety in the family).过敏学(Allergy)，2009；64：461-468。
[0293] 3.安立奎E.(Enrique，E.)，皮内达F.(Pineda，F.)，马莱克T.(Malek，T.)，巴尔特拉J.(Bartra，J.)，巴萨嘎纳M.( M.)，特利亚R.(Tella，R.)，卡斯特罗J.V.(Castelló，J.V.)，阿隆索R.(Alonso，R.)，德·马特奥J.A.(de Mateo，J.A.)，塞尔达-特里亚斯T.(Cerdá-Trias，T.)，圣米格尔-莫辛莫代尔M.(San Miguel-Moncín Mdel，M.)，蒙松S.(Monzón，S.)，加西亚M.(García，M.)，帕拉西奥斯R.(Palacios，R.)，斯特罗-巴赫马A.(Cisteró-Bahíma，A.)，用于榛子食物过敏症的舌下免疫疗法：使用一种经过标准化的榛子提取物进行的一项随机化、双盲、安慰剂对照研究(Sublingual immunotherapy for hazelnut food allergy：a randomized，double-blind，placebo-controlled study with astandardized hazelnut extract).过敏与临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)，2005；116(5)：1073-9。
[0294] 4.费尔南德斯-里瓦斯M.(Fernández-Rivas，M.)，加里多·费尔南德斯S.(Garrido Fernández，S.)，纳达尔J.A.(Nadal，J.A.)，迪亚斯·德·杜兰纳M.D.(Díaz de Durana，M.D.)，加希尔B.E.(García，B.E.)，冈萨雷斯-曼塞沃E.(Gonzalez-Mancebo，E.)，马丁S.(Martín，S.)，巴伯D.(Barber，D.)，里科P.(Rico，P.)，塔巴尔A.I.(Tabar，A.I.)，对于使用一种Pru p 3定量的桃提取物进行的舌下免疫疗法的随机化、双盲、安慰剂对照试验(Randomized double-blind，placebo-controlled trial of sublingual immunotherapy with a Pru p 3quantified peach extract).过敏学(Allergy)，2009；64(6)：876-83。
[0295] 5.霍 夫 曼A.M.(Hofmann，A.M.)，斯 库 洛 克 A.M.(Scurlock，A.M.)，琼 斯S.M.(Jones，S.M.)，帕尔莫K.P.(Palmer，K.P.)，洛克吉娜Y.(Lokhnygina，Y.)，斯蒂尔P.H.(Steele，P.H.)，卡米拉瑞斯J.(Kamilaris，J.)，博科思A.W.(Burks，A.W.)，一种花生口服免疫疗法方案对于患有花生过敏症的儿童的安全性(Safety of a peanut oral immunotherapy protocol in children with peanut allergy).过敏与临床免疫学杂志，2009年5月26日。
[0296] 6.琼斯S.M.(Jones，S.M.)，蓬斯L.(Pons，L.)，罗伯茨J.L.(Roberts，J.L.)，斯库洛克A.M.(Scurlock，A.M.)，佩里T.T.(Perry，T.T.)，库利斯M.(Kulis，M.)，施莱弗勒W.G.(Shreffler，W.G.)，斯蒂尔P.(Steele，P.)，亨利K.A.(Henry，K.A.)，阿黛尔M.(Adair，M.)，弗兰克斯J.M.(Francis，J.M.)，杜伦S.(Durham，S.)，维克利B.P.(Vickery，B.P.)，钟X.(Zhong，X.)，博科思A.W.(Burks，A.W.)，花生口服免疫疗法的临床功效和免疫调节作用(Clinical efficacy and immune regulation with peanut oral immunotherapy).过敏与临床免疫学杂志，2009年8月；124(2)：292-300，300。
[0297] 7.克拉克A.T.(Clark，A.T.)，伊斯兰S.(Islam，S.)，金Y.(King，Y.)，严重花生过敏症中口服耐受性的成功诱导(Successful oral tolerance induction in severepeanut allergy).过敏学，2009年8月；64(8)：1218-20。
[0298] 8.华莱士DV.(Wallace DV.)，宠物皮屑与常年性过敏性鼻炎：治疗选择方案(Pet dander and perennial allergic rhinitis：therapeutic options).过敏与哮喘会议录(Allergy Asthma Proc.)，2009年11月-12月；30(6)：573-83。
[0299] 9.玲M(Ling M)，朗AA(Long AA)，宠物皮屑与难以控制的哮喘：治疗选择方案(Pet dander and difficult-to-control asthma：Therapeutic options).过敏与哮喘会议录，2010年9月；31(5)：385-91。
[0300] 10.葛洛兰德H( H)，萨内T(Saarne T)，嘉芙琳G(Gafvelin G)，范·哈格M(van Hage M)，用于诊断与疗法中的主要猫过敏原Fel d 1(The majorcat allergen，Fel d 1，indiagnosis and therapy).国际过敏学与免疫学文献(Int Arch Allergy Immunol)，2010；151(4)：265-74.Epub 2009年10月22日，综述。
[0301] 网站参考文献
[0302] 1.过敏原命名法(Allergen nomenclature).国际免疫学会联合会过敏原命名下属委员会(International Union of Immunological Societies Allergen Nomenclature Sub-Committee).列表最近在2009年7月21日更新。
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