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疫苗载体

阅读：103发布：2020-07-13

专利汇可以提供疫苗载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性分子组成，该低变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其 片段 融合或结合。，下面是疫苗载体专利的具体信息内容。

1、一种低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性分子组成，该低 变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其片段融合或结合。
2、根据权利要求1所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个低变应原性分子 与所述至少一个另一个蛋白或其片段的N-末端和/或-C末端融合。
3、根据权利要求1或2所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个另一个蛋白 是病毒，特别是RNA或DNA病毒、细菌、真菌或原生动物蛋白。
4、根据权利要求3所述的低变应原性蛋白，其特征为该病毒蛋白是衣壳蛋白。
5、根据权利要求3或4所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个病毒蛋白源 自人类致病性病毒，优选为微小核糖核酸病毒科家族的病毒。
6、根据权利要求5所述的低变应原性蛋白，其特征为该微小核糖核酸病毒科家族 的病毒为鼻病毒种，优选为人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89和14。
7、根据权利要求1至6任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为变应原选自主要 桦树花粉变应原特别是Betv1和Betv4、主要牧草花粉变应原特别是Phl p1、Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7、主要屋尘螨变应原特别是Der p1和Der p2、主 要猫变应原Fel d1和Fel d2、主要蜜蜂变应原、主要黄蜂变应原、前纤维蛋白特 别是Phl p12、橄榄树变应原特别是Olee1、墙草变应原特别是Par j2、豚草变应 原特别是Amb a1、艾蒿花粉变应原特别是Art v1或储藏室尘螨变应原特别是Lep d2。
8、根据权利要求1至7任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为该低变应原性分 子表现出减少的IgE结合能力。
9、根据权利要求1至8任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为该低变应原性分 子表现出减少的T细胞反应活性。
10、根据权利要求1至8任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为该变应原片段 由下列氨基酸组成：Phl p1的151至177、87至117、1至30、43至70或212 至241位氨基酸，Phl p5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、 217至246、252至283或176至212位氨基酸，Fel d1的链1的1至34或35至 70位氨基酸，Fel d1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸，Bet v1的 30至59、50至79或75至104位氨基酸，Der p2的1至33、21至51、42至73、 62至103或98至129位氨基酸，Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、 125至155或165至198位氨基酸，Der p21的1至35、35至72、70至100或90 至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alt a1的 19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至60、45至 80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86 至120或107至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277 至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、 183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501 至542位氨基酸，Can f2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至 180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174 位氨基酸，Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的31 至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300、305至350 或356至396位氨基酸，Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174 至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1 至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
11、编码如权利要求1至10任一项所述融合的低变应原性蛋白的核酸分子。
12、包含如权利要求11所述核酸分子的载体。
13、根据权利要求12所述的载体，其特征为所述载体为表达载体。
14、根据权利要求12或13所述的载体，其特征为所述载体为细菌、真菌、昆虫、 病毒或哺乳动物载体。
15、一种包含如权利要求11所述核酸分子或如权利要求12至14任一项所述载体 的宿主。
16、一种针对如权利要求1至10任一项所述低变应原性蛋白的抗体。
17、根据权利要求16所述的抗体，其特征为所述抗体是单克隆或多克隆抗体。
18、一种包含如权利要求1至10任一项所述低变应原性复合物或如权利要求16 或17所述抗体的疫苗制剂。
19、根据权利要求18所述的制剂，其特征为所述制剂还包含至少一个佐剂，药学 上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
20、根据权利要求18或19所述的制剂，其特征为所述制剂包含10ng至1g，优 选为100ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述低变应原性蛋白或抗体。
21、根据权利要求1至10任一项所述的低变应原性蛋白或根据权利要求16或17 所述的抗体在制备用于治疗或预防人类或动物中病毒感染和/或过敏症的药物的用 途。
22、根据权利要求21所述的用途，其特征为所述药物还包含至少一个佐剂，药学 上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
23、根据权利要求21或22所述的用途，其特征为所述药物用于主动或被动免疫。
24、根据权利要求21至23所述的用途，其特征为所述药物包含10ng至1g，优 选为100ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述低变应原性蛋白或抗体。
25、根据权利要求21至24任一项所述的用途，其特征为该药物以0.01mg/kg体 重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的数量向个体使用。
26、根据权利要求1至10任一项所述的低变应原性复合物或根据权利要求16或 17所述的抗体在诊断个体中的过敏症和/或病毒感染中的用途。
27、来自微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣壳蛋白作为载体在药物或疫苗 中的用途或用于诊断病毒感染，特别是普通感冒的用途。
28、根据权利要求27所述的用途，其特征为该病毒是人类鼻病毒种，特别是人类 鼻病毒89或14。
29、一种源自Phl p5的低变应原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾，与野生型 Phl p5相比表现出减少的IgE结合能力。
30、根据权利要求29所述的分子，其特征为该截尾分子表现出减少的T细胞反应 活性。
31、根据权利要求30所述的分子，其特征为所述截尾的Phl p5由Phl p5的93至 128，98至128、26至53、26至58、252至283位氨基酸或其序列变体组成。 32、根据权利要求29所述的分子，其特征为所述截尾的Phl p5由Phl p5的132 至162，217至246、176至212位氨基酸或其序列变体组成。
33、一种源自Fel d1的低变应原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表现出减 少的IgE结合能力。
34、根据权利要求33所述的分子，其特征为该截尾分子表现出减少的T细胞反应 活性。
35、根据权利要求33或34所述的分子，其特征为所述截尾的Fel d1由Fel d1的 链1的1至34或35至70位氨基酸，Fel d1的链2的1至34、35至63或64至 92位氨基酸或其序列变体组成。
36、一种源自Der p2的低变应原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表现出减 少的IgE结合能力。
37、根据权利要求36所述的分子，其特征为该截尾分子表现出减少的T细胞反应 活性。
38、根据权利要求36或37所述的分子，其特征为所述截尾的Der p2由Der p2 的1至33、21至51、42至73、62至103、98至129位氨基酸或其序列变体组成。
39、一种源自Der p7、Der p21、克隆30、Alt a1、Par j1、Ole e1、Fel d2、Can f1、Can f1、Art v1、Amb a1、Alt a2或Alt a6的低变应原性分子，其具有C- 和/或N-末端截尾并表现出减少的IgE结合能力及任选地表现出减少的T细胞反应 活性，优选地由Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或 165至198位氨基酸，Der p10的1-35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、 210-250或250-284位氨基酸，Der p21的1至35、35至72、70至100或90至122 位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alt a1的19至58、 59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至60、45至80、60至 96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107 至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至 363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224 至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸， Can f2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Art v1的 27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的31至70、80至120、125 至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸， Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294 至333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1至40、41至80、81至 120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
40、一种包含至少两个根据权利要求29至39任一项所述的表现出减少的IgE结 合能力及任选地表现出减少的T细胞反应活性的低变应原性融合蛋白。
41、根据权利要求40所述的融合蛋白，其特征为如果至少两个分子源自相同的变 应原，则这些分子以不同于野生型变应原中片段顺序的顺序与彼此相融合。
42、一种编码如权利要求29至39任一项所述的低变应原性分子或如权利要求40 或41所述的融合蛋白的核酸分子。
43、一种包含如权利要求42所述核酸分子的载体。
44、根据权利要求43所述的载体，其特征为所述载体是表达载体。
45、根据权利要求43或44所述的载体，其特征为所述载体为细菌、真菌、昆虫、 病毒或哺乳动物载体。
46、一种包含如权利要求18所述核酸分子或如权利要求43至45任一项所述载体 的宿主。
47、一种针对如权利要求29至39任一项所述低变应原性分子或如权利要求40或 41所述融合蛋白的抗体。
48、根据权利要求47所述的抗体，其特征为所述抗体是单克隆或多克隆抗体。
49、一种包含如权利要求29至39任一项所述低变应原性分子、如权利要求40或 41所述融合蛋白或如权利要求46或47所述抗体的疫苗制剂。
50、根据权利要求49所述的制剂，其特征为所述制剂还包含至少一个佐剂，药学 上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
51、根据权利要求49或50所述的制剂，其特征为所述制剂包含10ng至1g，优 选为100ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述低变应原性分子或抗体。
52、根据权利要求29至39任一项所述低变应原性分子、根据权利要求40或41 所述融合蛋白、根据权利要求42所述核酸分子、根据权利要求43至45任一项所 述载体或根据权利要求47或48所述抗体在制备用于治疗或预防个体中过敏症的 药物的用途。
53、根据权利要求52所述的用途，其特征为所述药物还包含至少一个佐剂，药学 上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
54、根据权利要求52或53所述的用途，其特征为所述药物包含10ng至1g，优 选为100ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述免疫原性分子、核酸分子、 载体、宿主或抗体。
55、根据权利要求52至54任一项所述的用途，其特征为该药物以0.01mg/kg体 重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的数量向个体使用。
56、根据权利要求52至55任一项所述的用途，其特征为所述个体具有患过敏症 的风险。
57、根据权利要求29至39任一项所述低变应原性分子、如权利要求40所述融合 蛋白、或如权利要求47或48所述抗体在诊断个体中的过敏症或监视过敏症治疗 过程中的用途。

说明书全文

本发明涉及新型低变应原性分子及其用途。

I型过敏症是IgE介导的超敏性疾病，其影响大约25％的人口。它是基于特异 性免疫球蛋白E对无害的空中传播的、昆虫、毒液、食物变应原和接触变应原抗 原(源自本身无害的抗原来源，例如花粉、昆虫、霉菌和动物蛋白)的识别。与 效应细胞结合的IgE抗体的交联引起炎性调节子(例如组胺，白细胞三烯 (leucotrienes))的释放并因此引起过敏症的即刻症状(例如，鼻结膜炎、哮喘、 皮炎、过敏反应)。通过IgE依赖性和IgE非依赖性机制进行的T细胞激活有助于 慢性过敏性炎症。

过敏症治疗的可能的唯一致使形式为变应原特异性免疫治疗，其基于反复使 用渐增数量的大多数来源的变应原提取物。很多临床研究证明了注射免疫治疗的 临床功效，并有这种治疗下的几种免疫机理的证据。由于制备来自某些变应原来 源的高质量变应原提取物的困难，以及向病人使用变应原会引起严重的副作用的 事实，只能够向某些病人组和疾病表现来推荐变应原特异性免疫治疗。治疗对几 种不同变应原来源共同敏感的病人以及遭受严重疾病表现例如过敏性哮喘的病人 是特别困难的。过敏性哮喘是过敏症最严重的表现之一，因为它严重影响日常生 活质量，引起高入院率，其表现为严重的、威胁生命的形式，需要对病人的深切 关注。

从天然变应原来源制备的变应原提取物性质上是粗糙的，不可能通过技术手 段影响这种制备物中的个别变应原的质量和数量。它们也含有各种不明确的非变 应原性成分，几项最近的研究表明了这种提取物的劣质并证明了它们的高异质性。

在过去的十年中，使用重组DNA技术在分子变应原鉴定领域取得了巨大进步。 很大数量的引起疾病的最重要的变应原已被鉴定至分子水平，已经生产出模拟天 然变应原提取物表位复杂性的重组变应原。而且，几个研究小组已经使用已知的 关于变应原结构的知识发展了确定的新的过敏症疫苗。已经使用遗传工程、合成 肽化学和变应原与免疫刺激DNA序列的结合来减少新疫苗的变应原性活性，并因 此减少治疗诱导的副作用率。以这种变应原衍生物进行了第一个有前景的临床研 究。有趣的是，虽然可以强烈减少或甚至消除遗传工程化重组变应原和源自变应 原的合成的包含T细胞表位的肽的IgE反应活性，但是这些衍生物仍然可以诱导 全身性副作用(出现于注射几小时后)。例如，有报道指出，在皮内注射几个小时 以后，主要猫变应原Fel d 1的T细胞表位肽诱导了哮喘和支气管的高反应性，且 有力证据表明，这种效应是T细胞介导的和MHC限制性的。

这些结果表明，除去IgE反应活性可减少IgE介导的副作用，因为在这些免疫 治疗研究的过程中未记录到即现反应。但是，变应原特异性T细胞表位(被保留 在重组变应原衍生物以及肽混合物中)是造成延迟的副作用(例如非常有问题的 或过敏性皮炎，慢性T细胞介导的过敏性皮肤表现)的原因。在重组变应原衍生 物的情况下，所引起的副作用相对轻微，在T细胞肽疫苗的情况下可通过足够的 剂量来克服。因此这两种新方法似乎对过敏性鼻结膜炎的免疫治疗都是有前景的， 但对于治疗严重形式的过敏性哮喘(其中肺中的延迟副作用的诱导可能是非常有 问题的)可能具有局限性。

为了使用并因此激发针对肽、多肽和蛋白的有效免疫反应，通常使用佐剂和/ 或载体。例如，完全氟氏佐剂，是一种可获得的最有力的佐剂。但是，由于其副 作用，不允许用于人类。因此，需要能够诱导针对肽和多肽(源自变应原，当然， 和其他抗原)的强烈免疫反应的疫苗组合物，以避免使用完全氟氏佐剂。而且， 虽然在一个动物模型中已成功使用BSA作为载体，它可能不适宜用于人类疫苗组 合物，因为具有有害反应的风险，例如传播朊病毒病(变异型克雅氏病，(variant Creutzfeldt-Jakob disease))的风险。发展有效的针对变应原疫苗的一个进一步挑战 是需要能够迅速降低个体或动物中变应原的免疫反应。因此，需要血液中高浓度 的变应原特异性抗体(主要是IgG亚型)。在粘膜表面IgA抗体是主要的亚型。

霍乱毒素(一个现有技术中已知的载体蛋白)，通常也用作佐剂，减少疫苗组 合物中完全氟氏佐剂的需要。但是，霍乱毒素增加总的和特异性的IgE抗体水平， 并引起IgE相关的炎性反应。

由于大多数用于疫苗的载体蛋白所激发的副作用，需要能够刺激针对变应原 或其他抗原免疫反应的载体系统，而不使用毒性佐剂，不使用较差耐受的载体蛋 白，并且，在一些情况下，不刺激潜在的致病性免疫反应。满足这些特性的新型 载体系统可被用于形成适合于治疗或预防疾病(例如过敏性疾病)的新型佐剂和 组合物。

Bohle B.等人(J.Immunol.172(11)(2004)：6642-6648)描述了一种包 含S-层蛋白(S-layer protein)半体和Bet v 1半体的重组融合蛋白。这个分子包含 天然的高变应原性Bet v 1蛋白。

WO 2004/004761涉及融合至免疫原的病毒样颗粒，可用于免疫。

在WO 2004/003143中揭示了一种融合蛋白(包含病毒样颗粒和高变应原性分 子)作为免疫原用于接种疫苗的用途。

本发明的目标是提供可以克服前述缺陷并允许具有减少的副作用的变应原疫 苗的药物和载体。

因此，本发明涉及低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性 分子组成，该低变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其片段融合或 结合。

为了激发针对分子，特别是本发明所述的低变应原性分子的加强的免疫反应， 所述分子被融合至(通过遗传工程)或结合至(通过化学反应)载体。常规和通 常使用的载体为例如KLH(钥孔戚血蓝素，keyhole limpet hemocyanin)。KLH(分 离自巨大海洋软体动物Megathura crenulata)是最常见的用于产生用来注射的免疫 原的载体蛋白之一。由于具有高质量并且为非哺乳动物蛋白，KLH诱导强烈的抗 体反应。

融合至或结合至本发明的低变应原性分子的另一个蛋白(“载体”或“载体蛋 白”)是非源自变应原的(“非变应原性”)。但是，当向动物或人体使用时，本发 明中所用的载体蛋白可表现出T细胞反应活性，和/或激发针对其自身以及与其融 合或结合的低变应原性分子的免疫反应。因此，如果载体蛋白源自病原体(例如 病毒，细菌等)，则产生针对所述抗体和病原体的(保护性)抗体。

如这里所用的“低变应原性蛋白”意思是非变应原性来源的载体与低变应原 性分子的融合蛋白/多肽。而且，“低变应原性蛋白”也指载体与低变应原性分子的 结合产物(例如，化学偶联，吸附)。

如这里所用的“低变应原性”是指具有减少的变应原性潜力的分子。这样的 分子与野生型蛋白(即这些分子所源自的蛋白)相比，在个体中具有降低的激发 过敏性反应的能力。

优选地，至少一个源自变应原的并与另一个蛋白融合/结合的低变应原性分子 为C-和/或N-末端截尾。如这里所用的“C-和/或N-末端截尾”意思是来自野生型 变应原的N-末端或C末端-或N-和C-末端的氨基酸残基通过删除至少1、2、3、4、 5、7、10、15、20、30个氨基酸残基被除去。

低变应原性分子，即肽/多肽，优选为包含10至50个氨基酸，更优选为15至 40个氨基酸，特别地，20-30个氨基酸，并且表现出减少的IgE反应活性。将这些 分子设计为不包含T细胞表位(其可能引起T细胞介导的副作用)。T细胞表位和 表现出减少的T细胞反应的分子可通过本领域技术人员已知的方法确定和鉴别(例 如，Bercovici N.等人Clin Diagn Lab Immunol.(2000)7：859-864)。

发现可能使用表面暴露肽来设计源自变应原(如主要草花粉变应原例如Phl p 1和主要桦树花粉变应原，Bet v 1)的肽疫苗。获得的数据表明可针对任何变应原 (根据IgE表位制图，三维结构数据或电脑辅助的表面暴露结构域预测，这些变 应原的主要结构是已知的)来生产这些肽疫苗。但是，选择可用于疫苗的合适的 肽仍然是关键的，因为不是所有的经过这些方法鉴定的肽都可用于疫苗。适合于 疫苗目的的肽需要表现出减少的IgE结合能力，以及为了减少或避免延迟的副作 用而需要表现出减少的T细胞反应活性。

如这里所用的术语“源自变应原”意思是根据本发明所述的低变应原性分子 通过裂解或截断从变应原直接获得。优选地，本发明的低变应原性分子的氨基酸 序列与野生型变应原(这些低变应原性分子所源自的)的氨基酸序列的一段 (stretch)至少80％是同源的，更优选为至少90％同源，最优选为至少95％同源， 特别地为100％同源。但是，不与野生型变应原片段100％同源的分子需要能够以 至少60％，优选为至少70％，更优选为至少80％，最优选为至少90％的能力结合 至抗体(antibody)或抗体(antibodies)，优选为针对所述野生型变应原片段的IgG 抗体。

一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同源度可通过使用一定的算法直接对 比两个氨基酸序列来确定。这样的算法为例如，嵌合在各种计算机程序中(例如 ＂BLAST 2 SEQUENCES(blastp)＂(Tatusova等人.(1999)FEMS Microbiol. Lett.174：247-25；Corpet F，Nucl.Acids Res.(1988)16：10881-10890)。

根据本发明所述的截尾分子可被定义为完全变应原的一部分，其比完全野生 型变应原引起较少的变应原特异性T细胞激活(优选为至少30％，更优选为至少 50％，最优选至少70％的减少)，表现出减少超过50％的变应原性活性(优选为超 过70％，按照IgE结合测试所估计)和诱导IgE介导的细胞激活的能力，并且当 与所描述的载体偶联时，诱导产生IgG抗体，该IgG抗体抑制来自过敏性病人的 多克隆IgE与完全野生型变应原的结合。

该肽应该含有来自变应原的序列以避免与模拟位(mimotope)的重叠。但是， 模拟位(抗原碎片的小的肽模拟物，小于15个氨基酸，从随机肽文库中获得)不 代表如此处所定义的原始的、源自变应原的分子。根据本发明不能使用它们，因 为它们太小以致于不能诱导强有力的阻断IgG反应。

根据本发明所述的低变应原性分子可通过重组方法或化学合成来获得。或者， 当然也可能通过酶法或化学切割野生型变应原或容纳(harbour)感兴趣分子的多 肽/蛋白来获得。

优选地，低变应原性分子可包含至少两个截尾的变应原分子(源自至少一个 变应原)，其中，如果该至少两个分子源自相同变应原的话，截尾的变应原片段的 顺序与野生型变应原中片段的顺序不同。

根据本发明所述的低变应原性分子可包含一个或一个以上(优选为至少2个， 更优选为至少3个)如此处所定义的低变应原性分子，因此，形成融合蛋白。该 融合蛋白中的单个低变应原性分子(当然也缺少IgE结合能力并缺少T细胞表位)， 可源自相同和/或不同来源的变应原。如果分子源自相同的变应原，低变应原性融 合蛋白中的顺序应与野生型变应原中的顺序不同(这防止了IgE结合位点的还原 和形成)(参见例如WO 2004/065414，Linhart B和Valenta R(Int Arch Allergy Immunol.(2004)134：324-31))。

根据本发明的一个优选具体实施方式，至少一个低变应原性分子融合至所述 至少一个另一个蛋白或其片段的N-末端和/或C-末端。

变应原或其片段可通过化学或重组方法与彼此结合。如果变应原或其片段与 载体以化学方式结合，应该给所述变应原或其片段提供一个末端半胱氨酸残基(形 成一个自由巯基基团)。任何马来酰亚胺激活的载体蛋白可结合至所述末端(N-或 C-末端)半胱氨酸残基，因此产生一个免疫原/载体复合物。如果变应原或其片段 在末端没有巯基基团，可应用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺 盐酸盐)化学以把胺(赖氨酸)或羧基酸(谷氨酸、天冬氨酸或5’-磷酸盐)结合 至载体蛋白。

如果低变应原性分子融合至载体的N-或C-末端，则使用重组方法。

根据本发明的一个优选具体实施方式，至少一个另一个蛋白为病毒，特别是 RNA或DNA病毒，细菌、真菌或原生动物蛋白。

至少一个另一个蛋白(“载体”)可以是任何以上提及的来源。但是，特别优 选为使用激发免疫反应的蛋白，所述免疫反应为针对该蛋白本身及低变应原性分 子所融合或结合的。由于也针对至少一个另一个蛋白的(保护性)抗体形成的诱 导，根据本发明所述的低变应原性蛋白可也可用作针对所述另一个蛋白和其发生 起源(例如病毒、细菌、真菌)的疫苗。当然，也可能使用本领域熟知的载体蛋 白(例如KLH)作为至少一个另一个蛋白。

根据本发明所述的病毒蛋白优选为衣壳蛋白。

病毒衣壳蛋白是特别合适的，因为它们诱导抗病毒活性，激发抗体(阻断病 毒例如鼻病毒吸附至内皮细胞)的形成，表现出针对Th1反应的免疫调节活性， 增加肽的免疫原性(例如，较高的抗-肽，由此较高水平的保护性IgG抗体)，是被 证实适合于预防性疫苗(病毒疫苗)，并且是安全的(当衣壳蛋白用于持续暴露的 人(例如鼻病毒)时)。

根据本发明的另一个优选具体实施方式，至少一个病毒衣壳蛋白源自人类致 病性病毒，优选为微小核糖核酸病毒科家族的病毒。

微小核糖核酸病毒科家族的病毒优选为鼻病毒属，优选为人类鼻病毒种，特 别是人类鼻病毒89和14。衣壳蛋白可以是VP1、VP2、VP3和/或VP4。

融合至病毒衣壳蛋白的变应原优选为选自主要桦树花粉变应原(特别是Bet v 1和Bet v 4)、主要牧草花粉变应原(特别是Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5、Phl p 6和 Phl p 7)、主要屋尘螨变应原(特别是Der p 1和Der p 2)、主要猫变应原Fel d 1、 主要蜜蜂变应原、主要黄蜂变应原、前纤维蛋白(特别是Phl p 12)或储藏室尘螨 变应原(特别是Lep d 2)。

其他根据本发明所用的合适变应原可源自下表。

变应原

种名

             变应原名                生化.ID         分子量     cDNA(C)      参考文献，

                                     或川名                     或蛋白(P)    登录号

豚草(Ambrosia artemisiifolia)

矮豚草(short ragweed)

             Amb a 1                 抗原E           8          C            8，20

             Amb a 2                 抗原K           38         C            8，21

             Amb a 3                 Ra3             11         C            22

             Amb a 5                 Ra5             5          C            11，23

             Amb a 6                 Ra6             10C                     24，25

             Amb a 7                 Ra7             12         P            26

三裂叶豚草(Ambrosia trifida)

巨大豚草(giant ragweed)

             Amb t 5                 Ra5G            4.4        C            9，10，27

三裂叶豚草(Artemisia vulgaris)

艾蒿(mugwort)

             Art v 1                                 27-29      C            28

             Art v 2                                 35         P            28A

             Art v 3 脂肪转移蛋白                    12         P            53

             Art v 4        前纤维蛋白               14         C            29

向日葵(Helianthus annuus)

太阳花(sunflower)

             Hel a 1                                 34                      29A

             Hel a 2    前纤维蛋白                   15.7       C            Y15210

一年生山靛(Mercurialis annua)

             Mer a 1    前纤维蛋白                   14-15      C            Y13271

石竹目(Caryophyllales)

藜(Chenopodium album)

lamb＇s-quarters，藜(pigweed)，

             Che a 1                                 17         C            AY049012，29B

白苋菜(white goosefoot)

             Che a 2    前纤维蛋白14CAY082337

             Che a 3        polcalcin                10         C            AY082338

钾猪毛莱(Salsola kali)

Russian-thistle

             Salk 1                                  43         P            29C

Rosales

葎草(Humulus japonicus)

葎草(Japanese hop)

          Hum j 4w                                  C          AY335187

欧蓍草(Pariet ariajudaica)

          Par j 1 脂肪转移蛋白 1                15  C          参见变应原异构体列表

          Par j 2 脂肪转移蛋白 2                    C          参见变应原异构体列表

          Par j 3         前纤维蛋白                C          参见变应原异构体列表

药用墙草(Parietaria officinalis)

          Par o 1 脂肪转移蛋白                  15             29D

B.草

  Poales

中国狗牙根(Cynodon dactylon)

狗牙根(bermuda grass)

          Cyn d 1                               32  C          30，S83343

          Cyn d 7                                   C          31，X91256

          Cyn d 12  前纤维蛋白                  14  C          31a，Y08390

          Cyn d 15                              9   C          AF517686

          Cyn d 22w     烯醇酶         数据未定

          Cyn d 23  Cyn d 14                    9   C          AF517685

          Cyn d 24 发病机理相关性蛋白            21  P          未定

鸭茅(Dactylis glomerata)

果园草(orchard grass)

          Dac g 1       AgDg1                   32  P          32

          Dac g 2                               11  C          33，S45354

          Dac g 3                                   C          33A，U25343

          Dac g 5                               31  P          34

羊茅属禾草(Festuca pratensis)

牛尾草(meadow fescue)

          Fes p 4w                              60  -

绒毛草(Holcus lanatus)

天鵝絨草(velvet grass)

          Holl1                                     C          Z27084

黑麦草(lolium perenne)

黑麦草(rye grass)

          Lol p 1   第I组                       27  C          35，36

          Lol p 2   第II组                      11  P          37，37A，X73363

          Lol p 3   第III组                     11  P          38

          Lol p 5     Lol p IX，Lol p Ib                31/35    C        34，39

          Lol p11hom：胰岛素抑制剂                     16                39A

球茎草芦(Phalaris aquatica)

金黄草(Canary Grass)

          Pha a 1                                               C        40，S80654

猫尾草(Phleum pratense)

牧草      Phl p 1                                      27       C        X78813

          Phl p 2                                               C        X75925，41

          Phl p 4                                               P        41A

          Phl p 5   Ag25                               32       C        42

          Phl p 6                                               C        Z27082，43

          Phl p 11 胰岛素抑制剂hom.                    20       C        AF521563，43A

          Phl p 12 前纤维蛋白                                   C        X77583，44

          Phl p 13 多聚半乳糖醛酸酶                    55-60    C        AJ238848

草地早熟禾(Poa pratensis)

草地早熟禾(Kentucky blue grass)

          Poa p 1   第I组                             33       P        46

          Poa p 5                                     31/34    C        34，47

假高梁(Sorghum halepense)

蒋森草(Johnson grass)

          Sor h 1                                              C        48

C.树木

  Arecales

海枣(Phoenix dactylifera)

海枣(date palm)

          Pho d 2   前纤维蛋白                        14.3     C        Asturias p.c.

  Fagales

普通赤杨(Alnus glutinosa)

桤木

          Aln g 1                                     17       C        S50892

白桦(Betula verrucosa)

桦树      Bet v 1                                     17       C        参见变应原异构体列表

          Bet v 2前纤维蛋白                           15       C        M65179

          Bet v 3                                              C        X79267

          Bet v 4                                     8        C        X87153，S54819

          Bet v 6h：异黄酮还原酶                      33.5     C        参见变应原异构体列表

          Bet v 7亲环素                               18       P        P81531

欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)

铁树(Hornbeam)

        Car b 1                                  17       C        参见变应原异构体列表

纽西兰生鲜栗子(Castanea sativa)

栗子

        Cas s 1                                  22       P        52

        Cas s 5 几丁质酶

        Cas s 8 脂肪转移蛋白                     9.7      P        53

欧洲榛子(Corylus avellana)

榛子    Cor a 1                                  17       C        参见变应原异构体列表

        Cor a 2 前纤维蛋白                       14       C

        Cor a 8 脂肪转移蛋白                     9        C

        Cor a 9 11S 球蛋白样蛋白                 40/？    C        Beyerp.c.

        Cor a 10 鲁米诺结合蛋白                  70       C        AJ295617

        Cor a 11 7S 豌豆球蛋白样蛋白             48       C        AF441864

美洲白橡木(Quercus Alba)

白橡木

        Que a 1                                  17       P        54

   唇形目(Lamiales)

      木犀科(Oleaceae)

欧洲白蜡树(Fraxinus Excelsior)

岑树    Fra e 1                                  20       P        58A，AF526295

普通女贞(Ligustrum vulgare)

女贞    Lig v 1                                  20       P        58A

油橄榄(Olea europea)

橄榄树  Ole e 1                                  16       C        59，60

        Ole e 2 前纤维蛋白                       15-18    C        60A

        Ole e 3                                  9.2               60B

        Ole e 4                                  32       P        P80741

        Ole e 5   过氧化物歧化酶                 16       P        P80740

        Ole e 6                                  10       C        60C，U86342

        Ole e 7                                  ？       P        60D，P81430

        Ole e 8   Ca2+结合蛋白                   21       C        60E，AF078679

        Ole e 9   β-1，3-葡聚糖酶                46       C        AF249675

        Ole e 10 糖基水解酶hom.                  11       C        60F，AY082335

欧洲丁香(Syringa vulg aris)

丁香    Syr v 1                                  20       P        58A

车前科(Plantaginaceae)

长叶车前(Plantago Lanceolata)

英国车前草(English plantain)

         Pla l 1                                    18        P       P842242

   Pinales

日本柳杉(Cryptomeria japonica)

日本雪松Cry j 1                                     41-45     C       55，56

        Cry j 2                                               C       57，D29772

Cupressus arisonica

柏科树

        Cup a 1                                     43        C       A1243570

意大利柏(Cupressus sempervirens)

线杉(Common Cypress)

        Cup s 1                                     43        C       参见变应原异构体列表

        Cup s 3w                                    34        C       参考文献未定

杜松(Juniperus ashei)

mountain cedar

        Jun a 1                                     43        P       P81294

        Jun a 2                                               C       57A，AJ404653

        Jun a 3                                     30        P       57B，P81295

杜松木(Juniperus oxycedrus)

prickly juniper

        Jun o 4 hom：钙调蛋白(calmodulin)           29        C       57C，AF031471

Juniperus sabinoides

mountain cedar

        Jun s 1                                     50        P       58

铅笔柏(Juniperus virginiana)

eastern red cedar

        Jun v 1                                     43        P       P81825，58B

悬铃木科(platanaceae)

二球悬铃木

法国梧桐(London plane tree)

        Pla a 1                                     18        P       P82817

        Pla a 2                                     43        P       P82967

        Pla a 3 脂肪转移蛋白                        10        P       Iris p.c.

D.螨虫

粗脚粉螨(Acarus siro)         节肢动物

螨虫      Aca s 13 脂肪酸结合蛋白                     14*        C       AJ006774

热带剥爪螨(Blomia tropicalis)

螨虫      Blo t 1 半胱氨酸蛋白酶                      39         C       AF277840

          Blo t 3 胰岛素                              24*        C       Cheong p.c.

          Blo t 4α 淀粉酶                             56         C       Cheong p.c.

          Blo t 5                                                C       U59102

          Blo t 6 胰凝乳蛋白酶                        25         C       Cheong p.c.

          Blo t 10 原肌球蛋白                         33         C       61

          Blo t 11 副肌球蛋白                         110        C       AF525465，61A

          Blo t 12 Bt11a                                         C       U27479

          Blo t 13 Bt6，脂肪酸结合蛋白                           C       U58106

          Blo t 19 抗微生物肽hom.                     7.2        C       Cheong p.c.

粉尘螨(Dermatophagoides farinae)

美洲屋尘螨(American house dust mite)

          Der f 1   半胱氨酸蛋白酶                    25        C        69

          Der f 2                                     14        C        70，70A，参见变应原

                                                                         异构体列表

          Der f 3 胰岛素                              30        C        63

          Der f 7                                     24-31     C        SW：Q26456，71

          Der f 10 原肌球蛋白                                   C        72

          Der f 11 副肌球蛋白                         98        C        72A

          Der f 14 mag3，家蚕体液低分子蛋白(apolipophorin)      C        D17686

          Der f 15 98k 几丁质酶                       98        C        AF178772

          Der f 16 小鼠凝溶胶蛋白(gelsolin)/villin     53        C        71A

          Der f 17 Ca结合EF蛋白                       53        C        71A

          Der f 18w 60k 几丁质酶                      60        C        Weberp.c.

微角尘螨(Dermatophagoides microceras)

屋尘螨(house dust mite)

          Der m 1   半胱氨酸蛋白酶                    25        P        68

屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)

欧洲屋尘螨(European house dust mite)

          Der p 1 抗原 P1，半胱氨酸蛋白酶             25        C        62，参见变应原

                                                                             异构体列表

          Der p 2                                     14        C        62A-C，参见变应原

                                                                             异构体列表

          Der p 3 胰岛素                              28/30     C        63

          Der p 4 淀粉酶                              60        P        64

          Der p 5                                     14        C        65

          Der p 6   胰凝乳蛋白酶                            25         P        66

          Der p 7                                           22/28      C        67

          Der p 8 谷胱甘肽转移酶                                       C        67A

          Der p 9 溶胶原丝氨酸蛋白                                     P        67B

          Der p 10 原肌球蛋白                               36         C        Y14906

          Der p 14 家蚕体液低分子蛋白样蛋白                            C        Eptonp.c.

梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)

螨虫      Eur m 2                                                      C        参见变应原

                                                                                 异构体列表

          Eur m 14 家蚕体液低分子蛋白                       177        C        AF149827

家食甜螨(Glycyphagus domesticus)

储藏室尘螨(storage mite)

          Gly d 2                                                      C        72B，参见变应原

                                                                                      异构体列表

害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)

储藏室尘螨(storage mite)

          Lep d 2 Lep d 1                                   15         C        73，74，74A，

                                                                              参见变应原异构体列表

          Lep d 5                                                      C        75，AJ250278

          Lep d 7                                                      C        75，AJ271058

          Lep d 10原肌球蛋白                                           C        75A，AJ250096

          Lep d 13                                                     C        75，AJ250279

腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)

储藏室尘螨(storage mite)

          Tyr p 2                                                      C        75B，Y12690

E.动物

Bos domesticus

家牛(domestic cattle)

          Bos d 2 Ag3，lipocalin                            20         C        76，参见变应原异构

                                                                              体列表(同时参见食物)

          Bos d 3   Ca-结合S100hom.                         11         C        L39834

          Bos d 4   α-乳白蛋白                              14.2       C        M18780

          Bos d 5   β-乳球蛋白                              18.3       C        X14712

          Bos d 6   血清白蛋白                              67         C        M73993

          Bos d 7   免疫球蛋白                              160                 77

          Bos d 8   酪蛋白                                  20-30               77

家犬(Canis familiaris)

(Canis domesticus)

          Can f 1                                           25         C        78，79

狗       Can f 2                                       27       C       78，79

         Can f 3 白蛋白                                         C       S72946

         Can f 4                                       18       P       A59491

马(Equus caballus)

家马(domestic horse)

         Equ c 1    lipocalin                          25       C       U70823

         Equ c 2    lipocalin                          18.5     P       79A，79B

         Equ c 3    Ag3-白蛋白                         67       C       79C，X74045

         Equ c 4                                       17       P       79D

         Equ c 5    AgX                                17       P       Goubran Botros p.c.

Felis domesticus

猫  (唾液)

         Fel d 1    cat-1                              38       C       15

         Fel d 2    白蛋白                                      C       79E，X84842

         Fel d 3    血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin) 11       C       79F，AF238996

         Fel d 4    lipocalin                          22       C       AY497902

         Fel d 5w 免疫球蛋白 A                         400              Adedoyin p.c

         Fel d 6w 免疫球蛋白 M

800-

1000

         Adedoyin p.c.

         Fel d 7w  免疫球蛋白 G                        150              Adedoyin p.c.

天竺鼠(Cavia porcellus)

天竺鼠(guinea pig)

         Cav p 1    lipocalin 同族体                   20       P       SW：P83507，80

         Cav p 2                                       17       P       SW：P83508

小家鼠(Mus musculus)

小鼠(尿液)

         Mus m 1  MUP                                  19       C       81，81A

褐家鼠(Rattus norvegius)

大鼠(尿液)

         Rat n 1                                       17       C       82，83

F.真菌(霉菌)

   1.子囊菌门(Ascomycota)

      1.1座囊菌目(Dothideales)

烟草赤星病菌(Alternaria alternata)

         Alt a 1                                   28       C        U82633

         Alt a 2                                   25       C        83A，U62442

         Alt a 3 热击蛋白.                         70       C        U87807，U87808

         Alt a 4 蛋白二硫键异构酶                  57       C        X84217

         Alt a 6 酸性核糖体蛋白P2                  11       C        X78222，U87806

         Alt a 7 YCP4蛋白                          22       C        X78225

         Alt a 10 醛脱氢酶                         53       C        X78227，P42041

         Alt a 11 烯醇酶                           45       C        U82437

         Alt a 12 酸性核糖体蛋白P1                 11       C        X84216

草本枝孢(Cladosporium herbarum)

         Cla h 1                                   13                83B，83C

         Cla h 2                                   23                83B，83C

         Cla h 3 醛脱氢酶                          53       C        X78228

         Cla h 4 酸性核糖体蛋白P2                  11       C        X78223

         Cla h 5 YCP4蛋白                          22       C        X78224

         Cla h 6 烯醇酶                            46       C        X78226

         Cla h 12 酸性核糖体蛋白P1                 11       C        X85180

      1.2散囊菌目(Eurotiales)

黄曲霉(Aspergillus flavus)

         Asp fl 13 碱性丝氨酸蛋白酶                34                84

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)

         Asp f 1                                   18       C        M83781，S39330

         Asp f 2                                   37       C        U56938

         Asp f 3 过氧物酶体蛋白                    19       C        U20722

         Asp f 4                                   30       C        AJ001732

         Asp f 5 金属蛋白                          40       C        z30424

         Asp f 6 锰过氧化物歧化酶                  26.5     C        U53561

         Asp f 7                                   12       C        AJ223315

         Asp f 8 核糖体蛋白P2                      11       C        AJ224333

         Asp f 9                                   34       C        AJ223327

         Asp f 10 天冬氨酸蛋白酶                   34       C        X85092

         Asp f 11 肽基脯氨酰异构酶                 24                84A

         Asp f 12 热击蛋白P90                      90       C        85

         Asp f 13 碱性丝氨酸蛋白蜜                 34                84B

         Asp f 15                                  16       C        AJ002026

         Asp f 16                                  43       C        g3643813

         Asp f 17                                           C        AJ224865

         Asp f 18 气泡丝氨酸蛋白酶                 34                84C

         Asp f 22w 烯醇酶                          46       C        AF284645

         Asp f 23 L3 核糖体蛋白                    44       C        85A，AF464911

黑曲霉(Aspergillus niger)

        Asp n 14 β-木糖苷酶                            105        C       AF108944

        Asp n 18 气泡丝氨酸蛋白酶                      34         C       84B

        Asp n 25 3-肌醇六磷酸酶B                       66-100     C       85B，P34754

        Asp n？                                        85         C       Z84377

米曲霉(Aspergillus oryzae)

        Asp o 13 碱性丝氨酸酶                          34         C       X17561

        Asp o 21 TAKA-淀粉酶 A                         53         C       D00434，M33218

短密青霉菌(Penicillium brevicompactum)

        Pen b 13 碱性丝氨酸酶                          33                 86A

产黄青霉(Penicillium chrysogenum)

(旧称点青霉(P.notatum))

        Pen ch 13 碱性丝氨酸酶                         34                 87

        Pen ch 18 气泡丝氨酸蛋白酶                     32                 87

        Pen ch 20 N-乙酰-β-葡糖胺酶                    68                 87A

桔青霉(Penicillium citrinum)

        Pen c 3 过氧化物酶体膜蛋白                     18                 86B

        Pen c 13 碱性丝氨酸酶                          33                 86A

        Pen c 19 热击蛋白 P70                          70         C       U64207

        Pen c 22w 烯醇酶                               46         C       AF254643

        Pen c 24 延长因子 1β                                      C       AY363911

草酸青霉(Penicillium oxalicum)

        Pen o 18 气泡丝氨酸蛋白酶                      34                 87B

    1.3 肉座菌目(Hypocreales)

黄色镰孢(Fusarium culmorum)

        Fus c 1 核糖体蛋白 P2                          11*        C       AY077706

        Fus c 2 硫氧还蛋白样蛋白                       13*        C       AY077707

    1.4 爪甲团囊菌(Onygenales)

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)

        Tri r 2                                                   C       88

        Tri r 4 丝氨酸蛋白酶                                      C       88

断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)

        Tri t 1                                        30         P       88A

        Tri t 4 丝氨酸蛋白酶                           83         C       88

      1.5酵母目(Saccharomycetales)

白色念珠菌(Candida albicans)

         Cand a 1                                         40        C         89

         Cand a 3 过氧化物酶体蛋白                        29        C         AY136739

甲醇酵母(Candida boidinii)

         Cand b 2                                         20        C         J04984，J04985

2.担子菌亚门(Basidiomycotina)

2.1层菌纲(Hymenomycetes)

古巴裸盖菇(Psilocybe cubensis)

         Psi c 1

         Psi c 2    亲环素                                16                  89A

毛头鬼伞(Coprinus comatus)

shaggy cap

         Cop c 1 亮氨酸拉链蛋白                           11        C         AJ132235

         Cop c 2                                                              AJ242791

         Cop c 3                                                              AJ242792

         Cop c 5                                                              AJ242793

         Cop c 7                                                              AJ242794

      2.2锈菌纲(Urediniomycetes)

粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)

         Rho m 1 烯醇酶                                   47        C         89B

         Rho m 2 气泡丝氨酸蛋白酶                         31        C         AY547285

      2.3黑粉菌纲(Ustilaginomycetes)

Malassezia furfur

         Mala f 2 MF1，过氧化物酶体膜蛋白                 21        C         AB011804，90

         Mala f 3 MF2，过氧化物酶体膜蛋白                 20        C         AB011805，90

         Mala f 4 线粒体苹果酸盐脱氢酶                    35        C         AF084828，90A

马拉色菌(Malassezia sympodialis)

         Mala s 1                                                   C         X96486，91

         Mala s 5                                         18*       C         AJ011955

         Mala s 6                                         17*       C         AJ011956

         Mala s 7                                                   C         AJ011957，91A

        Mala s 8                              19*         C          AJ011958，91A

        Mala s 9                              37*         C          AJ011959，91A

        Mala s 10 热击蛋白 70                 86          C          AJ428052

        Mala s 11 锰过氧化物歧化酶.           23          C          AJ548421

3.半知菌亚门(Deuteromycotina)

3.1瘤座菌目(Tuberculariales)

紫附球菌(Epicoccum purpurascens)

(旧称E.nigrum)

       Epi p 1   丝氨酸蛋白酶                 30          P          SW：P83340，91B

G.昆虫

埃及斑蚊(Aedes aegyptii)

蚊子

       Aed a 1   三磷酸腺苷双磷酸酶            68          C          L12389

       Aed a 2                                37          C          M33157

西方蜜蜂(Apis mellifera)

蜜蜂

       Api m 1   磷脂酶 A2                    16          C          92

       Api m 2   透明质酸酶                   44          C          93

       Api m 4   蜂毒肽                       3           C          94

       Api m 6                                7-8         P          Kettner p.c.

       Api m 7   CUB丝氨酸蛋白酶              39           C          AY127579

熊蜂(Bombus pennsylvanicus)

大黄蜂bumble bee

       Bom p 1   磷脂酶                       16          P          95

       Bom p 4   蛋白酶                                   P          95

德国小蠊(Blattella germanica)

德国小蠊(German cockroach)

       Bla g 1 Bd90k                                     C

       Bla g 2 天冬蛋白酶                     36          C          96

       Bla g 4 卡里碱(calycin)                21          C          97

       Bla g 5 谷胱甘肽转移酶                 22          C          98

       Bla g 6 肌钙蛋白 C                     27          C          98

美洲大蠊(Periplaneta americana)

美洲大蠊(American cockroach)

       Per a 1   Cr-PII                                   C

       Per a 3   Cr-PI                        72-78       C         98A

       Per a 7   原肌球蛋白                   37          C          Y14854

花翅摇蚊(Chironomus kiiensis)

蚊       Chi k 10   原肌球蛋白                   32.5*         C         AJ012184

拟背摇蚊(Chironomus thummi thummi)

蚊       Chi t 1-9  血色素                       16            C         99

         Chi t 1.01 成分III                      16            C         P02229

         Chi t 1.02 成分IV                       16            C         P02230

         Chi t 2.0101     成分I                  16            C         P02221

         Chi t 2.0102     成分IA                 16            C         P02221

         Chi t 3    成分II-beta                  16            C         P02222

         Chi t 4    成分IIIA                     16            C         P02231

         Chi t 5    成分VI                       16            C         P02224

         Chi t 6.01 成分VIIA                     16            C         P02226

         Chi t 6.02 成分IX                       16            C         P02223

         Chi t 7    成分VIIB                     16            C         P02225

         Chi t 8    成分VIII                     16            C         P02227

         Chi t 9    成分X                        16            C         P02228

猫蚤(Ctenocephalides felis felis)

猫蚤

         Cte f 1

         Cte f 2    M1b                          27            C         AF231352

         Cte f 3                                 25            C

松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa)

松异带蛾(pine processionary moth)

         Tha p 1                                 15            P         PIR：A59396，99A

衣鱼(Lepisma saccharina)

蠹虫(silverfish)

         Lep s 1    原肌球蛋白                   36            C         AJ309202

大黄蜂(Dolichovespula maculata)

白面大黄蜂(white face hornet)

         Dol m 1    磷脂酶 A1                    35            C         100

         Dol m 2    透明质酸酶                   44            C         101

         Dol m 5    抗原 5                       23            C         102，103

黄蜂(Dolichovespula arenaria)

黄蜂(yellow hornet)

         Dol a 5    抗原 5                       23            C         104

Polistes annularies

黄蜂     Pol a 1    磷脂酶 Al                    35            P         105

         Pol a 2    透明质酸酶                   44            P         105

         Pol a 5    抗原 5                       23            C         104

胡蜂(Polistes dominulus)

地中海纸黄蜂(Mediterranean paper wasp)

       Pol d 1                                                        Hoffman p.c.

       Pol d 4 丝氨酸蛋白酶                        32-34       C       Hoffman p.c

       Pol d 5                                                         P81656

纸质黄蜂(Polistes exclamans)

黄蜂   Pol e 1   磷脂酶 Al                         34          P       107

       Pol e 5   抗原 5                            23          C       104

马蜂(Polistesfuscatus)

黄蜂   Pol f 5   抗原 5                            23          C       106

柞蚕马蜂(Polistes gallicus)

黄蜂   Pol g 5   抗原 5                            24          C       P83377

黄蜂(Polistes metricus)

黄蜂   Pol m 5   抗原 5                            23          C       106

黄边胡蜂(Vespa crabo)

欧洲蜜蜂(European honey)

       Vesp c 1 磷脂酶                             34          P       107

       Vesp c 5 抗原 5                             23          C       106

黑胡蜂(Vespa mandarina)

雀锋(giant asian hornet)

       Vesp m 1                                                        Hoffman p.c.

       Vesp m 5                                                        P81657

Vespula flavopilosa

黄蜂  Ves f 5     抗原 5                           23          C       106

德国黄胡蜂(Vespula germanica)

黄蜂  Ves g 5     抗原 5                           23          C       106

Vespula maculifrons

黄蜂

       Ves m 1 磷脂酶 Al                           33.5        C       108

       Ves m 2 透明质酸酶                          44          P       109

       Ves m 5 抗原 5                              23          C       104

Vespula pennsylvanica

黄蜂

       Ves p 5   抗原 5                            23          C       106

Vespula squamosa

黄蜂

       Ves s 5   抗原 5                            23          C       106

Vespula vidua

黄蜂   Ves vi 5  抗原 5                            23          C       106

黄胡蜂(Vespula vulgaris)

黄蜂

       Ves v 1   磷脂酶 Al                         35          C       105A

          Ves v 2   透明质酸酶                       44       P         105A

          Ves v 5   抗原 5                           23       C         104

Myrmecia pilosula

澳洲跳蚁(Australian jumper ant)

          Myr p 1                                             C         X70256

          Myr p 2                                             C         S81785

火蚁(Solenopsis geminata)

热带红火蚁(tropical fire ant)

          Sol g 2                                                       Hoffman p.c.

          Sol g 4                                                       Hoffman p.c.

红火蚁(Solenopsis invicta)

火蚁      Sol i 2                                    13       C         110，111

          Sol i 3                                    24       C         110

          Sol i 4                                    13       C         110

火蚁(Solenopsis saevissima)

巴西火蚁(Brazilian fire ant)

          Sol s 2                                                       Hoffman p.c.

Triatoma protracta

加州吸血虫(California kissing bug)

          Tria p 1   Procalin                        20       C         AF179004，111AH.食物

鳕鱼

鳕

          Gad c 1    变应原 M                        12       C         112，113

大西洋鲑

亚特兰大鲑鱼(Atlantic salmon)

          Sal s 1    小清蛋白                        12       C         X97824

Bos domesticus

domestic cattle

          Bos d 4   α乳白蛋白                        14.2     C         M18780

(牛奶)    Bos d 5   β-乳球蛋白                       18.3     C         X14712

同时参见动物

          Bos d 6   血清白蛋白                       67       C         M73993

          Bos d 7   免疫球蛋白                       160                77

          Bos d 8   酪蛋白                           20-30              77

鲤鱼(Cyprinus carpio)

          (普通鲤鱼(Common carp))

          Cyp c 1      小清蛋白                      12       C         129

家鸡(Gallus domesticus)

鸡

          Gal d 1   卵类粘蛋白                       28       C         114，115

          Gal d 2   卵清蛋白                     44        C        114，115

          Gal d 3   Ag22，伴清蛋白               78        C        114，115

          Gal d 4   溶解酵素                     14        C        114，115

          Gal d 5   血清白蛋白                   69        C        X60688

刀额新对虾(Metapenaeus ensis)

虾        Met e 1   原肌球蛋白                             C        U08008

棕虾(Penaeus aztecus)

虾        Pen a 1   原肌球蛋白                   36        P        116

印度对虾(Penaeus indicus)

虾        Pen i 1   原肌球蛋白                   34        C        116A

节对虾(Penaeus monodon)

黑虎虾(black tiger shrimp)

          Pen m 1   原肌球蛋白                   38        C

          Pen m 2   精氨酸激酶                   40        C        AF479772，117

北鱿((Todarodes pacificus)

鱿鱼      Tod p 1   原肌球蛋白                   38        P        117A

散大蜗牛(Helix aspersa)

散大蜗牛(brown garden snail)

          Hel as 1  原肌球蛋白                   36        C        Y14855，117B

南非鲍螺(Haliotis midae)

鲍鱼      Hal m 1                                49                 117C

食用蛙(Rana esculenta)

食用蛙

          Ran e 1   小清蛋白 α                   11.9*     C        AJ315959

          Ran e 2   小清蛋白 β                   11.7*     C        AJ414730

芥菜(Brassica juncea)

西亚大蒜芥(oriental mustard)

          Bra j 1   2S 白蛋白                    14        C        118

甘蓝型油菜(Brassica napus)

油菜籽

          Bra n 1   2S 白蛋白                    15        P        118A，P80208

白菜型冬油菜(Brassica rapa)

芜箐      Bra r 2   hom：prohevein               25                 P81729

大麦(Hordeum vulgare)

大麦      Hor v 15  BMAI-1                       15        C        119

          Hor v 16  α-淀粉酶

          Hor v 17  β-淀粉酶

          Hor v 21  γ-3 大麦醇溶蛋白             34        C        119A，

SW：P80198

黑麦(Secale cereale)

黑麦     Sec c 20  黑麦精                                         参见变应原异构体列表

小麦(Triticum aestivum)

小麦     Tri a 18  凝集素

         Tri a 19  ω-5麸朊                     65        P        PIR：A59156

玉米(Zea mays)

玉米(maise)，玉米(corn)

         Zeam 14 脂肪转移蛋白.                 9         P        P19656

水稻(Oryza sativa)

水稻     Ory s 1                                         C        119B，U31771

芹菜籽(Apium graveolens)

芹菜     Api g 1   hom：Bet v 1                16*       C        Z48967

         Api g 4   前纤维蛋白                                         AF129423

         Api g 5                               55/58     P        81943

胡萝卜(Daucus carota)

胡萝卜   Dau c 1   hom：Bet v 1                16        C        117D，参见变应原

                                                                           异构体列表

         Dau c 4   前纤维蛋白                            C        AF456482

欧洲榛子(Corylus avellana)

榛实

         Cor a 1.04 hom：Bet v 1               17        C        参见变应原异构体列表

         Cor a 2   前纤维蛋白                  14        C         AF327622

         Cor a 8   脂肪转移蛋白                9         C         AF329829

苹果(Malus domestica)

苹果     Mal d 1 hom：Bet v 1                            C        参见变应原异构体列表

         Mal d 2 hom：植物甜蛋白(thaumatin)              C         AJ243427

         Mal d 3 脂肪转移蛋白                  9         C         Pastorello p.c.

         Mal d 4 前纤维蛋白                    14.4*     C        参见变应原异构体列表

梨(Pyrus communis)

梨       Pyr c 1 hom：Bet v 1                  18        C        AF05730

         Pyr c 4 前纤维蛋白                    14        C        AF129424

         Pyr c 5 hom：异黄酮还原酶             33.5      C        AF071477

油梨(Persea americana)

鳄梨    Pers a 1    内几丁质酶                 32        C        Z78202

杏(Prunus armeniaca)

杏

         Pru ar 1   hom：Bet v 1                         C        U93165

         Pru ar 3 脂肪转移蛋白                 9         P

甜樱桃(Prunus avium)

甜樱桃

          Pru av 1 hom：Bet v 1                               C         U66076

          Pru av 2 hom：植物甜蛋白                            C         U32440

          Pru av 3 脂肪转移蛋白                      10       C         AF221501

          Pru av 4 前纤维蛋白                        15       C         AF129425

欧洲李(Prunus domestica)

欧洲李

          Pru d 3 脂肪转移蛋白                       9        P         119C

桃(Prunus persica)

桃        Pru p 3 脂肪转移蛋白                       10       P         P81402

          Pru p 4 前纤维蛋白                         14       C         参见变应原异构体列表

绿芦笋(Asparagus officinalis)

芦笋

          Aspa o 1 脂肪转移蛋白                      9        P         119D

藏红花(Crocus sativus)

藏红花    Cro s 1                                    21                 VarastehA-Rp.c

莴苣(Lactuca sativa)

莴苣

          Lac s 1   脂肪转移蛋白                     9                  Vieths p.c

葡萄(Vitis vinifera)

葡萄      Vit v 1   脂肪转移蛋白                     9        P         P80274

香蕉(Musa x paradisiaca)

香蕉      Mus xp 1  前纤维蛋                         15       C         AF377948

菠萝(Ananas comosus)

菠萝

          Ana c 1 前纤维蛋白                         15       C         AF377949

          Ana c 2 bromelain                          22.8*    C         119E-G，D14059

柠檬(Citrus limon)

柠檬      Cit 1 3 脂肪转移蛋白                       9        P         Torrejon p.c.

甜橙(Citrus sinensis)

甜橙

          Cit s 1 germin样蛋白                       23       P         Torrejon p.c.

          Cit s 2 前纤维蛋白                         14       P         Torrejon p.c.

          Cit s 3 脂肪转移蛋白                       9        P         Torrejon p.c.

荔枝(Litchi chinensis)

荔枝      Lit c 1    前纤维蛋白                      15       C         AY049013

白芥(Sinapis alba)

黄芥

          Sin a 1    2S 白蛋白                       14       C         120

大豆(Glycine max)

大豆    Gly m 1   HPS                            7         P       120A

        Gly m 2                                  8         P       A57106

        Gly m 3   前纤维蛋白                     14        C       参见变应原异构体列表

        Gly m 4   (SAM22)  PR-10 蛋白.           17        C       X60043，120B

绿豆(Vigna radiata)

绿豆

        Vigr 1    PR-10 蛋白                     15        C       AY792956

花生(Arachis hypogaea)

花生    Ara h 1   豌豆球蛋白                     63.5      C       L34402

        Ara h 2   conglutin                     17        C       L77197

        Ara h 3   大豆球蛋白                     60        C       AF093541

        Ara h 4 大豆球蛋白                       37        C       AF086821

        Ara h 5 前纤维蛋白                       15        C       AF059616

        Ara h 6 hom：羽扇豆球蛋白(conglutin)     15        C       AF092846

        Ara h 7 hom：羽扇豆球蛋白                15        C       AF091737

        Ara h 8 PR-10 蛋白                       17        C       AY328088

兵豆(Lens culinaris)

小扁豆  Len c 1 豌豆球蛋白                       47        C       参见变应原异构体列表

        Len c 2 种子生物素化蛋白.                66        P       120C

豌豆(Pisum savitum)

豌豆    Pis s 1 豌豆球蛋白                       44        C       参见变应原异构体列表

        Pis s 2    convicilin                   63        C       未决

中华猕猴桃(Actinidia chinensis)

几维    Act c 1 半胱氨酸蛋白酶                   30        P       P00785

        Act c 2 植物甜蛋白样蛋白                 24        P       SW：P81370，121

菜椒(Capsicum annuum)

甜椒(bell pepper)

        Cap a 1w 逆渗透蛋白(osmotin)样蛋白       23        C       AJ297410

        Cap a 2 前纤维蛋白                       14        C       AJ417552

番茄(Lycopersicon esculentum)

番茄    Lyc e 1 前纤维蛋白                       14        C       AJ417553

        Lyc e 2 b-呋喃果糖苷酶                   50        C       参见变应原异构体列表

        Lyc e 3 脂肪转移蛋白                     6         C       U81996

马铃薯(Solanum tuberosum)

马铃薯  Sola t 1 马铃薯块茎特异蛋白(patatin)     43        P       P15476

        Sola t 2 组织蛋白酶D抑制剂               21        P       P16348

        Sola t 3 半胱氨酸蛋白酶抑制剂            21        P       P20347

        Sola t 4 天冬蛋白酶抑制剂                16+4      P       P30941

巴西坚果(Bertholletia excelsa)

巴西坚果(Brzail nut)

         Ber e 1 2S 白蛋白                      9        C        P04403，M17146

         Ber e 2 11S 球蛋白种子贮存蛋白         29       C        AY221641

东部黑核桃(Juglans nigra)

山核桃(black walnut)

         Jug n 1 2S 白蛋白                      19*      C        AY102930

         Jugn 2 豌豆球蛋白样蛋白                56*      C        AY102931

核桃(Juglans regia)

英国核桃(English walnut)

         Jug r 1 2S 白蛋白                              C        U66866

         Jug r 2 豌豆球蛋白                    44       C        AF066055

         Jug r 3 脂肪转移蛋白                  9        P        Pastorello

腰果(Anacardium occidentale)

腰果     Ana o 1 豌豆球蛋白样蛋白               50       C        参见变应原异构体列表

         Ana o 2 豆球蛋白样蛋白                 55       C        AF453947

         Anao 3 2S 白蛋白                       14       C        AY081853

蓖麻(Ricinus communis)

蓖麻子

         Ricc 1 2S 白蛋白                               C        P01089

芝麻(Sesamum indicum)

芝麻     Ses i 1 2S 白蛋白                      9       C        121A，AF240005

         Ses i 2 2S 白蛋白                      7       C        AF091841

         Ses i 3 7S 豌豆球蛋白样蛋白            45      C        AF240006

         Ses i 4 油质蛋白(Oleosin)              17      C        AAG23840

         Ses i 5 油质蛋白                       15      C        AAD42942

厚皮甜瓜(Cucumis melo)

香瓜

         Cuc m 1 丝氨酸蛋白酶                   66       C        D32206

         Cuc m 2 前纤维蛋白                     14       C        AY271295

         Cuc m 3 发病机理相关性蛋白PR-1          16*      P        P83834

I.其他的

海兽胃线虫(Anisakis simplex)

线虫

         Ani s 1                                24       P        121B，A59069

         Ani s 2    副肌球蛋白                  97       C        AF173004

         Ani s 3    原肌球蛋白                  41       C        121C，Y19221

         Ani s 4                                9        P        P83885

翘缘锐缘蟀(Argas reflexus)

壁虱(pigeon tick)

         Arg r 1                                 17       C        AJ697694

猪蛔虫(Ascaris suum)

蠕虫     Asc s 1                                 10       P        122

番木瓜(Carica papaya)

木瓜     Car p 3w  木瓜蛋白酶                    23.4*    C        122A，M15203

软珊瑚(Dendronephthya nipponica)

软珊瑚

         Den n 1                                 53       P        122B

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)

橡胶(橡胶)

         Hev b 1   延伸因子                      58       P        123，124

         Hev b 2   1，3-葡聚糖酶                 34/36    C        125

         Hev b 3                                 24       P        126，127

         Hev b 4         microhelix 复合物成分   100-     P        128

         115

         Hev b 5                                 16       C        U42640

         Hev b 6.01 橡胶蛋白前体                 20       C        M36986，p02877

         Hev b 6.02 橡胶蛋白                     5        C        M36986，p02877

         Hev b 6.03 C-末端片段                   14       C        M36986，p02877

         Hev b 7.01 hom：来自B血清的马铃薯块茎特异蛋白 42     C       U80598

         Hev b 7.02 hom：来自C血清的马铃薯块茎特异蛋白 44     C       AJ223038

         Hev b 8 前纤维蛋白                      14       C        参见变应原异构体列表

         Hev b 9 烯醇酶                          51       C        AJ132580

         Hev b 10 锰过氧化物歧化酶               26       C        参见变应原异构体列表

         Hev b 11 1类几丁质酶                             C        参见变应原异构体列表

         Hev b 12 脂肪转移蛋白                   9.3      C        AY057860

         Hev b 13 酯酶                           42       P        P83269

智人(Homo sapiens)

人自身变应原(human autoallergens)

         Hom s 1                                 73*      C        Y14314

         Hom s 2                                 10.3*    C        X80909

         Hom s 3                                 20.1*    C        X89985

         Hom s 4                                 36*      C        Y17711

         Hom s 5                                 42.6*    C        P02538

硬白梧桐(Triplochiton scleroxylon)

非洲轻木(obeche)       Trip s 1    1类几丁质酶   38.5     P        Kespohl p.c.

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根据本发明的一个优选具体实施方式，低变应原性分子表现出减少的IgE结 合能力。

根据本发明的另一个优选具体实施方式，低变应原性分子表现出减少的T细 胞反应活性。

但是，在根据本发明所述的低变应原性分子中也可使用包含至少一个T细胞 表位的变应原片段。

如这里所用的“表现出减少的IgE结合能力”意思是，根据本发明所述的分 子显示出显著减少的IgE结合能力或活性(与野生型变应原相比，结合能力至少 减少50％，优选为至少减少70％，更优选为至少减少80％，再更优选为至少减少 90％，最优选为至少减少95％)或甚至完全缺失。

分子(像肽和蛋白)的IgE结合活性/能力可通过例如酶联免疫吸附测试 (ELISA)使用例如从曾经暴露于野生型变应原的个体(例如过敏性个体)获得的 血清来确定。简单来说，将待测肽包被至微量滴定板的孔中。洗涤并封闭孔后， 以抗体溶液(由过敏性个体的血浆组成，该个体曾暴露于所测肽或由其制备的蛋 白)在孔中温育。向孔中加入标记的二抗并温育。然后IgE结合的数量被定量并 与纯化的野生型变应原的IgE结合相比较。

或者，肽的结合能力可通过Western杂交分析确定。例如，使用SDS-PAGE 将所测肽在聚丙烯酰胺凝胶中分析。然后将该肽转移至硝化纤维，接下来以来自 过敏性个体的血清温育。经标记的二抗温育后，所结合的IgE数量被确定和定量。

另外一个可用于确定肽的IgE结合活性的测试为ELISA竞争测试。简单来说， 通过混合来自过敏性个体(通过直接ELISA表明其与野生型变应原有IgE反应活 性)的血浆产生一个IgE抗体库。在ELISA竞争测试中使用这个库将野生型变应 原的IgE结合与所测肽相比较。野生型变应原和所测肽的IgE结合被确定并定量。

“T细胞表位”意思是蛋白(例如变应原)或其片段，对于它T细胞具有抗 原特异性结合位点，结合至所述结合位点的结果为激活该T细胞。如这里所用的 术语“表现出减少的T细胞反应活性”是指分子表现出T细胞反应活性，使用本 领域已知的标准测试中的等摩尔量，与野生型变应原(低变应原性分子源自该野 生型变应原)所诱导的刺激相比，所述反应活性显著性减少(减少的T细胞反应 活性意味着，在等摩尔数量下，与野生型变应原相比，低变应原性分子的刺激减 少至少30％，优选为至少50％，更优选为至少70％，最优选为至少90％)。在本发 明的一个特别具体实施方式中，该分子可“缺少”T细胞表位，因此在待处理的个 体(即，将接受表位呈递价态分子)中分子显示出减少的T细胞反应活性。例如 可能是，源于变应原的分子相对于一个个体或一组个体为缺少T细胞表位，但相 对于其他个体则具有T细胞表位。检测T细胞表位存在的方法在本领域是已知的， 包括检测T细胞增殖的测试(例如胸苷摄入)。不能诱导统计学上显著高于背景(即， 使用标准的统计学方法，通常p小于0.05)的胸苷摄入的免疫原通常被认为是缺 少T细胞表位，虽然将意识到，胸苷摄入的定量数量可依赖于所测的免疫原而变 化(参见例如，Zhen L.等人(Infect Immun.(2003)71：3920-3926))。通常， 低于大约2-3的刺激指数(更优选为低于大约1)表明缺少T细胞反应活性和表位。 也可根据标准方法通过测定源自T细胞的淋巴因子的分泌来确定T细胞表位的存 在。可通过将受刺激细胞的增殖率(胸苷摄入)除以只在培养液中的未刺激细胞 的增值率来计算刺激系数(SI)。SI＝1意味着无刺激，SI<1意味着毒性效应，SI>1 意味着对细胞的刺激。可通过经验确定T细胞表位的位置和内容(如果存在的话)。

除了T细胞的刺激，还可确定细胞因子的分泌。例如，IFN-γ已被识别为有害 细胞因子。其他的例子可以是TNF-α、IL-5、IL-4、IL-8等。

优选地，变应原片段由下列组成：Phl p 1的151至177、87至117、1至30、 43至70或212至241位氨基酸，Phl p 5的93至128、98至128、26至53、26 至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸，Fel d 1的链1 的1至34或35至70位氨基酸，Fel d 1的链2的1至34、35至63或64至92位 氨基酸，Bet v 1的30至59、50至79或75至104位氨基酸，Der p 2的1至33、 21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Der p 7的1至30、20至50、 50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Der p 10的1-35、36-70、 71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸，Der p 21的1 至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48 或32至70位氨基酸，Alt a 1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨 基酸，Par j 2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e 1的1 至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Fel d 2的25至58、 99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至 608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416 至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f 2的19至58、52至91、82至 119、106至144或139至180位氨基酸，Can f 1的19至56、51至90、78至118、 106至145或135-174位氨基酸，Art v 1的27至70、70至100或92至132位氨 基酸，Amb a 1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264 至300 305至350或356至396位氨基酸，Alt a 6的1至34、35至74、74至115、 125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基 酸，Alt a 2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其 序列变体。

以上所列源自变应原的分子的具体氨基酸序列为：

  肽 位置 序列 SEQ ID No. Pep Alt a 1.1 19-58 APLESRQDTASCPVTTEGDYVWKISEFYGRKPEG TYYNSL                             23 肽 Alt a 1.2 59-95 GFNIKATNGGTLDFTCSAQADKLEDHKWYSCGE NSFM                              24 肽 Alt a 1.3 91-120 ENSFMDFSFDSDRSGLLLKQKVSDDITYVA 25 肽 Alt a 1.4 121-157 TATLPNYCRAGGNGPKDFVCQGVADAYITLVTLP KSS                                26 肽 Alt a 2.1 1-40 MHSSNNFFKDNIFRSLSKEDPDYSRNIEGQVIRLH WDWAQ                               27 肽 Alt a 2.2 41-80 LLMLSAKRMKVAFKLDIEKDQRVWDRCTADDLK GRNGFKR                           28 肽 Alt a 2.3 81-120 CLQFTLYRPRDLLSLLNEAFFSAFRENRETIINTDL EYAA                                 29 肽 Alt a 2.4 121-160 KSISMARLEDLWKEYQKIFPSIQVITSAFRSIEPELT VYT                                   30 肽 Alt a 2.5 161-190 CLKKIEASFELIEENGDPKITSEIQLLKAS 31 肽 Alt a 6.1 1-34 MTITKIHARSVYDSRGNPTVEVDIVTETGLHRAI 32 肽 Alt a 6.2 35-74 VTETGLHRAIVPSGASTGSHEACELRDGDKSKWG GKGVTK                             33 肽 Alt a 6.3 74-115 APALIKEKLDVKDQSAVDAFLNKLDGTTNKTNLG ANAILGVS                           34 肽 Alt a 6.4 125-165 EKGVPLYAHISDLAGT        KKPYVLPVPF QNVLNGGSHAGGRLA                    35 肽 Alt a 6.5 174-213 CEAPTFSEAMRQGAEVYQKLKALAKKTYGQSAG NVGDEGG                           36 肽 Alt a 6.6 241-280 IKIAMDVASSEFYKADEKKYDLDFKNPDSDKSKW LTYEQL                             37 肽 Alt a 6.7 294-333 VSIEDPFAEDDWEAWSYFFKTYDGQIVGDDLTVT NPEFIK                             38 肽 Alt a 6.8 361-400 AKDAFGAGWGVMVSHRSGETEDVTIADIVVGLR SGQIKTG                           39 肽 Alt a 6.9 401-438 APARSERLAKLNQILRIEEELGDNAVYAGNNFRTA VNL                                 40 肽 Amb a 1.1 31-70 EILPVNETRRLTTSGAYNIIDGCWRGKADWAENR KALADC                             41 肽 Amb a 1.2 80-120 GGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQN RPLWIIFE                          42 肽 Amb a 1.3 125-155 IRLDKEMVVNSDKTTDGRGAKVEIINAGFTL 43 肽 Amb a 1.4 160-200 NVIIHNINMHDVKVNPGGLIKSNDGPAAPRAGSD GDAISIS                            44 肽 Amb a 1.5 225-263 GTTRLTVSNSLFTQHQFVLLFGAGDENIEDRGML ATVAF                              45 肽 Amb a 1.6 264-300 NTFTDNVDQRMPRCRHGFFQVVNNNYDKWGSY AIGGS                            46 肽 Amb a 1.7 305-350 ILSQGNRFCAPDERSKKNVLGRHGEAAAESMKW NWRTNKDVLENGA                     47 肽 Amb a 1.8 356-396 GVDPVLTPEQSAGMIPAEPGESALSLTSSAGVLSC QPGAPC                              48 肽 Art v 1.1 27-70 SKLCEKTSKTYSGKCDNKKCDKKCIEWEKAQHG ACHKREAGKES                       49 肽 Art v 1.2 70-100 SCFCYFDCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGS 50 肽 Art v 1.3 92-132 APPPAAGGSPSPPADGGSPPPPADGGSPPVDGGSPP PPSTH                                51 Can f 1肽1 19-56 QDTPALGKDTVAVSGKWYLKAMTADQEVPEKPD SVTPM                             52 Can f 1肽2 51-90 DSVTPMILKAQKGGNLEAKITMLTNGQCQNITVV 53

  肽 位置 序列 SEQ ID No. LHKTSE Can f 1肽3 78-118 CQNITVVLHKTSEPGKYTAYEGQRVVFIQPSPVRD HYILYC                              54 Can f 1肽4 106-145 QPSPVRDHYILYCEGELHGRQIRMAKLLGRDPEQ SQEALE                             55 Can f 1肽5 135-174 RDPEQSQEALEDFREFSRAKGLNQEILELAQSETC SPGGQ                               56 Can f 2肽1 19-58 QEGNHEEPQGGLEELSGRWHSVALASNKSDLIKP WGHFRV                             57 Can f 2肽2 52-91 PWGHFRVFIHSMSAKDGNLHGDILIPQDGQCEKV SLTAFK                             58 Can f 2肽3 82-119 CEKVSLTAFKTATSNKFDLEYWGHNDLYLAEVDP KSYL                               59 Can f 2肽4 106-144 NDLYLAEVDPKSYLILYMINQYNDDTSLVAHLMV RDLSR                              60 Can f 2肽5 139-180 VRDLSRQQDFLPAFESVCEDIGLHKDQIVVLSDDD RCQGSRD                             61 Fel d 2肽1 25-58 EAHQSEIAHRFNDLGEEHFRGLVLVAFSQYLQQC 62 Fel d 2肽2 99-133 CTVASLRDKYGEMADCCEKKEPERNECFLQHKD DN                                63 Fel d 2肽3 154-183 NEQRFLGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYAE 64 Fel d 2肽4 277-307 CADDRADLAKYICENQDSISTKLKECCGKPV 65 Fel d 2肽5 334-363 VEDKEVCKNYQEAKDVFLGTFLYEYSRRHP 66 Fel d 2肽6 373-402 LAKEYEATLEKCCATDDPPACYAHVFDEFK 67 Fel d 2肽7 544-573 EKQIKKQSALVELLKHKPKATEEQLKTVMG 68 Fel d 2肽8 579-608 VDKCCAAEDKEACFAEEGPKLVAAAQAALA 69 Fel d 2肽9 58-99 CPFEDHVKLVNEVTEFAKGCVADQSAANCEKSLH ELLGDKLC                           70 Fel d 2肽10 125-165 CFLQHKDDNPGFGQLVTPEADAMCTAFHENEQR FLGKYLYE                          71 Fel d 2肽11 183-224 EEYKGVFTECCEAADKAACLTPKVDALREKVLA SSAKERLKC                         72 Fel d 2肽12 224-261 CASLQKFGERAFKAWSVARLSQKFPKAEFAEISKL VTD                                 73 Fel d 2肽13 252-289 FAEISKLVTDLAKIHKECCHGDLLECADDRADLA KYIC                               74 Fel d 2肽14 303-340 CGKPVLEKSHCISEVERDELPADLPPLAVDFVEDK EVC                                 75 Fel d 2肽15 416-457 CELFEKLGEYGFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVE VSRSLGKV                           76 Fel d 2肽16 460-500 CTHPEAERLSCAEDYLSVVLNRLCVLHEKTPVSE RVTKC                              77 Fel d 2肽17 501-542 CTESLVNRRPCFSALQVDETYVPKEFSAETFTFHA DLCTLPE                             78 肽 Ole e 1.1 1-40 EDIPQPPVSQFHIQGQVYCDTCRAGFITELSEFIPG ASLR                                 79 肽 Ole e 1.2 36-66 GASLRLQCKDKENGDVTFTEVGYTRAEGLYS 80 肽 Ole e 1.3 63-99 GLYSMLVERDHKNEFCEITLISSGRKDCNEIPTEG WA                                  81 肽 Ole e 1.4 86-120 GRKDCNEIPTEGWAKPSLKFKLNTVNGTTRTVNP L                                  82 肽 Ole e 1.5 107-145 LNTVNGTTRTVNPLGFFKKEALPKCAQVYNKLG MYPPNM                            83 肽 Par j 2.1 31-60 GEEACGKVVQDIMPCLHFVKGEEKEPSKEC 84 肽 Par j 2.2 45-80 CLHFVKGEEKEPSKECCSGTKKLSEEVKTTEQKR EA                                 85 肽 Par j 2.3 60-96 CCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVRATKGISGI KN                                  86

  肽 位置 序列 SEQ ID No. 肽 Par j 2.4 97-133 ELVAEVPKKCDIKTTLPPITADFDCSKIQSTIFRGY Y                                    87 Der p 1肽1 1-30 TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGG 88 Der p 1肽2 52-84 NQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ 89 Der p 1肽3 85-115 HNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISN 90 Der p 1肽4 99-135 REQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQ TH                                  91 Der p 1肽5 145-175 KDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIV 92 Der p 1肽6 155-187 GRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWI 93 Der p 1肽7 175-208 VGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFA ANI                             94 Der p 1肽8 188-222 VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYV VIL                              95 Der p 2肽1 1-33 DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGK 96 Der p 2肽2 21-51 CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK 97 Der p 2肽3 42-73 EANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDPNAC 98 Der p 2肽4 62-103 EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVP KIAPKSEN                           99 Der p 2肽5 98-129 APKSENVVVTVKVMGDNGVLACAIATHAKIRD 100 Der p 5肽1 1-35 MEDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYL Q                                  101 Der p 5肽2 25-60 KKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMD TI                                 102 Der p 5肽3 65-95 DGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQYNLEMAKKSG 103 Der p 5肽4 78-114 DLDIFEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKI EV                                 104 Der p 7肽1 1-30 DPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFD 105 Der p 7肽2 20-50 VAAIEKSETFDPMKVPDHSDKFERHIGIIDL 106 Der p 7肽3 50-80 LKGELDMRNIQVRGLKQMKRVGDANVKSEDG 107 Der p 7肽4 90-125 VHDDVVSMEYDLAYKLGDLHPNTHVISDIQDFV VEL                               108 Der p 7肽5 125-155 LSLEVSEEGNMTLTSFEVRQFANVVNHIGGL 109 Der p 7肽6 165-198 LSDVLTAIFQDTVRAEMTKVLAPAFKKELERNNQ 110 Der p 10肽1 1-35 MEAIKKKMQAMKLEKDNAIDRAEIAEQKARDAN LR                                111 Der p 10肽2 36-70 AEKSEEEVRALQKKIQQIENELDQVQEQLSAANT K                                  112 Der p 10肽3 71-110 LEEKEKALQTAEGDVAALNRRIQLIEEDLERSEER LKIAT                               113 Der p 10肽4 111-145 AKLEEASQSADESERMRKMLEHRSITDEERMEGL E                                  114 Der p 10肽5 140-170 RMEGLENQLKEARMMAEDADRKYDEVARKLA 115 Der p 10肽6 175-205 DLERAEERAETGESKIVELEEELRVVGNNLK 116 Der p 10肽7 210-250 SEEKAQQREEAHEQQIRIMTTKLKEAEARAEFAE RSVQKLQ                            117 Der p 10肽8 250-284 QKEVDRLEDELVHEKEKYKSISDELDQTFAELTG Y                                  118 Der p 21肽1 1-35 MFIVGDKKEDEWRMAFDRLMMEELETKIDQVEK GL                                119 Der p 21肽2 35-72 LHLSEQYKELEKTKSKELKEQILRELTIGENFMKG AL                                  120 Der p 21肽3 70-100 GALKFFEMEAKRTDLNMFERYNYEFALESIK 121 Der p 21肽4 90-122 YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYY 122 Clone 30肽1 1-32 MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFG 123 Clone 30肽2 15-48 PTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSN 124 Clone 30肽3 32-70 GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNE DEETCT                            125

  肽 位置 序列 SEQ ID No. Bet v 1肽1 30-59 LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF 126 Bet v 1肽2 50-79 GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN 127 Bet v 1肽3 75-104 VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK 128 Fel d 1链1肽1 1-34 EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVV C                                  129 Fel d 1链1肽2 35-70 LENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSP LC                                 130 Fel d 1链2肽1 1-34 VKMAITCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNAC 131 Fel d 1链2肽2 35-63 TEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVC 132 Fel d 1链2肽3 64-92 CMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR 133 Phl p 5肽1 98-128 CGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK 134 Phl p 5肽2 26-58 ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKC 135 Phl p 5肽3 132-162 AYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIC 136 Phl p 5肽4 217-246 CEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVK 137 Phl p 5肽5 252-283 TVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKC 138 Phl p 5肽6 176-212 CAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAP ANDK                               139 Phl p 5肽1a 93-128 CFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALT SK                                  141 Phl p 5肽2b 26-53 ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAC 142

术语“其片段”和“其序列变体”是指从此处披露的源自变应原分子所导出 的肽，其表现出与所述源自变应原分子相当的或相同的生物化学特性(例如，防 止IgE与变应原(那些分子所源自的变应原)结合的能力)。本发明所述的片段包 含至少5个，优选为至少7个，更优选为至少10个连续的，和/或最大为95％，优 选的最大为90％，更优选的最大为80％的源自变应原的分子的氨基酸残基。术语 “序列变体”包括对肽进行的修饰例如片段化(参上)、氨基酸取代(例如以其他 天然或非天然的氨基酸或氨基酸衍生物)、去除或加入。“序列变体”也指上表中 的所述源自变应原的分子，其中至少1个，优选为至少2个，更优选为至少3个， 再更优选为至少4个(5、6、7、8、9、10、15、20)个氨基酸残基被加入到C- 和/或N-末端。

注意到克隆30变应原是源自屋尘螨Dermatophagoides pteronyssinus的变应原， 由以下序列组成： MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSNWEAVH KDCPGNTRWNEDEETCT(SEQ ID No.140；也参见AT A 733/2006)。

根据本发明，肽也是环绕的(encompassed)，其与以上所披露的氨基酸序列为 至少80％，优选为90％同源。

本发明的另一个方面涉及编码根据本发明所述的融合的低变应原性蛋白的核 酸分子。

本发明的另一个方面涉及包含本发明所述的核酸分子的载体。

所述载体优选为表达载体。

容纳本发明所述核酸分子的载体可用于克隆目的或用于生产表达载体。所述 载体可以是质粒、粘粒(cosmid)、病毒、噬菌体或任何其他遗传工程中通常使用 的载体，并且，除了本发明所述的核酸分子外，还可包括控制表达的真核或原核 元件，例如用于转录和/或翻译启动和终止的调节序列、增强子、启动子、信号序 列等。

根据本发明的一个优选具体实施方式，该载体是细菌、真菌、昆虫、病毒或 哺乳动物载体。

优选地，本发明所述的载体可用于在各种宿主中克隆和表达的目的。因此， 所述载体除了编码本发明所述的低变应原性分子或融合蛋白之外，还包含宿主特 异性调节序列。

本发明的另一个方面涉及包含本发明所述核酸分子或载体的宿主。

根据本发明所述的核酸分子和载体可被引入合适的宿主。所述分子可被引入 该宿主的基因组。该载体可在胞质中以染色体外的形式存在或被引入宿主的染色 体。

本发明的另一个方面涉及针对本发明所述低变应原性分子、低变应原性融合 蛋白或融合蛋白的抗体。

根据本发明的一个优选具体实施方式，抗体是单克隆或多克隆抗体。

根据本发明所述的抗体包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人源 化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段和任何以上的表位结合片段。而 且，抗体被认为是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗 原结合位点(与抗原免疫特异性地结合)的分子。优选地，本发明所述的免疫球蛋白 分子为IgG、IgM、IgD、IgA和IgY型，免疫球蛋白分子的类(例如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

多克隆抗体可通过向非人类的哺乳动物使用本发明所述多肽(优选为使用佐 剂)并收集所产生的抗血清来制备。可通过一段时间的重复注射来获得改善的效 价。对于引起抗体的哺乳动物种没有特别限制；通常优选使用兔子或天竺鼠，但 是也可使用马、猫、狗、山羊、猪、大鼠、母牛、绵羊、骆驼等。在制备抗体时， 将确定数量的本发明所述免疫原用例如生理盐水溶液稀释至合适的浓度，将得到 的稀释溶液与例如完全弗氏佐剂混合以制备悬浮液，或与矿物胶例如氢氧化铝、 表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类(pluronic polyols)、聚阴离 子、肽、油乳状液、钥孔戚血蓝素、二硝基酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡 介苗，bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)混合。 每次使用大约50μg至大约2500μg的本发明所述多肽通过例如腹膜内方式向哺乳 动物例如兔子使用悬浮液和混合物。优选地，在大约2-3个月的时间内，优选大约 1个月每2周使用一次悬浮液以引起免疫。在最后一次施药1至2周后，通过从免 疫的动物中收集血液，离心血液并从血液中分离血清来重新获得抗体。

单克隆抗体可以是例如人源或鼠源的。鼠单克隆抗体可由和Milstein 的方法(，G.和Milstein，C.，Nature 256(1975)495)来制备，例如通过将 超免疫小鼠的脾细胞与合适的鼠骨髓瘤细胞系融合。

嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物种的分子，这样的抗体具有源自鼠 单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区。产生嵌合抗体的方法在本领域是 已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125：191-202；US 5,807,715；US 4,816,567和US 4,816,397。

人源化抗体是与所需的抗原结合的来自非人物种抗体的抗体分子，其具有来 自该非人物种的一个或一个以上补体决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的 框架区。通常，人框架区的框架残基被来自CDR供体抗体的相应残基替代，以改 变(优选为改善)抗原的结合。这些框架取代物通过本领域熟知的方法鉴定，例 如通过模拟CDR和框架残基之间的相互作用来鉴定对抗原结合重要的框架残基， 通过序列比对来鉴定特定位置不正常的框架残基(参见例如，Queen等人，US 5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323(1988))。可使用本领域已知的众多方 法将抗体人源化，例如，CDR-移植(CDR-grafting)(EP 239,400；WO 91/09967；US 5,225,539；US 5,530,101；和US 5,585,089)，镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)， (EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)； Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-913(1994))，和链穿梭(chain shuffling)(US 5,565,332)。

根据本发明所述的抗体可有利地用于遭受过敏症(特别是遭受屋尘螨过敏症) 个体的脱敏(desensitization)。对于被动免疫，抗体优选为IgG或其衍生物(例如 嵌合或人源化抗体)。而且，抗体也可被用于个体的脱敏(desensibilisation)。

本发明的另一个方面涉及包含本发明所述低变应原性蛋白或抗体的疫苗制 剂。

根据本发明所述的疫苗制剂可以本领域已知的方式制成，并必要地适应于所 述疫苗制剂的使用方式。

(本发明的)疫苗制剂的优选使用方式包括通常的为疫苗接种所描述和建议 的所有标准使用制度以及特异的过敏症免疫治疗(口服、经皮、静脉内、鼻内、 经粘膜、直肠等)。但是，特别优选为经皮下或肌内使用本发明所述的分子和蛋白。

本发明所述的疫苗制剂可只包含鼻病毒属成员的病毒衣壳蛋白或其片段。

优选地所述制剂进一步包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐 剂。

为了增加本发明所述的低变应原性分子的免疫原性，可在本发明所述的药物 中使用例如佐剂。根据本发明所述的佐剂为辅助性试剂，当与抗原一起或平行使 用时，增加其免疫原性和/或影响免疫反应的质量。因此，佐剂可例如相当地影响 体液或细胞免疫反应的程度。通常的佐剂为例如铝化合物、含脂化合物或灭活的 分支杆菌。

通常，佐剂可以是不同的形式，只要它们适合于向人类使用。这些佐剂的其 他例子为矿物或植物来源的油乳状液、矿物化合物例如磷酸铝或氢氧化铝，或磷 酸钙、细菌产物和衍生物，例如P40(源自肉芽肿棒状杆菌(Corynebacterium granulosum)的细胞壁)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A，MPL，LPS的衍 生物)和胞壁酰肽(muramyl peptide)衍生物及其结合物(衍生自分支杆菌成分)、 明矾、不完全氟氏佐剂、静脉脂肪乳剂(liposyn)、皂角苷、鲨烯等(参见例如Gupta R.K.等人(Vaccine 11：293-306(1993))和Johnson A.G.(Clin.Microbiol.Rev. 7：277-289)。

根据本发明的另外一个优选具体实施方式，所述疫苗制剂包含10ng至1g， 优选为100ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述低变应原性分子或抗体。

本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性蛋白或抗体在制备用于治疗 或预防人类或动物中病毒感染和/或过敏症的药物的用途。

所述药物优选为进一步包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐 剂。

根据本发明所述的药物可用于主动(使用本发明的低变应原性蛋白和/或分子) 以及被动(针对本发明所述低变应原性蛋白和/或分子的抗体)免疫。

根据本发明的一个优选具体实施方式，所述药物包含10ng至1g，优选为100 ng至10mg，特别地，0.5μg至200μg的所述低变应原性分子、核酸分子、载体、 宿主或抗体。

优选地，该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至 2mg/kg体重的数量向个体使用。

特别的剂量制度，即剂量、时间和重复，取决于特别的个体和该个体的医疗 史。经验考虑，例如半衰期，通常有助于确定剂量。可在治疗过程中确定并调节 使用频率。

优选地，向其使用本发明所述药物的个体为具有成为过敏症风险的个体或动 物。

患有或具有患过敏性病状、紊乱或疾病风险的个体包括已存在过敏性病状或 者已知的或怀疑趋势(朝着与过敏性病状相连或由过敏性病状引起的征状发展的 趋势)的个体。因此，该个体可具有主动的慢性过敏性病状、紊乱或疾病，急性 过敏性发作，或潜伏的过敏性病状、紊乱或疾病。某些过敏性病状与季节性或地 理性环境因素相关。因此，有风险的个体包括那些具有遭受病状风险的(该病状 基于既往个人或家庭史，以及季节或物理位置)的个体，但该病状或与该病状相 关的症状可能不在个体中表现其自身。

根据本发明所述的向个体使用的药物(其包括至少一个如此处描述的低变应 原性分子)可预防所述个体的致敏或诱导针对变应原的合适的免疫反应。如果本 发明的药物用于预防致敏，则它应该在个体与所述变应原首次接触前使用。因此， 优选为向婴儿和儿童使用本发明所述的药物。向怀孕个体使用本发明所述的药物 将在未出生子女中诱导针对变应原的抗体的形成。对这种治疗使用本发明所述低 变应原性分子是特别有益的，这是因为，由于缺少T细胞表位，在变应原免疫治 疗过程中发生的副作用可被显著减少甚至完全避免。

本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性蛋白或抗体在诊断个体中过 敏症和/或病毒感染中的用途。

本发明的另一个方面涉及来自微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣壳蛋 白作为载体在药物或疫苗中的用途或用于诊断病毒感染，特别是普通感冒的用途。

作为广泛传播的KLH载体蛋白的有价值的替代物，可使用微小核糖核酸病毒 科家族的病毒的病毒衣壳蛋白。载体可通过化学方式结合至或通过重组技术融合 至肽、蛋白和多肽或其他抗原。而且，病毒衣壳蛋白可用于检测例如针对个体血 清中所述衣壳蛋白的抗体。

这样的载体的一个优点为，不仅所融合或结合的抗原可暴露于免疫系统，而 且诱导了针对鼻病毒的衣壳蛋白的免疫反应。因此，这样的疫苗引起对鼻病毒引 起的疾病的预防和/或治疗。该病毒优选为人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89和 14。

本发明的另一个方面涉及源自Phl p 5(Genbank Nr.X7435)的低变应原性分 子，具有C-和/或N-末端截尾并实质上缺乏IgE结合能力。

草花粉是空气传播过敏原(对干草热和过敏性哮喘负责)的最有力的室外季 节性来源之一。

超过40％的过敏性个体表现出对草花粉变应原的IgE反应活性，其被分成超 过11个组。超过80％的草花粉过敏性病人与第5组变应原反应。

第5组变应原为非糖基化的，高度同源蛋白，具有介于25-33kD的分子量。 几个第5组变应原已被克隆和/或免疫鉴定。

通过引入点突变、行中几个氨基酸的突变或缺失来降低变应原性活性的试验 表明没有效果(Schramm G，等人J Immunol 1999；162：2406-1435)。已经描述了 Phl p 5的IgE结合区域(Flicker S，等人J Immunol 2000；165：3849-3859)，已经解 决了其三维结构(Maglio O，等人2002.Protein Eng.15：635-642)。

特别地，根据本发明所述的Phl p 5肽(其为C-和/或N-末端截尾的并缺少IgE 结合能力)，可用于个体的主动疫苗接种。

根据本发明的一个优选具体实施方式，经截尾的分子缺少T细胞表位。

如上所述，如果低变应原性分子实质上缺少T细胞表位，变应原免疫治疗的 延迟副作用可被显著降低甚至是避免。

缺少T细胞表位的经截尾的Phl p 5分子由Phl p 5的93至128、98至128、 26至53、26至58或252至283位氨基酸或其片段或其序列变体组成。

特别地，这些经截尾的分子实质上表现出无T细胞表位，但是，能够激发针 对野生型变应原的合适的免疫反应。

根据本发明的另一个优选的具体实施方式，低变应原性经截尾的Phl p 5由Phl p 5的132至162、217至246或176至212位氨基酸或其序列变体组成。

这些低变应原性分子包含一个或一个以上T细胞表位但缺少IgE结合能力。

本发明的另一个方面涉及源自Fel d 1的低变应原性分子(Genbank Nr.X62477 和X62478)，其具有C-和/或N-末端截尾并缺少IgE结合能力。

对动物的过敏症影响多达40％的过敏性病人。在国内环境中，对主要流行宠 物，猫和狗的过敏症占特别主导并与长年的症状相连。动物变应原存在于皮屑、 上皮细胞、唾液、血清或尿液中。既可通过直接的皮肤接触也可通过吸入携带变 应原的颗粒而暴露于变应原。已表明主要猫和狗变应原普遍存在，甚至可在不拥 有宠物的家庭和公共地方例如学校被检测到。这是由于工业化国家养宠物的家庭 数目较高并在增长(大约50％)以及变应原(其被得到并分散)的高度稳定性。

Fel d 1被鉴定为主要猫变应原，其被超过90％的猫过敏性病人所识别。Fel d 1 代表生物功能未知的38kDa的酸性糖蛋白。它由两个相同的非共价连接的异二聚 物组成，所述异二聚物又由两个反平行的由3个二硫键连接的多肽链组成。链1 和链2在不同的基因上编码，每个由3个外显子组成。已经在大肠杆菌(E.coli) 中作为链2-链1融合蛋白而表达了重组Fel d 1(rFel d 1)。这个重组Fel d 1能够 完全模拟野生型变应原的免疫特性。

源自主要猫变应原Fel d 1并缺少IgE结合能力的肽适合于例如免疫治疗和预 防性的过敏症疫苗接种。这些肽可包含在一个较大的多肽中或与合适的载体蛋白 (例如钥孔戚血蓝素，KLH)偶联。源自Fel d 1的合成肽(像Phl p 5和这里所揭 露的源自变应原的肽)能够诱导IgG反应，即产生所谓的“阻断抗体”或“保护 性抗体”。这些抗体防止IgE与变应原Fel d 1的结合。因此可达到过敏性症状的显 著性降低。

根据本发明的一个优选具体实施方式，经截尾的分子表现出减少的T细胞反 应活性。

为了避免或显著降低延迟的副作用，源自Fel d 1的低变应原性分子表现出如 本发明所定义的减少的T细胞反应活性。

优选地，经截尾的Fel d 1由Fel d 1的链1的1至34或35至70位氨基酸， Fel d 1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸或其序列变体组成。

本发明的另一个方面涉及低变应原性分子，其由下列氨基酸组成或包含下列 氨基酸：Der p 2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸， Der p 7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨 基酸，Der p 21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的 1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alt a 1的19至58、59至95、91至120 或121至157位氨基酸，Par j 2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨 基酸，Ole e 1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸， Fel d 2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、 544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至 289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f 2的19 至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Can f 1的19至 56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Art v 1的27至70、70 至100或92至132位氨基酸，Amb a 1的31至70、80至120、125至155、160 至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alt a 6的1 至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361 至400或401至438位氨基酸，Alt a 2的1至40、41至80、81至120、121至 160位氨基酸或其片段或其序列变体。

本发明的另一个方面涉及低变应原性融合蛋白，其包含至少两个本发明所述 的低变应原性分子，所述低变应原性分子表现出减少的IgE结合能力并表现出任 选减少的T细胞反应活性。

本发明所述的源自变应原并缺少IgE结合能力的低变应原性分子可重组地与 彼此融合或化学地与彼此结合。作为融合蛋白/多肽的单一成分(变应原片段)，所 述融合蛋白/多肽也缺少IgE结合能力。

根据本发明所述的融合蛋白可包含至少两个，优选为至少3个，更优选为至 少4个，再更优选为至少5个本发明所述的低变应原性分子。当然，也可能将低 变应原性分子与其他非源自变应原的肽、多肽和蛋白融合。当向个体使用时，这 些肽、多肽和蛋白也可诱导免疫反应或者作为载体或表现出酶学活性。根据本发 明所述的融合蛋白中的低变应原性分子可直接或通过一个连接子(优选为由氨基 酸残基组成)与彼此相连。

制备融合蛋白的方法在本领域中是熟知的，可在标准的分子生物学参考书例 如Sambrook等人(Molecular Cloning，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)和Ausubel等人(Short Protocols in Molecular Biology，3rd ed；Wiley and Sons， 1995)中找到。通常，通过首先构建融合基因(被插入到合适的表达载体中)，然 后，用于转染合适的宿主细胞来产生融合蛋白。通常，通过一系列限制性酶消化 和连接反应(这导致产生所需要的插入到质粒中的序列)来产生重组融合构建体。 如果不能得到合适的限制性位点，则可使用本领域技术人员已知的和以上所列参 考书中的合成低聚核苷酸接头或连接子。编码变应原和天然蛋白的多聚核苷酸序 列可在被插入到合适的载体之前被组装，或者编码变应原的序列可被插入到编码 载体中已经存在的天然序列的序列附近。将序列插入到载体中应该符合读码框(in frame)以使该序列能被转录成蛋白。所需要的精确的限制性酶、连接子和/或接头 以及精确的反应条件将根据所用的序列和克隆载体而变化，这对于本领域普通技 术人员来说将是明显的。但是DNA构建体的组装在本领域是常规的，可由本领域 技术人员容易地完成。

根据本发明的一个优选具体实施方式，如果至少两个分子源自相同的变应原， 则这些分子以不同于野生型变应原中片段顺序的顺序与彼此相融合。

根据本发明所述的融合蛋白可包含至少两个源自相同野生型变应原的低变应 原性分子。在这样的情况下，单一的分子(变应原片段)以不同于野生型变应原 中顺序的顺序与彼此相融合。这样的方法防止了低变应原性融合蛋白中潜在的IgE 结合位点/表位的重新形成。

本发明的另一个方面涉及编码本发明所述的低变应原性分子和融合蛋白的核 酸分子。

本发明的核酸分子可用于例如重组地生产所述分子。

根据本发明的另一个方面，所述核酸分子可包含在载体中。

该载体优选为表达载体。

本发明的另一个方面涉及疫苗制剂，其包含本发明所述的低变应原性分子、 融合蛋白或抗体。

优选地，该制剂进一步包含至少一个佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐 剂。

现今最新的增加免疫反应的方法中也有使用特别的载体物质例如KLH(钥孔 戚血蓝素)。本发明所述的低变应原性分子也可融合或结合至病毒衣壳蛋白，该病 毒衣壳蛋白也可用作载体(参见以上)。

根据本发明的一个优选具体实施方式，所述制剂包含10ng至1g，优选为100 ng至10mg，特别为0.5μg至200μg的所述低变应原性分子或抗体。

疫苗制剂实质上可由本发明所述的药物组成(参见以上)。

本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体在制 备用于治疗或预防个体中过敏症的药物中的用途。

根据本发明所述的低变应原性分子、融合蛋白和抗体可用于个体的疫苗接种。 此疫苗接种可降低或防止由野生型变应原所引起的过敏性反应。

根据本发明的一个优选具体实施方式，所述药物进一步包含至少一个佐剂、 药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。

优选地，根据本发明所述的药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg， 特别为0.5μg至200μg的所述免疫原性分子、核酸分子、载体、宿主或抗体。

根据本发明的另一个优选具体实施方式，该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg 体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的量向个体使用。

根据本发明的一个优选具体实施方式，所述个体具有获得过敏症的风险。

本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体在诊 断个体中的过敏症或监视过敏症治疗过程中的用途。

根据本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体不仅可用于药物也可合适 地用于各种诊断目的。例如，这些分子和融合蛋白可通过例如将个体的样品(包 含组胺释放细胞)暴露于所述多肽而用于诊断过敏症(参见例如，Purohit等人， Clin.Exp.Allergy 35(2005)：186-192)。而且，这些分子、融合蛋白和抗体可被 固定于表面以形成多肽阵列/芯片。这样的阵列可用于例如高通量筛选以诊断取自 许多个体的许多样品中的过敏症。

本发明通过以下图示和实施例进一步解释，但是，并不限制于此。

图1A显示了载体p89VP1的示意性综述。

图1B显示了pET-17b载体的多克隆位点和89VP1编码基因的DNA序列。

图1C显示了产生核酸融合体三种可能性的示意性代表。

图2显示了含有经纯化的89VP1his-标签化蛋白的经考马斯蓝染色的12％的 SDS-PAGE凝胶(第1道：5μg分子标记；第2-5道：10μl 89VP1洗脱样品)。

图3显示了对14VP1的IgG识别：14VP1和对照的免疫杂交。点通过放射自 显影来显示(第1-6道：以1:500-1:16000稀释的兔子抗-14VP1抗血清温育；第7-12 道：以1:500-1:16000稀释的免疫前血清温育)。

图4显示了小鼠中89VP1特异性IgG1反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠， 如每个箱顶部所示。89VP1特异性IgG1的效价通过ELISA测定，以y-轴上的OD 值来表达。结果显示为箱线图(box plot)，其中50％的值在箱和柱之间的非异常值 之内。箱内的线表明了中位数。

图5显示了小鼠中Phl p 1特异性IgG反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠， 如每个箱顶部所示。rPhl p 1特异性IgG1的效价通过ELISA测定，以y-轴上的光 学值(OD 405nm)来表达。光学值对应于小鼠血清中的IgG1抗体水平。结果显 示为箱线图，其中50％的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位 数。

图6显示了经免疫小鼠中牧草花粉提取物特异性IgG1反应。以不同的抗原来 免疫各组小鼠，如每个箱顶部所示。牧草花粉提取物特异性IgG1的效价通过ELISA 测定，以y-轴上的光学值(OD 405nm)来表达。光学值对应于小鼠血清中的IgG1 抗体水平。结果显示为箱线图，其中50％的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱 内的线表明了中位数。

图7显示了通过以所有19个病人的针对rPhl p 1、r89P5和KLHP5的抗血清 预温育而对病人的IgE与rPhl p 1结合的％抑制的平均值。％抑制显示于y-轴。结 果以柱形图显示。

图8显示了经免疫小鼠的脾细胞的增殖。用肽5、89VP1(89)和KLH来刺 激经不同抗原(如每个箱顶部所示)免疫的小鼠的T细胞。培养液用作参考。在 y-轴显示了刺激指数。结果以柱形图显示。

图9显示了在人血清中通过ELISA测定而检测的IgG1、IgG2、IgG4和IgA 对14VP1、89VP1和rPhl p 1的反应。对于4个89VP1、14VP1及rPhl p 1特异性 抗体测试了10个病人的血清(如每个箱顶部所示)。在左手边和右手边的每个“柱 形图配对”分别显示了秋季和冬季所取的血清。效价通过ELISA测定，以y-轴上 的光学值(OD 405nm)来表达。光学值对应于人血清中的抗体水平。结果显示为 箱线图，其中50％的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。

图10显示了过敏性病人的血清中抗-89VP1和抗-rPhl p 1抗体的检测。对于7 个89VP1特异性抗体(每对的左侧柱形图)和rPhl p 1特异性抗体(每对的右侧 柱形图)测试了5个Phl p 1过敏性病人的血清。效价通过ELISA测定，以y-轴上 的光学值(OD 405nm)来表达。光学值对应于人血清中的抗体水平。结果显示为 箱线图，其中50％的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。

图11显示了抗-14 VP1IgG与HRV14蛋白提取物和纯化的14VP1的结合(第 1和4道：5μg的标记；第2和4道：病毒提取物；第2和5道：5μg的14VP1)。 用抗-14VP1免疫血清和免疫前血清分别温育A杂交和B杂交。通过Western杂交 来检测所结合的IgG，通过放射自显影来显示。

图12显示了HRV14的中和(第A道(细胞对照)：以1:102-1:108稀释的抗-14VP1 免疫血清预温育HRV14之后的细胞(A1-A6行)；第B道：以1:102-1:108稀释的 免疫前血清预温育HRV14之后的细胞(B1-B6行)；第C道：以HRV14 10 TCD50-106 TCD50温育之后的细胞(C1-C6行)；D5：以免疫前血清温育之后的细胞；D6： 以免疫血清温育之后的细胞)。细胞植板于所有的孔，在三天后以结晶紫染色。

图13显示了抗-肽抗血清与完全Phl p 5变应原的IgG反应活性。显示了从6 只兔子(每个均以一种KLH偶联的肽来免疫)获得的3个血清样品(取血1：免 疫前血清；取血2-3：月间隔收集的血清样品)对Phl p 5的IgG反应活性(OD值)。

图14显示了rPhl p 5的变应原性活性，以及由CD203c表达所检测的肽混合 物。来自三个Phl p 5过敏性病人的肝素化血液样品以10-4至10μg/mL系列稀释的 重组变应原、源自Phl p 5的肽的等摩尔混合物、抗-IgE或对照缓冲液(co，x-轴) 进行温育。然后以CD203c mAb将细胞染色，并在FACScan上分析CD203c的表 达。在y-轴上显示了刺激指数(SI)。

图15显示了对源自Phl p 5的肽的鉴定，该肽诱导低淋巴增殖反应。以不同浓 度的肽和用于对照目的的白细胞介素-2(x-轴)刺激来自牧草花粉过敏性病人的 PBMC。在y-轴上显示了刺激指数(SI)。

图16显示了源自Fel d 1的合成肽(其在兔子中诱导Fel d 1特异性IgG免疫 反应)。以KLH偶联的源自Fel d 1的合成肽或未偶联的rFel d 1来免疫6只兔子， 在月间隔进行取血3-4次。免疫前血清和抗血清针对ELISA板上所结合的rFel d 1 的IgG反应活性表示为光学密度(O.D.值，y-轴)。

图17显示了通过敏性病人嗜碱细胞上CD63和CD203c的表达而确定的源自 Fel d 1的合成肽的低变应原性活性。以系列稀释的Fel d 1(实心框)或源自Fel d 1 的合成肽的混合物(空心框)(x-轴)温育来自5个猫过敏性病人的PBMC。对于 病人RR，也用系列稀释的源自Fel d 1的合成肽作为单一成分对PBMC进行探测。 表面标记CD203c和CD63表达的诱导以平均荧光强度测定，经计算的刺激指数显 示于y-轴。

图18显示了以KLH偶联的源自Bet v 1的肽处理在致敏小鼠中减少了针对 rBet v 1的淋巴增殖反应。在体外以重组桦树花粉变应原Bet v 1(白色条形柱)、 KLH(黑色条形柱)或肽混合物(灰色条形柱)刺激后培养的脾细胞中测定了T 细胞增殖。条形柱代表不同小鼠组别的平均刺激指数(SI±SD)。

图19显示了以KLH偶联的源自Bet v 1的肽对初次接受试验小鼠进行预防性 疫苗接种，在致敏后该肽减少针对rBet v 1的淋巴增殖反应。

图20显示了以KLH偶联的源自Bet v 1的肽对初次接受试验小鼠进行预防性 疫苗接种诱导了Bet v 1特异性IgG反应并为由完全变应原诱导的变应原特异性 IgG反应作好了准备。在不同的时间点(x-轴)测定了4个处理组中的针对Bet v 1 的IgG反应(OD值：y-轴)。

图21显示了源自Phl p 5的肽(1，2)和变体(1a，2b)的IgE反应活性：IgE 结合能力的对比，使用来自7个草花粉过敏性病人(p1-p7)和来自一个非过敏性 个体(NHS)的血清通过使用0.20g/点的点杂交测验来确定。rPhl p 5用作阳性对 照，HSA用作阴性对照。以125I标记的抗-人IgE来检测所结合的IgE。

图22显示了源自Phl p 5的肽(1，2)和变体(1a，2b)的淋巴增殖反应。以 不同浓度的肽和用于对照目的的等摩尔浓度的rPhl p 5刺激来自草花粉过敏性病人 的PBMC。在y-轴显示了刺激指数(SI)。

图23显示了抗VP1抗体的交叉保护。

实施例

实施例1：载体p89VP1的构建

使用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen，Germany)从细胞培养物上清液中提 取RNA，然后加入1μl的RNase抑制剂(Boehringer GmbH，Germany)至最终浓 度0.01U/μl，这样来制备用于RT-PCR的病毒贮存样品。

通过用编码人类鼻病毒株89(89VP1)的VP1蛋白的cDNA序列替代pET-17b 的多克隆位点的NdeI/EcoRI片段来构建质粒p89VP1(图1A)。NdeI和EcoRI限 制性位点(在pET-17b中)用于插入AseI/EcoRI连接的89VP1，该89VP1在5’末 端带有ATG，在3’末端带有6个组氨酸，接着是终止密码子TGA(图1B)。

通过核苷酸测序来确定在pET-17b中插入了89VP1。

在NdeI/AseI融合代替NdeI位点后产生了CATAAT，其不能被任何已有酶切 割。因此，该位点突变为CTTAAG，即Afl II的限制性位点。为了再插入一个变 应原片段，ACCGTT序列在3’末端被突变为ACCGGT，即AgeI的限制性位点。 89VP1的核苷酸序列下面显示了氨基酸序列。在图1B中以下划线显示了限制性位 点。

所述Afl II和AgeI限制性位点以快速改变位点形成突变试剂盒(Quick change site mutagenesis Kit(Stratagene))产生。

因此，如图1C所示，可在89VP1的5’末端(使用Afl II)或3’末端(使用 AgeI)的剩余限制性位点或同时两个位点插入基因片段的cDNA，以便于容易纯化。 因此重组变应原片段将在89VP1的N-末端和/或C-末端表达。

表1：克隆和突变形成的引物(5’至3’)

  89VP1克隆 SEQ ID No. 89VP1正向 CGGAATTCATTAATATGAACCCAGTTGAAA ATTATATAGATAGTGTATTA 1 89VP1反向 CGATTAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGG ACGTTTGTAACGGTAA 2 89VP1克隆 SEQ ID No. 突变形成 Afl II正向 CTTTAAGAAGGAGATATACTTAAGATGAAC CCAGTTG 3 Afl II反向 CAACTGGGTTCATCTTAAGTATATCTCCTTC TTAAAG 4 AgeI正向 CCTGATGTTTTTACCGGTACAAACGTCCAC CAC 5 AgeI反向 GTGGTGGACGTTTGTACCGGTAAAAACATC AGG 6

实施例2：表达89VP1-变应原片段融合蛋白的构建体的克隆

将以上所描述的方法示例于C-末端Phl p 1变应原片段，即肽5 (CVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTAYESK；M.Focke等人FASEB J (2001)15：2042-4)。用Phl p 1 cDNA(GenBank：X78813)作为模板通过PCR 扩增肽5的DNA序列(引物：Phl p 1正向 5’-CGCGCTTAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3’(SEQ ID No.7)；Phl p 1反向5’-CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAGGCGGTGTCGGC-3’(SEQ ID No. 8))。将PCR产物插入p89VP1载体的Afl II限制性位点，得到的构建体被称为载 体p89P5和基因产物r89P5。

实施例3：89VP1肽5融合蛋白和89VP1的表达和纯化

为了达到89VP1或r89P5(重组89VP1-肽5融合蛋白)，将质粒转化至E.coli BL21(DE3)。经转化的E.coli在37℃下生长于250ml含有100mg/l氨比西林的 LB培养基，生长至0.4的光密度(600nm)，通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)至1mM的最终浓度来诱导蛋白表达。4小时后，通过在4℃和3500rpm 下离心10分钟来收集E.coli细胞。使用Qiagen Ni-NTA和柱以Qiagen程序来进行 纯化。将细胞沉淀在变性条件下重悬于5ml的6M盐酸胍1个小时。离心(20分 钟，10000 x g)后，以1ml的Ni-NTA再温育上清液1个小时。然后将悬浮液装 柱，以5ml的洗涤缓冲液(8M的尿素，pH6.3)洗涤两次，然后以4ml的洗脱 缓冲液(8M的尿素，pH3.5)洗脱。通过降低尿素的摩尔浓度透析后达到复原。

如图2所示以SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度和大小。蛋白带对应于经计算 的33.6kD的蛋白大小。也通过Western杂交分析(使用抗-组氨酸标签抗体)确定 了蛋白的完整性。

实施例4：通过免疫杂交检测14VP1特异性兔子抗体

将5μg的14VP1(人类鼻病毒株14的VP1蛋白)和对照(Bet v 1、Phl p 5、 BSA)点膜至硝化纤维膜带。将这些带暴露于兔子抗-14VP1抗血清(第1-6道) 和免疫前血清(第8-12道)的稀释液。以1:1000稀释的125I标记的驴抗-兔子IgG 检测所结合的兔子IgG抗体，并以放射自显影显示(图3)。

兔子抗-14VP1血清的点杂交分析表明14VP1有强烈的免疫原性。与免疫前血 清和Bet v 1、Phl p 5和BSA对照相反，以1:16000稀释的抗血清仍能检测到IgG 抗体。

实施例5：通过ELISA确定免疫小鼠中89VP1特异性抗体反应

为了确定89VP1的免疫原性及其作为肽5的载体的能力，以下列抗原免疫六 周龄的雌性balb/c小鼠组(Charles River)：KLH、KLH马来酰亚胺偶联的肽5 (KLHP5)和KLH EDC偶联的肽5(KLHP5edc)。通过Imject马来酰亚胺激活的 mcKLH和Imject Immunogen EDC Kit(Pierce)进行化学偶联。马来酰亚胺基团 与SH基团反应，EDC与羧基和氨基基团反应以形成稳定的键。每组4只的小鼠 以89VP1、r89P5和89P5edc进行免疫，2只以单独的肽5进行免疫(每只5μg， 与氢氧化铝1:2混合)。在大约三周间隔内通过皮下来免疫小鼠，在尾静脉取血。 通过ELISA确定89VP1特异性IgG1抗体的水平。

以5μg/ml的89VP1包被ELISA板(Nunc)。以1:500稀释小鼠抗-89VP1、抗 -r89P5和肽5血清。以1:1000的大鼠抗-小鼠IgG1(BD Pharmingen)，然后以1:2000 的POX偶联的山羊抗大鼠IgG(Amersham Bioscience)检测所结合的IgG1。在 y-轴显示了光学值(OD405nm)，对应于小鼠血清的IgG1抗体水平(图4)。

KLHP5、KLHP5edc、KLH和肽5用作对照。以89VP1(89VP1、89P5edc和 r89P5)注射的小鼠的免疫过程中以增加的效价检测到了IgG1抗体。以89VP1、 r89P5和KLHP5免疫的兔子显示了相同的结果。

实施例6：通过ELISA确定免疫小鼠中rPhl p 1特异性抗体反应

为了评估以r89P5免疫是否诱导与完全Phl p 1反应的IgG抗体，使用了如实 施例5中描述的同样的方法和同样的小鼠血清。以5μg/ml的rPhl p 1包被ELISA 板并测定了IgG1抗体的效价(图5)。

所有的与KLH或89VP1偶联的源自Phl p 1的肽都在免疫过程中以渐增的反 应来诱导rPhl p 1特异性IgG1抗体。以r89P5和KLHP5免疫的兔子显示了相同的 结果。

实施例7：通过ELISA测定牧草花粉提取物特异性IgG1抗体

如第5部分所述进行了小鼠免疫和ELISA分析。将全牧草花粉提取物包被于 ELISA板(100μg/ml)，并确定了IgG1抗体的效价(图6)。

三次免疫后可在以肽5免疫的小鼠中检测到提取物特异性IgG1抗体。

实施例8：兔子抗-r89P5抗体阻断病人的IgE与rPhl p 1的结合

为了确定肽诱导的兔子Ig的抑制过敏性病人的IgE抗体与rPhl p 1结合的能 力，以1μg/ml的rPhl p 1包被ELISA板，洗涤并封闭。板以1:100稀释的兔子抗- 肽(89P5，KLHP5)、兔子抗rPhl p 1以及用于对照目的的相应的免疫前血清进行预 温育。洗涤以后，板以来自Phl p 1过敏性病人的(1:3稀释的)人血清进行温育， 以小鼠抗-人IgE(Pharmingen 1:1000)，然后以1:2000的POX偶联的绵羊抗-小 鼠IgG(Amersham Bioscience)来检测所结合的IgE。按照如下计算经抗-肽抗血 清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率：100-ODi/ODp x 100。

ODi和ODp分别代表以兔子免疫血清和免疫前血清预温育后的消光度。表2 显示了抗-Phl p 1肽抗体抑制19个过敏性病人的IgE与完全rPhl p 1结合的能力。 图7显示了所有的抗-rPhl p 1、抗-r89P5和抗-KLHP5免疫血清的平均抑制(以％ 表示)。抗-肽血清比rPhl p 1更好的阻断了IgE的结合。抑制能力与89P5和KLHP5 几乎一样。表2显示了所有19个病人的抑制(以％表示)。

表2：以兔子抗-rPhl p 1、r89P5和抗-KLHP5抗血清温育后19个病人的IgE 与rPhl p 1结合的％抑制

实施例9：抗原刺激小鼠脾细胞后的T细胞增殖

以KLH、KLHP5和KLHP5edc免疫每组三只小鼠。以89VP1、r89P5和89P5edc 免疫每组4只小鼠四次，以单独的肽5免疫2只小鼠(每只5μg)。最后一次免疫 10天后取出脾细胞，在96孔板中以三次重复用肽5(P5)、89VP1、KLH和分别 作为阳性对照和阴性对照的Con A和培养液来刺激单独的细胞培养物。四天后向 每个孔中加入放射性[3H]胸苷0.5μCi。然后在15小时后用Packard细胞收集器收 集细胞至unifilter板。用β计数器测定细胞相连的放射活性。计算了刺激指数并显 示于y-轴。在x-轴上显示了用于刺激的抗原。每个框代表用于免疫小鼠的抗原的 数据(图8)。所有超过2的值作为阳性。经KLH和KLHP5免疫的小鼠只有当以 KLH刺激时是阳性的，肽5小鼠是完全阴性的。对应于ELISA结果，KLHP5edc 组也是阴性的。来自经r89P5、89P5edc和89VP1免疫小鼠的细胞只有当以89VP1 刺激后增殖。初次接受试验的对照小鼠在所有的情况下没有表现出增殖。这些结 果表明T细胞表位是由载体89VP1而不是由肽5提供的。

实施例10：通过ELISA检测秋季和冬季获得的人血清中的14VP1-、89VP1- 和rPhlp 1特异性抗体

在秋季从五个随机选取的个体中取血清，冬季五个。通过ELISA确定了针对 14VP1、89VP1和rPhl p 1的IgG1、IgG2、IgG4和IgA抗体水平，如实施例5中 所述。以1:1000用1:2000 POX偶联的绵羊抗小鼠IgG(Amersham Bioscience)来 检测人IgG1、IgG2、IgG4和IgA(BD Pharmingen)。在取自秋季和冬季的血清中 可检测到抗-14VP1和89VP1 IgG1高效价(图9)。抗-rPhl p 1 IgG1抗体效价相比 较很低。IgG2、IgG4和IgA抗体可在所有的情况下检测到，水平非常低。不同HRV 株的VP1蛋白紧密相关，在其他的研究中已表现出交叉反应性。

实施例11：Phl p 1过敏性病人的抗-89VP1和抗-rPhl p 1抗体

获取了五个Phl p 1过敏性病人的血清，如实施例5所述进行了ELISA实验。 以rPhl p 1和89VP1包被ELISA板，确定了特异性IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA和IgE抗体效价(图10)。可检测到比抗-rPhl p 1 IgG1抗体更多的抗-89VP1 IgG1 抗体。

实施例12：通过Western杂交分析检测抗-14VP1抗体与全病毒的结合

通过使用全HRV14病毒(第2和5道)和作为对照的5μg的纯化的14VP1 (第3和6道)来确定经14VP1注射兔子血清中的IgG抗体与全病毒的结合。以 12％的SDS-Page分离病毒提取物并点膜至硝化纤维膜。测试了1:500的兔子抗 -14VP1抗血清(第1-3道)和1:500的免疫前血清(第4-6道)与HRV14和14VP1 的结合。以125I标记的驴抗-兔子抗体检测了所结合的IgG，通过放射自显影显示 (图11)。

可在与14VP1相同的大小处(33.6kD)检测到14VP1-抗血清的结合。

实施例13：抗-14VP1抗体对完整的人类鼻病毒14的中和

确定了HRV14的组织培养半剂量50(TCD50)。因此，在MEM-Eagle，1％ FCS 和40mMMgCl2中进行了1:102至1:108的病毒稀释，在24孔板于34℃下5％CO2 加湿的空气中和HeLa Ohio细胞一起温育三天。也展开了无病毒的对照。

三天后通过结晶紫显示病毒的毒性效应，计算了TCD50(引起50％细胞死亡 的稀释)。

在34℃下温育行A和B中的血清稀释液和病毒(100TCD50)。两小时后在所 有的孔中展开细胞。D5和D6是血清对照。在图12中显示了实验计划。三天后以 结晶紫检测了抗体的中和效应(图12)。

实施例14：源自Phl p 5的合成肽的特性

使用IIBTU-激活(0.1mmol小级别循环)以Fmoc策略在Applied Biosystems 肽合成器Model 433A上合成了肽，如Focke等人Faseb J(2001)15：2042所述。 在对Phl p 5变应原进行了深度分析后，制备了六个源自Phl p 5的肽，这些肽在长 度上介于31(P1：3026道尔顿)至38(P6：3853道尔顿)个氨基酸，富含暴露 于溶剂的氨基酸(表3)。

这些肽具有介于4.32至8.98的等电点，其中三个(肽3、4和6)可含有人T 细胞表位。

表3.非变应原性的源自Phl p 5的合成肽的特性。显示了位置(相对于Phl p 5 分子)、序列、长度、分子量(MW)，等电点(pI)和源自Phl p 5肽的T细胞表 位的存在性。以黑体和下划线标示了所加入的半胱氨酸残基(为了促进偶联)。

  aa   位置 序列 aa   长度 MW pI T细胞 表位  肽1          (SEQ ID No.9) 98-128 CGAASNKAFAEGLSGEP KGAAES SSKAALTSK      32 3026 8.16 - 肽2       (SEQ ID No. 10)             26-58 ADLGYGPATPAAPAAGY TPATPAAPAEAAPAGKC    34 3068      4.37      - 肽3       (SEQ ID No.           11)              132-16 2      AYKLAYKTAEGATPEAK YDAYVATLSEALRIC                        32    3482           6.29           +     肽4       (SEQ ID No. 12)              217-24 6      CEAAFNDAIKASTGGAY ESYKFIPALEAAVK       31 3236      4.87      +   肽5       (SEQ ID No.           13)              252-28        TVATAPEVKYTVFETAL                   KKAITAMSEAQKAAKC        33 3501           8.98          

  aa 位置 序列 aa 长度 MW pI T细胞 表位 肽6 (SEQ ID No. 14) 176-21 2 CAEEVKVIPAGELQVIE KVDAAFKVAATAANAA PANDK 38 3853 4.66 +

实施例15：源自Phl p 5的肽缺少IgE反应活性和变应原性活性

15.1 缺少IgE反应活性

为了分析六个源自Phl p 5的肽的IgE反应活性，使用来自29个草花粉过敏性 病人的血清通过ELISA对分离的和KLH偶联的源自Phl p 5的肽的IgE结合能力 与完全rPhl p 5的IgE结合能力进行了比较(表4)。

表4：29个草花粉过敏性病人和1个非变应原性对照的血清学特性。性别、 年龄、总血清IgE水平(kU/L)、牧草提取物特异性IgE(kUA/L)、对rPhl p 5特 异性的IgE抗体和6个分离的(P1至P6)和KLH偶联的(KLH-P1至KLh-P6) 肽(通过ELISA测定)，显示了OD(光密度)。破折号表示对分离的和KLH偶联 的肽缺少IgE反应活性。

以源自Phl p 5的肽(5μg/ml)或作为对照的rPhl p 5(5μg/ml)包被ELISA 板(Nunc Maxisorp，Denmark)，洗涤并封闭。随后，在4℃下，板以1:3稀释的 来自29个草花粉过敏性病人和1个非过敏性个体的血清进行温育过夜。根据季节 性花粉病病历显示来选择遭受过敏性鼻结膜炎和/或哮喘的草花粉过敏性病人，并 使用牧草花粉提取物和血清学CAP-FEIA(Pharmacia Diagnostics，Uppsala， Sweden)测试通过刺皮试验来鉴定。通过CAP测试来确定血清中的总IgE水平 (Pharmacia)。通过ELISA确定对rPhl p 5特异性的IgE抗体。来自29个草花粉 过敏性病人和1个非过敏性个体的血清用于IgE竞争研究。草花粉过敏性病人组 由13个男性和16个女性组成，平均年龄为35岁(介于25-51岁)(表4)。

以1:1000稀释的碱性磷酸酶偶联的小鼠单克隆抗-人IgE抗体(Pharmingen， CA)来检测所结合的IgE抗体。

总IgE水平和草花粉提取物特异性IgE分别介于24.9至2000kU/L(平均： 262.7)和2.2至100kUA/L(平均：41.5)。所有的病人都含有rPhl p 5特异性IgE 抗体，介于0.157至2.530OD单位(平均：1.082OD单位)，但是29个病人中没 有一个显示出对任何肽(P1-P6)或肽的等摩尔混合物的IgE反应活性(OD≤0.08)。 这个结果证明没有血清是含有可检测的对六个源自Phl p 5肽中任一个有特异性的 IgE抗体。

15.2.由嗜碱细胞上CD 203c表达所检测的减少的变应原性活性：嗜碱细胞的 激活和流式细胞术：

CD 203c的上调已被描述为变应原诱导的嗜碱细胞激活和脱粒的代理标志 (Hauswirth等人，J Allergy Clin Immunol 2002；110：102)。因此，通过测定草花粉 过敏性病人的嗜碱细胞上CD 203c的上调比较了完全rPhl p 5变应原和肽的等摩 尔混合物的变应原性活性。

在获得知会同意之后，从三个过敏性捐赠人取得了外周血细胞。以系列稀释 的重组变应原(10-4至10μg/ml)、抗-IgE抗体(1μg/ml)或对照缓冲液(磷酸盐 缓冲盐水＝PBS)在37℃下温育肝素化血液等分试样(100μl)15分钟。温育后， 以含有20mM EDTA的PBS洗涤细胞。然后以10μl PE偶联的CD203c mAb 97A6 在室温(RT)下温育细胞15分钟。然后，以2mL的FACSTM裂解溶液将红血球 裂解。然后洗涤细胞，重悬于PBS，并在FACScan(Becton Dickinson)上用二色 流式细胞术使用Paint-a-Gate软件分析。变应原诱导的CD203c的上调通过平均荧 光强度(MFI)(由经刺激的(MFIstim)和未刺激的(MFIcontrol)细胞获得)来 计算，并表达为刺激指数(MFIstim：MFIcontrol)。SI≥2.0(≥2倍上调)被认为 是特异性反应的指征。

如图14中所示，发现：在致敏个体中完全rPhl p 5表现出外周血嗜碱细胞上 CD203c的表达的剂量依赖性(10-4至10μg/ml)增长，而肽的等摩尔混合物没有 表现出效应。

对来自草花粉过敏性病人的嗜碱细胞上CD 203c表达的确定表明：以源自Phl p 5的肽观察不到变应原性活性。

实施例16：以源自Phl p 5的肽免疫诱导了与rPhl p 5和来自不同草种的天然 变应原反应的IgG抗体

16.1.重组变应原和变应原提取物

在E.Coli中表达了纯化的重组Phl p 5，如Vrtala等人(J of Immunol(1993) 151：4773-4781)所描述。

从Allergon Pharmacia(Sweden)获得了来自梯牧草(Phleum pratense)、多 年生黑麦草(Lolium perenne)、草地早熟禾(Poa pratensis)、鸭茅(Dactylis glomerata)、黑麦(Secale cereale)、小麦(Triticum aestivum)、燕麦(Avena sativa)、 大麦(Hordeum vulgare)、黄花茅(Anthoxanthum odoratum)的草花粉，制备了水 性花粉提取物，如Vrtala等人(Int Arch Allergy Immunol(1993)102：160-9.)所 描述。

16.2.兔子的免疫

根据生产商的建议，将HPLC纯化的肽偶联至KLH(钥孔戚血蓝素，MW 4.5 x 103-1.3 x 107，Pierce，USA)，使用Conjugation Kit(Sigma，USA)进行纯化。

以每个KLH偶联的肽(200μg/注射)和用于对照目的的完全rPhl p 5使用弗 氏完全佐剂和不完全佐剂(Charles River)将兔子免疫。在四周间隔内取得血清样 品。

16.3.兔子抗体与完全rPhl p 5和来自不同草种的天然变应原的反应活性

为了研究以KLH偶联的肽免疫之后所诱导的抗体是否能够识别rPhl p 5、天 然Phl p 5和来自其他草花粉种的Phl p 5相关草花粉变应原，进行了ELISA实验。 为了进行ELISA检测，板(Nunc Maxisorp，Denmark)以花粉变应原提取物(100 μg/ml：梯牧草、多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦、小麦、燕麦、大麦、 黄花茅)或纯化的重组变应原(5μg/ml：rPhl p 5)进行包被。洗涤ELISA板并封 闭，接下来以兔子抗-肽抗血清和1:2500稀释的相应的免疫前血清进行温育。以 HRP偶联的山羊抗-兔子Ig抗血清(Jackson Immunresearch，Pennsylvania)检测所 结合的兔子IgG。结果代表两次重复测定的平均，其误差<5％(图13，表5)。

表5：抗-Phl p 5肽抗血清与rPhl p 5和来自梯牧草、多年生黑麦草、草地早熟 禾、鸭茅、黑麦、小麦、燕麦、大麦、黄花茅的天然第5组变应原的交叉反应活 性。显示了经过KLH偶联的源自Phl p 5的肽(P1至P6)免疫的六只兔子中肽抗 血清(抗-P1至抗-P6)与Phl p 5和来自草花粉的花粉提取物的IgG反应活性(OD 值)。

抗-肽抗血清与rPhl p 5和草花粉提取物的交叉反应活性

16.4.以源自Phl p 5的肽免疫诱导了交叉反应性IgG抗体

以每个肽免疫诱导了有力的Phl p 5特异性IgG反应，其在第一次免疫四周后 可检测到，在第二次免疫后增加(图13)。以肽2免疫诱导了最高的Phl p 5特异 性IgG反应，接下来是肽6、4、5和1，肽1诱导了最低的反应。除了抗-肽1抗 体(其缺少与第5组变应原中多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦和大麦的 反应活性)之外，其他的肽抗血清均与每个所测的草花粉提取物有交叉反应(表5)。

实施例17：以源自Phl p 5的肽免疫诱导了可抑制草花粉过敏性病人的IgE与 Phl p 5结合的IgG抗体

17.1.肽特异性IgG对过敏性病人的IgE与rPhl p 5a结合的抑制

关于肽诱导阻断抗体的能力的信息是重要的，因为已表明阻断抗体在免疫治 疗中扮演重要角色。

为了检测肽诱导的兔子Ig的抑制过敏性病人的IgE与完全rPhl p 5结合的能 力，使用来自29个草过敏性病人的血清进行了竞争性ELISA实验。

以rPhl p 5(1μg/ml)包被ELISA板，并以1:250稀释的每个抗-肽抗血清(抗 -P1至抗-P6)、抗-肽抗血清混合物、抗-rPhl p 5抗血清或者用于对照目的的相应的 免疫前血清或免疫前血清混合物进行预温育。洗涤后，板以1:3稀释的来自29个 草花粉过敏性病人的血清温育，以碱性磷酸酶偶联的小鼠单克隆抗-人IgE抗体 (Pharmingen)来检测所结合的IgE抗体。按照如下计算经抗-肽抗血清预温育而 达到的对IgE结合的抑制百分率：IgE结合的％抑制＝100-ODI/ODP x 100。ODI和 ODP分别代表以兔子免疫血清和免疫前血清预温育后的消光度。以肽诱导的兔子 IgG预温育Phl p 5在不同程度上抑制了过敏性病人IgE反应活性。对IgE结合的 平均抑制程度介于19.3％(抗-肽6IgG)至28.5％(抗-肽1IgG)。针对完全Phl p 5 获得的兔子抗体诱导了对IgE结合平均43.6％的抑制。

表6：兔子抗-Phl p 5抗血清抑制牧草花粉过敏性病人的血清IgE与Phl p 5的 结合。显示了对Phl p 5用抗-肽抗血清(抗-P1至抗-P6)、六个抗-肽抗血清(抗-P1-P6) 的混合物或抗-rPhl p 5抗血清进行预温育之后，每个病人的IgE与Phl p 5结合的 抑制百分率。在最底行显示了平均抑制百分率。N.d.：未做。

实施例18：源自Phl D 5的肽诱导低特异性的淋巴增殖反应

18.1.淋巴增殖测试

为了鉴定具有最低可能的T细胞反应活性的肽(为了使治疗相关的副作用最 小化)，通过淋巴增殖测试检测了T细胞反应活性。从两个草花粉过敏性病人中通 过Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech，UK)密度梯度离心分离了外周血单核细胞 (PBMC)。以三次重复方式在96孔板(Nunclone；Nalge Nunc International， Denmark)中在37℃下5％CO2加湿的空气中以200μl的无血清Ultra Culture培养 液(BioWhittaker，Rockland，ME，培养液以2mM L-谷氨酸(SIGMA，USA)，50μM β-巯基乙醇(SIGMA)和每毫升0.1mg的庆大霉素(Sigma)补充)来培养PBMC (2 x 105)。用不同浓度的合成肽(每孔1.25、0.6和0.3μg)和用于对比的每孔4U 白细胞介素-2(Boehringer Mannheim，Germany)以及单独的培养液来刺激细胞。 培养6天后每孔加入0.5μCi的[3H]胸苷(Amersham Pharmacia Biotech)，16小时 后使用微贝塔闪烁计数器(Wallac ADL，Germany)通过液体闪烁计数来测定所引 入的放射活性。从三次重复计算出平均cpm，从抗原或白细胞介素-2刺激与未刺 激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数(SI)。

以不同浓度的合成肽刺激来自牧草花粉过敏性病人的PBMC。以肽刺激的刺 激指数显著性低于以IL2刺激的。源自Phl p 5的肽诱导了低特异性淋巴增殖反应。 最低的反应出现于肽5，然后是肽4。

实施例19：源自Fel d 1的合成肽的特性

为了获得适合于猫过敏症疫苗接种的肽，根据Fel d 1的已知氨基酸序列设计 了五个肽，这五个肽长度为30至36个氨基酸，并且覆盖了全分子。

使用HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3四甲基脲六氟磷酸]-激活(0.1 mmol小级别循环)以Fmoc(9-芴甲氧羰基)策略在Applied Biosystems肽合成 器Model 433A(USA)上合成了肽。预装的PEG-PS(聚乙烯乙二醇聚苯乙烯) 树脂(0.15-0.2mmol/g装载)(PerSeptive Biosystems，UK)用作固相以建立起 肽。化学物质从Applied Biosystems购买。通过在反馈控制系统中监视传导性来确 定氨基酸的结合。向肽1、3、4和5加入一个半胱氨酸残基以促进其与载体的偶 联(表7)。用250μl蒸馏水、250μl triisopropylsilan(Fluka，Switzerland)、9.5ml TFA的混合物从树脂中切割肽2小时，在叔丁基甲基醚(Fluka，Switzerland)中 进行沉淀(Focke 2001)。通过质谱检测肽的特性，通过制备性HPLC(PiChem， Austria)将肽纯化至>90％的纯度。

表7：源自Fel d 1的合成肽的分子特性。显示了源自Fel d 1的合成肽在天然 Fel d 1分子内的位置、氨基酸序列、氨基酸数目、经计算的分子量(MW)和理论 等电点(pI)。所有的肽在水中可溶。

  位置 氨基酸序列 aa长度 MW pI 肽1SEQ ID No. 15 链1，aa1-34 EICPAVKRDVDLFLTGTPDEY VEQVAQYKALPVVC 35 3911 4.30 肽2SEQ ID No. 16 链1，aa35-70 LENARILKNCVDAKMTEED KENALSLLDKIYTSPLC 36 4083 4.72 肽3SEQ ID No. 17 链2，aa1-34 VKMAITCPIFYDVFFAVANG NELLLDLSLTKVNAC 35 3835 4.56 肽4SEQ ID No. 18 链2，aa35-63 TEPERTAMKKIQDCYVENGL ISRVLDGLVC 30 3382 4.93 肽5SEQ ID No. 19 链2，aa64-92 CMTTISSSKDCMGEAVQNTV EDLKLNTLGR 30 3246 4.78

五个源自Fel d 1的合成肽具有介于3246至4083道尔顿的分子量，具有4.30 至4.93的经计算的等电点。所有的五个肽均为水溶性的，肽1、2和3可能含有人 T细胞表位(表7)。

表8.与rFel d 1相比源自Fel d 1的合成肽具有减少的IgE反应活性

实施例20：与rFel d 1相比源自Fel d 1的合成肽具有减少的IgE反应活性并 且源自Fel d 1的合成肽缺少变应原性活性

为了鉴定适合于疫苗接种的低变应原性肽，研究了血清IgE对源自Fel d 1的 合成肽的反应活性。

对IgE介导的猫过敏症的诊断是基于既往病历、刺皮测试(Allergopharma， Reinbek，Germany)和对血清总IgE以及猫皮屑特异性血清IgE的测定(CAP-FEIA， Pharmacia Diagnostics，Sweden)。包括了用于对照目的的非过敏性人员。

20.1.在ELISA测试中检测的IgE结合能力

使用来自14个猫过敏性病人的血清对五个源自Fel d 1的合成肽的IgE结合能 力与完全rFel d 1变应原进行了比较。ELISA板(Nunc Maxisorb，Denmark)以源 自Fel d 1的合成肽或作为对照的rFel d 1(0.5μg/孔)进行包被，洗涤然后封闭。 然后以1:5稀释的来自猫过敏性病人和非过敏性个体的血清在4℃下进行温育过 夜。所结合的IgE抗体用1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的抗-人IgE抗体(KPL， USA)进行检测。

对来自7个女性和7个男性猫过敏性病人(年龄为22至75岁)的血清进行 CAP-FEIA确定。所测的总IgE水平介于122至>4000kU/l，猫皮屑特异性IgE水 平介于1.99至>100kUA/l(表7)。在ELISA测试中，确定了所测的所有14个血 清对主要猫变应原Fel d 1的IgE反应活性。以光密度(OD)获得结果，其介于0.178 至2.838OD单位。在相同的ELISA测试中测定了14个血清对源自Fel d 1的合成 肽的IgE反应活性。发现：肽1、2、3和5保留了IgE结合。对于肽1来说观察到 的IgE结合为6/14血清，对于肽2为3/14血清，对于肽3为1/14血清，对于肽5 为10/14血清。所测的OD单位对于肽1来说介于0.051至1.998之间，对于肽2 来说介于0.060至0.123，对于肽3为0.186，对于肽5来说介于0.056至0.677。 总之，所测的所有OD单位均显著性低于各自的相对于完全Fel d 1变应原所测的 值。

这证明了与完全Fel d 1变应原相比，源自Fel d 1的合成肽具有减少的IgE反 应活性。因此，源自Fel d 1的合成肽可认为是低变应原性的，当在SIT中使用时， 其提供了减少的IgE介导的副作用的优点。

20.1.对人嗜碱细胞上的表面标记CD203c和CD63表达的特异性诱导(图17)

由于IgE结合是诱导1型过敏性反应的先决条件，但不足以诱导1型过敏性 反应，1型过敏性反应还需要与效应细胞结合的特异性IgE的交联，所以在嗜碱细 胞激活测试中研究了源自Fel d 1的合成肽的实际变应原性活性。这些测试检测到 表面标记CD203c和CD63的变应原特异性上调，CD203c和CD63二者均被识别 为嗜碱细胞激活的标记(Hauswirth等人J Allergy Clin Immunol.(2002) 110：102-109)。

在获得知会同意之后，从5个猫过敏性病人取得了肝素化血液样品。以系列 稀释的rFel d 1、源自Fel d 1的合成肽作为单独成分或作为等摩尔混合物、抗-IgE 抗体或缓冲液(PBS)在37℃下对血液等分试样(100μl)进行温育15分钟。 温育之后，在含有20mM EDTA的PBS中洗涤细胞。然后以10μl PE偶联的CD203c mAb 97A6和20μl的FITC偶联的CD63 mAb CLB-gran12在室温下对细胞进行温 育15分钟。然后，将样品以2ml FACSTM裂解溶液进行红血球裂解。然后洗涤细 胞，重悬于PBS，并在FACScan(Becton Dickinson)上用二色流式细胞术使用 Paint-a-Gate软件分析。变应原诱导的CD203c和CD63的上调通过平均荧光强度 (MFI)(由经刺激的(MFIstim)和未刺激的(MFIcontrol)细胞获得)来计算， 并表达为刺激指数(MFIstim：MFIcontrol)。SI大于2.0(即大于2倍上调)被认 为是特异性(诊断性)反应的指征。

在所研究的所有五个猫过敏性病人(RR、EB、KC、MG和SM)的嗜碱细胞 上，以rFel d 1刺激均诱导了表面标记CD203c和CD63的变应原特异性上调。在 5个病人中的4个(RR、KC、MG和SM)中观察到CD203c和CD63的上调为剂 量依赖性的。对于这些病人来说：对于所测的最低浓度(0.001μg rFel d 1/ml)， CD203c刺激指数为1.1(SM)至3.2(RR)；对于所测的最高浓度(10μg的 rFel d 1/ml)，CD203c刺激指数为3.6(KC)至6.2(RR)。在同样的测试中所确 定的CD63的刺激指数：对于所测的rFel d 1的最低浓度(0.001μg rFel d 1/ml) 为介于1.1(RR)至2.0(MG)；对于所测的rFel d 1的最高浓度(10μg的 rFel d 1/ml)为介于3.9(RR)至7.3(MG)。对于病人EB来说，0.001μg/ml的 Fel d 1已经足以诱导表面标记CD203c和CD63的高水平的上调，从而防止观察到 表面标记上调的剂量依赖性。

以五个渐增的浓度(0.005、0.05、0.5、5和50μg/ml)的五个源自Fel d 1的 合成肽的等摩尔混合物对来自所有的五个猫过敏性病人的嗜碱细胞进行探测。另 外以五个渐增浓度(0.001、0.01、0.1、1和10μg/ml)的五个单独的源自Fel d 1 的合成肽对病人RR的嗜碱细胞进行探测。发现肽在上调表面标记CD203c和CD63 上是缺陷的。肽不能够诱导病人RR、KC和SM的CD203c和CD63表达的任何增 加。对于病人MG可检测到CD203c(SI＝2.3)和CD63(SI＝2.5)轻微的上调， 但是仅限于所测的最高浓度(50μg肽混合物/ml)，而所用的最低浓度也没有刺激 效应。对于病人EB观察到更为有力的CD203c(SI＝4.2)和CD63(SI＝4.3)的 上调，但是，仍然是只对所测肽混合物的最高浓度。在这两种情况下(病人MG 和EB)，以肽刺激后的上调率均比相应的以完全Fel d 1变应原刺激后的显著性降 低。

这证明了源自Fel d 1的合成肽提供了比完全Fel d 1变应原具有较低的变应原 性活性的优点。当在SIT中使用源自Fel d 1的合成肽时，这与减少IgE介导的副 作用风险相关。

实施例21：以源自Fel d 1的合成肽免疫诱导了与完全rFel d 1反应的IgG抗 体

源自Fel d 1的合成肽在IgE结合方面表现为缺陷的。作为疫苗接种(目的是 诱导变应原特异性IgG抗体)的候选分子，肽必须保持特异性的变应原结构并且 必须仍然能够诱导对完全变应原特异性的IgG免疫反应。为了找出源自Fel d 1的 合成肽是否满足这些要求，在兔子中进行了免疫实验。

以未经偶联的rFel d 1和KLH偶联的源自Fel d 1的合成肽对兔子进行免疫。 使用Imject马来酰亚胺激活免疫原偶联试剂盒(Imject Maleimide Activated Immunogen Conjugation Kit)(Pierce，USA)，通过它们的半胱氨酸残基将经HPLC 纯化的肽偶联至KLH。

使用CFA(第一次免疫)和IFA(4周后第一次推进性注射；7周后进行带有 不完全佐剂的第二次推进性注射)(Charles River Breeding Laboratories，Germany) 以免疫原(200μg/注射)对兔子(New Zealand White rabbits)进行免疫。在第一 次免疫8周后然后在4周间隔内对兔子进行取血。

在ELISA测试中监视肽特异性和rFel d 1特异性抗体的诱导。ELISA板(Nunc Maxisorb，Denmark)以rFel d 1(0.5μg/孔)进行包被，洗涤并封闭。然后用1:1000 稀释的兔子抗血清和相应的兔子免疫前血清以两次重复的方式对板上所结合的 rFel d 1进行探测，以1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗-兔子抗血清 (Jackson ImmunoResearch Inc.，USA)对所结合的IgG进行探测。计算两次重复的 平均值，显示出小于5％的误差。

以源自Fel d 1的合成肽进行的免疫诱导了与Fel d 1反应的IgG抗体。以五个 源自Fel d 1的合成肽中的每个进行第一次免疫八周之后，可在五个兔子抗血清中 的每个里面检测到与完全Fel d 1变应原反应的IgG抗体。在接下来的取血中IgG 抗体水平保持了相当的水平(图16)。

抗-肽1、抗-肽2、抗-肽4和抗-肽5兔子抗血清在与抗-Fel d 1兔子抗血清大 约相同的程度上表现出对Fel d 1的IgG反应活性。抗-肽3兔子抗血清也表现出明 显的但有些低的对Fel d 1的IgG反应活性。

这表明所有的5个源自Fel d 1的合成肽均为诱导Fel d 1特异性IgG抗体反应 的候选分子。

实施例22：源自Fel d 1的合成肽诱导比Fel d 1较弱的淋巴增殖反应

所需要的用于改善的SIT的候选分子不仅提供减少的IgE介导的副作用的优 点，而且有减少的T细胞介导的副作用的优点。为了研究源自Fel d 1的合成肽的 T细胞激活特性，进行了淋巴增殖测试。

通过Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech，UK)密度梯度离心从7个猫过敏 性病人中分离了PBMC。以三次重复方式在96孔板(Nunclone，Nalgene Nunc International，Denmark)中在37℃下5％CO2加湿的空气中以200μl的无血清Ultra Culture培养液(Cambrex，Belgium，培养液以2mM L-谷氨酸(Sigma，USA)，50μM β-巯基乙醇(Sigma)和每毫升0.1mg的庆大霉素(SIGMA)补充)来培养PBMC (2 x 105)。以不同浓度(5、2.5、1.25和0.6μg/孔)的rFel d 1和源自Fel d 1的合 成肽作为单独成分或作为等摩尔混合物以及用作对照目的的4U白细胞介素-2或 单独的培养液来刺激细胞。培养6天后每孔加入0.5μCi的3H-胸苷(Amersham Pharmacia Biotech)，16小时后使用微贝塔闪烁计数器(Wallac ADL，Germany) 通过液体闪烁计数来测定所引入的放射活性，从三次重复计算出平均cpm。从抗 原或白细胞介素-2刺激与未刺激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数(SI)。

IL-2刺激了来自所测的所有7个猫过敏性病人的PBMC的增殖，产生的刺激 指数对RR为9.8，对EB为5.2，对KC为3.2，对MG为6.7，对SM为6.3，对 RA为15.7以及对AR为13.9。

源自Fel d 1的合成肽诱导了较低的刺激指数(表9)。

表9：可鉴定源自Fel d 1的合成肽(基于等摩尔)诱导了比Fel d 1较弱的淋 巴增殖反应。以系列稀释的rFel d 1或源自Fel d 1的合成肽作为单独成分对来自7 个猫过敏性病人的PBMC进行刺激。以刺激指数显示特异性淋巴增殖反应。

实施例23：以源自Fel d 1的合成肽免疫而诱导的IgG抗体抑制猫过敏性病人 的IgE与完全Fel d 1变应原的结合

在ELISA竞争测试中检测了肽诱导的兔子Ig抑制过敏性病人的IgE抗体与完 全rFel d 1结合的能力。ELISA板(Nunc Maxisorb，Denmark)以rFel d 1(0.05μg/ 孔)进行包被，洗涤并封闭。然后以1:100稀释的兔子抗-肽抗血清(使用了单独 的抗-肽抗血清以及抗-肽抗血清的混合物)、兔子抗-rFel d 1抗血清和用于对照目的 的相应的兔子免疫前血清对板上所结合的rFel d 1进行预温育。在对板进行洗涤后， 以1:5稀释的来自猫过敏性病人的人血清对它们进行温育。以1:2500稀释的辣根 过氧化物酶标记的抗-人IgE抗体(KPL，USA)来检测所结合的IgE。按照如下计 算经抗-肽抗血清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率：IgE结合的％抑制 ＝100-O.D.I/O.D.P x 100，其中O.D.I为以兔子免疫血清预温育后所测的光密度，O.D.P 为兔子免疫前血清预温育后所测的光密度。

以5个抗-肽兔子抗血清预温育ELISA板上所结合的Fel d 1产生的抑制图谱 在所测的来自猫过敏性病人的14个不同血清中有差别。抗-肽1兔子抗血清阻断了 所测的13/14个病人的血清IgE与Fel d 1的结合，抗-肽2兔子抗血清阻断了8/14 个，抗-肽3兔子抗血清阻断了13/14个，抗-肽4兔子抗血清阻断了9/14个，抗- 肽5兔子抗血清阻断了5/14个。

在不同的抗血清中也显示出抑制程度的差异。在所测的单一的抗-肽兔子抗血 清中，抗-肽1兔子抗血清表现出最好的抑制率(从0-55％，平均为29％)。抗-肽2 兔子抗血清抑制率可达到0-18％(平均为5％)，抗-肽3兔子抗血清为0-29％(平 均为11％)，抗-肽4兔子抗血清为0-24％(平均为8％)，抗-肽5兔子抗血清为0-18％ (平均为5％)。

所有5个抗-肽兔子抗血清的混合物对所有病人的血清最有效地达到了对病人 的IgE与Fel d 1的结合的抑制，其抑制率为25-84％(平均为59％)。这些抑制甚 至比通过用抗-Fel d 1兔子抗血清预温育而达到的抑制还要显著(表10)。

表10：针对源自Fel d 1的合成肽产生的兔子抗血清抑制人IgE与Fel d 1的结 合。显示了14个病人中通过用兔子抗血清预温育Fel d 1而达到的对IgE与Fel d 1 结合的抑制百分率(作为平均值)。预温育以5个针对源自五个Fel d 1的合成肽产 生的兔子抗血清(抗-肽1至5)、5个抗-肽抗血清的混合物(Mix)和一个针对Fel d1产生的抗血清(抗-rFel d 1)进行。

当把抗-肽1兔子抗血清与每个其他的抗-肽抗血清组合起来时，对过敏性病人 的IgE结合的抑制显著性增高，几乎达到(例如，抗-肽1+4：41％，抗-肽1+5： 42％)用抗-rFel d 1抗体所得到的值(67％)(表11)。

表11：

  病人 抗-肽1+抗-肽2 抗-肽1+抗-肽3 抗-肽1+抗-肽4 抗-肽1+抗-肽5 抗-rFel d 1 1 61 49 61 63 75 2 24 17 28 28 74 3 60 52 62 57 86 4 43 33 43 40 68 5 17 9 27 30 67 6 37 24 42 46 73 7 26 21 36 34 74 8 51 46 53 55 72 9 40 28 46 43 61 10 16 11 30 34 40 11 45 35 47 45 78 12 52 40 56 59 76 13 29 17 29 32 62 14 7 10 14 16 28 平均 36 28 41 42 67

实施例24：接收到来自源自载体的T细胞表位的T细胞帮助的源自Bet v 1的 肽诱导Bet v 1特异性IgG反应并减少Bet v 1特异性T细胞增殖

已经表明源自Bet v 1的、表面暴露的B细胞肽在小鼠治疗和预防性疫苗接种 模型中诱导保护性的Bet v 1特异性IgG反应(Focke M等人Clin Exp Allergy (2004)34：1525-1533)。在Focke M等人(2004)中，在免疫小鼠前将6个源自 Bet v 1的肽偶联至载体分子KLH。在本实施例中表明：这些肽所诱导的Bet v 1 特异性IgG反应(表1)是由源自载体的而不是源自Bet v 1变应原的T细胞表位 的帮助所驱动。令人惊奇地发现：任何一个具有以下序列的源自Bet v 1的肽均未 诱导相关的T细胞反应：LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF(SEQ ID No. 20)，GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN(SEQ ID No.21)和 VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK(SEQ ID No.22)。这可以证明：大 多数T细胞反应为针对载体分子KLH(图18和19)。这个发现对于减少治疗性疫 苗接种中的副作用和减少预防性疫苗接种中潜在的致敏风险具有重要意义。过去 已经证明：源自变应原的肽缺少任何IgE反应活性，但是由于T细胞激活而含有 源自变应原的T细胞表位诱导的副作用。源自变应原的肽缺少IgE和T细胞反应 活性，如Bet v 1肽所例示，在治疗性疫苗接种中既没有诱导IgE介导的也没有诱 导T细胞介导的副作用。当用于预防性疫苗接种时，该肽将诱导Bet v 1特异性的 保护性IgG反应而不预先准备好Bet v 1特异性T细胞。这将最小化通过疫苗接种 而预先准备好免疫反应(其可为接下来的过敏性致敏铺好道路)的风险。

在本实施例中，在治疗性和预防性变应原疫苗接种小鼠模型中变应原性和载 体特异性T细胞反应是分开的。选取了源自Bet v 1的肽2、3和6(Focke M等 人(2004))并且在BALB/c小鼠中测试了它们是否含有任何已知的Bet v 1特异性 T细胞表位。按照如下对小鼠进行免疫(表10显示了致敏和处理程序)：以10μg重 组Bet v 1(Biomay，Austria)和/或合成的源自Bet v 1的肽2、3和6的混合物(每 个10μg)来免疫BALB/c小鼠组(n＝5)。如前所述将肽偶联至KLH(Focke M等 人(2004))。为了进行免疫，把Bet v 1和肽混合物吸附至氢氧化铝(Alu-Gel-S， Serva，Germany)，总体积为150μl/小鼠。

表12：致敏和处理程序

在T细胞增殖测试中分析了变应原特异性、肽特异性和载体特异性淋巴增殖。 在无菌条件下取出脾脏并匀浆。对红血球进行裂解后，洗涤细胞并重悬于完全培 养液(RPMI，10％胎牛血清，0.1mg/ml庆大霉素，2mM谷氨酸)。将单细胞悬浮 液以2 x 105细胞/孔植板于96孔圆底板并以作为阳性对照的concavalin A(0.5μg/ 孔)、rBet v 1(2μg/孔)、KLH(2μg/孔)、肽混合物(0.34μg每种肽/孔)或单 独的培养液刺激4天。以0.5μCi/孔含氚胸苷进行脉冲16小时并收集。由闪烁计 数来测定增殖反应。计算了抗原和培养液对照刺激后的平均增殖比率值，即刺激 指数(SI)。

有趣的是，可以显示出：与致敏但未治疗的组S+/T-相比，Bet v 1致敏小鼠 (S+/T+组)中以源自Bet v 1的肽进行的治疗性疫苗接种能够减少Bet v 1特异性 增殖。在致敏和处理组中，未检测到肽特异性增殖，但是根据载体效应，观察到 了KLH特异性增殖。单独的肽疫苗(S-/T+组)主要诱导了KLH特异性T细胞， 但几乎没有Bet v 1特异性T细胞反应(图18)。

与Bet v 1致敏组P-/S+相比，以肽进行的预防性疫苗接种几乎没有诱导Bet v 1 特异性增殖(P+/S-组)，但是有KLH特异性增殖。在进行预防性疫苗接种然后致 敏的小鼠(P+/S+组)中，Bet v 1特异性增殖显著地减少，而且，没有在任何小 鼠组中观察到肽特异性反应(图19)。

因此，可以显示：在过敏症小鼠模型中，以结合至载体的源自变应原的B细 胞肽进行的预防性疫苗接种没有预先预备肽特异性T细胞，几乎没有变应原特异 性而只有载体特异性T细胞。在过敏性致敏以及治疗性疫苗接种之前对小鼠进行 的预防性疫苗接种减少了变应原特异性T细胞增殖。

以源自Bet v 1的肽进行的预防性处理(而无Bet v 1特异性T细胞的帮助)诱 导了Bet v 1特异性IgG反应。而且，预防性处理增加了Bet v 1特异性IgG反应(已 经由Bet v 1变应原在第一次致敏20和40天诱导)(图20)。

这些结果证明：肽疫苗诱导了可被变应原暴露所推进的Bet v 1特异性IgG反 应。

实施例25：表现出减少的IgE结合能力的源自Der p 2的肽

使用根据表13所述的肽和遭受屋尘螨过敏症个体的血清按照实施例15.1和 20.1对源自Der p 2的肽的IgE结合能力进行了确定。

表13：源自Der p 2的肽

  肽 位置 序列 SEQ ID No. Der p 2肽1 1-33 DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCI IHRGK 96 Der p 2肽2 21-51 CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKT AK 97 Der p 2肽3 42-73 EANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDP NAC 98 Der p 2肽4 62-103 EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDI KYTWIVPKIAPKSEN 99 Der p 2肽5 98-129 APKSENVVVTVKVMGDNGVLACAIATH AKIRD 100

结果清晰地显示：本发明的源自Der p 2的肽表现出显著性减少IgE结合的能 力。

表14：结果

  rDer p 2 肽1 肽2 肽3 肽4 肽5 平均 (n＝50) 1,080 0,010 0,015 0,004 0,031 0,006

实施例26：肽长度的变异对肽的IgE结合能力、T细胞反应活性和免疫原性 没有效应

26.1.肽的设计

为了研究肽长度变异对IgE结合能力、T细胞反应活性和免疫原性的效应，通 过几个氨基酸来增加肽1(P1)的长度和减少肽2(P2)的长度而设计了源自Phl p 5的肽的变体(表15)。

表15：合成的源自Phl p 5的肽(1，2)及其变体(1a，2b)的位置、序列、 氨基酸数目的长度和分子量

表15：源自PHL p 5的合成肽的变体

26.2.缺少IgE反应活性

为了分析源自Phl p 5的肽1、2及其变体1a、2b的IgE反应活性，使用0.2μg 的肽/点和来自7个草花粉过敏性病人(p1-p7)和1个来自非过敏性个体(NHS) 的血清进行了点杂交测试。所结合的IgE以125I标记的抗-人IgE(Phadia，Uppsala， Sweden)进行检测。rPhl p 5用作阳性对照，HSA用作阴性对照。病人与rPhl p 5 但不与肽和肽变体(图21)反应。

26.3.淋巴增殖反应

以不同浓度的源自Phl p 5的肽1、2及其变体1a、2b和用于对照的rPhl p 5 刺激来自2个草花粉过敏性病人的PBMC。由肽所获得的刺激指数显著性较低于 由rPhl p 5所获得的(图22)。

26.4.肽变体的免疫原性

以KLH偶联的源自Phl p 5的肽及其变体对兔子进行免疫。使用ELISA实验 来测定所获得的兔子抗血清对肽及其变体的IgG反应活性(表16)。以肽及其变 体进行免疫诱导了交叉反应性的能识别肽及其相应变体的IgG抗体。

表16：在兔子中经以KLH偶联的肽免疫而产生的抗-Phl p 5肽抗血清的交叉 反应活性。显示了肽抗血清对肽(1，2)和变体(1a，2b)的IgG反应活性。用 免疫前血清未观察到反应活性(pre P1，pre P1a，pre P2，pre P2b)。

a.抗肽1抗血清(抗P1)与肽1变体(1a)交叉反应，抗肽1a抗血清(抗P1a) 与肽1交叉反应。

b.抗肽2抗血清(抗P2)与肽2变体(2b)交叉反应，抗肽2b抗血清(抗 P2b)与肽2交叉反应。

表16：兔子抗血清的交叉反应活性

a)

b)

26.5.肽诱导的兔子抗血清抑制草花粉过敏性病人的IgE与rPhl p 5的结合

在竞争性ELISA中研究了兔子抗-肽2和2b IgG的抑制人IgE与rPhl p 5结合 的能力。ELISA板以抗P2、抗P2b和用于对照目的的抗Phl p 5抗血清进行预温育。 然后将板暴露于来自12个草花粉过敏性病人的血清。在表17中显示了对IgE与 rPhl p 5结合的抑制百分率。抗肽2和抗肽2b抗血清在相同程度上抑制病人的IgE 与rPhl p 5的结合。

也以兔子抗肽1和1a抗血清进行了竞争性ELISA。在实施例17中(以源自 Phl p 5的肽进行免疫诱导了IgG抗体，其抑制了草花粉过敏性病人的IgE与Phl p 5 的结合)抗肽1(P1)抗体抑制了病人的IgE与Phl p 5的结合(其平均抑制率为 28.5％)。使用抗肽1a抗血清获得了相似的结果(其抑制百分率为23.7％)。

表17：抗肽抗血清对病人的IgE与rPhl p 5结合的抑制。抗肽2和抗肽2b抗 血清在相同程度上抑制病人的IgE与rPhl p 5的结合。ELISA板上所结合的rPhl p 5 以抗P2、抗P2b和用于对照目的的抗Phl p 5抗血清进行预温育。然后将板暴露于 来自12个草花粉过敏性病人的血清。显示了对IgE与rPhl p 5结合的抑制百分率。

表17：对IgE结合的％抑制

实施例27：抗-VP1抗体的交叉保护

人类鼻病毒包含超过一百种不同的株。在这个中和测试中显示：一种株的鼻 病毒感染也可被另一种株的VP1特异性抗体所抑制。以等密度将HeLa细胞铺种 于孔中。100TCD50HRV14以抗-14VP1和抗-89VP1抗体(未稀释的；1:2-1:32孔 1-6)进行预温育并分别加入到行A和D的孔中。把用抗-14VP1和抗-89VP1分别 预温育的100TCD50 HRV 89加入到行B和C的孔中。3天后活细胞染成紫色。抗 -89VP1抗体和抗-14VP1抗体以相互可比较的方式阻断了HRV14的感染。针对 14VP1和89VP1产生的抗体也在相同浓度上抑制了HRV89的感染。

序列表

<110>碧欧美公司

<120>疫苗载体

<130>R 49994

<150>AT A 994/2006

<151>2006-06-09

<160>142

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

<210>2

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

<210>9

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>9

<210>10

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>10

<210>11

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>11

<210>12

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>12

<210>13

<211>33

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>13

<210>14

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>14

<210>15

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的低变应原性分子

<400>15

<210>16

<211>36

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的低变应原性分子

<400>16

<210>17

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的低变应原性分子

<400>17

<210>18

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的低变应原性分子

<400>18

<210>19

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的低变应原性分子

<400>19

<210>20

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Bet v 1的低变应原性分子

<400>20

<210>21

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Bet v 1的低变应原性分子

<400>21

<210>22

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Bet v 1的低变应原性分子

<400>22

<210>23

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 1的低变应原性分子

<400>23

<210>24

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 1的低变应原性分子

<400>24

<210>25

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 1的低变应原性分子

<400>25

<210>26

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 1的低变应原性分子

<400>26

<210>27

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 2的低变应原性分子

<400>27

<210>28

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 2的低变应原性分子

<400>28

<210>29

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 2的低变应原性分子

<400>29

<210>30

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 2的低变应原性分子

<400>30

<210>31

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 2的低变应原性分子

<400>31

<210>32

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>32

<210>33

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>33

<210>34

<211>42

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>34

<210>35

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>35

<210>36

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>36

<210>37

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>37

<210>38

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>38

<210>39

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>39

<210>40

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Alt a 6的低变应原性分子

<400>40

<210>41

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>41

<210>42

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>42

<210>43

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>43

<210>44

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>44

<210>45

<211>39

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>45

<210>46

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>46

<210>47

<211>46

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>47

<210>48

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Amb a 1的低变应原性分子

<400>48

<210>49

<211>44

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Art v 1的低变应原性分子

<400>49

<210>50

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Art v 1的低变应原性分子

<400>50

<210>51

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Art v 1的低变应原性分子

<400>51

<210>52

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 1的低变应原性分子

<400>52

<210>53

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 1的低变应原性分子

<400>53

<210>54

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 1的低变应原性分子

<400>54

<210>55

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 1的低变应原性分子

<400>55

<210>56

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 1的低变应原性分子

<400>56

<210>57

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 2的低变应原性分子

<400>57

<210>58

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 2的低变应原性分子

<400>58

<210>59

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 2的低变应原性分子

<400>59

<210>60

<211>39

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 2的低变应原性分子

<400>60

<210>61

<211>42

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Can f 2的低变应原性分子

<400>61

<210>62

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>62

<210>63

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>63

<210>64

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>64

<210>65

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>65

<210>66

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>66

<210>67

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>67

<210>68

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>68

<210>69

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>69

<210>70

<211>42

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>70

<210>71

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>71

<210>72

<211>42

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>72

<210>73

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>73

<210>74

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>74

<210>75

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>75

<210>76

<211>42

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>76

<210>77

<211>39

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>77

<210>78

<211>42

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 2的低变应原性分子

<400>78

<210>79

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Ole e 1的低变应原性分子

<400>79

<210>80

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Ole e 1的低变应原性分子

<400>80

<210>81

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Ole e 1的低变应原性分子

<400>81

<210>82

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Ole e 1的低变应原性分子

<400>82

<210>83

<211>39

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Ole e 1的低变应原性分子

<400>83

<210>84

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Par j 2的低变应原性分子

<400>84

<210>85

<211>36

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Par j 2的低变应原性分子

<400>85

<210>86

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Par j 2的低变应原性分子

<400>86

<210>87

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Par j 2的低变应原性分子

<400>87

<210>88

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>88

<210>89

<211>33

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>89

<210>90

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>90

<210>91

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>91

<210>92

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>92

<210>93

<211>33

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>93

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<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>94

<210>95

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 1的低变应原性分子

<400>95

<210>96

<211>33

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 2的低变应原性分子

<400>96

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<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 2的低变应原性分子

<400>97

<210>98

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 2的低变应原性分子

<400>98

<210>99

<211>42

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 2的低变应原性分子

<400>99

<210>100

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 2的低变应原性分子

<400>100

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<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 5的低变应原性分子

<400>101

<210>102

<211>36

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 5的低变应原性分子

<400>102

<210>103

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 5的低变应原性分子

<400>103

<210>104

<211>36

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 5的低变应原性分子

<400>104

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<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 7的低变应原性分子

<400>105

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<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 7的低变应原性分子

<400>106

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<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 7的低变应原性分子

<400>107

<210>108

<211>36

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 7的低变应原性分子

<400>108

<210>109

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 7的低变应原性分子

<400>109

<210>110

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 7的低变应原性分子

<400>110

<210>111

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>111

<210>112

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>112

<210>113

<211>40

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>113

<210>114

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>114

<210>115

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>115

<210>116

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>116

<210>117

<211>41

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>117

<210>118

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 10的低变应原性分子

<400>118

<210>119

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 21的低变应原性分子

<400>119

<210>120

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 21的低变应原性分子

<400>120

<210>121

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 21的低变应原性分子

<400>121

<210>122

<211>33

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Der p 21的低变应原性分子

<400>122

<210>123

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自克隆30的低变应原性分子

<400>123

<210>124

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自克隆30的低变应原性分子

<400>124

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<211>39

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自克隆30的低变应原性分子

<400>125

<210>126

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Bet v 1的低变应原性分子

<400>126

<210>127

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Bet v 1的低变应原性分子

<400>127

<210>128

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Bet v 1的低变应原性分子

<400>128

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<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的链1的低变应原性分子

<400>129

<210>130

<211>36

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的链1的低变应原性分子

<400>130

<210>131

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的链2的低变应原性分子

<400>131

<210>132

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的链2的低变应原性分子

<400>132

<210>133

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Fel d 1的链2的低变应原性分子

<400>133

<210>134

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>134

<210>135

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>135

<210>136

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>136

<210>137

<211>31

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>137

<210>138

<211>33

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>138

<210>139

<211>38

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的低变应原性分子

<400>139

<210>140

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>克隆30屋尘螨变应原

<400>140

<210>141

<211>37

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的肽

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<210>142

<211>29

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>源自Phl p 5的肽

<400>142

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