PHL P1变应原衍生物
阅读：231发布：2020-07-11
专利汇可以提供PHL P1变应原衍生物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且与野生型变应原相比变应原活性下降的野生型 蛋白质 变应原Phl p1衍 生物 的制备方法，其包含下列步骤：产生野生型蛋白质变应原Phl p1，将所述野生型蛋白质变应原至少分成三个 片段 ，其中所述至少三个片段中至少有一个片段包含至少一个T细胞表位，所述至少三个片段的变应原活性下降或缺乏变应原活性，和以区别于野生型变应原中的片段顺序的顺序重新连接所述至少三个片段。，下面是PHL P1变应原衍生物专利的具体信息内容。
1、与野生型变应原相比变应原活性下降的野生型蛋白质变应原 Phl p 1衍生物的制备方法，其包含下列步骤：
-产生野生型蛋白质变应原Phl p 1，
-将所述野生型蛋白质变应原至少分成三个片段，其中所述至少 三个片段中至少有一个片段包含至少一个T细胞表位，所述至少三 个片段的变应原活性下降或缺乏变应原活性和
-以区别于野生型变应原中的片段顺序的顺序重新连接所述至 少三个片段。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于通过与野生型变应原 相比，IgE结合能力下降至少10％，优选至少20％，更优选至少30％， 尤其是至少50％来测定变应原活性下降。
3、根据权利要求1或2的方法，其特征在于通过变应原致敏 患者血清中的IgE抗体不能结合到所述衍生物的斑点印迹上或嗜碱 性粒细胞释放试验来测定变应原活性下降。
4、根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于在将所 述野生型蛋白质变应原至少分成三个片段之前确定所述变应原的T 细胞表位。
5、根据权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于至少三 个片段包含Phl p 1的氨基酸残基25至39、氨基酸残基34至45、 氨基酸残基73至84、氨基酸残基91至102、氨基酸残基100至 111、氨基酸残基109至133、氨基酸残基121至135、氨基酸残基 127至138、氨基酸残基157至168、氨基酸残基169至183或氨基 酸残基226至240。
6、根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于至少三 个片段选自Phl p 1的氨基酸残基1至64(A)、氨基酸残基65至 125(B)、氨基酸残基126至205(C)或氨基酸残基206至240(D)。
7、根据权利要求6的方法，其特征在于变应原衍生物中所述 片段的顺序是B-D-A-C。
8、根据权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于所述衍 生物与药学上可接受的赋形剂联合并制成药物制剂。
9、根据权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于所述衍 生物与适合的疫苗佐剂联合并制成药学上可接受的疫苗制剂。
10、根据权利要求9的方法，其特征在于所述衍生物与至少一 种进一步变应原联合制成联合疫苗。
11、根据权利要求10的方法，其特征在于所述进一步变应原 是野生型变应原，尤其是一种野生型变应原混合物、重组野生型变 应原、野生型蛋白质变应原衍生物或它们的混合物。
12、根据权利要求9至11中任一项的方法，其特征在于所述 制剂进一步包含变应原提取物。
13、根据权利要求10至12中任一项的方法，其特征在于所述 进一步变应原选自主要桦树花粉变应原，尤其是Bet v 1和Bet v 4， 主要猫尾草花粉变应原，尤其是Phl p 2、Phl p 5、Phl p 6和Phl p 7， 主要屋尘螨变应原，尤其是Der p 1和Der p 2，主要猫变应原Fel d 1，主要蜜蜂变应原，主要黄蜂变应原，肌动蛋白抑制蛋白，尤其是 Phl p 12或储存尘螨变应原，尤其是Lep d 2。
14、根据权利要求1至7中任一项的方法获得的变应原衍生物。
15、野生型蛋白质变应原Phl p 1的变应原衍生物，其特征在于 所述衍生物包含所述野生型蛋白质变应原的至少三个以区别于野 生型变应原中的片段顺序的顺序彼此融合的片段，其中所述至少三 个野生型变应原片段表现出下降的变应原活性或缺乏变应原活性 并且其中所述至少三个片段中至少有一个片段包含一个或多个T细 胞表位。
16、根据权利要求15的变应原衍生物，其特征在于所述至少 三个变应原片段包含至少6个氨基酸残基，优选至少10个氨基酸 残基，尤其是至少15个氨基酸残基。
17、根据权利要求15或16的变应原衍生物，其特征在于至少 三个片段包含Phl p 1的氨基酸残基25至39、氨基酸残基34至45、 氨基酸残基1至64、氨基酸残基73至84、氨基酸残基91至102、 氨基酸残基100至111、氨基酸残基109至133、氨基酸残基121 至135、氨基酸残基65至125、氨基酸残基126至205、氨基酸残 基127至138、氨基酸残基157至168、氨基酸残基169至183、氨 基酸残基206至240或氨基酸残基226至240。
18、根据权利要求15至17中任一项的变应原衍生物，其特征 在于至少三个片段选自Phl p 1的氨基酸残基1至64(A)、氨基酸 残基65至125(B)、氨基酸残基126至205(C)或氨基酸残基206 至240(D)。
19、根据权利要求18的变应原衍生物，其特征在于变应原衍 生物中所述片段的顺序是B-D-A-C。
20、包含根据权利要求14至19中任一项的变应原衍生物和进 一步变应原的变应原组合物，其中进一步变应原优选野生型变应 原，尤其是野生型变应原的混合物、重组野生型变应原和野生型蛋 白质变应原衍生物或它们的混合物。
21、根据权利要求20的变应原组合物，其特征在于所述组合 物进一步包含变应原提取物。
22、根据权利要求20或21的变应原组合物，其特征在于所述 组合物包含药学上可接受的赋形剂。
23、根据权利要求20至22中任一项的变应原组合物，其特征 在于所述组合物进一步包含一种或多种变应原，该变应原选自主要 桦树花粉变应原，尤其是Bet v 1和Bet v 4的，主要猫尾草花粉变 应原，尤其是Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5、Phl p 6和Phl p 7，主要屋 尘螨变应原，尤其是Der p 1和Der p 2，主要猫变应原Fel d 1，主 要蜜蜂变应原，主要黄蜂变应原，肌动蛋白抑制蛋白，尤其是Phl p 12或储存尘螨变应原，尤其是Lep d 2。
24、根据权利要求14至23中任一项的变应原衍生物或变应原 组合物制备变应原特异性免疫治疗药剂的用途。
25、根据权利要求14至23中任一项的变应原衍生物或变应原 组合物制备主动免疫接种药剂的用途。
26、根据权利要求14至23中任一项的变应原衍生物或变应原 组合物制备预防免疫接种药剂的用途。
27、根据权利要求14至26中任一项的用途，其特征在于所述 药剂进一步包含佐剂、稀释剂和防腐剂或它们的混合物。
28、根据权利要求24至27中任一项的用途，其特征在于该用 途包含10ng至1g，优选100ng至10mg，尤其是0，5μg至200μg 的所述重组变应原衍生物。
29、根据权利要求15至18中任一项的变应原衍生物的制备方 法，其特征在于采用下列步骤：
-产生编码根据权利要求15至18中任一项的变应原衍生物的 DNA分子，
-将所述DNA分子转化宿主细胞，和
-在所述宿主细胞中表达所述衍生物和分离所述衍生物。
30、根据权利要求29的方法，其特征在于所述宿主是优选酵 母或植物细胞的真核细胞或优选大肠杆菌的原核细胞。
31、根据权利要求15至18中任一项的变应原衍生物的制备方 法，其特征在于变应原衍生物通过化学合成制备。
技术领域
本发明涉及野生型蛋白质变应原Phl p1的衍生物及其制备方 法。
背景技术
变态反应是遗传性的或获得性的对通常是无害的外源性(即非 己)物质(“变应原”)的反应能力的特异性改变。变态反应与受累 器官系统(皮肤、结膜、鼻、咽、支气管粘膜和胃肠道)的炎性反 应，速发疾病症状，如变态反应性鼻炎、结膜炎、皮炎、过敏性休 克和哮喘，和慢性疾病现象，如哮喘和特应性皮炎的迟发期反应有 关。
I型变态反应代表了一种遗传决定的影响到约20％的世界工业 化人口的超敏反应性疾病。I型变态反应的病理生理学标志是抗别 的无害抗原(变应原)的免疫球蛋白E(IgE)抗体的产生。
目前，治疗变态反应的唯一病因形式是变应原特异性免疫治 疗，其中增加给予患者的变应原剂量以诱导变应原特异性的无应答 性。虽然一些研究已经显示了变应原特异性免疫治疗的临床有效 性，但并没有充分理解其根本机制。
变应原特异性免疫治疗的主要缺点是依赖于使用天然变应原 提取物，而天然变应原提取物如果不是因为无法标准化而难以得 到，也至少因为难以达到工业化生产水平而难以得到。这些天然变 应原提取物由不同的变应原和非变应原复合物构成，并且由于这一 事实，有可能在给药提取物中不存在某些变应原或甚至更糟糕的是 在治疗过程中患者对其成分形成新的Ig E特异性。基于提取物的治 疗的另一个缺点来自于给予生物活性变应原制剂能够引起过敏反 应副作用这一事实。
分子生物学技术在变应原鉴定领域中的应用使编码所有相关 的环境中的变应原的cDNA得以分离，并得以制备重组变应原。使 用这种重组变应原使得通过体外诊断方法(即检测血清中的变应原 特异性IgE抗体)或者通过体内试验确定个体患者的反应性谱成为 可能。基于这一技术，有可能开发新的基于成分的抗变态反应的疫 苗接种策略，尤其是抗患者致敏谱明确的I型变态反应的疫苗接种 策略。然而，由于重组变应原与它们对应的天然物质的相似性，重 组变应原也表现出显著的变应原活性。由于重组变应原与野生型变 应原的变应原活性非常接近，所以在使用天然变应原进行免疫治疗 时出现的与此变应原活性有关的缺点在使用重组变应原时也同样 存在。为了改进免疫治疗，不得不降低重组变应原的变应原活性以 便能增加变应原的给药剂量而仅有很低的过敏反应副作用的风险。
建议通过给予仅包含T细胞表位的多肽完全影响变应原特异性 T细胞的活性。T细胞表位代表完整变应原经抗原呈递细胞的蛋白 水解消化产生的小分子多肽。这种T细胞表位能通过多肽的合成而 制备。然而，迄今为止用T细胞表位所做的试验仅显示出差的结果 和低的有效性。考虑以下因素可以解释一些基于T细胞表位多肽的 免疫治疗的有效性低的原因：第一，很难给予为T细胞所耐受而不 使之激活的最佳剂量。第二，小的T细胞表位多肽在体内的半衰期 很短。第三，有相当多的证据表明，特应性个体IgE的产生代表了 不需重新类型转换从而不能被T细胞来源的细胞因子所调控的记忆 性免疫应答。完全基于T细胞表位的给药的治疗形式可因此调制变 应原特异性T细胞的活性，但可几乎不影响已经转换的记忆性B细 胞产生变应原特异性IgE抗体。
另一个建议就是通过重组DNA技术或多肽合成技术制备低变 应原性变应原衍生物或片段。这种衍生物或片段带有T细胞表位并 能诱导IgG抗体与IgE竞争天然变应原的识别位点。在20多年前 证明变应原的蛋白质水解消化作用产生小的变应原片段，这些片段 部分保留了其IgE结合能力但不能引起速发型反应。虽然变应原的 蛋白水解过程难以控制和标准化，但分子生物学研究开辟了新的制 备IgE结合半抗原的途径。这种IgE结合半抗原因其发生过敏性反 应的风险低已经建议用于主动免疫接种，并且建议用于被动治疗使 效应细胞结合的IgE在接触变应原之前饱和从而阻断变应原诱导的 介质释放。
基于变应原可天然出现只有少数几个氨基酸残基有区别和/或 在具有低IgE结合能力的构象上有区别的的同分异构体这一认识， 另一个建议是可通过基因工程制备低变应原性变应原。例如，主要 桦树花粉变应原，Bet v1，通过基因工程方法使其发生寡聚化得到 变应原活性大大降低的重组三聚体。另外，建议引入点突变使变应 原结构发生构象变化从而破坏IgE构象表位或直接影响IgE结合能 力(Valenta等人，Biol.Chem.380(1999)，815-824)。
文献还表明，变应原分成几个部分(如分成两部分)后由于丧 失了近似天然的折叠结构，因而导致变应原几乎完全丧失其IgE结 合能力和变应原活性(Bet v1，Vrtala等人，J.Clin.Invest.99(1997)， 1673-1681；Bet v4，Twardosz等人，BBRC239(1997)，197-204； Aln g4，Hayek等人，J.Immunol.161(1998)，7031-7039；牛毛发 皮屑变态反应变应原，Zeiler等人，J.Allergy Clin.Immunol.100 (1997)，721-727；Lep d2，Elfman，Int.Arch.Allergy Immunol.117 (1998)，167-173；Phlp7，Westritschnig，J.Immunol.172(2004)， 5684-5692))。将主要含有不连续或构象IgE表位的蛋白质分段导致 变应原的IgE结合能力实质上地下降。基于这一知识，在在先技术 中研究了这种低变应原性变应原片段能否在体外诱导保护性免疫 应答(Westritschnig等人，(Curr.Opinion in Allergy and Clin.Immunol. 3(2003，495-500))。
Ball等人的文献(Eur J Immunol 1999，29：2026-2036)描述了 在免疫治疗过程中使用氢氧化铝吸附的牧草花粉提取物给药。
专利US 2002/0052490 A1公开了编码包含至少一种Phl p1表 位的多肽的重组DNA分子。
Flicker S等人的文章(J Allergy Clin Immunol 2006，117：1336- 1343)公开了Phl p1变应原的C末端包含整个Phl p1分子的绝大 部分变应原潜力。
Linhart B等人的文章(FASEB J 2002，16：1301-1303)描述了 包含几种猫尾草变应原的杂合分子的制备。
专利DE 103 51 471 A1涉及由变应原的几种免疫显性T细胞表 位构成的不会发生交叉反应的杂合多肽。
I型变态反应代表了一种遗传决定的影响到约20％的世界工业 化人口的超敏反应性疾病。I型变态反应的病理生理学标志是抗别 的无害抗原(变应原)的免疫球蛋白E(IgE)抗体的产生。
目前，治疗变态反应的唯一病因形式是变应原特异性免疫治 疗，其中增加给予患者的变应原剂量以诱导变应原特异性的无应答 性。虽然一些研究已经显示了变应原特异性免疫治疗的临床有效 性，但并没有充分理解其根本机制。
变应原特异性免疫治疗的主要缺点是依赖于使用天然变应原 提取物，而天然变应原提取物如果不是因为无法标准化而难以得 到，也至少因为难以达到工业化生产水平而难以得到。这些天然变 应原提取物由不同的变应原和非变应原复合物构成，并且由于这一 事实，有可能在给药提取物中不存在某些变应原或甚至更糟糕的是 在治疗过程中患者对其成分形成新的Ig E特异性。基于提取物的治 疗的另一个缺点来自于给予生物活性变应原制剂能够引起过敏反 应副作用这一事实。
分子生物学技术在变应原鉴定领域中的应用使编码所有相关 的环境中的变应原的cDNA得以分离，并得以制备重组变应原。使 用这种重组变应原使得通过体外诊断方法(即检测血清中的变应原 特异性IgE抗体)或者通过体内试验确定个体患者的反应性谱成为 可能。基于这一技术，有可能开发新的基于成分的抗变态反应的疫 苗接种策略，尤其是抗患者致敏谱明确的I型变态反应的疫苗接种 策略。然而，由于重组变应原与它们对应的天然物质的相似性，重 组变应原也表现出显著的变应原活性。由于重组变应原与野生型变 应原的变应原活性非常接近，所以在使用天然变应原进行免疫治疗 时出现的与此变应原活性有关的缺点在使用重组变应原时也同样 存在。为了改进免疫治疗，不得不降低重组变应原的变应原活性以 便能增加变应原的给药剂量而仅有很低的过敏反应副作用的风险。
建议通过给予仅包含T细胞表位的多肽完全影响变应原特异性 T细胞的活性。T细胞表位代表完整变应原经抗原呈递细胞的蛋白 水解消化产生的小分子多肽。这种T细胞表位能通过多肽的合成而 制备。然而，迄今为止用T细胞表位所做的试验仅显示出差的结果 和低的有效性。考虑以下因素可以解释一些基于T细胞表位多肽的 免疫治疗的有效性低的原因：第一，很难给予为T细胞所耐受而不 使之激活的最佳剂量。第二，小的T细胞表位多肽在体内的半衰期 很短。第三，有相当多的证据表明，特应性个体IgE的产生代表了 不需重新类型转换从而不能被T细胞来源的细胞因子所调控的记忆 性免疫应答。完全基于T细胞表位的给药的治疗形式可因此调制变 应原特异性T细胞的活性，但可几乎不影响已经转换的记忆性B细 胞产生变应原特异性IgE抗体。
另一个建议就是通过重组DNA技术或多肽合成技术制备低变 应原性变应原衍生物或片段。这种衍生物或片段带有T细胞表位并 能诱导IgG抗体与IgE竞争天然变应原的识别位点。在20多年前 证明变应原的蛋白质水解消化作用产生小的变应原片段，这些片段 部分保留了其IgE结合能力但不能引起速发型反应。虽然变应原的 蛋白水解过程难以控制和标准化，但分子生物学研究开辟了新的制 备IgE结合半抗原的途径。这种IgE结合半抗原因其发生过敏性反 应的风险低已经建议用于主动免疫接种，并且建议用于被动治疗使 效应细胞结合的IgE在接触变应原之前饱和从而阻断变应原诱导的 介质释放。
基于变应原可天然出现只有少数几个氨基酸残基有区别和/或 在具有低IgE结合能力的构象上有区别的的同分异构体这一认识， 另一个建议是可通过基因工程制备低变应原性变应原。例如，主要 桦树花粉变应原，Bet v1，通过基因工程方法使其发生寡聚化得到 变应原活性大大降低的重组三聚体。另外，建议引入点突变使变应 原结构发生构象变化从而破坏IgE构象表位或直接影响IgE结合能 力(Valenta等人，Biol.Chem.380(1999)，815-824)。
文献还表明，变应原分成几个部分(如分成两部分)后由于丧 失了近似天然的折叠结构，因而导致变应原几乎完全丧失其IgE结 合能力和变应原活性(Bet v1，Vrtala等人，J.Clin.Invest.99(1997)， 1673-1681；Bet v4，Twardosz等人，BBRC239(1997)，197-204； Aln g4，Hayek等人，J.Immunol.161(1998)，7031-7039；牛毛发 皮屑变态反应变应原，Zeiler等人，J.Allergy Clin.Immunol.100 (1997)，721-727；Lep d2，Elfman，Int.Arch.Allergy Immunol.117 (1998)，167-173；Phlp7，Westritschnig，J.Immunol.172(2004)， 5684-5692))。将主要含有不连续或构象IgE表位的蛋白质分段导致 变应原的IgE结合能力实质上地下降。基于这一知识，在在先技术 中研究了这种低变应原性变应原片段能否在体外诱导保护性免疫 应答(Westritschnig等人，(Curr.Opinion in Allergy and Clin.Immunol. 3(2003，495-500))。
Ball等人的文献(Eur J Immunol 1999，29：2026-2036)描述了 在免疫治疗过程中使用氢氧化铝吸附的牧草花粉提取物给药。
专利US 2002/0052490 A1公开了编码包含至少一种Phl p1表 位的多肽的重组DNA分子。
Flicker S等人的文章(J Allergy Clin Immunol 2006，117：1336- 1343)公开了Phl p1变应原的C末端包含整个Phl p1分子的绝大 部分变应原潜力。
Linhart B等人的文章(FASEB J 2002，16：1301-1303)描述了 包含几种猫尾草变应原的杂合分子的制备。
专利DE 103 51 471 A1涉及由变应原的几种免疫显性T细胞表 位构成的不会发生交叉反应的杂合多肽。
发明内容
本发明的目标是提供基于上面提到的知识的改进变态反应免 疫治疗的手段和方法。这种方法和手段应该是有效、过敏性休克的 风险低、易于应用、可调整以满足个体患者的需要和易于转化为工 业化规模。
因此，本发明涉及与野生型变应原相比变应原活性下降的野生 型蛋白质变应原Phl p1(主要猫尾草花粉变应原)衍生物的制备方 法，该方法包括以下步骤：
-产生野生型蛋白质变应原Phl p1，
-将所述野生型蛋白质变应原至少分成三个片段，其中所述至少 三个片段中至少有一个片段包含至少一个T细胞表位，并且所述至 少三个片段的变应原活性下降或者缺乏变应原活性，和
-以区别于野生型变应原中片段顺序的顺序重新连接所述至少 三个片段。
当变应原与肥大细胞上预形成的结合在高亲和力受体FcεRI上 的IgE发生交联时，就激发了变态反应。肥大细胞排列在身体表面 并能提醒免疫系统预防局部感染。一旦激活，肥大细胞通过分泌贮 存在预形成囊泡中的化学介质并通过激活后合成白细胞介素和细 胞因子诱导免疫应答。因此，野生型变应原由于其引发的副作用用 于预防、治疗或致敏患有变态反应的个体或存在患变态反应风险的 个体的给药是不利的。避免免疫治疗中的变态反应的途径是修饰野 生型变应原以使所述修饰后的“变应原”与IgE结合的数量减少或 不再结合IgE。因此这些分子无法激发强烈的变态反应。然而，应 该注意的是，某些变应原片段的免疫原性不足以诱导产生保护性抗 体应答(Westritschnig等人，(2004))。
根据本发明的方法可以制备出与IgE的结合能力下降或缺失但 同时保留了那些对于变应原诱导T细胞介导的免疫应答是必需的 特征的变应原衍生物。用根据本发明的方法可达到上述目的，因为 上述负责诱导T细胞介导的免疫应答的结构性要素，例如野生型变 应原上的T细胞表位，在根据本发明的变应原衍生物中实质上仍然 保留。然而，变应原片段的转换(分段和再连接)将导致IgE结合 能力的显著下降或者甚至是所述结合能力的完全丧失。当然，如果 在变应原衍生物的产生过程中仅有一些氨基酸残基丢失(删除)或 添加(插入)，或如果各个部分通过接头连接而不是直接连接，那 么根据本发明的优势仍然存在。变应原活性的下降或消失可通过将 变应原分成特定片段的已知和一般原理而实现。
根据本发明的变应原衍生物优选重组制备。当然，也可能化学 合成单一变应原片段然后将它们连接起来。
根据本发明的优选具体实施方式，测定变应原活性下降是根据 与野生型变应原相比，变应原的IgE结合能力下降至少10％，优选 至少20％，更优选至少30％，尤其是至少50％。
测定变应原活性下降优选根据变应原敏感的患者血清中的IgE 抗体不能结合到所述衍生物的斑点印迹上或根据嗜碱性粒细胞释 放试验。
评价变应原活性的常规体外试验包括RAST(Sampson和 Albergo，J.Allergy Clin.Immunol.74：26，1984)，ELISAs(Burks等 人，N.Engl.J.Med.314：560，1986)，免疫印迹(Burks等人，J. Allergy Clin.Immunol.81：1135，1988))，嗜碱性粒细胞组胺释放试 验(Nielsen，Dan.Med.Bull.42：455，1995和du Buske，Allergy Proc. 14：243，1993)和其他试验(Hoffmann等人，Allergy 54：446，1999)。
根据本发明的优选具体实施方式，至少三个片段包含Phl p1 的氨基酸残基25至39、氨基酸残基34至45、氨基酸残基73至84、 氨基酸残基91至102、氨基酸残基100至111、氨基酸残基109至 133、氨基酸残基121至135、氨基酸残基127至138、氨基酸残基 157至168、氨基酸残基169至183和/或氨基酸残基226至240。
在根据本发明的方法中使用的该至少三个片段可包含至少一 个上述鉴定了的T细胞表位(见如Schenk S，等人J Allergy Clin Immunol.(1995)96：986-996)。
根据本发明的另一优选具体实施方式，至少三个片段选自Phl p 1的氨基酸残基1至64(A)、氨基酸残基65至125(B)、氨基酸 残基126至205(C)或氨基酸残基206到240(D)。
选择本发明的片段是为了破坏IgE结合表位或B细胞表位和保 留可诱导对所述表位产生适当免疫应答的T细胞表位。野生型变应 原Phl p1中天然存在的B细胞表位的破坏或减少可使得所述衍生 物在为个体患者给药时主要激发T细胞介导应答而不诱导变态反应 (与结合到介质释放细胞上的IgE完全不结合或结合减少)。
变应原衍生物中所述片段的顺序是B-D-A-C。
如果获得的变应原衍生物与野生型变应原相比表现出下降的 变应原活性，当然也有可能用另一种方式(D-B-A-C、B-A-D-C等) 排列所述片段。
根据本发明获得的衍生物可易于与药学上可接受的赋形剂联 合并制成药物制品。
优选地，衍生物与适合的疫苗佐剂联合并制成药学上可接受的 疫苗制品。
根据优选具体实施方式，根据本发明的衍生物与进一步变应原 联合制成联合疫苗。这些变应原优选是野生型变应原，尤其是野生 型变应原的混合物、重组野生型变应原、野生型蛋白质变应原衍生 物或它们的混合物。这种混合物可应某个患者的需要(变应原谱) 而特制。
在优选具体实施方式中，这种药物制品进一步包含变应原提取 物。
根据本发明的另一优选具体实施方式，所述进一步变应原选自 主要桦树花粉变应原，尤其是Bet v1和Bet v4，主要猫尾草花粉 变应原，尤其是Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7，主要屋尘 螨变应原，尤其是Der p1和Der p2，主要猫变应原Fel d1，主要 蜜蜂变应原，主要黄蜂变应原，肌动蛋白抑制蛋白，尤其是Phl p12 或储存尘螨变应原，尤其是Lep d2。
根据本发明的医药和疫苗制品可包含仅次于Phl p1衍生物的 其它变应原或其衍生物和片段，变应原提取物等。
本发明的另一方面涉及可通过本发明的方法获得的变应原衍 生物。
本发明的另一方面涉及野生型蛋白质变应原Phl p1的变应原 衍生物，其特征在于所述衍生物包含至少三个以区别于野生型变应 原中片段顺序的顺序彼此融合的所述野生型蛋白质变应原片段，其 中所述至少三个野生型变应原片段表现出变应原活性下降或缺乏 变应原活性并且其中所述至少三个片段中至少有一个片段包含一 个或多个T细胞表位。
根据本发明的优选具体实施方式，所述至少三个变应原片段包 含至少六个氨基酸残基，优选至少10个氨基酸残基，尤其是至少 15个氨基酸残基。
该至少三个片段优选包含Phl p1的氨基酸残基25至39、氨基 酸残基34至45、氨基酸残基73至84、氨基酸残基91至102、氨 基酸残基100至111、氨基酸残基109至133、氨基酸残基121至 135、氨基酸残基127至138、氨基酸残基157至168、氨基酸残基 169至183和氨基酸残基226至240。
根据本发明的另一优选具体实施方式，该至少三个片段选自 Phl p1的氨基酸残基1至64(A)、氨基酸残基65至125(B)、氨 基酸残基126至205(C)或氨基酸残基206至240(D)。
变应原衍生物中所述片段的顺序优选是B-D-A-C。
本发明的变应原衍生物也可用于检测和诊断对Phl p1的敏感 性。例如，在体外，在适合血液成分(例如抗体、T细胞和B细胞) 与该衍生物结合和适合确定该结合达到的程度的条件下，将具有 Phl p1活性的多肽与从进行敏感性评价的客体获得的血液或血液 制品联合，可对Phl p1的敏感性进行检测或诊断。可使用本发明的 衍生物的过敏性疾病的其它诊断方法包括放射性变应性吸附试验 (RAST)、试纸放射免疫吸附试验(PRIST)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、放射性免疫测定试验(RIA)、免疫放射测定试验 (IRMA)、荧光免疫试验(LIA)、组氨酸释放试验和IgE免疫印迹 试验。
本发明的另一发面涉及包含根据本发明的变应原衍生物(见 上)和进一步变应原的变应原组合物，进一步变应原优选野生型变 应原、尤其是野生型变应原的混合物、重组野生型变应原、野生型 蛋白质变应原衍生物或它们的混合物。
所述组合物优选进一步包含变应原提取物。
根据本发明的优选具体实施方式，变应原组合物包含药学上可 接受的赋形剂。
根据本发明另一优选具体实施方式，所述组合物进一步包含一 种或多种选自主要桦树花粉变应原，尤其是Bet v1和Bet v4，主 要猫尾草花粉变应原，尤其是Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7， 主要屋尘螨变应原，尤其是Der p1和Der p2，主要猫变应原，尤 其是Fel d1，主要蜜蜂变应原，主要黄蜂变应原，肌动蛋白抑制蛋 白，尤其是Phl p12或储存尘螨变应原，尤其是Lep d2。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物或变应原 组合物用于制备变应原特异性免疫治疗药剂的用途。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物或变应原 组合物用于制备主动免疫接种药剂的用途。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物或变应原 组合物用于制备预防免疫接种药剂的用途。
所述药剂优选进一步包含佐剂、稀释剂、防腐剂或它们的混合 物。
根据本发明的优选具体实施方式，药剂包含所述重组变应原衍 生物10ng至1g，优选100ng至10mg，尤其0，5μg至200μg。优 选给药方式包括一般疫苗接种和特定变态反应免疫治疗的疫苗接 种所描述和建议的所有标准给药体系(口服给药、经皮给药、静脉 给药、鼻内给药和经粘膜给药等)。本发明包括通过给予有效剂量 的根据本发明的医药制剂治疗和预防变态反应的方法。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物的制备方 法，其特征在于通过以下步骤：
-产生编码根据本发明的变应原衍生物的DNA分子，
-用所述DNA分子转化宿主细胞，和
-在所述宿主细胞内表达所述衍生物和分离所述衍生物。
根据本发明的优选具体实施方式，所述宿主是真核细胞，优选 是酵母或植物细胞，或原核细胞，优选是大肠杆菌。
优选地，所述宿主是具有高表达能力的宿主。正如此处所用的， “具有高表达能力的宿主”是该宿主目的蛋白质的表达量至少是1 mg/l培养物，优选至少5mg/l，更优选至少10mg/l，最优选至少20 mg/l。当然，表达能力还依赖于选定的宿主和表达系统(如载体)。 根据本发明的优选宿主是大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母、枯草杆菌、 pant细胞(例如衍生形成烟草细胞)等。
当然，根据本发明的变应原衍生物也可通过任何其它适合的方 法制备，尤其是化学合成或半化学合成的方法。
附图说明
通过下列附图和实施例进一步解释本发明，然而并不限于此。
图1A显示根据本发明的低变应原性Phl p1衍生物的构建。
图1B显示根据本发明的Phl p1嵌合体蛋白质的氨基酸序列(序 列号NO：1)。
图2A显示HSA纯化到90％纯度以上的Plm的考马斯染色的 烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
图2B显示Plm的质谱分析。在电离飞行时间压缩基质辅助激 光解析II质谱仪(TOF Compact MALDI II)(Kratos，UK)(piCHEM， Austria)上采用线性模式进行激光解吸质谱。
图2C显示Plm的圆二色性(CD)分析。室温，Plm蛋白质终 浓度是46μM，重组Phlp1蛋白质终浓度是12μM，分别用0.001cm 和0.05cm径长的石英杯，在Jasco J-810型分光旋光计(Jasco，Easton， MD)上收集远紫外圆二色性光谱。记录三次独立测量结果和平均 每个光谱点。通过减去在同一条件下获得的相应缓冲液的光谱对最 终光谱进行基线校正。结果用在给定波长的平均残基椭圆率[θ]表 示。
图3显示IgE结合到膜结合的重组变应原rPhl p1、Plm和HSA 上。49名牧草花粉过敏患者的血清和一份非特应性供体血清(n＝50) 与膜结合的重组变应原rPhl p1、Plm和HSA孵育。用125I标记的 抗人IgE抗体测定结合型IgE。
图4显示将五名Phl p1过敏个体的样品与rPhl p1和Plm接触 时CD203c表达的比较。
图5显示小鼠接种rPhl p1和Plm诱导IgG1应答。
因此，本发明涉及与野生型变应原相比变应原活性下降的野生 型蛋白质变应原Phl p1(主要猫尾草花粉变应原)衍生物的制备方 法，该方法包括以下步骤：
-产生野生型蛋白质变应原Phl p1，
-将所述野生型蛋白质变应原至少分成三个片段，其中所述至少 三个片段中至少有一个片段包含至少一个T细胞表位，并且所述至 少三个片段的变应原活性下降或者缺乏变应原活性，和
-以区别于野生型变应原中片段顺序的顺序重新连接所述至少 三个片段。
当变应原与肥大细胞上预形成的结合在高亲和力受体FcεRI上 的IgE发生交联时，就激发了变态反应。肥大细胞排列在身体表面 并能提醒免疫系统预防局部感染。一旦激活，肥大细胞通过分泌贮 存在预形成囊泡中的化学介质并通过激活后合成白细胞介素和细 胞因子诱导免疫应答。因此，野生型变应原由于其引发的副作用用 于预防、治疗或致敏患有变态反应的个体或存在患变态反应风险的 个体的给药是不利的。避免免疫治疗中的变态反应的途径是修饰野 生型变应原以使所述修饰后的“变应原”与IgE结合的数量减少或 不再结合IgE。因此这些分子无法激发强烈的变态反应。然而，应 该注意的是，某些变应原片段的免疫原性不足以诱导产生保护性抗 体应答(Westritschnig等人，(2004))。
根据本发明的方法可以制备出与IgE的结合能力下降或缺失但 同时保留了那些对于变应原诱导T细胞介导的免疫应答是必需的 特征的变应原衍生物。用根据本发明的方法可达到上述目的，因为 上述负责诱导T细胞介导的免疫应答的结构性要素，例如野生型变 应原上的T细胞表位，在根据本发明的变应原衍生物中实质上仍然 保留。然而，变应原片段的转换(分段和再连接)将导致IgE结合 能力的显著下降或者甚至是所述结合能力的完全丧失。当然，如果 在变应原衍生物的产生过程中仅有一些氨基酸残基丢失(删除)或 添加(插入)，或如果各个部分通过接头连接而不是直接连接，那 么根据本发明的优势仍然存在。变应原活性的下降或消失可通过将 变应原分成特定片段的已知和一般原理而实现。
根据本发明的变应原衍生物优选重组制备。当然，也可能化学 合成单一变应原片段然后将它们连接起来。
根据本发明的优选具体实施方式，测定变应原活性下降是根据 与野生型变应原相比，变应原的IgE结合能力下降至少10％，优选 至少20％，更优选至少30％，尤其是至少50％。
测定变应原活性下降优选根据变应原敏感的患者血清中的IgE 抗体不能结合到所述衍生物的斑点印迹上或根据嗜碱性粒细胞释 放试验。
评价变应原活性的常规体外试验包括RAST(Sampson和 Albergo，J.Allergy Clin.Immunol.74：26，1984)，ELISAs(Burks等 人，N.Engl.J.Med.314：560，1986)，免疫印迹(Burks等人，J. Allergy Clin.Immunol.81：1135，1988))，嗜碱性粒细胞组胺释放试 验(Nielsen，Dan.Med.Bull.42：455，1995和du Buske，Allergy Proc. 14：243，1993)和其他试验(Hoffmann等人，Allergy 54：446，1999)。
根据本发明的优选具体实施方式，至少三个片段包含Phl p1 的氨基酸残基25至39、氨基酸残基34至45、氨基酸残基73至84、 氨基酸残基91至102、氨基酸残基100至111、氨基酸残基109至 133、氨基酸残基121至135、氨基酸残基127至138、氨基酸残基 157至168、氨基酸残基169至183和/或氨基酸残基226至240。
在根据本发明的方法中使用的该至少三个片段可包含至少一 个上述鉴定了的T细胞表位(见如Schenk S，等人J Allergy Clin Immunol.(1995)96：986-996)。
根据本发明的另一优选具体实施方式，至少三个片段选自Phl p 1的氨基酸残基1至64(A)、氨基酸残基65至125(B)、氨基酸 残基126至205(C)或氨基酸残基206到240(D)。
选择本发明的片段是为了破坏IgE结合表位或B细胞表位和保 留可诱导对所述表位产生适当免疫应答的T细胞表位。野生型变应 原Phl p1中天然存在的B细胞表位的破坏或减少可使得所述衍生 物在为个体患者给药时主要激发T细胞介导应答而不诱导变态反应 (与结合到介质释放细胞上的IgE完全不结合或结合减少)。
变应原衍生物中所述片段的顺序是B-D-A-C。
如果获得的变应原衍生物与野生型变应原相比表现出下降的 变应原活性，当然也有可能用另一种方式(D-B-A-C、B-A-D-C等) 排列所述片段。
根据本发明获得的衍生物可易于与药学上可接受的赋形剂联 合并制成药物制品。
优选地，衍生物与适合的疫苗佐剂联合并制成药学上可接受的 疫苗制品。
根据优选具体实施方式，根据本发明的衍生物与进一步变应原 联合制成联合疫苗。这些变应原优选是野生型变应原，尤其是野生 型变应原的混合物、重组野生型变应原、野生型蛋白质变应原衍生 物或它们的混合物。这种混合物可应某个患者的需要(变应原谱) 而特制。
在优选具体实施方式中，这种药物制品进一步包含变应原提取 物。
根据本发明的另一优选具体实施方式，所述进一步变应原选自 主要桦树花粉变应原，尤其是Bet v1和Bet v4，主要猫尾草花粉 变应原，尤其是Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7，主要屋尘 螨变应原，尤其是Der p1和Der p2，主要猫变应原Fel d1，主要 蜜蜂变应原，主要黄蜂变应原，肌动蛋白抑制蛋白，尤其是Phl p12 或储存尘螨变应原，尤其是Lep d2。
根据本发明的医药和疫苗制品可包含仅次于Phl p1衍生物的 其它变应原或其衍生物和片段，变应原提取物等。
本发明的另一方面涉及可通过本发明的方法获得的变应原衍 生物。
本发明的另一方面涉及野生型蛋白质变应原Phl p1的变应原 衍生物，其特征在于所述衍生物包含至少三个以区别于野生型变应 原中片段顺序的顺序彼此融合的所述野生型蛋白质变应原片段，其 中所述至少三个野生型变应原片段表现出变应原活性下降或缺乏 变应原活性并且其中所述至少三个片段中至少有一个片段包含一 个或多个T细胞表位。
根据本发明的优选具体实施方式，所述至少三个变应原片段包 含至少六个氨基酸残基，优选至少10个氨基酸残基，尤其是至少 15个氨基酸残基。
该至少三个片段优选包含Phl p1的氨基酸残基25至39、氨基 酸残基34至45、氨基酸残基73至84、氨基酸残基91至102、氨 基酸残基100至111、氨基酸残基109至133、氨基酸残基121至 135、氨基酸残基127至138、氨基酸残基157至168、氨基酸残基 169至183和氨基酸残基226至240。
根据本发明的另一优选具体实施方式，该至少三个片段选自 Phl p1的氨基酸残基1至64(A)、氨基酸残基65至125(B)、氨 基酸残基126至205(C)或氨基酸残基206至240(D)。
变应原衍生物中所述片段的顺序优选是B-D-A-C。
本发明的变应原衍生物也可用于检测和诊断对Phl p1的敏感 性。例如，在体外，在适合血液成分(例如抗体、T细胞和B细胞) 与该衍生物结合和适合确定该结合达到的程度的条件下，将具有 Phl p1活性的多肽与从进行敏感性评价的客体获得的血液或血液 制品联合，可对Phl p1的敏感性进行检测或诊断。可使用本发明的 衍生物的过敏性疾病的其它诊断方法包括放射性变应性吸附试验 (RAST)、试纸放射免疫吸附试验(PRIST)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、放射性免疫测定试验(RIA)、免疫放射测定试验 (IRMA)、荧光免疫试验(LIA)、组氨酸释放试验和IgE免疫印迹 试验。
本发明的另一发面涉及包含根据本发明的变应原衍生物(见 上)和进一步变应原的变应原组合物，进一步变应原优选野生型变 应原、尤其是野生型变应原的混合物、重组野生型变应原、野生型 蛋白质变应原衍生物或它们的混合物。
所述组合物优选进一步包含变应原提取物。
根据本发明的优选具体实施方式，变应原组合物包含药学上可 接受的赋形剂。
根据本发明另一优选具体实施方式，所述组合物进一步包含一 种或多种选自主要桦树花粉变应原，尤其是Bet v1和Bet v4，主 要猫尾草花粉变应原，尤其是Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7， 主要屋尘螨变应原，尤其是Der p1和Der p2，主要猫变应原，尤 其是Fel d1，主要蜜蜂变应原，主要黄蜂变应原，肌动蛋白抑制蛋 白，尤其是Phl p12或储存尘螨变应原，尤其是Lep d2。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物或变应原 组合物用于制备变应原特异性免疫治疗药剂的用途。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物或变应原 组合物用于制备主动免疫接种药剂的用途。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物或变应原 组合物用于制备预防免疫接种药剂的用途。
所述药剂优选进一步包含佐剂、稀释剂、防腐剂或它们的混合 物。
根据本发明的优选具体实施方式，药剂包含所述重组变应原衍 生物10ng至1g，优选100ng至10mg，尤其0，5μg至200μg。优 选给药方式包括一般疫苗接种和特定变态反应免疫治疗的疫苗接 种所描述和建议的所有标准给药体系(口服给药、经皮给药、静脉 给药、鼻内给药和经粘膜给药等)。本发明包括通过给予有效剂量 的根据本发明的医药制剂治疗和预防变态反应的方法。
本发明的另一方面涉及根据本发明的变应原衍生物的制备方 法，其特征在于通过以下步骤：
-产生编码根据本发明的变应原衍生物的DNA分子，
-用所述DNA分子转化宿主细胞，和
-在所述宿主细胞内表达所述衍生物和分离所述衍生物。
根据本发明的优选具体实施方式，所述宿主是真核细胞，优选 是酵母或植物细胞，或原核细胞，优选是大肠杆菌。
优选地，所述宿主是具有高表达能力的宿主。正如此处所用的， “具有高表达能力的宿主”是该宿主目的蛋白质的表达量至少是1 mg/l培养物，优选至少5mg/l，更优选至少10mg/l，最优选至少20 mg/l。当然，表达能力还依赖于选定的宿主和表达系统(如载体)。 根据本发明的优选宿主是大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母、枯草杆菌、 pant细胞(例如衍生形成烟草细胞)等。
当然，根据本发明的变应原衍生物也可通过任何其它适合的方 法制备，尤其是化学合成或半化学合成的方法。
附图说明
通过下列附图和实施例进一步解释本发明，然而并不限于此。
图1A显示根据本发明的低变应原性Phl p1衍生物的构建。
图1B显示根据本发明的Phl p1嵌合体蛋白质的氨基酸序列(序 列号NO：1)。
图2A显示HSA纯化到90％纯度以上的Plm的考马斯染色的 烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
图2B显示Plm的质谱分析。在电离飞行时间压缩基质辅助激 光解析II质谱仪(TOF Compact MALDI II)(Kratos，UK)(piCHEM， Austria)上采用线性模式进行激光解吸质谱。
图2C显示Plm的圆二色性(CD)分析。室温，Plm蛋白质终 浓度是46μM，重组Phlp1蛋白质终浓度是12μM，分别用0.001cm 和0.05cm径长的石英杯，在Jasco J-810型分光旋光计(Jasco，Easton， MD)上收集远紫外圆二色性光谱。记录三次独立测量结果和平均 每个光谱点。通过减去在同一条件下获得的相应缓冲液的光谱对最 终光谱进行基线校正。结果用在给定波长的平均残基椭圆率[θ]表 示。
图3显示IgE结合到膜结合的重组变应原rPhl p1、Plm和HSA 上。49名牧草花粉过敏患者的血清和一份非特应性供体血清(n＝50) 与膜结合的重组变应原rPhl p1、Plm和HSA孵育。用125I标记的 抗人IgE抗体测定结合型IgE。
图4显示将五名Phl p1过敏个体的样品与rPhl p1和Plm接触 时CD203c表达的比较。
图5显示小鼠接种rPhl p1和Plm诱导IgG1应答。
具体实施方式
实施例：低变应原性Phl p1嵌合体(Plm)蛋白质的鉴定
实施例1：低变应原性Phl p1嵌合体(Plm)蛋白质的构建
为构建重组低变应原性Phl p1嵌合体，扩增编码四种Phl p1 片段的cDNA。片段A(氨基酸1-64)、B(氨基酸65-125)、C(氨 基酸126-205)和D(氨基酸206-240)见图1A。按B-D-A-C的顺 序根据“基因重叠延伸拼接法”(Horton等人，1999)组装所述cDNA 片段。在第一次PCR反应中获得片段A的cDNA(引物AF：5’ATC CCC AAG GTT CCC 3’和AR：5’CAG CTC GCC GGC GCT CTT GAA GAT GGG 3’)、片段B的cDNA(引物BF：5’C TCC TCC CAT ATG TCC GGA CGC GGC 3’和BR：5’GGT GAA GGG GCC CGT GCG CAG CTT CTG 3’)、片段C的cDNA(引物CF：5’AGC GCC GGC GAG CTG 3’和CR：5’C GGG ATC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGC GGC GAG CTT GTC GGG AGT GTC 3’)和片段D 的cDNA(引物DF：5’ACG GGC CCC TTC ACC 3’和DR：5’GGG AAC CTT GGG GAT CTT GGA CTC GTA 3’)。在接下来的第一次重 叠延伸拼接反应中，用凝胶纯化的PCR产物作为模板以获得编码 片段BD(用引物BF和DR)和AC(用引物A F和CR)的cDNA。 在后续第二次重叠延伸拼接反应中，用凝胶纯化的片段BD和AC 作为模板，用引物BF和CR以获得编码BDAC的PCR产物(概图 见图1A)。
将所得编码BDAC的cDNA构建体插入质粒pET17b(Novagen， Madison，WI)的NdeI/BamHI限制性酶切位点中。在BDAC构建体 的C末端的两个甘氨酸后面是使嵌合体蛋白质能通过Ni2+亲合色谱 法纯化的六组氨酸标签(图1B)。测序确定编码Phl p1嵌合体(Plm) 的cDNA的正确序列。
所得分子保留完整的基本序列(Laffer等人，1994)和T细胞 表位(Schenk等人，1995)。
实施例2：Plm的生物化学鉴定
Plm的表达和纯化
Plm构建体转化入大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene， Australia)并在添加100mg/l氨苄青霉素的LB培养基中表达。转 化细胞在37℃生长到OD600＝0.9时添加1mM异丙基-β-硫代半乳糖 苷(IPTG)诱导重组Plm的表达。在相同条件下继续孵育4小时， 之后离心收获细胞。变性条件下从不溶的片状沉淀物中纯化重组 Plm。在8M尿素、100mM NaH2PO4，10mM Tris，pH8.0条件下震 荡混合60分钟使细胞裂解。14,000×g离心30分钟后，将上清液 加入到Ni-NTA柱中。重组Plm在8M尿素、100mM NaH2PO4、 10mM Tris、pH4.5条件下洗脱并通过梯度透析复性，每个梯度至 少4小时，透析液为100mM NaH2PO4、10mM Tris、pH8.0，分别 含6、4、3、2、1和0.5M尿素。蛋白质最终在10mM Tris、100mM NaCl和pH8.0条件下被透析出来并用Amicon centricon YM.-3浓 缩器浓缩。
通过烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白 质得到纯化。纯化了的样品的蛋白质浓度通过在280nm处的紫外 线吸光度来估计。蛋白质的摩尔吸光系数通过其酪氨酸和色氨酸含 量而计算(Gill等人，1989)。
Plm显示出可与重组Phl p1相比的迁移模式(见图2A)，该迁 移模式与根据蛋白质推断出的氨基酸序列计算出的分子量一致。
Plm的分子量通过质谱确定是27 082道尔顿，与该蛋白质的预 测分子量一致(见图2B)。
纯化了的Plm通过圆二色性分析法分析并与重组Phlp1比较 以确定它们的二级结构内容(见图2C)。意料之外的是，Plm是在 207和215nm处具有最小值，在195nm处具有最大值的折叠分子， 提示了有大量β二级结构的存在。Plm，代表人工变应原蛋白质， 表现出区别于在杆状病毒感染的昆虫细胞内表达的折叠重组Phlp 1的CD光谱(Ball等人)。作为对比，大肠杆菌表达的重组Phl p1 表现出非折叠蛋白质的光谱，事实最近被描述(Ball等人，2005) 实施例3：Plm的IgE结合能力下降
Plm的IgE反应性在抗原过剩的条件下通过斑点实验确定并与 rPhl p1比较(Niederberger等人，1998)。将3μg纯化重组蛋白质点 到硝酸纤维素试纸条上并与49名Phl p1过敏患者的血清孵育。结 合型IgE抗体用125I标记的抗人IgE抗体检测并用γ计数法定量 (Wallac，Finland)(Ball等人，1999)。
在非变性条件下确定的Plm的IgE反应性与rPhl p1的IgE结 合能力相比明显下降(图3)。与rPhl p1(表1)相比，将Plm结 合的IgE抗体定量，显示出平均有86.5％的Plm IgE结合能力下降。
图3显示IgE结合到膜结合型重组变应原rPhl p1、Plm和HSA 上。49名牧草花粉过敏患者的血清和一份非特应性的供体(n＝50) 血清与膜结合型重组变应原rPhl p1、Plm和HSA孵育。结合型IgE 用125I标记的抗人IgE抗体检测。
表1rPhl p1和Plm的血清IgE反应性。将点上去的蛋白质与 29名牧草花粉过敏患者的血清相接触。结合型IgE抗体用125I标记 的抗人IgE抗体检测并用γ计数法定量。
实施例4：Plm表现出变应原活性下降
通过CD203c的表达测定嗜碱性粒细胞的激活
在给予知情同意书后，采集5名过敏症供体的外周血。用肝 素化试管收集血液。等量血液(100μl)与Plm和rPhl p1(10-3至 10μg/ml)系列稀释液、抗IgE抗体(1μg/ml)(Immunotech，Marseille， France)或缓冲液(磷酸盐缓冲液PBS)在37℃孵育15分钟。孵 育结束后，用含20mM EDTA的PBS冲洗细胞。然后将细胞与10μl 结合PE的CD203c单抗(mAb)97A6(Immunotech，Marseille， France)在室温(RT)孵育15分钟。此后，样品用2ml FACSTM裂 解液(Becton Dickinson，San Jose，CA)裂解红细胞。用PBS冲洗并 使细胞在PBS中重新悬浮并在FACScan仪(Becton Dickinson)上 用Paint-a-Gate软件通过双色流式细胞计数法对细胞进行分析。变 应原诱导的CD203c的上调通过计算刺激细胞的平均荧光强度(MFI 刺激细胞)和未刺激细胞的平均荧光强度(MFI未刺激细胞)而得到，并用 刺激指数(MFI刺激细胞：MFI未刺激细胞)表示。
Plm的变应原活性通过测定5名Phl p1过敏患者血嗜碱性粒细 胞CD203c的表达来分析。正如图4所描述的那样，与蛋白质浓度 为1μg/ml的rPhl p1孵育后，CD203c的表达显著上调(p<0.05)， 而与Plm孵育的则无CD203c的诱导表达。只有当Plm的浓度增加 到10μg/ml时，CD203c的表达才上调。因此，与Plm相比，Phl p1 表现出10倍于Plm的变应原活性。
实施例5：免疫接种Plm诱导产生的IgG抗体抑制患者的IgE 与rPhl p1的结合
家兔的免疫接种
用CFA为家兔首次接种200μg的Plm和rPhl p1，并用IFA加 强注射100μg免疫源(4周后第一次加强注射；7周后用不完全佐 剂第二次加强注射)(Charles River Breeding Laboratories，Kisslegg， Germany)。第一次免疫接种后8周，家兔被放血。
Plm诱导的IgG抑制过敏患者的IgE与rPhl p1的结合
Plm和rPhl p1诱导的家兔IgG抑制过敏患者的IgE与rPhl p1 的结合用ELISA竞争试验法(Focke等人，2001)检测。ELISA平 皿(Nunc Maxisorp，Denmark)用1μg/ml rPhl p1包被并与100倍 稀释的rPhl p1和Plm抗血清预孵育，并与相应免疫前血清预孵育 作为对照。冲洗后，将平皿与10倍稀释的43名Phl p1致敏的牧草 花粉过敏患者的血清孵育。用稀释了2500倍的HRP-偶联的山羊抗 人IgE抗体(KPL，Gaithersburg，MD)检测结合型IgE抗体。与抗 Phl p1和抗Plm抗血清预孵育达到的抑制IgE结合的百分数计算如 下：抑制IgE结合的百分数＝100—ODI/ODP×100。ODI和ODP代表 分别与家兔的免疫血清和相应免疫前血清预孵育的吸光度。
表2中Plm抑制患者IgE与rPhl p1结合的能力用下降百分比 表示。用抗Plm抗体可达到的对患者IgE与rPhl p1结合的最强抑 制程度的变化范围是0至89％(平均下降52％)而用抗Phl p1 抗体达到的抑制程度的变化范围是4至75％(平均43％)。
表2。家兔抗rPhl p1和Plm抗血清抑制牧草花粉过敏患者IgE 与rPhl p1结合。结合rPhl p1和Plm的ELISA平皿与家兔抗rPhl p1和抗Plm抗血清预孵育。43名牧草花粉过敏患者的IgE结合下 降百分数列于此表。
Plm诱导的家兔IgG使IgE与rPhl p1结合下降％
实施例6：Plm的免疫源性
为研究Phl p1嵌合体蛋白质在体内能否诱导变应原特异性IgG 应答，皮下免疫接种6周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Breeding Laboratories)。5只小鼠一组免疫接种5μg Plm、rPhl p1和作为对 照的吸附到Al(OH)3(Alu-Gel-S，Serva，Germany)(Vrtala等人， 1998)上的PBS。小鼠被免疫接种三次(第1天、第28天和第56 天)，每间隔4周从尾静脉抽血并将血清存放在-20℃直到被分析。
IgG1对rPhl p1的应答通过ELISA(Vrtala等人，1998)测定。 ELISA平皿(NuncMaxisorp，Denmark)用5μgPlm包被并与1000 倍稀释的小鼠血清孵育。结合型IgG1抗体用1000倍稀释的单克隆 大鼠抗小鼠IgG1(Pharmingen，CA)和200倍稀释的HRP标记的 绵羊抗大鼠抗血清(Amersham，UK)检测。
正如图5所证明的那样，Plm诱导的IgG1对rPhl p1的应答与 免疫接种rPhl p1诱导的应答强度几乎相等。
图5。Plm的免疫原性。用PBS、rPhl p1或Plm(x轴)免疫 接种5只小鼠，接种后4、8周或12周IgG1应答的平均值(以OD 值表示，y轴)。
参考文献
Ball，T.，et al.(2005)FEBS J.272：217-227.
Ball，T.，et al.(1999)FASEB J.13：1277.
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序列表
<110>AG·比奥维
KG·阿勒戈法曼·约阿希姆·甘泽尔
<120>变应原衍生物
<130>R 49993
<150>A755/2006，AT
<151>2006-05-03
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
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<223>Phl p1嵌合体蛋白质
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实施例1：低变应原性Phl p1嵌合体(Plm)蛋白质的构建
为构建重组低变应原性Phl p1嵌合体，扩增编码四种Phl p1 片段的cDNA。片段A(氨基酸1-64)、B(氨基酸65-125)、C(氨 基酸126-205)和D(氨基酸206-240)见图1A。按B-D-A-C的顺 序根据“基因重叠延伸拼接法”(Horton等人，1999)组装所述cDNA 片段。在第一次PCR反应中获得片段A的cDNA(引物AF：5’ATC CCC AAG GTT CCC 3’和AR：5’CAG CTC GCC GGC GCT CTT GAA GAT GGG 3’)、片段B的cDNA(引物BF：5’C TCC TCC CAT ATG TCC GGA CGC GGC 3’和BR：5’GGT GAA GGG GCC CGT GCG CAG CTT CTG 3’)、片段C的cDNA(引物CF：5’AGC GCC GGC GAG CTG 3’和CR：5’C GGG ATC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGC GGC GAG CTT GTC GGG AGT GTC 3’)和片段D 的cDNA(引物DF：5’ACG GGC CCC TTC ACC 3’和DR：5’GGG AAC CTT GGG GAT CTT GGA CTC GTA 3’)。在接下来的第一次重 叠延伸拼接反应中，用凝胶纯化的PCR产物作为模板以获得编码 片段BD(用引物BF和DR)和AC(用引物A F和CR)的cDNA。 在后续第二次重叠延伸拼接反应中，用凝胶纯化的片段BD和AC 作为模板，用引物BF和CR以获得编码BDAC的PCR产物(概图 见图1A)。
将所得编码BDAC的cDNA构建体插入质粒pET17b(Novagen， Madison，WI)的NdeI/BamHI限制性酶切位点中。在BDAC构建体 的C末端的两个甘氨酸后面是使嵌合体蛋白质能通过Ni2+亲合色谱 法纯化的六组氨酸标签(图1B)。测序确定编码Phl p1嵌合体(Plm) 的cDNA的正确序列。
所得分子保留完整的基本序列(Laffer等人，1994)和T细胞 表位(Schenk等人，1995)。
实施例2：Plm的生物化学鉴定
Plm的表达和纯化
Plm构建体转化入大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene， Australia)并在添加100mg/l氨苄青霉素的LB培养基中表达。转 化细胞在37℃生长到OD600＝0.9时添加1mM异丙基-β-硫代半乳糖 苷(IPTG)诱导重组Plm的表达。在相同条件下继续孵育4小时， 之后离心收获细胞。变性条件下从不溶的片状沉淀物中纯化重组 Plm。在8M尿素、100mM NaH2PO4，10mM Tris，pH8.0条件下震 荡混合60分钟使细胞裂解。14,000×g离心30分钟后，将上清液 加入到Ni-NTA柱中。重组Plm在8M尿素、100mM NaH2PO4、 10mM Tris、pH4.5条件下洗脱并通过梯度透析复性，每个梯度至 少4小时，透析液为100mM NaH2PO4、10mM Tris、pH8.0，分别 含6、4、3、2、1和0.5M尿素。蛋白质最终在10mM Tris、100mM NaCl和pH8.0条件下被透析出来并用Amicon centricon YM.-3浓 缩器浓缩。
通过烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白 质得到纯化。纯化了的样品的蛋白质浓度通过在280nm处的紫外 线吸光度来估计。蛋白质的摩尔吸光系数通过其酪氨酸和色氨酸含 量而计算(Gill等人，1989)。
Plm显示出可与重组Phl p1相比的迁移模式(见图2A)，该迁 移模式与根据蛋白质推断出的氨基酸序列计算出的分子量一致。
Plm的分子量通过质谱确定是27 082道尔顿，与该蛋白质的预 测分子量一致(见图2B)。
纯化了的Plm通过圆二色性分析法分析并与重组Phlp1比较 以确定它们的二级结构内容(见图2C)。意料之外的是，Plm是在 207和215nm处具有最小值，在195nm处具有最大值的折叠分子， 提示了有大量β二级结构的存在。Plm，代表人工变应原蛋白质， 表现出区别于在杆状病毒感染的昆虫细胞内表达的折叠重组Phlp 1的CD光谱(Ball等人)。作为对比，大肠杆菌表达的重组Phl p1 表现出非折叠蛋白质的光谱，事实最近被描述(Ball等人，2005) 实施例3：Plm的IgE结合能力下降
Plm的IgE反应性在抗原过剩的条件下通过斑点实验确定并与 rPhl p1比较(Niederberger等人，1998)。将3μg纯化重组蛋白质点 到硝酸纤维素试纸条上并与49名Phl p1过敏患者的血清孵育。结 合型IgE抗体用125I标记的抗人IgE抗体检测并用γ计数法定量 (Wallac，Finland)(Ball等人，1999)。
在非变性条件下确定的Plm的IgE反应性与rPhl p1的IgE结 合能力相比明显下降(图3)。与rPhl p1(表1)相比，将Plm结 合的IgE抗体定量，显示出平均有86.5％的Plm IgE结合能力下降。
图3显示IgE结合到膜结合型重组变应原rPhl p1、Plm和HSA 上。49名牧草花粉过敏患者的血清和一份非特应性的供体(n＝50) 血清与膜结合型重组变应原rPhl p1、Plm和HSA孵育。结合型IgE 用125I标记的抗人IgE抗体检测。
表1rPhl p1和Plm的血清IgE反应性。将点上去的蛋白质与 29名牧草花粉过敏患者的血清相接触。结合型IgE抗体用125I标记 的抗人IgE抗体检测并用γ计数法定量。
实施例4：Plm表现出变应原活性下降
通过CD203c的表达测定嗜碱性粒细胞的激活
在给予知情同意书后，采集5名过敏症供体的外周血。用肝 素化试管收集血液。等量血液(100μl)与Plm和rPhl p1(10-3至 10μg/ml)系列稀释液、抗IgE抗体(1μg/ml)(Immunotech，Marseille， France)或缓冲液(磷酸盐缓冲液PBS)在37℃孵育15分钟。孵 育结束后，用含20mM EDTA的PBS冲洗细胞。然后将细胞与10μl 结合PE的CD203c单抗(mAb)97A6(Immunotech，Marseille， France)在室温(RT)孵育15分钟。此后，样品用2ml FACSTM裂 解液(Becton Dickinson，San Jose，CA)裂解红细胞。用PBS冲洗并 使细胞在PBS中重新悬浮并在FACScan仪(Becton Dickinson)上 用Paint-a-Gate软件通过双色流式细胞计数法对细胞进行分析。变 应原诱导的CD203c的上调通过计算刺激细胞的平均荧光强度(MFI 刺激细胞)和未刺激细胞的平均荧光强度(MFI未刺激细胞)而得到，并用 刺激指数(MFI刺激细胞：MFI未刺激细胞)表示。
Plm的变应原活性通过测定5名Phl p1过敏患者血嗜碱性粒细 胞CD203c的表达来分析。正如图4所描述的那样，与蛋白质浓度 为1μg/ml的rPhl p1孵育后，CD203c的表达显著上调(p<0.05)， 而与Plm孵育的则无CD203c的诱导表达。只有当Plm的浓度增加 到10μg/ml时，CD203c的表达才上调。因此，与Plm相比，Phl p1 表现出10倍于Plm的变应原活性。
实施例5：免疫接种Plm诱导产生的IgG抗体抑制患者的IgE 与rPhl p1的结合
家兔的免疫接种
用CFA为家兔首次接种200μg的Plm和rPhl p1，并用IFA加 强注射100μg免疫源(4周后第一次加强注射；7周后用不完全佐 剂第二次加强注射)(Charles River Breeding Laboratories，Kisslegg， Germany)。第一次免疫接种后8周，家兔被放血。
Plm诱导的IgG抑制过敏患者的IgE与rPhl p1的结合
Plm和rPhl p1诱导的家兔IgG抑制过敏患者的IgE与rPhl p1 的结合用ELISA竞争试验法(Focke等人，2001)检测。ELISA平 皿(Nunc Maxisorp，Denmark)用1μg/ml rPhl p1包被并与100倍 稀释的rPhl p1和Plm抗血清预孵育，并与相应免疫前血清预孵育 作为对照。冲洗后，将平皿与10倍稀释的43名Phl p1致敏的牧草 花粉过敏患者的血清孵育。用稀释了2500倍的HRP-偶联的山羊抗 人IgE抗体(KPL，Gaithersburg，MD)检测结合型IgE抗体。与抗 Phl p1和抗Plm抗血清预孵育达到的抑制IgE结合的百分数计算如 下：抑制IgE结合的百分数＝100—ODI/ODP×100。ODI和ODP代表 分别与家兔的免疫血清和相应免疫前血清预孵育的吸光度。
表2中Plm抑制患者IgE与rPhl p1结合的能力用下降百分比 表示。用抗Plm抗体可达到的对患者IgE与rPhl p1结合的最强抑 制程度的变化范围是0至89％(平均下降52％)而用抗Phl p1 抗体达到的抑制程度的变化范围是4至75％(平均43％)。
表2。家兔抗rPhl p1和Plm抗血清抑制牧草花粉过敏患者IgE 与rPhl p1结合。结合rPhl p1和Plm的ELISA平皿与家兔抗rPhl p1和抗Plm抗血清预孵育。43名牧草花粉过敏患者的IgE结合下 降百分数列于此表。
Plm诱导的家兔IgG使IgE与rPhl p1结合下降％
实施例6：Plm的免疫源性
为研究Phl p1嵌合体蛋白质在体内能否诱导变应原特异性IgG 应答，皮下免疫接种6周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Breeding Laboratories)。5只小鼠一组免疫接种5μg Plm、rPhl p1和作为对 照的吸附到Al(OH)3(Alu-Gel-S，Serva，Germany)(Vrtala等人， 1998)上的PBS。小鼠被免疫接种三次(第1天、第28天和第56 天)，每间隔4周从尾静脉抽血并将血清存放在-20℃直到被分析。
IgG1对rPhl p1的应答通过ELISA(Vrtala等人，1998)测定。 ELISA平皿(NuncMaxisorp，Denmark)用5μgPlm包被并与1000 倍稀释的小鼠血清孵育。结合型IgG1抗体用1000倍稀释的单克隆 大鼠抗小鼠IgG1(Pharmingen，CA)和200倍稀释的HRP标记的 绵羊抗大鼠抗血清(Amersham，UK)检测。
正如图5所证明的那样，Plm诱导的IgG1对rPhl p1的应答与 免疫接种rPhl p1诱导的应答强度几乎相等。
图5。Plm的免疫原性。用PBS、rPhl p1或Plm(x轴)免疫 接种5只小鼠，接种后4、8周或12周IgG1应答的平均值(以OD 值表示，y轴)。
参考文献
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Vrtala，S.，et al.(1998)J.Immunol.160：6137.
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<120>变应原衍生物
<130>R 49993
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<170>PatentIn version 3.3
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<223>Phl p1嵌合体蛋白质
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<223>引物
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<213>人工
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