促进多巴胺能神经元神经突生长和存活的方法
阅读：1008发布：2020-08-05
专利汇可以提供促进多巴胺能神经元神经突生长和存活的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 一般涉及促进多巴胺能神经元再生，生长和存活的方法，其包括将所述多巴胺能神经元与有效量的含Sp35拮抗剂的组合物相 接触 。此外，本发明一般涉及通过施用Sp35拮抗剂 治疗 各种与多巴胺能神经元变性或死亡相关的 疾病 、紊乱或损伤。，下面是促进多巴胺能神经元神经突生长和存活的方法专利的具体信息内容。
1.一种促进多巴胺能神经元再生、生长或存活的方法，其包括将 所述多巴胺能神经元与有效量的包含选自以下组合的Sp35拮 抗剂的组合物相接触：
(i)可溶性Sp35多肽；
(ii)Sp35抗体或其免疫特异性片段；
(iii)Sp35拮抗剂多聚核苷酸，
(iv)Sp35适体；以及
(v)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。
2.一种在哺乳动物中促进多巴胺能神经元再生、生长和存活的方 法，其包括向有此需要的哺乳动物施用有效量的包含选自以下 组合的Sp35拮抗剂的组合物：
(i)可溶性Sp35多肽；
(ii)Sp35抗体或其片段；
(iii)Sp35拮抗剂多聚核苷酸，以及
(iv)Sp35适体；以及
(v)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的哺乳动物患有与多巴胺 能神经元变性相关的疾病、紊乱或损伤。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的疾病、紊乱或损伤选自 由帕金森氏病(PD)、多系统萎缩、纹状体黑质变性、橄榄脑桥 小脑萎缩、Shy-Drager综合症、具有帕金森特征的运动神经元 疾病、路易体痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底神经节变性、 额颞叶痴呆、具有帕金森病征的阿尔茨海默病、Wilson病、 Hallervordern-Spatz病、Chediak-Hagashi病、SCA-3脊髓小脑 性共济失调、X-连锁的肌张力障碍-帕金森综合征(DYT3)、亨 廷顿舞蹈病(Westphal变体)、朊蛋白病、Jacob-Creutzfeldt 病(CJD)、血管性帕金森综合征、脑性瘫痪、重复头部外伤、 脑炎后怕金森综合症、神经系梅毒和精神分裂症构成的组合。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的疾病、紊乱或损伤为帕 金森氏病(PD)。
6.如权利要求1至5任意一项所述的方法，其中所述的Sp35拮 抗剂包含可溶性Sp35多肽。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽包含 选自以下组合的Sp35区域：
(i)Sp35Ig结构域或其片段、变体或衍生物，
(ii)Sp35LRR结构域或其片段、变体或衍生物，
(iii)Sp35细胞质区或其片段、变体或衍生物，
(iv)Sp35跨膜区或其片段、变体或衍生物，
(v)Sp35碱性区C末端至LRR区或其片段、变体或衍生物， 以及
(vi)(i)至(v)至少两个所述Sp35区域或其片段、变体或衍生物 的组合。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽缺失 选自以下组合的Sp35区域：
(i)Sp35Ig结构域，
(ii)Sp35LRR结构域，
(iii)Sp35细胞质区，
(iv)Sp35跨膜区，
(v)Sp35碱性区C末端至LRR结构域，以及
(vi)(i)至(v)至少两个所述Sp35区域的组合。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽缺失 Sp35跨膜区和Sp35细胞质区。
10.如权利要求6至9任意一项所述的方法，其中所述的可溶性 Sp35多肽包含
(i)Sp35LRR结构域或其片段、变体或衍生物，
(ii)Sp35碱性区C末端至LRR结构域或其片段、变体或衍生 物，以及
(iii)Sp35免疫球蛋白(Ig)结构域或其片段、变体或衍生物。
11.如权利要求8或9所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽 至少包含Sp35LRR结构域的一部分，但缺失Sp35Ig结构域、 Sp35碱性区、Sp35跨膜区和Sp35细胞质区。
12.如权利要求1至11任意一项所述的方法，其中所述的可溶性 Sp35多肽包含选自以下组合的多肽片段：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1至33；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至35；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至64；
(iv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至64；
(v)SEQ ID NO：2的氨基酸66至89；
(vi)SEQ ID NO：2的氨基酸90至113；
(vii)SEQ ID NO：2的氨基酸114至137；
(viii)SEQ ID NO：2的氨基酸138至161；
(ix)SEQ ID NO：2的氨基酸162至185；
(x)SEQ ID NO：2的氨基酸186至209；
(xi)SEQ ID NO：2的氨基酸210至233；
(xii)SEQ ID NO：2的氨基酸234至257；
(xiii)SEQ ID NO：2的氨基酸258至281；
(xiv)SEQ ID NO：2的氨基酸282至305；
(xv)SEQ ID NO：2的氨基酸306至329；
(xvi)SEQ ID NO：2的氨基酸330至353；
(xvii)SEQ ID NO：2的氨基酸363至416；
(xviii)SEQ ID NO：2的氨基酸417至424；
(xix)SEQ ID NO：2的氨基酸419至493；
(xx)SEQ ID NO：2的氨基酸494至551；
(xxi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至64；
(xxii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至89；
(xxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至113；
(xxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至137；
(xxv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至161；
(xxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至185；
(xxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至209；
(xxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至233；
(xxix)SEQ ID NO：2的氨基酸1至257；
(xxxx)SEQ ID NO：2的氨基酸1至281；
(xxxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至305；
(xxxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至329；
(xxxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至353；
(xxxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至416；
(xxxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸1至424；
(xxxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸1至493；
(xxxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至551；
(xxxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸1至531；
(iL)SEQ ID NO：2的氨基酸1至532；
(Li)SEQ ID NO：2的氨基酸34至89；
(Lii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至113；
(Liii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至137；
(Liv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至161；
(Lv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至185；
(Lvi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至209；
(Lvii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至233；
(Lviii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至257；
(Lix)SEQ ID NO：2的氨基酸34至281；
(Lx)SEQ ID NO：2的氨基酸34至305；
(Lxi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至329；
(Lxii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至353；
(Lxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至416；
(Lxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至424；
(Lxv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至493；
(Lxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至551；
(Lxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至530；
(Lxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至531；
(Lxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至532；
(Lxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至533；
(Lxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至534；
(Lxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸34至535；
(Lxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至536；
(Lxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至537；
(Lxxix)SEQ ID NO：2的氨基酸34至538；
(Lxxx)SEQ ID NO：2的氨基酸34至539；
(Lxxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸30至532；
(Lxxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸31至532；
(Lxxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸32至532；
(Lxxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸33至532；
(Lxxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至532；
(Lxxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸35至532；
(Lxxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至532；
(Lxxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸30至531；
(Lxxxix)SEQ ID NO：2的氨基酸31至531；
(Lxxxx)SEQ ID NO：2的氨基酸32至531；
(Lxxxxi)SEQ ID NO：2的氨基酸33至531；
(Lxxxxii)SEQ ID NO：2的氨基酸34至531；
(Lxxxxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸35至531；
(Lxxxxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至531；
(Lxxxxv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至89；
(Lxxxxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至113；
(Lxxxxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至137；
(Lxxxxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至161；
(Lxxxxvc)SEQ ID NO：2的氨基酸36至185；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸36至209；
(ci)SEQ ID NO：2的氨基酸36至233；
(cii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至257；
(ciii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至281；
(civ)SEQ ID NO：2的氨基酸36至305；
(cv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至329；
(cvi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至353；
(cvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至416；
(cviii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至424；
(cix)SEQ ID NO：2的氨基酸36至493；
(cx)SEQ ID NO：2的氨基酸36至551；
(cxi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至530；
(cxii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至531；
(cxiii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至532；
(cxiv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至533；
(cxv)SEQ ID NO：2的氨基酸36至534；
(cxvi)SEQ ID NO：2的氨基酸36至535；
(cxvii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至536；
(cxviii)SEQ ID NO：2的氨基酸36至537；
(cxix)SEQ ID NO：2的氨基酸36至538；
(cxx)SEQ ID NO：2的氨基酸36至539；
(cxxi)任意所述多肽片段的变体或衍生物，以及
(cxxii)至少两个任意所述多肽片段或其变体或衍生物 的组合。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽包 含SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-532或SEQ ID NO：2的氨基 酸36-532。
14.如权利要求6-13任意一项所述的方法，其中所述的可溶性 Sp35多肽包含Sp35Ig结构域或其片段、变体或衍生物。
15.如权利要求6所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽包含 SEQ ID NO：2的氨基酸417-493。
16.如权利要求6至15任意一项所述的方法，其中所述的可溶性 Sp35多肽进一步包含非Sp35部分。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述非Sp35部分为融合至 所述可溶性Sp35多肽的多肽。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述非Sp35部分选自由抗 体Ig部分、血清白蛋白部分、靶标部分、报告部分以及纯化 促进部分构成的组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述的非Sp35部分为抗体 Ig部分。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述的抗体Ig部分为铰链和 Fc部分。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽与 聚合物相结合。
22.如权利要求21所述的方法，其中该聚合物选自由聚烷撑二醇、 糖聚合物和多肽构成的组合。
23.如权利要求22所述的方法，其中该聚合物为聚烷撑二醇。
24.如权利要求23所述的方法，其中该聚烷撑二醇为聚乙二醇 (PEG)。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述的可溶性Sp35多肽与 1，2，3，或4聚合物相结合。
26.如权利要求25所述的方法，其中该聚合物的总分子量为5,000 Da至100,000Da。
27.如权利要求1至5任意一项所述的方法，其中所述的Sp35拮 抗剂包含Sp35抗体或其片段。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述Sp35抗体或其片段特 异性结合基本由选自以下组合的多肽片段组成的表位：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸66至89；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸66至113；
(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸66至137；
(iv)SEQ ID NO：2的氨基酸90至113；
(v)SEQ ID NO：2的氨基酸114至137；
(vi)SEQ ID NO：2的氨基酸138至161；
(vii)SEQ ID NO：2的氨基酸162至185；
(viii)SEQ ID NO：2的氨基酸186至209；
(ix)SEQ ID NO：2的氨基酸210至233；
(x)SEQ ID NO：2的氨基酸234至257；
(xi)SEQ ID NO：2的氨基酸258至281；
(xii)SEQ ID NO：2的氨基酸282至305；
(xiii)SEQ ID NO：2的氨基酸306至329；
(xiv)SEQ ID NO：2的氨基酸330至353；
(xv)SEQ ID NO：2的氨基酸34至64；
(xvi)SEQ ID NO：2的氨基酸363至416；
(xvii)任意所述多肽片段的变体或衍生物；以及
(xviii)两个或多个任意所述多肽片段或其变体或衍生物的组 合。
29.如权利要求1至5任意一项所述的方法，其中所述的Sp35拮 抗剂包含Sp35拮抗剂多聚核苷酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述的Sp35拮抗剂多聚核 苷酸选自以下组合：
(i)反义多聚核苷酸；
(ii)核酶；
(iii)小干扰RNA(siRNA)；以及
(iv)小发夹RNA(shRNA)。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述的Sp35拮抗剂多聚核 苷酸为反义多聚核苷酸，其包含了与Sp35mRNA编码部分互 补的至少10个碱基。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述的Sp35拮抗剂多聚核苷 酸为核酶。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述的Sp35拮抗剂多聚核 苷酸为siRNA。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述的Sp35拮抗剂多聚核 苷酸为shRNA。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述的shRNA包含核苷酸序 列：UGAUCGUCAU CCUGCUAGAC UUCAAGAGAG UCUAGCAGGA UGACGAUCUU UUUUC(SEQ ID NO：13)。
36.如权利要求1至35任意一项所述的方法，其中所述的Sp35 拮抗剂通过弹丸注射或慢性灌输进行施用。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述的Sp35拮抗剂被直接 施用至中枢神经系统。
38.如权利要求1至37任意一项所述的方法，其包括(a)将多聚核 苷酸导入所述多巴胺能神经元，该多聚核苷酸通过可操作连接 至表达控制序列编码所述Sp35拮抗剂，以及(b)允许所述Sp35 拮抗剂的表达。
39.如权利要求38或39任意一项所述的方法，其中所述的多聚核 苷酸通过选自以下组合的方法导入所述多巴胺能神经元：
(a)转染；
(b)电穿孔；
(c)转导；以及
(d)直接显微注射。
40.如权利要求2至37任意一项所述的方法，其包括(a)向所述哺 乳动物施用多聚核苷酸，该多聚核苷酸通过可操作连接至表达 控制序列编码所述Sp35拮抗剂，以及(b)允许所述Sp35拮抗 剂的表达。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述的多聚核苷酸在能够表 达所述多聚核苷酸的培养宿主细胞中进行施用。
42.如权利要求38至41任意一项所述的方法，其中所述的多聚核 苷酸作为表达载体进行施用。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述的表达载体为病毒载体。
44.如权利要求38至41任意一项所述的方法，其中所述的多聚核 苷酸在该神经系统疾病、紊乱或损伤位点或该位点附近被导入 所述哺乳动物。
45.如权利要求41所述的方法，其中所述的培养宿主细胞通过以 下方法制备，其包括(a)以权利要求40所述的多聚核苷酸或者 权利要求42或43所述的载体转化或转染受体宿主细胞，以及 (b)培养所述转化或转染宿主细胞。
46.如权利要求41至45任意一项所述的方法，其中所述的宿主细 胞来自于待治疗的哺乳动物。
47.如权利要求1至46任意一项所述的方法，其中所述的Sp35 拮抗剂的表达量足以减少对存在于神经系统疾病、紊乱或损伤 位点或该位点附近的多巴胺能神经元再生、生长或存活的抑 制。
48.如权利要求43所述的方法，其中该病毒载体选自由腺病毒载 体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒载体、慢病毒载体、 杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体、细小病毒和 痘病毒载体构成的组合。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述的疱疹病毒载体选自由 单纯疱疹病毒载体和Epstein Barr病毒载体构成的组合。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述的痘病毒载体为痘苗病 毒载体。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述的慢病毒载体为pLL3.7。
52.如权利要求48所述的方法，其中所述的细小病毒为腺相关病 毒(AAV)。
53.如权利要求43或48-52任意一项所述的方法，其中所述的载 体的施用途径选自由局部施用、眼内施用、肠胃外施用、鞘内 施用、硬膜下施用和皮下施用构成的组合。
54.一种在多巴胺能神经元中抑制EGFR和Sp35相互作用的方 法，其包括将所述多巴胺能神经元与有效量的包含选自以下组 合的Sp35拮抗剂的组合物相接触：
(i)可溶性Sp35多肽；
(ii)Sp35抗体或其片段；
(iii)Sp35拮抗剂多聚核苷酸；
(iv)Sp35拮抗剂适体；以及
(v)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。
55.一种提高多巴胺能神经元中Akt磷酸化的方法，其包括将所述 多巴胺能神经元与有效量的包含选自以下组合的Sp35拮抗剂 的组合物相接触：
(i)可溶性Sp35多肽；
(ii)Sp35抗体或其片段；
(iii)Sp35拮抗剂多聚核苷酸，
(iv)Sp35拮抗剂适体；以及
(v)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。
56.一种提高多巴胺能神经元中EGFR表达的方法，其包括将所 述多巴胺能神经元与有效量的包含选自以下组合的Sp35拮抗 剂的组合物相接触：
(i)可溶性Sp35多肽；
(ii)Sp35抗体或其片段；
(iii)Sp35拮抗剂多聚核苷酸，
(iv)Sp35拮抗剂适体；以及
(v)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。
技术领域
[0001]本发明涉及神经学，神经生物学和分子生物学。更具 体而言，本发明涉及促进多巴胺能神经元(DA神经元)的多巴胺能神 经突再生、生长和存活的方法。此外，本发明涉及通过施用 Sp35(LINGO-1)受体拮抗剂治疗具有多巴胺能神经元变性或死亡的 疾病的方法。
背景技术
[0002]特定的神经变性紊乱以多巴胺能神经元的变性为表 征。例如，帕金森氏病伴随着中脑的黑质中的多巴胺能神经元渐进 性破坏。该种破坏可导致化学递质多巴胺水平的下降。帕金森氏病 的生理症状包括随意运动的损伤以及肌肉组不受控的节奏性颤搐 形成特有的颤抖。
[0003]帕金森氏病最广泛的治疗是施用多巴胺前体、L-dopa (L-3，4-二羟(基)苯丙氨酸多巴)，后者可在主要被残留多巴胺神经 元脱羧基后通过替换缺失的多巴胺间接作用。然而，L-dopa的使用 伴有不良作用。患者常经受如运动障碍、恶心、呕吐、腹胀等副作 用和精神性副作用的折磨，且随着时间的推移患者对L-dopa疗法的 响应通常逐渐下降。针对L-dopa治疗的疗效随时间推移而下降，人 们提出的理由之一是存活的多巴胺能神经元的数量被耗竭因此无 法对施用的L-dopa进行响应。参见Isacson O.，″Problems and solutions for circuits and synapses in Parkinson＇s disease，＂Neuron 43： 165-168(2004)。此外，L-dopa的效力随着因多巴胺能神经元死亡而 持续损失的神经元连接(末端或神经键)而下降。参见同上。采用 突触后多巴胺激动剂进行的其它治疗形式同样伴有副作用。此外， 尽管L-dopa改善了患者的生活质量，它并不能阻止疾病进展。
[0004]其他化合物如神经胶质细胞系衍生神经营养因子 (GDNF)已显示了通过慢性灌输传递在人类患者中治疗帕金森氏病 的希望。例如，参见Gill等人.，″Direct brain infusion of glial cell line derived neurotrophic factor in Parkinson disease，＂Nature Med.9： 589-95(2003)。然而，这些治疗方案仍处在发展早期。
[0005]许多其它的疾病和紊乱可包括多巴胺能神经元的变 性。其中包括多系统萎缩、纹状体黑质变性、橄榄脑桥小脑萎缩、 Shy-Drager综合症、具有帕金森特征的运动神经元疾病、路易体痴 呆、进行性核上性麻痹、皮质基底神经节变性、额颞叶痴呆、具有 帕金森病征的阿尔茨海默病、Wilson病、Hallervordern-Spatz病、 Chediak-Hagashi病、SCA-3脊髓小脑性共济失调、X-连锁的肌张力 障碍-帕金森综合征(DYT3)、亨廷顿舞蹈病(Westphal变体)、朊蛋 白病、Jacob-Creutzfeldt病、血管性帕金森综合征、脑性瘫痪、重复 头部外伤、脑炎后帕金森综合症、精神分裂症和神经系梅毒。
[0006]相应地，有必要对以多巴胺能神经元变性或死亡为特 征的帕金森氏病和其它症状采取附加治疗方法。
发明内容
[0007]本发明基于如下发现：LINGO-1在中脑多巴胺能(DA) 神经元表达，并负向调节DA神经元神经突生长和存活。基于该发 现，本发明一般涉及促进多巴胺神经元增殖、存活、修复、生长和 再生的方法，其包括将所述多巴胺能神经元与有效量的含Sp35拮 抗剂的组合物相接触。此外，本发明一般涉及通过施用Sp35拮抗 剂治疗各种与多巴胺能神经元变性或死亡相关的疾病、紊乱或损 伤。
[0009]在附加的实施方式中，该哺乳动物经诊断患有与多巴 胺能神经突变性或死亡相关的疾病、紊乱、损伤等症状。在一些实 施方式中，该疾病、紊乱、损伤等症状选自由帕金森氏病(PD)、多 系统萎缩、纹状体黑质变性、橄榄脑桥小脑萎缩、Shy-Drager综合 症、具有帕金森特征的运动神经元疾病、路易体痴呆、进行性核上 性麻痹、皮质基底神经节变性、额颞叶痴呆、具有帕金森病征的阿 尔茨海默病、Wilson病、Hallervordern-Spatz病、Chediak-Hagashi 病、SCA-3脊髓小脑性共济失调、X-连锁的肌张力障碍-帕金森综 合征(DYT3)、亨廷顿舞蹈病(Westphal变体)、朊蛋白病、 Jacob-Creutzfeldt病(CJD)、血管性帕金森综合征、脑性瘫痪、重复 头部外伤、脑炎后帕金森综合症、神经系梅毒和精神分裂症构成的 组合。
[0010]在上述方法的不同实施方式中，该Sp35拮抗剂可以是 任何能干预Sp35效能以负向调节多巴胺能神经元再生、生长或存 活的能力的分子。在特定实施方式中，该Sp35拮抗剂选自由可溶 性Sp35多肽、Sp35抗体或其片段、Sp35拮抗剂多聚核苷酸(例如， RNA干扰)、Sp35适体或两种或多种Sp35拮抗剂构成的组合。
[0011]在特定实施方式中，该Sp35拮抗剂是可溶性Sp35多 肽。本发明的特定可溶性Sp35多肽包括，但不限于，包含或缺失 下列一个或多个结构域的可溶性Sp35多肽：(i)Sp35富亮氨酸重复 序列(LRR)结构域，(ii)Sp35碱性区C末端至LRR结构域，以及 (iii)Sp35免疫球蛋白(Ig)结构域。在一些实施方式中，该可溶性Sp35 多肽缺失Sp35Ig结构域、Sp35LRR结构域、跨膜区以及细胞质区。 本发明的其它Sp35可溶性多肽包括缺失跨膜区和细胞质区的多肽。 在一些实施方式中，该可溶性Sp35包含Sp35LRR结构域并缺失 Sp35Ig结构域、Sp35碱性区、跨膜区以及细胞质区。在一些实施 方式中，该可溶性Sp35多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-532 或SEQ ID NO：2的氨基酸残基36-532。
[0012]在一些实施方式中，该Sp35拮抗剂为包含了非Sp35 部分的融合多肽。在一些实施方式中，该非Sp35部分选自由抗体 Ig部分、血清白蛋白部分、靶标部分、报告部分以及纯化促进部分 构成的组合。在一些实施方式中，该抗体Ig部分为铰链和Fc部分。
[0013]在替代性实施方式中，该Sp35拮抗剂是与包含了下列 一种或多种Sp35结构域的Sp35多肽相结合的抗体或其片段： (i)Sp35富亮氨酸重复序列(LRR)结构域，(ii)Sp35碱性区C末端至 LRR结构域，以及(iii)Sp35免疫球蛋白(Ig)结构域。此外，该Sp35 抗体或其片段特异性结合包含此处所述的Sp35多肽片段的多肽中 的表位。
[0014]在其它实施方式中，该Sp35拮抗剂为Sp35拮抗剂多 聚核苷酸，如反义多聚核苷酸、适体、小干扰RNA(siRNA)、或小 发夹RNA(shRNA)。
[0015]在附加实施方式中，该Sp35拮抗剂为Sp35适体。Sp35 适体为结合Sp35并干扰Sp35效能以负向调节多巴胺能神经元再 生、生长和存活的能力的小多肽或多聚核苷酸。
[0016]本发明的进一步实施方式包括促进多巴胺能神经元再 生、生长和存活的方法或是通过体内基因疗法治疗与多巴胺能神经 突变性或死亡有关的疾病、紊乱或损伤的治疗方法，其包括在疾病、 紊乱或损伤位点或该位点附近向哺乳动物施用为Sp35拮抗剂编码 的核苷酸序列，从而由该核苷酸序列在哺乳动物中的损伤位点或该 位点附近表达其数量足以降低对多巴胺能神经元再生、生长或存活 的抑制作用的Sp35拮抗剂。在特定的实施方式中，该载体为选自 由腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒载体、慢病 毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳 多空病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体、细小病毒载体以及单 纯疱疹病毒载体构成的组合。在一些实施方式中，该载体通过选自 由局部施用、眼内施用、肠胃外施用、鞘内施用、硬膜下施用和皮 下施用构成的组合的途径进行施用。在一些实施方式中，该疾病、 紊乱、损伤等症状选自由帕金森氏病(PD)、多系统萎缩、纹状体黑 质变性、橄榄脑桥小脑萎缩、Shy-Drager综合症、具有帕金森特征 的运动神经元疾病、路易体痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底神 经节变性、额颞叶痴呆、具有帕金森病征的阿尔茨海默病、Wilson 病、Hallervordern-Spatz病、Chediak-Hagashi病、SCA-3脊髓小脑 性共济失调、X-连锁的肌张力障碍-帕金森综合征(DYT3)、亨廷顿 舞蹈病(Westphal变体)、朊蛋白病、Jacob-Creutzfeldt病(CJD)、 血管性帕金森综合征、脑性瘫痪、重复头部外伤、脑炎后帕金森综 合症、神经系梅毒和精神分裂症构成的组合。
[0017]此外，本发明包括了促进多巴胺能神经元再生、生长 和存活的方法，或是哺乳动物体内与多巴胺能神经突变性或死亡有 关的疾病、紊乱或损伤的治疗方法，其包括(a)将为Sp35拮抗剂编 码的多聚核苷酸导入多巴胺能神经元，以及(b)允许所述Sp35拮抗 剂的表达。此外，本发明涉及包括(a)向所述哺乳动物施用多聚核苷 酸，该多聚核苷酸通过可操作连接至表达控制序列可对所述Sp35 拮抗剂进行编码，以及(b)允许所述Sp35拮抗剂的表达的方法。在 一些实施方式中，该培养宿主细胞来自于待治疗的哺乳动物。在特 定的实施方式中，该多聚核苷酸通过转染、电穿孔、病毒转导或直 接显微注射被导入该宿主细胞或多巴胺能神经元。在特定的实施方 式中，该种待治疗的疾病、紊乱、损伤等症状选自由帕金森氏病 (PD)、多系统萎缩、纹状体黑质变性、橄榄脑桥小脑萎缩、Shy-Drager 综合症、具有帕金森特征的运动神经元疾病、路易体痴呆、进行性 核上性麻痹、皮质基底神经节变性、额颞叶痴呆、具有帕金森病征 的阿尔茨海默病、Wilson病、Hallervordern-Spatz病、Chediak-Hagashi 病、SCA-3脊髓小脑性共济失调、X-连锁的肌张力障碍-帕金森综 合征(DYT3)、亨廷顿舞蹈病(Westphal变体)、朊蛋白病， Jacob-Creutzfeldt病(CJD)、血管性帕金森综合征、脑性瘫痪、重复 头部外伤、脑炎后帕金森综合症、神经系梅毒和精神分裂症构成的 组合。
[0018]在一些实施方式中，本发明的多肽，适体和抗体与聚 合物相结合。在一些实施方式中，该聚合物选自由聚烷撑二醇、糖 聚合物和多肽构成的组合。在一些实施方式中，该聚烷撑二醇为聚 乙二醇(PEG)。在一些实施方式中，本发明的多肽和抗体与1，2，3， 或4聚合物相结合。在一些实施方式中，该聚合物的总分子量为 5,000Da至100,000Da。附图说明
[0019]图1：该图显示了经过载体对照，FL-Sp35(FL-LINGO-1) 和DN-Sp35(DN-LINGO-1)转导或经过与无Sp35蛋白的Fc对照 (*p＜0.003)和慢病毒对照(*p＜0.05)相比较的可溶性Sp35-Fc (LINGO-1-Fc)蛋白处理的原代大鼠DA神经元培养物的多巴胺能神 经元生长。
[0020]图2：该图显示了以生产全长Sp35(FL-LINGO-1)，显 性-阴性Sp35(DN-LINGO-1)的慢病毒或是对照慢病毒感染并以 10μM的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)或仅以用于施用该MPP+的 溶媒组合物处理的培养大鼠腹侧中脑(VM)神经元的存活。当暴露至 MPP+时，与DN-SP35孵育的酪氨酸水解酶(TH)神经元的数量显著 高于FL-Sp35和对照(*p＜0.05，单因素方差分析)。
[0021]图3：该图显示了以Sp35-Fc(LINGO-1-Fc)或1A7 Sp35拮抗剂抗体以及对照Fc或对照抗体处理的VM TH神经元的 数量。当暴露至MPP+时以Sp35-Fc或1A7处理可导致比对照Fc 或对照抗体更高的神经元数量(对于1A7*p＜0.01且对于Sp35-Fc *p＜0.05，单因素方差分析)。
[0022]图4：经DN-LINGO-1、FL-LINGO-1或对照转导后 VM原代大鼠神经元培养物中的磷酸化Akt(p-Akt)的Western印迹。 在以DN-LINGO-1转导的细胞中可观察到比FL-LINGO-1和对照更 高的磷酸化Akt。
[0023]图5：图示了Sp35敲除小鼠与野生型小鼠相比的运动 不对称。向野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的左纹状体注射6-羟多巴 胺(6-OHDA)后的1，2，3和4周内对运动不对称进行了评估。敲除 小鼠的运动不对称显著低于野生型(*p＝0.001，双因素方差分析)。
[0024]图6A至6F：图6A显示了在6-OHDA试验中野生型 和敲除小鼠的无损伤中脑内的TH神经元数量。图6B显示了在 6-OHDA试验中野生型和敲除小鼠相对无损伤侧的数量所规格化的 损伤侧的TH神经元数量。KO小鼠的TH神经元的百分比在统计上 大于WT小鼠(*p＝0.001，非配对t检验)。图6C显示了在1-甲基，4- 苯基1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)试验中野生型和敲除小鼠的中脑内的 TH神经元数量。KO小鼠的TH神经元的百分比在统计上大于WT 小鼠(*p＝0.002，非配对t检验)。图6D为显示了与未暴露至MPTP 的小鼠相比暴露至MPTP的WT和KO小鼠中磷酸化Akt(P-Akt) 水平的Western印迹。图6E为经盐水和MPTP处理的WT和KO VM 中的磷酸化Akt(p-Akt)、Akt和β-肌动蛋白的Western印迹(每组 中n＝6)。图6F显示了与MPTP处理的WT(*p＜0.05)和盐水处理 的KO VMs(#p＜0.05，每组中n＝6)相比在第7天MPTP处理的小鼠 VMs中的p-Akt水平明显更高。
[0025]图7A至7G：图7A为经Sp35抗体(1A7)或对照抗体 处理的VM TH神经元中P-Akt和表皮生长因子受体(EGFR)表达的 Western印迹。图7B为经Sp35-Fc或对照处理的VM TH神经元的 EGFR和P-Akt表达的Western印迹。图7C为经Sp35-Fc或Sp35 抗体(1A7)处理的VM培养物的EGFR、p-Akt、总Akt和β-肌动蛋 白表达的Western印迹。图7D为经Sp35和/或EGFR转染的培养 细胞中EGFR和Sp35的共免疫沉淀。+或-显示EGFR和Sp35的存 在(+)或缺失(-)。IP指用于免疫沉淀的抗体，而IB指用于Western 印迹的抗体。图7E为WT和KO VM中EGFR和LINGO-1的共免 疫沉淀。图7F为显示Sp35抗体1A7阻断Sp35与EGFR在共转 染细胞系中的结合的Western印迹。此外，另一Sp35抗体2F3不 阻断Sp35与EGFR的结合。少突细胞-髓鞘糖蛋白(OMgp)的转染被 作为对照。图7G显示了分别与对照和Fc片段比较得到的1A7和 Sp35-Fc处理的培养物中p-Akt水平的统计学分析。
[0026]图8：该图显示了患有6-OHDA诱导的试验帕金森综 合征的WT和KO小鼠中VM的未损伤和损伤侧的TH神经元数量。
[0027]图9：该图显示了6-OHDA损伤后Sp35蛋白水平的变 化。向野生型小鼠纹状体施用6-OHDA 3天后Sp35在损伤侧 (6-OHDA)较相对侧(对照)得到上调(各时间点n＝3，非配对学 生t检验，*p＜0.05)。
[0028]图10：该图显示了以盐水(WT：n＝7，KO n＝8) 和MPTP(各组n＝10)处理的WT和KO小鼠的黑质致密部(SNc)TH 神经元数量。
[0029]图11：该图显示了以盐水或MPTP处理的KO和 WT小鼠的纹状体多巴胺(DA)水平(ng/ml)。
[0030]图12：Western印迹显示了以0，1和5MOI表达 FL-Sp35的慢病毒转染后2天的COS-7细胞中Sp35和EGFR的表 达。
[0031]图13A-13B：图13A为凝胶，其显示了与对照相比 帕金森综合征患者(PD)的黑质中Sp35水平明显上升的半定量PCR 反应的结果。图13B显示了与对照相比帕金森综合征患者(PD)的黑 质中规格化的mRNA水平。
[0032]图14A-B：图14A为Western印迹，该印迹显示了 KO(-/-)和WT(+/+)小鼠(每组中n＝6)中多巴胺转运(DAT)水平。 图14B显示了WT和KO小鼠中的相对DAT水平。WT和KO小 鼠在DAT表达上没有显著区别(非配对学生t检验，p＞0.05)。
[0033]图15A-15C：图15A显示了在暴露至MPTP时与对 照相比Sp-35-Fc注射的小鼠的SNc中的TH神经元数量(*p＜0.05， n＝9)。图15B显示了在暴露至MPTP时与对照相比Sp35-Fc小鼠的 纹状体多巴胺水平(*p＜0.05，n＝9)。图15C显示了在暴露至MPTP 时与对照相比Sp35-Fc注射小鼠的纹状体MPP+水平。发明详述
定义
定义
[0034]除非另行说明，此处所用的技术和科学术语的含义等 同于本发明所属领域普通技术人员的普遍理解。在产生冲突的情况 下，将受本申请包括定义所支配。除非上下文另行指明，单数形式 的术语可包括复数形式，而复数形式的术语可包括单数形式。本说 明书中所涉及的所有出版物、专利和其它参考文献申请均以各种目 的全文引用作为参考，如同将每一个单独的出版物或专利申请均为 特定地单独的引用作为参考。
[0035]尽管其它与此处所述类似或等同的方法和材料也可用 于对本发明的实施或测试，下文描述了适用的方法和材料。该材料、 方法和事例仅作阐释目的，并非意在限制。从具体描述和权利要求 来看，本发明的其它特征和优势将显而易见。
[0036]为进一步明确本发明，提供了下列术语和定义。
[0037]应当注意术语“一个”或“一种”实体指一个或多个该种 实体；例如，一种“免疫球蛋白分子”应理解为代表一个或多个免疫 球蛋白分子。因此，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个”以及“至 少一个”在此处可进行互换。
[0039]此处所用的“治疗有效量”指按规定剂量并在必要时间 周期内其效果足以实现期望中的治疗结果的量。治疗结果可以是， 例如，症状的减轻、存活时间的延长、活动性的改善等等。治疗结 果不必要为“治愈”。
[0040]此处所用的术语“治疗”指向动物施用一种药剂以改善 或减轻疾病的症状。此外，术语“治疗”指向动物施用一种药剂以预 防疾病的发展。
[0041]此处所用的“预防有效量”指按规定剂量并在必要时间 周期内其效果足以实现期望中的预防结果的量。由于预防剂量通常 在疾病发生前或疾病早期施用，预防有效量将小于治疗有效量。
[0042]此处所用的“多聚核苷酸”可包含全长cDNA序列的核 苷酸序列，包括非翻译的5′和3′序列、编码序列、以及该核酸序列 的片段、表位、结构域以及变体。多聚核苷酸可由可以是未修饰 RNA或DNA或是修饰后的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或 多聚脱氧核苷酸组成。例如，多聚核苷酸可由单链和双链DNA、 由单链和双链区混合得到的DNA、单链和双链RNA以及由单链和 双链区混合得到的RNA、包含了可能是单链或者更典型为双链或单 链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子所组成。此外，该多 聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同时包含RNA和DNA的三 链区所组成。多聚核苷酸还可包含为稳定或为其它目的进行修饰的 一个或多个修饰碱基或者DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括， 例如，三苯甲基化碱基和异常碱基如肌苷。DNA和RNA可进行多 种修饰；因此，“多聚核苷酸”包括了化学、酶或代谢修饰的形式。
[0043]在本发明中，“多肽”可由通过肽键或修饰肽键(即， 肽等排物)结合的氨基酸组成，并可包含20个基因编码氨基酸以 外的氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸)。本发明的多肽可通过 翻译后作用等自然作用，或通过本领域公知的化学修饰技术进行修 饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以及大量的研究文献中有 具体的描述。修饰可在多肽的任何部分发生，包括肽骨架、氨基酸 侧链以及氨基或羧基末端。应当可以理解在给定多肽的多个位点可 相同或不同程度的出现相同类型的修饰。此外，一种给定多肽可包 含多种类型的修饰。多肽可因为泛素化的原因而带有分支，它们也 可呈带或不带分支的环状。环状、分支和带分支的环状多肽可通过 翻译后自然作用或合成方法形成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP- 核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、亚铁血红素部分的共价结合、 核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结 合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、形成二硫键、脱甲基、 共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、 gamma-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘处理、甲基化、豆 蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解作用、磷酸化、异戊烯化、 外消旋、硒化、硫酸盐化、如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白 添加氨基酸，泛素化。(例如，参见Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins， B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs 1-12(1983)； Seifter等人.，Meth Enzymo1182：626-646(1990)；Rattan等人.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
[0044]术语“片段”、“变体”、“衍生物”及“类似物”在指本发明 的Sp35拮抗剂时包括任何至少保留了部分抑制Sp35活性能力的拮 抗剂分子。只要该Sp35拮抗剂仍然能发挥功能，此处所述的Sp35 拮抗剂可不受限制地包括其片段、变体或衍生物。本发明的可溶性 Sp35多肽可包括Sp35水解片段、删除片段并特别包括传递至动物 时更容易到达作用位点的片段。多肽片段进一步包括包含了天然多 肽抗原性或免疫原性表位(包括线性和三维表位)的任意多肽部分。 本发明的可溶性Sp35多肽可包括变体Sp35区，包括如上所述的片 段，以及具有由氨基酸替换、缺失或插入所得的变更氨基酸序列的 多肽。变体可天然存在，例如等位基因变体。“等位基因”指占据了 有机体的染色体上给定位点的基因的副本。Genes II，Lewin，B.，ed.， John Wiley&Sons，New York(1985)。非天然存在的变体可通过本 领域已知的突变技术制备。可溶性Sp35多肽可包含保守或非保守 氨基酸替换、缺失或添加。本发明的Sp35拮抗剂还可包括衍生分 子。例如，本发明的可溶性Sp35多肽可包括经过变更后可显示出 未在天然多肽上发现的附加特性的Sp35区。其范例包括融合蛋白 和蛋白结合物。
[0045]在本发明中，“多肽片段”指Sp35多肽的短氨基酸序列。 蛋白片段可以是“独立式的”或是包含在更大的多肽中(该多肽片段 形成部分或域)。本发明的多肽片段的代表性范例包括，例如，包 含约5个氨基酸，约10个氨基酸，约15个氨基酸，约20个氨基 酸，约30个氨基酸，约40个氨基酸，约50个氨基酸，约60个氨 基酸，约70个氨基酸，约80个氨基酸，约90个氨基酸，以及约 100个氨基酸或长度更长的片段。
[0046]在特定的实施方式中，此处所述的方法中所用的Sp35 拮抗剂为“抗体”或“免疫球蛋白”分子，或是其免疫特异性的片段， 例如，天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或是与抗体分子以类似方 式结合抗原的工程改造的抗体分子或片段。术语“抗体”和“免疫球蛋 白”在此处可以替换使用。此外，本发明的方法中所用的免疫球蛋 白分子可也描述为“免疫特异性”或“抗原特异性”或“抗原结合”分子 并交替使用以指代抗体分子或其片段。一种抗体或免疫球蛋白至少 包含重链的可变区，并通常至少包含重链和轻链的可变区。脊椎动 物系统中的基本免疫球蛋白结构已得到较为充分的了解。例如，参 见Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)，在此引入作为参考。
[0047]如将在下文更加具体讨论的那样，术语“免疫球蛋白” 包含了能够以生化方式区分的五个大类的多肽。所有五个类别均明 确处于本发明范围之内，下述讨论将一般指向免疫球蛋白分子的 IgG分类。对于IgG，一个标准的免疫球蛋白分子包含了两个相同 的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽，以及两个相同的分子量为 53,000-70,000的重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”构型连 接，其中轻链自“Y的嘴部支持重链并持续至可变区域。”
[0048]轻链和重链均被划分为具有结构和功能同源性的区 域。术语“恒定”和“可变”具有功能性含义。就此而言，应当理解轻 (VL)和重(VH)链区的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻 链(CL)和重链(CH1，CH2or CH3)的恒定区则赋予了重要的生物功能， 例如分泌、经胎盘活动性、Fc受体结合、补体结合等。根据惯例恒 定区域越远离抗体的抗原结合位点或氨基酸末端，其数量越有所上 升。N末端区为可变区而C末端区为恒定区；CH3和CL区实际分 别包含了重链和轻链的羧基末端。
[0049]轻链分为kappa或lambda(κ，λ)。各重链分类均能与 kappa或lambda轻链的任意一种相结合。一般而言，轻链和重链彼 此共价连接，而两条重链的尾摂部以二硫键彼此共价连接或当免疫 球蛋白产自杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞时彼此非共 价连接。在重链中，氨基酸序列自Y构型叉端的N末端延续至各 链底部的C末端。本领域的技术人员均了解重链分为gamma，mu， alpha，delta，或epsilon，(γ，μ，α，δ，ε)，其中还有一些小类(例如， γ1-γ4)。由该链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG，IgM，IgA IgG 或IgE。免疫球蛋白小类(同型)如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1等均得 到了很好的区分并赋予了功能定位。熟练的技术人员能够轻易辨别 这些类别和同型的各修饰型，且它们均在本发明的范围之内。
[0050]如上文指出，可变区允许抗体选择性识别并特异性结 合抗原上的表位。即，抗体的VL区和VH区结合形成定义三维抗原 结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于Y上各臂末端的 抗原结合位点。更具体的说，该抗原结合位点可通过各VH和VL链 上的三个决定簇互补区(CDRs)定义。在一些情况下，例如对于源自 骆驼类或基于骆驼类免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子， 一个完整的免疫球蛋白分子可能仅由重链组成，而不含轻链。例如， 参见Hamers-Casterman等人.，Nature 363：446-448(1993)。
[0051]在自然存在的抗体中，各抗原结合区的六个“决定簇互 补区”或“CDRs”是当抗体在水环境中呈现三维构型时经特别定位形 成抗原结合区的非相邻的短序列。抗原结合区的剩余氨基酸称为 “框架”区，显示了较低的分子间可变性。框架区大体呈β-折叠构型， 而CDRs形成与β-折叠结构连接(在某些情况下形成其一部分)的 环形。因此，框架区通过链间非共价相互作用形成了支持CDRs以 正确方向定位的支架。由定位CDRs形成的抗原结合区定义了免疫 反应性抗原上的表位补体。该互补表面促进了抗体与其同源表位的 非共价结合。由于已有明确的描述，本领域的普通技术人员可简单 地在任何给定重或轻链可变区鉴别该种分别包含了CDRs和框架区 的氨基酸(参见，＂Sequences of Proteins of Immunological Interest，″ Kabat，E.，等人，U.S.Department of Health and Human Services， (1983)；以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol..，196：901-917(1987)，在 此全文引用作为参考)。
[0052]然而在骆驼类物种中，该重链可变区(称为VHH)形 成了完整的CDR。骆驼类VHH可变区和来自常规抗体(VH)的可变 区的主要区别包括(a)与VHH中的相应区域相比，VH的轻链接触表 面中具有更多的疏水氨基酸，(b)VHH中具有更长的CDR3，以及(c) VHH中的CDRl和CDR3之间二硫键出现的频率更高。
[0053]在一种实施方式中，本发明的方法中采用的抗原结合 分子包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施方式 中，本发明的方法中采用的抗原结合分子包含来自一种或多种抗体 分子的至少两个CDRs。在另一实施方式中，本发明的方法中采用 的抗原结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少三个CDRs。 在另一实施方式中，本发明的方法中采用的抗原结合分子包含来自 一种或多种抗体分子的至少四个CDRs。在另一实施方式中，本发 明的方法中采用的抗原结合分子包含来自一种或多种抗体分子的 至少五个CDRs。在另一实施方式中，本发明的方法中采用的抗原 结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少六个CDRs。示范性 的抗体分子至少包括一个可包含在主体抗原结合分子中的CDR，该 示范性分子在本领域已知并在此处得到描述。
[0054]本发明的方法中采用的抗体或其免疫特异性片段包 括，但不限于，多克隆，单克隆，多特异性，人源的，人源化的， 灵长动物源化的，或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段，如Fab， Fab＇和F(ab＇)2，Fd，Fvs，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接 Fvs(sdFv)，包含VL或VH区的片段，由Fab表达库制备的片段， 以及抗独特型(抗Id)抗体(例如，包括此处披露的结合分子的抗 Id抗体)。ScFv分子已为本领域所知，其描述参见US patent 5,892,019等。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分 子的任何形式(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(例如IgG1， IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或小类。
[0055]包括单链抗体在内的抗体片段可以仅单独包含可变 区，或是结合铰链区、重链的CH1、CH2和CH3区或是轻链的CL 的全部或部分。本发明还包括了同样包含可变区与铰链区，CH1， CH2，CH3或CL区任意组合的抗原结合片段。用于此处披露的方法 的抗体或其免疫特异性片段可来源于包括鸟类和哺乳动物在内的 任何动物。该抗体优选人，鼠，驴，兔，山羊，豚鼠，骆驼，羊驼， 马或鸡抗体。在另一实施例中，可变区可来自不同的来源(例如， 来自鲨鱼)。此处所用的人类摂抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基 酸序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白库或从表达一种或多种人 免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物中分离的抗体， 如下文描述，并可参见如Kucherlapati等人的U.S.Pat.No. 5,939,598。
[0056]此处所用的术语“重链部分”包括来自于免疫球蛋白重 链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽至少包含CH1区、铰链区(例 如，上、中和/或下铰链区)、CH2区、CH3区、或其变体或片段之 一。例如，重链部分可包括含有CH1区的多肽链；含有CH1区，至 少铰链区的一部分，以及CH2区的多肽链；含有CH1区和CH3区的 多肽链；含有CH1区，至少铰链区的一部分，以及CH3区的多肽链， 或含有CH1区，至少铰链区的一部分，CH2区以及CH3区的多肽链。 重链部分还可包括含有具有CH3区的多肽链的多肽。此外，本发明 中所采用的结合多肽可至少缺失CH2区的一部分(例如，CH2区的 全部或部分)。如上所述，本领域的普通技术人员应当可以理解这 些区域(例如，重链部分)可以进行修饰从而不同于天然存在的免 疫球蛋白分子中的氨基酸序列。
[0057]在此处披露的方法中采用的特定Sp35拮抗剂抗体或其 免疫特异性片段中，多聚体的一条多肽链中的重链部分与该多聚体 的其它多肽链的重链部分相同。此外，本发明的方法中采用的含重 链部分的单体并不相同。例如，各单体可包含不同的目标结合位点， 形成双特异性抗体等产物。
[0058]此处披露的方法中采用的结合多肽的重链部分可来自 于不同的免疫球蛋白分子。例如，一种多肽的重链部分可包含了来 自IgG1分子的CH1区和来自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中， 重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部分来自于IgG3分子的铰 链区。在另一实施例中，重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部 分来自于IgG4分子的嵌合铰链。
[0059]此处所用的术语“轻链部分”包括来自于免疫球蛋白轻 链的氨基酸序列。该轻链部分优选至少包含VL或CL区之一。
[0060]通过对免疫球蛋白的核苷酸序列引入一个或多个核苷 酸替代、添加或删除可生成编码免疫球蛋白多肽(例如，免疫球蛋 白重链区或轻链区)非天然变体的分离核酸分子，从而在编码蛋白 中引入一个或多个氨基酸替换、添加或删除。可通过定点突变和 PCR介导突变等标准技术引入突变。优选在一个或多个非必需氨基 酸残基上进行保守氨基酸替换。
[0061]此处披露的方法中采用的抗体或其免疫特异性片段还 可根据其对本发明多肽的结合亲和性进行描述或说明。优选的结合 亲和性包括解离常数或Kd小于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M， 5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M， 5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M， 10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M， 5×10-15M或10-15M的结合亲和性。
[0062]本文描述了在此披露的方法中采用作为Sp35拮抗剂的 抗体或其免疫特异性片段。例如，本发明的方法中采用的抗体作为 拮抗剂产生作用，阻断或抑制Sp35多肽的抑制活性。
[0063]此处所用的术语“嵌合抗体”将用于指代任何免疫反应 性区域或位点来自于一个种类而(根据本发明为完整的，部分的或 修饰的)恒定区来自于另一种类的抗体。在特定实施方式中，该目 标结合区域或位点来自于非人类来源(例如，小鼠或灵长动物)而 恒定区来自人类。
[0064]此处所用的术语“工程抗体”指一种重链和轻链中的一 个或全部可变区通过被来自已知特异性的抗体的一个或多个CDRs 至少部分替换，或在需要时通过部分框架区替换和序列更改所修饰 得到抗体。尽管CDRs可来自于与获得该框架区的抗体相同的类别 甚或小类，可设想CDRs将会来自于不同类别的抗体，并优先来自 于不同种类的抗体。将一个或多个来自于已知特异性的非人类抗体 的“供体”CDRs嫁接至人重链或轻链框架区的工程抗体在此称为“人 源化抗体”。无需将来自供体可变区的完整CDRs替换所有的CDRs 以将一个可变区的抗原结合能力转换至另一个。事实上仅需要转移 那些维持该目标结合位点活性所必需的残基。通过U.S.Pat.Nos. 5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,180,370等所给出的解释，本领 域的技术人员应当能够通过常规试验或试错法获取功能性的工程 或人源化抗体。
[0065]此处所用的术语“连接的”，“融合的”或“融合”可相互替 换。这些术语指通过化学连接或重组技术等任何方法连接两个或多 个元素或成分。“框内融合”指以能够维持原始开放阅读框架(ORFs) 的正确阅读框的方式连接两个或多个ORFs以形成一个更长的连续 ORF。因此，所得重组融合蛋白是一种含有两个或更多与原始ORFs 所编码的多肽相应的片段的单独蛋白(在天然状态下，该片段一般 不进行该种连接)。尽管该阅读框架在融合片段中彼此连续，该片 段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。
[0066]在有关多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”指多肽中 的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列内彼此相邻的残 基在多肽的一级结构内邻近。
[0067]此处所用的术语“表达”指一种工艺过程，通过该过程 基因可生产RNA或多肽等生化物质。该过程包括细胞内任何该基 因的功能存在的显现，包括但不限于，基因敲除以及瞬时表达和稳 定表达。它包括但不限于将基因转录为信使RNA(mRNA)，转移 RNA(tRNA)，小发夹RNA(shRNA)，小干扰RNA(siRNA)或任何其 它RNA产物，以及将mRNA翻译为多肽。如果该最终产物是生化 产物，则表达包括了该生化产物和任何前体的生成。
[0068]“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需 要进行诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳 动物对象包括，但不限于，人类，驯养动物，畜牧动物以及动物园 区动物，运动型动物，宠物动物，例如狗，猫，豚鼠，兔子，大鼠， 小鼠，马，牛，母牛等；灵长类动物，例如类人猿、猴、猩猩以及 黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫，狮以及虎；马科 动物，如马，驴以及斑马；食用动物，如牛，猪以及羊；有蹄动物， 如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠，大鼠，仓鼠以及豚鼠等。在特 定的实施方式中，该哺乳动物为人类对象。
[0069]术语“RNA干扰”或“RNAi”指通过siRNAs来沉默或减 少基因表达。双相区对沉默基因序列具有同源性的siRNA启动了动 物和植物的序列特异性，转录后基因沉默过程。该基因可以是该有 机体的内源或外源基因，整合于染色体或存在于未整合入基因组的 转染载体。该基因的表达被完全或部分抑制。也有人认为RNAi可 抑制靶RNA的功能；该靶RNA的功能可以是完全或部分的。Sp35(LINGO-1/LRRN6)
[0070]本发明基于以下发现：Sp35拮抗剂促进DA神经元的 神经突生长和存活。天然存在的人源Sp35为由614个氨基酸(SEQ ID NO：2)组成的糖基化的神经系统特异性蛋白。人源Sp35多肽包 含了一种由14个富亮氨酸重复序列(包括N和C末端帽子)，Ig 区，跨膜区以及细胞质区组成的LRR区。该细胞质区包含了一个 规范的酪氨酸磷酸化位点。此外，该天然存在的Sp35蛋白包含了 信号序列，介于LRRCT和Ig区的短碱性区，以及介于Ig区和细胞 质区的跨膜区。该人源Sp35基因包含了替代的翻译起始密码子， 因此Sp35信号序列的N末端可能存在或不存在六个附加氨基酸 (MQVSKR；SEQ ID NO：3)。表1根据SEQ ID NO：2的序列并参照 氨基酸残基数列出的Sp35区或其它区。表1
区域 起始残基 终止残基 信号序列 1 33或35 LRRNT 34或36 64 LRR 66 89 LRR 90 113 LRR 114 137 LRR 138 161
LRR 162 185 LRR 186 209 LRR 210 233 LRR 234 257 LRR 258 281 LRR 282 305 LRR 306 329 LRR 330 353 LRRCT 363 414或416 碱性 415或417 424 Ig 419 493 连接序列 494 551 跨膜 552 576 细胞质 577 614
区域 起始残基 终止残基 信号序列 1 33或35 LRRNT 34或36 64 LRR 66 89 LRR 90 113 LRR 114 137 LRR 138 161
LRR 162 185 LRR 186 209 LRR 210 233 LRR 234 257 LRR 258 281 LRR 282 305 LRR 306 329 LRR 330 353 LRRCT 363 414或416 碱性 415或417 424 Ig 419 493 连接序列 494 551 跨膜 552 576 细胞质 577 614
[0071]Sp35在人和大鼠中的组织分布和发育表达已得到研 究。Sp35生物学已在实验动物(大鼠)模型中进行研究。经northern 印迹和免疫组化染色测定，大鼠Sp35的表达定位于神经系统神经 元和脑少突细胞。大鼠Sp35mRNA表达水平受发育调节，在出生 后的短时间内(即，约出生后第一日)达到峰值。在大鼠脊髓横切 损伤模型中，经RT-PCR检测，Sp35在损伤位点被上调。此外， 据显示Sp35与Nogo66受体(Nogo受体)相互作用。例如，参见， 国际专利申请号PCT/US2004/00832，PCT公布号WO2004/08564。
[0072]Sp35(LINGO-1)是Nogo受体-1-75神经营养因子受体 复合物的附加成分。参见Mi等人，Nat Neurosci.7：221-228(2004)， 在此引入作为参考。与Nogo受体1不同，Sp35基因表达在脊髓中 的成熟神经细胞暴露至外伤时上升，这意味着Sp35对CNS神经功 能具有重要的生物作用。同上。
[0073]全长Sp35分子的核苷酸序列如下：ATGCTGGCGGGGGGCGTGAGGAGCATGCCCAGCCCCCTCCTGGCCTGCTGGCAGCCCATCCTCCTGCTGGTG
CTGGGCTCAGTGCTGTCAGGCTCGGCCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGTGCTCCGCCCAGGACCGCGCT
GTGCTGTGCCACCGCAAGCGCTTTGTGGCAGTCCCCGAGGGCATCCCCACCGAGACGCGCCTGCTGGACCTA
GGCAAGAACCGCATCAAAACGCTCAACCAGGACGAGTTCGCCAGCTTCCCGCACCTGGAGGAGCTGGAGCTC
AACGAGAACATCGTGAGCGCCGTGGAGCCCGGCGCCTTCAACAACCTCTTCAACCTCCGGACGCTGGGTCTC
CGCAGCAACCGCCTGAAGCTCATCCCGCTAGGCGTCTTCACTGGCCTCAGCAACCTGACCAAGCTGGACATC
AGCGAGAACAAGATTGTTATCCTGCTGGACTACATGTTTCAGGACCTGTACAACCTCAAGTCACTGGAGGTT
GGCGACAATGACCTCGTCTACATCTCTCACCGCGCCTTCAGCGGCCTCAACAGCCTGGAGCAGCTGACGCTG
GAGAAATGCAACCTGACCTCCATCCCCACCGAGGCGCTGTCCCACCTGCACGGCCTCATCGTCCTGAGGCTC
CGGCACCTCAACATCAATGCCATCCGGGACTACTCCTTCAAGAGGCTCTACCGACTCAAGGTCTTGGAGATC
TCCCACTGGCCCTACTTGGACACCATGACACCCAACTGCCTCTACGGCCTCAACCTGACGTCCCTGTCCATC
ACACACTGCAATCTGACCGCTGTGCCCTACCTGGCCGTCCGCCACCTAGTCTATCTCCGCTTCCTCAACCTC
TCCTACAACCCCATCAGCACCATTGAGGGCTCCATGTTGCATGAGCTGCTCCGGCTGCAGGAGATCCAGCTG
GTGGGCGGGCAGCTGGCCGTGGTGGAGCCCTATGCCTTCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTCAATGTC
TCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGGAATCAGTCTTCCACTCGGTGGGCAACCTGGAGACACTCATCCTG
GACTCCAACCCGCTGGCCTGCGACTGTCGGCTCCTGTGGGTGTTCCGGCGCCGCTGGCGGCTCAACTTCAAC
CGGCAGCAGCCCACGTGCGCCACGCCCGAGTTTGTCCAGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTGATGTGCTA
CTGCCCAACTACTTCACCTGCCGCCGCGCCCGCATCCGGGACCGCAAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAG
GGCCACACGGTGCAGTTTGTGTGCCGGGCCGATGGCGACCCGCCGCCCGCCATCCTCTGGCTCTCACCCCGA
AAGCACCTGGTCTCAGCCAAGAGCAATGGGCGGCTCACAGTCTTCCCTGATGGCACGCTGGAGGTGCGCTAC
GCCCAGGTACAGGACAACGGCACGTACCTGTGCATCGCGGCCAACGCGGGCGGCAACGACTCCATGCCCGCC
CACCTGCATGTGCGCAGCTACTCGCCCGACTGGCCCCATCAGCCCAACAAGACCTTCGCTTTCATCTCCAAC
CAGCCGGGCGAGGGAGAGGCCAACAGCACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCCTTCGACATCAAGACCCTCATC
ATCGCCACCACCATGGGCTTCATCTCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCCTGGTGCTGCTGTTTCTCTGG
AGCCGGGGCAAGGGCAACACAAAGCACAACATCGAGATCGAGTATGTGCCCCGAAAGTCGGACGCAGGCATC
AGCTCCGCCGACGCGCCCCGCAAGTTCAACATGAAGATGATATGA(SEQ ID NO：1).
CTGGGCTCAGTGCTGTCAGGCTCGGCCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGTGCTCCGCCCAGGACCGCGCT
GTGCTGTGCCACCGCAAGCGCTTTGTGGCAGTCCCCGAGGGCATCCCCACCGAGACGCGCCTGCTGGACCTA
GGCAAGAACCGCATCAAAACGCTCAACCAGGACGAGTTCGCCAGCTTCCCGCACCTGGAGGAGCTGGAGCTC
AACGAGAACATCGTGAGCGCCGTGGAGCCCGGCGCCTTCAACAACCTCTTCAACCTCCGGACGCTGGGTCTC
CGCAGCAACCGCCTGAAGCTCATCCCGCTAGGCGTCTTCACTGGCCTCAGCAACCTGACCAAGCTGGACATC
AGCGAGAACAAGATTGTTATCCTGCTGGACTACATGTTTCAGGACCTGTACAACCTCAAGTCACTGGAGGTT
GGCGACAATGACCTCGTCTACATCTCTCACCGCGCCTTCAGCGGCCTCAACAGCCTGGAGCAGCTGACGCTG
GAGAAATGCAACCTGACCTCCATCCCCACCGAGGCGCTGTCCCACCTGCACGGCCTCATCGTCCTGAGGCTC
CGGCACCTCAACATCAATGCCATCCGGGACTACTCCTTCAAGAGGCTCTACCGACTCAAGGTCTTGGAGATC
TCCCACTGGCCCTACTTGGACACCATGACACCCAACTGCCTCTACGGCCTCAACCTGACGTCCCTGTCCATC
ACACACTGCAATCTGACCGCTGTGCCCTACCTGGCCGTCCGCCACCTAGTCTATCTCCGCTTCCTCAACCTC
TCCTACAACCCCATCAGCACCATTGAGGGCTCCATGTTGCATGAGCTGCTCCGGCTGCAGGAGATCCAGCTG
GTGGGCGGGCAGCTGGCCGTGGTGGAGCCCTATGCCTTCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTCAATGTC
TCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGGAATCAGTCTTCCACTCGGTGGGCAACCTGGAGACACTCATCCTG
GACTCCAACCCGCTGGCCTGCGACTGTCGGCTCCTGTGGGTGTTCCGGCGCCGCTGGCGGCTCAACTTCAAC
CGGCAGCAGCCCACGTGCGCCACGCCCGAGTTTGTCCAGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTGATGTGCTA
CTGCCCAACTACTTCACCTGCCGCCGCGCCCGCATCCGGGACCGCAAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAG
GGCCACACGGTGCAGTTTGTGTGCCGGGCCGATGGCGACCCGCCGCCCGCCATCCTCTGGCTCTCACCCCGA
AAGCACCTGGTCTCAGCCAAGAGCAATGGGCGGCTCACAGTCTTCCCTGATGGCACGCTGGAGGTGCGCTAC
GCCCAGGTACAGGACAACGGCACGTACCTGTGCATCGCGGCCAACGCGGGCGGCAACGACTCCATGCCCGCC
CACCTGCATGTGCGCAGCTACTCGCCCGACTGGCCCCATCAGCCCAACAAGACCTTCGCTTTCATCTCCAAC
CAGCCGGGCGAGGGAGAGGCCAACAGCACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCCTTCGACATCAAGACCCTCATC
ATCGCCACCACCATGGGCTTCATCTCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCCTGGTGCTGCTGTTTCTCTGG
AGCCGGGGCAAGGGCAACACAAAGCACAACATCGAGATCGAGTATGTGCCCCGAAAGTCGGACGCAGGCATC
AGCTCCGCCGACGCGCCCCGCAAGTTCAACATGAAGATGATATGA(SEQ ID NO：1).
[0074]全长Sp35多肽的多肽序列如下：MLAGGVRSMPSPLLACWQPILLLVLGSVLSGSATGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDL
GKNRIKTLNQDEFASFPHLEELELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLIPLGVFTGLSNLTKLDI
SENKIVILLDYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIVLRL
RHLNINAIRDYSFKRLYRLKVLEISHWPYLDTMTPNCLYGLNLTSLSITHCNLTAVPYLAVRHLVYLRFLNL
SYNPISTIEGSMLHELLRLQEIQLVGGQLAVVEPYAFRGLNYLRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLIL
DSNPLACDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATPEFVQGKEFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDE
GHTVQFVCRADGDPPPAILWLSPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPA
HLHVRSYSPDWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKTLIIATTMGFISFLGVVLFCLVLLFLW
SRGKGNTKHNIEIEYVPRKSDAGISSADAPRKFNMKMI(SEQ ID NO：2).
GKNRIKTLNQDEFASFPHLEELELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLIPLGVFTGLSNLTKLDI
SENKIVILLDYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIVLRL
RHLNINAIRDYSFKRLYRLKVLEISHWPYLDTMTPNCLYGLNLTSLSITHCNLTAVPYLAVRHLVYLRFLNL
SYNPISTIEGSMLHELLRLQEIQLVGGQLAVVEPYAFRGLNYLRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLIL
DSNPLACDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATPEFVQGKEFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDE
GHTVQFVCRADGDPPPAILWLSPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPA
HLHVRSYSPDWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKTLIIATTMGFISFLGVVLFCLVLLFLW
SRGKGNTKHNIEIEYVPRKSDAGISSADAPRKFNMKMI(SEQ ID NO：2).
[0075]Sp35拮抗剂的使用方法
[0076]本发明的一个实施方式提供了促进多巴胺能(DA)神经 元的再生、生长或存活的方法，其包括将DA神经元与有效量的Sp35 拮抗剂或包含Sp35拮抗剂的组合物相接触，其中该Sp35拮抗剂选 自由可溶性Sp35多肽、Sp35抗体、Sp35拮抗剂多聚核苷酸、Sp35 适体以及两种或多种所述Sp35拮抗剂构成的组合。用于实施本发 明的各种示范性Sp35拮抗剂以及获取这些分子的方法和材料已在 下文予以描述并且/或者可参见，例如，国际专利申请号 PCT/US2004/008323，PCT公布号WO2004/085648，其全文在此引 用作为参考。可用于本发明的Sp35受体拮抗剂包括，例如，在 PCT/US2005/022881，PCT公布号WO2006/002437(其全文在此引 用作为参考)中描述的Sp35受体拮抗剂。
[0077]本发明的附加实施方式提供了在患有与DA神经元变 性或死亡相关的疾病、紊乱或损伤(例如，帕金森氏病)的动物(例 如，哺乳动物)中治疗该种疾病的方法，该方法包括或主要包括向 有此需要的动物施用治疗有效量的Sp35拮抗剂，该Sp35拮抗剂选 自由可溶性Sp35多肽、Sp35抗体、Sp35拮抗剂多聚核苷酸、Sp35 适体以及两种或多种所述Sp35拮抗剂构成的组合。
[0078]本发明的进一步实施方式包括促进DA神经元再生、 生长或存活以治疗与DA神经元死亡相关的疾病、紊乱或损伤的方 法，其包括在疾病、紊乱或损伤的位点或是该位点附近向哺乳动物 施用其数量足以减少对DA神经元再生、生长或存活的抑制的Sp35 拮抗剂。
[0079]在本发明的方法中，Sp35拮抗剂可通过直接施用可溶 性Sp35多肽、Sp35抗体、Sp35拮抗剂多聚核苷酸、Sp35适体或 其组合向患者施用。替代性地，Sp35拮抗剂可通过生产特异性Sp35 拮抗剂的表达载体进行施用。在本发明的特定实施方式中，在治疗 方法中施用Sp35拮抗剂的方法包括：(1)转化或转染具有表达Sp35 拮抗剂的核酸(例如，载体)的可移植宿主细胞；以及(2)将转化宿 主细胞在疾病、紊乱或损伤的位点移植进入哺乳动物。例如，该转 化宿主细胞可在多巴胺神经元来源(例如中脑)的特定感染位点或 其连接靶标(例如壳核、尾、皮层、苍白球或丘脑底核)进行移植。 在本发明的一些实施方式中，该可移植宿主细胞被取出哺乳动物， 临时培养，以编码Sp35拮抗剂的分离核酸转化或转染，并重新移 植进入原同一哺乳动物。该细胞可以是(但不要求)从其移植的同 一位点取出。该类实施方式(有时被称为活体外基因治疗)可于短 时间内在作用位点提供连续的Sp35拮抗剂。
[0080]可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或紊乱包括与 DA神经元死亡、变性或是缺乏再生或分化相关的疾病、紊乱或损 伤。该种疾病包括，但不限于，帕金森氏病(PD)，多系统萎缩，纹 状体黑质变性，橄榄脑桥小脑萎缩，Shy-Drager综合症，具有帕金 森特征的运动神经元疾病，路易体痴呆，进行性核上性麻痹，皮质 基底神经节变性，额颞叶痴呆，具有帕金森病征的阿尔茨海默病， Wilson病，Hallervordern-Spatz病，Chediak-Hagashi病，SCA-3脊 髓小脑性共济失调，X-连锁的肌张力障碍-帕金森综合征(DYT3)， 亨廷顿舞蹈病(Westphal变体)，朊蛋白病，Jacob-Creutzfeldt病 (CJD)，血管性帕金森综合征，脑性瘫痪，重复头部外伤，脑炎后 帕金森综合症，神经系梅毒和精神分裂症。
[0081]此处披露的方法采用的Sp35拮抗剂(例如，可溶性 Sp35多肽、Sp35抗体、Sp35拮抗剂多聚核苷酸或Sp35适体)可 作为阻止、减少、预防或抑制Sp35负向调节DA神经突生长、存 活或再生的能力的治疗剂进行制备和使用。可溶性Sp35多肽
[0082]本发明的方法采用的Sp35拮抗剂包括能阻断、抑制或 干扰天然存在Sp35的生物功能的多肽。特别地，本发明的可溶性 Sp35多肽包括可溶性Sp35多肽的片段、变体或其衍生物。上文表 1描述了Sp35多肽的各个区域。可溶性Sp35多肽缺失Sp35多肽 的跨膜区并通常缺失胞内区例如，特定的可溶性Sp35多肽缺失包 含了Sp35的跨膜区的氨基酸552-576和/或缺失包含了Sp35胞内区 的氨基酸577-614。此外，特定可溶性Sp35多肽包含了Sp35多肽 的LRR区、Ig区、碱性区和/或完整胞外区(对应SEQ ID NO：2的 氨基酸34至532)。本领域的技术人员可以理解完整的Sp35胞外 区可包括存在于胞外区多肽的C末端或N末端中的附加的或更少的 氨基酸。因此，本发明的方法中采用的可溶性Sp35多肽包括，但 不限于，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：2的41-525，SEQ ID NO：2的40-526，SEQ ID NO：2的39-527，SEQ ID NO：2的38-528， SEQ ID NO：2的37-529，SEQ ID NO：2的36-530，SEQ ID NO：2的 35-531，SEQ ID NO：2的34-531，SEQ ID NO：2的46-520，SEQ ID NO：2的45-521，SEQ ID NO：2的44-522，SEQ ID NO：2的43-523 以及SEQ ID NO：2的42-524的Sp35多肽，或该多肽的片段、变体 或衍生物。Sp35多肽拮抗剂可包括表1所述的区域的任意组合。
[0083]本发明的方法采用的其它可溶性Sp35多肽包括，但不 限于，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：2的1-33；SEQ ID NO：2 的1-35；SEQ ID NO：2的34-64；SEQ ID NO：2的36-64；SEQ ID NO：2 的66-89；SEQ ID NO：2的90-113；SEQ ID NO：2的114-137；SEQ ID NO：2的138-161；SEQ ID NO：2的162-185；SEQ ID NO：2的 186-209；SEQ ID NO：2的210-233；SEQ ID NO：2的234-257；SEQ ID NO：2的258-281；SEQ ID NO：2的282-305；SEQ ID NO：2的 306-329；SEQ ID NO：2的330-353；SEQ ID NO：2的363-416；SEQ ID NO：2的417-424；SEQ ID NO：2的419-493；以及Q ID NO：2的 494-551的Sp35多肽，或该多肽的片段、变体或衍生物。
[0084]本发明的方法中采用的可溶性Sp35多肽进一步包括， 但不限于，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：2的1-33；SEQ ID NO：2的1-35；SEQ ID NO：2的1-64；SEQ ID NO：2的1-89；SEQ ID NO：2的1-113；SEQ ID NO：2的1-137；SEQ ID NO：2的1-161；SEQ ID NO：2的1-185；SEQ ID NO：2的1-209；SEQ ID NO：2的1-233； SEQ ID NO：2的1-257；SEQ ID NO：2的1-281；SEQ ID NO：2的 1-305；SEQ ID NO：2的1-329；SEQ ID NO：2的1-353；SEQ ID NO：2 的1-416；SEQ ID NO：2的1-424；SEQ ID NO：2的1-493；SEQ ID NO：2的1-551；SEQ ID NO：2的1-531和SEQ ID NO：2的1-532的 Sp35多肽，或该多肽的片段、变体或衍生物。
[0085]本发明的方法中采用的可溶性Sp35多肽更进一步包 括，但不限于，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：2的34-64；SEQ ID NO：2的34-89；SEQ ID NO：2的34-113；SEQ ID NO：2的34-137； SEQ ID NO：2的34-161；SEQ ID NO：2的34-185；SEQ ID NO：2的 34-209；SEQ ID NO：2的34-233；SEQ ID NO：2的34-257；SEQ ID NO：2的34-281；SEQ ID NO：2的34-305；SEQ ID NO：2的34-329； SEQ ID NO：2的34-353；SEQ ID NO：2的34-416；SEQ ID NO：2的 34-424；SEQ ID NO：2的34-493以及SEQ ID NO：2的34-551的Sp35 多肽，或该多肽的片段、变体或衍生物。
[0086]本发明的方法中采用的可溶性Sp35多肽更进一步包 括，但不限于，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：2的34-530；SEQ ID NO：2的34-531；SEQ ID NO：2的34-532；SEQ ID NO：2的34-533； SEQ ID NO：2的34-534；SEQ ID NO：2的34-535；SEQ ID NO：2的 34-536；SEQ ID NO：2的34-537；SEQ ID NO：2的34-538；SEQ ID NO：2的34-539；SEQ ID NO：2的30-532；SEQ ID NO：2的31-532； SEQ ID NO：2的32-532；SEQ ID NO：2的33-532；SEQ ID NO：2的 34-532；SEQ ID NO：2的35-532；SEQ ID NO：2的36-532；SEQ ID NO：2的30-531；SEQ ID NO：2的31-531；SEQ ID NO：2的32-531； SEQ ID NO：2的33-531；SEQ ID NO：2的34-531；SEQ ID NO：2的 35-531以及SEQ ID NO：2的36-531的Sp35多肽，或该多肽的片段， 变体或衍生物。
[0087]本发明的方法中采用的可溶性Sp35多肽更进一步包 括，但不限于，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：36的36-64；SEQ ID NO：2的36-89；SEQ ID NO：2的36-113；SEQ ID NO：2的36-137； SEQ ID NO：2的36-161；SEQ ID NO：2的36-185；SEQ ID NO：2的 36-209；SEQ ID NO：2的36-233；SEQ ID NO：2的36-257；SEQ ID NO：2的36-281；SEQ ID NO：2的36-305；SEQ ID NO：2的36-329； SEQ ID NO：2的36-353；SEQ ID NO：2的36-416；SEQ ID NO：36 的34-424；SEQ ID NO：2的34-493以及SEQ ID NO：2的36-551， 的Sp35多肽，或该多肽的片段、变体或衍生物。
[0088]可用于本发明的方法的其它可溶性Sp35多肽包括，但 不限于，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：2的36-530；SEQ ID NO：2的36-531；SEQ ID NO：2的36-532；SEQ ID NO：2的36-533； SEQ ID NO：2的36-534；SEQ ID NO：2的36-535；SEQ ID NO：2的 36-536；SEQ ID NO：2的36-537；SEQ ID NO：2的36-538；SEQ ID NO：2的36-539的Sp35多肽，或该多肽的片段、变体或衍生物。
[0089]其它的可溶性Sp35多肽，其片段、变体或衍生物包括 包含了Sp35的Ig区的多肽。例如，包含或主要包含氨基酸SEQ ID NO：2的417-493；SEQ ID NO：2的417-494；SEQ ID NO：2的417-495； SEQ ID NO：2的417-496；SEQ ID NO：2的417-497；SEQ ID NO：2 的417-498；SEQ ID NO：2的417-499；SEQ ID NO：2的417-500； SEQ ID NO：2的417-492；SEQ ID NO：2的417-491；SEQ ID NO：2 的412-493；SEQ ID NO：2的413-493；SEQ ID NO：2的414-493； SEQ ID NO：2的415-493；SEQ ID NO：2的416-493；SEQ ID NO：2 的411-493；SEQ ID NO：2的410-493；SEQ ID NO：2的410-494； SEQ ID NO：2的411-494；SEQ ID NO：2的412-494；SEQ ID NO：2 的413-494；SEQ ID NO：2的414-494；SEQ ID NO：2的415-494； SEQ ID NO：2的416-494；SEQ ID NO：2的417-494；以及SEQ ID NO：2的418-494的Sp35多肽，或该多肽的片段、变体或衍生物。
[0090]用于实施本发明的各种示范性可溶性Sp35多肽以及获 取这些分子的方法和材料已在下文描述并且/或者可参见，例如，国 际专利申请号PCT/US2004/008323，PCT公布号WO2004/085648， 其全文在此引用作为参考。
[0091]在此描述的本发明方法采用的可溶性Sp35多肽可以呈 环状。可溶性Sp35多肽的环化减少了线性肽的构型自由度并形成 了更具结构约束性的分子。本领域已知多种肽环化方法，例如，通 过肽的N末端和C末端氨基酸残基之间的氨键的形成进行“骨架至 骨架”环化。“骨架至骨架”环化法包括在两个ω-硫氨基酸残基(例 如，半胱氨酸，高半胱氨酸)之间二硫桥的形成。本发明的特定可 溶性Sp35肽包括在肽的N和C末端进行修饰以形成环状Sp35多 肽。该种修饰包括，但不限于，半胱氨酸残基、乙酰化半胱氨酸残 基、具有NH2部分和生物素的半胱氨酸残基。肽环化的其它方法 可参见Li及Roller.Curr.Top.Med.Chem.3：325-341(2002)，其全文 在此引用作为参考。
[0092]此处描述的可溶性Sp35多肽可进行多种改造，例如替 换、插入或删除。例如，替换可包括，但不限于以下替换：将SEQ ID NO：2的Sp35多肽6号位置上的缬氨酸替换为甲硫氨酸；将SEQ ID NO：2的Sp35多肽294号位置上的丝氨酸替换为甘氨酸；将SEQ ID NO：2的Sp35多肽348号位置上的缬氨酸替换为丙氨酸；将SEQ ID NO：2的Sp35多肽419号位置上的精氨酸替换为组氨酸；将SEQ ID NO：2的Sp35多肽456号位置上的精氨酸替换为谷氨酸；以及将 SEQ ID NO：2的Sp35多肽458号位置上的精氨酸替换为缬氨酸。
[0093]还预期包括与此处所述的SEQ ID NO：2的多肽至少具 有70％，75％，80％，85％，90％或95％一致性的可溶性Sp35多 肽的相应片段。
[0094]如本领域所知，两个多肽之间的“序列一致性”可通过 将一个多肽的氨基酸序列与另一个多肽的序列比较得到。此处讨论 的任何特定多肽与另一多肽是否具有至少约70％，75％，80％，85％， 90％或95％的一致性可通过本领域已知的方法和计算机程序/软件 进行测定，例如，但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8for Unix，Genetics Computer Group， University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)。 BESTFIT采用了应用数学进展(Advances in Applied Mathematics) 2：482-489(1981)中Smith和Waterman的局部同源性算法以发现两 个序列间的最佳同源性片段。在采用BESTFIT或任何其它序列比 对程序测定一个特定序列与本发明所述的参考序列是否具有如95 ％的一致性时，该参数当然会设定为对参考多肽序列的全长计算相 似度百分比且允许最大同源性差距为参考序列中总氨基酸数的5 ％。
[0095]本发明的方法采用的可溶性Sp35多肽可包括两种或多 种可溶性Sp35多肽的任意组合。抗体或其抗原结合片段
[0096]在一个实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮抗 剂为抗体分子，或其免疫特异性片段。除非特别注明，此处所用的 抗体的“片段”指免疫特异性片段，即，抗原特异性片段。在一个实 施方式中，本发明的方法中采用的抗体为双特异性结合分子、结合 多肽或抗体，例如对超过一个表位(例如，一个以上抗原或在相同 抗原中的一个以上表位)具有结合特异性的双特异性抗体、微抗体、 区域缺失抗体或融合蛋白。在一个实施方式中，双特异性抗体至少 具有一个特异性针对Sp35上至少一个表位的结合区。双特异性抗 体可以是具有两个特异性针对Sp35表位的目标结合区和两个针对 其它目标的目标结合区的四价抗体。因此，四价双特异性抗体可以 对各特异性为双价。
[0097]本发明的方法中采用的Sp35拮抗剂还包括作为Sp35 活性拮抗剂的Sp35特异性抗体或抗原结合片段、变体或衍生物。 例如，特定Sp35抗体与DA神经元上表达的Sp35的结合可阻断对 DA神经突生长、分化和存活的抑制。
[0098]此处所述的方法中采用的特定拮抗剂抗体特异性或优 先结合特定的Sp35多肽片段或区域。该Sp35多肽片段包括，但不 限于，包含或主要包含SEQ ID NO：2的氨基酸34-532；34-417， 34-425，34-493，66-532，66-417(LRR区)，66-426，66-493，66-532， 417-532，417-425(Sp35碱性区)，417-424(Sp35碱性区)，417-493， 417-532，419-493(Sp35Ig区)，或425-532的Sp35多肽；或与SEQ ID NO：2的氨基酸34-532；34-417；34-425；34-493；66-532；66-417； 66-426；66-493；66-532；417-532；417-425(Sp35碱性区)；417-493； 417-532；419-493(Sp35Ig区)或425-532至少有70％，75％，80％， 85％，90％或95％的一致性的Sp35变体多肽。
[0099]本发明的方法中采用的针对特定Sp35特异性抗体或其 抗原结合片段、变体或衍生物的附加Sp35肽片段包括，但不限于， 包含或主要包含Sp35的一个或多个富亮氨酸重复序列(LRR)的片 段。该片段的范例包括，包含或主要包含SEQ ID NO：2的氨基酸 66-89；66-113；66-137；90-113；114-137；138-161；162-185；186-209； 210-233；234-257；258-281；282-305；306-329或330-353的片段。还 预期包括与SEQ ID NO：2的氨基酸66-89；66-113；90-113；114-137； 138-161；162-185；186-209；210-233；234-257；258-281；282-305； 306-329或330-353至少具有70％，75％，80％，85％，90％或95％一致 性的变体Sp35多肽的相应片段。
[0100]与本发明的特定抗体或其抗原结合片段、变体或衍生 物相结合的附加Sp35肽片段包括，但不限于，包含或主要包含Sp35 的LRR侧翼的一个或多个富半胱氨酸区的片段。该种片段包括， 例如，包含或主要包含SEQ ID NO：2的氨基酸34-64(N末端LRR 侧翼区(LRRNT))的片段，或是包含或主要包含SEQ ID NO：2的氨 基酸363-416(C末端LRR侧翼区(LRRCT))的片段。还预期包括 与SEQ ID NO：2的氨基酸34-64和363-416至少具有70％，75％，80％， 85％，90％或95％一致性的变体Sp35多肽的相应片段。
[0101]在其它实施方式中，此处所述的方法采用的Sp35拮抗 剂包括特异性或优先结合Sp35的至少一个表位的抗体，或其抗原 结合片段、变体或衍生物，其中该表位包含或主要包含至少四至五 个SEQ ID NO：2，至少七个，至少九个，或介于至少约15至约30 个氨基酸。所述的SEQ ID NO：2的给定表位的氨基酸可以是(但并 非必需是)邻近或线性的。在特定的实施方式中，Sp35的至少一个 表位包含或主要包含在细胞表面表达的或作为可溶性片段的Sp35 胞外区形成的(例如，融合至IgG Fc区)非线性表位。因此，在特 定的实施方式中，Sp35的至少一个表位包含或主要包含SEQ ID NO：2的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个， 至少9个，至少10个，至少20个，至少25个，介于至少约15至 约30个，或至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60， 65，70，75，80，85，90，95或100个邻近或非邻近氨基酸，其中 非邻近氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
[0102]在其他实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮抗 剂包括特异性或优先结合Sp35至少一个表位的Sp35抗体，或其抗 原结合片段、变体或衍生物，其中该表位在上述SEQ ID NO：2的一 个，两个，三个，四个，五个，六个或更多个邻近或非邻近氨基酸 的基础上包含或主要包含修饰蛋白的附加部分(例如，可包括糖部 分，从而使Sp35抗体能够对修饰目标蛋白以高于未修饰蛋白的亲 和性进行结合)。替代性地，该Sp35抗体完全不与未经修饰的该 目标蛋白相结合。
[0103]在特定的实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮 抗剂包括如下的本发明的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物： 特异性结合Sp35至少一个表位的(即，与不相关的或随机表位相 比更轻易地与该表位结合)；优先结合上述Sp35或片段或变体的 至少一个表位(即，与不相关的，相近的，同源的，或类似表位相 比更轻易地与该表位结合)；竞争性抑制本身与上述Sp35或片段 或变体的特定表位结合的参考抗体的结合；或以解离常数KD小于 约5×10-2M，约10-2M，约5×10-3M，约10-3M，约5×10-4M， 约10-4M，约5×10-5M，约10-5M，约5×10-6M，约10-6M，约5 ×10-7M，约10-7M，约5×10-8M，约10-8M，约5×10-9M，约10-9 M，约5×10-10M，约10-10M，约5×10-11M，约10-11M，约5×10-12 M，约10-12M，约5×10-13M，约10-13M，约5×10-14M，约10-14 M，约5×10-15M，约10-15M表征的亲和性结合上述Sp35或片段 或变体的至少一个表位。在一个特定的方面，该抗体或其片段相对 鼠Sp35多肽或其片段优先结合人Sp35多肽或其片段。
[0104]在抗体结合解离常数上下文所用的术语“约”允许了用 于测量抗体亲和性的方法的内在变差程度。例如，依据所用仪器的 精度，基于所测样本的样本数的标准误差，以及常规误差，术语约 “10-2M”可包括，如从0.05M至0.005M。
[0105]在特定实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮抗 剂包括以小于或等于5×10-2/秒，10-2/秒，5×10-3/秒或10-3/秒的 解离速率(k(off))与Sp35多肽或其片段或变体相结合的本发明的抗 体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。替代性地，本发明的抗体， 或其抗原结合片段、变体或衍生物以小于或等于5×104/秒，104/ 秒，5×10-5/秒，或10-5/秒，5×10-6/秒，10-6/秒，5×10-7/秒或10-7/ 秒的解离速率(k(off))与Sp35多肽或其片段或变体相结合。
[0106]在其他实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮抗 剂包括以大于或等于103M/秒，5×103M/秒，104M/秒或5×104M/ 秒的结合速率(k(on))与Sp35多肽或其片段或变体相结合的本发明 的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。替代性地，本发明的 抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物以大于或等于105M/秒，5× 105M/秒，106M/秒或5×106M/秒或107M/秒的结合速率(k(on))与 Sp35多肽或其片段或变体相结合。
[0107]本发明的特定方法包括施用Sp35拮抗剂抗体，或其免 疫特异性片段，其中至少一个或多个恒定区域的至少一个部分被删 除或以其它方式改造从而提供所需的生化性质，例如下降的效应功 能、非共价二聚化的能力、提高的肿瘤位点定位能力、下降的血清 半衰期、或是与具有大致相同免疫原性的完整、未改造的抗体相比 具有提高的血清半衰期。例如，此处所述的方法中采用的特定抗体 为区域缺失抗体，其包含了与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺 失了一个或多个重链区的至少一部分。例如，在特定的抗体中，修 饰抗体的恒定区中的一个完整区域将被删除，例如，CH2区的全部 或部分将被删除。
[0108]在此处所述的方法中采用的特定Sp35拮抗剂抗体或其 免疫特异性片段中，可采用本领域已知技术对Fc部分进行突变以 减少效应功能。例如，(通过点突变或其它方法)对恒定区域的删 除或灭活可降低循环修饰抗体的Fc受体结合从而提高肿瘤定位。 在其它情况下恒定区修饰与本发明的适度互补结合相一致从而减 少了血清半衰期以及与结合细胞毒素的非特异性结合。恒定区的另 一种修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分从而通过提高抗原特异性 或抗体灵活性来增强定位。通过修饰得到的生理功能、生物相容性 以及其它生化作用(例如肿瘤定位、生物分布以及血清半衰期)可 通过公知的免疫技术在不采取附加试验的情况下进行检测和定量。
[0109]此处披露的方法采用的抗体或其免疫特异性片段的修 饰形式可采用本领域已知的技术由完整的前体或父代抗体制备。本 文对示范性的技术进行了更具体的讨论。
[0110]在特定的实施方式中此处披露的方法采用的Sp35拮抗 剂抗体或其免疫特异性片段的可变和恒定区均为完全人源。全人源 抗体可通过本领域已知的以及此处描述的技术进行制备。例如，针 对特异性抗原的全人源抗体可通过向经修饰在应答抗原性攻击时 生产该种抗体同时其内源性基因座被灭活的转基因动物施用抗原 进行制备。可用于制备该种抗体的示范性技术参见美国专利 6,150,584；6,458,592；6,420,140。其它的技术已为本领域所知。全人 源抗体还可通过各种展示技术(例如噬菌体展示或其它病毒展示系 统)进行制备，本文其它部分将对此作更具体的讨论。
[0111]此处披露的方法中采用的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特 异性片段可通过本领域已知的技术进行制备或生产。在特定的实施 方式中，抗体分子或其片段可进行“重组生产”，即，采用重组DNA 技术进行生产。制备抗体分子或其片段的示范性技术将在本文其它 部分作更详细的讨论。
[0112]此处披露的方法中采用的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特 异性片段包括修饰(例如，通过向该抗体共价连接任何类型的分子， 且该种共价连接不阻止抗体特异性结合其同源表位)后的衍生物。 例如，但非限制，该抗体衍生物包括通过糖基化、乙酰化、聚乙二 醇化、磷酰化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、蛋 白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。 各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括，但不限 于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。此外， 该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
[0113]在优选的实施方式中，此处披露的方法中采用的Sp35 拮抗剂抗体或其免疫特异性片段不会引起待治疗动物(例如，人) 体内的有害免疫应答。在一个实施方式中，此处披露的方法中采用 的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段可通过本领域认可的技术 进行修饰以降低其免疫原性。例如，可对抗体进行人源化、灵长源 化、去免疫化，或可制备嵌合抗体。这些抗体类型来自于保留或充 分保留了父代抗体的抗原结合功能，但在人体内具有更低免疫原性 的非人源抗体，通常为鼠或灵长动物抗体。这可通过多种方法实现， 包括(a)将完整非人类可变区嫁接至人恒定区以生成嵌合抗体；(b) 将一个或多个非人类决定簇互补区(CDRs)的至少一部分嫁接至保 留或未保留关键框架残基的人框架和恒定区；或(c)移植整个非人类 可变区，但通过替换表面残基以类人切片将其“包覆”。该类方法参 见Morrison等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.57：6851-6855(1984)； Morrison等人，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等人， Science 232：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.25：489-498 (1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169217(1994)，以及U.S.Pat.Nos. 5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,190,370，其全文在此引用作为 参考。
[0114]去免疫化还可用于降低一种抗体的免疫原性。此处所 用的术语“去免疫化”包括对抗体进行改造以修饰T细胞表位(例如， 参见WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，对来自起始抗体的VH 和VL序列进行分析，由各V区“定位”的人T细胞表位显示了与序 列内的决定簇互补区(CDRs)和其它关键残基相关的表位定位。对来 自于T细胞表位图谱的单独T细胞表位进行分析，以在不轻易改变 终抗体活性的情况下鉴定选择性的氨基酸替代物。经设计得到了一 系列包括氨基酸替代物组合物的VH和VL序列，随后这些序列被整 合进入一系列的结合多肽(例如，Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性 片段)以用于此处披露的诊断和治疗方法，并对功能进行测验。通 常可生成和测验12-24个变体抗体。然后将包含修饰后的V区和人 C区的完整重链和轻链基因克隆进入表达载体，将该后续质粒导入 细胞系进行全抗体生产。然后对该类抗体通过适当的生化和生物测 定进行比较，并鉴定得到最佳变体。
[0115]本发明的方法中采用的Sp35拮抗剂抗体或其片段可通 过本领域公知的任何适用技术生成。多克隆抗体可通过本领域公知 的多种方法进行制备。例如，可向多种宿主动物包括，但不限于， 兔子、小鼠、大鼠等施用Sp35免疫特异性片段以诱导针对该抗原 的含多克隆抗体的血清的制备。依据宿主种类不同，各种佐剂可用 于提高免疫应答，其包括但不限于，弗氏试剂(完全或不完全)、 矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic 多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚以及潜 在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。该类佐剂也已 为本领域熟知。
[0116]单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备， 包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术的应用或其组合。例如，单克 隆抗体可通过本领域已知的杂交瘤技术进行生产，该技术还在许多 文献中予以教述，例如，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)； Hammerling等人，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier，N.Y.，563-681(1981)(所述文献在此全文引用作为参考)。 此处所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。 术语“单克隆抗体”指由单个克隆(包括真核、原核或噬菌体克隆) 得到的抗体，而非它的生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于 通过杂交瘤技术生产的抗体。单克隆抗体可通过本领域已知的多种 技术进行制备，包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术的应用。
[0117]在一个实施例中，采用本领域认可的方案，可通过多 次皮下或腹腔注射相关抗原(例如，纯化的Sp35抗原或包含该种 抗原的细胞或细胞萃取物)和佐剂在哺乳动物体内产生抗体。该免 疫作用通常可引发包含了从激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反 应抗体的免疫应答。尽管可从动物血浆获取所得的抗体以进行多克 隆制备，通常可从脾、淋巴结或外周血分离单独的淋巴细胞以进行 单克隆抗体(mAbs)的均一制备。该淋巴细胞优选从脾中获取。
[0118]在该公知方法中(Kohler等人，Nature 256：495 (1975))，该取自注射了抗原的哺乳动物的相对短命或终会死亡的 淋巴细胞与一个永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)相融合， 从而得到了永生的并能生产B细胞的转基因编码抗体的杂交细胞 或“杂交瘤”。所得的杂交物通过对包含了能够形成单独抗体的特定 基因的单独株系进行挑选、稀释和再生得到单独遗传株系。它们可 生产针对目标抗原的相似抗体，并由于其单纯的遗传亲缘而被称为 “单克隆”。
[0119]将由此制备的杂交瘤细胞在适当的培养基中接种和培 养，该培养基优选包含抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞生长或存活 的一种或多种物质。本领域的技术人员均了解用于杂交瘤形成、挑 选和培养的试剂、细胞系和介质可从多个来源购买，且已充分建立 了标准化的方案。通常对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析以测定 针对目标抗原的单克隆抗体的生产。优选地，由杂交瘤细胞生产的 单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀、放射性免疫测定(RIA)或酶 联免疫吸收分析(ELISA)等体外分析进行测定。当杂交瘤经鉴定能 够生产具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体后，该克隆可通过 有限稀释法进行亚克隆并以标准方法来培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp 59-103 (1986))。可以进一步理解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可从培养基、 腹水或血浆中通过蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲 和层析等传统方法进行纯化。
[0120]识别特定表位的抗体片段可通过已知技术生成。例如， 可采用木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)2片段) 等酶通过蛋白水解裂解免疫球蛋白分子获得Fab和F(ab′)2片段。 F(ab′)2片段包含了可变区、轻链恒定区和重链CH1区。
[0121]本领域技术人员还可理解编码抗体或抗体片段(例如， 抗原结合位点)的DNA还可以从抗体噬菌体库获得。该种噬菌体 可特别用于展示由抗体库或组合抗体库(例如，人或鼠)表达的抗 原结合区。表达能够结合目标抗原的抗原结合区的噬菌体可通过抗 原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原) 进行选择和鉴别。这些方法中常用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包 括由带有重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或 二硫键稳定的Fv抗体区域的噬菌体表达的fd和M13结合区。示范 性方法可参见，例如，EP 368 684 B1；美国专利5,969,108， Hoogenboom，H.R.以及Chames，Immunol.Today 21：371(2000)；Nagy 等人Nat.Med.5：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui等人，J.MolBiol.315：1063(2002)，其全文在此 引用作为参考。许多文献(例如，Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))均已描述了通过链替换，以及作为构建大型噬菌 体库的策略的组合感染和体内重组对高亲和性人抗体的生产。在另 一实施方式中，可采用核糖体展示替代噬菌体作为展示平台(例如， 参见Hanes等人，Nat.Biotechnol75：1287(2000)；Wilson等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol Methods 248：31(2001))。在另一实施方式中，可通过细胞表面库筛 选抗体(Boder等人，Proc.Natl Acad.Sci USA 97：10701(2000)； Daugherty等人，J.Immunol.Methods 243：211(2000)).该类方法可 为用于单克隆抗体的分离和后续克隆的传统杂交瘤技术提供替代 方法。
[0122]在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在携带了 对其编码的多聚核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别地，可从 动物cDNA库(例如，人或鼠淋巴组织cDNA库)或合成cDNA库 扩增编码VH和VL区的DNA序列。在特定实施方式中，该编码VH 和VL区的DNA在PCR中通过scFv接头相连接并被克隆进入一个 噬菌粒载体(例如，p CANTAB或pComb 3HSS)。将该载体导入 E.coli并以辅助噬菌体感染E.coli。这些方法中常用的噬菌体通常 为包括fd和M13的丝状噬菌体；VH或VL区通常重组融合至噬菌 体基因III或基因VIII。表达能够结合目标抗原(即，Sp35多肽或 其片段)的抗原结合区的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或 者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择或鉴别。
[0123]可用于制备该抗体的噬菌体展示方法的附加示范可参 见Brinkman等人，J.Immunol.Methods 752：41-50(1995)；Ames等 人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人， Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 757：9-18 (1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)； PCT Application No.PCT/GB91/01134；PCT publications WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236； WO 95/15982；WO 95/20401；以及U.S.Pat.Nos.5,698,426； 5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047； 5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和 5,969,108；其全文在此引用作为参考。
[0124]如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可从该噬菌 体分离该抗体编码区并用于生成包括人抗体或任何其它目标抗原 结合片段的完整抗体，并在包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细 胞、酵母和细菌的目标宿主中表达。例如，用于重组生产Fab，Fab′ 和F(ab′)2片段的技术也可采用本领域已知的技术，例如参见PCT publication WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；以及Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；和 Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献全文引用 作为参考)。
[0125]可用于生产单链Fvs和抗体的技术示范可参见U.S.Pat. Nos.4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；以及Skerra 等人，Science 240：1038-1040(1988)。对于某些用途，包括抗体在人 体的体内应用和体外检测分析，优选使用嵌合、人源化或人抗体。 嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如一 种包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产 嵌合抗体的方法在已为本领域所知。例如，参见Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J. Immunol.Methods 125：191-202(1989)；U.S.Pat.Nos.5,807,715； 4,816,567；和4,816397，其全文在此引用作为参考。人源化抗体指 能够与具有一个或多个来自非人类决定簇互补区(CDRs)和人免疫 球蛋白分子框架区的目标抗原相结合的由非人类抗体衍生的抗体 分子。人框架区的框架残基通常可被CDR供体抗体的相应残基所 替代从而改变，并优选改善抗原结合。这些框架替换可通过本领域 公知的方法进行鉴定，例如，可通过对CDR和框架残基的相互作 用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，可通过序列比较鉴定在 特定位点的反常框架残基。(例如，参见Queen等人.，U.S.Pat.No. 5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其全文在此引用 作为参考)。抗体可通过本领域已知的多种技术进行人源化，该技 术包括，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT publication WO 91/09967； U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶饰或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498 (1991)；Studnicka等人.，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)； Roguska等人，PNAS 91：969-973(1994))，以及链替换(U.S.Pat.No. 5,565,332，其全文引用作为参考)。
[0126]完整人类抗体可特别用于人类患者的治疗。人类抗体 可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述采用来自人免疫球蛋 白序列的抗体库进行的噬菌体展示方法。还可参见U.S.Pat.Nos. 4,444,887和4,716,111；以及PCT publications WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735， 和WO 91/10741；分别全文引用作为参考。
[0127]人类抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白， 但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行生产。例如，人重链 和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源重组进入小 鼠胚胎干细胞。可替代地，除人重链和轻链基因外，还可将人可变 区、恒定区和多样区导入鼠胚胎干细胞。鼠重链和轻链免疫球蛋白 基因可通过同源重组导入的人免疫球蛋白基因座进行单独或同时 的非功能性修饰。特别地，JH区纯合子的删除防止了内源抗体的生 产。扩增该修饰后的胚胎干细胞并显微注射进入胚泡以生产嵌合小 鼠。然后饲养该嵌合小鼠以生产表达人抗体的纯合子型后代。该转 基因小鼠以选择抗原(例如，所需目标多肽的全部或部分)通过常 规方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术 从免疫后的转基因小鼠中获取。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转 基因在B细胞分化时重排，随后进行类型转换和体细胞突变。因此， 通过该种技术可生产治疗有效的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。该生产 人类抗体技术的综述可参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol. 73：65-93(1995)。有关用于生产人类抗体和人类单克隆抗体的技术 以及生产该类抗体的方案的具体讨论可参见PCT公布WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；U.S.Pat.Nos.5,413,923； 5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和 5,939,598等，其全文在此引用作为参考。此外，可委托Abgenix，Inc. (Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)等公司通过与上述 类似的技术提供针对选定抗原的人类抗体。
[0128]识别选定表位的完整人类抗体可通过一种称为“定向 选择”的技术进行生产。在该方法中采用一种选定的非人类单克隆 抗体(例如，小鼠抗体)引导识别相同表位的完整人类抗体的筛选。 (Jespers等人，Bio/Technology 72：899-903(1988).还可参见，美国专 利号5,565,332。
[0129]在另一实施方式中，编码本发明的方法采用的目标单 克隆抗体的DNA可采用常规方法简单分离和测序(例如，可采用 能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)。分 离的亚克隆杂交瘤细胞可用作该DNA的优选来源。该DNA一旦分 离后可导入表达载体，随后将后者转染进入不生产免疫球蛋白的原 核或真核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠 卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体的说，如1995年1月25日 Newman等人提交的U.S.Pat.No.5,658,570所述(在此引用作为参 考)，该分离DNA(如此处所述，可为合成DNA)可为制备抗体 用于克隆恒定和可变区序列。简要而言，将来自该选定细胞的RNA 遗传提取物转化为cDNA，然后以Ig特异性引物进行PCR扩增。 能够完成该目的的合适引物还可参见U.S.Pat.No.5,658,570。如下 文所将详述，可相对大量培养该表达所需抗体的转化细胞以提供临 床或商业所需的免疫球蛋白。
[0130]在特定的实施方式中，该重链和/或轻链可变区的氨基 酸序列可通过本领域公知的方法检查以确定决定簇互补区(CDRs) 的序列，例如，可通过比较已知氨基酸序列和其它重链和轻链可变 区以确定高可变序列区。可采用常规重组DNA技术将一个或多个 CDRs插入框架区，例如，插入人框架区以将非人类抗体人源化。 该框架区可以是天然存在的或为共有框架区，且优选为人框架区 (例如，参见Chothia等人.，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)的人 框架区列表)。由框架区和CDRs的组合生成的多聚核苷酸优选编 码一种能与所需多肽(例如，SP35)的至少一个表位特异性结合的 抗体。在框架区内可优选进行一个或多个氨基酸替换，该氨基酸替 换优选能够提高抗体与其抗原的结合。此外，该类方法可用于对参 与链间二硫键的半胱氨酸残基的一个或多个可变区进行氨基酸替 换或删除，从而生成缺失一个或多个链间二硫键的抗体分子。其它 对多聚核苷酸的改造在本发明和本领域的现有技术范围内。
[0131]此外，可采用通过拼接具有适当抗原特异性的小鼠抗 体分子基因和具有适当生物活性的人类抗体分子基因生产“嵌合抗 体”的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci 81：851-855(1984)； Neuberger等人，Nature 372：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985))。此处所用的嵌合抗体是一种抗体的不同部分来 自不同动物种类的分子，例如包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫 球蛋白恒定区的抗体，如人源化抗体。
[0132]替代性地，描述用于生产单链抗体的技术(U.S.Pat.No. 4,694,778；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等人.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)以及Ward等人，Nature 334：544-554(1989))也可用于生成单链抗体。可通过氨基酸桥连接 Fv区的重链和轻链片段生成单链抗体。也可采用在大肠杆菌内组装 功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988))。
[0133]Sp35拮抗剂抗体还可以是在不能生成内源免疫球蛋白 的转基因动物(例如，小鼠)体内生成的人源或实质人源抗体(例 如，参见U.S.Pat.Nos.6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369， 分别在此引用作为参考)。例如，据描述在嵌合和胚系突变小鼠中 的抗体重链结合区的纯合子缺失可导致内源抗体生产的完全抑制。 人免疫球蛋白基因阵列向该胚系突变小鼠的转移可导致在抗原攻 击下的人抗体生产。另一使用SCID小鼠生成人抗体的优选方法可 参见U.S.Pat.No.5,811,524，该文献在此引用作为参考。应当可以 理解与这些人抗体相关的遗传材料也可以依照此处所述进行分离 和操作。
[0134]用于生成重组抗体的另一高效方法可参见Newman， Biotechnology 10：1455-1460(1992)。该技术可特别生成包含了猴可 变区和人恒定序列的灵长动物源化抗体。该参考文献在此全文引用 作为参考。此外，该技术还可参见共同受让的U.S.Pat.Nos. 5,658,570，5,693,780和5,756,096，该文献在此引用作为参考。
[0135]在另一实施方式中，可通过显微操作选择淋巴细胞并 分离可变基因。例如，可从免疫哺乳动物分离外周血单核细胞并在 体外培养7天。筛选该培养物以获得达到筛选标准的IgGs。可对 positive wells的细胞进行分离。可通过FACS或补体介导的溶血空 斑检测的鉴定分离得到生产Ig的单独B细胞。可通过显微操作将 生成Ig的B细胞转移至试管，并可采用RT-PCR等方法扩增VH和 VL基因。将VH和VL基因克隆至抗体表达载体并转染进入细胞(例 如，真核或原核细胞)以进行表达。
[0136]替代性地，可采用本领域技术人员公知的技术筛选抗 体生成细胞系并进行培养。该类技术可从各种试验手册和出版物中 得到描述。在此方面，适用于本发明的技术的描述可见下文，并可 参见Current Protocols in Immunology，Coligan等人.，Eds.，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons， New York(1991)，其内容全文(包括附录)在此引用作为参考。
[0137]此处披露的方法采用的抗体可通过本领域已知的任何 抗体合成方法，特别是化学合成方法或是优选此处所述的重组表达 技术进行制备。
[0138]应当进一步理解本发明的范围进一步包括抗原结合 DNA序列所有的等位基因、变体及突变体。
[0139]众所周知，RNA可通过标准技术(例如在异硫氰酸胍 萃取和沉淀后进行离心或层析)从原始杂交瘤细胞或其它转化细胞 分离。在需要时可通过oligo dT纤维素层析等标准技术从总RNA 分离mRNA。适用的技术已为本领域熟知。
[0140]在一个实施方式中，对本发明的方法中采用的抗体轻 链和重链进行编码的cDNAs可参照公知的方法采用逆转录酶和 DNA聚合酶同时或单独制备。可通过共有恒定区引物或基于公开 的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物启动PCR。 如上文讨论，PCR还可用于分离编码该抗体轻链和重链的DNA克 隆。在此处可用共有引物或更具同源性探针如鼠恒定区探针筛选该 库。
[0141]DNA，通常是质粒DNA，可采用本领域已知技术从细 胞分离，并参考标准的，公知技术(例如，其具体内容可参见前述 有关重组DNA技术的参考文献)获得限制性酶图谱和测序。当然， 该DNA可在分离过程或后续分析中参照本发明在任意点进行合 成。
[0142]抗体，或其片段、衍生物或类似物(例如作为Sp35拮 抗剂的的抗体重或轻链)的重组表达需要构建一种包含了编码该抗 体的多聚核苷酸的表达载体。一旦获得编码本发明抗体分子或者抗 体的重链或轻链，或其部分(优选包含该重链或轻链可变区)的多 聚核苷酸，可通过本领域公知的重组DNA技术制备生产该抗体分 子的载体。因此，此处描述了通过表达包含抗体编码核苷酸序列的 多聚核苷酸制备一种蛋白的方法。可采用本领域技术人员公知的方 法构建包含抗体编码序列和适当的转录和转译控制信号的表达载 体。这些方法包括，例如，体内重组DNA技术、合成技术以及体 内遗传重组。因此，本发明提供了包含可操作地连接至启动子的编 码本发明抗体分子，或其重链或轻链，或重链或轻链可变区的核苷 酸序列的可复制载体。该类载体可包含编码该抗体分子恒定区的核 苷酸序列(例如，参见PCT公布WO 86/05807；PCT公布WO 89/01036以及U.S.Pat.No.5,122,464)，且该抗体的可变区可被克 隆进入该种载体以表达完整的重或轻链。
[0143]该表达载体通过常规技术转入宿主细胞，然后以常规 技术培养该转染细胞以生产用于此处所述方法的抗体。因此，本发 明包括宿主细胞，该宿主细胞则包含可操作地连接至一种外源启动 子的编码本发明抗体，或其重或轻链的多聚核苷酸。在针对表达双 链抗体的优选实施例中，如下文详述，同时编码重和轻链的载体可 在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子。
[0144]可采用多种宿主表达载体系统来表达用于此处所述方 法的抗体分子。该种宿主表达系统代表了可生产和后续纯化目标编 码序列的载体，还代表了在以适当核苷酸编码序列进行转化或转染 后原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于微生物，如以 包含了抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA 表达载体转染的细菌(例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌)；以包含 抗体编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如，毕赤酵母)； 以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(杆状病毒)感染的昆虫 细胞系统；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰 菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或重组质粒表达 载体(例如，Ti质粒)转染的植物细胞系统；或包含了带有哺乳动 物细胞基因组启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒 启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒75k启动子)的重组 表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BLK，293，3T3 细胞)。优选地，可使用细菌细胞如大肠杆菌，更优选使用真核细 胞表达重组抗体分子，特别是完整重组抗体分子。例如，结合来自 人细胞巨化病毒的中间早期基因启动子元件等载体的哺乳动物细 胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种有效的抗体表达系统(Foecking 等人.，Gene 45：101(1986)；Cockett等人.，Bio/Technology 8：2 (1990))。
[0145]在细菌系统中，根据被表达的抗体分子的目标用途， 可方便地选择多种表达载体。例如，当需要生产大量该种蛋白，以 得到一种抗体分子的药物组合物时，可采用能够引导高水平表达易 纯化融和蛋白产物的载体。该类载体包括，但不限于，大肠杆菌表 达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，其中该抗体 克隆序列可在与lacZ编码区同框的情况下单独连接至该载体从而 生产融和蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res. 73：3101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem. 24：5503-5509(1989))；等等。pGEX载体也可用于将外源多肽以谷 胱甘肽S转移酶(GST)融和蛋白的形式进行表达。一般而言，该种 融和蛋白具有可溶性，并能通过吸附，结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖 珠，然后在自由谷胱甘肽存在下洗脱进行简单的纯化。通过设计该 包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点的pGEX载体，从而使该 克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
[0146]在昆虫系统中，通常使用苜蓿尺蠖核多角体病毒 (AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒生长于草地夜蛾细胞中。 该抗体编码序列可单独克隆进入该病毒的非必须区(例如多角体蛋 白基因)并处于AcNPV启动子(例如该多角体蛋白启动子)的控 制下。
[0147]在哺乳动物宿主细胞中，可采用一系列基于病毒的表 达系统。当采用人腺病毒作为表达载体时，可将目标抗体编码序列 连接至腺病毒转录/翻译控制复合物如晚期启动子和三联先导序列。 然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组。插入 病毒基因组的非必须区(例如，E1或E3区)将形成有活力的并能 在感染宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan及Shenk， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。插入抗体编码序列 的有效翻译还将需要特定的启动信号。这些信号包括ATG起动密 码子和邻近序列。此外，该起动密码子应当与目标编码序列的阅读 框架同框以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起动 密码子可来自于多种天然和合成来源。表达的效率可通过包含适当 的转录增强原件，转录终止子等得到提高(参见Bittner等人.， Methods in Enzymol.753：51-544(1987))。
[0148]此外，还可选择以必需的特定形式调节插入序列表达， 或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对该蛋白产物的该种修饰 (例如，糖基化)和处理(例如，裂解)可对该蛋白的功能非常重 要。不同的宿主细胞可对蛋白和基因产物的翻译后处理和修饰均有 不同的特性和特殊的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保 表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为此，可使用具有正确处理基 因产物的初级转录、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。 该种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO，VERY，BHK，HeLa， COS，293，3T3，WI387，并特别包括例如BT483，Hs578T，HTB2， BT20以及T47D等乳腺癌细胞系以及例如CRL7030和Hs578Bst 等正常乳腺细胞系。
[0149]可采用稳定表达以进行重组蛋白的长期高产量生产。 例如，可通过工程改造得到稳定表达该抗体分子的细胞系。宿主细 胞可通过由适当表达控制元件(例如，启动子，增强子，序列，转 录终止子，聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的进行转化，而 非使用包含病毒复制起始区的表达载体。在导入外源DNA后，将 工程细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转入选择性培养基。重 组质粒中的选择性标记可带来对选择因素的耐受并使细胞将该质 粒稳定整合进入其染色体，然后生长得到可进行后续克隆并扩展入 细胞系的病灶。该方法可用于工程改造可稳定表达抗体分子的细胞 系。
[0150]多种选择系统可供使用，包括但不限于单纯疱疹病毒 胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷 酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci USA 48：202(1992))，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人.，Cell 22：817 1980)基因，并可分别应用于tk-，hgprt-或aprt-细胞。此外， 抗代谢物抗性可用作下列基因选择的基础：具有对氨甲喋呤的抗性 的dhfr(Wigler等人.，Natl.Acad.Sci USA 77：357(1980)；O′Hare等 人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：1527(1981))；具有对麦考酚酸的抗 性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：2072 (1981))；具有对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Clinical Pharmacy 72：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann. Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem. (52：191-217(1993)；，TIB TECH 11(5)：155-215(1993年5月)；具有对 潮霉素的抗性的hygro(Santerre等人.，Gene 30：147(1984)。本领域 公知的可供使用的重组DNA技术可参见Ausubel等人.(eds.)， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY (1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual， Stockton Press，NY(1990)；以及Dracopoli等人.(eds)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)； Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol..150：1(1981)，在此全文引用作 为参考。
[0151]抗体分子的表达水平可通过载体扩增得到提高(其综述 参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。当表达抗体 的载体系统中的标记可进行扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的 提升可提高标记基因拷贝数。由于扩增区与抗体基因关联，因而抗 体的产量也会得到提高(Grouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
[0152]该宿主细胞可被本发明的两个表达载体共转染，该第 一载体编码一种重链衍生多肽而该第二载体编码一种轻链衍生多 肽。这两种载体可包含相同的能使重和轻链多肽同等表达的可选择 标记。替代性地，也可使用一种同时编码重和轻链多肽的单独载体。 在该种情况下，该轻链被优先放置在重链之前以防止过量的无毒重 链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad. Sci. USA 77：2197(1980))。该重和轻链的编码序列可包含cDNA或基因 组DNA。
[0153]当本发明的抗体分子被重组表达后，可通过本领域已 知的任意免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如，层析(例 如，离子交换层析、亲和层析、特别是对蛋白A特异性抗原的亲和 层析、筛分柱层析)、离心、微分溶出、或通过任何其它蛋白纯化 标准技术。替代性地，提高本发明抗体亲和性的优选方法参见US 20020123057A1。
[0154]在一个实施方式中，本发明的方法中采用的结合分子 或抗原结合分子包含了一种合成恒定区(“区域缺失抗体”)，其中 一个或多个区域被部分或全部删除。在特定实施例中的相容性修饰 抗体包含了整个CH2区被去除的区域缺失构建体或变体(DCH2构 建体)。在其它实施方式中可采用短连接肽替换缺失区域以提供可 变区的灵活性和自由移动性。本领域的技术人员将可以理解由于 CH2区对抗体分解率的调节属性，因而特别优选该构建体。
[0155]在特定的实施方式中，本发明披露的方法中采用的修 饰抗体为微抗体。微抗体可通过本领域已描述的方法进行制备(例 如，参见，美国专利5,837,821或WO94/09817A1)。
[0156]在另一实施方式中，本发明披露的方法中采用的修饰 抗体为本领域已知的CH2区缺失抗体。区域缺失构建体可通过编码 IgG1人源恒定区的载体(例如，来自Biogen IDEC公司)获得(例 如，参见WO02/060955A2和WO02/096948A2)。这些示范性载体 经工程改造缺失了CH2区并提供了表达区域缺失IgG1恒定区的合 成载体。
[0157]在一个实施方式中，本发明所披露的方法中采用的 Sp35拮抗剂抗体或其片段含了一种具有能支持单体亚基间结合的 数个或者甚至单个氨基酸缺失或替换的免疫球蛋白重链。例如，在 CH2区选定部位的单个氨基酸突变可足以降低Fc结合并从而增强 肿瘤定位。类似地，可能仅需要删除控制带调节效应功能(例如， 补体结合)的一个或多个恒定区。该恒定区的部分缺失可能提高该 抗体的选定特性(血浆半衰期)，同时保留其它与对象恒定区相关 的所需功能的完整性。此外，如上文指出，所披露抗体的恒定区可 通过对增强所得构建体作用的一个或多个氨基酸的突变或替换进 行合成。就此而言，可以在破坏保守结合位点(例如，Fc结合)的 活性的同时充分保留修饰抗体的构型和免疫原性作用。另一实施方 式包含了向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强所需的特性(例如 效应功能)或者提供更多细胞毒素或糖附着。在该类实施例中可能 需要插入或复制来自选定恒定区的特定序列。
[0158]本发明还提供了包含此处所述的抗体分子(例如，VH 区和或VL区)的变体(包括衍生物)，主要由其组成，或由其组 成的抗体的用途，该抗体或其片段免疫特异性结合Sp35多肽。本 领域技术人员已知的标准技术可用于在编码结合分子的核苷酸序 列引入突变，包括但不限于，可导致氨基酸替换的定点突变和PCR 介导的突变。优选地，该变体(包括衍生物)相对参考VH区，VHCDR1， VHCDR2，VHCDR3，VL区，VLCDR1，VLCDR2或VLCDR3编码少于 50个氨基酸替换，少于40个氨基酸替换，少于30个氨基酸替换， 少于25个氨基酸替换，少于20个氨基酸替换，少于15个氨基酸 替换，少于10个氨基酸替换，少于5个氨基酸替换，少于4个氨 基酸替换，少于3个氨基酸替换，或少于2个氨基酸替换。“保守 氨基酸替换”是以具有类似电荷侧链的氨基酸残基替换其中一个氨 基酸残基。本领域内已经定义了有类似电荷侧链的氨基酸残基家 族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)， 酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如， 甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)， 无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸， 苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，beta分支侧链(例如，苏氨酸，缬 氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸， 组氨酸)的氨基酸。此外，该突变可沿全部或部分编码序列进行(例 如饱和突变)，对所得的突变进行生物活性筛选以鉴定保留活性的 突变体。
[0159]例如，可以仅在抗体分子的框架区或CDR区引入突变。 所引入的突变可以是同义或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能 力没有或具有很少的影响。这些类型的突变可能对优化密码子用途 或提高杂交瘤的抗体生产非常有用。然而非中性错义突变可改变一 种抗体结合抗原的能力。多数同义和中性错义突变的位点可能在框 架区中，而多数非中性错义突变的位点可能在CDR中，尽管这并 非绝对。本领域的技术人员均能设计和测试具有所需属性的突变分 子，该所需属性如未改变抗原结合活性或改变了结合活性(例如， 提高了抗原结合活性或改变了抗体特异性)。突变后可对编码蛋白 进行常规表达，编码蛋白的功能性和/或生物活性可通过此处所述的 技术或本领域已知的常规修饰技术进行测定。
[0160]本发明的方法中采用的示范性抗体或其片段包括但不 局限于一种分离抗体或其抗原结合片段，其与由201′，3A3，3A6， 1A7，1G7，2B10，2C11，2F3，3P1D10.2C3，3P1E11.3B7， 3P2C6.3G10.2H7，3P2C9.2G4，3P4A6.1D9，3P4A1.2B9，3P4C2.2D2， 3P4C5.1D8，3P4C8.2G9，30-C12(Li01)，38-D01(Li02)，35-E04 (Li03)，36-C09(Li04)，30-A11(Li05)，34-F02(Li06)，29-E07(Li07)， 34-G04(Li08)，36-A12(Li09)，28-D02(Li10)，30-B01(Li11)，34-B03 (Li12)，Li13，Li32，Li33，Li34，3383(Lla.1)，3495(Lla.2)，3563(Lla.3)， 3564(Lla.4)，3565(Lla.5)，3566(Lla.6)，3567(Lla.7)，3568(Lla.8)， 3569(Lla.9)，3570(LIa.10)，3571(Lla.11)，3582(Lla.12)，以及1968 (Lla.13)构成的组合选出的参考单克隆抗体的相同Sp35表位能够特 异性结合，以上抗体均在美国临时专利申请60/697,336，60/771,990 和60/814,522中予以描述，其全文在此引用作为参考。融合蛋白以及结合多肽和抗体
[0161]此处披露的方法采用的Sp35拮抗剂多肽、适体和拮抗 剂抗体可进一步在N-或C-末端重组融合至外源多肽或化学结合(包 括共价或非共价结合)至多肽或其它组合物。例如，Sp35拮抗剂多 肽、适体和抗体可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或 外源多肽、药物、放射性核素或毒素等效应分子。例如，参见PCT 公布WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；U.S.Patent No. 5,314,995和EP 396,387。
[0162]此处披露的方法采用的Sp35拮抗剂多肽、适体和抗体 包括修饰后的衍生物，即，通过向该抗体共价连接任何类型的分子， 且该种共价连接不阻止该Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体抑制Sp35 的生物功能。例如，但非限制，本发明的Sp35拮抗剂多肽、适体 和抗体可通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，磷酸化，酰 胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细 胞配体或其它蛋白连接等方法进行修饰。各种化学修饰中的任意一 种均可通过已知技术实现，包括，但不限于特异性化学裂解、乙酰 化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或 多个非传统氨基酸。
[0163]此处披露的方法采用的Sp35拮抗剂多肽、适体和抗体 可由通过肽键或修饰肽键(即，肽等排物)彼此连接的氨基酸所组 成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。Sp35拮抗剂多 肽、适体和抗体可通过转译后作用等自然作用，或通过本领域公知 的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以 及大量的研究文献中得到了具体的描述。Sp35拮抗剂多肽、适体和 抗体的任何部位均可进行修饰，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基 或羧基终端，或在糖等部分上。应当可以理解在给定Sp35拮抗剂 多肽、适体和抗体的多个位点可出现相同或不同程度的相同类型的 修饰。此外，一种给定Sp35拮抗剂多肽、适体和抗体可包含多种 类型的修饰。Sp35拮抗剂多肽、适体和抗体可因为泛素化等原因而 带有分支，它们也可呈带或不带分支的环状。环状、分支和带分支 的环状Sp35拮抗剂多肽、适体和抗体可通过转译后自然作用或合 成方法形成。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄 素的共价结合，亚铁血红素部分的共价结合，核苷酸或核苷酸衍生 物的共价结合，脂质或脂质衍生物的共价结合，磷脂酰肌醇的共价 结合，交联，环化，形成二硫键，脱甲基，共价交联的形成，半胱 氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，gamma-羧化，糖基化， GPI锚形成，羟基化，碘处理，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二 醇化，蛋白水解作用，磷酸化，异戊烯化，外消旋，硒化，硫酸盐 化，如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白添加氨基酸，泛素化。 (例如，参见Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E. Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)； Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson， Ed.，Academic Press，New York，pgs 1-12(1983)；Seifter等人.，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等人.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
[0164]本发明还提供了包含或主要包含有抑制Sp35功能的 Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体融合的融合蛋白。优选地，与该Sp35 拮抗剂多肽、适体或抗体融合的外源多肽可用于靶向Sp35拮抗剂 多肽或抗体。在本发明的特定实施方式中可溶性Sp35拮抗剂多肽， 例如包含LRR区、Ig区或完整胞外区(对应SEQ ID NO：2的氨基 酸34至532)的Sp35多肽，被融合至外源多肽部分以形成Sp35 拮抗剂融合多肽。Sp35拮抗剂融合蛋白、适体和抗体可用于实现多 种目的，例如，提高血清半衰期，改善生物相容性，体内靶向特定 器官或组织类型，提高重组表达效率，提高宿主细胞分泌，简化纯 化，以及获得更高的亲和性。根据待实现的目标不同，该外源部分 可呈惰性或具有生物活性。另外，它可选择稳定融合至Sp35拮抗 剂多肽、适体或抗体或者在体外或体内裂解。实现这些目标的外源 性部分已为本领域所知。
[0165]作为Sp35拮抗剂融合多肽、适体或抗体表达的替代， 也可选择外源性部分并化学结合至该Sp35拮抗剂多肽、适体和抗 体。在多数情况下，选定的外源部分在融合或结合Sp35拮抗剂多 肽、适体或抗体时均具有类似的功能。因此，在下列对外源氨基酸 序列的讨论中，除非另行指明，应当理解该外源序列可作为融合蛋 白或化学结合物的形式与Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体结合。
[0166]具有药理活性的多肽如Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体 通常在体内显示出快速的清除，从而需要大剂量以在体内达到治疗 有效浓度。此外，小于约60KDa的多肽有可能被肾小球滤过，这有 时可导致肾毒性。可通过融合或结合相对小的多肽如Sp35拮抗剂 多肽、适体或抗体以减少或避免该种肾毒性的风险。已知有多种外 源性氨基酸序列(即，多肽部分或“载体”)可提高治疗性多肽的体 内稳定性(即，血清半衰期)。
[0167]基本全长人血清白蛋白(HSA)或HSA片段由于其半衰 期长，体内分布广，且不具有酶或免疫功能而常被用作外源部分。 通过如Yeh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1904-08(1992)和 Syed等人，Blood 89：3243-52(1997)等所示的方法与材料，HSA可 用于形成显示由Sp35部分带来的药理活性同时显示显著提升的体 内稳定性(例如，高10倍至100倍)的Sp35拮抗剂融合多肽、适 体、抗体或多肽/抗体结合物。HSA的C末端可融合至可溶性Sp35 部分的N末端。由于HSA是一种天然分泌的蛋白，可开发HAS信 号序列以当融合蛋白在真核(例如，哺乳动物)表达系统生成时将 可溶性Sp35融合蛋白分泌进入细胞培养基。
[0168]在特定的实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮 抗剂多肽、适体、抗体及其抗体片段进一步包含靶向部分。靶向部 分包括引导定位至身体特定部位(如脑部或其分区)的蛋白质或肽。 在特定的实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮抗剂多肽、 适体、抗体及其抗体片段与脑部靶向部分结合或融合。该脑部靶向 部分被共价连接(例如，引导，转译融合，或者直接或通过可选择 性裂解的间隔分子进行化学连接)或非共价连接(例如，通过抗生 物素蛋白，生物素，蛋白A，IgG等进行可逆相互作用)。在其他 的实施方式中，本发明的方法中采用的Sp35拮抗剂多肽、适体、 抗体及其抗体片段与另一脑部靶向部分结合。在附加的实施方式 中，该脑部靶向部分与本发明的方法中采用的多个Sp35拮抗剂多 肽、适体、抗体及其抗体片段相结合。
[0169]与Sp35拮抗剂多肽、适体、抗体及其抗体片段相连接 的脑部靶向部分增强了该Sp35拮抗剂多肽、适体、抗体及其抗体 片段的脑部传递。据描述多种多肽在融合至蛋白或治疗剂时可将该 蛋白或治疗剂传递通过血脑屏障(BBB)。非限制范例包括单域抗体 FC5(Abulrob等人.(2005)J. Neurochem.95，1201-1214)；mAB 83-14，一种针对人胰岛素受体的单克隆抗体(Pardridge等人.(1995) Pharmacol.Res.12，807-816)；结合至人铁传递蛋白受体(hTfR)的B2， B6和B8肽(Xia等人.(2000)J.Virol.14，11359-11366)；结合至人 铁传递蛋白受体的OX26单克隆抗体(Pardridge等人.(1991)J. Pharmacol.Exp.Ther.259，66-70)；以及U.S.Patent No.6,306,365的 SEQ ID NOs：1-18。上述参考文献的全文在此引用作为参考。
[0170]Sp35组合物增强的脑部传递可通过本领域所建立的多 种方法进行测定。例如，向动物施用连接至脑部靶向部分的一种放 射标记的Sp35拮抗剂多肽、适体、抗体及其抗体片段；检测脑部 定位；与未连接脑部靶向部分的同等放射性标记的Sp35拮抗剂多 肽、适体、抗体及其抗体片段比较定位。其它检测增强靶向的方法 参见上述参考文献。
[0171]该信号序列为编码启动蛋白跨越内质网膜的运输的氨 基酸序列的多聚核苷酸。可用于构建免疫融合素的信号序列包括抗 体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等人.，J. Immunol.Meth. 125：191-202(1989))，抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链 信号序列(Sakano等人.，Nature 286：5174(1980))。替代性地，也可 采用其它信号序列。例如，参见Watson，Nucl.Acids Res.72：5145 (1984)。该信号肽通常在内质网内腔中被信号肽酶裂解。由此可获 得含Fc区和可溶性Sp35部分的免疫融合素蛋白分泌物。
[0172]在一些实施方式中，该DNA序列可在分泌表达单元和 可溶性Sp35部分之间编码蛋白水解裂解位点。该裂解位点可提供， 例如编码融合蛋白的蛋白水解裂解，从而将Fc区从目标蛋白中分 离。有用的蛋白水解裂解位点包括包括被胰蛋白酶、血浆酶、凝血 酶、Xa因子或是肠激酶K等蛋白水解酶识别的氨基酸序列。
[0173]该分泌表达单元可被整合进入可复制表达载体。有用 的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒等。示范性的表达载体 为pdC，其中免疫融合素DNA的转录受人细胞巨化病毒增强子和 启动子的控制。例如，参见Lo等人.，Biochim.Biophys.Acta 1088：112 (1991)；以及Lo等人，Protein Engineering 77：495-500(1998)。可通 过编码可溶性Sp35多肽的DNA转化或转染适当的宿主细胞并用于 可溶性Sp35多肽的表达和分泌。通常采用的宿主细胞包括永生杂 交瘤细胞、骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa 细胞，以及COS细胞。
[0174]在一个实施方式中，可溶性Sp35多肽被融合至铰链区 和Fc区，即，Ig重链恒定区的C末端部分。Sp35-Fc融合的潜在优 点包括可溶性，体内稳定性，以及多价性，例如，二聚化。所采用 的Fc区可以是IgA，IgD或IgG Fc区(铰链-CH2-CH3)。替代性地， 它可以是IgE或IgM Fc区(铰链-CH2-CH3-CH4)。通常可采用IgG Fc区，例如，IgG1 Fc区或IgG4 Fc区。在一个实施方式中，在融合 中可采用在化学定义IgG Fc(即，根据Kabat系统，以重链恒定区 的第一残基为114时的残基216)的木瓜蛋白酶裂解位点或其它免 疫球蛋白的类似位点上游的铰链区起始的序列。进行融合的确切位 点并非关键；特定的位点已众所周知并可通过选择优化分子的生物 活性、分泌或结合特性。构建和表达编码Fc融合物的DNA的材料 和方法已为本领域所知，并可不经失当的试验进行采用以获得可溶 性Sp35融合物。本发明的一些实施方式采用如Capon等人的美国 专利5,428,130和5,565,335所述的Sp35融合蛋白。
[0175]完整的野生型Fc区显示了效应功能，该效应功能在本 发明的方法采用的Fc融合蛋白中通常不必要且不需要的。因此， 通常在该分泌表达单元构建过程中从Fc区删除特定的结合位点。 例如，由于不需要与轻链共表达，可从IgE的Fc区的CH2区中删 除重链结合蛋白的结合位点Bip(Hendershot等人，Immunol.Today 5：111-14(1987))，从而使该位点不干扰免疫融合素的有效分泌。 跨膜区序列(例如存在于IgM的该序列)也通常被删除。
[0176]IgG1 Fc区最为常用。替代性地，免疫球蛋白gamma 的其它小类(gamma-2，gamma-3以及gamma-4)的Fc区可用于分泌 表达单元。免疫球蛋白gamma-1的IgG1 Fc区通常用于分泌表达单 元并包括至少部分铰链区、CH2区以及CH3区。在一些实施方式中， 免疫球蛋白gamma-1的Fc区为CH2-缺失-Fc，其包括部分的铰链区 和CH3区，但不包括CH2区。对CH2-缺失-Fc的描述可参见Gillies 等人.(1990)Hum.Antibod. Hybridomas 1：47。在一些实施方式中采 用了IgA，IgD，IgE或IgM之一的Fc区。
[0177]Sp35-Fc融合蛋白可构建为多种不同的构型。在一种构 型中可溶性Sp35部分的C末端被直接融合至Fc铰链部分的N末 端。在一个略微不同的构型中，在融合物中可溶性Sp35部分的N 末端和Fc部分的C末端之间整合了短多肽如2-10氨基酸。该种接 头提供了构型灵活性，从而在某些情况下可提高生物活性。如果Fc 部分保留了充分的铰链区部分，Sp35-Fc融合物将二聚化，从而形 成二价分子。单体Fc融合物的均一群将带来单特异性、二价二聚 体。两种具有不同特异性的单体Fc融合物的混合物将带来双特异 性、二价二聚体。
[0178]多种包含相应氨基反应性基团和硫醇反应性基团的交 联接头中的任意一种均可用于连接Sp35拮抗剂多肽和血清白蛋白。 适用接头的范例包括插入硫醇反应性马来酰亚胺(例如，SMCC， AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS以及GMBS) 的胺反应性交联接头。其它适用的接头插入硫醇反应性卤乙酸基 团，例如，SBAP，SIA，SIAB。可对与巯基基团的反应提供保护或 非保护硫醇的以生成可还原键的接头包括SPDP，SMPT，SATA以 及SATP。该种试剂可从市场上购得(例如Pierce Chemicals)。
[0179]结合物不一定需要包含可溶性Sp35多肽的N末端或血 清白蛋白的硫醇部分。例如，可溶性Sp35-白蛋白融合物可通过遗 传工程技术获得，其中可溶性Sp35部分被融合至血清白蛋白的N 末端、C末端，或同时融合至两个末端。
[0180]可溶性Sp35多肽可被融合至外源肽，以促进该Sp35 部分的纯化或鉴定。例如，可将组氨酸标签融合至可溶性Sp35多 肽，以促进通过商用色谱介质进行纯化。
[0181]在本发明的一些实施方式中，可溶性Sp35融合物构建 体可用于促进可溶性Sp35部分在细菌中的生成。在该构建体中， 在可溶性Sp35多肽的N末端融合伙伴上通常采用高水平表达和/ 或分泌的细菌蛋白。例如，参见Smith等人，Gene 67：31(1988)；Hopp 等人，Biotechnology 6：1204(1988)；La Vallie等人，Biotechnology 77：187(1993)。
[0182]通过在适当的融合伙伴的氨基和羧基末端融合可溶性 Sp35部分可获得可溶性Sp35多肽的二价或四价形式。例如，可将 可溶性Sp35部分融合至Ig部分的氨基和羧基末端以生成含有两个 可溶性Sp35部分的二价单体多肽。在这些单体的二聚化后，可通 过Ig部分获得可溶性Sp35蛋白的四价形式。该种多价形式可用于 提高对目标的结合亲和性。可溶性Sp35的多价形式还可通过串联 可溶性Sp35部分形成串联体(可单独采用或融合至Ig或HAS等融 合伙伴)获得。结合的聚合物(多肽除外)
[0183]本发明的一些实施方式涉及可溶性Sp35多肽、Sp35 适体，或Sp35抗体，其中一种或多种聚合物被结合(共价连接) 至Sp35多肽、适体或抗体，以供本发明的方法采用。适用于该种 结合物的聚合物的范例包括多肽(已在上文讨论)、适体、糖聚合 物以及聚烷撑二醇链。通常，但不尽然，可通过将聚合物结合至可 溶性Sp35多肽、适体或Sp35抗体以改善下列一种或多种性质：可 溶性、稳定性，或生物相容性。
[0184]通常用于结合Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体的聚合物 类别为聚烷撑二醇。最为常用的是聚乙二醇(PEG)。可将PEG部分 (例如，1，2，3，4或5PEG聚合物)结合至各Sp35拮抗剂多肽、 适体或抗体，从而相对单独的Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体提高 血清半衰期。PEG部分无抗原性，且基本呈生物惰性。本发明实施 中采用的PEG部分可以带分支或不带分支。
[0185]与Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体结合的PEG部分的 数量以及单独PEG的分子量不尽相同。总体而言，聚合物的分子量 越高，与多肽结合的聚合物链越少。与Sp35拮抗剂多肽、适体或 抗体结合的总聚合物量通常介于20kDa至40kDa。因此，当一个 聚合物链被结合时，该链的分子量通常为20-40kDa。如果结合了 两条链时，各链的分子量通常为10-20kDa。如果结合了三条链， 该分子量通常为7-14kDa。
[0186]如PEG等聚合物可通过多肽上的任何适用的、暴露的 反应性基团连接至Sp35将拮抗剂多肽、适体或抗体。该种暴露的 反应性基团可以是，例如，内部赖氨酸残基的N末端氨基基团或 epsilon氨基基团中的一种或两种。活化的聚合物可与Sp35拮抗剂 多肽、适体或抗体上任何自由氨基基团进行反应和共价连接。Sp35 拮抗剂多肽、适体或抗体(如有)的自由羧基基团、适当活化的羰 基基团、羟基、胍基、咪唑、氧化糖部分以及巯基基团也可用作聚 合物结合的反应基团。
[0187]根据多肽浓度的不同，在结合反应中每摩尔的多肽通 常可采用约1.0至约10摩尔活化聚合物。该比例的选择通常代表了 在使反应最大化的同时使能损害该Sp35拮抗剂多肽或抗体目标药 理活性的副反应(通常为非特异性的)最小化之间的平衡。优选 地，至少保留Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体50％的生物活性(例 如，在本领域已知或本文所述的任意测定所证实)，最优选保留接 近100％的活性。
[0188]该聚合物可通过常规化学方法结合至Sp35拮抗剂多 肽、适体或抗体。例如，聚烷撑二醇部分可被偶合至Sp35拮抗剂 多肽、适体或抗体的赖氨酸epsilon氨基基团。可通过如PEG琥珀 酰亚胺丁二酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)等N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS)活化酯与赖氨酸侧链进行连接。适用的聚烷撑二 醇部分包括，例如，羧甲基-NHS和正亮氨酸-NHS，SC。这些试剂 可从市场上购得。其它的胺-反应性PEG接头可用于替代琥珀酰亚 胺部分。其中包括，例如，异硫氰酸，硝基苯基碳酸盐(PNP)，环 氧化物，苯三唑碳酸盐，SC-PEG，磺酸酯，醛，环氧化物，羰基 咪唑以及碳酸PNP。通常可对条件进行优化以使反应的选择性和程 度最大化。该种反应条件的优化属于本领域的普通技术。
[0189]可通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应进行聚乙二 醇化。例如，参见，Focus on Growth Factors 3：4-10(1992)，以及欧 洲专利申请EP 0154316和EP 0401384。可通过与反应性聚乙二 醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进 行聚乙二醇化。
[0190]通过酰化进行的聚乙二醇化通常包括与聚乙二醇的活 性酯衍生物进行反应。任何反应性PEG分子均可用于进行聚乙二醇 化。PEG酯化的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)是一种常用的活化PEG 酯。此处所用的“酰化”包括但不限于下列治疗性蛋白和水溶性聚合 物(如PEG)之间的键类型：酰胺、氨基甲酸酯、聚氨酯等。例如， 参见Bioconjugate Chem.5：133-140，1994。可对反应参数进行一般选 择以避免对可溶性Sp35多肽、适体或抗体造成损伤或灭活的温度， 溶剂以及pH条件。
[0191]一般而言，该连接键为酰胺，且通常至少95％的所得 产物被单-，双-或三-聚乙二醇化。然而还可形成具有更高聚乙二醇 化程度的种类，其数量取决于所采用的特异性反应条件。纯化的聚 乙二醇化种类可采用常规的纯化方法(包括，例如，透析、盐析、 超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水交换层析以及电泳)选 择性地从混合物(特别是未反应的种类)中分离。
[0192]通过酰化进行的聚乙二醇化通常包括在还原剂存在下 PEG的N末端醛衍生物与Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体的反应。 此外，人们可对反应条件进行调节使得实际上仅在Sp35拮抗剂多 肽、适体或抗体的N末端氨基基团进行聚乙二醇化，即，得到单- 聚乙二醇化蛋白。对于单-聚乙二醇化或多-聚乙二醇化，PEG组通 常通过-CH2-NH-基团与蛋白结合。特别对于-CH2-基团，该种类型 的键被称为“烷”键。
[0193]通过还原性烷化反应进行衍生化以生成N末端靶向单- 聚乙二醇化产物可利用可供衍生化的不同类型伯胺基基团(N末端 赖氨酸)的不同反应性。该反应可在特定pH下进行，该pH可允 许人们利用赖氨酸残基的epsilon-氨基基团和蛋白的N末端氨基基 团之间的pKa差异。通过该种选择性衍生化可控制包含反应性基团 (例如，醛)的水溶性聚合物与蛋白的结合：与聚合物的结合主要 发生在蛋白的N末端，且未发生对其它反应性基团(例如，赖氨酸 侧链氨基基团)的明显修饰。
[0194]该用于酰化和烷化方法的聚合物分子可选自水溶性聚 合物。所选的聚合物通常可经过修饰以具有单独的反应性基团(例 如用于酰化的活性酯或用于烷化的醛)，从而可如同本方法一样控 制聚合程度。反应性PEG醛的范例之一为水中稳定的聚乙二醇丙 醛，或单C1-C10烷氧基或其烷氧基衍生物(例如，参见Harris等 人.，U.S.Pat.No.5,252,714)。该聚合物可带有或不带有分支。对于 酰化反应，所选的聚合物通常具有单独反应性酯基团。对于还原性 烷化反应，所选的聚合物通常具有单独反应性醛基团。一般而言， 水溶性聚合物不会选自天然存在的糖基残基，因为它们通常更方便 由哺乳动物重组表达系统生成。
[0195]制备聚乙二醇化可溶性Sp35多肽、适体或抗体的方法 通常包括下列步骤：(a)将Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体与聚乙二醇 (例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应，在该反应条件下该分子可 与一个或多个PEG基团连接，以及(b)获取反应产物。一般而言，酰 化反应的最佳反应条件将根据已知参数和目标结果进行个别确定。 例如，PEG与蛋白的比例越大通常可生成更大比例的聚-聚乙二醇 化产物。
[0196]还原性烷化可用来生成充分均匀的单-聚合物/可溶性 Sp35多肽、Sp35适体或Sp35抗体群，其通常包括以下步骤：(a) 将可溶性Sp35蛋白或多肽与反应性PEG分子在还原性烷化条件下 反应，反应pH适于对多肽或抗体的N末端氨基基团进行选择性修 饰；以及(b)获得反应产物。
[0197]对于充分均匀的单-聚合物/可溶性Sp35多肽、Sp35适 体或Sp35抗体群，还原性烷化反应条件为允许水溶性聚合物部分 与多肽或抗体的N末端选择性结合的条件。该反应条件通常提供了 赖氨酸侧链氨基基团和N末端氨基基团之间的pKa差异。为达成本 发明的目的，该pH通常在3-9的范围内，典型在3-6的范围内。
[0198]可溶性Sp35多肽、适体或抗体可包括标签，例如，可 通过蛋白水解充分释放的部分。因此，该赖氨酸部分可进行如下选 择性修饰：首先与以低分子量接头(例如可同时与赖氨酸和N末端 反应的Traut试剂(Pierce))修饰的His-tag反应，然后释放该His-tag。 然后该多肽将包含可用含硫醇-反应性头基(例如马来酰亚胺基团、 乙烯砜基团、卤乙酸基团，或者自由或保护SH)的PEG选择性修 饰的自由SH基团。
[0199]Traut试剂可通过能建立PEG连接特定位点的任何接 头进行替代。例如，Traut试剂可用SPDP，SMPT，SATA或SATP (Pierce)进行替代。类似地，可将蛋白与插入马来酰亚胺(例如， SMCC，AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS 或GMBS)，卤乙酸(SBAP，SIA，SIAB)，或乙烯砜基团的胺-反 应性接头反应，并将所得的产物与包含自由SH的PEG反应。
[0200]在一些实施方式中，该聚烷撑二醇部分被偶合至本发 明的方法中采用的Sp35拮抗剂多肽、适体或抗体的半胱氨酸基团。 可通过如马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤乙酸基团或硫醇基团等 基团形成该偶合。
[0201]该可溶性Sp35多肽、适体或抗体可选择性地通过易分 解的键与聚烷撑二醇部分结合。该易分解的键可在如生化水解、蛋 白水解或是巯基裂解中断裂。例如，该键可在体内(生理)条件下 断裂。
[0202]该反应在任何用于将生物活性材料与惰性聚合物反应 的方法中发生，通常pH约为5-8，例如，当反应性基团在N末端 的alpha氨基基团上时pH为5，6，7或8.通常该过程包括制备活 化的聚合物，然后使蛋白与该活化聚合物反应以生成适用于制剂的 可溶性蛋白。Sp35多聚核苷酸拮抗剂
[0203]本发明的方法中Sp35拮抗剂包括由特异性结合编码 Sp35的多聚核苷酸的核酸分子组成的Sp35多聚核苷酸拮抗剂。该 Sp35多聚核苷酸拮抗剂可防止Sp35的表达(抑制)。Sp35多聚核 苷酸拮抗剂包括，但不限于，反义分子、核酶、siKNA、shRNA、 RNAi。该种结合分子通常单独向动物施用(例如，参见O＇Connor，J. Neurochem.56：560(1991))，但该种结合分子也可在体内通过被宿 主细胞摄取的多聚核苷酸体内表达。也可参见Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton， FL(1988)。
[0204]RNAi指干扰目标mRNA表达的RNA的表达。该RNAi 可特别通过siRNA(短干扰RNA)与特定mRNA(例如，Sp35) 相互作用而沉默目标基因。然后可靶向该ds RNA复合物以通过细 胞降解。其它的RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)；以及短干扰 发夹。shRNA分子包含了来自目标基因并由环连接的正义和反义序 列。该shRNA由细胞核被运输至细胞质，并随mRNA被降解。Pol III或U6启动子可用于为RNAi表达RNAs。在本发明的一些实施 方式中，该shRNA从慢病毒载体(例如，pLL3.7)中表达。
[0205]RNAi可通过对其“目标”mRNAs具有序列特异性同源 性的双链RNA(dsRNA)分子进行介导(Caplen等人，Proc Natl Acad Sci USA P5：9742-9747，2001)。对果蝇无细胞溶解物的生化研究显示 RNA依赖性基因沉默的介导物为21-25核苷酸“小干扰”RNA双链 体(siRNAs)。相应地，在本发明的方法中，siRNA分子可方便地 采用。siRNA可在称为DICER的RNA酶对dsRNA的处理过程中 获得(Bernstein等人，Nature 409：363-366，2001)。可以看到siRNA双 链体产物被招募进入名为RISC(RNA诱导沉默复合物)的多蛋白 siRNA复合物中。不希望受限于任何特定的理论，据认为RISC被 导向目标mRNA，其中的siRNA双链体进行序列特异性相互反应 以通过催化方式介导裂解(Bernstein等人，Nature 409：363-366，2001； Boutla等人，CurrBiol 71：1776-1780，2001)。
[0206]RNAi已被用于通过非限制性样本神经元等途径 (Krichevsky等人，Proc Natl Acad Sci USA 29：11926-11929，2002)分 析基因功能以及鉴定哺乳动物细胞中的必要基因(Elbashir等人， Methods 26：199-213，2002；Harborth等人，J Cell Sci 114：4557-4565， 2001)。人们评价了RNAi的治疗形态，例如对病毒(包括但不限于 脊髓灰质炎病毒(Gitlin等人，Nature 418：379-380，2002)和 HIV(Capodici等人，J Immunol 169：5196-5201，2002))的感染、复 制和/或生长的抑制和阻断，以及减少致癌基因的表达(例如，bcr-abl 基因；Scherr等人，Blood 101(4)：1566-9，2002)。RNAi已被用于调 节哺乳动物(小鼠)和两栖动物(爪蟾)胚胎(分别为Calegari等 人，Proc Natl Acad Sci USA 99：14236-14240，2002；以及Zhou，等 人，Nucleic Acids Res 30：1664-1669，2002)以及出生后小鼠中的基因 表达，并用于诱导成年转基因小鼠中的转基因表达(McCaffrey等人， Nature 418：38-39，2002)。在细胞培养和体内检测siRNAs效力和特 异性的方法已有描述(例如，参见Bertrand等人，Biochem Biophys Res Commun 296：1000-1004，2002；Lassus等人，Sci STKE 2002(147)：PL13，2002；以及Leirdal等人，Biochem Biophys Res Commun 295：744-74％，2002)。
[0207]介导RNAi的分子(包括但不限于siRNA)可通过化 学合成(Hohjoh，FEBS Lett 521：195-199，2002)，dsRNA水解(Yang等 人，Proc Natl Acad Sci USA 99：9942-9947，2002)，以T7RNA聚合酶 体外转录(Donzeet等人，Nucleic Acids Res 30：e46，2002；Yu等人， Proc Natl Acad Sci USA 99：6047-6052，2002)，以及采用如大肠杆菌 RNA酶III等核酸酶水解双链RNA(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：9942-9947，2002)进行体外制备。
[0209]其中N，X和Y为核苷酸，X与Y通过氢键连接；“：” 表示两个碱基之间的氢键；x为介于1和约100之间的自然数；而 m和n为介于0和约100之间的相互独立的整数。在一些实施方式 中，N，X和Y各自为A，G，C和T或U。特别对于合成siRNA (即，两个寡聚核苷酸的退火产物)，可能存在非天然存在的碱基 和核苷酸。该双链中心区被称为“核心”并以碱基对(bp)作为测量单 位；该单链部分悬挂，并以核苷酸(nt)作为测量单位。所示的悬挂 为3′悬端，但具有5′悬端的分子同样在本发明的范围之内。没有悬 挂的siRNA分子(即，m＝0且n＝0)，以及仅在核心一侧具有悬挂 的分子(例如，m＝0且n＞1，或与之相反)同样在本发明的范围之 内。
[0210]RNAi技术最初并未显示出可方便地应用于哺乳动物 系统。这是因为在哺乳动物中，dsRNA激活的dsRNA-活化蛋白激 酶(PKR)可导致凋亡级联和细胞死亡(Der等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94：3279-3283，1997)。此外，人们很久以前便知道dsRNA可在 哺乳动物细胞中激活干扰素级联，从而还可导致细胞生理学的改变 (Colby等人，Annu.Rev.Microbiol.25：333，1971；Kleinschmidt等人.， Annu.Rev.Biochem.41：517，1972；Lampson等人.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 58L782，1967；Lomniczi等人.，J.Gen.Virol.8：55，1970； 以及Younger等人.，J.Bacteriol.92：862，1966)。然而，dsRNA介导 的PKR激活和干扰素级联需要长度超过约30个碱基对的dsRNA。 相对地，据证明长度小于30个碱基对的dsRNA可引起哺乳动物细 胞中的RNAi(Caplen等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742- 9747，2001)。因此，可期待通过制备基本没有更长dsRNAs的短RNA 来避免更长dsRNA分子带来的有害的、非特异性的作用。
[0211]有关siRNA的参考文献：Bernstein等人.，Nature 409：363-366，2001；Boutla等人，CurrBiol 11：1776-1780，2001； Cullen，Nat Immunol.3：597-599，2002；Caplen等人，Proc Natl Acad Sci USA 98：9742-9747，2001；Hamilton等人，Science 286：950-952， 1999；Nagase等人，DNA Res.6：63-70，1999；Napoli等人，Plant Cell 2：279-289，1990；Nicholson等人，Mamm.Genome 13：67-73，2002； Parrish等人，Mol Cell 6：1077-1087，2000；Romano等人，MoI Microbiol 6：3343-3353，1992；Tabara等人，Cell 99：123-132，1999； 以及Tuschl，Chembiochem.2：239-245，2001。
[0212]Paddison等人.(Genes & Dev.16：948-958，2002)曾将 小RNA分子折叠发夹以引起RNAi。相应地，该短发夹RNA(shRNA) 分子同样可被本发明的方法方便采用。功能性shRNAs的主干和环 的长度各不相同；在不影响沉默活性的前提下，主干长度可介于约 25至约30nt，而环的大小可介于4至约25nt。不希望受任何特定理 论的束缚，据认为这些shRNAs类似于DICER RNA酶的dsRNA产 物，且在任意情况下具有相同的抑制特定基因表达的能力。
[0213]反义技术可通过反义DNA或RNA，或通过三螺旋构 型控制基因表达。反义技术的讨论可参见，例如，Okano，J. Neurochem.56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。三 螺旋构型的讨论可参见，例如，Lee等人。Nucleic Acids Research 6：3073(1979)；Cooney等人，Science 241：456(1988)；以及Dervan 等人，Science 251：1300(1991)。该方法基于多核苷酸与互补DNA或 RNA的结合。
[0214]例如，编码Sp35的多核苷酸的5′编码部分可用于设计 长度介于约10至40碱基对的反义RNA寡聚核苷酸。DNA寡聚核 苷酸经设计与涉及转录的基因区域互补，从而可以阻止转录和目标 蛋白的生产。反义RNA寡聚核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断 mRNA分子翻译成为目标多肽。
[0215]在一个实施方式中，针对Sp35基因的反义核酸可通过 由外源序列转录在胞内生成。例如，通过转录载体或其部分生成反 义核酸(RNA)。只要该载体可通过转录生成目标反义RNA，它可呈 游离态或与染色体整合。该载体可通过本领域重组DNA技术的标 准方法进行构建。载体可以是可用于在脊椎动物细胞中复制和表达 的质粒、病毒或其它本领域已知物质。该反义分子可通过本领域已 知的任何作用于脊椎动物、优选人类细胞的启动子(例如见本文其 它部分的描述)进行表达。
[0216]尽管优选反义分子的绝对互补，但对此不作要求。至 少与编码Sp35的RNA中的一部分互补的指其互补性足以与RNA 进行杂交，形成稳定双链体的序列；或可检测到三链体形成。杂 交的能力将取决于互补的程度以及反义核酸的长度。一般而言，杂 交核酸越大，它可在包含更多碱基错配的情况下依然形成稳定的双 链体(或在某些情况下形成三链体)。本领域的技术人员可通过标 准步骤确定错配的容忍度以确定杂交复合物的熔点。
[0217]与信使RNA的5′端(例如至AUG起动密码子或包括 AUG起动密码子的5′非翻译序列)互补的寡聚核苷酸在抑制翻译方 面具有最高的效率。然而，据显示与mRNAs的3′非翻译序列互补 的序列也能有效抑制mRNAs的翻译。一般可参见Wagner，R.， Nature 372：333-335(1994)。因此，与5′-或3′-非翻译、非编码区互 补的寡聚核苷酸可用于抑制Sp35翻译的反义过程。与mRNA的5′ 非翻译区互补的寡聚核苷酸应当包括AUG起始密码子的补体。与 mRNA编码区互补的反义寡聚核苷酸在抑制翻译方面的效率较低， 但可参照本发明进行使用。反义核酸的长度至少应为六个核苷酸， 优选长度介于6至约50个核苷酸的寡聚核苷酸。在某些方面该寡 聚核苷酸具有至少10个核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核 苷酸或至少50个核苷酸。
[0218]在另一实施方式中，此处披露的方法中采用的反义寡 聚核苷酸为α-异头寡聚核苷酸。α-异头寡聚核苷酸可与互补RNA 形成特定的双链杂交体，并且与通常的情况相反，其中链相互平行 (Gautier等人.，Nucl.Acids Res.15：6625-6641(1987))。该寡聚核苷 酸为2＇-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等人.，Nucl.Acids Res. 15：6131-6148(1987))，或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人.，FEBS Lett.215：327-330(1987))。
[0219]此处披露的方法采用的多聚核苷酸组合物进一步包括 催化性RNA，或核酶(例如，参见PCT国际申请WO 90/11364， 于1990年10月4日公布；Sarver等人，Science 247：1222-1225 (1990))。优选采用锤头状核酶。锤头状核酶可在与目标mRNA形 成互补碱基对的侧翼区决定的位点裂解mRNAs。唯一的要求是具 有下列两个碱基(5＇-UG-3′)的序列的目标mRNA。锤头状核酶的 构建体和产物已为本领域公知并在Haseloff和Gerlach，Nature 334：585-591(1988)有更为完全的描述。优选地，可对该核酶进行改 造从而使裂解识别位点接近目标RNA的5′端；即，提高效率并使 非功能性mRNA转录物的胞内积累最小化。
[0220]在反义过程中，本发明披露的方法中采用的核酶可由 修饰后的寡聚核苷酸(例如，为提高稳定性，可进行靶向等)组成 并传递至体内表达Sp35的细胞。编码核酶的DNA构建体可以与上 述导入反义编码DNA同样的方式导入细胞。优选的传递方法包括 采用在“编码”受强构建型启动子(例如，pol III或pol II启动子)控 制的核酶的DNA构建体，从而使转染细胞生成足够数量的核酶以 破坏内源性Sp35信息并抑制翻译。与反义分子不同，由于核酶具 有催化性，其产生效果所需的胞内浓度也更低。
[0221]此处披露的方法采用的多聚核苷酸(包括下文描述的 适体)可以是单链或双链的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物 或修饰形式。该多聚核苷酸可在碱基部分、糖部分，或磷酸盐骨架 进行修饰，从而提高如分子、杂交物稳定性等。该多聚核苷酸可包 括其它附加基团，例如肽(例如，为在体内靶向宿主细胞受体)， 或是促进跨域细胞膜(例如，参见Letsinger等人，Proc.Natl Acad. Sci.U.S.A.5(5：6553-6556(1989)；Lemaitre等人，Proc.Natl.Acad. Sci 84：648-652(1987))；于1988年12月15日公布的PCT公布 WO88/09810)或是血脑屏障(例如，参见于1988年4月25日公 布的PCT公布WO89/10134)进行运输的试剂，杂交触发裂解剂(例 如，参见Krol等人，BioTechniques 6：958-976(1988))或是嵌入剂 (例如，参见Zon，Pharm.Res.5：539-549(1988))。为实现该目标， 可将该多聚核苷酸结合至另一分子，例如，肽、杂交触发交联剂、 运输剂、杂交触发裂解剂等。
[0222]此处披露的方法采用的多聚核苷酸(包括适体)可包 括至少一个选自以下组合的修饰碱基部分，该组合包括，但不限于， 5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄 嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨 基甲基-2-硫尿核苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，二羟尿嘧啶，β-D- 半乳糖Q核苷，肌苷，N-6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基 肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞 嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N-6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基 尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖Q核苷，5′甲 氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫-N-6-异戊烯腺嘌 呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，怀丁氧苷(wybutoxosine)，假尿嘧啶，Q 核苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶， 5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，5- 甲基-2-硫尿嘧啶，3(3-氨基-3-N2-羧基丙基)尿嘧啶，3-(3-氨基-3- 羧基-丙基)w，以及2，6-二氨基嘌呤。
[0223]此处披露的方法采用的多聚核苷酸(包括适体)还可 包括至少一个选自包括，但不限于，阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木 酮糖以及己糖的组合的修饰糖部分。
[0224]在另一实施方式中，此处披露的方法采用的多聚核苷 酸(包括适体)至少包含一个选自以下组合的修饰磷酸盐骨架，该 组合包括，但不限于，硫代磷酸盐、二硫代磷酸盐、氨基硫代磷酸 酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯，以 及缩醛键或其类似物。
[0225]本发明的方法采用的多聚核苷酸(包括适体)可通过 本领域已知的标准方法合成，例如，可采用自动化DNA合成器(可 从Biosearch，Applied Biosystems等公司购得)。例如，硫代磷酸寡 聚核苷酸的合成方法可参见Stein等人.，Nucl.Acids Res.16：3209 (1988)，甲基磷酸寡聚核苷酸可采用可控孔度玻璃高分子载体进行 制备(Sarin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.55：7448-7451(1988))， 等等。适体
[0226]在另一实施方式中，本发明的方法采用的Sp35拮抗剂 为适体。适体可以是具有独特序列的，具有对所需靶标(例如，多 肽)具有结合特异性的并且是给定靶标的特异性配体的核苷酸或多 肽。本发明的核苷酸适体包括结合Sp35的双链DNA和单链RNA 分子。
[0227]核酸适体可通过本领域已知的方法进行选择，例如， 可通过指数富集的配体系统进化(SELEX)过程进行选择。SELEX是 一种能高度特异性结合目标分子的核酸分子的体外进化方法，其描 述可参见，例如U.S.Pat.Nos.5,475,096，5,580,737，5,567,588， 5,707,796，5,763,177，6,011,577以及6,699,843，其全文在此引用作 为参考。另一鉴定适体的筛选方法可参见U.S.Pat.No.5,270,163(同 样在此引用作为参考)。SELEX过程基于核酸形成一系列二和三维 结构的能力，以及核苷酸单体实际上能作为任何单体或聚合形式的 化合物(包括其它核酸分子和多肽)的配体(形成特异性结合对) 的多功能性。任何大小的分子或组合物可用作靶标。
[0228]SELEX法包括从候选寡聚核苷酸混合物中进行选择， 并采用相同的选择方案逐步循环结合、区分和扩增以获得所需的结 合亲和性和选择性。该SELEX法以核酸混合物(优选包含随机序 列的片段)起始，包括以下步骤：将混合物和靶标在利于结合的条 件下相接触；将未结合核酸和与靶标分子特异性结合的核酸进行区 分；分离核酸-靶标复合物；扩增从核酸-靶标复合物分离的核酸以 获得核酸的配体富集混合物。根据需要重复结合、区分、分离和扩 增步骤以获得针对靶标分子的高特异性高亲和性核酸配体。
[0229]核苷酸适体可用作诊断工具或作为抑制剂来分析胞内 信号转导和运输途径(James(2001)Curr.Opin.Pharmacol. 1：540-546)。核苷酸适体的高亲和性和特异性使它们成为药物研发 的良好候选物。例如，毒素蓖麻毒素的适体拮抗剂已被分离并具有 纳摩尔级的IC50值(Hesselberth JR等人.(2000)J Biol Chem 275：4937-4942)。核苷酸适体还可用以抵抗传染性疾病、恶性肿瘤 以及病毒表面蛋白以降低细胞传染性。
[0230]本发明的方法采用的核苷酸适体可按此处所述的对其 它多聚核苷酸的修饰方法进行修饰(例如，修饰骨架或碱基或与肽 结合)。
[0231]采用Sp35的蛋白结构并通过SELEX过程来筛选作用 于Sp35的适体可对抑制Sp35介导的过程(例如，Sp35介导的轴 突再生抑制)的适体进行鉴别。
[0232]本发明的方法采用的多肽适体为根据其结合并因此阻 断Sp35作用的能力选择的任意肽。多肽适体可包括在两端与蛋白 支架连接的短可变肽区。这种双结构限制大大提升了肽适体的结合 亲和性，达到了与抗体相当的水平(纳摩尔级)。例如，参见 Hoppe-Seyler F等人.(2000)J Mol Med 78(8)：426-430。短可变肽的 长度通常约为10至20个氨基酸，该支架可以是任何具有良好溶解 性和相容性的蛋白。支架蛋白的一个非限制性范例为细菌蛋白硫氧 还蛋白-A。例如，参见Cohen BA等人.(1998)PNAS 95(24)： 14272-14277。此外，本发明的方法采用的多肽适体的一个非限制性 范例为配体调节肽适体(LiRPA)。该LiRPA支架可由三个蛋白区组 成：FK506结合蛋白(FKBP)、FRBP-雷帕霉素结合区(FRB)以及谷 胱甘肽-S-转移酶(GST)。例如，参见Binkowski BF等人.，(2005) Chem & Biol 12(7)：847-855，在此引用作为参考。
[0233]多肽适体为可作为蛋白功能显性抑制剂的肽或小多 肽。肽适体特异性结合目标蛋白，阻断其功能(Kolonin等人.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.95：14，266-14，271)。以高亲和性和特异性结合 目标蛋白的肽适体可通过本领域已知的多种技术进行分离。肽适体 可通过酵母双杂交筛选(Xu，C.W.，等人.(1997)Proc.Natl.Acad. Sci.94：12，473-12，478)或通过核糖体展示(Hanes等人.(1997)Proc. Natl.Acad.Sci.94：4937-4942)从随机肽库中分离得到。它们还可从 噬菌体库(Hoogenboom，H.R.，等人.(1998)Immunotechnology 4：1-20)或是化学生成肽库中分离得到。尽管由于肽适体合成较为困 难，其使用比多聚核苷酸适体更为复杂，但它们具有无限的化学多 样性。
[0234]本发明的方法采用的肽适体可参照本文别处描述的其 它多肽的修饰方法进行修饰(例如，与聚合物结合或与蛋白融合)。载体
[0235]包含编码Sp35拮抗剂的核酸的载体也可用于生成本发 明的方法采用的拮抗剂。与该种核酸可操作连接的载体和表达控制 序列的选择依赖于所需的功能(例如，蛋白表达)以及待转化的宿 主细胞。
[0236]可用于调节可操作连接的编码序列表达的表达控制元 件已为本领域所知。其范例包括，但不限于，诱导型启动子、组成 性启动子、分泌信号以及其它调节元件。在采用诱导型启动子时， 它可通过宿主细胞培养基中营养状态的改变或是温度的改变进行 控制。
[0237]载体可包括原核复制子，即，能够引导细菌宿主细胞 中染色体外重组DNA分子自主复制和维持的DNA序列。该种复制 子已为本领域公知。此外，包含原核复制子的载体还可包含其表达 可带来可测标记(例如耐药性)的基因。细菌耐药性基因的范例为 可对氨比西林或四环素形成抗性的基因。
[0238]包含原核复制子的载体还可包括原核或噬菌体启动 子，以引导编码基因序列在细菌宿主细胞中的表达。与细菌宿主相 容的启动子序列通常可在含有可插入待表达DNA片段的常规限制 性位点的质粒载体中予以提供。该种质粒载体的范例为pUC8， pUC9，pBR322以及pBR329(BioRad)，pPL和pKK223(Pharmacia)。 任何适用的原核宿主均可用于表达编码本发明的方法中采用的蛋 白的重组DNA分子。
[0239]可采用多种表达载体系统实现本发明目的。例如，一 类利用来自动物病毒(例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘 苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40 病毒)的DNA元件的载体。其它包括了具有内部核糖体结合位点 的多顺反子系统的应用。此外，将该DNA整合至其染色体的细胞 可通过导入一个或多个支持转染宿主细胞选择的标记进行选择。该 标记可向一种营养缺陷型宿主提供原营养、耐受抗微生物剂(例如， 抗生素)或耐受铜等重金属。该选择性标记基因既可直接连接至待 表达的DNA序列，也可通过共转化导入相同的细胞。新霉素磷酸 转移酶(neo)基因便是选择性标记基因的一个范例(Southern等人， J.Mot Anal.Genet.1：327-341(1982))。为优化mRNA的合成可能 还需要附加元件。这些元件可包括信号序列或剪接信号，以及转录 启动子、增强子，以及终止信号。
[0240]在一个实施方式中可采用称为NEOSPLA(美国专利 6,159,730)的Biogen IDEC，Inc.的专有表达载体。该载体包含了细胞 巨化病毒启动子/增强子、小鼠beta球蛋白主启动子、SV40复制起 始区、牛生长激素多聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1 和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。据发现该载体可在 转染进入CHO细胞，并经过含G418培养基中选择和甲氨蝶呤扩增 后可导致极高水平的表达。当然，任何能在真核细胞引发表达的表 达载体均可用于本发明。适用载体的范例包括，但不限于质粒 pcDNA3，pHCMV/Zeo，pCR3.1，pEF 1/His，pIND/GS，pRc/HCMV2， pSV40/Zeo2，pTRACER-HCMV，pUB6/V5-His，pVAX1和pZeoSV2 (可从Invitrogen，San Diego，CA购买)，以及质粒pCI(可从Promega， Madison，WI购买)。其它的真核细胞表达载体已为本领域所知并可 在市场上购得。该种载体通常包含可插入目标DNA片段的常规限 制性位点。示范性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1， pml2d(Intemational Biotechnologies)，pTDTl(ATCC 31255)，逆转录 表达载体pMIG和pLL3.7，腺病毒穿梭载体pDC315以及AAV载 体。其它示范性载体系统可参见U.S.Patent 6,413,777。
[0242]针对哺乳动物宿主细胞表达的常用调节序列包括在哺 乳动物细胞中引导高水平的蛋白表达的病毒元件，例如来自于逆转 录LRTs、细胞巨化病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿 病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病 毒主晚期启动子(AdmlP))、多瘤的启动子和增强子以及天然免疫 球蛋白和肌动蛋白启动子等强哺乳动物启动子。对病毒调节元件及 其序列的进一步描述可参见，例如Stinski，U.S.Pat.No.5,168,062； Bell，U.S.Pat.No.4,510,245以及Schaffher，U.S.Pat.No.4,968,615。
[0243]重组表达载体可携带调节载体在宿主细胞中复制(例 如，复制起始区)的序列和选择性标记基因。选择性标记可帮助选 择未导入载体的宿主细胞(例如，参见Axel，U.S.Pat.Nos.4,399,216； 4,634,665以及5,179,017)。例如，该选择性标记基因通常可赋予 导入了该载体的宿主细胞对药物(例如G418，潮霉素或氨甲喋呤) 的耐受性。常用的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因 (针对dhfr-宿主细胞在氨甲喋呤选择/扩增中的使用)和neo基因 (针对G418选择)。
[0244]编码Sp35拮抗剂的载体可用于转化适当的宿主细胞。 转化可通过任何适用方法进行。将外源性DNA导入哺乳动物细胞 的方法已为本领域公知并包括葡萄糖介导转染、磷酸钙沉淀、聚凝 胺介导转染、原生质体融合、电穿孔、通过在脂质体中包封多聚核 苷酸进行转染以及直接将DNA显微注射进入细胞核。此外，还可 通过病毒载体将核酸分子导入哺乳动物细胞。还可通过包含待转入 哺乳动物细胞的外源性DNA的重组病毒转导哺乳动物细胞。
[0245]宿主细胞转化可通过载体和宿主细胞适用的常规方法 实现。对于转化原核细胞，可采用电穿孔和盐处理法(Cohen等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110-14(1972))。对于转化脊椎动物 细胞，可采用电穿孔、阳离子脂质体或盐处理法。例如，参见Graham 等人，Virology 52：456-467(1973)；Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 7(5：1373-76(1979)。
[0246]该用于蛋白表达的宿主细胞系最优选来源于哺乳动 物；本领域技术人员应当具有确定并优选适用于表达目标基因产物 的特定宿主细胞系的能力。示范性宿主细胞系包括，但不限于， NSO，SP2细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝癌细 胞(例如，Hep G2)，A549细胞DG44和DUXB11(中国仓鼠卵 巢细胞系，DHFR-)，HELA(人子宫颈癌)，CVI(猴肾细胞系)，COS (带有SV40T抗原的CVI衍生物)，R1610(中国仓鼠纤维原细胞) BALBC/3T3(小鼠纤维原细胞)，HAK(仓鼠肾细胞系)，SP2/0(小 鼠骨髓瘤)，P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细 胞)，RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。通常可从商业服务机构、 美国组织培养保藏中心(American Tissue Culture Collection)或公开 文献获取。
[0247]生产细胞系中的多肽表达可通过已知技术进行增强。 例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系统常用于特定条件下的表达增强。例 如，参见European Patent Nos.0216846，0256055和0323997以 及European Patent Application No.89303964.4.宿主细胞
[0248]本发明的方法采用的表达Sp35拮抗剂的宿主细胞可以 是原核或真核细胞。示范性的真核细胞包括，但不限于，酵母和哺 乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC编号CCL61)、 瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3(ATCC编号CRL1658)以及幼仓鼠肾细 胞(BHK)。其它有用的真核宿主细胞包括昆虫细胞和植物细胞。示 范性的原核宿主细胞为大肠杆菌和链霉菌。基因治疗
[0249]Sp35拮抗剂可通过基因治疗方法在哺乳动物(例如， 人类患者)体内生成，以治疗与DA神经元变性、死亡或再生缺失 相关的疾病、紊乱或损伤。这涉及施用可操作连接至适当表达控制 序列的编码适当Sp35拮抗剂的核酸。一般而言，该序列被整合进 入病毒载体。用于该种基因治疗的适当病毒载体包括腺病毒载体， 甲病毒载体，肠道病毒载体，瘟疫病毒载体，慢病毒载体，杆状病 毒载体，疱疹病毒载体，Epstein Barr病毒载体，乳多空病毒载体， 痘病毒载体和牛痘病毒载体，腺相关病毒以及单纯疱疹病毒。该病 毒载体可以是复制缺陷型病毒载体。通常可采用E1基因或E3基因 缺失的腺病毒载体。当采用腺病毒载体时，该载体通常不具有选择 性标记基因。药物组合物
[0250]本发明的方法采用的Sp35拮抗剂可制成药物组合物以 向哺乳动物(包括人)施用。本发明的方法中采用的药物组合物包 含了药学可接受的载体，例如包括离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝， 卵磷脂，血清蛋白(例如人血清白蛋白)，缓冲物质(例如磷酸盐， 氨基乙酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合物， 水，盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾， 氯化钠，锌盐，硅胶，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的 物质，聚乙烯乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯 -聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙烯乙二醇和羊毛脂)。
[0251]本发明的方法采用的组合物可通过任何适用方法(例 如，肠胃外，心室内，经口，通过吸入喷雾，局部，直肠，鼻腔， 口腔，阴道或通过植入药盒)给药。此处所用的术语“肠胃外给药” 包括皮下，静脉内，肌肉内，关节内，滑液内，胸骨内，鞘内，肝 内，病灶内和颅内注射或灌输技术。如前文所述，本发明的方法采 用的Sp35拮抗剂作用于神经系统以促进少突细胞的存活、再生和 分化以及神经元的髓鞘形成。相应地，在本发明的方法中，该Sp35 拮抗剂以可以穿越血脑屏障的方式进行施用。这种穿越可通过Sp35 拮抗剂分子本身固有的物理化学属性，药物制剂中的其它成分，或 通过可到达血脑屏障的仪器设备(如针、套管或外科器具)得以实 现。当该Sp35拮抗剂是一种不能天然穿越血脑屏障的分子时，例 如，与帮助穿越的部分相融合时，适用的给药途径为，例如鞘内或 颅内注射，例如直接注射至MS的慢性病灶。当该Sp35拮抗剂是 一种能够天然穿越血脑屏障的分子时，其给药途径可以是下述多种 途径中的一种或多种。
[0252]本发明的方法采用的组合物的无菌可注射形式可以是 水或油悬浮液。这些悬浮液可参照本领域的已知技术，采用适当的 分散剂或湿润剂以及悬浮剂进行制备。该无菌、可注射制剂还可以 是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌、可注射溶液或 悬浮液，例如1，3-丁二醇中的悬浮液。可供采用的可接受的溶媒和 溶剂可以是水、Ringer溶液以及等渗氯化钠溶液。此外，无菌、固 定油常可用作溶剂或悬浮介质。为达到该种目的，可采用任何温和 固定油，包括合成的单-或二-甘油酯。与天然的药学可接受的油(例 如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙基化产物)类似，油酸及其甘 油酯衍生物等脂肪酸可用于制备可注射剂，这些油溶液或悬浮液还 可包含长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或是常用于制备 包括乳剂和悬浮剂的药学可接受剂型的类似分散剂。其它在制备药 学可接受固体、液体或其它剂型中常用的表面活性剂(例如，Tweens， Spans)以及其它乳化剂或生物相容性强化剂也可用于该制剂目的。
[0253]肠胃外剂型可以是单剂量、灌输或在负荷剂量后加以 维持剂量。这些组合物可以固定或可变的间隔(例如，一天一次， 或“按需”给药)给药。
[0254]本发明的方法所采用的特定药物组合物可通过可接受 剂型(例如，胶囊，片剂，水悬浮液或溶液)进行口服给药。特定 的药物组合物还可通过鼻腔喷雾或吸入的方式给药。该种组合物可 制备成盐溶液、采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂(以 增加生物相容性)和/或其它常规增溶或分散剂。
[0255]Sp35拮抗剂可与载体材料结合以制备单剂型，该Sp35 拮抗剂量随治疗宿主、所用的拮抗剂类型以及施用的特定模式的变 化而不同。该组合物可以单剂量、多剂量或在一定时间段内以灌输 的方式施用。还可对给药方案进行调整以获得最佳的目标响应(例 如，治疗或预防响应)。
[0256]本发明的方法采用“治疗有效量”或“预防有效量”的 Sp35拮抗剂。该种治疗或预防有效量可因个体的疾病状态、年龄、 性别以及体重等因素而不同。治疗或预防有效量还可以是治疗有益 效果超越毒性或有害效果的量。
[0257]对任意特定患者的具体剂量和治疗方案取决于多种因 素，包括所用的特定Sp35拮抗剂，患者年龄，体重，总体健康， 性别，以及饮食，给药时间，排泄率，药物组合，以及具体的待治 疗疾病的严重性。医疗看护者对该类因素的判断属于本领域的普通 技术。该给药量还取决于待治疗的个体患者，给药途径，剂型，所 用化合物的性质，疾病的严重性，以及所需的效果。该给药量可采 用本领域公知的药理和药代动力学原理进行制定。
[0258]在本发明的方法中该Sp35拮抗剂通常经脑室或鞘内直 接施用于神经系统，例如施用至MS的慢性病灶。根据本发明的方 法施用的组合物可制成制剂，从而可以按照0.001-10mg/kg体重/天 的剂量施用Sp35拮抗剂多肽。在本发明的一些实施方式中，该剂 量为0.01-1.0mg/kg体重/天。在一些实施方式中，该剂量为 0.001-0.5mg/kg体重/天。
[0259]在采用Sp35拮抗剂抗体进行治疗时，该剂量相对宿主 体重可以为，例如，从约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg (例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg， 2mg/kg等)。例如，该剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或 在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。上述范围的中间剂量也在 本发明的范围之内。对象给药可采取每天给药，隔日给药，每周给 药或根据任何其它通过实证分析得到的进度给药。一种示范性的治 疗需要在较长的期限内(例如，至少六个月)进行多剂量给药。一 种示范性的治疗方案采用每两周施用一次或每月施用一次或每3至 6个月施用一次。示范性的剂量给法包括连续每天1-10mg/kg或 15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中对具有不 同结合特异性的两种或多种单克隆抗体同时给药，其中各抗体的给 用剂量均在指示的范围之内。
[0260]在特定的实施方式中，可采用编码Sp35拮抗剂多聚核 苷酸的核酸分子治疗对象。核酸的剂量范围为每个患者约10ng至 1g，100ng至100mg，1μg至10mg，或30-300μg DNA。传染性病 毒载体的剂量在每剂10-100或更多病毒体。
[0261]本发明的方法采用的组合物还可结合辅助活性化合 物。例如，可溶性Sp35多肽或融合蛋白可与一种或多种附加治疗 剂共同制剂或共同施用。
[0262]本发明包含了向选定目标组织传递本发明Sp35拮抗剂 的任意适用传递方法，包括水溶液的弹丸注射或控释系统的植入。 控制植入减少了重复注射的需求。
[0263]本发明的方法采用的Sp35拮抗剂可直接灌输入脑部。 已知有多种直接向脑部灌输化合物的方法，且这些方法对于向患有 神经紊乱的人类患者传递治疗化合物非常有效。这些方法包括适用 泵向脑部慢性灌输、立体定向灌输、临时间质导管、永久颅内导管 灌输以及外科手术植入的可生物降解的灌输。例如，参见Gill等人， 同前文；Scharfen等人，″High Activity Iodine-125Interstitial Implant For Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)：583-591 (1992)；Gaspar等人，″Permanent 1251Implants for Recurrent Malignant Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.45(5)：977- 982(1999)；chapter 66，pages 577-580，Bellezza等人，″Stereotactic Interstitial Brachytherapy，″in Gilderiberg等人，Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill(1998)；以及 Brem等人，″The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas：Phase I Trial，″J. Neuro-Oncology 26：111-23(1995)。
[0264]该组合物还可包括一种Sp35拮抗剂，该拮抗剂分散于 作为该化合物适当传递或支持系统的生物相容载体材料中。缓释载 体的适当范例包括成形(例如栓剂或胶囊)的半透性聚合物基质。 可植入的或是微胶囊状的缓释基质包括具乳酸(U.S.Patent No. 3,773,319；EP 58,481)，L-谷氨酸和gamma-乙基-L-谷氨酸酯共聚物 (Sidman等人，Biopolymers 22：547-56(1985))；聚(2-羟乙基-异丁烯 酸酯)，乙烯醋酸乙烯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res. 15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.2：98-105(1982))或聚 -D-(-)-3羟基丁酸(EP 133,988)。
[0265]在本发明的一些实施方式中，Sp35拮抗剂通过直接灌 输至脑部适当区域的方式施用至患者。例如，参见Gill等人.，″Direct brain infusion of glial cell line derived neurotrophic factor in Parkinson disease，″Nature Med.9：589-95(2003)。此外还存在其它技术并可用 于施用本发明所述的Sp35拮抗剂。例如，可采用Riechert-Mundinger 设备和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位设备实现立体定向安置 导管或植入物。一种对比增强计算机断层摄影术(CT)扫描(注射 120ml欧乃派克，350mg碘酒/ml，层厚2mm)可支持三维多层治 疗计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。该技术支持在磁共振影像 研究的基础上进行计划，融合CT和MRI目标信息以进行明确的目 标确认。
[0266]经改造后可配合使用GE CT扫描仪(General Electric Company，Milwaukee，WT)的Leksell立体定向系统(Downs Surgical， Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)立体定向系统 (Radionics，Burlington，MA)可用于该种用途。因此，在灌输初期， 可将BRW立体定向框架的环状底座圈附着在患者的头骨上。可以 3mm的间隔通过带有夹在底盘上的石墨棒定位框的(目标组织)区 域获取连续CT层。计算机治疗计划程序可以在VAX 11/780计算 机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行，该计算 机采用石墨棒成像的CT坐标在CT空间和BRW空间之间绘图。
[0267]此处所述的治疗紊乱的方法，要得到目标治疗或预防 活性，通常可在人体使用前先进行体外试验，然后在可接受的动物 模型中进行体内试验。合适的动物模型(包括转基因动物)可为本 领域普通技术人员所知。例如，此处所述的验证Sp35拮抗剂分化 和存活作用的体外测试。Sp35拮抗剂对于轴突髓鞘形成的作用可参 照实施例描述进行体外测试。最后，可通过构建表达Sp35拮抗剂 的转基因小鼠或通过向此处描述的小鼠或大鼠施用Sp35拮抗剂进 行体内试验。
[0268]本发明的实施将采用(除非另行指出)细胞生物学， 细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA， 以及免疫学的常规技术，其均在本领域的技术范围之内。该类技术 在文献中得到了充分的解释。例如，参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3-Volume Set)，J.Sambrook，D.W.Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)；Genes Vm，B.Lewin，Prentice Hall(2003)；PCR Primer，CW.Dieffenbach及G.S.Dveksler，CSHL Press(2003)；DNA Cloning，D.N.Glover ed.，Volumes I and II(1985)； Oligonucleotide Synthesis：Methods and Applications(Methods in Molecular Biology)，P.Herdewijn(Ed.)，Humana Press(2004)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，4th edition，R.I. Freshney，Wiley-Liss(2000)；Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gait (Ed.)，(1984)；Mullis等人.U.S.Pat.No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization，B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)；Nucleic Acid Hybridization，M.L.M.Anderson，Springer(1999)；Animal Cell Culture and Technology，2nd edition，M.Butler，BIOS Scientific Publishers(2004)；Immobilized Cells and Enzymes：A Practical Approach(PracticaI Approach Series)，J.Woodward，M Pr(1992)； Transcription And Translation，B.D.Hames&S.J.Higgins(Eds.) (1984)；Culture Of Animal Cells，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.， (1987)；Immobilized Cells And Enzymes，IRL Press，(1986)；A Practical Guide To Molecular Cloning，3rd edition，B.Perbal，John Wiley&Sons Inc.(1988)；the treatise，Methods Li Enzymology， Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells，J.H.Miller and M.P.Calos eds.，Cold Spring Harbor Laboratory (1987)；Methods In Enzymology，Vols.154and 155，Wu等人.(Eds.)； Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology，Mayer and Walker，(Eds.)，Academic Press，London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV，D.M.Weir和C.C. Blackwell(Eds.)，(1986)；Immunology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques(4Volume Set)，1st edition， I.Lefkovits，Academic Press(1997)；Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002)；以及Ausubel等人.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)。
[0269]抗体工程的一般原则参见Antibody Engineering： Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，B.L.Lo(Ed.)， Humana Press(2003)；Antibody engineering，R.Kontermann and S. Dubel(Eds.)，Springer Verlag(2001)；Antibody Engineering，2nd edition，C.A.K.Borrebaeck(Ed.)，Oxford Univ.Press(1995)。蛋白工 程的一般原则可参见Protein Engineering，A Practical Approach， Rickwood，D.，等人，Eds.，IRL Press at Oxford Univ.(Eds.)，IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)。抗体和抗体-半抗原结合 的一般原则可参见Antibodies：A Laboratory Manual，E.Harlow和D. Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；Nisonoff，A.， Molecular Immunology，2nd edition，Sinauer Associates，Sunderland， MA(1984)；and Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure and Function，Chapman和Hall，New York，NY(1984).此外，本领域已 知但未具体描述的免疫学标准方法可参照Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，New York；Stites等人.(Eds.)， Immunochemical Protocols(Methods in Molecular Biology)，2nd edition，J.D.Pound(Ed.)，Humana Press(1998)，Weir′s Handbook of Experimental Immunology，5th edition，D.M.Weir(Ed.)，Blackwell Publishers(1996)，Methods in Cellular Immunology，2nd edition，R. Fernandez-Botran，CRC Press(2001)；Basic and Clinical Immunology， 8th edition，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)and Mishell and Shiigi(Eds.)，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H. Freeman and Co.，New York(1980)。
[0270]阐述了免疫学基本原理的标准参考著作包括Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，New York；Klein，J.； Kuby Immunology，4th edition，R.A.Goldsby，等人.，H.Freeman& Co.(2000)；Basic and Clinical Immunology，M.Peakman，等人.， Churehill Livingstone(1997)；Immunology，6th edition，I.Roitt，等人.， Mosby，London(2001)；Cellular and Molecular Immunology，5th edition；A.K.Abbas，A.H.Lichtman，Elsevier-Health Sciences Division(2005)；Immuology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques(4Volume Set)，1st edition，I.Lefkovits， Academic Press(1997)Immunology，5th edition，R.A.Goldsby，等人.， W.H.Freeman(2002)；Monoelonal Antibodies：Principles and Practice，3rd Edition，J.W.Goding，Academic Press(1996)； Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley &Sons，New York(1982)；Kennett，R.，等人.(Eds.)，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses， Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，″Monoclonal Antibody Technology＂in Burden，R.，等人.(Eds.)，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Elsevere，Amsterdam (1984).
[0271]前文及此处引用的所有参考文献均在此全文引用作为 参考。
具体实施方式
实施例1.
Sp35(LINGO-1)在大鼠中脑多巴胺能(DA)神经元中得到表达
Sp35(LINGO-1)在大鼠中脑多巴胺能(DA)神经元中得到表达
[0272]Sp35的表达可通过免疫组化和/或原位杂交在出生后7 日(P7阶段)于大鼠脑部、成年大鼠脑部以及大鼠原代胚胎培养(El 5)中进行评估。可用处于上述P7和成年阶段的大鼠制备冷冻大鼠 脑部切片。可采用下列方案并参照Mi等人.Neurosci. 7：221-228(2004)的描述制备脑部切片以供原位杂交。使用CO2将动 物处死。快速取出脑部并以10％中性缓冲福尔马林固定48小时。 以含30％蔗糖的PBS平衡脑部以进行冷冻保护和连续切片。对随 机选择的包含总腹侧中脑的每第6个的切片系列进行原位杂交。
[0273]以地高辛标记的Sp35反义和正义RNA探测脑部切片。 参照生产商说明使用荧光性TSA和抗地高辛结合抗体试剂盒 (Perkin Elmer)对切片染色。然后以DAPI(Sigma)和抗酪氨酸羟化酶 (TH)抗体(Chemicon)对切片染色。在P7阶段，Sp35mRNA在中脑 酪氨酸羟化酶(TH)-阳性DA神经元适度表达。根据之前的报导，在 小脑中还有强烈的Sp35mRNA表达，而在纹状体中有较弱的表达。 参见Mi等人.Nat.Neurosci.7：221-228(2004)。然而，在成年中脑 中，TH阳性DA神经元中的Sp35mRNA表达相对较少。
[0274]原代胚胎腹侧中脑(VM)培养物可参照Lin，L.等人. Mol.Cell Neurosci.28：547-555(2005)的描述从E15Sprague Dawley 大鼠中分离得到。简单的说，在含有热灭活马血清(10％)、葡萄糖(6.0 mg/ml)、青霉素(10,000U/ml)、链霉素(10mg/ml；Sigma)和谷氨酰胺 (2mM；Gibco)的冷Dulbecco改良EAGLE培养基(DMEM；Gibco，NY) 中用抛光巴斯德移液管机械破碎脑组织。在培养基中重新悬浮 2×105细胞，并接种至24孔盘(Falcon)中各微孔的以15mg/ml聚-L- 鸟氨酸(Sigma)和1mg/ml纤维连接蛋白(Sigma)预涂的盖玻片上。
[0275]可参照Lin，L.等人Mol.Cell.Neurosci.28：547-555 (2005)的描述对脑部切片和VM原代培养物进行荧光免疫组化。简 单地说，以10％普通山羊血清(Jackson Laboratories，Maine)和含 0.1％Triton X-100的0.1M磷酸盐缓冲液溶液(PBS)在室温下处理约 含2×105细胞的盖玻片30分钟。随后，将盖玻片与一抗在4℃下孵 育过夜，然后与直接结合荧光的适当二抗在室温下孵育1小时。可 采用以1∶300稀释的针对酪氨酸羟化酶(TH)的抗体(Chemicon)(一 种DA神经元标记)。可采用以1∶500的浓度与Alexa 488(Molecular Probes)结合的二抗。缺少一抗或以过量抗原预孵育的抗体可用作对 照。可通过共焦成像系统(LSM510 META，Carl Zeiss，NY)检查荧光 信号。
[0276]在原代VM培养物中，可在Sp35和TH染色共存的 DA神经元观察到Sp35。当Sp35特异性抗体与过量Sp35蛋白预孵 育时未检测到染色。Sp35还可在人黑质和啮齿动物中脑的非TH神 经元中表达。
[0277]这些试验显示Sp35在胚胎中脑(E15)和P7DA神经元中 表达，在成年VM中以较小程度表达。免疫组化研究还显示Sp35 蛋白不仅在神经突中表达，还在中脑原代培养的DA神经元的质膜 中表达。实施例2.
Sp35(LINGO-1)拮抗剂促进DA神经突体外生长和存活
Sp35(LINGO-1)拮抗剂促进DA神经突体外生长和存活
[0278]Sp35的细胞质区包含了规范的EGFR样酪氨酸磷酸化 位点，因而具有直接或间接参与信号转导的潜力。为评估细胞质区 的重要性，可构建缺失细胞质区(SEQ ID NO：2的氨基酸34-581或 34-548)的截短型Sp35(DN-Sp35)。据显示缺失了细胞质区的截短 型Sp35可通过与Nogo受体1(NgR1)和p75NTR和/或如TAJ/TROY 等其它受体形成复合物作为显性阴性(DN)分子阻止信号转导。参见 Shao等人.Neuron 45：353-359(2005)以及Park等人.Neuron 45：345-351(2005)。
[0279]表达全长(FL)-Sp35(SEQ ID NO：2的氨基酸34-614) 或显性阴性(DN)-Sp35的慢病毒可采用下列方法以及Mi等人. Neurosci.7：221-228(2004)的描述进行构建。将全长和截短型 (DN-Sp35)人Sp35的cDNA序列亚克隆至pSECTAG-A(Invitrogen) 以表达HA标记的融合蛋白，然后连接至HRST-IRESeGFP载体。 将慢病毒构建体和水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)及包装载体delta 8.9参照Wang等人.Nature 417：941-944(2002)的描述共转染进入 293T细胞以生成重组慢病毒。
[0280]以生成FL-Sp35、显性DN-Sp35的慢病毒或以载体对 照转导大鼠原代VM神经元培养物。各病毒组以1或5的感染复数 (MOI)添加入VM神经元培养物中。将细胞培养24小时，然后以含 4％的多聚甲醛的PB(pH 7.4)在室温下固定30分钟。在这些感染神 经元中检查神经突的生长。为检查神经突延长或细胞数量，可采用 全能Axioskop 2显微镜(Carl Zeiss，NY)和Steroinvestigator图像捕捉 设备和软件(MicroBrightField，VT)从各个微孔捕捉多个视野。
[0281]DN-Sp35感染的TH-阳性神经元中的神经突的生长得 到了促进。相反的，TH-阳性神经元在以FL-Sp35转导时未显示神 经突长度的差异。这些观察显示DN-Sp35扰乱了内源性Sp35的功 能，从而促进了DA神经突生长。参见图1。
[0282]Sp35-Fc蛋白(与Fc区融合的SEQ ID NO：2的氨基酸 1-532)可用于测定它是否可在DA神经元中通过促进DA神经突生 长用作FL-Sp35功能的拮抗剂。对照-Fc和Sp35-Fc可参照Mi等 人.Nat.Neurosci.7：221-228(2004)的描述进行制备。简单地说，将 人Sp35的氨基酸1-532融合至人IgG1的铰链和Fc区。在CHO细 胞中表达Sp35-Fc多肽并在蛋白A琼脂糖(Pharmacia)上进行纯化。 通过在还原条件下于SDS-PAGE凝胶上进行凝胶电泳并与已知蛋 白标准对照测得纯化后蛋白(＞95％纯)的分子量为90kDa。在非还 原条件下于SDS-PAGE凝胶上进行凝胶电泳并与已知标准对照测 得该蛋白的分子量为180kDa。
[0283]向VM神经元的培养物外源提供纯化Sp35-Fc多肽。 神经突生长可通过添加过量Sp35-Fc得到促进。参见图1。外源提 供的对照IgG多肽未能促进DA神经突生长。此外，还对以表达 DN-Sp35的慢病毒处理的培养物的TH神经突长度进行了检测。以 DN-Sp35和Sp35-Fc处理的培养物显著长于以对照慢病毒(p＜0.05， 单因素方差分析)和对照Fc处理的培养物(p＜0.003)。
[0284]DN-Sp35的作用还在以1-甲基-苯基吡啶离子(MPP+) 处理的原代VM培养物中得到了测验。MPP+通常诱导细胞原代DA 神经元细胞的细胞死亡，并且是研究PD的成熟模型系统。参见Gille 等人，Ann NY Acad Sci 1018：533-540(2004)。参照上文描述以慢病毒 感染VM神经元。在第4日将培养细胞对10μM MPP+暴露48小时， 然后(第6日)进行固定。DN-Sp35在大鼠中脑原代培养中对暴露 至10μM MPP+TH-阳性神经元加以保护。参见图2。在暴露至MPP+ 时DN-Sp35转导细胞中的TH神经元的数量明显高于FL-Sp35和对 照转导神经元(p＜0.05，单因素方差分析)。此外，如美国临时专利申 请60/697,336所描述(其全文在此引用作为参考)，暴露至MPP+ 的原代VM培养物可通过暴露至Sp35-Fc和Sp35拮抗剂、抗体1A7 而防止细胞死亡。以Sp35-Fc和1A7抗体处理的细胞与Fc或对照 IgG处理的培养物相比，前者具有对抗TH-阳性神经元的MPP+毒 性的显著的保护作用(1A7的p＜0.01，Sp35-Fc的p＜0.05，单因素 方差分析)。参见图3。这些结果显示抑制内源性Sp35可使DA神 经元在MPP+神经毒素暴露中得到保护。实施例3.
阻断Sp35活性诱导Akt磷酸化
阻断Sp35活性诱导Akt磷酸化
[0285]Akt是PI3激酶存活途径的下游效应物。Williams及 Doherty Mol.Cell.Neurosci.13：272-280(1999)。大鼠原代VM培养 物中的普通Akt磷酸化水平可通过Western印迹分析进行评估。实 施例2中已经描述了采用表达FL-Sp35或DN-Sp35(HA-标记)的 慢病毒转导大鼠原代VM神经元。在48小时后收集转导的大鼠原 代VM神经元，并在500μl溶解缓冲液(50mM HEPES(pH 7.5)；150 mM NaCl；1.5mM MgCl2；1mM EDTA；1％Triton X-100以及10％ 甘油)中于4℃下溶解30分钟。在4-20％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad， CA)中将上清液电泳，转移至免疫印迹膜并以抗-HA亲和基质 (Roche，Switzerland)或抗-磷Akt抗体(Cell Signaling，MA)或抗-总 Akt抗体(Cell Signaling，MA)进行探测。
[0286]与通过表达FL-Sp35或对照载体的慢病毒转导的大鼠 原代VM神经元相比，以表达DN-Sp35的慢病毒转导的大鼠原代 VM神经元的Akt磷酸化显著上升。参见图4。这些结果显示 DN-Sp35通过参与PI3/Akt信号转导途径部分影响TH-阳性神经元 的存活。实施例4.
Sp35敲除小鼠的构建
Sp35敲除小鼠的构建
[0287]如Schiemann等人.(Science 293：2111-2114(2001)所 述，Sp35敲除小鼠可通过靶向Sp35的完整、单个外显子编码序列 的GFP/Neo(绿色荧光蛋白/新霉素)置换性载体进行构建。从 lambda基因组库(Stratagene#946313)分离小鼠基因组129/SvJ DNA。将14.6-kb EcoRV片段亚克隆进入pBSK+，然后通过同源性 重组在细菌内靶向以在起始ATG插入eGFP Q40报告基因。最终的 构建体删除了Sp35的单独外显子编码序列的完整1-1841核苷酸。 该构建体可用于在D3(129/Sv)胚胎干细胞中靶向Sp35位点。正确 靶向的细胞可通过对EcoRI-消化的胚胎干细胞DNA的Southern印 迹进行鉴定，将该正确靶向的细胞注射进入C57B1/6胚囊以生成嵌 合小鼠。将嵌合体杂交进入C57B1/6小鼠以生成杂合子首建小鼠。 通过尾DNA的三引物PCR测定基因型。在35次循环反应中(94℃ 反应20s，65℃反应30s，72℃反应30s)，利用正向引物 5′-CTATCCAAGCACTGCCTGCTC-3′(SEQ ID NO：6)和两个反向引 物5′-GAGTTCTAGCTCCTCCAGGTGTG-3′(SEQ ID NO：7)及 5′-GATGCCCTTCAGCTCGATGCG-3′(SEQ ID NO：，8)分别得到了 275bp野生型和356bp突变等位基因产物。参见Mi，S.等人.Nat. Neurosci.7：221228(2004)。Sp35基因缺失可通过Southern印迹、 RT-PCR和norther印迹分析进行验证。在野生型小鼠的northern印 迹和RT-PCR中测得了明显条带，而在敲除小鼠中则发现条带完全 缺失。杂合子的Southern印迹同时显示了野生型和修饰的Sp35等 位基因。Sp35敲除小鼠表现正常，未有明显的生理异常或行为、运 动或繁殖力上的变化。杂合子F1后代同胎仔畜的大小各不相同。 Sp35敲除小鼠的构建可参见Mi等人.Nat.Neuroscience 7：221-228 (2004)，在此引用作为参考。实施例5.
Sp35敲除小鼠中DA神经元存活和再生的体内6-OHDA测定
Sp35敲除小鼠中DA神经元存活和再生的体内6-OHDA测定
[0288]检查Sp35敲除小鼠以测定没有Sp35的小鼠其损伤后 的脑中多巴胺能途径中的神经元存活和功能恢复是否得到提高。使 用克他命和甲苯噻嗪(分别为100和10mg/kg ip)麻醉13只Sp35 敲除小鼠和13只野生型同胎仔畜对照小鼠，并置于立体定向仪以 接受单侧纹状体6-羟多巴胺盐酸(6-OHDA)注射。以优碘和乙醇擦 拭手术位置，形成0.5em的中线径向切口以暴露前囟。在注射位点 上的颅骨上形成小钻孔，并在AP+04、侧面1.5mm、中线侧面、头 骨表面的腹侧DV-2.5mm的坐标处将溶解了10μg 6-OHDA的0.02％ 抗坏血酸/盐水(Sigma)注射入左纹状体。采用26规格的10μl汉密 尔顿注射器以0.5μl/min的速率灌输6-OHDA达2分多钟。
[0289]在灌输6-OHDA后，将套管留在原处2分钟，然后缓 慢拔出。使用自动夹闭合切口，将小鼠放置在电热垫上直至从麻醉 中恢复。在小鼠纹状体注射6-OHDA可使DA轴突和神经元逐渐减 少，这是研究PD的成熟模型系统。参见Brundin等人.Brain Res. 366：346-349(1986)。
[0290]在6-OHDA灌输后1，2，3和4周后进行旋转测试。为旋 转测试，以0.4mg/kg的剂量皮下注射含有阿朴吗啡的0.02％抗坏 血酸。计算30分钟内相对损伤侧的旋转。
[0291]“旋转行为”指对黑质纹状体多巴胺途径单侧损伤的动 物施用如阿朴吗啡等多巴胺激动剂或如苯丙胺等多巴胺释放剂时 所显示的行为。动物将反复旋转以远离脑部受纹状体多巴胺受体刺 激更大的一侧。旋转响应的量级(即，进行旋转的数量)与黑质纹 状体多巴胺途径受损的程度成正比。例如，参见Fuxe等人. Pharmacol.Ther.2：41-47(1976)。
[0292]在旋转行为测定至少24小时后将小鼠通过CO2窒息处 死。快速取出脑部并以10％中性缓冲福尔马林固定48小时。以含 30％蔗糖的PBS平衡脑部以进行冷冻保护和连续切片。对随机选择 的包含总腹侧中脑的每第6个切片的切片系列进行常规ABC免疫 组化。将切片用抗-酪氨酸羟化酶(TH)(1∶300，Pel Freez，AK)在4℃下 孵育过夜，然后分别用生物素化的山羊抗-绵羊二抗(1∶300，Vector Laboratories，CA)和链霉亲和素-生物素复合物在室温下孵育1小时。 通过镍增强的3，3′-二氨基联苯胺溶液(Vector Laboratories，CA)孵育 对染色可视化。将一抗缺失作为对照。采用全能Axioskop 2显微镜 (Carl Zeiss，NY)和Steroinvestigator图像捕捉设备和软件 (MicroBrightField，VT)对染色切片进行体视学研究。采用光组分探 测对TH阳性细胞进行计数。通过Microbrightfield软件获得估计的 细胞总数。可通过研究者盲选群组治疗进行体视学分析。
[0293]在检测的各时间点上，敲除小鼠的运动不对称显著低 于野生型同胎仔畜对照(p＜0.001，双因素方差分析)。参见，图5。 在6-OHDA注射32天后的尸体解剖分析显示损伤中脑里的TH神 经元数量明显减少。体视学分析显示野生型和敲除小鼠的中脑里的 TH神经元的数量并无不同(p＞0.05，非配对t检验)。参见图6A。 为了校正由基因型产生的差异，各动物损伤中脑的TH神经元数量 被表示为未损伤侧数量的百分比。统计学分析显示敲除小鼠比野生 型小鼠中具有更高比例的TH神经元(p＝0.002，非配对t检验)，从 而证明了与野生型同胎仔畜对照相比敲除小鼠在6-OHDA模型中 得到了保护。参见图6B。
[0294]在腹侧被盖区(VTA，A10区)和黑质致密部(SNc，A9区) 区域采用Blum，M.，Nat.Neurosci.1：374-377(1998)中描述的无偏光 分离法对TH神经元的数量进行体视学计数。KO和WT小鼠的TH 神经元数量上并无区别(F1,48＝1.321，p＞0.05)。然而，损伤和未损伤 侧的TH细胞数量明显不同(F1,48＝27.53，p＜0.0001)，且损伤和未损伤 侧的TH细胞数量明显受到基因型的影响(基因型和脑侧之间的相 互作用)(F1,48＝4.34，p＞0.05)。参见图8。将各动物的损伤侧的神经 元数量通过未损伤侧的神经元数量归一化以防止基因型的影响。统 计学分析显示KO小鼠的TH神经元数量(平均±s.e.m.：79％±4.5％) 高于WT小鼠(56％±5.5％)(非配对学生t检验，t(24)＝3.34；p＝0.003)， 这证明了敲除在这些小鼠中的神经保护作用。
[0295]在6-OHDA诱导的试验性帕金森综合症模型的野生型 小鼠中，损伤3日后纹状体中的Sp35蛋白有所上升。参见图9。在 野生型小鼠纹状体施用6-OHDA 3日后，与对照侧(对照)相比损 伤侧(6-OHDA)的Sp35得到上调。在各个时间点上(第0，3，7和15 日)检查3只小鼠(非配对学生t检验，p＜0.05)。实施例6
Sp35敲除小鼠中DA神经元存活和再生的体内MPTP测定
Sp35敲除小鼠中DA神经元存活和再生的体内MPTP测定
[0296]为进一步确认无Sp35的小鼠是否提高了损伤后的脑中 多巴胺能途径中的神经元存活和功能恢复，还可在PD的MPTP模 型中评估小鼠。以MPTP盐酸(Sigma)腹腔注射13只WT和14只 Sp35敲除小鼠四次，各注射间隔两小时。例如，参见Battaglia G 等人.，Neuropharmacology 45：155-166(2003)。所有的动物在注射后 7日处死。将小鼠通过CO2窒息处死。快速取出脑部并以10％中性 缓冲福尔马林固定48小时。以含30％蔗糖的PBS平衡脑部以进行 冷冻保护和连续切片。采用全能Axioskop 2显微镜(Carl Zeiss，NY) 和Steroinvestigator图像捕捉设备和软件(MicroBrightField，VT)对染 色切片进行体视学研究。采用光组分探测对TH阳性细胞进行计数。 通过Microbrightfield软件获得估计的细胞总数。可通过研究者盲选 群组治疗进行体视学分析。在MPTP处理7天后的尸体解剖体视学 分析显示KO小鼠的中脑中的TH神经元数量高于WT小鼠。参见 图6C。
[0297]在另一试验中，采用PD的MPTP模型对10只KO小 鼠和10只WT同胎仔畜进行了评估。以盐水注射的WT(n＝7)和 KO(n＝8)小鼠作为对照。在MPTP处理7天后的尸体解剖体视学分 析显示黑质致密部(SNc，A9区)中的TH细胞数量与对照WT和KO 小鼠之间并无区别。然而，与溶媒处理WT和KO小鼠相比，以 MPTP处理的WT小鼠的SNc中TH神经元数量有所减少(分别为 Kruskal-Wallis检验，p＜0.001)。参见图10。对照和MPTP处理的 KO小鼠的TH神经元数量并无统计学差异。
[0298]同样检测了对照和MPTP处理的KO和WT小鼠的纹 状体多巴胺水平。在冷冻的0.1M高氯酸(PCA，约100μl/mg组织) 中将切开的纹状体超声并离心。参照Yang，L.等人，Exp.Neurol. 191：86-93(2005)的描述取上清液进行多巴胺检测。简单地说，采用 含有0.1M LiH2PO4，0.85mM 1-辛基磺酸和10％(v/v)甲醇的流动相 通过80×4.6mm C18柱(ESA，Inc.，Chelmsford，MA)等度洗脱15μl 上清液，并用双通道Coulochem II电化学检测器(ESA，Inc.， Chelmsford，MA)进行检测。多巴胺的浓度表示为纳克/毫克蛋白。 采用Bradford法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)和Perkin Elmer Bio Assay Reader(Norwalk，CT)检测组织匀浆中的蛋白浓度。MPTP 处理的WT中的纹状体多巴胺水平低于对照WT小鼠 (Kruskal-Wallis检验，p＜0.01)和对照KO小鼠(p＜0.05)。参见图11。 对照和MPTP处理的KO小鼠多巴胺水平并无统计学差异，这与 6-OHDA范例中同样观察到的神经保护相一致。
[0299]为测定Sp35基因切除是否改变MPTP毒素摄取和代 谢，可在MPTP处理90分钟后测定Sp35KO和WT(各组均为n ＝6)中的纹状体MPP+水平。为测定MPP+，可于0.1M PCA中将 纹状体组织超声并离心，并将等分的上清液注射至META 250×4.6 C18柱(ESA，Inc.，Chelmsford，MA)。以含有3mM四丁基硫酸氢铵、 0.25mM 1-庚基磺酸和10％异丙醇的20mM硼酸/硼酸钠缓冲液(pH 7.75)等度洗脱样本。以设置为激发295nm和发射375nm的荧光检 测器检测MPP+。在MPTP处理后，KO和WT中的MPP+水平并 无显著区别(非配对学生检验，t(10)＝1.69；p＞0.05，平均±s.e.m.，WT 为39.68±3.92且KO为62.06±12.67)。Western印迹分析还显示 Sp35KO小鼠中的多巴胺运输(DAT)水平未改变。见图14。
[0300]此外，还对暴露至MPTP和对照的KO和WT小鼠的 VM组织溶解产物进行了Western印迹。在500μl溶解缓冲液中溶 解小鼠组织[50mM HEPES，pH 7.5，，150mM NaCl，1.5mM MgCl2， 1mM EDTA，1％Triton x-100，10％甘油，含完全蛋白酶抑制剂 (Roche，Basel，Switzerland)和磷酸酶抑制剂(Sigma)]。将上清液在 4-20％或10％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)中电泳，并以 抗-磷-Akt和抗Akt以及抗-EGFR抗体(Cell Signaling，Beverly，MA) 进行免疫印迹。可发现与暴露至MPTP的WT同胎仔畜对照相比， 暴露至MPTP的KO小鼠的腹侧中脑中的磷酸化Akt有所上升。参 见图6D-6F。
[0301]此外，还向C57BL/6小鼠(n＝9)的纹状体单侧注射了作 为显性-阴性分子的截短型Sp35--Sp35-Fc蛋白(6.5μg/μl，总计2μl)。 小鼠在手术后6目接受MPTP，然后继续存活7天。这些动物中TH 神经元数量的尸体解剖分析显示同侧SNc比相对侧SNc的数量更 高(非配对学生t检验；t(16)＝2.114；p＜0.05)。参见图15A。Sp35-Fc 注射的脑部具有更高的纹状体多巴胺水平(Mann-Whitney检验， p＜0.05)，从而显示了神经保护作用。参见图15B。此外，在脑部 Sp35-Fc注射侧和相对侧中，MPTP注射后90分钟检测的纹状体 MPP+水平并无区别。参见图15C。实施例7.
RNAi阻抑慢病毒的生成
RNAi阻抑慢病毒的生成
[0302]Sp35特异性RNAi可用于消除DA神经元中的Sp35表 达，从而检查Sp35如何促进DA神经突存活、再生和分化。以携 带了按下文制备的Sp35-特异性RNAi序列或对照RNAi的慢病毒 感染DA神经元培养物。
[0303]比较鼠和大鼠Sp35DNA序列以发现可用作候选小发夹 RNAs(shRNA)的同源区。用于Sp35RNAi慢病毒表达的CH324可 通过将寡核苷酸LV1-035和LV1-036退火并连接至Hpal和Xhol 消化的pLL3.7进行构建。关于该pLL3.7载体、附加方法及病毒生 产可参见Rubinson等人，Nat.Genet.33，401-06(2003)。Sp35 RNAi 寡聚核苷酸可从MWG购得并具有如下序列：LV1-035(正义寡聚)-
5′-TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCTAGCAG GATGACGATCTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：9)以及
LV1-036(反义寡聚)5′-
TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAA GTCTAGCAGGATGACGATCA-3′(SEQ ID NO：10).
5′-TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCTAGCAG GATGACGATCTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：9)以及
LV1-036(反义寡聚)5′-
TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAA GTCTAGCAGGATGACGATCA-3′(SEQ ID NO：10).
[0304]除以小写字母显示的核苷酸替换外，对照RNAi具有 相同的寡聚核苷酸序列：5′-TGATCcTCATcCttCTAtACTTCAAGAGAGTgTAGCAGGA TGAcGATCTTTTTTCTCGA-3′(SEQ ID NO：11)以及
5′-TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGA AGTaTAGaAGGATGACGATCA-3′.(SEQ ID NO：12).
5′-TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGA AGTaTAGaAGGATGACGATCA-3′.(SEQ ID NO：12).
[0305]在生成慢病毒前，来自pLL3.7的DNA或pLL3.7中的 候选shRNA将与鼠Sp35-HA标记质粒以5比1的比例共转染至6 孔板中的CHO细胞。可通过对转染CHO细胞溶解产物的Sp35-HA 标签进行Western印迹检测或对由重复微孔制备的总RNA的 northen印迹进行阻抑分析。该印迹以Sp35cDNA片段进行探测。 分析在转染后48小时进行。与预计相同，CH324RNAi-处理的CHO 细胞中的Sp35mRNA比对照处理细胞少10倍。实施例8.
Sp35表达的Sp35-特异性RNAi阻抑可以促进DA神经元存活和分 化
Sp35表达的Sp35-特异性RNAi阻抑可以促进DA神经元存活和分 化
[0306]为检测DA神经元中Sp35表达缺失的影响，可采用如 实施例7描述的消除Sp35表达的表达RNAi分子的慢病毒感染大 鼠原代VM神经元。可参照Rubinson等人和实施例7的描述生成 携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒。用对照或Sp35RNAi以1-5的 感染复数(MOI)来感染大鼠原代VM神经元培养物。GFP阳性细胞 指示了慢病毒感染的DA神经元。Sp35抑制的作用可通过DA神经 元延伸和存活进行检测。实施例9.
Sp35-Fc和Sp351A7抗体提高了MPP+处理的VM培养物中的 EGFR表达和Akt磷酸化
Sp35-Fc和Sp351A7抗体提高了MPP+处理的VM培养物中的 EGFR表达和Akt磷酸化
[0307]为检查MPP+处理的VM培养物中Akt的磷酸化以及 Sp35和EGFR之间的相互作用，可从E15或E16Sprague Dawley 大鼠(Charles River，MA)的腹侧中脑获取DA神经元的原代培养物。 参见Shah等人，J Cell Physiol in press.简要地说，在含有热灭活马 血清(10％)、葡萄糖(6.0mg/ml)、青霉素(10,000U/ml)、链霉素(10 mg/ml；Sigma)和谷氨酰胺(2mM；Gibco)的冷Dulbecco改良EAGLE 培养基(DMEM；Gibco，NY)中用抛光巴斯德移液管机械破碎组织。 在培养基中重新悬浮2×105细胞，并接种至24孔盘(Falcon)中各微 孔的以15mg/ml聚-L-鸟氨酸(Sigma)和1mg/ml纤维连接蛋白 (Sigma)预涂的盖玻片。在第4天吸出未贴壁的细胞，并添加1ml 含10μg/ml的LINGO-1-Fc、1A7，对照IgG或对照-Fc的新鲜培养 基。8小时后，将培养细胞暴露至10μM MPP+48小时。在500μl 溶解缓冲液中溶解培养的VM细胞[50mM HEPES，pH 7.5，，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，1％Triton x-100，10％甘油，含 完全蛋白酶抑制剂(Roche，Basel，Switzerland)和磷酸酶抑制剂 (Sigma)]。将上清液在4-20％或10％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad， Hercules，CA)中电泳，并以抗-磷-Akt和抗Akt以及抗-EGFR抗体 (Cell Signaling，Beverly，MA)或抗-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。与 1A7抗体和Sp35-Fc蛋白孵育的MPP+处理的VM神经元培养物分 别比对照IgG和对照-Fc蛋白孵育的培养物具有更高的EGFR和Akt 磷酸化(F3,12＝23.645；1A7p＜0.001；F3,12＝18.89，Sp-Fc p＜0.001)。 参见图7A-7C以及7G。
[0308]此外，全长Sp35提高了EGFR表达。如实施例2所述， 采用FL-Sp35慢病毒在2天内以0，1和5的MOI转染COS7细胞。 检测各MOI下转染细胞中的EGFR蛋白表达。如图12所示，EGFR 的表达水平以剂量依赖形式下降。
[0309]可采用抗-Sp35(1A7或2F3)或抗-EGFR抗体进行免疫 沉淀验证来自WT和KO小鼠的培养细胞和VM脑组织中Sp35和 EGFR之间的直接相互作用(参见图7D-7F)。以Sp35，EGFR和 Sp35/EGFR转染COS-7或HEK293细胞(100mm培养皿)。在48 小时后采集细胞，并在1ml溶解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，1％Triton x-100，10％甘 油)或RIPA缓冲液(50mM TRIS，pH 7.2，1％Triton X-100，0.5％脱 氧胆酸钠，0.1％SDS，15OmM NaCl，10mM MgCl2，5％甘油)中于 4℃下溶解30分钟。以14，000xg离心15分钟后，将上清液与蛋白 A/G-琼脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology)在4℃下孵育1小时，然后 将200μl预清除的溶解产物与抗-EGFR(Santa Cruz Biotechnology) 或抗-Sp35抗体(Biogen Idee，参见美国临时专利申请60/697,336， 其内容在此全文引用作为参考)在4℃下孵育1小时，然后以蛋白 A/G-琼脂糖珠进行处理。以溶解缓冲液洗涤珠子3次，在Laemmli 样本缓冲液中煮沸，上样至4-20％SDS-PAGE，并采用抗-EGFR抗 体或抗-Sp35抗体进行Western印迹分析。以抗-兔IgG-HRP显示 EGFR和Sp35抗体。
[0310]参照上文描述，在RDPA缓冲液中溶解Sp35KO或 WT VMs并以蛋白A/G-琼脂糖珠进行预清除。然后采用抗-Sp35对 1mg的腹侧中脑萃取物于4℃下免疫沉淀过夜，然后以蛋白A/G-琼 脂糖珠孵育1小时。在腹侧中脑培养物中还观察到Sp35和EGFR 之间的直接相互作用。参见图7E。
[0311]此外，在与Sp35和EGFR共转染细胞系的IP试验中， 抗-Sp35抗体1A7阻断了Sp35与EGFR的结合，而抗-Sp35抗体2F3 未阻断结合。参见图7F。该试验中OMgp被用作抗体结合的对照。实施例10.
[0312]对来自帕金森疾病(PD)死亡患者的黑质的存活多巴胺 能神经元中的Sp35表达进行了检测。死后组织的获取得到了哈佛 脑组织资源中心的同意。下文的表2包含了有关本实施例中描述的 试验中所用的PD患者以及同龄对照组的信息。表2
有关PD患者和同龄对照组的信息
脑# 诊断 年龄(岁) 性别 PMI(小时) SN病理学 PD1 PD 77 男 30.5 4+苍白
PD2 PD 70 男 13.58 4+苍白 PD3 PD 75 男 14.9 4+苍白 弥漫性Lewy体 PD4 PD 75 男 20 暗淡，Lewy体 PD5 PD 78 女 4.25 暗淡，Lewy体 PD6 PD 79 女 18.5 3-4+苍白 C1 对照 70 男 15.1 正常 C2 对照 73 男 30.25 中度着色 C3 对照 74 男 14.33 正常 C4 对照 75 女 16.67 正常 C5 对照 75 男 20.5 正常 C6 对照 78 女 22.67 正常
有关PD患者和同龄对照组的信息
脑# 诊断 年龄(岁) 性别 PMI(小时) SN病理学 PD1 PD 77 男 30.5 4+苍白
PD2 PD 70 男 13.58 4+苍白 PD3 PD 75 男 14.9 4+苍白 弥漫性Lewy体 PD4 PD 75 男 20 暗淡，Lewy体 PD5 PD 78 女 4.25 暗淡，Lewy体 PD6 PD 79 女 18.5 3-4+苍白 C1 对照 70 男 15.1 正常 C2 对照 73 男 30.25 中度着色 C3 对照 74 男 14.33 正常 C4 对照 75 女 16.67 正常 C5 对照 75 男 20.5 正常 C6 对照 78 女 22.67 正常
[0313]通过原位杂交对来自上述患者的存活多巴胺能神经 元中的Sp35表达进行了检测。将SN组织包埋于最佳切削温度(OCT) 化合物中：按照Mi等人.Nat.Neurosci.7：221-228(2004)的描述， 进行冷冻切片的制备、处理和以地高辛标记的Sp35反义和正义 RNA探测。参照生产商说明使用荧光性TSA和抗地高辛结合抗体 试剂盒(Perkin Elmer，Wellesley，MA)对切片染色。然后以抗 -TH(Chemicon，Temecula，CA)和DAPI(Sigma)对切片染色。PD死后 组织(n＝6)的SN中的存活多巴胺能神经元的Sp35相对同龄对照组 (n＝6)得到了上调。
[0314]还可采用半定量PCR对表2中所述患者的Sp35表达 进行检测。参照生产商说明使用Absolutely RNA miniprep kit试剂 盒(Strategene)从人SN组织萃取mRNA。采用Sp35正向引物- 5′-AGAGACATGCGATTGGTGA-3′(SEQ ID NO：14)和反向引物 5′-AGAGATGTAGACGAGGTCATT-3′(SEQ ID NO：15)扩增Sp35 mRNA。如图13A所示，PD死后组织的SN中的存活多巴胺能神 经元的Sp35相对同龄对照组得到了上调。PD SN中的Sp35mRNA 水平统计地显著高于对照组(非配对学生t检验；t(10)＝2.280； p＜0.05)。参见图13B。***
[0315]本发明中的特定实施例意在对本发明的某一方面进行 单独阐述，并非对本发明进行限制，且任意功能性相同的组合物或 方法亦在本发明范围之内。事实上，通过前述和附图，在本文所示 和所述的调整之外对本发明所进行的各种调整对本领域的技术人 员而言是显而易见的。该种调整意在落入权利要求的范围之内。
[0316]本说明书中所涉及的所有出版物和专利申请均引用作 为参考，其引用程度如同每一个单独的出版物或专利申请均为特定 的单独的引用作为参考。序列表
<110>比奥根艾迪克MA公司
麦克莱恩医院
米莎
奥利·艾萨克森
<120>促进多巴胺能神经元神经突生长和存活的方法
<130>2159.073PC03
<150>60/814,523
<151>2006-06-19
<150>60/800,009
<151>2006-05-15
<150>60/733,166
<151>2005-11-04
<150>US 60/800,009
<151>2006-05-15
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1845
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1845)
<400>1
atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60
ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc 120
gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcagtcccc 180
gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc 240
aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tggagctcaa cgagaacatc 300
gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctccggac gctgggtctc 360
cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc 420
aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg 480
tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc 540
ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc 600
cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgaggctccg gcacctcaac 660
atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc 720
tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg 780
tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta 840
gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg 900
ttgcatgagc tgctccggct gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960
gagccctatg ccttccgcgg cctcaactac ctgcgcgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020
ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg 1080
gactccaacc cgctggcctg cgactgtcgg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140
ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag 1200
ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc 1260
cgggaccgca aggcccagca ggtgtttgtg gacgagggcc acacggtgca gtttgtgtgc 1320
cgggccgatg gcgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc 1380
tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440
gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac 1500
tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac 1560
aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc 1620
actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680
tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag 1740
ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgga cgcaggcatc 1800
agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga targa 1845
<210>2
<211>614
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Leu Ala Gly Gly Val Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys
1 5 10 15
Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala
35 40 45
Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro
50 55 60
Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Thr Leu
65 70 75 80
Asn Gln Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu
85 90 95
Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu
100 105 110
Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile
115 120 125
Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile
130 135 140
Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu
145 150 155 160
Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile
165 170 175
Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu
180 185 190
Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu
195 200 205
His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile
210 215 220
Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile
225 230 235 240
Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly
245 250 255
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Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gln Gln Val Phe Val Asp Glu
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Gly His Thr Val Gln Phe Val Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro
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<223>用于制备siRNA分子的寡聚核苷酸的一般结构
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<220>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200
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<220>
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120
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agagatgtag acgaggtcat t 21
<110>比奥根艾迪克MA公司
麦克莱恩医院
米莎
奥利·艾萨克森
<120>促进多巴胺能神经元神经突生长和存活的方法
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<150>60/814,523
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<151>2005-11-04
<150>US 60/800,009
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<170>PatentIn version 3.3
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agagatgtag acgaggtcat t 21
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