GDNF最初在1990年代早期作为支持中脑多巴胺能神经元的存活和分 化的神经营养因子被纯化和表征，基于GDNF的氨基酸序列，克隆GDNF 基因是可能的(Lin等，1993)。Neurturin(NRTN，也称为NTN)基于其促进交 感神经元存活的能力于1996年被分离(Kotzbauer等，1996)。随后，基于序 列同源性，克隆了persephin(PSPN，也称为PSP)和artemin(ARTN，也称为 ART)(Milbrandt等，1998；Baloh等，1998)。据报道，基因组数据库分析已显 示了不太可能找到其它功能性GDNF家族配体(GFL)(Airaksinen & Saarma， 2002)。
已有多种生物学作用归因于GFL。像GDNF一样，NRTN、PSPN和 ARTN促进中脑多巴胺能神经元的存活(Lin等，1993；Milbrandt等，1998； Baloh等，1998a)。CNS中其它几种神经元亚群的存活由GFL所支持，包括 中枢运动神经元(Milbrandt等，1998)和去甲肾上腺素能神经元(Arenas等， 1995)。GDNF、NRTN和ARTN也支持PNS中神经元的存活，包括交感、 副交感、感觉(Kotzbauer等，1996；Baloh等，1998)、和肠神经元(Hearn等， 1998)。除了其存活促进效应之外，GFL还促进神经元分化(Lin等，1993； Baloh等，1998a；Yan等，2003；Paratcha等，2003)。
对于分泌蛋白典型的是，GDNF家族的四个成员以无活性的前原形式 (prepro-form)合成。信号肽从GDNF的前原形式裂解，分泌proGDNF。进 一步的裂解将proGDNF转变为长134个氨基酸的成熟GDNF。成熟NRTN 含有100个氨基酸，成熟PSPN含有96个氨基酸，而成熟ARTN含有113 个氨基酸(Kotzbauer等，1996；Milbrandt等，1998；Baloh等，1998)。GFL同源 性相当高，共享53-64％的序列相似性。将pro-GFL裂解为成熟GFL的蛋白 酶的身份还有待于测定。
四种GFL的序列显示了成熟蛋白中七个保守性半胱氨酸残基的存在。 这些残基以与转化生长因子(TGF)-β超家族成员中发现的七个保守性半胱氨 酸残基类似的方式间隔开。因此，虽然GFL与家族中的其它成员显示了低 于20％的序列相似性，但是仍然认为GFL是TGF-β超家族的成员，并构成 它们自己的亚家族(Lin等，1993；Kotzbauer等，1996；Milbrandt等，1998； Baloh等，1998)。TGF-β超家族的所有成员属于半胱氨酸节(cysteine knot)生 长因子超家族(Saarma & Sariola，1999)。该家族中的蛋白质以包含拓扑节的 二聚体蛋白质为特征，所述拓扑节由三个半胱氨酸残基形成。这些半胱氨 酸残基中的两个与邻近的氨基酸一起形成共价环，第三个半胱氨酸从该共 价环中穿过。
已经在两项研究中调查了GDNF中可能的GFRα结合位点(等， 1999；Baloh等，2000)。第一项研究鉴定了指状物1中的三个带负电荷的氨 基酸和指状物2中的一个带负电荷的氨基酸，它们对于GDNF与GFRα1的 结合是至关重要的(等，1999)。这些残基位于所述指状物的最远端部 分，其为四个疏水性氨基酸(一个在指状物1中，其余的在指状物2中)，同 样证明其对于GDNF与GFRα1的结合是决定性的。此外，显示GDNF的柔 性N-末端区对于与GFRα1的结合是重要的。相反，集中在跟部中的带正电 荷的氨基酸似乎不涉及与GFRα1的结合(等，1999)。令人惊讶的是， 由于这些位置发生了突变的GDNF分子仍能诱导Ret的磷酸化，因而指状 物2中鉴定的残基和指状物1中的疏水性残基均不是Ret存在下GDNF结 合所需的。N-末端区域的删除也不抑制Ret磷酸化。因此，作者提出了GFRα1 中存在两个不同GDNF结合位点。一个单独由GFRα1受体组成的结合位点 将用于缺乏Ret时结合GDNF，而当GDNF与在先结合的GFRα1-Ret复合 体相互作用时，另一个由来自GFRα1和Ret的残基组成的结合位点将开始 起作用(等，1999)。
在Baloh等(2000)的研究中，发现指状物2中的两个区域对于GDNF诱 导的经由GFRα1的Ret活化是重要的，而不需要柔性N-末端。类似的试验 显示NRTN和ARTN中相应的两个区域分别对于这些GFL通过GFRα2和 GFRα3活化Ret的能力来说是重要的。对于NRTN和ARTN，包含大型α- 螺旋最N-末端部分的区域也是Ret活化所需的(Baloh等，2000)。
总之，所述两项研究显示了GFL中存在一个以上的结合位点，并且， 虽然关于哪个指状物是最重要的似乎有一些分歧，但是等(1999)和 Baloh等(2000)的工作强调了所述指状物区域在GDNF结合其受体复合体以 及后续Ret活化中的重要性。
对NCAM和GDNF/GFRα1之间的异嗜性相互作用的理解仍然非常有 限，但研究已经显示GDNF和GFRα1都结合NCAM，而且NCAM与GDNF 的结合在GFRα1的存在下被大大增强了(Paratcha等，2003)。此外，同一研 究中显示GDNF诱导的神经突生长独立于FGFR而发生，并且也可能独立 于反式(trans)同嗜性NCAM相互作用。事实上GDNF-GFRα-NCAM相互作 用看起来干扰同嗜性NCAM相互作用(Paratcha等，2003)。
发明概述
本发明公开了属于TGFβ超家族的蛋白质(特别是GDNF、NRTN、PSPN、 ARTN、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3和TGFβ-4)的短肽片段，其能够刺激神 经元细胞分化、神经元细胞存活和与学习和记忆有关的神经可塑性并能够 抑制炎症应答。根据本发明，本文描述的所有肽片段在结构上是相似的， 即它们包含对于所述肽的生物学活性来说必不可少的共同氨基酸基序。
因此，本发明的第一个方面涉及包含下式基序的具有6到22个连续氨 基酸残基序列的肽：
Xa-(x)-Xb-Xc-Xd-Xf
其中
Xa是氨基酸残基D、E、A或G，
(x)是选自氨基酸残基A、D、E、G、I、K、L、P、Q、S、T和V所组 成的组的2-3个氨基酸残基的序列或单个氨基酸残基，
Xb是氨基酸残基Y或H，或者疏水性氨基酸残基，并且
Xc、Xd或Xf中至少一个是带电荷的或疏水性的氨基酸残基。
本发明公开了源于GDNF、NRTN、PSPN、ARTN、TGFβ-1、TGFβ-2、 TGFβ-3和TGFβ-4的特定肽序列，它们均包含上述基序并能够刺激神经元 细胞分化、神经元细胞存活和/或与学习和记忆有关的神经可塑性。
进一步，本发明涉及包含含有上述基序的肽序列的复合物，特别是包 含源于GDNF、NRTN、PSPN、ARTN、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3或TGFβ-4 的序列的复合物。
本发明还涉及所公开的肽序列和包含这些肽序列的复合物用于生产药 剂和/或用于制备抗体的用途。本发明还涉及包含本发明的肽、复合物和/或 抗体的药物组合物。
利用本发明的肽、复合物、抗体和/或药物组合物刺激神经突细胞分化、 神经元细胞存活和/或与学习和记忆有关的神经元可塑性的方法也在保护范 围内，以及包括为有所需要的个体施用有效量的本发明的肽、复合物、抗 体或药物组合物的治疗方法。
附图说明
图1：原代海马神经元中GDNF诱导的神经突生长。细胞用GDNF(1、 5、10、50、和100ng/ml)刺激24小时。单独培养于培养基中的神经元作为 对照。对于对照，神经突生长的绝对长度是11.65μm±1.57μm。结果以对 照的百分比表示，记作平均值±S.E.M。附图基于5个独立试验的结果。针 对重复测量值，利用单因素(one-way)ANOVA比较平均神经突生长长度。 F(5，24)＝5.903，p＜0.01表明GDNF处理有整体的统计学上显著的影响。
图2：原代海马神经元中G1不诱导神经突生长。细胞用G1(0.3、1、 3、9、和27μg/ml)刺激24小时。单独培养于培养基中的神经元用作对照。 对于对照，神经突生长的绝对长度是11.68μm±2.20μm(A)或11.00μm± 0.94μm(B)。结果以对照的百分比表示，记作平均值±S.E.M。附图基于来 自5个(A)或4个(B)独立试验的结果。对于重复测量值，利用单因素ANOVA 比较平均神经突生长长度。F(5，24)＝0.4873，p＝0.7823表明G1处理的整体影 响不是统计学上显著的。
图3：原代海马神经元中G2诱导的神经突生长。细胞用G2(0.1、0.3、 1、3、和9μg/ml)刺激24小时。单独培养于培养基中的神经元用作对照。 对于对照，神经突生长的绝对长度是11.50μm±2.20μm。结果以对照的百 分比表示，记作平均值±S.E.M。附图基于来自4个独立试验的结果。对于 重复测量值，利用单因素ANOVA比较平均神经突生长长度。F(5，18)＝91.91， p＜0.0001表明G2处理有整体的统计学上显著的影响。利用具有Tukeys多 重比较检验(multiple comparisons test)的事后检验(post-testing)将G2的各个 浓度的影响与对照相比。
图4：原代海马神经元中G3不诱导神经突生长。细胞用G3(0.3、1、 3、9、和27μg/ml)刺激24小时。单独培养于培养基中的神经元用作对照。 对于对照，神经突生长的绝对长度是11.68μm±2.20μm(A)或11.00μm± 0.94μm(B)。结果以对照的百分比表示，记作平均值±S.E.M。附图基于来自 5个(A)或4个(B)独立试验的结果。对于重复测量值，利用单因素ANOVA 比较平均神经突生长长度。F(5，18)＝1.710，p＝0.1833表明G3处理的整体影响 不是统计学上显著的。
图5：海马神经元中GDNF诱导的神经突生长，其中海马神经元与对 照成纤维细胞或表达NCAM的成纤维细胞共培养。将神经元培养在对照 成纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤维细胞(红色曲线)的上部，并用 GDNF(1、5、10、50、和100ng/ml)刺激24小时。单独培养于培养基中的 神经元用作对照。结果表示为对照的百分比(对照成纤维细胞上未经刺激的 神经元)并以平均值±S.E.M表示。对于对照成纤维细胞上的对照，神经突生 长的绝对长度为38.97μm±0.21μm。附图基于来自4个独立试验的结果。 对于重复测量值，利用独立的单因素ANOVA比较平均神经突生长长度。 F(5，18)＝27.33，p＜0.0001表明GDNF处理对于培养在对照成纤维细胞上的神 经元整体上有显著影响。F(5，18)＝9.967，p＜0.001表明GDNF处理对于培养在 表达NCAM的成纤维细胞上的神经元整体上有显著影响。利用具有Tukeys 多重比较检验的事后检验将GDNF的各个浓度的影响与匹配的对照对比。 黑色*表示与培养在对照成纤维细胞上的未经刺激的细胞相比较的p值，而 红色*表示与培养在表达NCAM的成纤维细胞上的未经刺激的细胞相比较 的p值。采用成对t-检验比较两个对照，其显示它们在统计学上明显不同(p 值以黑色+表示)。对于每个浓度，计算培养在对照成纤维细胞上的神经元 中的和培养在表达NCAM的成纤维细胞上的神经元中的神经突生长之间的 差异，以对照的百分比表示(对照成纤维细胞上未经刺激的神经元)(蓝色曲 线)。重复测量值的单因素ANOVA显示平均值差异不完全相同(F(5，18)＝ 5.835，p＜0.05)。采用具有Tukeys多重比较检验的事后检验将各个GDNF浓 度的差异与两个匹配对照(NCAM介导的神经突生长)的差异相比较。蓝色* 表示p值。
图6：海马神经元中G1干扰NCAM诱导的神经突生长，其中海马神 经元与对照成纤维细胞或表达NCAM的成纤维细胞共培养。将神经元培 养在对照成纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤维细胞(红色曲线)的 上部，并用G1(0.3、1、3、9、27和81μg/ml)刺激24小时。单独培养于培 养基中的神经元用作对照。结果表示为对照的百分比(对照成纤维细胞上未 经刺激的神经元)并以平均值±S.E.M表示。对于对照成纤维细胞上的对 照，神经突生长的绝对长度为34.64μm±0.63μm。附图基于来自4个独立 试验的结果。对于重复测量值，利用独立的单因素ANOVA比较平均神经 突生长长度。F(4，15)＝1.581，p＝0.2422表明G1处理对于培养在对照成纤维 细胞上的神经元整体上没有显著影响。F(4，15)＝10.45，p＜0.001表明G1处理 对于培养在表达NCAM的成纤维细胞上的神经元整体上有统计学显著的影 响。此影响在更高G1浓度时看起来是抑制性的。利用具有Tukeys多重比 较检验的事后检验将G1的各个浓度的影响与匹配的对照相比。红色*表示 与培养在表达NCAM的成纤维细胞上的未经刺激的细胞相比较的p值。采 用成对t-检验比较两个对照，其显示它们在统计学上显著不同(p值以黑色+ 表示)。对于每个浓度，计算培养在对照成纤维细胞上的神经元中的和培养 在表达NCAM的成纤维细胞上的神经元中的神经突生长之间的差异，以对 照的百分比表示(对照成纤维细胞上未经刺激的神经元)(蓝色曲线)。重复测 量值的单因素ANOVA显示平均值差异不完全相同(F(4，15)＝3.389，p＜0.05)。 采用具有Tukeys多重比较检验的事后检验将GDNFp2在各个浓度时的差异 与所述两个对照的差异相比较。蓝色*表示p值。
图7：海马神经元中G2诱导的神经突生长，其中海马神经元与对照 成纤维细胞或表达NCAM的成纤维细胞共培养。将神经元培养在对照成 纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤维细胞(红色曲线)上，并用G2 (0.1、0.3、1、3、和9μg/ml)刺激24小时。单独培养于培养基中的神经元 用作对照。结果表示为对照的百分比(对照成纤维细胞上未经刺激的神经元) 并以平均值±S.E.M表示。对于对照成纤维细胞上的对照，神经突生长的绝 对长度为38.74μm±0.47μm。附图基于来自4个独立试验的结果。对于重 复测量值，利用独立的单因素ANOVA比较平均神经突生长长度。F(5，18)＝ 81.76，p＜0.0001表明G2处理对于培养在对照成纤维细胞上的神经元整体上 有显著影响。F(5，18)＝176.6，p＜0.0001表明G2处理对于培养在表达NCAM 的成纤维细胞上的神经元整体上有显著影响。利用具有Tukeys多重比较检 验的事后检验将G2的各个浓度的影响与匹配的对照对比。黑色*表示与培 养在对照成纤维细胞上的未经刺激的细胞相比较的p值，而红色*表示与培 养在表达NCAM的成纤维细胞上的未经刺激的细胞相比较的p值。采用成 对t-检验比较两个对照，其显示它们在统计学上明显不同(p值以黑色+表 示)。对于每个浓度，计算培养在对照成纤维细胞上的神经元中的和培养在 表达NCAM的成纤维细胞上的神经元中的神经突生长之间的差异，以对照 的百分比表示(对照成纤维细胞上未经刺激的神经元)(蓝色曲线)。重复测量 值的单因素ANOVA显示平均值差异不完全相同(F(5，18)＝3.761，p＜0.05)。 采用具有Tukeys多重比较检验的事后检验将各个GDNF或GDNFp1浓度的 差异与两个匹配对照(NCAM介导的神经突生长)的差异相比较。蓝色*表示 p值。
图8：海马神经元中G3干扰NCAM诱导的神经突生长，其中海马神 经元与对照成纤维细胞或表达NCAM的成纤维细胞共培养。将神经元培 养在对照成纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤维细胞(红色曲线)上， 并用G3(0.3、1、3、9、27和81μg/ml)刺激24小时。单独培养于培养基中 的神经元用作对照。结果表示为对照的百分比(对照成纤维细胞上未经刺激 的神经元)并以平均值±S.E.M表示。对于对照成纤维细胞上的对照，神经 突生长的绝对长度为34.20μm±0.68μm。附图基于来自4个独立试验的结 果。对于重复测量值，利用独立的单因素ANOVA比较平均神经突生长长 度。F(4，15)＝2.440，p＝0.1039表明GDNFp3处理对于培养在对照成纤维细胞 上的神经元整体上没有显著影响。F(4，15)＝5.967，p＜0.01表明G3处理对于 培养在表达NCAM的成纤维细胞上的神经元整体上有统计学上显著的影 响。此影响在更高G3浓度时看起来是抑制性的。利用具有Tukeys多重比 较检验的事后检验将G3的各个浓度的影响与匹配的对照相比。红色*表示 与培养在表达NCAM的成纤维细胞上的未经刺激的细胞相比较的p值。采 用成对t-检验比较两个对照，其显示它们在统计学上显著不同(p值以黑色+ 表示)。对于每个浓度，计算培养在对照成纤维细胞上的神经元中的和培养 在表达NCAM的成纤维细胞上的神经元中的神经突生长之间的差异，以对 照的百分比表示(对照成纤维细胞上未经刺激的神经元)(蓝色曲线)。重复测 量值的单因素ANOVA显示平均值差异不完全相同(F(4，15)＝1.314，p＝ 0.3199)。采用具有Tukeys多重比较检验的事后检验将GDNFp2在各个浓度 时的差异与所述两个对照的差异相比较。蓝色*表示p值。
附图9：GDNF或G2介导的神经突生长中NCAM的介入。将用 cyt-NCAM-A、cyt-NCAM-B或空白载体转染的海马神经元培养在对照成纤 维细胞上，并用10ng/ml GDNF或3μg/ml GDNFp1刺激18小时。将培养 基单独添加到对照中。**p＜0.01，***p＜0.001。
附图10：GDNF或G2介导的神经突生长中NCAM的介入。将用 cyt-NCAM-A、cyt-NCAM-B或空白载体转染的海马神经元培养在表达 NCAM的成纤维细胞上，并用10ng/ml GDNF或3μg/ml GDNFp1刺激18 小时。将培养基单独添加到对照中。**p＜0.01，***p＜0.001。
附图11：Fyn-激酶抑制剂PP2减弱海马神经元中GDNF诱导的神经 突生长。将神经元培养在对照成纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤 维细胞(红色曲线)上。用10ng/ml GDNF刺激，并将神经元与PP2(0.2、1、 5、和25μM)一起温育24小时。用不含PP2的GDNF刺激的神经元作为阳 性对照。单独培养在培养基中的神经元作为阴性对照，并用未连接到所述 曲线的黑色和红色圈表示。结果表示为阴性对照的百分比(对照成纤维细胞 上未经刺激的神经元)并以平均值±S.E.M表示。附图基于来自6个独立试验 的结果。利用独立的单因素ANOVA比较平均神经突长度。与相应对照相比 时，***和+++p＜0.001。
附图12：Fyn-激酶抑制剂PP2减弱海马神经元中G2诱导的神经突生 长。将神经元培养在对照成纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤维细 胞(红色曲线)上。用3μg/ml G2刺激，并将神经元与PP2(0.2、1、5、和100 μM)一起温育24小时。用不含PP2的G2刺激的神经元作为阳性对照。单 独培养在培养基中的神经元作为阴性对照，并用未连接到所述曲线的黑色 和红色圈表示。结果表示为阴性对照的百分比(对照成纤维细胞上未经刺激 的神经元)并以平均值±S.E.M.表示。附图基于来自6个独立试验的结果。利 用独立的单因素ANOVA比较平均神经突长度。与相应对照相比时，*** 和+++p＜0.001，或者++++p＜0.0001。
附图13：FGFR抑制剂SU5402减弱海马神经元中GDNF诱导的神经 突生长。将神经元培养在对照成纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤 维细胞(红色曲线)上。用10ng/ml GDNF刺激，并将神经元与SU5402(1、 5、和25μM)一起温育24小时。用不含SU5402的GDNF刺激的神经元作 为阳性对照。单独培养在培养基中的神经元作为阴性对照，并用未连接到 所述曲线的黑色和红色圈表示。结果表示为阴性对照的百分比(对照成纤维 细胞上未经刺激的神经元)并以平均值±S.E.M.表示。利用独立的单因素 ANOVA比较平均神经突生长长度。黑色*表示与培养在对照成纤维细胞上 的阳性对照相比较的p值，而红色*表示与培养在表达NCAM的成纤维细 胞上的阳性对照相比较的p值。采用成对t-检验比较两个阴性对照，其显 示它们在统计学上明显不同(p值以黑色+表示)。
附图14：FGFR抑制剂SU5402减弱海马神经元中G2诱导的神经突 生长。将神经元培养在对照成纤维细胞(黑色曲线)或表达NCAM的成纤维 细胞(红色曲线)上。用3μg/ml GDNFp1刺激，并将神经元与SU5402(1、 5、25、和100μM)一起温育24小时。用没有SU5402的G2刺激的神经元 作为阳性对照。单独培养在培养基中的神经元作为阴性对照，并用未连接 到所述曲线的黑色和红色圈表示。结果表示为阴性对照的百分比(对照成纤 维细胞上未经刺激的神经元)并以平均值±S.E.M.表示。利用独立的单因素 ANOVA比较平均神经突生长长度。利用具有Tukeys多重比较检验的事后 试验将SU5402的各个浓度的影响与匹配的阳性对照对比。黑色*表示与培 养在对照成纤维细胞上的阳性对照相比较的p值，而红色*表示与培养在表 达NCAM的成纤维细胞上的阳性对照相比较的p值。采用成对t-检验比较 两个阴性对照，其显示它们在统计学上明显不同(p值以黑色+表示)。
附图15：显性阴性FGFR的转染减弱由GDNF或G2介导的神经突生 长。将用dnFGFR、wtFGFR或空白载体转染的海马神经元培养在对照成纤 维细胞上并用10ng/ml GDNF或3μg/ml GDNFp1刺激18个小时。将培养 基单独添加到对照中。附图基于5个独立试验的结果。通过应用成对t-检 验完成统计学评估。当与相应对照相比时，*p＜0.05和***p＜0.001。
附图16：显性阴性FGFR的转染减弱由GDNF或G2介导的神经突生 长。将用dnFGFR、wtFGFR或空白载体转染的海马神经元培养在表达 NCAM的成纤维细胞上并用10ng/ml GDNF或3μg/ml GDNFp1刺激18个 小时。将培养基单独添加到对照中。附图基于5个独立试验的结果。通过 应用成对t-检验完成统计学评估。当与相应对照相比时，*p＜0.05、** p＜0.01以及***p＜0.001。
附图17.artemin对来自小脑颗粒神经元(CGN)的神经突生长的影响。 当与未经处理的对照相比时，*p＜0.05。
附图18.A1肽对来自CGN的神经突生长的影响。当与未经处理的对 照相比时，*p＜0.05以及**p＜0.01。
附图19.A2肽对来自CGN的神经突生长的影响。当与未经处理的对 照相比时，*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001以及****p＜0.0001。
附图20.A3肽对来自CGN的神经突生长的影响。当与未经处理的对 照相比时，***p＜0.001以及****p＜0.0001。
附图21.neurturin对来自CGN的神经突生长的影响。当与未经处理 的对照相比时，*p＜0.05以及**p＜0.01。
附图22.N1肽对来自CGN的神经突生长的影响。当与未经处理的对 照相比时，*p＜0.05。
附图23.N2肽对来自CGN的神经突生长的影响。当与未经处理的对 照相比时，*p＜0.05以及****p＜0.0001。
附图24.N3肽对来自CGN的神经突生长的影响。当与未经处理的对 照相比时，*p＜0.05。
附图25.GDNF衍生肽，Gah(SEQ ID NO：9，ETTYDKILKNLSRNR) 对多巴胺能神经元存活的影响。图表显示Gah提高多巴胺能神经元的存活。
C3d为阳性对照(提高多巴胺能神经元存活的肽，参见Ditlevsen等，J. Neurochem.，2003)。
附图26.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。GDNF衍生 肽，Gah(SEQ ID NO：9，ETTYDKILKNLSRNR)与NCAM的Ig1-2模块的结 合。结果显示Gah肽可能是神经细胞粘附分子(NCAM)的GDNF结合位点 的一部分。
附图27.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。SPR显示 GDNF衍生肽，Gah(SEQ ID NO：9，ETTYDKILKNLSRNR)与GFRα1受体 的结合。
附图28.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。附图显示 GDNF衍生肽，Gi(SEQ ID NO：16，DDLSFLDDNLVY)与GFRα1受体的结 合。
附图29.artemin衍生肽，ArtGah(SEQ ID NO：10， RSPHDLSLASLLGAG)对小脑颗粒神经元(CGN)存活的影响。图表显示 ArtGah提高CGN的存活。
附图30.artemin衍生肽，ArtGg(SEQ ID NO：2， VPVRALGLGHRSDEL)对小脑颗粒神经元(CGN)存活的影响。图表显示 ArtGg提高CGN的存活。
附图31.artemin衍生肽，ArtGi(SEQ ID NO：17，EAVSFMDVNSTWR) 对小脑颗粒神经元(CGN)存活的影响。图表显示ArtGi提高CGN的存活。
附图32.neurturin衍生肽，NeuGg(SEQ ID NO：3， VRVSELGLGYASDET)对小脑颗粒神经元(CGN)存活的影响。图表显示 NeuGg提高CGN的存活。
附图33.neurturin衍生肽，NeuGi(SEQ ID NO：18，DEVSFLDAHSRY) 对小脑颗粒神经元(CGN)存活的影响。图表显示NeuGi提高CGN的存活。
附图34.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。附图显示 neurturin衍生肽，NeuGah(SEQ ID NO：11，ARVYDLGLRRLRQRR)与GFRα 受体的结合。
附图35.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。附图显示 neurturin衍生肽，NeuGg(SEQ ID NO：3，VRVSELGLGYASDET)与GFRα受 体的结合。
附图36.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。附图显示 neurturin衍生肽，NeuGi(SEQ ID NO：18，DEVSFLDAHSRY)与GFRα受体 的结合。
附图37.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。附图显示 artemin衍生肽，ArtGah(SEQ ID NO：10，RSPHDLSLASLLGAG)与GFRα受 体的结合。
附图38.通过表面等离振子共振(SPR)进行的结合分析。附图显示 artemin衍生肽，ArtGi(EAVSFMDVNSTWR)与GFRα受体的结合。
发明详述
肽序列
本发明的第一个方面涉及具有6到22个连续氨基酸残基的序列的肽， 所述序列包含以下基序：
Xa-(x)-Xb-Xc-Xd-Xf
其中
Xa是氨基酸残基D、E、A或G，
(x)是选自氨基酸残基A、D、E、G、I、K、L、P、Q、S、T和V所组 成的组的2-3个氨基酸残基的序列或单个氨基酸残基，
Xb是氨基酸残基Y或H，或者疏水性氨基酸残基，并且
Xc、Xd或Xf中至少一个是带电荷的或疏水性的氨基酸残基。
根据本发明，在一个优选实施方案中，Xa可以是酸性氨基酸残基，例 如E或D。在另一个优选实施方案中，Xa可以是A或G。
在一些实施方案中，上述基序的位置(x)可以优选被任何两个氨基酸残 基的序列所占据，其中优选的序列是残基L、G、A、S、T、K或I中的任 何两个的序列，其中序列L-G、L-A、L-S、T-Q、T-T或K-I是更优选的。
在其他实施方案中，(x)可以是任何三个氨基酸残基的序列，优选所述 残基选自L、G、A、S、T、K、I，其中更优选序列L-X-G，X是任何氨基 酸残基，最优选序列L-Q-G。
在其它实施方案中，(x)可以代表任何单个氨基酸残基，优选带电荷的 或疏水性的氨基酸残基。更优选所述氨基酸残基可以选自D、E、A、V或 P。
在一个优选实施方案中，上述基序于位置Xb的残基可以是A、L、V 或W。在另一个优选实施方案中，Xb可以是H。在又一个优选实施方案中， Xb可以是Y。
根据本发明，残基Xc、Xd或Xf可以独立地为任何氨基酸残基，然而优 选Xc、Xd或Xf中至少一个选自带电荷的或疏水性的氨基酸残基。特别优选 位置Xf为带电荷的或疏水性的残基，其中疏水性残基当中残基A、I、V、L 或M是最优选的，带电荷的残基当中最优选残基R、E或D。
本发明进一步涉及包含下式氨基酸序列的肽：
x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10
其中
x1为选自D、A、E或H的氨基酸残基，
x2为选自L、G、T、D、A、E、V或P的氨基酸残基，
x3为选自G、Q、I、S、G、L、T、V或A的氨基酸残基，
x4为选自L、W、G、A、Y、H、S、F、P或T的氨基酸残基，
x5为选自G、K、M、A、R、L、S、F或I的氨基酸残基，
x6为选自Y、H、W、K、N、S、R、A、M、L、D或V的氨基酸残基，
x7为选自E、R、A、I、V、W、L、D或Y的氨基酸残基，
x8为选自T、S、H、L、R、D、V、A或Y的氨基酸残基，
x9为选自K、D、E、R、G、Q、A、S、N、H、V或I的氨基酸残基，
x10为选自E、P、N、A、R、G、L或S的氨基酸残基，
其中所述氨基酸序列包含上述基序。
包含上述氨基酸序列的肽优选长10到22个氨基酸残基，或其包含最 少6个氨基酸残基的、包含本发明基序的片段。根据本发明，这样的氨基 酸序列优选包含选自以下序列的序列：
LNVTDLGLGYETKEE(SEQ ID NO：1)、
VPVRALGLGHRSDEL(SEQ ID NO：2)、
VRVSELGLGYASDET(SEQ ID NO：3)、
LSVAELGLGYASEEK(SEQ ID NO：4)、
IDFRKDLGWKWIHEPKG(SEQ ID NO：5)、
IDFKRDLGWKWIHEPKG(SEQ ID NO：6)、
IDFRQDLGWKWVHEPKG(SEQ ID NO：7)、
IDLQGMKWAKNWVLEPPG(SEQ ID NO：8)、
ETTYDKILKNLSRNR(SEQ ID NO：9)、
RSPHDLSLASLLGAG(SEQ ID NO：10)、
ARVYDLGLRRLRQRR(SEQ ID NO：11)、
RTQHGLALARLQGQG(SEQ ID NO：12)、
WSLDTQYSKVLALYN(SEQ ID NO：13)、
WSSDTQHSRVLSLYN(SEQ ID NO：14)、
RSADTTHSTVLGLYN(SEQ ID NO：15)、
DDLSFLDDNLVY(SEQ ID NO：16)、
EAVSFMDVNSTW(SEQ ID NO：17)、
DEVSFLDAHSRY(SEQ ID NO：18)、
DVAFLDDRHRWQ(SEQ ID NO：19)、
EPLPIVYYVGRK(SEQ ID NO：20)、
EPLTILYYIGKT(SEQ ID NO：21)或
EPLTILYYVGRT(SEQ ID NO：22)。
在一些优选实施方案中，所述肽可以包含以下序列的其中一个或其片 段：
LNVTDLGLGYETKEE(SEQ ID NO：1)、
VPVRALGLGHRSDEL(SEQ ID NO：2)、
VRVSELGLGYASDET(SEQ ID NO：3)或
LSVAELGLGYASEEK(SEQ ID NO：4)。
在其它优选实施方案中，所述肽可以包含以下序列的其中一个或其片 段：
IDFRKDLGWKWIHEPKG(SEQ ID NO：5)、
IDFKRDLGWKWIHEPKG(SEQ ID NO：6)、
IDFRQDLGWKWVHEPKG(SEQ ID NO：7)或
IDLQGMKWAKNWVLEPPG(SEQ ID NO：8)。
在其它优选实施方案中，所述片段可以包含以下序列的其中一个或其 片段：
ETTYDKILKNLSRNR(SEQ ID NO：9)、
RSPHDLSLASLLGAG(SEQ ID NO：10)、
ARVYDLGLRRLRQRR(SEQ ID NO：11)或
RTQHGLALARLQGQ(SEQ ID NO：12)。
在更多其它优选实施方案中，所述片段可以包含以下序列的其中一个 或其片段：
WSLDTQYSKVLALYN(SEQ ID NO：13)、
WSSDTQHSRVLSLYN(SEQ ID NO：14)或
RSADTTHSTVLGLYN(SEQ ID NO：15)。
在更多其它优选实施方案中，所述肽可以包含以下序列的其中一个或 其片段：
DDLSFLDDNLVY(SEQ ID NO：16)、
EAVSFMDVNSTWR(SEQ ID NO：17)、
DEVSFLDAHSRY(SEQ ID NO：18)或
DVAFLDDRHRWQ(SEQ ID NO：19)。
一些实施方案可以优选涉及包含以下序列的其中一个或其片段的肽：
EPLPIVYYVGRK(SEQ ID NO：20)、
EPLTILYYIGKT(SEQ ID NO：21)或
EPLTILYYVGRT(SEQ ID NO：22)。
在一些优选实施方案中，本发明涉及包含以下序列的肽：
VPVRALGLGHRSDEL(SEQ ID NO：2)、
VRVSELGLGYASDET(SEQ ID NO：3)、
ETTYDKILKNLSRNR(SEQ ID NO：9)、
RSPHDLSLASLLGAG(SEQ ID NO：10)、
ARVYDLGLRRLRQRR(SEQ ID NO：11)、
DDLSFLDDNLVY(SEQ ID NO：16)、
EAVSFMDVNSTWR(SEQ ID NO：17)、
DEVSFLDAHSRY(SEQ ID NO：18)。
如以上已经提到的，本发明的肽包含6到22个连续的氨基酸残基。然 而，肽的长度可以优选在例如6到10个氨基酸残基诸如7到9个氨基酸残 基范围内，或者在11到15个氨基酸残基诸如12到14个氨基酸残基范围内 选择。肽的长度也可以在16到20个氨基酸残基例如17到19个氨基酸残 基范围内。也可以是21或22个氨基酸残基。
例如，在一个优选实施方案中，所述肽可以是18个氨基酸残基的序列。 此时，本发明优选的18个氨基酸残基的序列为序列 IDLQGMKWAKNWVLEPPG(SEQ ID NO：8)。
在另一个优选实施方案中，所述肽可以是17个氨基酸残基的序列。在 这种情况下，优选的17个氨基酸残基的序列可以选自以下氨基酸序列：
IDFRKDLGWKWIHEPKG(SEQ ID NO：5)、
IDFKRDLGWKWIHEPKG(SEQ ID NO：6)或
IDFRQDLGWKWVHEPKG(SEQ ID NO：7)。
还有，在另一个优选实施方案中，所述肽可以是15个氨基酸残基的序 列。这样的序列可以优选选自以下序列：
LNVTDLGLGYETKEE(SEQ ID NO：1)、
VPVRALGLGHRSDEL(SEQ ID NO：2)
VRVSELGLGYASDET(SEQ ID NO：3)、
LSVAELGLGYASEEK(SEQ ID NO：4)、
ETTYDKILKNLSRNR(SEQ ID NO：9)、
RSPHDLSLASLLGAG(SEQ ID NO：10)、
ARVYDLGLRRLRQRR(SEQ ID NO：11)、
RTQHGLALARLQGQG(SEQ ID NO：12)、
WSLDTQYSKVLALYN(SEQ ID NO：13)、
WS SDTQHSRVLSLYN(SEQ ID NO：14)或
RSADTTHSTVLGLYN(SEQ ID NO：15)。
还有，在另一个优选实施方案中，所述肽可以是12个氨基酸残基的序 列。这样的肽可以优选选自以下序列：
DDLSFLDDNLVY(SEQ ID NO：16)、
EAVSFMDVNSTWR(SEQ ID NO：17)、
EVSFLDAHSRY(SEQ ID NO：18)、
VAFLDDRHRWQ(SEQ ID NO：19)、
EPLPIVYYVGRK(SEQ ID NO：20)、
EPLTILYYIGKT(SEQ ID NO：21)或
EPLTILYYVGRT(SEQ ID NO：22)。
相应地，由以下序列的任意一个构成的肽是本发明的其中一个优选技 术方案：
LNVTDLGLGYETKEE(SEQ ID NO：1)、
VPVRALGLGHRSDEL(SEQ ID NO：2)、
VRVSELGLGYASDET(SEQ ID NO：3)、
LSVAELGLGYASEEK(SEQ ID NO：4)、
IDFRKDLGWKWIHEPK(SEQ ID NO：5)、
IDFKRDLGWKWIHEPKG(SEQ ID NO：6)、
IDFRQDLGWKWVHEPKG(SEQ ID NO：7)、
IDLQGMKWAKNWVLEPPG(SEQ ID NO：8)、
ETTYDKILKNLSRNR(SEQ ID NO：9)、
RSPHDLSLASLLGAG(SEQ ID NO：10)、
ARVYDLGLRRLRQRR(SEQ ID NO：11)、
RTQHGLALARLQGQ(SEQ ID NO：12)、
WSLDTQYSKVLALYN(SEQ ID NO：13)、
WS SDTQHSRVLSLYN(SEQ ID NO：14)、
RSADTTHSTVLGLYN(SEQ ID NO：15)、
DDLSFLDDNLVY(SEQ ID NO：16)、
EAVSFMDVNSTWR(SEQ ID NO：17)、
DEVSFLDAHSRY(SEQ ID NO：18)、
DVAFLDDRHRWQ(SEQ ID NO：19)、
EPLPIVYYVGRK(SEQ ID NO：20)、
EPLTILYYIGKT(SEQ ID NO：21)或
EPLTILYYVGRT(SEQ ID NO：22)。
本申请中既使用氨基酸残基的标准单字母代码也使用标准三字母代 码。氨基酸的缩写按照生物化学命名IUPAC-IUB联合委员会的建议(Eur.J. Biochem，1984，vol.184，pp 9-37)。整个说明书和权利要求书中对于天然氨基 酸使用三字母代码或者单字母代码。没有指定L或D构型时，将所讨论的 氨基酸理解为具有天然L构型，参见Pure & Appl.Chem.Vol.(56(5)pp 595-624(1984)或D构型，这样所形成的肽可以由氨基酸的L构型、D构型、 或者L构型和D构型的混合序列构成。
未指定时，将本发明肽的C-末端氨基酸理解为以游离羧酸形态存在， 这也可以表示为“-OH”。然而，本发明复合物的C-末端氨基酸可以是酰胺化 衍生物，其表示为“-NH2”。未作其他陈述时，多肽的N-末端氨基酸包含游 离氨基，这也可以表示为“H-”。
未作其它指定时，氨基酸可以选自任何氨基酸，无论是天然发生的或 非天然发生的，如α氨基酸、β氨基酸、和/或γ氨基酸。相应地，该组包 括但不限于：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、 Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His Aib、Nal、Sar、Om、赖 氨酸类似物、DAP、DAPA和4Hyp。
还有，根据本发明，可以对所述复合物/肽进行修饰，诸如氨基酸的糖 基化和/或乙酰化。
根据本发明，氨基酸残基Arg、Lys和His代表碱性氨基酸残基，氨基 酸残基Glu和Asp代表酸性氨基酸残基。碱性和酸性氨基酸残基构成带电 荷氨基酸残基组。氨基酸残基Leu、Ile、Val、Phe、Trp、Tyr和Met代表疏 水性氨基酸残基组。
在一个实施方案中，变体可以理解为随插入、删除和取代(包括保守 性取代)的数目和范围增加而显示出逐渐不同于优选的预定序列的氨基酸 序列。此差异以预定序列与所述变体之间同源性的减小来测定。
本发明涉及天然发生的、合成/重组制备的肽序列/片段、和/或通过酶学 /化学裂解更长多肽的手段来制备的肽序列/片段，其中所述肽序列/片段是所 述更长多肽的组成部分(integral part)。本发明涉及分离的单个肽序列。
本发明还涉及上述肽序列的变体。
一个方面，术语“肽序列变体”指所述肽可以被修饰，例如取代一个或多 个氨基酸残基。L-氨基酸和D-氨基酸均可使用。其它修饰可以包括衍生 物，诸如酯、糖等等。例子为甲基和乙酰基酯。
另一方面，根据本发明的肽片段的变体可以在同一变体或其片段内或 者在不同变体或其片段之间包含至少一个取代，诸如彼此独立引入的许多 取代。因此，所述复合体的变体或其片段可以包含彼此独立的保守性取代， 其中所述变体或其片段的至少一个甘氨酸(Gly)被选自下组氨基酸的氨基酸 所取代：Ala、Val、Leu和Ile；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变 体或其片段的至少一个丙氨酸(Ala)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代： Gly、Val、Leu和Ile；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片 段的至少一个缬氨酸(Val)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、 Leu和Ile；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一 个亮氨酸(Leu)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Val和Ile；及 与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个异亮氨酸(Ile) 被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Val和Leu；及与此独立的， 变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个天冬氨酸(Asp)被选自下 组氨基酸的氨基酸所取代：Glu、Asn和Gln；及与此独立的，变体或其片段， 其中所述变体或其片段的至少一个天冬酰胺(Asn)被选自下组氨基酸的氨基 酸所取代：Asp、Glu和Gln；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体 或其片段的至少一个谷氨酰胺(Gln)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代： Asp、Glu和Asn；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的 至少一个苯丙氨酸(Phe)被选自下组氨基酸：Tyr、Trp、His、Pro，优选选自 下组氨基酸：Tyr和Trp的氨基酸所取代；及与此独立的，变体或其片段，其 中所述变体或其片段的至少一个酪氨酸(Tyr)被选自下组氨基酸的氨基酸： Phe、Trp、His、Pro，优选选自下组氨基酸的氨基酸：Phe和Trp所取代；及 与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个精氨酸(Arg) 被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Lys和His；及与此独立的，变体或其片 段，其中所述变体或其片段的至少一个赖氨酸(Lys)被选自下组氨基酸的氨 基酸所取代：Arg和His；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其 片段的至少一个脯氨酸(Pro)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Phe、Tyr、 Trp和His；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一 个半胱氨酸(Cys)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Asp、Glu、Lys、Arg、 His、Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr。
以下讨论肽序列变体的其它标准。
由此，从上述得出肽片段的功能等同物或者所述功能等同物的片段可 以包含一个以上的保守性氨基酸取代，所述保守性氨基酸取代来自上述限 定的一个以上的保守性氨基酸组。本文所用术语“保守性氨基酸取代”与术语 “同源性氨基酸取代”同义。
保守性氨基酸组如下：
P、A、G(中性、弱疏水性)；
S、T(中性、亲水性)；
Q、N(亲水性、酸胺(acid amine))；
E、D(亲水性、酸性)；
H、K、R(亲水性、碱性)；
A、L、I、V、M、F、Y、W(疏水性、芳香族)；
C(形成交联的)。
保守性取代可以在本发明优选的预定肽或其片段的任何位置引入。然 而，也可能需要引入非保守性取代，特别是但不限于在任何一个或多个位 置引入非保守性取代。
例如，导致形成本发明肽的功能上等同的片段的非保守性取代i)在极性 上有本质不同，例如具有非极性侧链的残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、 Ile、Leu、Phe或Met)取代具有极性侧链的残基(诸如Gly、Ser、Thr、 Cys、Tyr、Asn或Gln)或带电荷的氨基酸(诸如Asp、Glu、Arg或Lys)，或 用带电荷的或极性的残基取代非极性的残基；和/或ii)在其对肽骨架取向的 影响上有本质不同，诸如用Pro或Gly取代另一种残基或者Pro或Gly被另 一种残基取代；和/或iii)在电荷上有本质不同，例如带负电荷的残基诸如 Glu或Asp取代带正电荷的残基诸如Lys、His或Arg(反之亦然)；和/或iv) 在空间大小上有本质不同，诸如大型残基诸如His、Trp、Phe或Tyr取代具 有较小侧链的残基例如Ala、Gly或Ser(反之亦然)。
在一个实施方案中，可以基于氨基酸侧链取代基的疏水性和亲水性值 以及相对相似性包括电荷、大小等等实施氨基酸取代。考虑前述不同特征 的示例性氨基酸取代是本领域熟练技术人员熟知的，包括：精氨酸和赖氨 酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬 氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
如以上所提到的，本发明涉及上述肽序列的片段、变体和同源物。
在上下文中
i)片段指的如下序列，该序列的序列长度的至少40％、更优选至少 50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少 90％、更优选至少95％相应于包含本发明基序的序列，特别是选自序列 SEQ ID NO：1-22的序列。优选选自序列SEQ ID NO：1-22的序列的片段至 少包含上述基序Xa-(x)-Xb-Xc-Xd-Xf的4个氨基酸残基，更优选包含所述基 序的残基Xb-Xc-Xd-Xf，诸如例如序列DLSFLDDNLVY(SEQ ID NO：23)、 VSFMDVNSTWR(SEQ ID NO：24)、EVSFLDAHSRY(SEQ ID NO：25)， 其相应的为鉴定为SEQ ID NO：16、17和18的序列的片段；
ii)变体指与包含本发明基序的序列特别是与选自序列SEQ ID NO： 1-22的序列有至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少 90％、更优选95％同源性的氨基酸序列，或者指与包含本发明基序的序列 特别是与序列SEQ ID NO：1-22相比有至少60％、更优选至少70％、更优 选至少80％、更优选至少90％、更优选95％积极氨基酸匹配的氨基酸序 列。本文中积极氨基酸匹配定义为在两个进行比较的序列中具有相同位置 的氨基酸的物理和/或化学特性所限定的同一性或相似性。本发明优选的积 极氨基酸匹配为K与R、E与D、L与M、Q与E、I与V、I与L、A与S、 Y与W、K与Q、S与T、N与S及Q与R。一条氨基酸序列与另一条氨基 酸序列的同源性定义为所述两条对比序列中相同氨基酸的百分比。序列同 源性可以利用熟知的算法诸如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、 BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、 BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85、或BLOSUM 90 计算；
iii)同源物指与包含本发明基序的序列特别是与序列SEQ ID NO：1-22 有小于60％但大于30％，诸如50-59％，例如55％，诸如40-49％，例如45％， 诸如30-39％，例如35％同源性的氨基酸序列。
假定以上定义的片段、变体和同源物至少保持了原始序列的一些生物 学活性，例如刺激神经可塑性的能力，例如与神经细胞分化有关的和/或诸 如与记忆和学习有关的，刺激细胞存活的能力，诸如抑制凋亡，激活所述 原始序列所起源的蛋白质的受体的能力。
如上所述，本发明既涉及天然发生的、以合成或重组方式制备的肽又 涉及通过酶学/化学裂解更长的多肽序列而制备的肽。根据本发明，通过酶 学裂解更长的多肽序列而生产的肽以及通过重组表达或通过化学合成制备 的肽来源于所述更长的多肽或蛋白质序列，其中所述肽序列对应于更长的 多肽或蛋白质的组成序列(integral sequence)。
优选本发明涉及来源于TGFβ蛋白质超家族的蛋白质特别是GDNF、 ARTN、NRTN、PSTN、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3和TGFβ-4的序列的肽。
因此，在一个实施方案中，本发明的肽可以具有或包含对应于神经胶 质衍生神经营养因子(GDNF)的组成序列。根据本发明，这样的肽来源于神 经胶质衍生神经营养因子(GDNF)。来源于DGNF的满足本发明肽序列标准 的序列的例子为SEQ ID NO：1、9和16。
根据本发明的肽可以具有或包含源于artemin(ARTN)的肽序列。本发明 优选的ARTN衍生肽序列此处鉴定为SEQ ID NO：2、10和17。肽序列也 可以衍生自neurturin(NRTN)或persephin(PSTN)。衍生自NRTN和PSTN的 本发明序列此处相应地鉴定为SEQ ID NO：3、11和18以及SEQ ID NO：4、 12和19。
本发明的肽可以包含源于转化生长因子-β-1(TGFβ-1)、转化生长因子 -β-2(TGFβ-2)、转化生长因子-β-3(TGFβ-3)或转化生长因子-β-4(TGFβ-4)的序 列，其中衍生自这些蛋白质的优选序列此处相应地鉴定为SEQ ID NO：5-8、 13-15或20-22。
根据本发明，可以将上述分离的肽序列配制为复合物(compound)。
复合物可以包含单一拷贝的选自上述任一种的个体(individual)氨基酸 序列，或者可以包含两个或多个拷贝的此种氨基酸序列。这意味着本发明 的复合物可以配制为肽序列单体，诸如包含单个个体肽序列，或者可以配 制为肽序列多聚体，即包含两个或多个个体肽序列，其中所述个体肽序列 可以呈现为两个或多个拷贝相同的序列或者呈现为两个或多个不同的个体 肽序列。多聚体也可以包含全长序列与其一种或多种片段的组合。在一个 实施方案中，复合物可以包含两条氨基酸序列，这样的复合物此处定义为 二聚体，在另一个实施方案中，复合物可以包含两条以上的氨基酸序列， 诸如例如三条、四条或更多条序列。本发明优选涉及包含两条或四条本发 明的肽序列的复合物。然而，包含3、5、6、7、8或更多条序列的复合物 也在本发明的范围内。
配制为二聚体或多聚体的肽片段可以具有相同的氨基酸序列，或者可 以具有不同的氨基酸序列。这种复合物的一个例子可以是包含SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO：9的复合物。另一个例子可以是包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：16的复合物。取决于不同的实施方案，可以获得本发明序列的任意 其它组合。所述序列可以借助于肽键相互连接，或者通过接头分子或基团 (grouping)相互连接。
本发明的复合物可以包含两个或多个相同拷贝的序列，诸如例如两个 拷贝的选自SEQ ID NO：1-22的序列，其中所述两条序列可以借助于接头分 子或基团相互连接。优选其中所述序列借助于接头基团相连的复合物。这 种连接基团的一个例子可以是非手性的二、三或四羧酸。合适的非手性二、 三或四羧酸和制备这种复合物的方法(配体呈递装配法(a ligand presentation assembly method，LPA))描述于WO0018791和WO2005014623。另一种可能 的接头的例子可以是赖氨酸。个体肽序列可以附着于核心分子诸如赖氨酸， 从而形成个体肽序列的树枝状多聚体(树状聚体(dendrimer))。树状聚体的 生产也是本领域熟知的(PCT/US90/02039，Lu等(1991)Mol Immunol. 28：623-630；Defoort等(1992)Int J Pept Prot Res.40：214-221；Drijfhout等 (1991)Int J Pept Prot Res.37：27-32)，目前树状聚体广泛用于研究和医学应 用。本发明的优选实施方案是提供包含四条附着于赖氨酸核心分子的个体 氨基酸序列的树状聚体复合物。所述四个个体氨基酸序列中的至少一个包 含上述通式的氨基酸序列也是优选的。更加优选树状聚体复合物的所有四 个个体氨基酸序列分别包含上述通式的氨基酸序列。
本发明的多聚体复合物诸如LPA-二聚体或溶素(lysin)-树状聚体是本发 明的优选复合物。然而，取决于实施方案，包含两个或多个本发明个体序 列的其它类型的多聚体复合物可能是优选的。
生物学活性
本发明的肽序列和包含本发明序列的复合物拥有生物学活性。本发明优 选涉及选自下述的生物学活性：
-刺激与神经细胞分化有关的神经可塑性的能力，例如刺激神经突生长，
-刺激与记忆和学习有关的神经可塑性的能力，例如刺激突触效能，
-刺激细胞存活的能力，例如抑制凋亡，
-抑制炎症的能力，诸如刺激抗炎应答，
-结合GDNF家族受体α(GFRα)和激活或抑制信号转导的能力，诸如与 Ret受体酪氨酸激酶有关的或与神经细胞粘附分子(NCAM)有关的信号转 导，
-结合GFR/神经细胞粘附分子(NCAM)复合体的组分的能力。这样，在 一个优选实施方案中，根据本发明的肽结合NCAM。
因此，在一个实施方案中，上述分离的肽序列能够结合选自GFRα-1、 GFRα-2、GFRα-3或GFRα-4的GFRα受体。
本发明的发明人已鉴定了存在于属于TGFβ蛋白质超家族的一组蛋白 质特别是蛋白质GDNF、ARTN、NRTN、PSTN、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3 和TGFβ-4中的氨基酸基序，并将该基序的存在与所述蛋白质以及由其衍生 的本发明肽片段的生物学活性联系起来。根据本发明的基序是本发明肽序 列结合受体特别是GFRα受体、更特别地结合GFRα-1、GFRα-2、GFRα-3 或GFRα-4所必不可少的。
GFRα受体是脑中的主要受体。GFRα受体与受体酪氨酸激酶Ret一起 构成多组分受体复合体，经由该复合体的信号驱动神经前体细胞分化、轴 突生长、促进神经元存活、特别是与学习和记忆有关的神经可塑性。本发 明的肽序列结合并活化GFRα-Ret或受体复合体的能力用于调节依赖于所述 受体复合体活性的生物学应答。相应地，本发明提供了调节GFRα-Ret受体 复合体活性的方法，包括使用本发明的分离的肽序列或包含所述序列的复 合物。在优选实施方案中，本发明涉及活化GFRα受体的方法。
在另一个实施方案中，上述分离的肽序列能够结合GFRα-神经细胞粘 附分子(NCAM)受体复合体并因此活化或抑制NCAM相关的信号转导。
NCAM扮演神经元细胞的主要细胞粘附分子的角色，其同时作为与神 经元细胞中多种胞内信号转导途径相关的受体样分子。近来已显示GFRα 受体募集因GDNF与GFRα结合而被活化的信号复合体中的NCAM (Paratcha等(2003)Cell 113：867-879)。
因此，根据本发明，本发明的分离的肽序列能够通过活化上述其中一 种GFNα受体复合体而刺激神经元细胞分化。此处术语“神经元分化”既理解 为神经前体细胞或神经干细胞的分化也理解为神经细胞的分化，诸如例如 神经元细胞的成熟。这种分化的例子可以是来自未成熟神经元的神经突生 长、神经突分支、还有神经元再生。
因此，本发明的一个优选实施方案涉及与刺激神经前体/干细胞或未成 熟神经元分化有关的肽序列的生物学活性，在另一个优选实施方案中，本 发明涉及从成熟神经元(例如受伤但存活且指定要再生损伤进程的神经元) 刺激神经突生长。相应地，本发明还涉及刺激神经元细胞分化的方法，包 括使用本发明的肽序列或包含所述序列的复合物。
本发明的其中一个最优选的实施方案涉及所述肽序列与学习和记忆有 关的活性，特别是肽序列刺激突触可塑性、脊柱形成、突触效能的能力。 因此，本发明还涉及刺激记忆和/或学习的方法，包括使用本发明的肽序列 和/或包含所述序列的复合物。本发明既涉及短期记忆又涉及长期记忆。
本发明的肽序列也可以刺激神经元细胞存活。本发明涉及因外伤和变 性疾病刺激神经元细胞存活的能力。相应地，本发明涉及通过使用本发明 的肽序列和/或包含所述序列的复合物刺激细胞存活，优选刺激神经元细胞 存活的方法。
在又一实施方案中，本发明的肽序列可以调节细胞粘附，特别是NCAM 介导的细胞粘附。术语“调节细胞粘附”既包括刺激细胞粘附又包括抑制细胞 粘附。肽序列的这种活性影响发育中的和成熟的神经系统中的许多进程， 而且与许多病理学疾患例如癌症有重大关联。因此，通过使用本发明的肽 序列或包含所述序列的复合物调节细胞粘附特别是NCAM介导的细胞粘附 的方法也在本发明的范围内。
本发明的肽序列和包含所述序列的复合物作为细胞生长培养基的可溶性 /流动性物质以及作为细胞生长底物的固定性物质来说都具有生物学活性。在 一些实施方案中，可能优选使用肽或包含所述肽的复合物作为可溶性物质， 而在其他实施方案中，可能优选使用肽序列作为细胞底物。然而，更优选可 溶性肽序列或包含所述肽序列的复合物。
在另一个实施方案中，本发明的肽序列还能够抑制炎性进程，特别是脑 中的炎性进程。
炎症是由起因于机械损伤或者细菌、病毒或其它生物感染的组织损伤 引发的防御反应。炎症应答涉及三个主要阶段：第一，毛细管膨胀以增加 血流；第二，微血管结构变化以及血浆蛋白自血流逃逸；第三，白细胞通 过内皮迁移并累积于损伤和感染部位。炎症应答从炎性介质的释放开始。 炎性介质是可溶性的、可扩散的分子，局部作用于组织损伤和感染部位， 并且在更多的较远部位影响炎症应答的后续事件。炎性介质可能是外源 的，例如细菌产物或毒素，或者是内源的，其在自身免疫系统内产生，还 可能是受损伤的组织细胞、淋巴细胞、肥大细胞和血液蛋白。
神经炎症在阿耳茨海默氏病的发展中起重要作用，可能决定着易损坏 区域诸如海马的变性。神经炎症与胞外谷氨酸水平的升高有关，而且可能 与谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸受体的刺激升高有关。
抗炎是本发明肽序列的另一种重要生物学活性。因此，本发明涉及抗 炎肽，其能够充当特别是脑中的持续性炎症应答的抑制剂。
体内炎性介质诸如例如TNFα应答外伤和/或感染后数天或数周期间细 菌产物或甚至活细菌的局部持续存在的持续存在促进针对炎症的反应，诸 如例如发热、肿胀和疼痛。已经证实持续的炎症应答对机体非常有害。如 果细菌产物或活细菌自其局部病灶变得遍布体内，那么炎性反应将变得难 以抵抗和失去控制，并引发败血症，最终进一步发展为严重的败血症和败 血性休克。抗炎肽可用于阻断或抑制以血液和重要器官诸如肺、肝、肠、 脑和肾中的大量有害细胞因子级联反应为代表的难以抵抗的持续炎症应 答。
上下文中术语“抗炎复合物”指具有至少一种如下活性的复合物：
i)响应于细菌产物、活细菌或外伤而产生内源炎性介质包括炎性介 质的受体和涉及炎性介质的信号转导的转录因子从而减弱或抑制免疫细胞 优选单核细胞/巨噬细胞中的基因表达，所述介质优选选自：选自TNFα、 IL-1、IL-6、G-CSF、GM-CSF、M-CSF的细胞因子，选自IL-8、MCP-1的 趋化因子，选自组织因子和IL-2Rα的受体，
ii)减弱或抑制通过相接触系统(phase contact system)的缓激肽生产，
iii)减弱或抑制单核细胞的引诱剂潜力，和/或
iv)缩短或抑制单核细胞、嗜中性粒细胞和作为凋亡诱导物的其它免 疫细胞的寿命，
v)减少或抑制血管内皮细胞表达粘附分子，所述粘附分子优选选自 PECAM、ICAM-1、E-选择素、VCAM-1，
vi)减弱或抑制生产缓激肽的接触相系统(contact phase system)的活 化，其中缓激肽引发血管通透性提高，
vii)刺激抗炎介质的合成，所述抗炎介质选自IL-10和IL-12，
viii)抑制补体活化；
ix)降低存在慢性神经炎症时神经细胞变性的风险，例如表达谷氨酸 N-甲基-D-天冬氨酸受体的神经元。
本发明的肽序列和包含所述肽序列的复合物的生物学活性的其中一种 非限制性例子描述于下述应用中。
神经突生长的刺激
具有促进神经突生长以及刺激神经元细胞再生和/或分化潜力的物质诸 如某些内源营养因子是寻找促进例如神经元再生和其它形式神经可塑性的 复合物时的首要目标。为了评估本发明复合物的潜力，可以研究其刺激神 经突生长相关信号、干扰细胞粘附、刺激神经突生长、神经再生的能力。 已表明本发明的复合物促进神经突生长，因此认为其为神经元连接再生以 及由此发生的损伤后机能恢复的良好促进剂，它也同样是需要这种疗效的 其它疾患中神经元机能的促进剂。
上下文中“分化”与神经元的成熟和神经突的伸长过程有关，其发生于所 述神经元最后的细胞分裂之后。本发明的复合物可能能够终止神经细胞分 裂并启动所述细胞的成熟，诸如启动神经突的伸长。另外，“分化”与神经元 祖细胞、未成熟神经细胞或胚胎干细胞的遗传学、生物化学、形态学和生 理学转化进程的起始有关，所述进程导致具有正常神经元细胞的功能特征 的细胞的形成，所述功能特征在本领域中是明确的。本发明中将“未成熟神 经细胞”定义为至少具有神经细胞的一种特征的细胞，所述特征在本领域被 公认为神经细胞的特征。
根据本发明，包含至少一种上述肽序列的复合物能够刺激神经突生长。 本发明涉及神经突生长增强/刺激，诸如在对照/未经刺激的细胞的神经突生 长之上大约有75％的增强/刺激，例如50％，诸如大约150％，例如100％， 诸如大约250％，例如200％，诸如大约350％，例如300％，诸如大约450％， 例如400％，诸如大约500％。
可以通过采用评估神经突生长的任何已知的方法或测试来完成候选复 合物刺激神经突生长能力的评估，诸如例如以下实施例中所描述的。
根据本发明，复合物作为细胞生长底物的不溶性固定性组分和细胞生 长培养基的可溶性组分都具有神经突发生活性。本文中“固定性”指所述复合 物结合/附着于不溶于水或水溶液的物质并因此变得在这种溶液中同样不能 溶解。对于医学应用来说，不溶性和可溶性复合物都可以考虑，但可溶性 复合物是优选的。“可溶性复合物”理解为可溶于水或水溶液的复合物。
个体肽序列的生产
本发明的肽序列可以通过任何常规的合成方法、重组DNA技术、衍生 所述肽序列的全长蛋白的酶学裂解或上述方法的组合来制备。
重组制备
因此，在一个实施方案中，本发明的肽利用重组DNA技术生产。
编码肽或衍生所述肽的相应全长蛋白的DNA序列可以通过合成途径制 备，其中使用已制定的标准方法，例如Beaucage和Caruthers，1981， Tetrahedron Lett.22：1859-1869描述的磷酰脒(phosphoamidine)法、或者 Matthes等，1984，EMBO J.3：801-805描述的方法。根据磷酰脒法，寡核苷酸 例如在自动DNA合成仪中合成、纯化、退火，在合适的载体中连接和克隆。
也可以根据标准方案，利用DNA酶I将编码肽来源的相应全长蛋白的 DNA序列片段化以制备编码肽的DNA序列(Sambrook等，Molecular cloning： A Laboratory manual.第二版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。本 发明涉及选自以上鉴定的蛋白质的全长蛋白。或者可以利用特异性限制性内 切核酸酶将编码本发明全长蛋白的DNA片段化。利用Sambrook等， Molecular cloning：A Laboratory manual.第二版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的标准方法进一步纯化所述DNA片段。
编码全长蛋白的DNA序列也可以是基因组或cDNA来源的，例如通过 制备基因组或cDNA文库并筛选编码全长蛋白的全部或一部分的DNA序列 而获得，所述筛选依照标准技术利用合成寡核苷酸探针杂交进行(参考 Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。也可以利用特异性引物通过聚合酶链式反应制备所述DNA 序列，例如如US 4,683,202或Saiki等，1988，Science 239：487-491中所述。
然后将所述DNA序列插入到重组表达载体中，所述重组表达载体可以 是能够方便地用于重组DNA程序的任何载体。载体的选择通常取决于其所 要导入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体 外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，所述载 体可以是当导入到宿主细胞中时，整合到宿主细胞基因组中并与其已经整 合到其中的染色体一起复制的载体。
编码肽或全长蛋白的DNA序列在载体中应当可操作地连接到合适的启 动子序列。所述启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何 DNA序列，可以衍生自与所述宿主细胞同源或异源的编码蛋白质的基因。 引导哺乳动物细胞中编码DNA序列转录的合适启动子的例子是SV 40启动 子(Subramani等，1981，Mol.Cell Biol.1：854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启 动子(Palmiter等，1983，Science 222：809-814)或腺病毒2主要晚期启动子。 用于昆虫细胞的合适启动子是多角体蛋白启动子(Vasuvedan等，1992，FEBS Lett.311：7-11)。用于酵母宿主细胞的合适启动子包括来自酵母糖酵解基因 (Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.255：12073-12080；Alber和Kawasaki，1982， J.Mol.Appl.Gen.1：419-434)或乙醇脱氢酶基因(Young等，1982，Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等编，Plenum Press， New York)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，1983， Nature 304：652-654)启动子。用于丝状真菌宿主细胞的合适启动子为例如 ADH3启动子(McKnight等，1985，EMBO J.4：2093-2099)或tpiA启动子。
所述编码DNA序列也可以可操作地连接到合适的终止子，诸如人生长 激素终止子(Palmiter等，前面引用的)或(用于真菌宿主)TPI1(Alber和 Kawasaki，前面引用的)或ADH3(McKnight等，前面引用的)启动子。所述载 体可以进一步包含其他成分，诸如多聚腺苷酸化信号(例如来自SV 40或腺 病毒5Elb区)、转录增强子序列(例如SV 40增强子)和翻译增强子序列(例如 编码腺病毒VARNA的那些)。
所述重组表达载体可以进一步包含能够使所述载体在所述宿主细胞中 复制的DNA序列。这种序列的例子(宿主细胞为哺乳动物细胞时)是SV 40 复制起点。所述载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补宿主细胞的 缺陷的基因，诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或赋予药物抗性例如 新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤抗性的基因。
分别用于连接编码肽或全长蛋白的DNA序列、启动子和终止子并将它 们插入到包含复制所必需的信息的适当载体中的方法是本领域熟练人员熟 知的(参见例如Sambrook等，前面引用的)。
为了获得本发明的重组肽，有益地可以将编码DNA序列与第二个肽编 码序列和蛋白酶裂解位点编码序列融合在一起，提供编码融合蛋白的DNA 构建体，其中蛋白酶裂解位点编码序列位于HBP片段和第二个肽编码DNA 之间，DNA构建体被插入到重组表达载体中，并在重组宿主细胞中表达。在 一个实施方案中，所述第二个肽选自但不限于包含谷胱甘肽-S-还原酶、小 牛胸腺素、细菌硫氧还蛋白或人泛素天然或合成变体或其肽在内的组。在 另一个实施方案中，包含蛋白酶裂解位点的肽序列可以是具有裂解位点氨 基酸序列IEGR的因子Xa、具有裂解位点氨基酸序列DDDDK的肠激酶、 具有裂解位点氨基酸序列LVPR/GS的凝血酶、或具有裂解位点氨基酸序列 XKX的水解无色杆菌(Acharombacter lyticus)。
表达载体导入到其中的宿主细胞可以是能够表达所述肽或全长蛋白的 任何细胞，优选真核细胞，诸如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞，例 如爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或哺乳动物细胞，特别是昆虫和哺乳动物细 胞。合适的哺乳动物细胞系的例子是HEK293(ATCC CRL-1573)、COS(ATCC CRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632、ATCC CCL-10)或CHO(ATCC CCL-61) 细胞系。转染哺乳动物细胞并表达导入在所述细胞中的DNA序列的方法描 述于例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621；Southern和 Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341；Loyter等，1982，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 79：422-426；Wigler等，1978，Cell 14：725；Corsaro和Pearson，1981， Somatic Cell Genetics 7，p.603；Graham和van der Eb，1973，Virol.52：456；以 及Neumann等，1982，EMBO J.1：841-845。
或者，真菌细胞(包括酵母细胞)可以用作宿主细胞。合适的酵母细胞的 例子包括酵母(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)细 胞，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。其它真菌细胞的例子 是丝状真菌，例如曲霉(Aspergillus spp.)或脉孢菌(Neurospora spp.)，特别是 米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的细胞。曲霉用于 表达蛋白质的用途描述于例如EP 238 023。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养哺乳动物细胞的任何常规培 养基，诸如含血清的或无血清的、含有合适添加物的培养基，或者用于培 养昆虫、酵母或真菌细胞的合适培养基。可从供应商那里获得合适的培养 基，或者也可以按照公开的配方(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中的)制备合适的培养基。
然后，可以通过常规方法从培养基回收由细胞重组生产的肽或全长蛋 白，所述常规方法包括通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞，以盐例如 硫酸铵方式沉淀上清液或滤出液的蛋白质组分，通过多种层析程序例如 HPLC、离子交换层析、亲和层析等等纯化。
合成制备
合成生产肽的方法是本领域熟知的。生产合成肽的详细说明和实践建 议可以在Synthetic Peptides：A User′s Guide(Advances in Molecular Biology)， Grant G.A.编，Oxford University Press，2002或者Pharmaceutical Formulation： Development of Peptides and Proteins，Frokjaer和Hovgaard编，Taylor和 Francis，1999中找到。
例如，可以利用Fmoc化学和Acm-保护的半胱氨酸合成肽。用反相 HPLC纯化后，可以进一步处理肽以获得例如环状或C-或N-末端修饰的同 等型(isoform)。环化和末端修饰的方法是本领域熟知的，详细描述于上述引 用的手册中。
在优选实施方案中，本发明的肽序列以合成途径生产，特别是使用序 列辅助的肽合成(Sequence Assisted Peptide Synthesis，SAPS)法。
通过SAPS，肽可以在配备有过滤用的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中分 批合成，或者使用用作N-a-氨基保护基的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰 基(Boc)和侧链官能基的合适公用保护基在完全自动化的肽合成仪上以持续 流动型聚酰胺固相法(Dryland，A.和Sheppard，R.C.，(1986)J.Chem.Soc. Perkin Trans.I，125-137)合成。
然后可以在合成时利用本领域熟知的技术将个体肽序列配制为多聚 体，例如所述序列的二聚体可以通过WO 00/18791中描述的LPA法获得， 树枝状聚合物可以通过PCT/US90/02039描述的MAP合成法获得。
抗体
本发明的一个目的是提供能够识别并选择性结合GDNF、ARTN、 NRTN、PSTN、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3和/或TGFβ-4上的表位的抗体、 其抗原结合片段或重组蛋白，所述表位包含本发明的基序或选自SEQ ID NO：1-22的序列或所述序列的片段。
术语“表位”指(抗原的)抗体所识别的(抗原分子上的)特定原子基团(由 此引发免疫应答)。术语“表位”与术语“抗原决定簇”等同。表位可以包含非 常接近的(诸如位于连续氨基酸序列中的，或者位于抗原氨基酸序列的远 离部分但由于蛋白质折叠已经相互靠近的)3个或更多个氨基酸残基，诸如 例如4个、5个、6个、7个、8个氨基酸残基。
属于血浆蛋白家族的抗体分子称为免疫球蛋白，其基本构件即免疫球 蛋白折叠或结构域以多种形式用于免疫系统及其它生物识别系统的许多分 子中。典型的免疫球蛋白具有四个多肽链，包含称为可变区的抗原结合区 和称为恒定区的不变区。
天然抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由 两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链由一个共价二硫键 连接于重链，然而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型重链之间有变化。 每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链一端具有可变区 (VH)，接下来是许多恒定区。每条轻链在一端具有可变区(VL)，在其另一 端具有恒定区。轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排在一起，轻链可变 区与重链可变区排在一起。据信特定氨基酸残基形成轻链和重链可变区之 间的接触面(Novotny J，& Haber E.Proc Natl Acad Sci U S A.82(14)：4592-6， 1985)。
依据其重链恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类 别。至少有五种(5)主要免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其 中几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4； IgA-1和IgA-2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定区分别称为 alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。抗体的轻链可以基于其 恒定区的氨基酸序列指定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种截然不同的类 型之一。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是熟知的。
在抗体可变区的上下文中术语“可变”指抗体当中可变区的某些部分在 序列上差异非常大的事实。可变区用于结合并决定每种特定抗体针对其特 定抗原的特异性。然而，可变性在整个抗体可变区中不是均匀分布的。在 轻链和重链可变区中，可变性都集中于称为互补决定区(CDR)也称为高变区 的三个区段。
可变区更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区 各自包含四个大量采用β-片层构象的FR区，其通过三个CDR相连，这三 个CDR形成连接β-片层结构的环，在一些情况下构成β-片层结构的一部分。 每条链中的CDR通过FR非常紧密地结合在一起，与另一条链中的CDR一 起对抗体的抗原结合部位的形成作出贡献。恒定区不直接涉及抗体与抗原 的结合，但显示多种效应器功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
因此预期用于本发明的抗体可以具有多种形式中的任何一种，包括完 整免疫球蛋白，抗体片段诸如Fv、Fab、以及类似片段，包括可变区互补决 定区(CDR)的单链抗体等等形式，所有这些都落在本文所用广义术语“抗体” 的范围内。本发明预期具有任何特异性的抗体的应用，多克隆的或单克隆 的，不限于识别并与特定抗原发生免疫反应的抗体。在优选实施方案中， 在下述治疗方法和筛选方法的上下文中均使用在免疫上特异于本发明抗原 或表位的抗体或其片段。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常指抗原结合或可变区。抗体 片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生 两条相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每条都具有单一的抗原结合位 点，和剩余的“Fc”片段，由于其易于结晶的能力而称为“Fc”片段。胃蛋白酶 处理产生具有能够交联抗原的两个抗原结合片段的F(ab′)2片段，和剩余的 其它片段(称为pFc′)。其他片段可能包括双抗体、线性抗体、单链抗体分子、 以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本文所用抗体的“功能性片段”指Fv、 F(ab)和F(ab′)2片段。
本文术语“抗体片段”可与术语“抗原结合片段”互换使用。
抗体片段可以短至约4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基 酸、9个氨基酸、约12个氨基酸、约15个氨基酸、约17个氨基酸、约18 个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸或更多个氨基 酸。通常本发明的抗体片段可以具有任何尺寸上限，只要其相对于特异性 结合如下表位的抗体来说具有类似的或免疫学的特性，所述表位包含选自 本文鉴定为SEQ ID NO：1-22的任一序列或所述序列的片段的肽序列。这 样，本发明的上下文中术语“抗体片段”等同于术语“抗原结合片段”。
抗体片段保留了一些与其抗原或受体选择性结合的能力。一些抗体片 段类型如下定义：
(1)Fab指包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以用木 瓜蛋白酶消化完整抗体产生完整轻链和一条重链的一部分而制备。
(2)Fab’指能够用胃蛋白酶处理完整抗体，之后还原以产生完整轻链和 重链的一部分而获得的抗体分子的片段。每个抗体分子获得两个Fab’片段。
Fab′片段与Fab片段不同，其在重链CH1区的羧基末端添加了几个残 基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。
(3)(Fab’)2指能够用胃蛋白酶处理完整抗体随后不经还原而获得的抗体 片段。
F(ab’)2指通过两个二硫键结合在一起的两个Fab’片段的二聚体。
(4)Fv是包含完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密 非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体(VH-VL二聚体)构 成。正是在这种构象中，每个可变区的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚 体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。 然而，即便是单一的可变区(或者是只包含三个抗原特异性CDR的半个Fv) 也具有识别并结合抗原的能力，虽然其亲和力低于完整的结合位点。
(5)单链抗体(“SCA”)定义为包含通过适当的多肽接头连接的轻链可变 区、重链可变区的基因工程化分子，其为基因工程手段融合的单链分子。 这样的单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，Fv多肽在VH和 VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使sFv能够形成所需的用于抗原结 合的结构。有关sFv的综述参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113：269-315，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NY，1994。
术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述 片段包含同一多肽链中相连的轻链可变区(VL)的重链可变区(VH) (VH-VL)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域配对的接头，迫 使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。例 如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90： 6444-6448(1993)中更为详细地描述了双抗体。
本发明既包括能够结合本发明表位的多克隆抗体和单克隆抗体，也包 括其抗原结合片段和重组蛋白。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员熟知的。参见例如Green等，1992， Production of Polyclonal Antisera，在Immunochemical Protocols中(Manson 编)，1-5页(Humana Press)；Coligan等，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，在Current Protocols in Immunology中，第 2.4.1节，这些文献加入本文作为参考文献。
单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler和Milstein，Nature， 256：495-7(1975)；Coligan等，第2.5.1-2.6.7节；以及Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，726页，Cold Spring Harbor Pub.(1988)。单克隆抗体可以 通过多种成熟的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。这些分离技术包括使用 蛋白A-Sepharose的亲和层析、大小排阻层析、和离子交换层析。参见例如 Coligan等，第2.7.1-2.7.12节和第2.9.1-2.9.3节；Barnes等，Purification of Immunoglobulin G(IgG).在Methods in Molecular Biology中，1992，10： 79-104，Humana Press，NY。
体外和体内操作单克隆抗体的方法是本领域技术人员熟知的。例如， 根据本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤法制备，所述杂交瘤法由 Kohler和Milstein，1975，Nature 256，495-7首次描述，或者可以通过重组DNA 法(其描述于例如US 4,816,567)制备。供本发明使用的单克隆抗体也可以利 用Clackson等，1991，Nature 352：624-628以及Marks等，1991，J Mol Biol 222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。另一种方法涉及将单克 隆抗体人源化，所述人源化通过重组手段制备包含人特定的和可识别的序 列的抗体而实施。综述参见Holmes等，1997，J Immunol 158：2192-2201和 Vaswani等，1998，Annals Allergy，Asthma & Immunol 81：105-115。
本文所用术语″单克隆抗体″指由基本上同质的抗体群体获得的抗体，即 除了可能少量存在的天然发生的突变之外，构成所述群体的个体抗体是相 同的。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点。另外，与典型地包 括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制品相反，每种单克 隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体由于是 通过杂交瘤培养物合成的，不受其它免疫球蛋白的污染而具有优势。所述 修饰语“单克隆”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，不能理解为 需要以任何特定方法生产所述抗体。
本文中单克隆抗体特别包括″嵌合″抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻 链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列 相同或同源，而链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的 抗体中的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们显示所需 的生物学活性(US 4,816,567；和Morrison等，1984，Proc Natl Acad Sci， 81：6851-6855)。
制备抗体片段的方法也是本领域已知的(参见例如，Harlow和Lane， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1988，加 入本文作为参考文献)。本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或者通 过在大肠杆菌中表达编码所述片段的DNA而制备。抗体片段可以通过完整 抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的常规方法获得。例如，可以用胃蛋白 酶酶学裂解抗体，提供称为F(ab’)2的5S片段而制备抗体片段。可以利用硫 醇还原剂以及任选由二硫键裂解而来的巯基的封闭基团进一步裂解该片 段，以制备3.5S Fab’单价片段。或者用胃蛋白酶酶学裂解直接制备两个单 价Fab’片段和Fc片段。这些方法描述于例如US 4,036,945和US 4,331,647 以及包含于其中的参考文献。此处将这些专利文献整体加入作为参考文献。
也可以使用其它裂解抗体的方法，诸如分离重链形成单价轻链-重链片 段，进一步裂解片段，或者其它酶学、化学、或遗传技术，只要所述片段 结合由所述完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包含VH与VL链的结合。 这种结合可以是非共价的，或者可变链可以由分子间二硫键连接或者由化 学药品诸如戊二醛交联。优选Fv片段包含由肽接头连接的VH和VL链。这 些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建如下结构基因而制备，所述结构基因包 含由寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列。将所述结构基因插 入到表达载体中，随后将表达载体导入到宿主细胞诸如大肠杆菌中。重组 宿主细胞合成由接头肽桥接两个V结构域的单个多肽链。例如，Whitlow 等，1991，在Methods：A Companion to Methods in Enzymology中，2：97；Bird 等，1988，Science 242：423-426；US 4,946,778；和Pack等，1993， BioTechnology 11：1271-77描述了制备sFv的方法。
另一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽 (“最小识别单元”)通常涉及抗原识别和结合。CDR肽可以通过克隆或构建 编码感兴趣抗体的CDR的基因而获得。例如，利用聚合酶链式反应制备这 些基因，由生产抗体的细胞自RNA合成可变区。参见例如Larrick等， Methods：a Companion to Methods in Enzymology，Vol.2，p.106(1991)。
本发明预期人和人源化形式的非人(例如鼠)抗体。这些人源化抗体是包 含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列诸如表位识别序列的嵌合免疫球蛋 白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原 结合子序列)。很大程度上，人源化抗体指其中来自受体互补决定区(CDR) 的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的、来自非人物种(供体抗体)CDR 的残基所置换的人免疫球蛋白(受体抗体)，所述非人物种为诸如小鼠、大鼠 或兔。包含如下本发明抗体最小序列的人源化抗体是本发明的优选实施方 案之一，所述最小序列为诸如识别本文所述表位的序列。
一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应的非人残基所置换。 此外，人源化抗体可以包含在受体抗体和引入的CDR或框架序列中都未发 现的残基。构建了这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。总的来说，人 源化抗体基本上会包含至少一个、和典型地两个整个这样的可变区，其中 所有的或者基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区， 并且所有的或者基本上所有的FR区均为人免疫球蛋白共有序列的FR区。 最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)典型地人免疫球蛋白恒 定区的至少一部分。更多详情参见Jones等，1986，Nature 321，522-525； Reichmann等，1988，Nature 332，323-329；Presta，1992，Curr Op Struct Biol 2：593-596；Holmes等，1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等，1998， Annals Allergy，Asthma & Immunol 81：105-115。
可以通过本领域的任何标准方法生产抗体，所述方法利用人GDNF、 ARTN、NRTN、PSTN、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3和TGFβ-4的天然或重 组片段制备多克隆和单克隆抗体，所述片段包含作为抗原的选自SEQ ID NO：1-22的序列。也可以利用肽序列SEQ ID NO：1-22的变体、同源物或片 段制备这些抗体，所述变体、同源物和片段是满足下述标准的免疫原性肽 序列：
(i)是至少6个氨基酸的连续氨基酸序列；
(ii)包含本发明的基序。
也可以例如将根据本发明的免疫原性片段施用于个体，由所处理的个 体在体内产生抗体。相应地，本发明进一步涉及包含上述免疫原性片段的 疫苗。
本申请还涉及生产本发明的抗体的方法，所述方法包括提供上述免疫 原性片段的步骤。
本发明既涉及能够调节诸如增强或减弱GDNF、ARTN、NRTN、PSTN、 TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3和TGFβ-4的生物学功能，特别是涉及神经细胞 分化、存活和/或可塑性的功能的抗体，又涉及能够识别和特异性结合后者 所述蛋白质但不调节其生物学活性的抗体。
本发明涉及上述抗体用于1)需要调节人GDNF、ARTN、NRTN、PSTN、 TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3和TGFβ-4活性时的治疗性应用，2)诊断目的的 体外和/或体内检测和/或监测后者所述蛋白，3)研究目的的用途。
药物组合物
本发明还涉及包含如上定义的一种或多种复合物的药物组合物，其中 所述复合物能够刺激神经突生长和/或神经细胞分化、神经细胞存活和/或 刺激学习和/或记忆。因此，本发明涉及能够刺激神经元细胞分化和/或刺激 神经元细胞再生、和/或刺激与学习和记忆有关的神经元可塑性、和/或刺 激神经细胞存活的药物组合物。
上下文中所用术语“药物组合物”与术语“药剂(medicament)”同义。
肽序列可以配制为包含上述分离的个体肽片段或其多聚体或二聚体的 组合物。
所述药物组合物在体外或体内可以具有针对细胞的上述效应，其中将 所述组合物施用于患者。
本发明的药剂包含有效量的一种或多种上述定义的复合物，或者包含 如上定义的组合物与药学上可接受的添加剂的组合。可以适当地配制这种 药剂以用于口服、经皮、肌肉内、静脉内、颅内、鞘内、脑室、鼻内或肺 部给药。
基于本发明复合物的药剂和组合物的制剂开发策略通常与基于任何其 它蛋白质的药物产品的制剂策略一致。几本教科书中讨论了潜在的问题以 及克服这些问题所需的教导，例如“Therapeutic Peptides and Protein Formulation.Processing and Delivery Systems”，A.K.Banga编著，Technomic Publishing AG，Basel，1995。
可注射的制剂通常制备为液态溶液或悬浮液、适于在注射之前溶解于 或悬浮于液体中的固体形式。也可以乳化所述制品。通常将活性成分与药 学上可接受的且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如 水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等及其组合。此外，需要的话，所述制 品可以含有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或提高制剂 的效果或方便其运输的辅助物质。
本发明复合物的制剂可以通过本领域熟练人员已知的技术制备。所述 制剂可以含有药学上可接受载体和赋形剂，包括微球体、脂质体、微胶 囊、纳米颗粒等等。
可以适当地通过注射施用所述制品，任选在活性成分要发挥其效应的 部位注射。适合于其它给药方式的其他制剂包括栓剂、鼻腔的、肺部的以 及一些情况下口服的制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体包括聚亚烷基 二醇或甘油三酯。这些栓剂可以由含有0.5％到10％，优选1-2％的活性成分 的混合物构成。口服制剂包括正常情况下使用的赋形剂，诸如例如药物等 级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这 些组合物为溶液、悬浮液、药片、药丸、胶囊、缓释制剂或粉末形式的， 通常含有10-95％的活性成分，优选25-70％。
其它制剂为适于鼻腔和肺部给药的制剂，诸如例如吸入剂和气雾剂。
活性复合物可以配制为中性或盐形式的。药学上可接受的盐包括酸加 成盐(与肽复合物的游离氨基一起形成)，其由无机酸诸如例如盐酸或磷酸 或有机酸诸如醋酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等等形成。由游离羧基形成 的盐也可以衍生自无机碱诸如例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁，以及有 机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。
所述制品以与剂量制剂相容的方式施用，这样的量将是治疗上有效 的。所要施用的量取决于所要治疗的患者，包括例如患者的体重和年龄、 所要治疗的疾病以及疾病的发展阶段。合适的剂量范围为每次给药每公斤 体重正常情况下在几百μg数量级的活性成分，优选范围为每公斤体重约 0.1μg至5000μg。使用单体形式的复合物时，合适的剂量通常为每公斤体 重0.1μg至5000μg的范围，诸如每公斤体重约0.1μg至3000μg的范围， 尤其是每公斤体重约0.1μg到1000μg的范围。使用多聚体形式的复合物 时，合适的剂量通常为每公斤体重0.1μg至1000μg的范围，诸如每公斤体 重约0.1μg至750μg的范围，尤其是每公斤体重约0.1μg到500μg的范 围，诸如每公斤体重约0.1μg到250μg的范围。特别是鼻腔给药时，使用 比其它途径给药更小的剂量。可以一次给药或者后续给药。剂量也将取决 于给药途径，并且会随着所治疗的患者的年龄和体重而变化。多聚体形式 的优选剂量介于每70kg体重1mg至70mg。
对于一些适应征，优选局部或基本上局部用药。本发明的一些复合物 活性是足够的，但是对于其它一些复合物，如果所述制品进一步包含药学 上可接受的添加剂和/或载体则将增强其效力。这些添加剂和载体将是本领 域已知的。在一些例子中，包括促进活性物质向其目标递送的化合物将是 有益的。
许多情况下，多次施用所述制剂是必要的。可以连续输注给药，诸如 心室内输注，或者施用多剂，例如一天多次、每天一次、一周多次、每周 一次等等。优选在个体已经遭受可能导致细胞死亡的因素之前或者之后不 久开始施用所述药剂。优选在所述因素出现8小时内施用所述药剂，诸如 在所述因素出现5小时内。许多复合物具有长期效应，由此可以以较长时 间间隔施用所述复合物，诸如1周或2周。
与神经导管(nerve guide)的应用有关，可以基于活性复合物的受控释放 连续或分为小份施用。此外，可以使用前体控制释放速率和/或释放部位。 类似地，其他类型的植入物以及口服给药可以基于受控释放和/或前体的应 用。
如以上所讨论的，本发明涉及治疗个体以在体外或体内诱导神经细胞 分化、刺激其再生、可塑性和存活，所述治疗涉及施用有效量的上述一种 或多种复合物。
另一种给药策略是植入或注射能够表达和分泌所述复合物的细胞。由 此可以在其要发挥作用的部位产生所述复合物。
治疗
又一方面，本发明涉及所述肽、或其片段、变体诱导神经细胞分化和/ 或刺激其再生、可塑性和/或存活的用途。所述用途是治疗以预防中枢和周 围神经系统、以及肌肉或多种器官的疾病和疾患。
在一个实施方案中，利用根据本发明的复合物/组合物进行治疗可用于 诱导植入或移植细胞的分化、调节其增殖、刺激其再生、神经元可塑性和 存活。这在使用具有长期效应的复合物时特别有用。
因此，所述治疗包括与中枢和周围神经系统疾病或疾患有关的细胞死 亡的治疗和/或预防，所述疾病或疾患为诸如手术后神经损伤(postoperative nerve damage)、外伤性神经损伤(traumatic nerve damage)例如由脊髓损伤 (spinal cord injury)引起的、神经纤维髓鞘形成减弱(impaired myelination of nerve fiber)、缺血后损伤(postischaemic damage)例如由中风(stroke)引起的、 多发性梗塞性痴呆(multiinfarct dementia)、多发性硬化(multiple sclerosis)、与 糖尿病有关的神经变性(nerve degeneration associated with diabetes mellitus)、 神经-肌肉变性(neuro-muscular degeneration)、精神分裂症(schizophrenia)、阿 耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、或亨 廷顿氏病(Huntington’s disease)。
同样，与肌肉有关的疾病或疾患，包括神经-肌肉连接机能减弱的疾患， 诸如遗传性或外伤性萎缩性肌肉病症(genetic or traumatic atrophic muscle disorder)；或者对于多种器官的疾病或疾患，诸如生殖腺、胰腺(诸如I型 和II型糖尿病)、肾脏(诸如肾病)的变性疾患(degenerative condition)的治 疗来说，根据本发明的复合物可用于诱导分化、调节增殖、刺激再生、神 经元可塑性和存活，即刺激存活。
在又一实施方案中，所述复合物和/或药物组合物的用途是用于刺激学 习和/或短期和/或长期记忆的能力。
特别地，本发明的复合物和/或药物组合物可用于治疗临床疾患，诸如 精神病(psychoses)诸如老年性和早老性器质性精神疾患(senile and presenile organic psychotic conditions)、酒精中毒性精神病(alcoholic psychoses)、药物 性神经病(drug psychoses)、瞬时性器质性精神疾患(transient organic psychotic condition)、阿耳茨海默氏病、脑脂质沉积(cerebral lipidoses)、癫 痫(epilepsy)、全身性轻瘫(general paresis)[梅毒(syphilis)]、肝豆状核变性 (hepatolenticular degeneration)、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington′s chorea)、雅- 克二氏病(Jakob-Creutzfeldt disease)、多发性硬化、脑的皮克氏病(Pick′s disease of the brain)、梅毒(syphilis)、精神分裂性障碍(Schizophrenic disorder)、情感性精神病(affective psychoses)、神经症性障碍(neurotic disorder)、人格障碍(personality disorder)包括性格神经症(character neurosis)、与器质性脑病综合征(organic brain syndrome)有关的非精神病人 格障碍(nonpsychotic personality disorder)、偏执型人格障碍(paranoid personality disorder)、狂信型人格(fanatic personality)、类偏执性人格 (paranoid personality(disorder))、偏执狂样特性(paranoid traits)、性偏离和紊 乱(sexual deviations and disorders)、精神发育迟缓(mental retardation)、神经 系统和感觉器官的疾病、认知异常(cognitive anomalies)、中枢神经系统的 炎性疾病诸如脑膜炎(meningitis)、脑炎(encephalitis)、脑变性(Cerebral degeneration)诸如阿耳茨海默氏病、皮克氏病、脑的老年性脑变性(senile degeneration of brain)、交通性脑积水(communicating hydrocephalus)、阻塞 性脑积水(obstructive hydrocephalus)、帕金森氏病包括其它锥体外束病 (extra pyramidal disease)和异常运动障碍(abnormal movement disorders)、脊 髓小脑疾病(spinocerebellar disease)、小脑性共济失调(cerebellar ataxia)、马 里氏病(Marie′s)、桑格-布朗二氏病(Sanger-Brown)、肌阵挛性小脑协同失调 (Dyssynergia cerebellaris myoclonica)、原发性小脑变性(primary cerebellar degeneration)诸如脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)、家族性(familial)、 青少年(juvenile)、成人(adult)脊髓性肌萎缩、运动神经元病(motor neuron disease)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、运动神经元病 (motor neuron disease)、进行性延髓性麻痹(progressive bulbar palsy)、假性 延髓性麻痹(pseudobulbar palsy)、原发性脊髓侧索硬化(primary lateral sclerosis)、其它前角细胞疾病(anterior horn cell disease)、未定性的 (unspecified)前角细胞疾病、其它脊髓疾病、脊髓空洞症(syringomyelia)和 延髓空洞症(syringobulbia)、血管性脊髓病(vascular myelopathies)、急性脊 髓梗塞(acute infarction of spinal cord)(栓塞性(embolic))(非栓塞性 (nonembolic))、脊髓动脉血栓形成(arterial thrombosis of spinal cord)、脊髓 水肿(edema of spinal cord)、亚急性坏死性脊髓病(subacute necrotic myelopathy)、疾病分类中其它地方的亚急性脊髓混合变性(subacute combined degeneration of spinal cord)、脊髓病(myelopathy)、药物诱发的 (drug-induced)、辐射诱发的(radiation-induced)脊髓炎(myelitis)、自主神经 系统障碍(disorders of the autonomic nervous system)、外周自主(peripheral autonomic)、交感(sympathetic)、副交感(parasympathetic)或植物(vegetative) 系统障碍、家族性缺陷自主症(familial dysautonomia)[赖利-戴综合征 (Riley-Day syndrome)]、特发性周围自主神经病(idiopathic peripheral autonomic neuropathy)、颈动脉窦性晕厥或综合征(carotid sinus syncope or syndrome)、颈交感神经性营养不良或麻痹(cervical sympathetic dystrophy or paralysis)；疾病分类中其它地方的周围自主神经病(peripheral autonomic neuropathy)、淀粉样变(amyloidosis)、周围神经系统疾病、臂丛病损 (brachial plexus lesions)、颈肋综合征(cervical rib syndrome)、肋锁综合征 (costoclavicular syndrome)、前斜角肌综合征(scalenus anterior syndrome)、胸 出口综合征(thoracic outlet syndrome)、臂丛神经炎(brachial neuritis)或神经 根炎(radiculitis)包括新生儿的、炎性和毒性神经病(inflammatory and toxic neuropathy)包括急性传染性多神经炎(acute infective polyneuritis)、吉兰-巴 雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)、感染后多神经炎(Postinfectious polyneuritis)、胶原血管病(collagen vascular disease)中的多神经病 (polyneuropathy)、侵袭眼睛多种结构的病症、化脓性眼内炎(purulent endophthalmitis)、耳和乳突疾病、新生儿器官和软组织异常包括神经系统 中的、分娩(labor and delivery)过程中施用麻醉剂或其它镇静剂的并发症、 皮肤病包括感染、循环不充分的问题、损伤包括手术后的、压碎性损伤 (crushing injury)、烧伤(burns)、神经和脊髓损伤包括神经分开(division of nerve)、连续性病变(lesion in continuity)(有或没有开放性伤口的)、创伤性 神经瘤(traumatic neuroma)(有或没有开放性伤口的)、外伤性瞬时麻痹 (traumatic transient paralysis)(有或没有开放性伤口的)、医疗过程中意外刺 伤(puncture)或撕裂(laceration)、视神经和通道损伤、视神经即第二脑神经 损伤、视交叉损伤、视通道损伤、视皮层损伤、未定性的失明、其它脑神 经损伤、其它的和未定性的神经的损伤、药物、医学和生物学物质中毒、 遗传性或外伤性萎缩性肌肉病症；或者用于多种器官疾病或疾患的治疗， 例如生殖腺、胰腺(诸如I型和II型糖尿病)、肾脏(诸如肾病)的变性 疾患。
脑部炎症通常是感染、自身免疫过程、毒素、和其它疾患的结果。
这种疾患相对比较常见的病因是病毒感染。脑炎可能以披膜病毒科病 毒(TOGAVIRIDAE)感染；疱疹病毒科病毒(HERPESVIRIDAE)感染；腺病毒 科病毒(ADENOVIRIDAE)感染；黄病毒科病毒(FLAVIVIRIDAE)感染；本扬 病毒科病毒(BUNYAVIRIDAE)感染；小核糖核酸病毒科病毒 (PICORNAVIRIDAE)感染；副粘病毒科病毒(PARAMYXOVIRIDAE)感染； 正粘病毒科病毒(ORTHOMYXOVIRIDAE)感染；逆转录病毒科病毒 (RETROVIRIDAE)感染；和沙粒病毒科病毒(ARENAVIRIDAE)感染的原发 性或继发性形式发生。
相应地，本发明的肽、复合物或药物组合物可用于与病毒感染有关的 脑部炎症的治疗。
大量临床和实验数据显示补体活化是吉兰-巴雷综合征中神经和神经胶 质损伤的重要机理。因此可以预期抑制补体活化将限制疾病的发展(Halstead 等(2005)Annals of Neurology 58：203-21)。
因此，在另一个实施方案中，肽序列、复合物和药物组合物可用于治 疗吉兰-巴雷综合征、其变异形式诸如米勒.费希尔综合征(Miller Fisher syndrome)、以及其它补体依赖性神经肌肉紊乱。
肽序列、复合物和药物组合物也可用于治疗儿童孤独症。
孤独症是开始于儿童期早期并存在于整个成人期的脑病；侵袭三个重 要的发育领域：交流(communication)、社会交往(social interaction)、和创造 或想象活动(creative or imaginative play)。估计每1000名儿童中有2至5名 遭受此困扰，侵袭男孩的可能性超过女孩的四倍。患孤独症的儿童社会交 往和交流有困难，可能出现重复行为并且对物品(object)或日常事务(routine) 有异乎寻常的爱好。
近年来已发现孤独症儿童有免疫系统异常的科学线索。
因此，肽序列、或者包含肽序列的复合物或组合物可能有利地用于治 疗炎症，特别是脑部炎症。
本发明的又一方面是生产药物组合物的方法，包括将有效量的一种或 多种本发明复合物、或者根据本发明的药物组合物与一种或多种药学上可 接受的添加剂或载体混合，为患者施用有效量的至少一种所述复合物、或 所述药物组合物。
在上述方法的一个实施方案中，所述复合物与假体装置(prosthetic device)组合使用，其中所述装置是修复性神经导管(prosthetic nerve guide)。因此，另一方面，本发明涉及修复性神经导管，特征在于其包括一 种或多种如上定义的复合物或药物组合物。神经导管是本领域已知的。
本发明的另一方面涉及如上定义的复合物的用途。特别是根据本发明 的复合物用于生产药物组合物的用途。所述药物组合物优选用于治疗或预 防以上提到的任一种疾病和疾患。
又一方面，本发明涉及通过施用本文定义的复合物以治疗上述疾病或 疾患的方法。
实施例
1.GDN、artemin和neurturin蛋白以及衍生自这些蛋白质的肽片段 A1、A2、A3、G1、G2、G3、N1和N2对神经元细胞分化的影响
肽
G1    LNVTDLGLGYETKEE    (SEQ ID NO：1)GDNF片段
A1    VPVRALGLGHRSDEL    (SEQ ID NO：2)artemin片段
N1    VRVSELGLGYASDET    (SEQ ID NO：3)neurturin片段
G2    ETTYDKILKNLSRNR    (SEQ ID NO：9)GDNF片段
A2    RSPHDLSLASLLGAG    (SEQ ID NO：10)artemin片段
N2    ARVYDLGLRRLRQRR    (SEQ ID NO：11)neurturin片段
G3    DLSFLDDNLVY        (SEQ ID NO：23)GDNF片段
A3    VSFMDVNSTWR        (SEQ ID NO：24)artemin片段
N3    EVSFLDAHSRY        (SEQ ID NO：25)neurturin片段
方法
该研究采用两种不同方案的神经突生长测试方法，单培养和共培养。
在单培养中，直接将神经元培养在塑料上，唯一的神经突发生性刺激 是由添加的物质所提供的。在共培养中，将神经元培养在表达NCAM-140 的成纤维细胞(LBN110)或NCAM阴性对照成纤维细胞(LVN212)的汇合单层 上部。神经元上的NCAM与LBN110细胞上的NCAM相互作用，由此刺激神 经元的神经突生长。因此该系统允许研究NCAM-NCAM相互作用和NCAM 与其它分子之间的相互作用。
对于所有试验，细胞都培养在含有上述添加物的神经基质培养基 (neurobasal medium)中，终体积为8孔LabTekPermanox Chamber载玻片上 300μl/孔或者4孔LabTekPermanox Chamber载玻片上500μl/孔。
对于单培养，以10,000细胞/孔的密度将原代海马神经元接种在8孔 LabTekPermanox Chamber载玻片上。
对于共培养，以100,000细胞/孔的密度将L-细胞接种在8-孔LabTek Permanox Chamber载玻片上，而对于转染试验则以200,000细胞/孔的密度 将细胞接种在4孔LabTekPermanox Chamber载玻片上。L-细胞在添加有 10％(v/v)FCS、1％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2.5 μg/ml fungizone、和567μg/ml新霉素(G418)的DMEM中培养24小时，然 后在含添加物的神经基质培养基中清洗两次，之后将原代海马神经元以 7,000细胞/孔的密度接种在8孔载玻片中或以20,000细胞/孔的密度接种在 4孔载玻片中。
为了评估肽对神经突生长的影响，将GDNF和肽G1、G2、G3、A1、 A2、A3、N1、N2和N3稀释至合适浓度，并在接种后大约10分钟添加至 神经元。将培养基单独添加到对照，并将细胞温育24小时。
为了评估所述影响，将不同的胞内信号转导途径药理学抑制剂特别是 FGFR抑制剂SU5402和Fyn-激酶抑制剂PP2稀释至合适浓度，并在接种之 后立即添加至神经元。10分钟后添加GDNF、GDNFp1或培养基(对照)，并 将细胞温育24小时。
此外，用显性阴性(dominant negative)形式的FGFR(dnFGFR)瞬时转染 神经元，作为使用药理学FGFR抑制剂的备选方案。dnFGFR质粒编码缺少 激酶结构域的FGFR。该突变受体通过参与缺少激酶活性的二聚体而抑制野 生型FGFR的功能。用空白载体转染作为对照。还用wtFGFR进行转染以评 估过表达FGFR的影响。
为了分别研究NCAM-180和NCAM-140的作用，用编码NCAM-180 或NCAM-140的胞质结构域的质粒实施转染。过表达的胞质结构域与内源 NCAM分子的胞质结构域竞争胞质靶物，可能发挥NCAM-180或 NCAM-140信号传导抑制剂的功能。用空白载体转染作为对照。
用NucleofectorTM装置和Rat Neuron NucleofectorTM试剂盒(Amaxa Inc.， Gaithersburg，MD，USA)实施转染。该转染方法基于电穿孔与包含亲脂性试 剂的NucleofectorTM溶液的组合。这些试剂形成包含质粒DNA的脂质体， 然后在电穿孔期间进入细胞。该方法允许转染不分裂的细胞诸如神经元。 将3μg感兴趣的质粒与NucleofectorTM溶液混合，并将原代海马神经元重悬 在该混合物中，在NucleofectorTM装置中电穿孔，转移到含有添加物和5％ (v/v)FCS的神经基质培养基。细胞然后温育2小时，之后重悬在无血清培 养基中，计数，接种并温育6小时，之后添加GDNF或GDNFp1。将培养 基单独添加至对照，并将细胞温育18小时。
该研究中所有瞬时转染都包括与编码EGFP的质粒一起共转染，其允许 鉴定已转染的细胞。为了确保所有表达EGFP的细胞也受到感兴趣的质粒一 起转染，所用EGFP编码质粒与感兴趣质粒之间的比例为1∶5(即每次转染使 用0.5μgEGFP编码质粒)。
在固定细胞指定时间后终止神经突生长试验。为了显现神经元及其神 经突，实施GAP-43免疫染色。这种染色对神经元是特异性的。由于GFP 发射的荧光，已转染的细胞及其神经突在未进行免疫染色时应当是看得见 的。然而在该研究中，发现GFP自身荧光的强度太弱，不能提供正确鉴定 已转染细胞和分析神经突长度所需的图像质量。GFP是一种胞质蛋白，由 于细的神经突只含有少量的细胞质，因而大多数神经突中只有少数能找到 GFP。因此，采用双染色方案，即对细胞进行GFP和GAP-43免疫染色。该 方案允许基于GFP染色并组合基于GAP-43染色的神经突显影来鉴定已转 染的细胞。
在之前没有去除培养基的情况下，向培养物添加300μl/孔(8孔载玻片) 或500μl/孔(4孔载玻片)含0.4mM CaCl2、0.05M蔗糖和8％(v/v)甲醛的 PBS溶液。然后细胞在PBS中清洗10分钟，之后在含有1％(w/v)BSA的 PBS中清洗20分钟，之后细胞与第一抗体一起4℃温育过夜。
1∶1000稀释兔抗大鼠GAP-43抗体，用于未转染细胞的染色，1∶2000 稀释用于已转染细胞的染色。1∶1000稀释小鼠抗GFP抗体。在含7％(v/v) FCS(用于阻止非特异性结合)、50mM甘氨酸(用于封闭固定用的甲醛)、 0.2％(v/v)皂苷(用于使细胞可渗透化)、和0.02％(v/v)NaN3(用于保存 抗体以备以后使用)的PBS溶液中稀释抗体。
次日，细胞在PBS中清洗10分钟，之后在含有1％(w/v)BSA的PBS 中清洗20分钟。然后将细胞与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释的第二抗体 一起于室温温育一个小时。偶联有Alexa 488的山羊抗兔IgG抗体1∶1000 稀释用于未转染细胞，1∶2000稀释用于已转染细胞。1∶1000稀释偶联有Alexa 546的山羊抗小鼠IgG抗体。最后，细胞在PBS中清洗3x7分钟，并用荧 光封固培养基(fluorescent mounting medium)封固。
用偶联到摄像机(Grundig Electronics Germany)的带有Nikon Plan 20x物 镜的Nikon diaphot倒置显微镜(Nikon，东京，日本)实施计算机辅助的荧光 显微术。对于每个试验中的每个条件，在系统性视野系列中获得了大约200 个细胞(未转染细胞)或100个细胞(已转染细胞)的图像，其中如等 (2000c)所述随机选择第一个图像的位置。这样给予每个细胞均等的被选择 机会。对于已转染细胞的每个视野，首先记录GFP染色(绿色光)，然后将 光转换为蓝色并记录GAP-43染色。然后将光转回，移动到下一视野。
利用Protein Laboratory开发的软件包“ProcessLength”(等，2000)在 无偏(unbiased)计数框中统计神经突和测试线之间交会点(intersections)的数 目以分析神经突生长。然后可以将神经突生长定量为每个细胞的交会点的 数目，其与每个细胞的神经突绝对长度有关，公式为：L＝(πdI)/2(I＝每个细 胞的交会点的数目，d＝所述框中两条平行线之间的垂直距离)。
结果
神经元分化的一个重要部分是总称为神经突的轴突和树突的生长。因 此神经突生长测试方法是一种神经元分化测试方法，通常用于测试给定物 质的神经突发生性潜力。大体上，神经元在感兴趣分子的存在下培养特定 时间，之后定量神经突的生长。可以使用不同的抑制剂进一步研究决定所 看到的神经突发生性应答的信号转导机理。
2.GDNF、Artemin、Neurturin衍生肽对神经元存活的影响。
原代细胞培养
多巴胺能神经元
从处于胚胎期第15天的Wistar大鼠胚胎(Charles River，Sulzfeld，德国 或丹麦)制备多巴胺能神经元。杀死妊娠大鼠并取出子宫，于 冰上置于Hank氏平衡盐溶液(HBSS；Gibco，BRL)中。从胚胎脑解剖中脑的 腹侧部分，在添加有5g/l葡萄糖(Sigma-Aldrich)的Gey氏平衡盐溶液 (GBSS；Gibco，BRL)中于冰上均质化，其后胰蛋白酶消化。在DNA酶1和 大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)存在下清洗解离的细胞。
小脑颗粒神经元
基本上如先前Schousboe等(1989)所述从产后七天的Wistar大鼠制备小 脑颗粒神经元(CGN)。在保存于冰上的改良的Krebs-Ringer溶液中解剖小脑 组织，并如以上针对海马神经元所述处理。所有细胞培养物都在含5％ CO2的湿润空气中于37℃温育。所有动物都依照国家动物福利政策处理。
存活测试
多巴胺能神经元
在上述包被有聚-D-赖氨酸的24孔细胞培养板中以150,000细胞/cm2的 密度接种多巴胺能神经元。在有或没有不同浓度的肽的情况下让神经元分 化六天，之后以100μM的浓度添加6-OHDA，持续两个小时。在用于预防 氧化的0.1％(w/v)偏亚硫酸氢钠溶液中将6-OHDA溶解至浓度为10mM， 如此制备母液。加入6-OHDA后两个小时，将培养基改为含有添加物和肽 的神经基质培养基，细胞培养物进一步温育24小时，固定并对酪氨酸羟化 酶免疫染色。每个单独试验中对于每个试验条件自动视频记录98个图像。
小脑颗粒神经元
CGN原代培养物在添加有2％(v/v)B27、0.5％(v/v)glutamax、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和KCl的神经基质-A培养基(Gibco，BRL)中 在聚-L-赖氨酸包被的8孔permanox载玻片上以100,000细胞/cm2的密度铺 板，其中KCl在培养基中的终浓度为40mM。铺板后24小时，添加胞嘧啶 -β-D-阿拉伯呋喃糖苷(arabinofuranoside)(Ara-C；Sigma-Aldrich)至终浓度10 μM以防止胶质细胞增殖，之后于37℃让神经元进一步分化六天。清洗两 次，并将培养基改为添加有1％(v/v)谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素、3.5g/l D-葡萄糖和1％(v/v)丙酮酸钠(Gibco BRL)以及不同 浓度的肽的Eagle氏基本培养基(Basal Medium Eagle，BME；Gibco BRL)，以 诱导凋亡性细胞死亡。由此将培养物中钾的浓度减少到5mM KCl(D’Mello 等，1993)。诱导凋亡后两天，用4％(v/v)甲醛固定细胞并如Kruman等(1997) 所述用Hoechst 33258染色25分钟。对于每个试验中的每一组均利用海马 神经突生长测试中所述计算机辅助荧光显微术随机记录1000-1500个神经 元的图像。利用Protein Laboratory开发的软件包Prima统计来自死的和活的 神经元的细胞核，估算活神经元相对于总神经元的比例。
结果
结果显示并概括于图25和图29至33。
3.GDNF、Artemin和Neurturin衍生肽与GFR和NCAM的结合。
表面等离振子共振(SPR)分析
将含有150mM NaCl的10mM pH 7.4磷酸钠用作运行缓冲液(磷酸盐缓 冲盐水，PBS)，于25℃使用BIAcoreX仪器(Biosensor AB，Uppsala，瑞典)分 析结合。流速为5μl/min。利用厂商提供的软件通过非线性曲线拟合来分 析数据。如下所述利用胺偶联试剂盒(Biosensor AB)将受体蛋白例如NCAM Ig1-Ig2和GFR蛋白固定在传感器芯片CM5上：用20μl活化溶液活化芯片； 用12μl溶于10mM磷酸钠缓冲液pH 6.0中的20μg/ml蛋白质固定蛋白质； 用35μl封闭溶液封闭芯片。将指定浓度的各种肽注射到传感器芯片中。用 对应于结合受体和空白芯片之间的差异的曲线分析。
结果
结果显示并概括于图26至28和图34至38。
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