BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病药物中的应用
阅读：1024发布：2020-05-28
专利汇可以提供BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供BAT3蛋白在制备由 朊病毒 引起的神经系统 疾病 药物中的应用。本发明还提供一种用于 治疗 由朊病毒引起的神经系统疾病的药物，特别是用于治疗由PrP106-126毒性多肽引起的神经系统疾病的药物，所述药物中的有效成分为BAT3蛋白，其 氨 基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。BAT3蛋白的表达缓解了PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡，为进一步阐释该蛋白对朊病毒引起的神经元损失的治疗作用机制提供了有效而集约的研究手段，另外也填补了该蛋白在治疗方法方面的空白。，下面是BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病药物中的应用专利的具体信息内容。
BAT3蛋白在制备由朊病毒引起的神经系统疾病药物中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 脂质体（Liposomes）是利用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体-DNA复合物，是应用最多的非病毒介导的基因转移系统。脂质体单室脂质体、多室脂质体，含有表面活性剂的脂质体。按性能脂质体可分为一般脂质体（包括单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等）、特殊性能脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。按电荷性，脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。脂质体区别于其它普通制剂的一个重要特点是其具有靶向性。脂质体的靶向性分为被动靶向性和主动靶向性，被动靶向性是脂质体进入人体后的自然分布，即静注体内的脂质体主要定位于肝、脾、骨髓、血液中的巨噬细胞等；而主动靶向性是改变脂质体被动靶向性的特点，使其定位于特定的细胞、组织、器官，这受到了脂质体粒子大小及毛细血管种类的限制。脂质体的靶向性可以通过放射性元素标记或高效液相色谱分析法检验得以验证。阳性脂质体（cationic liposome）又称阳离子脂质体，正电荷脂质体（Positiveiy charged liposome）是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。大多数阳性脂质体是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组成。阳性脂质体中使用的中性磷脂成分上与常规脂质体相似，如胆固醇（chol）、磷脂酞胆碱（PC）、磷脂酚乙醇胺（PE）等。阳性成分多为合成的双链季按盐型表面活性剂，具有体外稳定性好，体内可被生物降解的优点。阳性脂质体介导的基因转染作用机制介导转染过程 中，阳性脂质体的主要作用在于DNA形成复合物，介导与细胞的作用，并将DNA释放到细胞中，实现基因转染。
[0003] 阳性脂质体作为一种可供选择的基因传递载体具有下列优点：(1)可防止核酸被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中；(2)无毒、无免疫性，具有生物惰性，可生物降解；(3)易于制备，使用方便，可将大的DNA片断转运到细胞中；(4)基因转染率高，100%离体细胞可以瞬间表达外源基因。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供BAT3蛋白在制备用于治疗由朊病毒引起的神经系统疾病的药物中的应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种用于治疗由朊病毒引起的神经系统疾病的药物。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种用于治疗由朊病毒引起的神经系统疾病的药物，所述药物中的有效成分为BAT3蛋白。
[0007] 本发明还提供一种用于治疗由PrP106-126毒性多肽引起的神经系统疾病的药物，所述药物中的有效成分为BAT3蛋白。
[0008] 本发明还提供BAT3蛋白在制备治疗由朊病毒引起的神经系统疾病的药物中的应用。所述神经系统疾病是指由朊病毒引起的神经细胞凋亡。
[0009] 本发明还提供BAT3蛋白在制备治疗由PrP106-126毒性多肽引起的神经系统疾病的药物中的应用。所述神经系统疾病是指由PrP106-126毒性多肽引起的神经细胞凋亡。
[0010] 本发明进一步提供重组质粒pCMV-HA-BAT3，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
[0011] 本发明还提供含有所述重组质粒pCMV-HA-BAT3的转基因细胞系。所述细胞系包括但不限于Hela细胞系、N2a细胞系、原代神经元细胞系等。
[0012] 本发明中涉及到的BAT3蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0013] 本发明中涉及到的PrP106-126毒性多肽的氨基酸序列如Seq IDNo.2所示。
[0014] 本发明通过构建一套完善的目的基因转移载体系统，在可调控的条件下在需要的时间内表达一定量治疗基因产物——目的蛋白。BAT3蛋白的表达缓解了PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡，为进一步阐释该蛋白对朊病毒引起的神经元损失的治疗作用机制提供了有效而集约的研究手段，另外也填补了该蛋白在治疗方法方面的空白。
[0015] 通过脂质体转染方法将已经构建好的pCMV-HA-BAT3质粒转染进入小鼠神经瘤细胞系N2a，Western blot检测转染后BAT3表达量的变化；用PrP106-126神经毒性多肽处理N2a细胞，用TUNEL凋亡检测试剂盒分析经BAT3转染或对照组的N2a细胞的凋亡水平；Western blot检测PrP106-126神经毒性多肽处理前后胞浆内细胞色素c和Bcl-2的变化，进一步了解BAT3在神经元凋亡中发挥的作用机制。
附图说明
附图说明
[0016] 图1为本发明神经元细胞的鉴定以及证明BAT3蛋白在N2a细胞中的过表达。
[0017] 图2为本发明BAT3蛋白在N2a细胞中的过表达情况。
[0018] 图3为本发明BAT3蛋白与全长朊蛋白发生相互作用的情况。
[0019] 图4为本发明用PrP106-126毒性多肽刺激原代神经元或N2a细胞后，BAT3蛋白从胞核转移到胞浆的情况；其中，A.首先用FITC标记的PrP106-126毒性多肽刺激原代神经元24h，用免疫荧光染色实验证实，多肽刺激之后，BAT3从细胞核转移到胞浆；B和C.进一步用Western blot证实了PrP106-126毒性多肽刺激N2a细胞后，BAT3蛋白从 胞核向胞浆转移的情况。
[0020] 图5为本发明BAT3蛋白过表达后可以缓解由PrP106-126毒性多肽引起的神经细胞凋亡；其中，A.用TUNEL试验证实了BAT3蛋白过表达之后，与只攻毒组以及转染空载体+攻毒组相比，神经细胞凋亡水平明显下降；B.用Western blot检测BAT3在对应组别中的表达量。
[0021] 图6为本发明用PrP106-126毒性多肽刺激N2a细胞引起细胞色素C向胞浆中的释放以及Bcl-2抗凋亡蛋白水平下调。
[0022] 图7A为本发明BAT3蛋白过表达后可以抑制细胞色素C向胞浆的释放，同时稳定胞浆中Bcl-2抗凋亡蛋白的水平。
[0023] 图7B为本发明实施例中用PrP106-126毒性多肽攻毒之后，BAT3蛋白过表达对细胞色素C释放的抑制作用呈剂量依赖性。
具体实施方式
[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0025] 实施例BAT3蛋白的表达缓解了PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡[0026] 1.材料及来源
[0027] 小鼠神经瘤细胞系N2a（ATC-CCCL-131TM），购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；BAT3鼠源单克隆抗体，细胞色素c兔源多克隆抗体购自Santa Cruz公司；HA鼠源单克隆抗体，Bcl-2（P65）兔源多克隆抗体，β-actin兔源多克隆抗体，Lamin B1鼠源单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗,Alexa Fluor594标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自中杉金桥公司；FITC标记的山羊抗兔二抗和Cy5标记的山羊抗兔二抗，兔源TUBB3/betaIII tubulin（神经元标记物）购自博奥森公司， 神经元III族-β-Tubulin（Tuj1）抗体，DAPI二氢氯化物和碘化丙啶（PI），免疫荧光染色用的免疫固定液、免疫洗涤液，免疫封闭液购自碧云天公司；脂质体转染试剂Lipofectamine2000和无血清培养基Opti-MEM购自Invitrogen公司；胞浆蛋白提取试剂盒购自武汉博士德公司；多肽：朊蛋白多肽片段(KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG;PrP106-126)由上海生物公司合成；FITC标记的PrP106-126毒性多肽购自FANBO生化制剂公司；TUNEL试剂盒购自Roche公司；多肽以2mM浓度溶于PBS中，存储于-20℃；电泳仪：BIO-RAD美国；电转仪：BIO-RAD美国。
[0028] 2.试验方法
[0029] 2.1Hela细胞和N2a细胞的复苏与培养
[0030] 取出液氮罐中装有N2a细胞的冻存管，立即放入预热至37℃的水浴中并摇动，使管中细胞悬液快速融化，然后低速800r/min离心5min，离心后弃去冻存液，取1ml完全DMEM培养基加至管中反复吹打，吸出吹打后的液体加至培养瓶中，重复冲洗吹打一次。用含20%胎牛血清的完全DMEM培养基4-5ml，37℃、5%CO2、饱和湿度培养。12h待细胞贴壁后，更换新鲜培养液继续培养。
[0031] 2.2原代神经元的分离与培养
[0032] 出生24h内的SD乳鼠75％酒精浸泡消毒5-10min，浸于无菌水中清洗，然后将头剪掉置于无菌平皿中，小剪刀沿大脑中部将皮肤剪开，露出颅骨。眼科剪沿着颅骨中缝剪开，用小止血钳去除颅骨，暴露出大脑皮质和小脑，小心分离出大脑，置（冰上）4℃DMEM液中，在解剖显微镜下分离出双侧大脑皮层，仔细剥除软脑膜和血管，然后沉淀洗涤分离出的3
组织5-6次（每次静止2min，弃上清），将分离的大脑皮质部分剪碎成1-2mm的小组织块。将组织悬液置于无菌的瓶中消化（这样消化液在瓶里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决消化不完全的情况），加入终浓度3mg/mL木瓜蛋白酶+适 量（0.05mg/ml）DNA酶。37度培养箱消化30-40分钟，每10分钟稍微摇动一下。加入少许血清终止反应，（papain置于37度30min彻底溶解），1000rpm，5min离心弃上清，加入3-4mL DMEM。用大口径吸管（配合枪头吹打）轻轻吹打组织块使细胞均匀分散为初细胞悬液。对初级细胞悬液经
75微米的不锈钢滤网过滤，转移至细胞培养瓶，培养箱培养30min（差速去杂细胞）后，胎盘蓝染色后细胞计数。然后细胞离心1000rpm，5min，用10％胎牛血清的DMEM／F12+0.5%B27
6
培养液悬起细胞沉淀。将初细胞悬液经计数稀释到2×10个／mL，接种到预先经50μg/ml的多聚左旋赖氨酸包被的培养板中，12孔板500μL，置CO2培养箱中孵育24h换液，每孔加
1ml培养基，24h后半量换液，加入10μmol/L的阿糖胞苷以抑制胶质细胞的生长，以后每隔
48h半量换液1次。6-7天使用细胞。
组织5-6次（每次静止2min，弃上清），将分离的大脑皮质部分剪碎成1-2mm的小组织块。将组织悬液置于无菌的瓶中消化（这样消化液在瓶里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决消化不完全的情况），加入终浓度3mg/mL木瓜蛋白酶+适 量（0.05mg/ml）DNA酶。37度培养箱消化30-40分钟，每10分钟稍微摇动一下。加入少许血清终止反应，（papain置于37度30min彻底溶解），1000rpm，5min离心弃上清，加入3-4mL DMEM。用大口径吸管（配合枪头吹打）轻轻吹打组织块使细胞均匀分散为初细胞悬液。对初级细胞悬液经
75微米的不锈钢滤网过滤，转移至细胞培养瓶，培养箱培养30min（差速去杂细胞）后，胎盘蓝染色后细胞计数。然后细胞离心1000rpm，5min，用10％胎牛血清的DMEM／F12+0.5%B27
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培养液悬起细胞沉淀。将初细胞悬液经计数稀释到2×10个／mL，接种到预先经50μg/ml的多聚左旋赖氨酸包被的培养板中，12孔板500μL，置CO2培养箱中孵育24h换液，每孔加
1ml培养基，24h后半量换液，加入10μmol/L的阿糖胞苷以抑制胶质细胞的生长，以后每隔
48h半量换液1次。6-7天使用细胞。
[0033] 2.3质粒转染
[0034] 收获处于对数生长期的Hela细胞、N2a细胞或原代神经元细胞，以2×105/孔接种于12孔培养板中，37℃，5%CO2环境中培养24h，细胞长至80%～90%融合，按转染试剂说明书进行转染，质粒和转染试剂的比例为2μg：3μL，转染过程使用Opti-MEM无血清培养基，转染后5h换为正常细胞培养时的10%FBS培养基。用于Western blot检测的细胞分为阴性对照组（转染pCMV-HA空载体）和实验组（转染pCMV-HA-BAT3重组质粒。用于免疫荧光实验的细胞接种于之前铺好爬片的12孔培养板中。转染48h后收集蛋白进行相应的检测。
[0035] pCMV-HA-BAT3质粒的构建方法如下：
[0036] 根 据GenBank 中 公 布 的 AAD18085.1，Homo sapiens BAG6BCL2-associated athanogene6(BAT3)mRNA序列，设计扩增BAT3全长基因序列的PCR引物（由上海生工生物公司合成）。以Hela细胞的cDNA作为模板，上游引物5′-GGAAGATCTCATGGAGCCTAATGATAGTACCAGTACCGCTG-3′ ；下游引物5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAAGGATCATCAGCAAAGGCCCGCTG-3′，两端分别插入BglII、NotI酶切位点。用BglII、NotI双酶切的目的基因与同样双酶切的pCMV-HA进行连接，构建重组表达质粒pCMV-HA-BAT3（Seq ID No.3），经双酶切和测序鉴定质粒构建成功。
[0037] 2.4免疫荧光实验
[0038] 用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到12孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，进行过表达或用毒性多肽处理。前期实验结束后，进行免疫荧光染色。用免疫染色固定液室温固定30分钟以上。固定完毕后，用免疫染色洗涤液洗涤两次，每次5分钟。加入免疫染色封闭液，封闭60分钟。按照适当比例用稀释一抗：BAT3抗体为1：100、HA抗体为：1：1000、TUBB3/beta IIItubulin神经元标记物为：1：100、Tuj1为：1：250。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，37℃孵育两个小时。然后弃去一抗，洗涤液洗涤5分钟，共洗涤3次。按照适当比例稀释二抗：Alexa Fluor594标记的山羊抗小鼠IgG二抗、FITC标记的山羊抗兔二抗和Cy5标记的山羊抗兔二抗稀释比例都为1：100（相应的一抗为鼠源，二抗就用山羊抗鼠孵育；一抗为兔源，二抗用山羊抗兔的孵育，Alexa Fluor594和Cy5激发红色荧光，FITC激发绿色荧光）。吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，37℃孵育一小时。之后加入免疫染色洗涤液，洗涤5分钟，共洗涤3次。最后加入DAPI染核3分钟，洗涤5分钟，共洗涤3次。用抗淬灭剂封片，在正置激光共聚焦显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)下观察试验结果。
[0039] Prion毒性多肽：PrP106-126的氨基酸序列为KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG（SEQ ID No.2），由上海生工合成，多肽的纯度达到95%。多肽在0.1M的PBS中溶解成1mM浓度，然后再 37℃放置12h，实验用终浓度为100μM。FITC标记的PrP106-126多肽购自北京泛博生物化学有限公司。
[0040] 2.5TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况
[0041] 将培养好的细胞调整到2×105个/mL，加入铺好爬片的12孔培养板上。首先进行转染，分别将BAT3重组质粒和空载体转染入N2a细胞，然后将室温处理过的终浓度为200μmol/L PrP106-126作用于经转染的N2a细胞以及设立未转染对照组，每个样品设三个重复，培养24h后按照试剂盒使用说明进行TUNEL检测，最后用PI染核，以显示所有细胞数目。使用正置激光共聚焦显微镜（Olympus，日本东京）进行结果观察。
[0042] 2.6Western blot检测细胞色素c、Bcl-2、BAT3等蛋白的变化情况[0043] 细胞浆和细胞核蛋白的提取按照试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）说明书操作。提取各实验组和对照组的胞浆蛋白，将样品调成相同的浓度，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水煮10min，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1h，将膜与一抗4℃孵育过夜，一抗的稀释浓度分别兔抗HA标签抗体1:3000稀释；鼠抗BAT3抗体1:100稀释；LaminB抗体1：1000稀释；兔抗细胞色素c抗体1：500稀释；兔抗Bcl-2抗体1:500稀释；兔源-β-actin抗体1:3000稀释。用TBST洗膜三次，每次5分钟，再与辣根过氧化物酶标记的鼠源（1:5000）或兔源(1:5000)二抗在室温下孵育1h，TBST洗膜三次，每次5分钟，用化学发光液室温孵育5分钟，曝光。
[0044] 3.试验结果
[0045] 3.1神经元细胞的鉴定
[0046] 如图1所示，利用免疫荧光技术，用两种神经元特异性抗体分别鉴定所分离培养的神经元纯度，左图为神经元特异性抗体TUBB3/betaIII tubulin神经元标记物（稀释比例为1：100），二抗为Alexa Fluor594标记的山羊抗小鼠IgG二抗（稀释比例为1：100）；右图为神经元特异 性标记物Tuj1（稀释比例为1：250），二抗为FITC标记的山羊抗兔二抗（稀释比例为1：100）。用DAPI染细胞核。
[0047] 3.2证明BAT3在N2a细胞中的过表达：
[0048] 如图2所示，pCMV-HA-BAT3重组质粒转染进入N2a细胞，用western bolt检测其过表达成功，试验分成五组，每组转染的质粒总量都为3μg，BAT3质粒的比例不同，如图所示，分别为0、0.1、0.3、1、3μg，其余的用空质粒补齐。第一行：HA为标签抗体，显示外源BAT3蛋白的表达量，随着BAT3质粒增加，外源BAT3的表达量也相应增加，同时证明外源蛋白的表达成功。第二行：显示内源与外源BAT3蛋白的表达。第三行：用β-actin作为内参蛋白，确定上样量。HA标签抗体1:3000稀释；鼠抗BAT3抗体1:100稀释；兔源-β-actin抗体1:3000稀释。
[0049] 3.3BAT3与全长的朊蛋白发生相互作用
[0050] 如图3所示，PCCN:primary cerebral cortex neuronal cell，原代大脑皮层神经元；merge指第一列与第二列图片的合图。
[0051] 将构建好的带绿色荧光标签的全长PRP载体，分别转染进入Hela细胞和原代神经元细胞。用免疫荧光染色方法观察到BAT3与PRP在胞浆共定位。
[0052] 带绿色荧光蛋白全长PRP质粒的构建：
[0053] 根据GenBank中AY569456公布的Homo sapiens prion protein(PRNP)mRNA序列，设计扩增PrP全长基因序列的PCR引物（由上海生工生物公司合成）。以Hela细胞的cDNA作为模板，上游引物：5′-ATACTC GAG ATG GCG AAC CTT GGC TGC T-3′；下游引物：5′-ACTAAG CTT TCC CAC TAT CAG GAA GAT GAG-3′，两端分别插入HindIII、XhoI酶切位点。经用Hind III、XhoI双酶切的目的基因与同样双酶切的PGEFP-N1进行连接，构建重组表达质粒。经双酶切和测序鉴定质粒构建成功。
[0054] 免疫荧光染色：
[0055] 用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到12孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，转染携带绿色荧光蛋白的全长朊蛋白质粒。用免疫染色固定液室温固定30分钟以上。固定完毕后，用免疫染色洗涤液洗涤两次，每次5分钟。加入免疫染色封闭液，封闭60分钟。按照适当比例用稀释一抗：BAT3抗体为1：100。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，37℃孵育两个小时。之后弃去一抗，洗涤液洗涤5分钟，共洗涤3次。按照适当比例稀释二抗：AlexaFluor594标记的山羊抗小鼠IgG二抗，稀释比例为1：100。吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，37℃孵育一小时。之后加入免疫染色洗涤液，洗涤5分钟，共洗涤3次。最后加入DAPI染核3分钟，洗涤5分钟，共洗涤3次。用抗淬灭剂封片，在正置激光共聚焦显微镜(Olympus，日本东京)下观察试验结果（图4）。
[0056] 3.4用PrP106-126毒性多肽刺激原代神经元或N2a细胞后，BAT3从胞核转移到胞浆
[0057] 3.4.1首先用FITC标记的PrP106-126毒性多肽刺激原代神经元24h，用免疫荧光染色实验证实，多肽刺激之后，BAT3从细胞核转移到胞浆
[0058] 方法同上，即用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到12孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，试验组加入100ul带FITC标签的PrP106-126毒性多肽，作用24h，对照组加入100ul PBS。用免疫染色固定液室温固定30分钟以上。固定完毕后，用免疫染色洗涤液洗涤两次，每次5分钟。加入免疫染色封闭液，封闭60分钟。按照适当比例用稀释一抗：BAT3抗体为1：100。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，37℃孵育两个小时。之后弃去一抗，洗涤液洗涤5分钟，共洗涤3次。按照适当比例稀释二抗：Alexa Fluor594标记的山羊抗小鼠IgG二抗，稀释比例为1：100。吸尽洗涤液后， 立即加入稀释好的二抗，37℃孵育一小时。之后加入免疫染色洗涤液，洗涤5分钟，共洗涤3次。最后加入DAPI染核3分钟，洗涤5分钟，共洗涤3次。用抗淬灭剂封片，在正置激光共聚焦显微镜(Olympus，日本东京)下观察试验结果。
[0059] 3.4.2进一步用Western blot证实了PrP106-126毒性多肽刺激N2a细胞后，BAT3蛋白从胞核向胞浆的转移。分别收获不同时间段（3h、6h、9h、12h和24h）的细胞，提取胞浆和胞核BAT3蛋白，分别用β-actin和Lamin B1作为胞浆和胞核的内参蛋白，经过蛋白相对密度分析，我们证实了BAT3蛋白的核输出。鼠抗BAT3抗体1:100稀释；LaminB抗体1：1000稀释；兔源-β-actin抗体1:3000稀释。**P＜0.01，表示极差异显著。
[0060] 3.5BAT3过表达后可以缓解由PrP106-126毒性多肽引起的神经细胞凋亡[0061] 3.5.1用TUNEL试验证实了BAT3过表达之后，与仅攻毒组以及转染空载体+攻毒5
组相比，神经细胞凋亡水平明显下降。将培养好的细胞调整到2×10个/mL，加入铺好爬片的12孔培养板上。首先进行转染，分别将BAT3重组质粒和空载体转染入N2a细胞，然后将室温处理过的终浓度为200μmol/L PrP106-126作用于经转染的N2a细胞以及设立未转染对照组，每个样品设三个重复，培养24h后按照试剂盒使用说明进行TUNEL检测，最后用PI染核，以显示所有细胞数目。使用正置激光共聚焦显微镜(Olympus，日本东京)进行结果观察。（图5）
组相比，神经细胞凋亡水平明显下降。将培养好的细胞调整到2×10个/mL，加入铺好爬片的12孔培养板上。首先进行转染，分别将BAT3重组质粒和空载体转染入N2a细胞，然后将室温处理过的终浓度为200μmol/L PrP106-126作用于经转染的N2a细胞以及设立未转染对照组，每个样品设三个重复，培养24h后按照试剂盒使用说明进行TUNEL检测，最后用PI染核，以显示所有细胞数目。使用正置激光共聚焦显微镜(Olympus，日本东京)进行结果观察。（图5）
[0062] 3.5.2用Western blot检测BAT3在对应组别中的表达量
[0063] 鼠抗BAT3抗体1:100稀释；β-actin为胞浆内参蛋白。兔源-β-actin抗体1:3000稀释。
[0064] 3.6用PrP106-126毒性多肽刺激N2a细胞引起细胞色素C向胞浆中的释放以及Bcl-2抗凋亡蛋白水平下调
[0065] 分别收集攻毒6h、9h、12h和24h的样品，进行Western blot检测， β-actin为胞浆内参蛋白。兔抗细胞色素c抗体1：500稀释；兔抗Bcl-2抗体1:500稀释；兔源-β-actin抗体1:3000稀释。（图6）
[0066] 3,7BAT3过表达后可以抑制细胞色素C向胞浆的释放，同时稳定胞浆中Bcl-2抗凋亡蛋白的水平
[0067] 细胞铺板后，BAT3质粒转染48h后，用毒性多肽作用24h，收样。试验组加入100μl多肽，对照组加入100μl PBS，用Western blot检测，β-actin为胞浆内参蛋白，HA标签抗体1:3000稀释，兔抗细胞色素c抗体1：500稀释；兔抗Bcl-2抗体1:500稀释，兔源-β-actin抗体1:3000稀释;B.攻毒之后，BAT3过表达对细胞色素C释放的抑制作用呈剂量依赖性。用6孔板铺板，试验分成五组，每组转染的质粒总量都为4μg，BAT3质粒的比例不同，如图所示，分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0μg，其余的用空质粒补齐。随着BAT3过表达质粒含量的增加，细胞色素c胞浆向胞浆内释放的含量减少。用Western blot检测细胞色素c的变化，β-actin为胞浆内参蛋白。鼠抗BAT3抗体1:100稀释；HA标签抗体1:3000稀释；兔源-β-actin抗体1:3000稀释；兔抗细胞色素c抗体1：500稀释；兔抗Bcl-2抗体1:500稀释。**P＜0.01，表示极差异显著。（图7A和B）
[0068] 采用上述方法能够有效缓解及治疗朊病毒引起的人类和动物的中枢神经系统的神经元损失；对于BAT3蛋白在哺乳动物系统中作用的研究表明，BAT3的过表达抑制了由PrP106-126毒性多肽引起的细胞色素c的过渡释放并且维持细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的稳定，同时通过TUNEL试剂盒对凋亡情况的分析，保证了该方法灵敏度高、特异性强，不易污染、易于标准化的优点，为进一步阐释该蛋白对朊病毒引起的神经元损失的治疗作用机制提供了有效而集约的研究手段，另外也填补了BAT3蛋白在治疗方法方面的空白。
[0069] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0070] 参考文献
[0071] 1Kamper N,Kessler J,Temme S,Wegscheid C,Winkler J,Koch N.A novel BAT3sequence generated by alternative RNA splicing of exon11B displays celltype-specific expression and impacts on subcellular localization.PLoS One2012,7:e35972
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