传染性海绵状脑病(TSE)或朊病毒病是动物和人的致死性神经变 性性疾病。经过数月至数十年的较长潜伏期，才出现临床疾病。TSE 的临床症状包括痴呆和运动协调力丧失。八十年代发现，TSE的共同 特征是受染动物和人中宿主编码的朊病毒蛋白(PrPc)的异常抗蛋白 酶同种型(PrPres或PrPSc)的蓄积。PrPSc的发现提供了一种分子标记 物，它对于所有朊病毒病是特异的，也是感染颗粒主要而很可能唯一 的成分，此感染颗粒称为朊病毒。
为了解瘙痒病传染性，通过分析叙利亚仓鼠脑的表观分子质量为 27-30kDa的蛋白酶K处理部分，发现了抗蛋白酶的PrPSc核，称为 PrP27-30。PrP-27-30的N末端测序在非感染动物中引起宿主编码PrP 基因的克隆以及朊病毒蛋白(PrPC)蛋白酶敏感同种型的识别。TSE 的关键致病性事件是宿主编码的朊病毒蛋白(PrPC)构象改变为致病 性同种型，它被称为PrPSc(在实验性瘙痒病感染啮齿动物中首次识别 后)。这种构象改变包括PrPC的α-螺旋结构重折叠为PrPSc的β-片状。 这种重折叠的朊病毒蛋白PrPSc只是在其三级结构上与PrPC不同，因 此它具有相同的氨基酸序列以及相同的翻译后修饰，诸如N-连接糖基 化和GPI锚。PrPSc聚集为淀粉样小纤维，并在神经组织和较小范围的 淋巴网状内皮组织中蓄积。
在感染宿主中，PrPSc水平与朊病毒滴度成正比。应用TSE剂对啮 齿动物进行实验室接种后，通常在发病前数周可在中枢神经系统中检 测到PrPSc，而且其水平到达最大并可在动物死亡前持续数月。在无症 状阶段，在淋巴网状内皮组织中均易检测到传染性和PrPSc。最近，还 发现PrPSc可在经口感染瘙痒病的仓鼠和实验室感染的转基因小鼠的 肌肉组织中蓄积。
尽管人类认识所有朊病毒病的原型-绵羊和山羊的瘙痒病-已超过 两个世纪，但自从1986年在英国首次发现一种新型动物朊病毒病-牛 海绵状脑病(BSE)以来，这种病便发展为一种动物传染病。感染BSE 家畜进入人类食物链到达何种程度仍在进行讨论，而且这些问题已成 为许多研究的主题。伦敦Imperial College(Donnelly，C.A.， Ferguson，N.M.，Ghani，A.C.& Anderson，R.M.，Statistical Methods in Medical Research 12，177-190(2003))发表的最新 研究提出，根据新的流行病数据，高达1.6Mio感染BSE家畜可能已 走上了英国消费者的餐桌。
人朊病毒病包括克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、Gerstmann- Straeussler-Scheinker病(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)和库鲁 病。这些疾病表明了朊病毒病通常的三种表现，即疾病的散发类型(所 有CID病例的80-90％)、与人PrP基因突变相关的遗传类型(家族 性GSS、家族性CJD和FFI)以及通过移植、感染或摄入朊病毒污染组 织的产品而获得的感染类型(医源性CJD、vCJD和库鲁病)。随着1996 年新型克罗伊茨费尔特-雅各布病在英国出现，则开始了一场针对食物 传播病原体所致人类疾病的斗争。迄今为止，英国已经报道了146例 变异型CJD(vCJD)，而且让人感兴趣的科学证据表明BSE和vCJD之 间存在因果关系。因为在这些患者中未确定任何明显的危险因素，所 以暴露于BSE污染食品似乎很有可能是一种因果联系。尤其迫切的是 在患者出现临床症状之前检测vCJD，因为它可极大地减小血液供应和 医院设备被污染的危险性。最近，一名英国患者在接受输血后6.5年 发生vCJD，而此献血员在献血后3.5年出现vCJD症状(Llewelyn et al.，2004，The Lancet 363，417-421)。此情况增加了vCJD可能 通过输血传播的可能性，而且强调了对血液及其成分进行朊病毒诊断 性检测的必要性。在本发明中公开了一种TSE感染哺乳动物血浆中疾 病相关类型PrP的检测方法。
因为PrPSc是朊病毒病唯一可靠的分子标记，所以免疫学检测脑组 织中抗蛋白酶的PrPSc部分是快速诊断试验的基础，此试验常用于BSE 和瘙痒病的活动性监测。由于该病临床前阶段中PrPSc缓慢蓄积的动力 学，现有诊断能力严重受限于潜伏期中对该病的早期检测。这里公开 的本发明提供了临床前阶段中朊病毒病的检测方法。
尽管PrPSc最初被定义为一种部分抗蛋白酶和去污剂不溶解的同 种型PrP，但已经识别的几种朊病毒病与异常PrP相关，这些异常PrP 缺乏典型的蛋白酶抵抗性。与这些朊病毒病相关的PrP类型称为“蛋 白酶敏感性”PrPSc，这样可将它们与抗蛋白酶的PrPSc类型区别开。
对动物或人组织中朊病毒蛋白疾病相关构象的检测被认为是对朊 病毒病的诊断。为了区分疾病相关PrP与细胞前体PrPC，可能用蛋白 酶处理以完全破坏PrPC，但仅仅除去了PrPSc的蛋白酶敏感N-末端部 分，或者也可以应用一种可区分PrPC和PrPSc的抗体。我们的专利申 请WO 98/37210和Korth等(1997，Nature 390：74-77)的题目为“朊 病毒的免疫学检测”中已经公开了这种抗体，它仅与自然PrPSc反应， 而不与PrPC反应，在此引用这篇论文以公开这种抗体，并对其进行描 述。
目前用于诊断朊病毒病的大多数试验是在中枢神经系统的组织上 进行的，该组织是在显示临床疾病或者怀疑患有疾病的动物或人死后 获得的。这种诊断检测方法依赖于使用预处理，以水解朊病毒蛋白的 蛋白酶敏感类型，然后通过免疫学方法检测朊病毒蛋白的抗蛋白酶类 型。但是，这些方法不能检测PrPSc的蛋白酶敏感类型。例如，专利申 请WO 00/52197要求保护在TSE感染哺乳动物血清中检测PrPSc的方法。 此方法的主要缺点在于，应用蛋白酶进行预处理，以水解蛋白酶敏感 性PrP。
现在迫切需要一种简单而有效的检测TSE相关抗蛋白酶类型PrP 和蛋白酶敏感类型PrP的方法和诊断试剂盒，以便在活体哺乳动物中 对该疾病进行检测。
发明目的
本发明的目的是克服现有技术的缺点和不足，提供活体动物和人 的朊病毒病的检测方法和诊断试剂盒。
这种方法的优势是，通过筛选血液以确定疾病相关PrP的存在， 可检测出传染性海绵状脑病的携带者，而且例如此方法可防止vCJD 意外地通过输血传播。
定义
名词“PrP”指朊病毒蛋白同种型的共同氨基酸序列，而不是不同 的构象。
名词“PrPC”指正常哺乳动物中大量存在的朊病毒蛋白同种型， 而且与TSE无关。
名词“PrPD”指疾病(TSE)相关类型的PrP，它被定义为正常宿 主朊病毒蛋白构象改变的同种型。PrPD包括疾病相关PrP的抗蛋白酶 类型和蛋白酶敏感类型。
名词“PrPD”与例如羊、牛或人构象改变的PrP同义，这里的羊、 牛或人仅是引用的一些实例。
名词“抗体”指通过动物免疫或者通过体外选择/淘选步骤而产生 的任何抗体。该抗体可为多克隆或者单克隆抗体，包括其片段，诸如 Fab或单链抗体。此抗体可为基因工程抗体，诸如嵌合或人源化抗体。
发明总结
按照本发明，公开了一种检测动物或人PrPD的方法，此方法包括 采集样品，此样品优选是血液或易于从活体哺乳动物中获得的其他体 液，然后将此样品与仅识别PrPD的抗体接触，最后应用免疫学方法检 测抗体/PrPD复合物的量。
本发明的方法考虑到与TSE相关同种型PrPD既可为蛋白酶敏感同 种型，也可为抗蛋白酶同种型存在。在上下文中提到，应用特异性捕 获抗体处理样品，此捕获抗体可识别TSE相关同种型PrPD上的构象表 位。选择对TSE相关同种型PrPD特异的，但不是朊病毒蛋白的抗蛋白 酶同种型所必须标示的表位。通过应用可识别所述构象表位的捕获抗 体，可获得最佳结果，尤其是在可含有TSE相关PrPD的样品中，此TSE 相关PrPD既可为蛋白酶敏感同种型中也可为抗蛋白酶同种型。
在优选实施方式中，应用此方法分析包括仅为蛋白酶敏感同种型 的PrPD的样品。按照本发明，仅通过应用捕获抗体即可处理这些样品。
在本发明的优选实施方式中，检测PrPD的方法是对血浆进行的， 按照作为本发明一部分的一种步骤由血液样品制备此血浆。
在另一种优选实施方式中，用化学品处理血浆样品，使抗体/PrPD 复合物的结合条件达到最佳。
在本发明的另一种实施方式中，应用抗体15B3仅检测PrPD，而不 检测正常类型的PrP。可从瑞士苏黎世的Prionics AG获得抗体15B3， WO 98/37210公开了产生这些抗体的方法。WO 98/37210中公开的可产 生抗体15B3的Hybridomacells被保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，登记号为DSM ACC2298。
在本发明另一种优选实施方式中，通过免疫学方法直接或间接检 测抗体/PrPD复合物。
本发明另一种实施方式提供了应用夹心ELISA法检测抗体/PrPD 复合物的方法，此方法应用一种识别朊病毒蛋白N一末端的标记抗体。
本发明的一种优选实施方式是应用检测PrPD的方法检验人血液样 品，以确定该血液是否可安全用于输血。
本发明另一种优选实施方式中提供了用于诊断活体哺乳动物TSE 的诊断试剂盒。
优选实施方式的详细描述
按照本发明，在诊断TSE中PrPD的检测方法包括：
1)采集动物或人的血液样品
2)由血液样品制备全血、血浆、血清、红细胞(RBC)或白细胞 (WBC)，并处理血浆，以便分析物PrPD与抗体结合
3)用作为捕获抗体的PrPD特异抗体孵育此血液样品
4)冲洗抗体/PrPD复合物，除去污染的蛋白
5)用敏感的免疫学分析检测抗体/PrPD复合物。
下面将参照具体实施例更详细地对个别步骤进行描述。应当清楚， 公开的方法和成分并不受限于特殊样品、化学药剂、抗体、标记物或 方法，这些都可以改变。除非另行定义，这里所用的所有技术和科学 名词的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同。
抽取哺乳动物的血液样品，将其置于含抗凝剂的容器中，此抗凝 剂诸如为EDTA、枸橼酸钠或肝素。优选抗凝剂为EDTA，而应用其他抗 凝剂也可具有相似的结果。通过1000xg离心分离血浆和血细胞。其他 优选样品为体液，诸如唾液、尿或脑脊液。如果应用血清，则将血液 抽至不含抗凝剂的容器中，并在室温下使血液凝结至少30分钟，然后 1000xg离心，分离血块和血清。
将血浆样品与含去污剂的等量缓冲液混合，防止PrPC与抗体发生 非特异性结合。适于阻断非特异性结合的去污剂有很多种，而且本领 域专业技术人员对它们很熟悉。优选去污剂有月桂酰肌氨酸钠、脱氧 胆酸钠、磺基三甲铵乙内酯、Triton X-100、NP-40、ZWITTERGENT、 Tween-20、Tween-80。特定分析方式所用的优选去污剂以及用于特定 物种的优选去污剂可以改变。优选浓度为0.05-1％。
将血浆样品与抗体接触。在本发明优选实施方式中，应用对疾病 相关类型PrPD特异的抗体。优选抗体为抗体15B3，已显示它对PrPD 是特异的，但也可以类似方式应用其他抗体。在特别优选实施方式中， 抗体包被在微量滴定板的孔上，或者包被在珠上以捕获样品中的PrPD。 然后通过免疫学方法，应用识别PrP的检测抗体检测抗体与PrPD的复 合物。通过各种免疫学方法可完成检测。本领域专业技术人员熟知这 些方法，它们可包括蛋白印迹法(免疫印迹法)、酶联免疫吸附法 (ELISA)、免疫-PCR或者荧光激活细胞分选法(FACS)。应用可与酶 缀合的朊病毒蛋白的抗体可进行直接检测，所述酶诸如为过氧化物酶、 碱性磷酸酶或者荧光分子或核酸。可替代的是，可应用未标记初级抗 体(抗朊病毒蛋白抗体)和标记的次级抗体进行间接检测。
通过下面非限制性实施例和附图对本发明进行举例说明：
实施例1：BSE阴性和阳性牛血浆中PrPD的检测。
实施例2：瘙痒病阴性和阳性羊血浆中PrPD的检测。
实施例3：瘙痒病阴性和阳性羊脑匀浆中PrPD的检测。
实施例4：瘙痒病阴性和阳性羊血清中的PrPD的检测。
实施例5：瘙痒病阴性和阳性羊白细胞中PrPD的检测。
附图简述
附图1是显示实施例1结果的图表。在此实施例中，对感染BSE (Pos 1-Pos 2)和正常牛(Neg 1-Neg 23)的血浆样品进行夹心免 疫法，15B3用作捕获抗体，可识别PrP N-末端的抗体用作检测抗体。
附图2是显示实施例2结果的图表。在此实施例中，对感染瘙痒 病(Pos 1-Pos 6)和正常羊(Neg 1-Neg 16)的血浆样品进行夹心 免疫法，15B3用作捕获抗体，可识别PrP N-末端的抗体用作检测抗体。
附图3是显示实施例3结果的图表。所示数据表明，应用FACS 分析可区分瘙痒病阳性脑匀浆(B)和瘙痒病阴性脑匀浆(A)。灰色 曲线显示抗体15B3包被珠所接收的荧光信号。黑线显示同种型对照珠 所获得的荧光信号。
附图4是显示实施例4结果的图表。所示数据表明，应用FACS 分析可区分源自感染瘙痒病羊的血清(B)和源自未感染瘙痒病羊的血 清(A)。在阳性样品(B)中采用在阴性样品(A)中设定为5％的右 上象限，并清楚地显示出5-32％的变化。
附图5是显示实施例5结果的图表。所示数据表明，应用FACS 分析可区分源自感染瘙痒病羊的白细胞(B)和源自未感染瘙痒病羊的 白细胞(A)。在阳性样品(B)中采用在阴性样品(A)中设定为5％ 的右上象限，并清楚地显示出5-36.9％的变化。
实施例1
附图1所示图表显示第一种实验的结果。其数据表明，应用夹心 免疫测定法可将BSE阳性血浆样品与阴性样品区分开。这里显示两次 测量值的均值，而误差棒显示与高值的差异。
室温下，用稀释于pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.1％牛血清白 蛋白(BSA)的2μg/ml抗-IgM抗体包被96孔平板1小时。用含0.05％ Tween-20的pH 7.4的PBS将平板冲洗3遍，除去未结合的抗体。然后， 将平板封阻2小时，并用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS冲洗3 遍。室温下，将浓度为2μg/ml于pH7.4的PBS中的构象特异性抗体 15B3与抗-IgM结合1小时。用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS将 平板冲洗3遍后，用含0.4％脱氧胆酸盐(DOC)的Tris缓冲盐水(TBS) 1∶1稀释的110μl BSE阴性和阳性牛的血浆被加至这些平板上，并在 室温下将它们孵育1.5小时。用含0.2％DOC的TBS将未结合蛋白冲掉。 在含有pH 7.4的PBS、0.02％ Casein、0.1％Tween-20的缓冲液中将 过氧化物酶标记的单克隆抗体805稀释为10ng/ml，此抗体可识别PrP 的氨基酸25-40，并将其加至孔中1小时。用含0.05％Tween-20的pH 7.4 的PBS冲洗3遍，除去未结合抗体。将100ml化学发光底物溶液加至 孔中，并在平板发光计中读数。值表示为相对光单位。
实施例2
附图2的图表显示第二种实验的结果。所示数据表明应用夹心免 疫测定法可将羊瘙痒病阳性血浆样品与阴性样品区分开。这里显示两 次测量值的均值，而误差棒显示与高值的差异。
按照实施例1所述，用15B 3抗体包被平板。用含0.2％ Sarcosyl 的TBS1∶1稀释的瘙痒病阴性和阳性羊的血浆被加至平板上，并在室温 下孵育1.5小时。用含0.1％ Sarcosyl的TBS将未结合蛋白冲掉。在 含有pH7.4的PBS、0.02％ Casein、0.1％Tween-20的缓冲液中将POD 标记的单克隆抗体805稀释为10ng/ml，此抗体可识别PrP的氨基酸 25-40，并将其加至孔中1小时。用含0.05％Tween-20的pH7.4的PBS 冲洗3遍，除去未结合抗体。将100ml化学发光底物溶液加至孔中， 并在平板发光计中读数。值表示为相对光单位。
实施例3
附图3的图表显示第三种实验的结果。所示数据表明应用FACS 分析可将瘙痒病阳性脑匀浆与阴性样品区分开。这里显示了一个直方 图，其中y轴表示事件，x轴表示FL-2检测器所测定的荧光相对强度。
室温下，在旋转轮上，将60ng单克隆15B 3抗体或同种型对照IgM 抗体(Becton Dickinson 550963)包被在3μl pH7.4的磷酸盐缓冲 盐水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15)上，进行 1小时，此磷酸盐缓冲盐水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。用含 0.1％BSA的pH7.4的PBS冲洗小珠三遍，除去未结合抗体。将这些小 珠加至1ml含0.25％Sarkosyl的Tris缓冲盐水(TBS)和10μl 10％ 瘙痒病阳性或阴性脑匀浆中，并在4℃，在旋转轮上孵育过夜。此后， 用含0.2％Sarkosyl的TBS将小珠冲洗三遍，除去未结合蛋白。然后 将这些小珠加入200μl含2μg生物素化单克隆抗体805的pH 7.4的 PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中，并在室温于旋转轮上孵育 15分钟。用200μl含0.1％Tween-20和0.02％Casein的pH7.4的PBS 冲洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％ Casein中的2.5μg链亲和素-藻红蛋白共轭物(Becton Dickinson 554061)，并在室温下再孵育5分钟。通过冲洗除去未结合共轭物后， 将这些小珠置于400μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20和0.02％Casein 中，并通过FACS(荧光激活细胞分选法)(MoFlow)分析。对FSC/SSC 以线性模型获得读数，对FL2以对数模型获取读数。以listmode形式 进行数据采集。FL2基线在未预先进行样品孵育的15B3小珠上设定。
实施例4
附图4的图表显示第四种实验的结果。所示数据表明应用FACS 分析可将瘙痒病阳性血清(B)与阴性样品(A)区分开。这里显示斑 点印迹，其中y轴表示颗粒大小(向前散射)，x轴表示FL2检测器 所测定的荧光相对强度。
室温下，在旋转轮上，将60ng单克隆15B3抗体包被在3μl pH7.4 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15) 上，进行1小时，此磷酸盐缓冲盐水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。 用含0.1％BSA的pH7.4的PBS冲洗小珠三遍，除去未结合抗体。将这 些小珠加入500μl含0.2％Sarkosyl的Tris缓冲盐水(TBS)和250μl 分别获自感染瘙痒病动物和未感染瘙痒病动物的血清中，并于4℃， 在旋转轮上孵育过夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS将小珠冲洗 三遍，除去未结合蛋白。然后将这些小珠加入200μl含2μg生物素 化单克隆抗体805的pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein 中，并在室温于旋转轮上孵育15分钟。用200μl含0.1％Tween-20 和0.02％Casein的pH 7.4的PBS冲洗三遍后，加入含于200μl pH7.4 的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein的2.5μg链亲和素-藻红蛋白 共轭物(Becton Dickinson 554061)，并在室温下再孵育5分钟。通 过冲洗除去未结合共轭物后，将这些小珠置于400μl pH7.4的PBS、 0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通过FACS(MoFlow)分析。对 FSC/SSC以线性模型获得读数，对FL2以对数模型获得读数。以 listmode形式进行数据采集。FL2基线在未预先进行样品孵育的15B3 小珠上设定。
实施例5
附图5的图表显示第五种实验的结果。所示数据表明应用FACS 分析可将从瘙痒病阳性(B)羊中提取的白细胞与瘙痒病阴性羊(A) 的白细胞区分开。这里显示斑点印迹，其中y轴表示颗粒大小(向前 散射)，x轴表示FL2检测器所测定的荧光相对强度。
室温下，在旋转轮上，将60ng单克隆15B3抗体包被在3μl pH7.4 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15) 上，进行1小时，此磷酸盐缓冲盐水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。 用含0.1％BSA的pH7.4的PBS冲洗小珠三遍，除去未结合抗体。将这 些小珠加入500μl含0.2％Sarkosyl的Tris缓冲盐水(TBS)和2百 万个分别获自感染瘙痒病动物和未感染瘙痒病动物的白细胞中，并在 4℃，在旋转轮上孵育过夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS将小珠 冲洗三遍，除去未结合蛋白。然后将这些小珠加入200μl含2μg生 物素化单克隆抗体805的pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein 中，并在室温于旋转轮上孵育15分钟。用200μl含0.1％Tween-20和 0.02％Casein的pH7.4的PBS冲洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的 PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein的2.5μg链亲和素-藻红蛋白共 轭物(Becton Dickinson 554061)，并在室温下再孵育5分钟。通过 冲洗除去未结合共轭物后，将这些小珠置于400μl pH7.4的PBS、 0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通过FACS(MoFlow)分析。对 FSC/SSC以线性模型获得读数，对FL2以对数模型获得得数。以 listmode形式进行数据采集。FL2基线在未预先进行样品孵育的15B3 小珠上设定。