[0002]克-雅综合征(Creutzfeldt-Jakob Disease)(CJD)是一种相对罕见的 人类神经变性疾病形式，以家族性、散发性或医源性疾病存在，发病 率是每百万人群中大约1例。该疾病的一个新的变种形式(vCJD)的出 现—其主要发生在年轻人群中并且可能是由于消费了受牛海绵状脑病 (BSE)感染的肉类产品，增加了病例数大量增加的概率。这些因素具有 重要的公共健康意义。在二十世纪八十年代晚期，高比例的英国人群 曾经通过食物潜在地暴露于该疾病。尽管迄今为止的病例数相对低(至 2004年2月是149例)，仍然存在着对来自通过其它传播途径，包括手 术、移植、输血或污染的医疗用品的所有形式CJD的显著风险。这些 途径中的许多涉及该疾病在临床情况中的医源性传播，其它途径在动 物模型中得到确定。

[0003]在人类中引起所有形式CJD的因子对应用标准方法的失活是高 度抵抗的。迫切需要对外科器械除污染的有效方法。已经对多种处理， 包括化学处理和利用湿热或干热的高温及高压的应用进行了测试，但 是没有一种方法是满足要求的[Taylor，D.M.(1999)于：Principles and practice of disinfection，preservation and sterilisation中.(Russell，A.D.， Hugo，W.B.and Ayliffe，G.A.J.，Eds)：pp 222-236 Blackwell Scientific Publications，Oxford；Taylor，D.M..(2001)Contrib Microbiol.7，58-67； Taylor，D.M.，Fernie，K，Steele，P.J.，McConnell，I.and Somerville，R.A. (2002)J Gen Virol.83，3199-3294]。焚烧是有效的，但是阻碍了对原材 料和或器械的任何恢复或再利用。已经显示，高浓度氢氧化钠(高达2M) 或高水平次氯酸钠(高达20000ppm)的应用明显降低TSE因子的水平， 但是其对外科器械具有损害效应，并且对操作者有害。已经提议了多 种其它方法作为失活外科器械上的TSE因子的方法，这些方法目前还 在开发中。这些包括多种气态杀菌剂，包括蒸气态过氧化氢、臭氧和 环氧乙烷。已经提议了其它方法作为常规灭菌之前特定的抗TSE预处 理，这些方法包括：在限定的pH条件和温度条件下，用热稳定蛋白酶 处理外科器械。

[0004]嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)芽孢的失活是常 规用于验证高压灭菌之正确实施的方法。这种指示物可以给出细菌或 病毒被该过程失活的相对指示，以该过程通常由于降低了感染因子水 平106个数量级而得到验证。然而，TSE因子独特的稳定性质意味着： 需要强得多的指示物来提供对失活这种因子的过程的性能的相对指 示。

[0005]基于热稳定芽孢或酶制备物的其它生物指示物是熟悉本领域技 术人员公知的。这些指示物都有缺点：它们不能验证感染因子活性降 低超过106的失活。

[0006]TSE因子的失活也是处理受牛海绵状脑病(BSE)感染物质和制 备动物来源的原材料中的重要问题。现在存在可靠的科学根据，认为 BSE的发生和传播是通过炼油操作中的转变形成的，高度感染的神经 组织被通过肉骨粉添加剂(meat-and-bone-meal supplements)反过来喂 给牲畜。也有可靠证据表明，BSE是vCJD的病因，几乎确定地是食用 污染的牛肉产品的结果。由于这个原因，死于BSE的任何牲畜，以及 所有牲畜的脊髓和脑组织，通常从食物链中被去除，并且经可选的途 径被处理。其结果是，大量的动物废物目前被积累或经焚烧处理。用 热稳定蛋白酶对这些物质进行处理是一个可能的解决方法。此外，存 在着对确保任何感染物在适当的过程中被摧毁的验证方法的需求。

[0007]本发明的一个目的是，提供可选的和/或改进的生物指示物以及 它的应用。

[0008]因此，在本发明的第一方面，提供了生物过程指示物(biological process indicator)，用于验证旨在降低样品中生物因子的含量或活性的 处理过程，其包括激酶。在一个优选实施方案中，指示物还包括固体 支持物，其中的激酶被固定化在所述固体支持物中或被固定化在所述 固体支持物上。在一个特别优选的实施方案中，激酶是热稳定激酶。

[0009]在本发明的应用中，生物指示物被包含在待接受处理的样品中， 所述处理意图在于降低样品中的潜在污染物，特别是传染因子的含量。 从以前的试验已知，处理所致指示物激酶活性的降低与污染物的量或 活性的降低相关。为了确定污染物的量/活性是否被降低至可接受水平 以下，在处理之前和之后，或在处理过程中测定指示物激酶的活性。 当达到已知与污染物中的可接受降低相关的活性水平时，则认为该处 理是有效的。如果污染物是感染因子，则认为样品是无菌的。

[0010]在本发明的一个特殊应用中，热稳定激酶是指示一种因子(例如， 感染因子)在清洁步骤或失活步骤之后可能存在的方法中的报告物。首 先，含有热稳定的腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶的样品被暴露 于清洁/失活程序(例如，选择的温度、pH值或蛋白酶浓度中的一种或 多种)。随后的步骤是通过热处理去除任何污染的酶活性，例如，在60 至80℃，至少10分钟(即，在不明显影响热稳定激酶的条件下)。随后 使热稳定激酶在30℃至70℃与底物(例如ADP)反应，使得ATP产生。 ATP的形成可以通过生物发光检测而测定，其中应用萤光素/萤光素酶 和合适的发光计，在20-30℃测定10分钟至1小时。发光计的读数给 出了残余激酶活性，即，暴露于清洁/失活处理后的激酶活性的读数。 根据以前的单独试验得到的数据，该方法通过将残余激酶活性与被处 理样品中的传染因子的可能性存在相关联而完成。

[0011]在一种实施方案中，在指示物加入之前，样品中的污染性酶活 性或ATP可以通过起始处理步骤(例如，选择的温度、pH值或蛋白酶 浓度)被去除。

[0012]已经发现激酶能够产生可以在极宽范围内检测的信号。一般而 言，激酶是应用含有ADP的底物被检测的，ADP转变为ATP，ATP 本身被用于产生光，例如，应用萤光素/萤光素酶，用发光计检测。宽 范围使得指示物特别适于验证，原因是激酶甚至在量/活性降低许多个 对数级时保持可检测。对于灭菌，大多数国家机构(national institutes) 认为生物因子的量或活性降低6个对数级是验证灭菌状态所需的。本 发明的激酶提供了验证因子的量或活性的降低程度充分超过6个对数 级、至8个对数级和更多的潜能，因而增加了目前提供的监测范围。 在本发明的优选实施方案中，激酶是热稳定的，因此适于在验证高温 下进行的过程中应用。也发现热稳定激酶对其它极端环境具有抗性， 并且例如，通常发现其对极端pH值具有抗性和对暴露于蛋白水解酶具 有抗性。因此本发明的激酶可以被用来监测生物因子的处理，所述处 理应用高pH值、高温和蛋白酶中的一种、其组合或全部。

[0013]热稳定意味着，暴露于70℃30分钟后，保留至少95％的激酶活 性。本发明的优选酶非常热稳定，并且在加热至80℃10分钟后将保留 至少95％的活性。来自嗜温生物、甚至是多种嗜热生物如嗜热脂肪芽 孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的激酶(广泛用作生物指示物)不 满足这些标准，但是适于用作在较低温度下进行处理的指示物。

[0014]在本发明特定实施方案中应用的激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶 和丙酮酸激酶，或它们的组合。进一步地，腺苷酸激酶、乙酸激酶或 丙酮酸激酶可以从激烈热球菌(Pyrococcus furiousus)、P.abyssi、P. horikoshii、沃氏热球菌(P.woesii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)、芝田硫化叶菌(S. shibatae)、Rhodothermus marinus、Thermococcus litoralis、Thermatoga maritima、Thermatoga neapolitana和甲烷球菌各种(Methanococcus spp.) 得到。腺苷酸激酶是特别优选的，用在下面详述的本发明实施例中。 激酶催化ATP从含ADP的底物中形成，随后容易地用已知方法和试剂 检测ATP。适用于本发明的具体激酶在SEQ ID NO.s 1-30中列出。

[0015]ATP生物发光检测是测定激酶活性的优选方法。标准的萤光素- 萤光素酶分析方法可以检测少至10-15摩尔的ATP。通过偶联酶扩增与 生物发光检测方法，能够检测少至10-20摩尔的激酶。这种类型的形式 从而提供了检测分子的显著灵敏性，其中应用与腺苷酸激酶(AK)连接 的结合物质种类(binding species)，如WO 02/053723中所述。

[0016]偶联于生物发光检测的激酶、例如AK的应用，具有许多其它 的明显优势。本分析在比其它类似分析形式相比大得多的范围内，给 出了酶活性和光产物之间的直接关联。因此，虽然应用传统报告酶如 辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的分析将在5-6个对数的稀释范围内得 到成比例的反应，但AK-萤光素酶分析可以提供至少8个对数级的动 态范围。作为直接指示物，这使得它们对于需要失活水平高于标准的6 个对数级范围的过程特别有用，因为其可以使信号在整个分析范围内 有意义，这在应用其它分析形式时有些不可能。这与在更坏的情况下， 多如8个对数级的传染性存在于外科器械表面时的TSE失活特别相关， 假定存在每mg高达108传染单位水平的1mg脑组织。在这些情况下， 提供8个对数级的信号范围的本发明指示物是特别有价值的。

[0017]假定过程类型需要TSE指示物，则优选高水平的热稳定性和物 理稳定性。在下面的实施例中，比较了来自嗜热生物体的一系列AK 酶的性质。甚至来自嗜热生物体如指示菌株嗜热脂肪芽孢杆菌的AKs 在相对低的温度下丧失其大部分活性。对于欲包含在例如高压灭菌循 环中的基于激酶的指示物，应用显著增强的热稳定性程度，如被来自 硫化叶菌属(Sulfolobus)的种或激烈热球菌的酶所证明。

[0018]对于增加酶、例如激酶对热失活的稳定性的许多添加剂和对制 剂的改变，是本领域技术人员已知的。鉴于本发明实施方案中应用的 热稳定激酶已经比这种过程类型中应用的其它酶明显更加稳定，它们 将需要明显少的稳定作用。本文描述的AK酶，特别是来自嗜酸热硫 化叶菌、硫磺矿硫化叶菌、芝田硫化叶菌、激烈热球菌、Rhodothermus marinus和Thermococcus litoralis的AK酶，在80℃和90℃时明显更加 稳定，这是与甚至来自通常用作灭菌过程指示物的生物体如嗜热脂肪 芽孢杆菌的酶相比而言的。在许多情况下，被固定在固体支持物上的 这些AK酶不需要进一步稳定以提供欲在例如高压灭菌、巴氏灭菌或 等价方法之后测定的所需活性范围。

[0019]稳定剂，如高达4M浓度的山梨醇，或高达2M浓度的其它多元 醇如乙二醇、甘油，或甘露醇的添加可以改进酶的热稳定性。其它添 加剂如木聚糖、海藻糖、明胶也可以单独或联合提供附加的稳定效应。 一定范围的二价金属离子，最主要是Ca2+、Mg2+或Mn2+的添加也可以 改进酶稳定性。

[0020]也可以用对酶的化学修饰改进它们的热稳定性。用乙醛酸对表 面暴露的氨基进行还原性烷基化(例如，Melik-Nubarov(1987)Biotech Ietts 9：725-730)、向蛋白质表面加入碳水化合物(例如，Klibanov(1979) Anal.Biochem.93：1-25)和酰胺化(例如，Klibanov(1983)Adv.Appl. Microbiol.29：1-28)，均可以增加酶的稳定性。用于酶固定的其它方法 —包括应用化学交联剂和应用多种聚合物支持物—也是增加酶的热稳 定性的相关方法(在Gupta(1991)Biotech.Appl.Biochem.14：1-11中综 述)。

[0021]相似的修饰也与指示物对其它灭菌过程如过氧化氢或臭氧的稳 定相关。特别地，气态杀菌剂向酶接近受到限制的过程，将在需要时 提供增加酶稳定性的有用方法，所述限制是例如，受到包封在合适聚 合物中或与降低气体渗透的添加剂配制的限制。

[0022]有效增强酶的热稳定性的许多处理也与对蛋白酶处理的稳定性 相关，例如，用于开发通过蛋白酶处理有效失活TSE因子的指示物。 一般而言，表现出高水平热稳定性的蛋白质对降解过程如变性或蛋白 酶处理也可能表现出高度的稳定性(参见，例如，Daniel RM，Cowan DA， Morgan HW，Curran MP，″A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis″，Biochem J.1982 207：641-4；Rees DC， Robertson AD，″Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins″，Protein Sci.2001 10：1187-94；Burdette DS，Tchernajencko V V，Zeikus JG.′Effect of thermal and chemical denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity″，Enzyme Microb Technol.2000 27：11-18；Scandurra R，Consalvi V，Chiaraluce R，Politi L，Engel PC，″Protein thermostability in extremophiles″，Biochimie.1998 Nov；80(11)：933-41；和Liao HH.， ″Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K，urea，detergents，and water-miscible organic solvents″，Enzyme Microb Technol.1993 Apr；15(4)：286-92)。从而，与等 价的嗜温性激酶相比，热稳定激酶通常表现出对设计用来失活TSE因 子的蛋白酶处理行为的更高的稳定性。根据应用的过程的类型，也可 以选择激酶，以便满足过程的其它特性。因此，对于碱性pH下的蛋白 酶处理，方案趋向于应用来自中度嗜碱生物如激烈热球菌的热稳定激 酶，而在酸性pH下的蛋白酶处理可能应用来自嗜酸性生物如嗜酸热硫 化叶菌或硫磺矿硫化叶菌的激酶。

[0023]如果需要改进激酶指示物对蛋白酶处理的稳定性，存在许多其 它选择。这些选择中的许多与上述针对热处理稳定酶的方法相同。例 如，含有山梨醇、甘露醇或其它复合聚合物的制剂降低指示物表面的 酶的失活水平。此外，特异性降低蛋白酶底物降解速率的处理与此用 途特别相关。例如，在含有充当可选的蛋白酶底物的、最高达约10mg/ml (超过优选的指示物浓度10倍)的合适的载体蛋白如酪蛋白或清蛋白的 溶液中的激酶制剂，将特异地降低激酶指示物的消化速率。类似地， 向制剂中加入游离氨基酸如甘氨酸、酪氨酸、色氨酸或二肽将提供在 底物水平对酶抑制的方法并降低激酶指示物的局部失活。

[0024]本发明还提供了通过在细菌中重组表达产生多种热稳定激酶的 方法，所述激酶用作生物指示物。

[0025]已经显示，酶的遗传修饰使热稳定性显著增加，通过类比，这 样的突变也可能显著增强指示物酶在其它过程，如蛋白酶处理或气态 “灭菌”中的稳定性。在图1中显示的、采用三聚体(古细菌)AKs的已 经确定的3-D结构(Vonrhein et al(1998)J.MoI.Biol.282：167-179 and Criswell et al(2003)J.MoI.Biol.330：1087-1099)，对激酶热稳定性进行 比较，鉴定出影响酶稳定性的氨基酸。

[0026]表现出改进热稳定性的激酶的遗传工程变体也在本发明中被提 供和应用，并且可以通过许多方法产生。这些主要涉及认为形成三聚 体分子的中央核心堆积区(central core packing region)的氨基酸的特定 的位点定向诱变和随机“定向进化”方法，其中整个分子经历随后的 诱变和对具有改进性质的分子进行选择/筛选的循环。本文中描述的修 饰，例如，在实施例8-10中描述的修饰，是基于杂交方法，其中根据 观察到的结构相关分子之间的差异，应用基于共有序列的方法，确定 出可能影响酶的热稳定性的区域。随后通过将确定变化引入与最佳热 稳定性相关的氨基酸，或者在确定为热稳定性所必须的位置处引入每 一可能的氨基酸的随机替换。

[0027]本发明的特定修饰酶是实施例8-10中列出的多种变体，将它们 共同称作SEQ ID NOs：17-19(尽管几种变体被每一参考符号所包含)。

[0028]生物指示物可以适当地用在处理样品的容器中。例如，指示物 包括为基质的固体支持物，激酶分散在所述基质中。基质应当耐受处 理条件，并且有助于为来自处理的激酶提供保护—因而对指示物提供 一些稳定作用。激酶可以位于聚合物基质中。支持物可以被设计为， 射入或加入到处理容器中，其可以是指示条(indicator strip)、蘸棒(dip stick)或珠子。

[0029]本发明中包含多种支持物，其带有或不带有化学修饰并带有多 种制剂中的一种或多种激酶指示物，这取决于，例如，待验证过程的 需要。在一种形式中，支持物是作为固定装置的塑料、陶瓷、钢或其 它金属或聚合物表面，激酶在其上被干燥。支持物可以是聚碳酸酯、 聚苯乙烯或聚丙烯条或蘸棒，其可能具有平坦表面，激酶被施加在该 表面上。带有用于连接激酶的多孔表面的其它类型的支持物作为气态 过程的指示物也特别有用。包被了激酶的塑料、金属或陶瓷珠子也可 以为指示物提供有价值的形式，这也具有监测气态过程的特定相关性。 对于一些用途，这些支持物比固体支持物有优势，因为它们为连接指 示物提供了明显增加的表面积。

[0030]对于制备用于验证TSE失活过程的设备的特定实例，钢表面如 棒(rod)、盘(disk)或切片(coupon)是外科器械除污染的有效指示物。例 如，热稳定腺苷酸激酶的结合是疾病相关朊病毒异构体的聚集形式 (PrPSc)的非常好的模式，如此提供了显著好的PrPSc与手术钢表面相互 作用的指示物。

[0031]激酶在指示物的支持物上结合或向指示物的支持物的结合可以 通过用于将蛋白质连接到表面上的常规方法获得，例如，将蛋白质在 0.1M碳酸氢钠缓冲液中，在约pH9.6，在室温下温育约1小时。可选 地，用本领域技术人员已知的宽范围的偶联化学中的任意方法，将蛋 白质与表面共价偶联。例如，与SPDP(Pierce chemicals；采用制造商的 指导说明)衍生化、用DTT还原，以提供游离巯基用于交联的腺苷酸激 酶，被共价连接到带有马来酰亚胺表面的聚苯乙烯支持物。带有这样 的巯基结合表面的塑料表面在文献中充分描述。这种偶联方法的另外 的益处是，如果需要，可以将酶从支持物切割出来，例如，通过用DTT 或MESNA还原，以使得单独对任何指示物支持物进行分析。本发明 描述的腺苷酸激酶和其它指示物激酶具有如下性质：它们在衍生化并 与这些支持物交联后保持活性。

[0032]可选地，应用聚苯乙烯或聚碳酸酯支持物上的胺活性表面，其 中应用双功能交联剂如单体戊二醛，以通过蛋白质上的游离胺基为激 酶提供直接的不可切割交联。也可以应用紫外线(UV)处理直接将指示 物连接到合适的支持物。可以用与塑料表面相似的方法处理钢表面， 用以介导指示物激酶的共价连接。

[0033]宽范围的蛋白交联剂可以从各个公司得到，如 Pierce chemical company(Perbio)。对巯基、氨基、羟基和羧基有活性的试剂被设计成 偶联蛋白质，但是它们可以被相等地用于将蛋白质交联到天然有活性 的或包被的固体支持物如塑料、其它聚合物、玻璃和金属。也可以利 用将酶交联到糖的活性化学物。例如，可以用试剂BMPH((N-[β-马来 酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)、KMUH((N-[k-马来酰亚胺基十一酸]酰肼) 和MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸盐酸酰肼) (4-(4-N-Maleimidophenyl)butyric acid hydrazide hydrochloride)将含有游 离巯基的激酶与糖交联，其中巯基的形式或是半胱氨酸残基或是还原 产生巯基活性基团的化学衍生蛋白质。这对于固体支持物可能特别重 要，所述支持物是复合糖(例如纸、基于纤维素的膜、凝胶或树脂)或者 可以用糖溶液包被或处理，产生适当的活性表面。

[0034]对于每种类型的支持物，激酶优选地在增强结合和/或稳定结合 的蛋白质的溶液中配制。这样的制剂包括含有多达10％(w/v)蔗糖、山 梨醇、甘露糖、纤维素或聚乙二醇(PEG)的溶液。此外，激酶可以被配 制为施加在合适支持物的表面或腔内的凝胶的一部分。实例包括藻酸 盐、琼脂或聚丙烯酰胺基质。

[0035]指示物也可以包括稳定激酶的制剂，合适的稳定剂选自金属离 子、糖、糖醇和凝胶形成剂。

[0036]为了协助指示物的应用，还可以包括将指示物连接到表面的装 置，如突出部分、凹入部分或孔，用于通过工具如螺钉、螺帽和螺栓 或夹具将支持物连接到表面。

[0037]在本发明的特定实施方案中，将纯化的激酶如腺苷酸激酶(AK)， 配制成高达1mg/ml的浓度，并包被在固体支持物上。优选地，将1-2mg 或0.5-1mg或0.1-0.5mg或0.1mg的激酶包被在固体支持物上。对于蛋 白酶处理，可以使激酶干燥在类似于微量滴定板的聚丙烯、聚碳酸酯 或聚苯乙烯表面上。对于121℃15-20分钟的标准高压灭菌或134℃18 分钟的“朊病毒循环”高压灭菌，可以应用热稳定性支持物如不锈钢。 对于气态失活步骤如过氧化氢或臭氧，可以应用聚碳酸酯固体支持物， 其也可以被配制为多孔基质，以便在需要时，对失活剂提供更高程度 的抗性。

[0038]方便的固体支持物采用蘸棒形式，其从失活步骤直接被转移到 含有全部所需分析成分的管中。这可以是与食品和制药工业市场上已 有的众多“快速读出(rapid read-out)”卫生监测器中的其中一种监测器 相连的管式发光计(tube luminometer)。可选地，它可以采用为研究中的 指示物设计的专用设备形式，特别着重于保持热稳定酶所需的最佳温 度(参见实施例24)。

[0039]本发明也提供了生物指示物，包括在生物因子经历不同水平失 活作用后可以检测的多种酶。一种实施方案的生物指示物包括支持物、 位于第一位置的第一酶和位于第二位置的第二酶，第二位置与第一位 置分开。第一酶和第二酶都具有将产物转变为底物的活性，并且在生 物指示物暴露于失活过程起始时间段之后，两种酶的活性均可以被检 测。在生物指示物暴露于失活过程随后一段时间后，第一酶的活性不 能被检测到，但是第二酶的活性可以被检测。在生物指示物暴露于失 活过程又一随后时间段后，第二酶的活性不能被检测到。

[0040]本实施方案的优势是，可以用指示物表示由过程得到的生物因 子的大致失活水平，而无需采取精确的测定。因此，例如，当可以测 定两种酶时，这可以表明，失活没有达到一定的阈值。当仅可以测定 第二酶时，这表明，失活的第一阈值已经达到，但还没有达到第二阈 值。最后，当两种酶均不再测得时，这表明，失活已经经过了第二阈 值。如果第一酶在活性降低程度达到6个对数级时可以检测，第二酶 在活性降低程度达到8个对数级时可以检测，则能够检测两种酶表明， 失活没有达到6个对数级，仅能够检测第二酶表明，活性的降低程度 已达到6个对数级和8个对数级之间，两种酶均检测不到表明，活性 降低程度达到了至少8个对数级。

[0041]第一酶适于在活性降低多达5和8个对数级之间时可检测，第 二酶适于在活性降低6个对数级或更多时可检测。第一酶优选地在活 性降低6和7个对数级之间时可检测，第二酶优选地在活性降低7和8 个对数级之间时可检测。生物指示物还可以包括位于第三位置(与第一 位置和第二位置分开)的第三酶，其中在生物指示物暴露于失活过程又 一随后时间段之后，第三酶可以被检测，并且在生物指示物暴露于失 活过程第三个随后时间段之后，第三酶不能被检测。第三酶适于在活 性降低8个对数级或更多时可检测。

[0042]应用具有在不同水平处理中(例如，不同的暴露时间)可检测的多 种酶的这种类型的指示物，可以监测失活过程的进展，并且可以容易 地预测失活的终点。

[0043]多酶指示物的优选酶是激酶，更优选地是热稳定的酶，更优选 地是如本文中公开和描述的与本发明其它实施方案相关的酶。

[0044]在本发明的第二方面，提供了试剂盒(任选地是便携式试剂盒)， 用于验证降低样品中生物因子的量或活性的处理过程，包括：(i)根据本发明第一方面的生物过程指示物，和
(ii)激酶的底物。

[0045]为了对激酶量/活性进行测定，试剂盒可以包括检测ATP的工具， 例如萤光素/萤光素酶和任选的发光计。底物优选地是ADP。

[0046]从前面的对已知生物因子的试验中，可以得出将生物因子的量 或活性的降低程度与激酶活性相关联的数据，试剂盒从而也可以包括 将激酶活性与指定的一系列生物因子的量或活性的降低程度相关联的 一个或多个查询表(look-up tables)。在优选的实施方案中，试剂盒用于 监测TSE失活。

[0047]在本发明的第三方面，提供了验证处理过程的方法，包括：(i)获得样品，所述样品含有生物因子，或者怀疑其含有生物因子；
(ii)在确定量的激酶存在的情况下，使样品接受处理，其中所述处理 降低生物因子的量或活性；
(iii)测定残余的激酶活性，可选地，计算激酶活性的降低程度；和
(iv)将所述残余活性与预先确定的激酶活性相比较，或者将激酶活性 的所述降低程度与预先确定的激酶活性降低程度相比，其中所述 预先确定的激酶活性或预先确定的激酶活性降低程度相当于在 相同处理条件下，该生物因子量或活性的确认的降低程度。

[0048]在本文中，激酶可以是本说明书中描述的任一激酶，和/或具有 本说明书描述激酶的任意性质。优选地，激酶被配制为根据本发明第 一方面的指示物。

[0049]样品通常在不存在任何激酶的情况下提供，因此方法可以包括， 获得认为含有生物因子的样品和加入确定量的激酶。因子可以根本不 存在(虽然优选地，已知样品含有生物因子)。验证的要点在于，在进行 处理之后，确认曾经可能存在的任何因子已被去除/失活至可接受的程 度。

[0050]典型地，操作者在处理样品之前和处理样品之后测定激酶活性。 也可能有污染的激酶，通常是嗜温性激酶，可以在激酶活性分析之前 进入样品。因此，优选的是，加入到样品的激酶是热稳定的并且分析 步骤包括使嗜温性激酶失活，如在测定残余激酶活性之前，在70℃处 理样品至少30分钟，优选地在80℃处理样品至少10分钟。

[0051]在优选的实施方案中，当在萤光素/萤光素酶存在的情况下用发 光计检测时，激酶在处理之前的活性是每千克激酶至少10,000,000相 对光单位(Relative Liht Unit)(RLU)，或者每千克激酶至少8,000,000相 对光单位，或者每千克激酶至少5,000,000相对光单位，或者每千克激 酶至少3,000,000相对光单位，或者每千克激酶至少1,000,000相对光 单位，或者每千克激酶至少500,000相对光单位。

[0052]在本发明的优选实施方案中，预先确定的激酶活性是小于每千 克激酶10,000相对光单位，或者小于每千克激酶1000相对光单位，或 者小于每千克激酶500相对光单位，或者小于每千克激酶250相对光 单位，或者小于每千克激酶100相对光单位，或者小于每千克激酶10 相对光单位，或者小于每千克激酶1相对光单位，或者是每千克激酶0 相对光单位。

[0053]在本发明的优选实施方案中，预先确定的激酶活性降低程度等 于或大于激酶活性1个对数级的降低(log reduction)，或者2个对数级 的降低，或者3个对数的级降低，或者4个对数级的降低，或者5个 对数级的降低，或者6个对数级的降低，或者7个对数级的降低，或 者8个对数级的降低，或者9个对数级的降低。

[0054]在其它实施方案中，预先确定的激酶活性降低程度相当于激酶 的量或浓度至少6个对数级的降低，或者7个对数级的降低，或者8 个对数级的降低，或者9个对数级的降低。在又一实施方案中，预先 确定的激酶活性降低程度相当于RLU降低至少800,000，或至少 900,000，或至少950,000，或至少990,000，或至少999,000，或至少 999,900，或至少999,990，或至少999,999RLU。

[0055]在本发明的优选实施方案中，样品中生物因子量或活性的确认 降低程度是至少6个对数级，优选地至少7个对数级，更优选地至少8 个对数级，最优选地至少9个对数级。

[0056]在特别优选的实施方案中，持续处理直至残余的激酶活性或激 酶活性降低程度相当于至少6个对数级、或至少7个对数级、或至少8 个对数级、或至少9个对数级的生物因子量或活性的确认降低程度。 在本发明的第四方面，提供了将样品中生物因子量或活性的降低程度 与根据本发明第一方面的指示物的激酶活性相关联的方法，包括：(i)制备含有确定量的生物因子的样品和含有限定量激酶的样品；
(ii)使样品接受处理；
(iii)测定残余的激酶活性，可选地计算激酶活性的降低程度；
(iv)测定生物因子的残余量或残余活性，可选地计算生物因子的量或 活性的降低程度；
(v)重复步骤(i)至(v)，其中至少一个处理参数被变化。

[0057]在一个实施方案中，生物因子和激酶可以在相同的样品中存在。

[0058]在一个优选的实施方案中，处理参数包括时间、温度、pH值、 压力、蛋白酶浓度、和杀菌剂或去污剂浓度中的一种或多种。

[0059]在一个特别的实施方案中，处理包括在50-140℃，优选地在 80-100℃，更优选在134-138℃加热样品；处理参数是时间；通过使样 品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟时间，重复步骤(i)至(iv)。

[0060]在又一实施方案中，处理包括将样品暴露于pH值9-14、优选地 pH值12或更高、更优选地约pH12；处理参数是时间；通过使样品接 受所述处理1、5、10、20、40和60分钟时间，重复步骤(i)至(iv)。 在另一实施方案中，处理包括将样品暴露于浓度是0.5-2mg/ml、优选 地是约1mg/ml、更优选地是约2mg/ml的蛋白酶；处理参数是时间； 通过使样品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟时间，重复步 骤(i)至(iv)。

[0061]上述方法使得能够制备校准数据，用于进一步用指示物验证对 含有或怀疑含有生物因子的样品的处理。许多处理过程的校准描述于实施例21-23中。

[0062]在本发明的第五方面，提供了激酶作为指示物的应用，用于验 证降低样品中生物因子的量或活性的处理过程。在该上下文中，激酶 可以是本说明书中描述的激酶中的任一，和/或具有本说明书中描述的 激酶的任意性质。优选地，激酶被配制为根据本发明第一方面的指示 物。

[0063]现在描述应用本发明指示物监测/验证多种过程。

[0064]在一个实施方案中，应用指示物验证生物洗涤制备物在洗涤循 环中的性能(参见实施例14)。虽然洗涤循环的验证将潜在地在家庭环 境中应用，其最有优势的用途将是在卫生保健、药学或食品制备环境 中，例如，用于验证与遭受或暴露于感染因子(例如，耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌(MRSA)或诺沃克病毒/诺沃克类病毒发作)的患者相关的床 上用品、外衣或其它物品的除污染情况。在本文中，本发明的指示物 的优势是，它与生物材料如血液或其它体液有关。

[0065]为了验证洗涤循环，通过将合适的激酶交联在柔性棒(flexible wand)、布条(strip of cloth)或适于包含在循环中的其它材料上，制备指 示物。将指示物和其它加载物放入洗涤器。优选地，可以将指示物固 定在洗涤器内部上合适的固定器中，以便协助其回收。

[0066]随后进行洗涤循环，在对加载物进行任意的进一步操作或处理 之前，去除指示物并评价指示物，其中应用“读数器(reader)”，读数器 已被校准，以便提示指示物中残余激酶活性的可接受水平—可接受水 平来自对过程中的合适洗涤性能的在前校准和评定。这种评定可能包 括污染(soiling)的总水平和微生物的可存活数，如应用技术人员已知的 合适的模式微生物所评定。根据校准的读数，加载物被批准进行进一 步处理，或重复洗涤循环。

[0067]在第二种实施方案中，应用指示物验证病毒失活过程(参见实施 例15)。对环境中活病毒分离物的检测是困难的，特别是在与对速度和 精确性要求严格的紧急情况相关时。本发明提供了开发出使能够基本 上实时监测除污染步骤的指示系统的可能性。这对于在病毒因子爆发 (例如，诺沃克类病毒)或蓄意释放(如天花)后卫生保健和相关设施的表 面除污染是特别有价值的。

[0068]验证病毒失活过程的指示物可以采取多种不同形式，例如，用 于监测喷洒或浸入杀病毒剂的区域的棒或蘸棒，或者用于监测气态除 污染过程的悬浮指示物。可选地，指示物激酶可以在除污染之前被喷 洒在表面上，随后通过擦拭该表面评定残余激酶活性水平。

[0069]在本发明的又一实施方案中，应用指示物验证细菌蛋白毒素， 植物毒素如蓖麻毒蛋白和其它毒性蛋白质、肽或肽类似物的蛋白酶降 解情况(参见实施例16)。蛋白酶表现出降解宽范围蛋白毒素的巨大潜能，所述蛋白毒素是潜在 的生物战/生物恐怖袭击制剂，包括肉毒杆菌毒素、炭疽毒素和蓖麻毒 蛋白。它们也具有失活宽范围的其它潜在具有毒性的或有害蛋白或肽 制剂，从而使得能够对表面/设备除污染或对物质进行安全处理的潜能。 在该上下文中，本发明的指示物与待除污染的表面/物质共同接受蛋白 酶除污染步骤。在步骤的末期，移去指示物并根据本发明方法评定残 余激酶活性水平。随后将残余激酶活性水平与特定蛋白毒素或毒素群 的失活指数相关联。假定活性水平等于或低于限定的指数值，则物质 可以被安全地处理或者表面/设备被重新使用。

[0070]优选地，将合适的安全极限设置在失活指数的校准中，使得允 许过程性能的任何变化。本发明的中应用的酶的附加稳定性使其比宽 范围的其它酶指示物更确定地和更动态范围地进行，所述其它酶指示 物包括那些来自“热稳定”生物如嗜热脂肪芽孢杆菌的指示物，如显 示AKs形式嗜热生物的相对热稳定性的数据所示(图1，实施例2)。

[0071]也可以用指示物验证洗净药物生产设备中的蛋白酶除污染步 骤。宽范围的药物产品应用来自人或动物的材料，所述材料可能受到 宽范围因子的污染，包括朊病毒(TSE)因子和病毒(例如，西尼罗病毒、 肝炎病毒、HIV)。当材料来源是动物来源(例如胎牛血清、马免疫球蛋 白)和中间处理期带有增加特定样品中未鉴定病原体浓度的风险时，风 险可能被加重。在制造批次之间应用蛋白酶洗净制造设备和装置(例如， 层析柱、容器、管)的可能性，具有降低或消除这种风险的潜能，甚至 在污染物没有被正式鉴定时。这对朊病毒因子是特别可靠的，例如， 具有将感染因子积累和携带进最终产物的显著风险的血液分离设备中 的朊病毒因子。

[0072]为了验证这种类型的步骤，本发明的指示物理想地被设计为欲 浸入蛋白酶处理液的蘸棒，或者与待清洁设备排列连接的筒状物 (cartridge)。通过在处理后评定指示部件中残余激酶的活性水平，并将 其与可接受的清洁水平相关联，可以开发快速和性能可靠的监测器。

[0073]在本发明的另一实施方案中，应用指示物验证生物因子如TSE 的气态失活(参见实施例17)。

[0074]许多出版物和文章提出了臭氧或其它气态杀菌剂使这种因子失 活的潜能，但是，至今为止，没有方法明确表现出是有效的。为了支 持此气态技术的开发和引入到卫生保健中，将需要验证该技术的性能 的方法。由于因子如TSE已经表现出比传统的病毒或细菌因子对这种 形式的失活作用更具抗性，目前可利用的验证气态失活的方法未必合 适。本发明着眼于此问题。

[0075]对于这种类型的失活，通过任何适当方法将指示物激酶连接在 固体支持物上，例如，普通吸附和通过酰胺、肽、羰基或半胱氨酸键 的化学交联。例如，对于臭氧灭菌，可以应用刚性的聚氯乙烯(PVC)、 玻璃、钢、聚酰胺或聚丙烯支持物，激酶通过以前描述的任一化学方法 偶联于支持物。随后将指示物包含在待灭菌的一批材料/器械中，暴露 于臭氧，并针对设计用来评价待测因子相应失活的适当校准的失活指 数进行评定。成功的失活使得能够继续加工或应用材料/器械。

[0076]指示物可以可选地被连接于管或等价的内部空间的内表面，以 至于气体渗透受到限制。这提供了适于评定气体渗透入带有腔的器械 的等价空间、或渗透通过填塞的加载物质的监测器。可选地，可以将 激酶连接于多孔材料如聚苯乙烯珠子，或者可以将其固定在凝胶或树 脂中。

[0077]在本发明的又一实施方案中，应用指示物验证液体化学灭菌系 统(例如，Endoclens)，如用于内窥镜和相关器械的处理(参见实施例18)。

[0078]宽范围的内窥镜常规用于医疗中，是医学诊断和治疗的重要部 分。这些器械极度敏感并且为常规清洁和消毒提出了非常显著的问题。 传统地，和在目前的实践中仍然存在的，在用低温方法除污染之前手 工清洁内窥镜。已经开发出一些化学消毒剂和自动再处理装置着眼于 对器械如内窥镜的敏感部件除污染的特殊问题，传统的高压灭菌对于 所述敏感部件是不可能的。这些方法有助于降低难于清洁器械上的污 染水平，该污染水平与宽范围的病毒和细菌病原体的医源性传播相关。 目前验证这种过程的方法是，监测洗涤溶液的流速和温度。本发明的 指示物提供了验证的进一步方法，所述方法提供了内窥镜腔内的实际 清洁效率的读数。

[0079]对于这种类型的验证，指示物被连接于设计为具有和内窥镜管 相似的总内径的管的内表面。此指示装置被串联连接于自动再处理装 置上的内窥镜。随后用通常的方式处理内窥镜。在处理末期，优选地 在将内窥镜从装置中移去之前，分离指示物并评定残余的激酶活性水 平。可以将活性水平与从前限定的该过程的可接受性能的阈值相关， 根据该评定结果，可以将内窥镜转移用于另外的清洁或除污染或准备 应用。如果性能水平不足，则可以用如前述连接的新的指示物再处理 器械(用相同和更严格的条件)。指示装置也适于验证内窥镜和/或任何 其它带有内腔的器械的手工清洁。

[0080]在制备用于上述验证的指示物时，优选的是，根据酶的疏水性， 使激酶通过非特异性蛋白吸附方法与其支持物粘合。图5说明了不同 的重组激酶以此方式与聚苯乙烯粘合的能力。图5也说明了，一些激 酶对于这种类型的用途具有更令人满意的性质，例如，与来自T. maritima和A.fulgidus的激酶相比，嗜酸热硫化叶菌激酶对这种类型的 表面明显更加粘附。这对于其它类型的表面可以是不同的，特别是对 表面的粘附可以通过带电氨基酸残基进行的表面。在此类指示物中， 激酶从表面的直接去除是评价清洁性能的决定性特征，而不是对激酶 的任何变化或修饰。如此，这类“吸附的”指示物在评定洗涤性能中 有非常宽范围的应用。这对于验证从设备如内窥镜的内腔有效去除生 物膜的过程的能力是特别重要的，因为认为它是影响性能的关键因素 之一。如此，可以用合适的非感染生物膜作为激酶的基质，优选地应 用血清、蔗糖溶液、含水凝胶或刺激生物膜的其它工具，以便确保该 过程有效针对对此污染形式。适于验证这种过程的其它类型的指示物 与以前描述的那些指示物相似，其中激酶被共价连接于支持物表面， 产生化学连接如二硫键、酰胺键或羰基键。在这些情况下，洗涤和/或 灭菌的效果通过修饰激酶被施加，以至于激酶不再有活性。这将与通 过断裂肽键、交联蛋白质或破坏蛋白质结构的其它方法起作用的化学 杀菌剂特别相关。

[0081]在本发明的进一步实施方案中，应用指示物监测洗涤器-消毒器 中的常规的清洁性能，如在医院中应用的那些洗涤器-消毒器(参见实施 例19)。

[0082]在本发明的另一实施方案中，应用指示物监测戊二醛或邻苯二 醛(ortho-phthaldehyde)(OPA)处理。多年来，戊二醛和甲醛已经被广泛 用作杀菌剂。化学消毒剂通过以非特异方式多重交联蛋白质，以破坏 其功能而起作用。近来，出现邻苯二醛(OPA)作为此家族的新的消毒剂， 由于它避免了与戊二醛有关的一些毒性问题而被广泛应用。本发明的 指示物适于监测所有这种类型的化学消毒剂，原因是激酶对这种类型 的非特异性交联敏感。在这种类型的指示物中，激酶被共价连接于合 适的表面并与待灭菌的其它物品共同暴露于化学杀菌剂。过程的效率 通过移去指示物并测定残余激酶活性来评定。将此活性与表明该过程 正确性能的限定阈值相比较。

[0083]不同类型激酶的应用可以为过程提供附加的敏感性或灵敏度， 如不同用途中可能所需的。本申请中描述的热稳定腺苷酸激酶可以根 据其分子结构被广义地归为两类。因此，来自硫化叶菌各种的酶是具 有含中央疏水核心的三聚结构的酶的例子，所述中央疏水核心是在高 温下维持其活性的主要决定因素。第二类酶是单体酶，由来自 Thermotoga各种的腺苷酸激酶示例，但是具有略微更长的多肽链，所 述多肽链带有影响活性部位的附加的“盖(lid)”结构域。这些不同类型 的热稳定酶将对这类化学杀菌剂表现出不同的敏感性，这是由于在酶 作用期间它们的肽链的可变的柔性。对于任何特定的杀菌剂和/或浓度， 经验筛选将鉴定出具有适当灵敏度的酶，用于监测和验证这些类型的 化学品。

[0084]在本发明的进一步实施方案中，应用指示物作为环氧乙烷、过 氧化氢或其它气态过程的超速读出监测器。

[0085]目前，宽范围的气态杀菌剂被许多制造商用于细菌和病毒因子 的常规消毒。本发明方法利用气体的氧化性质来破坏肽键。如此，本 发明的激酶，以它们的坚韧的理化性质，对提供非常快速的失活读出 是理想的。该实施例中的指示物与之前描述的那些指示物相似，例如， 与因子如TSE的臭氧失活相关的指示物。

[0086]杀菌和除污染过程中的特别有挑战性的问题是验证大量液体的 杀菌情况的能力，这可能在制造许多药品或其它药物制品中是必需的。 虽然目前的方法监测特定过程的温度、时间、和/或压力参数(根据其精 确性质)，但验证大量液体中的实际杀菌情况的可利用方法极少，如果 存在这种方法的话。这在甚至约1升体积内是困难的，而在更大体积 下几乎是不可能的。

[0087]本发明提供了许多解决此问题的可能方案(参见实施例20)。在 最简单的形式中，可以将激酶加入待灭菌的液体中，激酶的浓度适于 测定过程末期激酶失活的限定水平和使该水平等同于灭菌状态。虽然 这在一些类型的过程中可能不是所希望的，激酶的惰性性质和等同酶 活性在所有生物体中的普遍存在，使其可以接受。可接受性可以通过 下列事实得到改进：许多热稳定酶是被高度浓缩，因此在接种到动物 中之后具有非常低的免疫源性。

[0088]当这种直接添加不可接受时，可以将激酶这样加入大量液体中： 在透析袋、多孔容器中、或固定在合适的支持物上，以至于没有激酶 部分被释放到大量液体中，但是灭菌条件以与对全部样品相同的方式 在指示物上起作用。包含或固定蛋白质，以允许液体样品全面扩散但 是限制指示物样品移动的宽范围的可能方法，将是本领域技术人员已 知的。可能的示例包括但不限于透析膜、Visking管(Visking tubing)、 多孔膜、蛋白结合树脂、刚性凝胶或如对所论述的其它指示物所描述 的固体支持物。可以用前述任一方法，将指示物连接于表面，或仅包 封在合适的膜中而不连接，这样，可以在过程结束时将指示物简单地 从大量液体中移出。定义部分

[0089]术语“生物因子”(biological agent)包括感染因子和非感染因子。 与本发明相关的生物因子的具体例子包含细菌、病毒、芽孢、蛋白质、 肽和朊病毒(感染性PrPSc形式和非感染性PrPSc形式)，也包含实施例 14-20中描述的特定因子。在本发明的优选实施方案中，生物因子是传 染性海绵状脑病。

[0090]术语“处理”(treatment)或“处理过程”(treatment process)包括 设计用来降低样品中生物因子量或活性的任何过程。合适的处理包括 下列中的一种或多种：选择的pH值、温度或压力，将样品暴露于蛋白 酶或其它酶，将样品暴露于去污剂、化学杀菌剂或气态杀菌剂。在优 选的实施方案中，将处理设计为，降低感染性生物因子如TSE的感染 活性(也称为感染性)。在特别优选的实施方案中，处理包括将样品暴露 于蛋白酶，温度是50-120℃之间、优选地是60℃或更高、更优选地是 100℃或更高，和/或将样品暴露于至少9的pH值下、优选地pH值是 至少12。术语“处理”也包括清洁和失活过程如利用湿蒸气或干蒸气 的高温高压灭菌、臭氧灭菌、H2O2灭菌、熔解(rendering)或设计用于消 除或失活生物因子的其它方法。

[0091]术语“样品”(sample)包括任何物品、器械、表面、流体或材料。 示例包括但不限于，外科器械和医疗器械、医院衣物、床上用品、大 量液体、收集的动物材料、药品、工作台、墙壁和地板。

[0092]术语“RLU”意味着相对光单位(Relative Light Unit)。本领域技 术人员将了解，相对光单位是相对的而不是绝对的测定值。说明书中 给出的图涉及用带有进样系统的Berthold Orion 96孔微孔板发光计，用 “闪光型(flash)”光测定法取得的测定值，在加入萤光素/萤光素酶试 剂后即刻2秒钟测得(光电倍增管的技术规范测定在波长300-650nm发 出的光)。为了着眼于此问题，制造商生成了用于RLU“因数”的数据， 这使得能够针对校准过的标准品对给定发光计产生的数据进行标准 化。因此，可以在不同器械间进行比较。本说明书描述的试验中应用 的Berthold Orion 96孔微孔板发光计的RLU因数是1。因此，本说明 书给出的RLU值可以被认为是标准化的/规格化的 (standardized/normalised)RLU值。关于绝对值，RLU值可以与得到所述值所需的ATP浓度相关，其中应 用方法(例如，实施例1的方法)中描述的试剂。作为近似的转变，给出 RLU值和ATP浓度之间的线性关系，可以应用下列值：  RLU  ATP的近似浓度/μM  12,000,000  1000  1,200,000  100  120,000  10  12,000  1  12,00  0.1  120  0.01

[0093]现在用下列实施例中的具体实施方案并参考所附的附图详细描 述本发明，其中：

[0094]图1示出了在70℃(A)、80℃(B)和90℃(C)处理后腺苷酸激酶(AK) 的活性；

[0095]图2示出了用不同浓度的碱性蛋白酶消化腺苷酸激酶(AK)后的 残余酶活性；和

[0096]图3示出了关联腺苷酸激酶(AK)的酶活性和残余浓度的标准曲 线。

[0097]图4示出了在大肠杆菌中重组表达的一系列AK酶的热稳定性。 编码AK酶的基因如实施例4所述被克隆和表达。所有的基因都是从 载体pET28a表达的，除了嗜酸热硫化叶菌克隆I是如前述从pET3a表 达的。每一克隆的表达水平相似，但是一定比例的激烈热球菌 (Pyrococcus furiosus)(P.fu)酶在不可溶部分中，这可能降低了被分析的 酶量。重组酶的热稳定性是在从1mg/ml细胞总蛋白起10倍连续稀释 的粗提大肠杆菌裂解物(这样，柱12相当于1fg/ml总蛋白)中，80℃温 育30分钟后测定的。来自Thermotoga maritima和Archaeoglobus fulgidus的酶表现出比检测的其它酶明显高的稳定性，尽管残余酶 (Sulfolobus solfataricus(S.so P2)、Aeropyrum pernix和P.fu)表现出与用 作前面分析的基础的嗜酸热硫化叶菌酶(数据表示为S.ac I)相似的活 性。

[0098]图5示出了热稳定腺苷酸激酶(tAK)与固体支持物的差异性结 合。为了评定纯化的重组热稳定腺苷酸激酶与固体支持物的相对结合， 说明它们用于直接吸附型指示物的潜在应用，评价了酶与封闭平板的 结合。标准聚苯乙烯微量滴定板的表面通过加入5％脱脂奶而被封闭。 去除脱脂奶，将来自Archaeoglobus fulgidus(Afu)、Thermotoga maritima (Tma)和嗜酸热硫化叶菌(Sac)的tAKs的稀释物施加在平板上。洗涤之 后，如标准分析方法所述(实施例1)测定结合的tAK的量。结果表明， 与其它两个可选的tAKs中任意一个相比，Sac tAK对封闭平板表现出 显著高的结合。虽然酶的具体活性不同，但Afu和Tma tAKs都表现出 比Sac tAK更高的活性，如此，结合的实际差异甚至比图中显示的更 大。由于脱脂奶是普遍应用的用于降低蛋白质与平板结合的封闭试剂， 这些结果表明，Sac tAK具有疏水性吸附于这些试验中应用的表面(聚 苯乙烯)的极强倾向性。酶的这种性质—类似于对朊病毒分子与钢表面 所观察到的—意味着，它是评定宽范围TSE失活和/或去除过程的极有 效的指示物。

[0099]图6示出了失活朊病毒的蛋白酶消化处理的校准曲线的绘制。

[0100]图7示出了失活朊病毒的气态臭氧处理的校准曲线的绘制。

[0101]图8示出了去除标准污染物的医院洗涤器-消毒器的校准曲线的 绘制。

[0102]图9示出了对手持式卫生监测器的修改，以便使得能够快速读 出对tAK指示物的评价。

[0103]SEQ ID 1来自硫磺矿硫化叶菌的腺苷酸激酶的蛋白序列。

[0104]SEQ ID 2来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的蛋白序列。

[0105]SEQ ID 3来自Sulfolobus tokodaii的腺苷酸激酶的蛋白序列。

[0106]SEQ ID 4来自激烈热球菌的腺苷酸激酶的蛋白序列。

[0107]SEQ ID 5来自Pyrococcus horikoshii的腺苷酸激酶的蛋白序 列。

[0108]SEQ ID 6来自Pyrococcus abyssi的腺苷酸激酶的蛋白序列。

[0109]SEQ ID 7来自Methanococcus thermolithotrophicus的腺苷酸 激酶的蛋白序列。

[0110]SEQ ID 8来自Methanococcus voltae的腺苷酸激酶的蛋白序 列。

[0111]SEQ ID 9来自Methanococcus jannaschii的腺苷酸激酶的蛋 白序列。

[0112]SEQ ID 10来自Methanopyrus kandleri的腺苷酸激酶的蛋白 序列。

[0113]SEQ ID 11来自Methanotorris igneus的腺苷酸激酶的蛋白序 列。

[0114]SEQ ID 12来自Pyrobaculum aerophilum的腺苷酸激酶的蛋 白序列。

[0115]SEQ ID 13来自Thermotoga martima的腺苷酸激酶的蛋白序 列。

[0116]SEQ ID 14来自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)的腺苷酸激酶 的蛋白序列。

[0117]SEQ ID 15来自Archaeoglobus fulgidus的腺苷酸激酶的蛋白 序列。

[0118]SEQ ID 16来自Pyrococcus abyssi的腺苷酸激酶(单体腺苷酸 激酶(AdkE))的蛋白序列。

[0119]SEQ ID 17来自激烈热球菌的腺苷酸激酶的蛋白序列，所述 激酶被遗传工程改造以提供改进的稳定性。

[0120]SEQ ID 18来自Pyrococcus horikoshii的腺苷酸激酶的蛋白序 列，所述激酶被遗传工程改造以提供改进的稳定性。

[0121]SEQ ID 19来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的蛋白序列， 所述激酶被遗传工程改造以提供改进的稳定性。

[0122]SEQ ID 20来自Thermatoga mantlma的乙酸激酶的蛋白序列。

[0123]SEQ ID 21来自Pyrococcus horikoshii的丙酮酸激酶的蛋白序 列。

[0124]SEQ ID 22来自硫磺矿硫化叶菌的丙酮酸激酶的蛋白序列。

[0125]SEQ ID 23来自Thermotoga maritima的丙酮酸激酶的蛋白序 列。

[0126]SEQ ID 24来自激烈热球菌的丙酮酸激酶的蛋白序列

[0127]SEQ ID 25来自Methanosarcina thermophila的乙酸激酶的蛋 白序列。

[0128]SEQ ID 26编码来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的DNA 序列。

[0129]SEQ ID 27编码来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的DNA 序列，其中已经优化了密码子使用，用于在大肠杆菌(E-coli)中表达基 因。

[0130]SEQ ID 28编码来自Thermotoga maritima的腺苷酸激酶的 DNA序列。

[0131]SEQ ID 29编码来自Thermotoga maritima的腺苷酸激酶的 DNA序列，其中已经优化了密码子使用，用于在大肠杆菌中表达基因。

[0132]SEQ ID 30编码来自Archaeoglobus fulgidus的腺苷酸激酶的 DNA序列，其中已经优化了密码子使用，用于在大肠杆菌中表达基因。实施例1
对嗜酸热硫化叶菌AK的分析方案

[0133]指示物是合适固体支持物上的100微升的1mg/ml腺苷酸激酶 制剂，并且按需要接受处理过程。

[0134]热失活步骤是任选的。这包括将样品加热至指示物AK许可的 温度，但在高于其中任何嗜温性AKs均被变性的温度。典型地，通过 在80℃温育10分钟实现这一步骤。

[0135]洗涤步骤是可选的，可以并入此步骤，以便在发现用于实施处 理的任何痕量物质干扰分析时，去除该痕量物质。

[0136]随后向含有ADP底物(例如，得自Celsis，Biothema，Promega的 试剂)的管中加入指示物，浓度是13.5μM，在15mM MgAc、1mM EDTA 缓冲液pH 6.8中稀释，并在70℃温育20分钟。

[0137]冷却样品至室温，加入萤光素/萤光素酶底物(ATP试剂，Thermo Life Science)。温育分析物一段所需的时间，用发光计读取样品。实施例2
天然腺苷酸激酶的纯化

[0138]从24个不同嗜热和嗜高热微生物(表1)产生生物材料。

[0139]表示出八种古细菌成员和十六种不同的好氧菌和厌氧菌。通过 利用选择性吸附和解吸附的亲和层析—来自Cibacron Blue 3A(Blue Sepharose)—纯化出来自这些生物体中每一种的AKs。经过凝胶过滤进 一步表征和纯化(Superdex G200)所有的酶。这使得能够鉴定主要的AK 部分和估计分子量。实施例3
分析天然腺苷酸激酶的热稳定性

[0140]评价从来自嗜热性生物体的生物材料分离的天然腺苷酸激酶在 70℃、80℃和90℃的热稳定性，结果表示在图1中。

[0141]通过利用选择性吸附和解吸附的亲和层析—来自Cibacron Blue 3A(Blue Sepharose)—从生物材料分离出腺苷酸激酶。将从柱子洗脱的 样品稀释1∶10 000倍，随后将每一样品10μl加入微量滴定孔。将2.5μl 的腺苷三磷酸双磷酸酶加入到每孔，用以破坏洗脱缓冲液中存在的 ATP，在37℃温育30分钟。于65℃热处理20分钟，使腺苷三磷酸双 磷酸酶失活。

[0142]加入ADP底物，在70℃(图A)、80℃(图B)或90℃(图C)温育 30分钟并冷却至25℃，随后加入10μl的D-萤光素-萤光素酶试剂。产 生的ATP测定为平板上发光计上的RLU。实施例4
重组腺苷酸激酶的表达和纯化

[0143]得到表达代表性热稳定AKs的克隆，产生来自嗜热嗜酸古细菌， 嗜酸热硫化叶菌和嗜热性细菌，嗜热芽孢杆菌的重组热稳定AKs。将 质粒转移到大肠杆菌中，细胞提取物在相应于期望的AKs分子量处显 示出含有蛋白条带。在合适的温度下(对于嗜酸热硫化叶菌AK是80℃， 对于嗜热芽孢杆菌AK是60℃)温育后，测定热稳定AK的活性。

[0144]建立对两种热稳定AKs的纯化方法，其包括在80℃温育20分 钟进行初步的热处理，以便失活和凝集来自大肠杆菌的蛋白质，随后 进行亲和层析和凝胶过滤。亲和层析包括使酶吸附于Blue Sepharose， 随后用低浓度AK辅因子(AMP+ATP和镁离子)特异性地洗脱。洗脱缓 冲液中的ATP和AMP(Sigma)通过与嗜温性腺苷三磷酸双磷酸酶温育 而降解，嗜温性腺苷三磷酸双磷酸酶经随后的热处理容易地失活。凝 胶过滤层析被提高至利用制备级Superdex柱，以使得能够制备大量的 两种酶。

[0145]设计引物，用于对来自筛选候选的天然酶期间鉴定出的嗜热性 生物的AK基因进行PCR扩增。

[0146]用分别确定的生长条件培养热稳定微生物，分离基因组DNA， 将其用作PCR扩增每一生物体腺苷酸激酶基因的模板。将经PCR扩增 的来自嗜热性生物Thermotoga maritima、Aeropyrum pernix、嗜酸热硫 化叶菌和硫磺矿硫化叶菌的腺苷酸激酶基因亚克隆入载体pET28a，并 转化入表达稀有tRNAs的密码子增强的大肠杆菌菌株(codon enhanced E.coli strain)(Zdanovsky et al，2000)。此大肠杆菌菌株适于增强富含AT 的基因的表达水平。

[0147]转化成功与否通过小量表达试验(mini-expression study)评定，通 过对与IPTG温育之前和之后的培养上清进行SDS-PAGE来分析结果。 也在包含热处理步骤之后用SDS-PAGE分析上清液，热处理步骤由在 SDS-PAGE凝胶上跑胶之前加热样品至80℃20分钟，以去除样品中存 在的对热不稳定的蛋白质所构成。序列
Seq IDs

[0148]1-来自硫磺矿硫化叶菌的腺苷酸激酶

[0149]MKIGIVTGIP GVGKTTVLSF ADKILTEKGI SHKIVNYGDY MLNTALKEGY
VKSRDEIRKL QIEKQRELQA LAARRIVEDL SLLGDEGIGL IDTHAVIRTP
AGYLPGLPRH VIEVLSPKVI FLLEADPKII LERQKRDSSR ARTDYSDTAV
INEVIQFARY SAMASAVLVG ASVKVVVNQE GDPSIAASEI INSLM

[0150]2-来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶

[0151]MKIGIVTGIP GVGKSTVLAK VKEILDNQGI NNKIINYGDF MLATALKLGY
AKDRDEMRKL SVEKQKKLQI DAAKGIAEEA RAGGEGYLFI DTHAVIRTPS
GYLPGLPSYV ITEINPSVIF LLEADPKIIL SRQKRDTTRN RNDYSDESVI
LETINFARYA ATASAVLAGS TVKVIVNVEG DPSIAANEII RSMK

[0152]3-来自Sulfolobus tokodaii的腺苷酸激酶

[0153]MSKMKIGIVT GIPGVGKTTV LSKVKEILEE KKINNKIVNY GDYMLMTAMK
LGYVNNRDEM RKLPVEKQKQ LQIEAARGIA NEAKEGGDGL LFIDTHAVIR
TPSGYLPGLP KYVIEEINPR VIFLLEADPK VILDRQKRDT SRSRSDYSDE
RIISETINFA RYAAMASAVL VGATVKIVIN VEGDPAVAAN EIINSML

[0154]4-来自激烈热球菌的腺苷酸激酶

[0155]MPFVVIITGI PGVGKSTITR LALQRTKAKF RLINFGDLMF EEAVKAGLVK
HRDEMRKLPL KIQRELQMKA AKKITEMAKE HPILVDTHAT IKTPHGYMLG
LPYEVVKTLN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL
NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVNEYA

[0156]5-来自Pyrococcus horikoshii的腺苷酸激酶

[0157]MPFVVIITGI PGVGKSTITK LALQRTRAKF KLINFGDLMF EEALKLKLVK
HRDEMRKLPL EVQRELQMNA AKKIAEMAKN YPILLDTHAT IKTPHGYLLG
LPYEVIKILN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL
NRAAAITYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVKEYA

[0158]6-来自Pyrococcus abyssi的腺苷酸激酶

[0159]MSFVVIITGI PGVGKSTITR LALQRTKAKF KLINFGDLMF EEAVKAGLVN
HRDEMRKLPL EIQRDLQMKV AKKISEMARQ QPILLDTHAT IKTPHGYLLG
LPYEVIKTLN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL
NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVEILDL AVKEYA

[0160]7-来自Methanococcus thermolithotrophicus的腺苷酸激酶

[0161]MKNKLVVVTG VPGVGGTTIT QKAMEKLSEE GINYKMVNFG TVMFEVAQEE
NLVEDRDQMR KLDPDTQKRI QKLAGRKIAE MVKESPVVVD THSTIKTPKG
YLPGLPVWVL NELNPDIIIV VETSGDEILI RRLNDETRNR DLETTAGIEE
HQIMNRAAAM TYGVLTGATV KIIQNKNNLL DYAVEELISV LR

[0162]8-来自Methanococcus voltae的腺苷酸激酶

[0163]MKNKVVVVTG VPGVGSTTSS QLAMDNLRKE GVNYKMVSFG SVMFEVAKEE
NLVSDRDQMR KMDPETQKRI QKMAGRKIAE MAKESPVAVD THSTVSTPKG
YLPGLPSWVL NELNPDLIIV VETTGDEILM RRMSDETRVR DLDTASTIEQ
HQFMNRCAAM SYGVLTGATV KIVQNRNGLL DQAVEELTNV LR

[0164]9-来自Methanococcus jannaschii的腺苷酸激酶

[0165]MMMMKNKVVV IVGVPGVGST TVTNKAIEEL KKEGIEYKIV NFGTVMFEIA
KEEGLVEHRD QLRKLPPEEQ KRIQKLAGKK IAEMAKEFNI VVDTHSTIKT
PKGYLPGLPA WVLEELNPDI IVLVEAENDE ILMRRLKDET RQRDFESTED
IGEHIFMNRC AAMTYAVLTG ATVKIIKNRD FLLDKAVQEL IEVLK

[0166]10-来自Methanopyrus kandleri的腺苷酸激酶

[0167]MGYVIVATGV PGVGATTVTT EAVKELEGYE HVNYGDVMLE IAKEEGLVEH
RDEIRKLPAE KQREIQRLAA RRIAKMAEEK EGIIVDTHCT IKTPAGYLPG
LPIWVLEELQ PDVIVLIEAD PDEIMMRRVK DSEERQRDYD RAHEIEEHQK
MNRMAAMAYA ALTGATVKII ENHDDRLEEA VREFVETVRS L

[0168]11-来自Methanotorris igneus的腺苷酸激酶

[0169]MKNKVVVVTG VPGVGGTTLT QKTIEKLKEE GIEYKMVNFG TVMFEVAKEE
GLVEDRDQMR KLDPDTQKRI QKLAGRKIAE MAKESNVIVD THSTVKTPKG
YLAGLPIWVL EELNPDIIVI VETSSDEILM RRLGDATRNR DIELTSDIDE
HQFMNRCAAM AYGVLTGATV KIIKNRDGLL DKAVEELISV LK

[0170]12-来自Pyrobaculum aerophilum的腺苷酸激酶

[0171]MKIVIVALPG SGKTTILNFV KQKLPDVKIV NYGDVMLEIA KKRFGIQHRD
EMRKKIPVDE YRKVQEEAAE YIASLTGDVI IDTHASIKIG GGYYPGLPDR
IISKLKPDVI LLLEYDPKVI LERRKKDPDR FRDLESEEEI EMHQQANRYY
AFAAANAGES TVHVLNFRGK PESRPFEHAE VAAEYIVNLI LRTRQKS

[0172]13-来自Thermotoga maritima的腺苷酸激酶

[0173]MMAYLVFLGP PGAGKGTYAK RIQEKTGIPH ISTGDIFRDI VKKENDELGK
KIKEIMEKGE LVPDELVNEV VKRRLSEKDC EKGFILDGYP RTVAQAEFLD
SFLESQNKQL TAAVLFDVPE DVVVQRLTSR RICPKCGRIY NMISLPPKED
ELCDDCKVKL VQRDDDKEET VRHRYKVYLE KTQPVIDYYG KKGILKRVDG
TIGIDNVVAE VLKIIGWSDK

[0174]14-来自敏捷气热菌的腺苷酸激酶

[0175]MKVRHPFKVV VVTGVPGVGK TTVIKELQGL AEKEGVKLHI VNFGSFMLDT
AVKLGLVEDR DKIRTLPLRR QLELQREAAK RIVAEASKAL GGDGVLIIDT
HALVKTVAGY WPGLPKHVLD ELKPDMIAVV EASPEEVAAR QARDTTRYRV
DIGGVEGVKR LMENARAASI ASAIQYASTV AIVENREGEA AKAAEELLRL
IKNL

[0176]15-来自Archaeoglobus fulgidus的腺苷酸激酶

[0177]MNLIFLGPPG AGKGTQAKRV SEKYGIPQIS TGDMLREAVA KGTELGKKAK
EYMDKGELVP DEVVIGIVKE RLQQPDCEKG FILDGFPRTL AQAEALDEML
KELNKKIDAV INVVVPEEEV VKRITYRRTC RNCGAVYHLI YAPPKEDNKC
DKCGGELYQR DDKEETVRE RYRVYKQNTE PLIDYYRKKG ILYDVDGTKD
IEGVWKEIEA ILEKIKS

[0178]16-来自Pyrococcus abyssi的单体腺苷酸激酶(AdkE)

[0179]MNILIFGPPG SGKSTQARRI TERYGLTYIA SGDIIRAEIK ARTPLGIEME
RYLSRGDLIP DTIVNTLIIS KLRRVRENFI MDGYPRTPEQ VITLENYLYD
HGIKLDVAID IYITKEESVR RISGRRICSK CGAVYHVEFN PPKVPGKCDI
CGGELIQRPD DRPEIVEKRY DIYSKNMEPI IKFYQKQGIY VRIDGHGSID
EVWERIRPLL DYIYNQENRR
实施例5
重组腺苷酸激酶的热稳定性分析

[0180]评价粗提大肠杆菌细胞裂解物中的重组tAK酶的热稳定性。

[0181]基本上如实施例4所述培养细胞，经超声波裂解细胞。在80℃ 热处理30分钟之前和之后，随后按10倍连续稀释，测定粗提物中的 AK活性。

[0182]结果(参见图4)表明，宽范围的重组酶适于应用在本发明方法中。 特别优选的AKs是来自T.maritima、A.fulgidus和嗜酸热硫化叶菌的酶。 这些酶在需要的情况下，可能为生物发光分析提供更大的动态范围， 从而提供更进一步的灵敏度。实施例6

[0183]特定热稳定腺苷酸激酶的性质表明了它们作为TSE失活指示物 的价值

[0184]朊病毒分子表现出明显高的粘附于钢表面的倾向。

[0185]为了开发出验证朊病毒除污染程序的指示物，具有与朊病毒分 子相似性质的激酶是有优势的。为了研究这一概念，评价了不同重组 热稳定腺苷酸激酶与指定表面的结合情况(参见图5)。

[0186]评价激酶与之前已被封闭的平板的结合情况。通过加入5％脱脂 奶封闭标准聚苯乙烯微量滴定板的表面。去除脱脂奶并将来自 Archaeoglobus fulgidus(Afu)、Thermotoga maritime(Tma)和嗜酸热硫化 叶菌(Sac)的热稳定腺苷酸激酶的稀释物施加在平板上。洗涤之后，如 上述标准分析方法(实施例1)测定结合的激酶的量。结果表明，与任一 另外两种激酶相比，Sac激酶对封闭平板表现出显著高的结合。虽然酶 的比活性不相同，但是Afu和Tma激酶均表现出比Sac激酶高的活性， 从而结合的实际差异甚至比图中表现的更大。

[0187]由于脱脂奶是用于降低蛋白质与平板结合的常用封闭剂，这些 结果说明，Sac激酶具有与这些试验中应用的表面(聚苯乙烯)疏水吸附 的极强倾向性。酶的性质—与对朊病毒与钢表面中观察到的相似—意 味着，它是评价宽范围的TSE失活和/或去除过程的极有效的指示物。 Sac激酶以非常相似的方式与不锈钢结合，并且表现出结合协同性(即， 在低浓度时，结合活性和酶量之间存在对数关联(而不是线性关联)，这 表明，它在此表面上有聚集性质，这与在朊病毒中所见相似)。

[0188]酶的这种性质表明了其作为直接吸附型指示物的潜能，其中激 酶被直接吸附在适当的支持物上，而不是共价连接在支持物上。在这 种情况下，指示物通过评价一种过程从表面去除物质的能力而起作用， 并被广泛应用以便监测洗涤和除污染过程。实施例7
对腺苷酸激酶进行遗传修饰，以改进稳定性

[0189]应用本领域技术人员已知的标准方法，在分别如实施例8-10和 SEQ IDs 17-19所示的来自激烈热球菌、P.horikoshii和嗜酸热硫化叶菌 的AK基因中构建位点定向突变。

[0190]除了在每一基因中鉴定的特定变化之外，嗜酸热硫化叶菌序列 中下划线的区域形成古细菌腺苷酸激酶三聚体结构的核心包装区(core packing region)。因此，干扰此区域包装的氨基酸替换可能在降低酶的 热稳定性和物理稳定性中起主要作用。相反地，改进核心包装的氨基 酸替换，特别是具有大的侧链的疏水残基，可以使酶对热或其它过程 稳定。因此，除了已描述的特定突变，也应用许多“选择性”方法， 其中利用这些区域中的相关基因序列的局部基因改组(基本上如 Stemmer(1994)Nature 370：389-391和Crameri et al(1996)Nature Biotech.14：315-319所述)和应用简并寡核苷酸或修饰核苷酸混合物进 行基于PCR的随机诱变(例如，Vartanian et al(1996)Nucleic Acid Res.24：2627-2633)。通过在大肠杆菌中重组表达和在高温下快速分析裂 解细胞中的腺苷酸激酶活性时，这些修饰中的许多表现出改变的稳定 性。实施例8
来自激烈热球菌的腺苷酸激酶，被遗传工程改造以提供改进的稳定性 (SEQ ID NO.17)。

[0191]MPFVVIITGI PGVGKSTITR LALQRTKAKF RLINFGDLMF EEAVKAGLVK
HRDEMRKLPL(K变为E)IQRELQMKAAKKI(T变为A)EMAKE HPILVDTHAT
IKTPHGY(M变为L)LG LPYEVVKTLN PNFIVIIEAT PSEILGRRLR
DLKRDRDVET EEQIQRHQDL NRAAAIAYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA
VNELVKILDL AVNEYA

[0192]示出的在一个位点或多个位点或所有位点的突变改变酶的热稳 定性。除了被强调的这三种限定变化之外，位点157处的丙氨酸变为 另一小的疏水残基(如I、L)或较大的疏水残基(如F)增加重组蛋白的热 稳定性。因此，在这些位点处的改变的组合可能产生35种变体。将氨 基酸157改变为极性残基如T(如在P.horikoshii的AdkA中的等价位 点所见)、S、Y、D、E、K、R，导致稳定性减少。实施例9
来自Pyrococcus horikoshii的腺苷酸激酶，被遗传工程改造以提供改进 的稳定性(SEQ ID NO.18)。

[0193]粗体或下划线所示残基中的任一或两者的改变增加酶的热稳定 性(可能产生3种变体)。

[0194]MPFVVIITGI   PGVGKSTITK LALQRTRAKF KLINFGDLMF EEALKL GLVK
HRDEMRKLPL   EVQRELQMNA AKKIAEMAKN YPILLDTHAT IKTPHGYLLG
LPYEVIKILN   PNFIVIIEAT PSEILGRRLR DLKRDRDVET EEQIQRHQDL
NRAAAI AYAM HSNALIKIIE NHEDKGLEEA VNELVKILDL AVKEYA
实施例10
来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶，被遗传工程改造以提供改进的稳 定性(SEQ ID NO.19)。

[0195]所示的下划线残基的改变可以增加酶的热稳定性。

[0196]MKIGIVTGIP GVGKSTVLAK VKEILDNQGI NNKIINYGDF MLATALKLGY
AKDRDEMRKL SVEKQKKLQI DAAKGIAEEA RAGGEGYLFI DTHA VIR TPS
GY(A变为M)PGL PSYV ITEINPS VIF  LLEADPKIIL SRQKRDTTRN
RNDYSDESVI L ETI NFARYA  ATASAVLAGS TVKVIVNVEG DPSIAANEII
RSMK
实施例11
用于验证TSE失活的腺苷酸激酶指示物

[0197]开发在增加的温度和pH下与TSE材料的蛋白酶失活应用的基 于AK的朊病毒指示物。指示物1

[0198]用纯化的重组嗜酸热硫化叶菌AK制剂(如实施例4所述)包被聚 碳酸酯支持物。在磷酸缓冲盐水pH 7.4(PBS)中的5％(w/v)山梨醇、 10mg/ml牛血清白蛋白(Fraction V；Sigma chemical company)存在的情 况下，将酶配制为浓度1mg/ml。将100μl体积在支持物上干燥，22℃ 持续1小时。指示物2

[0199]用100微升的制剂包被聚苯乙烯支持物，所述制剂含有Tris缓 冲盐水(TBS)pH 7.4中的1mg/ml嗜酸热硫化叶菌AK、1mM色氨酸、 5％(w/v)山梨醇，4℃下干燥24小时。指示物3

[0200]用基于二硫键形成的方法，将100微升来自硫磺矿硫化叶菌的 热稳定腺苷酸激酶的1mg/ml制剂交联到柔性聚苯乙烯棒上，制备第三 种指示物。将重组热稳定腺苷酸激酶用异双功能剂硫代琥珀酰亚胺基 6-(3′-[2-吡啶基二硫]-丙酰胺基)己酸酯(SPDP；Pierce chemical company， UK)衍生化，SPDP：蛋白质的比率是1至3之间。随后通过与还原剂 二硫苏糖醇(DTT)反应还原衍生化的激酶，通过透析去除还原剂，使激 酶与马来酰亚胺衍生的聚苯乙烯棒反应。蛋白酶处理

[0201]设定器械洗浴(wash bath)在60℃操作，加入碱性蛋白酶制剂， 得到1.5至2mg/ml之间的、在pH 12缓冲的酶(如在浴温度下测定)。 适当的阴离子去污剂也可以在需要时包含在制剂中。在所述条件下温 育指示物30分钟。随后去除指示物，用蒸馏水洗涤1次。随后如实施 例1所述测定酶活性，用发光计测定发光情况。腺苷酸激酶的标准曲线

[0202]AK酶的标准曲线制备如下：制备纯化的嗜酸热硫化叶菌AK的 连续稀释物—从10微克/ml至1fg/ml，在50mM Tris、25mM MESNA， pH 7.3中制备。向微量滴定板的每孔中加入100微升酶，并向每孔加 入100微升135微摩尔ADP、15mM MgAc、1mM EDTA。对在30℃、 50℃和70℃温育20分钟的分析平板，绘制三条单独的标准曲线。温育 后加入30微升萤光素/萤光素酶试剂(Biothema)，在发光计(Orion， Berthold)中读取信号，结果显示于图3。TSE失活的验证

[0203]针对激酶的标准曲线评价激酶活性水平。对于带有发光值大于 1,000,000相对光单位(RLU)的100微克激酶的指示物而言，如标准曲 线所评价，小于4000RLU的发光值相当于激酶浓度下降6个对数级， 小于500 RLU的发光值相当于激酶浓度下降8个对数级。

[0204]在上述蛋白酶消化条件下，(2mg/ml指名为MC3的碱性蛋白酶， 在pH12的缓冲制剂中，于60℃消化30分钟)，我们证明，在VM小 鼠中生物分析的BSE-301V株的感染性水平降低约8个对数级。在相 同条件下，如上制备的AK指示物的RLU从超过1,000,000(未处理) 降低到低于500RLU。因此，激酶浓度降低8个对数级相当于BSE的 感染性降低8个对数级。应用本事实，可能监测激酶浓度并将其与BSE 感染性水平的降低程度关联起来。验证步骤的应用

[0205]将用于不知道感染了任何形式CJD的患者的常规外科或常规神 经外科中的一套外科器械在使用后送回医院的灭菌设备室中。在设定 于60℃操作30分钟的洗涤器/消毒器中，用碱性蛋白酶MC3制剂常规 清洁来准备器械。如上述的一种或多种AK指示物包含在处理浴中。 处理后，以及在器械送至常规高压灭菌之前，移去指示物，进行快速 分析以验证该过程是有效的。表现出6个对数级或8个对数级的活性 丧失的分析结果，如过程的参数所限定，是任何器械可以被进一步处 理前所必需的。成功处理之后，器械可以被准备，用于在需要时进行 其它灭菌步骤如高压灭菌。实施例12
乙酸激酶和丙酮酸激酶的表达

[0206]根据实施例4的方法，我们表达乙酸激酶和丙酮酸激酶：

[0207]20-来自Thermatoga maritima的乙酸激酶

[0208]MRVLVINSGS SSIKYQLIEM EGEKVLCKGI AERIGIEGSR LVHRVGDEKH
VIERELPDHE EALKLILNTL VDEKLGVIKD LKEIDAVGHR VVHGGERFKE
SVLVDEEVLK AIEEVSPLAP LHNPANLMGI KAAMKLLPGV PNVAVFDTAF
HQTIPQKAYL YAIPYEYYEK YKIRRYGFHG TSHRYVSKRA AEILGKKLEE
LKIITCHIGN GASVAAVKYG KCVDTSMGFT PLEGLVMGTR SGDLDPAIPF
FIMEKEGISP QEMYDILNKK SGVYGLSKGF SSDMRDIEEA ALKGDEWCKL
VLEIYDYRIA KYIGAYAAAM NGVDAIVFTA GVGENSPITR EDVCSYLEFL
GVKLDKQKNE ETIRGKEGII STPDSRVKVL VVPTNEELMI ARDTKEIVEK
IGR

[0209]21-来自Pyrococcus horikoshii的丙酮酸激酶

[0210]MRRMKLPSHK TKIVATIGPA TNSKKMIKKL IEAGMNVARI NFSHGTFEEH
AKIIEMVREQ SQKLDRRVAI LADLPGLKIR VGEIKGGYVE LERGEKVTLT
TKDIEGDETT IPVEYKDFPK LVSKGDVIYL SDGYIVLRVE DVKENEVEAV
VISGGKLFSR KGINIPKAYL PVEAITPRDI EIMKFAIEHG VDAIGLSFVG
NVYDVLKAKS FLERNGAGDT FVIAKIERPD AVRNFNEILN AADGIMIARG
DLGVEMPIEQ LPILQKRLIR KANMEGKPVI TATQMLVSMT MEKVPTRAEV
TDVANAILDG TDAVMLSEET AVGKFPIEAV EMMARIAKVT EEYRESFGIT
RMREFLEGTK RGTIKEAITR SIIDAICTIG IKFILTPTKT GRTARLISRF
KPKQWILAFS TREKVCNNLM FSYGVYPFCM EEGFNENDIV RLIKGLGLVG
SDDIVLMTEG KPIEKTVGTN SIKIFQIA

[0211]22-来自硫磺矿硫化叶菌的丙酮酸激酶

[0212]MRKTKIVATL GPSSEEKVKE LAEYVDVFRI NFAHGDETSH RKYFDLIRTY
APESSIIVDL PGPKLRLGEL KEPIEVKKGD KIVFSQKDGI PVDDELFYSA
VKENSDILIA DGTIRVRVKS KAKDRVEGTV IEGGILLSRK GINIPNVNLK
SGITDNDLKL LKRALDLGAD YIGLSFVISE NDVKKVKEFV GDEAWVIAKI
EKSEALKNLT NIVNESDGIM VARGDLGVET GLENLPLIQR RIVRTSRVFG
KPVILATQVL TSMINSPIPT RAEIIDISNS IMQGVDSIML SDETAIGNYP
VESVRTLHNI ISNVEKSVKH RPIGPLNSES DAIALAAVNA SKVSKADVIV
VYSRSGNSIL RVSRLRPERN IIGVSPDPRL AKKFKLCYGV IPISINKKMQ
SIDEIIDVSA KLMQEKIKDL KFKKIVIVGG DPKQEAGKTN FVIVKTLEQQ KK

[0213]23-来自Thermotoga maritima的丙酮酸激酶

[0214]MRSTKIVCTV GPRTDSYEMI EKMIDLGVNV FRINTSHGDW NEQEQKILKI
KDLREKKKKP VAILIDLAGP KIRTGYLEKE FVELKEGQIF TLTTKEILGN
EHIVSVNLSS LPKDVKKGDT ILLSDGEIVL EVIETTDTEV KTVVKVGGKI
THRRGVNVPT ADLSVESITD RDREFIKLGT LHDVEFFALS FVRKPEDVLK
AKEEIRKHGK EIPVISKIET KKALERLEEI IKVSDGIMVA RGDLGVEIPI
EEVPIVQKEI IKLSKYYSKP VIVATQILES MIENPFPTRA EVTDIANAIF
DGADALLLTA ETAVGKHPLE AIKVLSKVAK EAEKKLEFFR TIEYDTSDIS
EAISHACWQL SESLNAKLII TPTISGSTAV RVSKYNVSQP IVALTPEEKT
YYRLSLVRKV IPVLAEKCSQ ELEFIEKGLK KVEEMGLAEK GDLVVLTSGV
PGKVGTTNTI RVLKVD

[0215]24-来自激烈热球菌的丙酮酸激酶

[0216]MRRVKLPSHK TKIVATIGPA TNSRKMIKQL IKAGMNVARI NFSHGSFEEH
ARVIEIIREE AQKLDRRVAI LADLPGLKIR VGEIKGGYVE LKRGEKVILT
TKDVEGDETT IPVDYKGFPN LVSKGDIIYL NDGYIVLKVE NVRENEVEAV
VLSGGKLFSR KGVNIPKAYL PVEAITPKDF EIMKFAIEHG VDAIGLSFVG
SVYDVLKAKS FLEKNNAEDV FVIAKIERPD AVRNFDEILN AADGIMIARG
DLGVEMPIEQ LPILQKKLIR KANMEGKPVI TATQMLVSMT TEKVPTRAEV
TDVANAILDG TDAVMLSEET AIGKFPIETV EMMGKIAKVT EEYRESFGLS
RIREFMEIKK GTIKEAITRS IIDAICTIDI KFILTPTRTG RTARLISRFK
PKQWILAFST NERVCNNLMF SYGVYPFCLE EGFDENDIVR LIKGLGLVES
DDMVLMTEGK PIEKTVGTNS IKIFQIA

[0217]25-来自Methanosarcina thermophila的乙酸激酶

[0218]MKVLVINAGS SSLKYQLIDM TNESALAVGL CERIGIDNSI ITQKKFDGKK
LEKLTDLPTH KDALEEVVKA LTDDEFGVIK DMGEINAVGH RVVHGGEKFT
TSALYDEGVE KAIKDCFELA PLHNPPNMMG ISACAEIMPG TPMVIVFDTA
FHQTMPPYAY MYALPYDLYE KHGVRKYGFH GTSHKYVAER AALMLGKPAE
ETKIITCHLG NGSSITAVEG GKSVETSMGF TPLEGLAMGT RCGSIDPAIV
PFLMEKEGLT TREIDTLMNK KSGVLGVSGL SNDFRDLDEA ASKGNRKAEL
ALEIFAYKVK KFIGEYSAVL NGADAVVFTA GIGENSASIR KRILTGLDGI
GIKIDDEKNK IRGQEIDIST PDAKVRVFVI PTNEELAIAR ETKEIVETEV
KLRSSIPV
实施例13
热稳定腺苷酸激酶作为TSE因子蛋白水解失活的指示物

[0219]用在缓冲的0.2M KCI pH 12中的10μg/ml重组嗜酸热硫化叶菌 AK溶液稀释20mg/ml碱性蛋白酶贮存液，产生从2mg/ml降至0.001 μg/ml的一系列蛋白酶浓度。将100μl体积的材料加入聚苯乙烯热循环 平板，60℃温育10分钟，使得AK被碱性蛋白酶消化。随后通过加入 10μl的10×磷酸盐缓冲液pH 7中和溶液。以100μl/孔，加入15mM MgAc、1mM EDTA缓冲液中的135μM ADP。随后在热循环仪中70℃ 温育孔20分钟。加入30μl/孔的萤光素/萤光素酶(ATP)试剂(Biothema)， 迅速在发光计上对孔读数。分析结果显示于图2。

[0220]这些结果显示，在确定用于外科器械除污染的条件下，AK酶对 碱性蛋白酶消化有显著的稳定性。为了将碱性蛋白酶消化后观察到的 降低与处理后残余的活性水平相关联，应用如图3所示的标准曲线。 进而，应用TSE滴定曲线，将其与感染性水平的降低程度相关联。对 于作为指示物的应用，设计分析，以便酶活性标准曲线明确地标记有 相当于该过程的可接受除污染水平的限值/阈值。实施例14
验证应用生物去污剂的衣物洗涤循环的性能
指示物1的制备

[0221]应用基于二硫键形成的方法，将来自硫磺矿硫化叶菌的热稳定 腺苷酸激酶交联在柔性聚苯乙烯棒上，制备第一指示物。在本方法中， 将热稳定激酶用异双功能剂如硫代琥珀酰亚胺基6-(3′-[2-吡啶基二硫]- 丙酰胺基)己酸酯(SPDP；Pierce chemical company，UK)衍生化，SPDP： 蛋白质的比率是1-3之间。随后通过与还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或2- 巯基乙烷磺酸(MESNA)反应，还原衍生化的激酶，通过透析去除还原 剂，使激酶与马来酰亚胺衍生的聚苯乙烯表面反应。典型地，指示物 中存在0.1mg激酶。指示物2的制备

[0222]将来自嗜酸热硫化叶菌的热稳定腺苷酸激酶非特异性粘合在高 蛋白质结合聚苯乙烯条上，制备第二指示物。在碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6) 中制备浓度0.5-2mg/ml的激酶，缓冲液中任选地含有0.1至2％w/v 之间的稳定剂山梨醇。随后使结合缓冲液中的激酶与高蛋白质结合聚 苯乙烯条于22℃温育1-2小时(或4℃过夜)。通过在磷酸缓冲盐水中洗 涤去除残余激酶。典型地，指示物中存在0.1mg激酶。洗涤循环的验证

[0223]使洗涤器加载待洗涤物质，将指示物固定在洗涤器内适当的固 定器中(以便协助其回收)。随后进行洗涤循环。在循环完成时，移去指 示物，用基于实施例1所述分析方法的“读数器”评价激酶的残余活 性。该读数器被校准，显示出指示物中残余激酶活性的可接受“阈值” 水平。此“阈值”水平来自此前对该过程中适当性能的校准和评定。

[0224]如果读数器显示，残余激酶活性与此阈值水平相等或低于该阈 值水平，加载物已被清洗可用于进一步处理。实施例15
用蛋白酶制剂验证硬表面上诺沃克类病毒(也称为诺罗病毒 (Norovirus)、诺沃克病毒(Norwalk virus)或冬季呕吐疾病(Winter Vomiting Disease))的失活过程
指示物的制备

[0225]应用实施例14所述的二硫键介导的交联，将来自嗜酸热硫化叶 菌的0.1mg热稳定腺苷酸激酶固定在细聚苯乙烯条上，制备指示物。验证

[0226]将指示条放置在潜在污染的表面上。随后用在膏状物中配制的 具有高活性的碱性蛋白酶—蛋白酶K包被表面和指示条。(将蛋白酶K 配制在膏状物中改进了酶和表面/指示物之间的接触)，将膏状物留在表 面/指示物上1-2小时。

[0227]在处理末期，移去指示物，用实施例14所述“读数器”评价残 余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的阈值水平相等或低于 该阈值水平，则表面已被清洗可安全使用。实施例16
验证蓖麻毒蛋白的蛋白酶降解
指示物的制备

[0228]应用文中和实施例14中所述的标准的巯基-马来酰亚胺基偶联 方法，将来自Thermotoga maritima的0.1mg热稳定乙酸激酶固定在聚 碳酸酯条上，制备指示物。验证

[0229]将指示条和待除污染的物体浸没在蛋白酶溶液中，如实施例11 所示，或者将指示物连接于待除污染的表面，如实施例15所示。

[0230]随后用蛋白酶溶液处理物体/表面一段所需的时间。在处理末期， 移去指示物，用如实施例14所述的“读数器”评价残余激酶活性水平。 如果残余激酶活性与读数器的“阈值”水平相等或低于该“阈值”水 平，则该物体/表面已被清洗可安全使用。实施例17
验证TSE因子的气态臭氧失活
指示物1的制备

[0231]应用如实施例14所述的SPDP-马来酰亚胺方法，将来自嗜酸热 硫化叶菌的0.1mg热稳定腺苷酸激酶交联在刚性聚氯乙烯(PVC)支持 物上，制备第一指示物。指示物2的制备

[0232]在胺活性PVC表面存在的情况下，使嗜酸热硫化叶菌腺苷酸激 酶与二-[β-(4-叠氮水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED；Pierce chemicals) 反应，制备第二指示物。这导致激酶与表面通过酰胺键快速共价连接。验证

[0233]将指示物和受TSE污染的物品暴露于气态臭氧失活过程。在该 过程末期，移去指示物，用如实施例14所述的“读数器”评价残余激 酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的“阈值”水平相等或低于 该阈值水平，则该物品已被清洗可安全使用。实施例18
验证用于清洁内窥镜的液体化学灭菌系统(例如，Endoclens)
指示物1的制备

[0234]将来自A.fulgidus的0.1mg热稳定腺苷酸激酶化学交联(应用如 实施例14所述的基于SPDP的方法)在与内窥镜管总内径相似的管的内 表面，制备指示物。指示物2的制备

[0235]第二指示物在腺苷酸激酶不衍生化的情况下制备。修饰来自激 烈热球菌的腺苷酸激酶的基因序列，以至于重组蛋白质包括如SEQ ID 4所示的序列氨基末端上的附加半胱氨酸。如前述表达和纯化重组蛋白 质，并用DTT还原，以确保巯基可以利用。随后可以使其直接与马来 酰亚胺活化塑料反应，产生所需的交联。约1-2mg/ml含半胱氨酸酶的 制剂与如实施例14所述的衍生化方法所需的制剂相似。验证

[0236]将指示物装置串连连接到自动再处理装置上的内窥镜，随后以 正常方式处理内窥镜。在处理末期，分离指示物，用如实施例14所述 的“读数器”评价残余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的 “阈值”水平相等或低于该阈值水平，则内窥镜已被清洗可安全使用。实施例19
验证医院洗涤器-消毒器中的外科器械的清洁情况
指示物1的制备

[0237]将来自嗜酸热硫化叶菌的0.1mg热稳定腺苷酸激酶非共价连接 于不锈钢表面，制备指示物。在本实施例中，不将蛋白质共价连接在 指示部件上，原因是指示物被设计为，测定过程对表面污染物的去除 情况。将激酶配制为1-2mg/ml之间，优选地在约pH 9.6的碳酸氢盐缓 冲液中。通过在室温下温育1-2小时，将物质吸附在金属表面上。如果 需要，可以修饰金属表面，使其更具疏水性(例如，对于高严谨性洗涤， 需要额外的连接，以便确保指示物上保留足够的信号)。在不变换结合 的指示物激酶明显比例的情况下，通过洗涤指示物去除任何未连接的 激酶。指示物2的制备

[0238]将来自嗜酸热硫化叶菌的0.1mg腺苷酸激酶粘结在(应用指示物 1所述方法)不锈钢表面上，制备第二指示物，其作为含有目前用于验 证此类型清洁过程的标准污染物的制剂的一部分。这使得指示技术与 作为洗涤器-消毒器的常规验证和维护的一部分的调节部分能够接受的 方法相关。验证

[0239]指示物被包含在待处理的一批外科器械中，运行洗涤器-消毒器 循环。在运行末期，移去指示物，用如实施例14所述的“读数器”评 价残余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的“阈值”水平相 等或低于该阈值水平，则器械已清洁可安全使用。实施例20
验证对大量液体灭菌的过程
指示物1的制备

[0240]通过将来自硫磺矿硫化叶菌的0.1mg丙酮酸激酶共价连接于聚 苯乙烯条，制备第一指示物。指示物2的制备

[0241]将来自A.fulgidus的0.1mg热稳定激酶连接于半透膜如透析管 的内表面，制备第二指示物。A.fulgidus激酶含有天然发生的活性半胱 氨酸残基(即，在天然酶中不形成二硫键)，其可以与BMPH(Pierce)反 应。这产生了能够与氧化的糖反应的基团，如，例如，通过用适当的 氧化剂处理Visking管而产生。如实施例14所述配制酶，使其与氧化 的膜表面反应，产生共价连接指示物。验证

[0242]随后将指示物连接在大量液体中，进行灭菌过程(如高压灭菌， 通过氧化气体或其它化学杀菌剂)。

[0243]过程结束时，从大量液体中移去指示物，将残余的激酶活性与 限定阈值相比，实施例14所述。实施例21
蛋白酶消化后残余腺苷酸激酶活性的校准

[0244]用于评价朊病毒因子的适当失活水平的校准曲线的说明在图6 中示出。

[0245]示出的例子对于外科器械的蛋白酶处理而言的，处理条件限定 为pH 12、30℃、30分钟。

[0246]通过评价在所述条件下、在不同蛋白酶浓度下、朊病毒的失活 水平，确定出蛋白酶的浓度(图A)。在该示例中，在限定条件下，1mg/ml 浓度下，蛋白酶MC3能够提供相当于感染剂量降低6个对数级的失活 水平。在相等的蛋白酶浓度下，在相同的条件下，基本上如实施例11 所述制备的嗜酸热硫化叶菌指示物上残留的腺苷酸激酶的残余活性处 于10RLU级别(图B)。因而需要低于10RLU的值，使得允许一批器械 再使用。

[0247]任选地，建立额外的安全极限，以至于需要低于1的RLU值， 这将处理指示物后残余腺苷酸激酶活性水平与使朊病毒感染性降低7 个对数级(比设定标准的失活多1个对数级)的蛋白酶浓度关联起来。实施例22
臭氧处理后残余腺苷酸激酶活性的校准

[0248]评价朊病毒因子经臭氧处理方法失活的适当水平的说明在图7 中示出。

[0249]示出的例子是对于臭氧处理而言的，所述处理在限定期间将固 定比率的臭氧释放入灭菌室内。随后通过增加时间或减少时间，同时 增加或减少臭氧浓度，计算臭氧水平。

[0250]在图A中，示出了根据标准循环时间的分数或倍数的朊病毒失 活水平。从而，2.5个标准循环表示朊病毒失活6个对数级。在相等倍 数的臭氧循环，基本上如实施例17所述制备的指示物中残留的残余腺 苷酸激酶水平是1000RLU级别。

[0251]因而需要低于1000RLU的值，使得允许一批器械再使用。可选 地，为指示物建立额外的安全极限，以至于需要低于100的RLU值， 这将处理指示物后残余腺苷酸激酶活性水平与使朊病毒感染性降低7 个对数级(比设定标准的失活多1个对数级)的臭氧浓度关联起来。实施例23
对设计用来监测医院洗涤器-消毒器中的外科器械的常规清洁的指示物 的校准

[0252]图8示出了对校准曲线的说明，所述校准曲线用于评价应用基 于生物学(含酶)或去污剂的制剂对外科器械的常规清洁。

[0253]指示部件如实施例19所述制备。

[0254]图A示出了标准污染物通过洗涤器消毒器从限定医疗器械去除 的百分数，其中所述洗涤器消毒器用限定的洗涤器制剂运行。改变洗 涤循环的次数，用以鉴定出适当的性能水平。图B示出了如实施例17 所述制备并在与标准的污染器械相同的条件下洗涤的指示部件的残余 嗜酸热硫化叶菌激酶活性。

[0255]残余污染物水平被限定为本试验中起始物质的0.1％，这与25 分钟的洗涤时间相关。洗涤25分钟的指示物的RLU值是约100RLU。 从而，指示物可以在30分钟洗涤循环中应用，提供可接受“污染物” 去除的提示，在0.1％水平处，RLU阈值是100，或者在0.05％水平处， RLU截点(cut-off)是约25。实施例24
修改手持式卫生监测器，以便快速读出对激酶指示物的评价。

[0256]许多分析方式可以潜在地用于评价与本发明指示物相关的激酶 活性水平。这些包括管式发光计、微量滴定板发光计和多种其它方式。

[0257]特别用于评价本发明指示物上的激酶活性的一种方式是手持式 卫生监测器。目前的技术通过萤光素-萤光素酶系统检测ATP，或是在 表面上直接检测，或是通过裂解从表面去除的细菌或其它细胞而检测。

[0258]本领域技术人员将知道，此系统服从于适应检测指示部件上的 激酶，因为该系统已经具有产生和测定相应于ATP存在的光的能力。 通过改变试剂配方，加入激酶的ADP底物，能够快速测定指示物上酶 的存在。

[0259]事实上，指示物被加入一批材料并被处理。随后将指示物移去， 插入试剂管中，使ATP产生。本试剂管的配制基本上如实施例1的方 法所述，具有高纯度ADP试剂。将管温育一段限定的时间长度，如指 示物和监测过程的类型所限定。在温育末期，含ATP—由于存在残余 tAK而产生—的试剂样品被释放到含萤光素-萤光素酶的第二区室中， 产生可测定的光。

[0260]本设备不同于标准的卫生监测器，因为第一ATP-生成步骤不是 测定ATP所需的。构建这样的部件的最简单方法是，具有带2个区室 的管，所述区室通过可破隔膜分隔开，如图9所示。在第一位置插入 管中(步骤1)的指示物使得ATP产生，在温育末期，指示物自动地或手 动地被推动，到达步骤2所示的位置，在该处产生光。这种部件的宽 范围的其它构造都是可能的。可选地，可以进行热变性步骤，用以去 除内源性激酶活性和/或进行腺苷三磷酸双磷酸酶处理，用以去除内源 性ATP。如果需要，ATP生成步骤可以在增高的温度下进行。表1
被培养用以产生生物材料，用于分离热稳定AKs的嗜热性生物体列表。 生物体     结构域 生长 Topt   pHopt  1    2      3        4    5  6    7 敏捷气热菌 (Aeropyrum pernix) 酸热脂环酸芽孢杆 菌(Alicyclobacillus acidocaldarius) 嗜火产液菌 (Aquifex pyrophilus)     Bacillus caldotenax BT1 杆菌菌种PS3 嗜热芽孢杆菌 11057 嗜热芽孢杆菌     古细菌       细菌         细菌           细菌       细菌     细菌       细菌 需氧菌   需氧菌     微需氧 leeberophile (microaerophi leeberophile) 需氧菌   需氧菌 需氧菌   需氧菌 95℃   65℃     85℃       65℃   65℃ 65℃   65℃   7.0     3.5       6.5         7.0     7.0   7.0     7.0     8     9     10   11       12     13     14     15     16       17   18       19     20     21     22       23   12001   Bacillus   thermocatenulatus   Clostridium   stercocorarium   Meiothermus rubber   激烈热球菌   (Pyrococcus   furiosus)   Pyrococcus   horikoshii   伍斯氏热球菌   (pyrococcus woesei)   Rhodothermus   marinus   嗜酸热硫化叶菌   98-3   芝田硫化叶菌   (Sulfolobus shibatae)   B21   硫磺矿硫化叶菌P2   产乙醇热厌氧杆菌   (Thermoanaerobacter   ethanolicus)   Thermoanaerobacter   thermosulfurogenes   Thermobrachium   celere   Thermococcus   litoralis   水生栖热菌   (Thermus aquaticus)   YT1   Thermus caldophilus     细菌     细菌     细菌   古细菌       古细菌     古细菌     细菌     古细菌     古细菌       古细菌   细菌       细菌     细菌     古细菌     细菌       细菌   需氧菌   厌氧菌   需氧菌 厌氧菌     厌氧菌   厌氧菌   需氧菌   需氧菌   需氧菌     需氧菌 厌氧菌     厌氧菌   厌氧菌   厌氧菌   需氧菌     需氧菌     65℃       55℃       60℃     95℃         95℃       95℃       70℃       75℃       75℃         75℃     65℃         65℃       60℃       85℃       70℃         70℃    7.0    7.0    6.5  7.5      7.0    7.0    6.5    2.5    2.5      2.5  6.0      6.5    7.5    6.5    8.0      8.0    24  GK24  嗜热栖热菌  (Thermus  thermophilus)HB8       细菌       需氧菌       70℃   8.0
                               序列表
<110>健康保护机构
J·M·萨顿
N·D·H·雷文
<120>生物指示物
<130>P26205WO-MRM
<150>GB 0406427.5
<151>2004-03-22
<160>30
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>195
<212>PRT
<213>硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)
<400>1
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Phe Ala Asp Lys Ile Leu Thr Glu Lys Gly Ile Ser His
            20                  25                  30
Lys Ile Val Asn Tyr Gly Asp Tyr Met Leu Asn Thr Ala Leu Lys Glu
        35                  40                  45
Gly Tyr Val Lys Ser Arg Asp Glu Ile Arg Lys Leu Gln Ile Glu Lys
    50                  55                  60
Gln Arg Glu Leu Gln Ala Leu Ala Ala Arg Arg Ile Val Glu Asp Leu
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Gly Asp Glu Gly Ile Gly Leu Ile Asp Thr His Ala Val
                85                  90                  95
Ile Arg Thr Pro Ala Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Arg His Val Ile
            100                 105                 110
Glu Val Leu Ser Pro Lys Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys
        115                 120                 125
Ile Ile Leu Glu Arg Gln Lys Arg Asp Ser Ser Arg Ala Arg Thr Asp
    130                 135                 140
Tyr Ser Asp Thr Ala Val Ile Asn Glu Val Ile Gln Phe Ala Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ala Met Ala Ser Ala Val Leu Val Gly Ala Ser Val Lys Val Val
                165                 170                 175
Val Asn Gln Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Ser Glu Ile Ile Asn
            180                 185                 190
Ser Leu Met
        195
<210>2
<211>194
<212>PRT
<213>嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)
<400>2
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr
1               5                   10                  15
Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn
            20                  25                  30
Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu
        35                  40                  45
Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys
    50                  55                  60
Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile
                85                  90                  95
Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Val Ile Thr
            100                 105                     110
Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile
        115                 120                 125
Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val
                165                 170                 175
Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser
            180                 185                 190
Met Lys
<210>3
<211>197
<212>PRT
<213>Sulfolobus tokodaii
<400>3
Met Ser Lys Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly
1               5                   10                  15
Lys Thr Thr Val Leu Ser Lys Val Lys Glu Ile Leu Glu Glu Lys Lys
            20                  25                  30
Ile Asn Asn Lys Ile Val Asn Tyr Gly Asp Tyr Met Leu Met Thr Ala
        35                  40                  45
Met Lys Leu Gly Tyr Val Asn Asn Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro
    50                  55                  60
Val Glu Lys Gln Lys Gln Leu Gln Ile Glu Ala Ala Arg Gly Ile Ala
65                  70                  75                  80
Asn Glu Ala Lys Glu Gly Gly Asp Gly Leu Leu Phe Ile Asp Thr His
                85                  90                  95
Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Lys Tyr
            100                 105                 110
Val Ile Glu Glu Ile Asn Pro Arg Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp
        115                 120                 125
Pro Lys Val Ile Leu Asp Arg Gln Lys Arg Asp Thr Ser Arg Ser Arg
    130                 135                 140
Ser Asp Tyr Ser Asp Glu Arg Ile Ile Ser Glu Thr Ile Asn Phe Ala
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Ala Ala Met Ala Ser Ala Val Leu Val Gly Ala Thr Val Lys
                165                 170                 175
Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Asp Pro Ala Val Ala Ala Asn Glu Ile
            180                 185                 190
Ile Asn Ser Met Leu
        195
<210>4
<211>196
<212>PRT
<213>激烈热球菌(pyrococcus furiosus)
<400>4
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Arg Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu
        35                  40                  45
Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Lys Ile Gln Arg
    50                  55                  60
Glu Leu Gln Met Lys Ala Ala Lys Lys Ile Thr Glu Met Ala Lys Glu
65                  70                  75                  80
His Pro Ile Leu Val Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly
                85                  90                  95
Tyr Met Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Val Lys Thr Leu Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile
    130                 135                 140
Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
His Ser Asn Ala Leu 1le Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly
                165                 170                 175
Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val
            180                 185                 190
Asn Glu Tyr Ala
        195
<210>5
<211>196
<212>PRT
<213>Pyrococcus horikoshii
<400>5
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Ile Thr Lys Leu Ala Leu Gln Arg Thr Arg Ala Lys Phe Lys Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Leu Lys Leu Lys Leu
        35                  40                  45
Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Val Gln Arg
    50                  55                  60
Glu Leu Gln Met Asn Ala Ala Lys Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly
                85                  90                  95
Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile
    130                 135                 140
Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Thr Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly
                165                 170                 175
Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val
            180                 185                 190
Lys Glu Tyr Ala
        195
<210>6
<211>196
<212>PRT
<213>Pyrococcus abyssi
<400>6
Met Ser Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser
1                 5                 10                  15
Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Lys Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu
        35                  40                  45
Val Asn His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Ile Gln Arg
    50                  55                  60
Asp Leu Gln Met Lys Val Ala Lys Lys Ile Ser Glu Met Ala Arg Gln
65                  70                  75                  80
Gln Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly
                85                  90                  95
Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Thr Leu Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile
    130                 135                 140
Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly
                165                 170                 175
Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Glu Ile Leu Asp Leu Ala Val
            180                 185                 190
Lys Glu Tyr Ala
        195
<210>7
<211>192
<212>PRT
<213>Methanococcus thermolithotrophicus
<400>7
Met Lys Asn Lys Leu Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Thr Ile Thr Gln Lys Ala Met Glu Lys Leu Ser Glu Glu Gly Ile
            20                  25                  30
Asn Tyr Lys Met Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Val Ala Gln
        35                  40                  45
Glu Glu Asn Leu Val Glu Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Leu Asp Pro
    50                  55                  60
Asp Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu
65                  70                  75                  80
Met Val Lys Glu Ser Pro Val Val Val Asp Thr His Ser Thr Ile Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Val Trp Val Leu Asn Glu
            100                 105                 110
Leu Asn Pro Asp Ile Ile Ile Val Val Glu Thr Ser Gly Asp Glu Ile
        115                 120                 125
Leu Ile Arg Arg Leu Asn Asp Glu Thr Arg Asn Arg Asp Leu Glu Thr
    130                 135                 140
Thr Ala Gly Ile Glu Glu His Gln Ile Met Asn Arg Ala Ala Ala Met
145                 150                 155                 160
Thr Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Gln Asn Lys
                165                 170                 175
Asn Asn Leu Leu Asp Tyr Ala Val Glu Glu Leu Ile Ser Val Leu Arg
            180                 185                 190
<210>8
<211>192
<212>PRT
<213>Methanococcus voltae
<400>8
Met Lys Asn Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Ser
1               5                   10                  15
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Ala Met Asp Asn Leu Arg Lys Glu Gly Val
            20                  25                   30
Asn Tyr Lys Met Val Ser Phe Gly Ser Val Met Phe Glu Va1 Ala Lys
        35                  40                  45
Glu Glu Asn Leu Val Ser Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Met Asp Pro
    50                  55                  60
Glu Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Met Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu
65                  70                  75                  80
Met Ala Lys Glu Ser Pro Val Ala Val Asp Thr His Ser Thr Val Ser
                85                  90                  95
Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ser Trp Val Leu Asn Glu
            100                105                  110
Leu Asn Pro Asp Leu Ile Ile Val Val Glu Thr Thr Gly Asp Glu Ile
        115                120                  125
Leu Met Arg Arg Met Ser Asp Glu Thr Arg Val Arg Asp Leu Asp Thr
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Ile Glu Gln His Gln Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Val Gln Asn Arg
                165                 170                 175
Asn Gly Leu Leu Asp Gln Ala Val Glu Glu Leu Thr Asn Val Leu Arg
            180                 185                 190
<210>9
<211>195
<212>PRT
<213>Methanococcus jannaschii
<400>9
Met Met Met Met Lys Asn Lys Val Val Val Ile Val Gly Val Pro Gly
1              5                    10                  15
Val Gly Ser Thr Thr Val Thr Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys
            20                  25                  30
Glu Gly Ile Glu Tyr Lys Ile Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu
        35                  40                  45
Ile Ala Lys Glu Glu Gly Leu Val Glu His Arg Asp Gln Leu Arg Lys
    50                  55                  60
Leu Pro Pro Glu Glu Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Lys Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ala Glu Met Ala Lys Glu Phe Asn Ile Val Val Asp Thr His Ser
                85                  90                  95
Thr Ile Lys Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ala Trp Val
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Leu Asn Pro Asp Ile Ile Val Leu Val Glu Ala Glu Asn
        115                 120                 125
Asp Glu Ile Leu Met Arg Arg Leu Lys Asp Glu Thr Arg Gln Arg Asp
    130                 135                 140
Phe Glu Ser Thr Glu Asp Ile Gly Glu His Ile Phe Met Asn Arg Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ala Met Thr Tyr Ala Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile
                165                 170                 175
Lys Asn Arg Asp Phe Leu Leu Asp Lys Ala Val Gln Glu Leu Ile Glu
            180                 185                 190
Val Leu Lys
        195
<210>10
<211>91
<212>PRT
<213>Methanopyrus kandleri
<400>10
Met Gly Tyr Val Ile Val Ala Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Ala Thr
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Thr Glu Ala Val Lys Glu Leu Glu Gly Tyr Glu His Val
            20                  25                  30
Asn Tyr Gly Asp Val Met Leu Glu Ile Ala Lys Glu Glu Gly Leu Val
        35                  40                  45
Glu His Arg Asp Glu Ile Arg Lys Leu Pro Ala Glu Lys Gln Arg Glu
    50                  55                  60
Ile Gln Arg Leu Ala Ala Arg Arg Ile Ala Lys Met Ala Glu Glu Lys
65                  70                  75                  80
Glu Gly Ile Ile Val Asp Thr His Cys Thr Ile Lys Thr Pro Ala Gly
                85                  90                  95
Tyr Leu Pro Gly Leu Pro Ile Trp Val Leu Glu Glu Leu Gln Pro Asp
            100                 105                 110
Val Ile Val Leu Ile Glu Ala Asp Pro Asp Glu Ile Met Met Arg Arg
        115                 120                 125
Val Lys Asp Ser Glu Glu Arg Gln Arg Asp Tyr Asp Arg Ala His Glu
    130                 135                 140
Ile Glu Glu His Gln Lys Met Asn Arg Met Ala Ala Met Ala Tyr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Glu Asn His Asp Asp Arg
                165                 170                 175
Leu Glu Glu Ala Val Arg Glu Phe Val Glu Thr Val Arg Ser Leu
            180                 185                 190
<210>11
<211>192
<212>PRT
<213>Methanotorris igneus
<400>11
Met Lys Asn Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Thr Leu Thr Gln Lys Thr Ile Glu Lys Leu Lys Glu Glu Gly Ile
            20                  25                  30
Glu Tyr Lys Met Val Asn Phe Gly Thr Val Met Phe Glu Val Ala Lys
        35                  40                  45
Glu Glu Gly Leu Val Glu Asp Arg Asp Gln Met Arg Lys Leu Asp Pro
    50                  55                  60
Asp Thr Gln Lys Arg Ile Gln Lys Leu Ala Gly Arg Lys Ile Ala Glu
65                  70                  75                  80
Met Ala Lys Glu Ser Asn Val Ile Val Asp Thr His Ser Thr Val Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Lys Gly Tyr Leu Ala Gly Leu Pro Ile Trp Val Leu Glu Glu
            100                 105                 110
Leu Asn Pro Asp Ile Ile Val Ile Val Glu Thr Ser Ser Asp Glu Ile
        115                 120                 125
Leu Met Arg Arg Leu Gly Asp Ala Thr Arg Asn Arg Asp Ile Glu Leu
    130                 135                 140
Thr Ser Asp Ile Asp Glu His Gln Phe Met Asn Arg Cys Ala Ala Met
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Gly Val Leu Thr Gly Ala Thr Val Lys Ile Ile Lys Asn Arg
                165                 170                 175
Asp Gly Leu Leu Asp Lys Ala Val Glu Glu Leu Ile Ser Val Leu Lys
            180                 185                 190
<210>12
<211>197
<212>PRT
<213>Pyrobaculum aerophilum
<400>12
Met Lys Ile Val Ile Val Ala Leu Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile
1               5                   10                  15
Leu Asn Phe Val Lys Gln Lys Leu Pro Asp Val Lys Ile Val Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Asp Val Met Leu Glu Ile Ala Lys Lys Arg Phe Gly Ile Gln His
        35                  40                  45
Arg Asp Glu Met Arg Lys Lys Ile Pro Val Asp Glu Tyr Arg Lys Val
    50                  55                  60
Gln Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Ile Ala Ser Leu Thr Gly Asp Val Ile
65                  70                  75                  80
Ile Asp Thr His Ala Ser Ile Lys Ile Gly Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly
                85                  90                  95
Leu Pro Asp Arg Ile Ile Ser Lys Leu Lys Pro Asp Val Ile Leu Leu
            100                 105                 110
Leu Glu Tyr Asp Pro Lys Val Ile Leu Glu Arg Arg Lys Lys Asp Pro
        115                 120                 125
Asp Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ser Glu Glu Glu Ile Glu Met His Gln
    130                 135                 140
Gln Ala Asn Arg Tyr Tyr Ala Phe Ala Ala Ala Asn Ala Gly Glu Ser
145                 150                 155                 160
Thr Val His Val Leu Asn Phe Arg Gly Lys Pro Glu Ser Arg Pro Phe
                165                 170                 175
Glu His Ala Glu Val Ala Ala Glu Tyr Ile Val Asn Leu Ile Leu Arg
            180                 185                 190
Thr Arg Gln Lys Ser
        195
<210>13
<211>220
<212>PRT
<213>Thermotoga maritima
<400>13
Met Met Ala Tyr Leu Val Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Thr Tyr Ala Lys Arg Ile Gln Glu Lys Thr Gly Ile Pro His Ile Ser
            20                  25                  30
Thr Gly Asp Ile Phe Arg Asp Ile Val Lys Lys Glu Asn Asp Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp
    50                  55                  60
Glu Leu Val Asn Glu Val Val Lys Arg Arg Leu Ser Glu Lys Asp Cys
65                  70                  75                  80
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Val Ala Gln Ala
                85                  90                  95
Glu Phe Leu Asp Ser Phe Leu Glu Ser Gln Asn Lys Gln Leu Thr Ala
            100                 105                 110
Ala Val Leu Phe Asp Val Pro Glu Asp Val Val Val Gln Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Ser Arg Arg Ile Cys Pro Lys Cys Gly Arg Ile Tyr Asn Met Ile Ser
    130                 135                 140
Leu Pro Pro Lys Glu Asp Glu Leu Cys Asp Asp Cys Lys Val Lys Leu
145                 150                 155                 160
Val Gln Arg Asp Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg His Arg Tyr Lys
                165                 170                 175
Val Tyr Leu Glu Lys Thr Gln Pro Val Ile Asp Tyr Tyr Gly Lys Lys
            180                 185                 190
Gly Ile Leu Lys Arg Val Asp Gly Thr Ile Gly Ile Asp Asn Val Val
        195                 200                 205
Ala Glu Val Leu Lys Ile Ile Gly Trp Ser Asp Lys
    210                 215                 220
<210>14
<211>204
<212>PRT
<213>Aeropyrum pernix
<400>14
Met Lys Val Arg His Pro Phe Lys Val Val Val Val Thr Gly Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Val Gly Lys Thr Thr Val Ile Lys Glu Leu Gln Gly Leu Ala Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Gly Val Lys Leu His Ile Val Asn Phe Gly Ser Phe Met Leu
        35                  40                  45
Asp Thr Ala Val Lys Leu Gly Leu Val Glu Asp Arg Asp Lys Ile Arg
    50                  55                  60
Thr Leu Pro Leu Arg Arg Gln Leu Glu Leu Gln Arg Glu Ala Ala Lys
65                  70                  75                  80
Arg Ile Val Ala Glu Ala Ser Lys Ala Leu Gly Gly Asp Gly Val Leu
                85                  90                  95
Ile Ile Asp Thr His Ala Leu Val Lys Thr Val Ala Gly Tyr Trp Pro
            100                 105                 110
Gly Leu Pro Lys His Val Leu Asp Glu Leu Lys Pro Asp Met Ile Ala
        115                 120                 125
Val Val Glu Ala Ser Pro Glu Glu Val Ala Ala Arg Gln Ala Arg Asp
    130                 135                 140
Thr Thr Arg Tyr Arg Val Asp Ile Gly Gly Val Glu Gly Val Lys Arg
145                  150                155                 160
Leu Met Glu Asn Ala Arg Ala Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ile Gln Tyr
                165                 170                 175
Ala Ser Thr Val Ala Ile Val Glu Asn Arg Glu Gly Glu Ala Ala Lys
            180                 185                 190
Ala Ala Glu Glu Leu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Leu
        195                 200
<210>15
<211>216
<212>PRT
<213>Archaeoglobus fulgidus
<400>15
Met Asn Leu Ile Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln
1               5                   10                  15
Ala Lys Arg Val Ser Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Ser Thr Gly
            20                  25                  30
Asp Met Leu Arg Glu Ala Val Ala Lys Gly Thr Glu Leu Gly Lys Lys
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Tyr Met Asp Lys Gly Glu Leu Val Pro Asp Glu Val Val
    50                  55                  60
Ile Gly Ile Val Lys Glu Arg Leu Gln Gln Pro Asp Cys Glu Lys Gly
65                  70                  75                  80
Phe Ile Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Ala Gln Ala Glu Ala Leu
                85                  90                  95
Asp Glu Met Leu Lys Glu Leu Asn Lys Lys Ile Asp Ala Val Ile Asn
            100                 105                 110
Val Val Val Pro Glu Glu Glu Val Val Lys Arg Ile Thr Tyr Arg Arg
        115                 120                 125
Thr Cys Arg Asn Cys Gly Ala Val Tyr His Leu Ile Tyr Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Lys Glu Asp Asn Lys Cys Asp Lys Cys Gly Gly Glu Leu Tyr Gln Arg
145                 150                 155                 160
Asp Asp Lys Glu Glu Thr Val Arg Glu Arg Tyr Arg Val Tyr Lys Gln
                165                  170                175
Asn Thr Glu Pro Leu Ile Asp Tyr Tyr Arg Lys Lys Gly Ile Leu Tyr
            180                 185                 190
Asp Val Asp Gly Thr Lys Asp Ile Glu Gly Val Trp Lys Glu Ile Glu
        195                 200                 205
Ala Ile Leu Glu Lys Ile Lys Ser
    210                 215
<210>16
<211>220
<212>PRT
<213>Pyrococcus abyssi
<400>16
Met Asn Ile Leu Ile Phe Gly Pro Pro Gly Ser Gly Lys Ser Thr Gln
1               5                   10                  15
Ala Arg Arg Ile Thr Glu Arg Tyr Gly Leu Thr Tyr Ile Ala Ser Gly
            20                  25                  30
Asp Ile Ile Arg Ala Glu Ile Lys Ala Arg Thr Pro Leu Gly Ile Glu
        35                  40                  45
Met Glu Arg Tyr Leu Ser Arg Gly Asp Leu Ile Pro Asp Thr Ile Val
    50                  55                  60
Asn Thr Leu Ile Ile Ser Lys Leu Arg Arg Val Arg Glu Asn Phe Ile
65                  70                  75                  80
Met Asp Gly Tyr Pro Arg Thr Pro Glu Gln Val Ile Thr Leu Glu Asn
                85                  90                  95
Tyr Leu Tyr Asp His Gly Ile Lys Leu Asp Val Ala Ile Asp Ile Tyr
            100                 105                 110
Ile Thr Lys Glu Glu Ser Val Arg Arg Ile Ser Gly Arg Arg Ile Cys
        115                 120                 125
Ser Lys Cys Gly Ala Val Tyr His Val Glu Phe Asn Pro Pro Lys Val
    130                 135                 140
Pro Gly Lys Cys Asp Ile Cys Gly Gly Glu Leu Ile Gln Arg Pro Asp
145                 150                 155                 160
Asp Arg Pro Glu Ile Val Glu Lys Arg Tyr Asp Ile Tyr Ser Lys Asn
                165                 170                 175
Met Glu Pro Ile Ile Lys Phe Tyr Gln Lys Gln Gly Ile Tyr Val Arg
            180                 185                 190
Ile Asp Gly His Gly Ser Ile Asp Glu Val Trp Glu Arg Ile Arg Pro
        195                 200                 205
Leu Leu Asp Tyr Ile Tyr Asn Gln Glu Asn Arg Arg
    210                 215                 220
<210>17
<211>196
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>氨基酸″Xaa″可以是K或E。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(75)..(75)
<223>氨基酸″Xaa″可以是T或A。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(98)..(98)
<223>氨基酸″Xaa″可以是M或L。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(157)..(157)
<223>氨基酸″Xaa″可以是A，或小的疏水残基(例如I或L)，或大的疏水残基(例如F)，这增加了酶的 热稳定性。
<400>17
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Ile Thr Arg Leu Ala Leu Gln Arg Thr Lys Ala Lys Phe Arg Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Val Lys Ala Gly Leu
        35                  40                  45
Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Xaa Ile Gln Arg
    50                  55                  60
Glu Leu Gln Met Lys Ala Ala Lys Lys Ile Xaa Glu Met Ala Lys Glu
65                  70                  75                  80
His Pro Ile Leu Val Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly
                85                  90                  95
Tyr Xaa Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Val Lys Thr Leu Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile
    130                 135                 140
Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Xaa Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly
                165                 170                 175
Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val
            180                 185                 190
Asn Glu Tyr Ala
        195
<210>18
<211>196
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>氨基酸″Xaa″可以是G，或增加酶的热稳定性的任何其它残基。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(157)..(157)
<223>氨基酸″Xaa″可以是A，或小的疏水残基(例如I或L)，或大的疏水残基(例如F)，这增加了酶的 热稳定性。
<400>18
Met Pro Phe Val Val Ile Ile Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Ile Thr Lys Leu Ala Leu Gln Arg Thr Arg Ala Lys Phe Lys Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Phe Gly Asp Leu Met Phe Glu Glu Ala Leu Lys Leu Xaa Leu
        35                  40                  45
Val Lys His Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Pro Leu Glu Val Gln Arg
    50                  55                  60
Glu Leu Gln Met Asn Ala Ala Lys Lys Ile Ala Glu Met Ala Lys Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Pro Ile Leu Leu Asp Thr His Ala Thr Ile Lys Thr Pro His Gly
                85                  90                  95
Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Phe Ile Val Ile Ile Glu Ala Thr Pro Ser Glu Ile Leu Gly Arg Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Asp Leu Lys Arg Asp Arg Asp Val Glu Thr Glu Glu Gln Ile
    130                 135                 140
Gln Arg His Gln Asp Leu Asn Arg Ala Ala Ala Ile Xaa Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
His Ser Asn Ala Leu Ile Lys Ile Ile Glu Asn His Glu Asp Lys Gly
                165                 170                 175
Leu Glu Glu Ala Val Asn Glu Leu Val Lys Ile Leu Asp Leu Ala Val
            180                 185                 190
Lys Glu Tyr Ala
        195
<210>19
<211>194
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(103)..(103)
<223>氨基酸″Xaa″可以是A或M。
<400>19
Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser Thr
1               5                   10                  15
Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile Asn Asn
            20                  25                  30
Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala Leu Lys Leu
        35                  40                  45
Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu Ser Val Glu Lys
    50                  55                  60
Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Glu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Asp Thr His Ala Val Ile
                85                  90                  95
Arg Thr pro Ser Gly Tyr Xaa Pro Gly Leu Pro SerTyr Val Ile Thr
            100                 105                110
Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile
        115                 120                 125
Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Ser Val Ile Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Thr Ala Ser Ala Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val
                165                 170                 175
Asn Val Glu Gly Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser
            180                 185                 190
Met Lys
<210>20
<211>403
<212>PRT
<213>Thermotoga maritima
<400>20
Met Arg Val Leu Val Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Tyr Gln
1               5                   10                  15
Leu Ile Glu Met Glu Gly Glu Lys Val Leu Cys Lys Gly Ile Ala Glu
            20                  25                  30
Arg Ile Gly Ile Glu Gly Ser Arg Leu Val His Arg Val Gly Asp Glu
        35                  40                  45
Lys His Val Ile Glu Arg Glu Leu Pro Asp His Glu Glu Ala Leu Lys
    50                  55                  60
Leu Ile Leu Asn Thr Leu Val Asp Glu Lys Leu Gly Val Ile Lys Asp
65                  70                  75                  80
Leu Lys Glu Ile Asp Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly Glu
                85                  90                  95
Arg Phe Lys Glu Ser Val Leu Val Asp Glu Glu Val Leu Lys Ala Ile
            100                 105                 110
Glu Glu Val Ser Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn Leu Met
        115                 120                 125
Gly Ile Lys Ala Ala Met Lys Leu Leu Pro Gly Val Pro Asn Val Ala
    130                 135                 140
Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Ile Pro Gln Lys Ala Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Ile Pro Tyr Glu Tyr Tyr Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Arg Tyr
                165                 170                 175
Gly Phe His Gly Thr Ser His Arg Tyr Val Ser Lys Arg Ala Ala Glu
            180                 185                 190
Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ile Thr Cys His Ile
        195                 200                 205
Gly Asn Gly Ala Ser Val Ala Ala Val Lys Tyr Gly Lys Cys Val Asp
    210                 215                 220
Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met Gly Thr Arg
225                 230                 235                 240
Ser Gly Asp Leu Asp Pro Ala Ile Pro Phe Phe Ile Met Glu Lys Glu
                245                 250                 255
Gly Ile Ser Pro Gln Glu Met Tyr Asp Ile Leu Asn Lys Lys Ser Gly
            260                 265                 270
Val Tyr Gly Leu Ser Lys Gly Phe Ser Ser Asp Met Arg Asp Ile Glu
        275                 280                 285
Glu Ala Ala Leu Lys Gly Asp Glu Trp Cys Lys Leu Val Leu Glu Ile
    290                 295                 300
Tyr Asp Tyr Arg Ile Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Met
305                 310                 315                 320
Asn Gly Val Asp Ala Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Ile Thr Arg Glu Asp Val Cys Ser Tyr Leu Glu Phe Leu Gly Val
            340                 345                 350
Lys Leu Asp Lys Gln Lys Asn Glu Glu Thr Ile Arg Gly Lys Glu Gly
        355                 360                 365
Ile Ile Ser Thr Pro Asp Ser Arg Val Lys Val Leu Val Val Pro Thr
    370                 375                 380
Asn Glu Glu Leu Met Ile Ala Arg Asp Thr Lys Glu Ile Val Glu Lys
385                 390                 395                 400
Ile Gly Arg
<210>21
<211>478
<212>PRT
<213>Pyrococcus horikoshii
<400>2l
Met Arg Arg Met Lys Leu Pro Ser His Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr
1               5                   10                  15
Ile Gly Pro Ala Thr Asn Ser Lys Lys Met Ile Lys Lys Leu Ile Glu
            20                  25                  30
Ala Gly Met Asn Val Ala Arg Ile Asn Phe Ser His Gly Thr Phe Glu
        35                  40                  45
Glu His Ala Lys Ile Ile Glu Met Val Arg Glu Gln Ser Gln Lys Leu
    50                  55                  60
Asp Arg Arg Val Ala Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ile Arg
65                  70                  75                  80
Val Gly Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Glu Leu Glu Arg Gly Glu Lys
                85                  90                  95
Val Thr Leu Thr Thr Lys Asp Ile Glu Gly Asp Glu Thr Thr Ile Pro
            100                 105                 110
Val Glu Tyr Lys Asp Phe Pro Lys Leu Val Ser Lys Gly Asp Val Ile
        115                 120                 125
Tyr Leu Ser Asp Gly Tyr Ile Val Leu Arg Val Glu Asp Val Lys Glu
    130                 135                 140
Asn Glu Val Glu Ala Val Val Ile Ser Gly Gly Lys Leu Phe Ser Arg
145                 150                 155                 160
Lys Gly Ile Asn Ile Pro Lys Ala Tyr Leu Pro Val Glu Ala Ile Thr
                165                 170                 175
Pro Arg Asp Ile Glu Ile Met Lys Phe Ala Ile Glu His Gly Val Asp
            180                 185                 190
Ala Ile Gly Leu Ser Phe Val Gly Asn Val Tyr Asp Val Leu Lys Ala
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Leu Glu Arg Asn Gly Ala Gly Asp Thr Phe Val Ile Ala
    210                 215                 220
Lys Ile Glu Arg Pro Asp Ala Val Arg Asn Phe Asn Glu Ile Leu Asn
225                 230                 235                 240
Ala Ala Asp Gly Ile Met Ile Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Met
                245                 250                 255
Pro Ile Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gln Lys Arg Leu Ile Arg Lys Ala
            260                 265                 270
Asn Met Glu Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Val Ser
        275                 280                 285
Met Thr Met Glu Lys Val Pro Thr Arg Ala Glu Val Thr Asp Val Ala
    290                 295                 300
Asn Ala Ile Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Glu Glu Thr
305                 310                 315                 320
Ala Val Gly Lys Phe Pro Ile Glu Ala Val Glu Met Met Ala Arg Ile
                325                 330                 335
Ala Lys Val Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ser Phe Gly Ile Thr Arg Met
            340                 345                 350
Arg Glu Phe Leu Glu Gly Thr Lys Arg Gly Thr Ile Lys Glu Ala Ile
        355                 360                 365
Thr Arg Ser Ile Ile Asp Ala Ile Cys Thr Ile Gly Ile Lys Phe Ile
    370                 375                 380
Leu Thr Pro Thr Lys Thr Gly Arg Thr Ala Arg Leu Ile Ser Arg Phe
385                 390                 395                 400
Lys Pro Lys Gln Trp Ile Leu Ala Phe Ser Thr Arg Glu Lys Val Cys
                405                 410                 415
Asn Asn Leu Met Phe Ser Tyr Gly Val Tyr Pro Phe Cys Met Glu Glu
            420                 425                 430
Gly Phe Asn Glu Asn Asp Ile Val Arg Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu
        435                 440                 445
Val Gly Ser Asp Asp Ile Val Leu Met Thr Glu Gly Lys Pro Ile Glu
    450                 455                 460
Lys Thr Val Gly Thr Asn Ser Ile Lys Ile Phe Gln Ile Ala
465                 470                 475
<210>22
<211>452
<212>PRT
<213>硫磺矿硫化叶菌
<400>22
Met Arg Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr Leu Gly Pro Ser Ser Glu Glu
1               5                   10                  15
Lys Val Lys Glu Leu Ala Glu Tyr Val Asp Val Phe Arg Ile Asn Phe
            20                  25                  30
Ala His Gly Asp Glu Thr Ser His Arg Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Arg
        35                  40                  45
Thr Tyr Ala Pro Glu Ser Ser Ile Ile Val Asp Leu Pro Gly Pro Lys
    50                  55                  60
Leu Arg Leu Gly Glu Leu Lys Glu Pro Ile Glu Val Lys Lys Gly Asp
65                  70                  75                  80
Lys Ile Val Phe Ser Gln Lys Asp Gly Ile Pro Val Asp Asp Glu Leu
                85                  90                  95
Phe Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asn Ser Asp Ile Leu Ile Ala Asp Gly
            100                 105                 110
Thr Ile Arg Val Arg Val Lys Ser Lys Ala Lys Asp Arg Val Glu Gly
        115                 120                 125
Thr Val Ile Glu Gly Gly Ile Leu Leu Ser Arg Lys Gly Ile Asn Ile
    130                 135                 140
Pro Asn Val Asn Leu Lys Ser Gly Ile Thr Asp Asn Asp Leu Lys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Lys Arg Ala Leu Asp Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Leu Ser Phe
                165                 170                 175
Val Ile Ser Glu Asn Asp Val Lys Lys Val Lys Glu Phe Val Gly Asp
            180                 185                 190
Glu Ala Trp Val Ile Ala Lys Ile Glu Lys Ser Glu Ala Leu Lys Asn
        195                 200                 205
Leu Thr Asn Ile Val Asn Glu Ser Asp Gly Ile Met Val Ala Arg Gly
    210                 215                 220
Asp Leu Gly Val Glu Thr Gly Leu Glu Asn Leu Pro Leu Ile Gln Arg
225                 230                 235                 240
Arg Ile Val Arg Thr Ser Arg Val Phe Gly Lys Pro Val Ile Leu Ala
                245                 250                 255
Thr Gln Val Leu Thr Ser Met Ile Asn Ser Pro Ile Pro Thr Arg Ala
            260                 265                 270
Glu Ile Ile Asp Ile Ser Asn Ser Ile Met Gln Gly Val Asp Ser Ile
        275                 280                 285
Met Leu Ser Asp Glu Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Pro Val Glu Ser Val
    290                 295                 300
Arg Thr Leu His Asn Ile Ile Ser Asn Val Glu Lys Ser Val Lys His
305                 310                 315                 320
Arg Pro Ile Gly Pro Leu Asn Ser Glu Ser Asp Ala Ile Ala Leu Ala
                325                 330                 335
Ala Val Asn Ala Ser Lys Val Ser Lys Ala Asp Val Ile Val Val Tyr
            340                 345                 350
Ser Arg Ser Gly Asn Ser Ile Leu Arg Val Ser Arg Leu Arg Pro Glu
        355                 360                 365
Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Pro Asp Pro Arg Leu Ala Lys Lys Phe
    370                 375                 380
Lys Leu Cys Tyr Gly Val Ile Pro Ile Ser Ile Asn Lys Lys Met Gln
385                 390                 395                 400
Ser Ile Asp Glu Ile Ile Asp Val Ser Ala Lys Leu Met Gln Glu Lys
                405                 410                 415
Ile Lys Asp Leu Lys Phe Lys Lys Ile Val Ile Val Gly Gly Asp Pro
            420                 425                 430
Lys Gln Glu Ala Gly Lys Thr Asn Phe Val Ile Val Lys Thr Leu Glu
        435                 440                 445
Gln Gln Lys Lys
    450
<210>23
<211>466
<212>PRT
<213>Thermotoga maritima
<400>23
Met Arg Ser Thr Lys Ile Val Cys Thr Val Gly Pro Arg Thr Asp Ser
1               5                   10                  15
Tyr Glu Met Ile Glu Lys Met Ile Asp Leu Gly Val Asn Val Phe Arg
            20                  25                  30
Ile Asn Thr Ser His Gly Asp Trp Asn Glu Gln Glu Gln Lys Ile Leu
        35                  40                  45
Lys Ile Lys Asp Leu Arg Glu Lys Lys Lys Lys Pro Val Ala Ile Leu
    50                  55                  60
Ile Asp Leu Ala Gly Pro Lys Ile Arg Thr Gly Tyr Leu Glu Lys Glu
65                  70                  75                  80
Phe Val Glu Leu Lys Glu Gly Gln Ile Phe Thr Leu Thr Thr Lys Glu
                85                  90                  95
Ile Leu Gly Asn Glu His Ile Val Ser Val Asn Leu Ser Ser Leu Pro
            100                 105                 110
Lys Asp Val Lys Lys Gly Asp Thr Ile Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile
        115                 120                 125
Val Leu Glu Val Ile Glu Thr Thr Asp Thr Glu Val Lys Thr Val Val
    130                 135                 140
Lys Val Gly Gly Lys Ile Thr His Arg Arg Gly Val Asn Val Pro Thr
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Ser Val Glu Ser Ile Thr Asp Arg Asp Arg Glu Phe Ile
                165                 170                 175
Lys Leu Gly Thr Leu His Asp Val Glu Phe Phe Ala Leu Ser Phe Val
            180                 185                 190
Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Lys Ala Lys Glu Glu Ile Arg Lys His
        195                 200                 205
Gly Lys Glu Ile Pro Val Ile Ser Lys Ile Glu Thr Lys Lys Ala Leu
    210                 215                 220
Glu Arg Leu Glu Glu Ile Ile Lys Val Ser Asp Gly Ile Met Val Ala
225                 230                 235                 240
Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Ile Pro Ile Glu Glu Val Pro Ile Val
                245                 250                 255
Gln Lys Glu Ile Ile Lys Leu Ser Lys Tyr Tyr Ser Lys Pro Val Ile
            260                 265                 270
Val Ala Thr Gln Ile Leu Glu Ser Met Ile Glu Asn Pro Phe Pro Thr
        275                 280                 285
Arg Ala Glu Val Thr Asp Ile Ala Asn Ala Ile Phe Asp Gly Ala Asp
    290                 295                 300
Ala Leu Leu Leu Thr Ala Glu Thr Ala Val Gly Lys His Pro Leu Glu
305                 310                 315                 320
Ala Ile Lys Val Leu Ser Lys Val Ala Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu
                325                 330                 335
Glu Phe Phe Arg Thr Ile Glu Tyr Asp Thr Ser Asp Ile Ser Glu Ala
            340                 345                 350
Ile Ser His Ala Cys Trp Gln Leu Ser Glu Ser Leu Asn Ala Lys Leu
        355                 360                 365
Ile Ile Thr Pro Thr Ile Ser Gly Ser Thr Ala Val Arg Val Ser Lys
    370                 375                 380
Tyr Asn Val Ser Gln Pro Ile Val Ala Leu Thr Pro Glu Glu Lys Thr
385                 390                 395                 400
Tyr Tyr Arg Leu Ser Leu Val Arg Lys Val Ile Pro Val Leu Ala Glu
                405                 410                 415
Lys Cys Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Glu Lys Gly Leu Lys Lys Val
            420                 425                 430
Glu Glu Met Gly Leu Ala Glu Lys Gly Asp Leu Val Val Leu Thr Ser
        435                 440                 445
Gly Val Pro Gly Lys Val Gly Thr Thr Asn Thr Ile Arg Val Leu Lys
    450                 455                 460
Val Asp
465
<210>24
<211>477
<212>PRT
<213>激烈热球菌
<400>24
 Met Arg Arg Val Lys Leu Pro Ser His Lys Thr Lys Ile Val Ala Thr
 1               5                   10                  15
 Ile Gly Pro Ala Thr Asn Ser Arg Lys Met Ile Lys Gln Leu Ile Lys
             20                  25                  30
 Ala Gly Met Asn Val Ala Arg Ile Asn Phe Ser His Gly Ser Phe Glu
         35                  40                  45
Glu His Ala Arg Val Ile Glu Ile Ile Arg Glu Glu Ala Gln Lys  Leu
    50                  55                  60
Asp Arg Arg Val Ala Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ile Arg
65                  70                  75                  80
Val Gly Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Glu Leu Lys Arg Gly Glu Lys
                85                  90                  95
Val Ile Leu Thr Thr Lys Asp Val Glu Gly Asp Glu Thr Thr Ile Pro
            100                 105                 110
Val Asp Tyr Lys Gly Phe Pro Asn Leu Val Ser Lys Gly Asp Ile Ile
        115                 120                 125
Tyr Leu Asn Asp Gly Tyr Ile Val Leu Lys Val Glu Asn Val Arg Glu
    130                 135                 140
Asn Glu Val Glu Ala Val Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Phe Ser Arg
145                 150                 155                 160
Lys Gly Val Asn Ile Pro Lys Ala Tyr Leu Pro Val Glu Ala Ile Thr
                165                 170                 175
Pro Lys Asp Phe Glu Ile Met Lys Phe Ala Ile Glu His Gly Val Asp
            180                 185                 190
Ala Ile Gly Leu Ser Phe Val Gly Ser Val Tyr Asp Val Leu Lys Ala
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Leu Glu Lys Asn Asn Ala Glu Asp Val Phe Val Ile Ala
    210                 215                 220
Lys Ile Glu Arg Pro Asp Ala Val Arg Asn Phe Asp Glu Ile Leu Asn
225                 230                 235                 240
Ala Ala Asp Gly Ile Met Ile Ala Arg Gly Asp Leu Gly Val Glu Met
                245                 250                 255
Pro Ile Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gln Lys Lys Leu Ile Arg Lys Ala
            260                 265                 270
Asn Met Glu Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Val Ser
        275                 280                 285
Met Thr Thr Glu Lys Val Pro Thr Arg Ala Glu Val Thr Asp Val Ala
    290                 295                 300
Asn Ala Ile Leu Asp Gly Thr Asp Ala Val Met Leu Ser Glu Glu Thr
305                 310                 315                 320
Ala Ile Gly Lys Phe Pro Ile Glu Thr Val Glu Met Met Gly Lys Ile
                325                 330                 335
Ala Lys Val Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ser Phe Gly Leu Ser Arg Ile
            340                 345                 350
Arg Glu Phe Met Glu Ile Lys Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ala Ile Thr
        355                 360                 365
Arg Ser Ile Ile Asp Ala Ile Cys Thr Ile Asp Ile Lys Phe Ile Leu
    370                 375                 380
Thr Pro Thr Arg Thr Gly Arg Thr Ala Arg Leu Ile Ser Arg Phe Lys
385                 390                 395                 400
Pro Lys Gln Trp Ile Leu Ala Phe Ser Thr Asn Glu Arg Val Cys Asn
                405                 410                 415
Asn Leu Met Phe Ser Tyr Gly Val Tyr Pro Phe Cys Leu Glu Glu Gly
            420                 425                 430
Phe Asp Glu Asn Asp Ile Val Arg Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu Val
        435                 440                 445
Glu Ser Asp Asp Met Val Leu Met Thr Glu Gly Lys Pro Ile Glu Lys
    450                 455                 460
Thr Val Gly Thr Asn Ser Ile Lys Ile Phe Gln Ile Ala
465                 470                 475
<210>25
<211>408
<212>PRT
<213>Methanosarcina thermophila
<400>25
Met Lys Val Leu Val Ile Asn Ala Gly Ser Ser Ser Leu Lys Tyr Gln
1               5                   10                  15
Leu Ile Asp Met Thr Asn Glu Ser Ala Leu Ala Val Gly Leu Cys Glu
            20                  25                  30
Arg Ile Gly Ile Asp Asn Ser Ile Ile Thr Gln Lys Lys Phe Asp Gly
        35                  40                  45
Lys Lys Leu Glu Lys Leu Thr Asp Leu Pro Thr His Lys Asp Ala Leu
    50                  55                  60
Glu Glu Val Val Lys Ala Leu Thr Asp Asp Glu Phe Gly Val Ile Lys
65                  70                  75                  80
Asp Met Gly Glu Ile Asn Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly Gly
                85                  90                  95
Glu Lys Phe Thr Thr Ser Ala Leu Tyr Asp Glu Gly Val Glu Lys Ala
            100                 105                 110
Ile Lys Asp Cys Phe Glu Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Pro Asn Met
        115                 120                 125
Met Gly Ile Ser Ala Cys Ala Glu Ile Met Pro Gly Thr Pro Met Val
    130                 135                 140
Ile Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Pro Tyr Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Met Tyr Ala Leu Pro Tyr Asp Leu Tyr Glu Lys His Gly Val Arg Lys
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Lys Tyr Val Ala Glu Arg Ala Ala
            180                 185                 190
Leu Met Leu Gly Lys Pro Ala Glu Glu Thr Lys Ile Ile Thr Cys His
        195                 200                 205
Leu Gly Asn Gly Ser Ser Ile Thr Ala Val Glu Gly Gly Lys Ser Val
    210                 215                 220
Glu Thr Ser Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu Gly Leu Ala Met Gly Thr
225                 230                 235                 240
Arg Cys Gly Ser Ile Asp Pro Ala Ile Val Pro Phe Leu Met Glu Lys
                245                 250                 255
Glu Gly Leu Thr Thr Arg Glu Ile Asp Thr Leu Met Asn Lys Lys Ser
            260                 265                 270
Gly Val Leu Gly Val Ser Gly Leu Ser Asn Asp Phe Arg Asp Leu Asp
        275                 280                 285
Glu Ala Ala Ser Lys Gly Asn Arg Lys Ala Glu Leu Ala Leu Glu Ile
    290                 295                 300
Phe Ala Tyr Lys Val Lys Lys Phe Ile Gly Glu Tyr Ser Ala Val Leu
305                 310                 315                 320
Asn Gly Ala Asp Ala Val Val Phe Thr Ala Gly Ile Gly Glu Asn Ser
                325                 330                 335
Ala Ser Ile Arg Lys Arg Ile Leu Thr Gly Leu Asp Gly Ile Gly Ile
            340                 345                 350
Lys Ile Asp Asp Glu Lys Asn Lys Ile Arg Gly Gln Glu Ile Asp Ile
        355                 360                 365
Ser Thr Pro Asp Ala Lys Val Arg Val Phe Val Ile Pro Thr Asn Glu
    370                 375                 380
Glu Leu Ala Ile Ala Arg Glu Thr Lys Glu Ile Val Glu Thr Glu Val
385                 390                 395                 400
Lys Leu Arg Ser Ser Ile Pro Val
                405
<210>26
<211>585
<212>DNA
<213>嗜酸热硫化叶菌
<400>26
atgaagattg gtattgtaac tggaattcct ggtgtaggga aaagtactgt cttggctaaa    60
gttaaagaga tattggataa tcaaggtata aataacaaga tcataaatta tggagatttt    120
atgttagcaa cagcattaaa attaggctat gctaaagata gagacgaaat gagaaaatta    180
tctgtagaaa agcagaagaa attgcagatt gatgcggcta aaggtatagc tgaagaggca    240
agagcaggtg gagaaggata tctgttcata gatacgcatg ctgtgatacg tacaccctct    300
ggatatttac ctggtttacc gtcatatgta attacagaaa taaatccgtc tgttatcttt    360
ttactggaag ctgatcctaa gataatatta tcaaggcaaa agagagatac aacaaggaat    420
agaaatgatt atagtgacga atcagttata ttagaaacca taaacttcgc tagatatgca    480
gctactgctt ctgcagtatt agccggttct actgttaagg taattgtaaa cgtggaagga    540
gatcctagta tagcagctaa tgagataata aggtctatga agtaa                    585
<210>27
<21l>585
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>27
atgaaaatcg gtatcgttac cggtatcccg ggtgttggta aatctaccgt tctggctaaa    60
gttaaagaaa tcctggacaa ccagggtatc aacaacaaaa tcatcaacta cggtgacttc    120
atgctggcta ccgctctgaa actgggttac gctaaagacc gtgacgaaat gcgtaaactg    180
tctgttgaaa aacagaaaaa actgcagatc gacgctgcta aaggtatcgc tgaagaagct    240
cgtgctggtg gtgaaggtta cctgttcatc gacacccacg ctgttatccg taccccgtct    300
ggttacctgc cgggtctgcc gtcttacgtt atcaccgaaa tcaacccgtc tgttatcttc    360
ctgctggaag ctgacccgaa aatcatcctg tctcgtcaga aacgtgacac cacccgtaac    420
cgtaacgact actctgacga atctgttatc ctggaaacca tcaacttcgc tcgttacgct    480
gctaccgctt ctgctgttct ggctggttct accgttaaag ttatcgttaa cgttgaaggt    540
gacccgtcta tcgctgctaa cgaaatcatc cgttctatga aatag                    585
<210>28
<211>663
<212>DNA
<213>Thermotoga maritima
<400>28
atgatggcgt accttgtctt tctaggacct ccaggtgcag gaaaaggaac ctacgcaaag    60
agattgcagg aaataacggg gattcctcat atatccaccg gtgacatttt cagggacatt    120
gtaaaaaaag agaacgacga gcttgggaaa aagataaaag agatcatgga aaggggagaa    180
ctcgttccgg acgaactcgt gaacgaggtt gtgaaaagaa gactctcaga aaaagattgt    240
gaaagaggat tcatactgga cggctatcca agaaccgttg ctcaggcgga attcctcgac    300
ggctttttga aaactcaaaa caaagagctc acggctgctg tactctttga agttcctgag    360
gaagtggtcg ttcagaggct cacggccaga aggatctgcc cgaaatgtgg aagaatttac    420
aatttgattt cgctccctcc aaaagaagac gaactgtgcg atgattgtaa agtgaagctc    480
gttcagagag aagacgacaa agaagaaaca gtgagacaca gatacaaggt ttatctcgaa    540
aagacacagc cagtgattga ttactacgat aaaaagggca ttctcaaacg agtggatggt    600
accataggaa tagacaacgt gatcgctgaa gtgttaaaga taatagggtg gagtgataaa    660
tga                                                                  663
<210>29
<211>660
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>29
atgatggcct atctggtttt tcttggtcca ccgggggcag gcaaaggtac atatgcgaaa    60
cgtttacagg aaatcaccgg catcccgcac attagcacgg gcgacatttt tcgtgatatt    120
gtcaaaaagg aaaatgacga attaggtaag aaaattaaag aaattatgga gcgcggcgag    180
ttggtgccgg acgaactggt gaatgaagtt gtcaaacgtc ggctgtctga aaaggattgc    240
gaacgtggct ttattttgga cggttacccg cgtacagtag ctcaggcaga gtttctcgac    300
ggcttcctga agactcagaa taaggagtta acggctgcgg tcctgttcga ggtgcctgaa    360
gaggtggtcg ttcagcgtct gaccgcgcgg cgtatctgcc cgaagtgtgg tcgtatttac    420
aacctgattt cacttcctcc aaaagaagat gaactgtgtg atgactgcaa agtaaaactg    480
gtgcaacgcg aagatgataa agaggaaact gtgcgccatc gctacaaagt atatctggaa    540
aaaacccaac cggttatcga ttattatgat aaaaaaggca ttttgaaacg cgttgatggg    600
accatcggca tcgataacgt gattgccgaa gttctcaaaa tcattgggtg gagtgataaa    660
<210>30
<211>651
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>30
atgaacctga ttttcctggg tccgcctggg gcaggcaaag gcacccaggc gaaacgtgtg    60
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atcgaaggag tttggaaaga aattgaggcg attctggaaa aaattaaaag c             651