本发明涉及一种诊断传染性海绵状脑病的方法和一种使用朊病毒蛋白 和层粘连蛋白受体的特异性抗体的诊断性检验试剂盒。本发明还涉及所述方 法或检验试剂盒在诊断传染性海绵状脑病中的用途。

250年以前，人们发现了绵羊患的一种疾病，这种疾病伴随着精神紧张、 瘙痒病、共济失调，最终瘫痪和死亡。这种疾病在使用英语的国家被称为“瘙 痒病”(因为动物为了止痒而在木桩和树干上摩擦)，在法国被称为“la tremblante”而在德国被称为“Traberkrankheit”。这些名称反映了其症状的 多样性。“瘙痒病”被作为一组不仅影响动物而且影响人类的疾病：传染性 海绵状脑病(＝TSE)的原型来研究。TSE是能攻击多种哺乳动物的致命的神经 系统疾病。

牛海绵状脑病(BSE)是牛所患的一种神经系统疾病，它与绵羊和山羊的 瘙痒病和人类的克-雅氏病有关。一种宿主编码的功能未知的膜相关糖蛋白， 就是所谓的朊病毒蛋白PrP在这种疾病的发病机制中起关键作用。这种细胞 同工型不仅能在神经元细胞上有非常强的表达，而且在非神经元细胞上也可 以以不定的频率测到。这种膜蛋白对特异性酶(蛋白酶)的消化敏感(PrP-sen)。 然而，可溶性的、恶性形式的PrP(PrP-res)是抗蛋白酶的，它在感染BSE的 动物大脑中蓄积从而形成淀粉样斑块。这种PrP-res形式仅与所有传染性海绵 状脑病，包括BSE有关，它可以从感染传染性海绵状脑病/BSE的脑组织中 提取出来。

在早期，人们推测这种瘙痒病/BSE病原体的非同寻常的特征是：它仅 由核酸或蛋白组成或既不含核酸也不含蛋白，而是一种多糖或膜片段。目前 争论最多的是“仅含蛋白”的假说和病毒/朊病毒假说：“仅含蛋白”的假说 是基于不包含核酸并能自我复制的感染性PrP-res。据推测PrP-res可结合 PrP-sen，从而使其转化为恶性同工型。这种恶性同工型的构象是以β-折叠结 构为特征的，然而其细胞同工型中却以α-螺旋占优势。病毒/朊病毒假说是 基于由病毒核酸(可能为RNA)组成的感染因子以及作为该病毒基因组的外壳 的朊病毒蛋白。朊病毒外壳的宿主起源可以解释为什么不发生免疫反应和炎 症反应。核酸的存在可以进一步解释迄今为止被描述过的20种不同的瘙痒 病鼠毒株。

细胞同工型PrP-sen在两个天冬酰胺位点被糖基化，它具有33-35000Da 的分子量，它通过磷脂酰肌醇糖脂被固定在胞质膜的外表面，该糖脂在其羧 基端氨基酸处被固定。PrP-sen的最高表达率可在大脑中检测到，但其基因也 在非神经元性胚胎组织和成人组织中表达。这种蛋白的生物功能至今仍不清 楚。可以设想，PrP可能是一种神经营养性(neurotrophic)分化因子的受体。 该蛋白还与睡眠/苏醒节律有关。但是，PrP也可能是亲神经(neurotrophic)病 毒的受体。

这种蛋白的正常细胞同工型能被蛋白酶完全降解(PrP-sen)。相反，恶性 异构型(PrP-res)被蛋白酶降解为27-30000Da的片段，这种片段仍具有完全的 感染力(PrP-res)。PrP-res缺乏成熟PrP-sen蛋白最初的67个氨基酸。转录后 加工与PrP-sen到PrP-res的转化有关，而且有人怀疑PrP-sen和PrP-res之间 唯一的不同在三维结构中。在该蛋白的正常和非正常形式之间，没有显示出 任何生物化学方面的不同。这也解释了为什么这两种同工型没有显示出任何 抗原性的不同。此外，PrP-sen和PrP-res具有共同的氨基酸序列。PrP是由 染色体基因的单拷贝编码的，其在哺乳动物中高度保守。完整PrP编码序列 包含在单一的外显子中。    

与表达于表面的PrP-sen比较，PrP-res在胞浆滤泡中累积，这些滤泡中 大多数是次级溶酶体。

TSE疾病以较长潜伏期为其特征，潜伏期间观察不到临床症状，然后是 短暂的临床期，其总是导致死亡。

因为自然感染的动物可能不对PrP-res起血清学反应，通过接种试验动 物来诊断需要18个月的工作，所以，迄今为止，瘙痒病和BSE使用组织病 理学、临床和流行病学方法进行诊断。临床诊断是于死后对大脑进行组织病 理学检查。BSE状态可细分为：BSE阳性、BSE阴性和BSE可疑。被认为 BSE可疑的动物显示出与BSE阳性的动物相同的临床症状。但在检查时， BSE的组织病理学表现为阴性。但是这种BSE可疑状态可能是一种“前BSE 阳性”状态，尽管在一些病例中采用了另一种诊断方法或者动物也许没患 BSE。

上述综合诊断方法包括显微镜检查，例如，神经元和神经纤维网中BSE 特异性液泡、星形胶质细胞增多、神经元的丢失和PrP-res，也称为瘙痒病相 关纤丝(SAF)的异常聚积的沉积。SAF可以原位检测，如通过对组织印迹 (histoblot)的免疫印迹，以及对处理过的受感染脑部提取物的蛋白质印迹、斑 点印迹，或作为透射电镜中负染出的典型原纤维(fibril)聚积。

另一个间接诊断BSE的方法是分析脑脊液。神经学疾病与中枢神经系 统(CNS)中蛋白质代谢的质和量的改变有关，而这些都反映在脑脊液(CSF)组 成的改变中。应用双向凝胶电泳可找到与此疾病相关的标记蛋白。这种可能 的标记物(仅是BSE的间接指标)可在实验型BSE潜伏期的晚期首次检测到。 然而，通过与取自克-雅氏病人的样品对照，这种标记物也曾在阿耳茨海默病 病人体内发现。阿耳茨海默病被认为是一种非传染性海绵状脑病。

即使开发了更简单的检测方法，这类检验也不太可能适用于诊断亚临床 BSE。

现有技术描述了具有朊病毒蛋白抗原决定簇的合成多肽的制备方法 (WO93/11155，WO93/23432)，天然瘙痒病朊病毒蛋白的特异性抗体 (WO97/10505)，以及检测绵羊的瘙痒病的方法(WO97/37227)。Korth等(1997， 自然390：74-77)描述了一种小鼠单克隆抗体，该抗体能够区分细胞同工型 (PrPc)和瘙痒病同工型(PrPsc)。

本发明的目标是提供一种诊断亚临床或临床传染性海绵状脑病的方 法。

依据本发明，在说明书和权利要求书范围内，通过诊断亚临床或临床传 染性海绵状脑病的方法，该目标已经达到。

依据本发明，该方法的特征在于：

a)血液样品取自活体哺乳动物

b)细胞从该血液样品中浓缩，所述细胞被称为靶细胞

c)在靶细胞上测定传染性海绵状脑病标记蛋白的表达

d)所获得的结果与对照值比较。

在本发明方法的一种具体实施方案中，靶细胞已匀浆(homogenised)。

传染性海绵状脑病的亚临床阶段是虽感染了朊病毒蛋白但没有外在临 床症状的很长潜伏期。本发明使诊断传染性海绵状脑病，尤其在没有外在临 床症状的时期诊断传染性海绵状脑病成为可能。因此，本发明还能诊断疑有 传染性海绵状脑病，但是在检验时组织病理学表现(仍然)是阴性的哺乳动物 (疑有传染性海绵状脑病，也参照上面对BSE的描述)。临床期是出现临床症 状的短暂期，它跟随着亚临床期，迄今由于缺乏任何治疗，它一定导致感染 动物的死亡。使用本发明的技术教导，在这一时期也能诊断传染性海绵状脑 病。所述传染性海绵状脑病(TSE)尤其包括绵羊的瘙痒病、牛海绵状脑病 (BSE)、人类的库鲁病和克-雅氏病。

测定标记蛋白的表达意味着所述标记蛋白与对照比较有可证实的升高 或降低。“可证实地”指，例如，标记蛋白的表达比对照中的增高或降低50％ 到100％或为统计学显著性增高或降低。可测定对照值或标准，例如，使用 非感染动物的细胞，这些值可用于校准本发明的方法。这些方法是本领域的 技术人员所熟知的。

标记蛋白可能是技术人员已知，在亚临床或临床传染性海绵状脑病中可 证实地升高或降低的任一蛋白。比如，标记蛋白在对照中不能检测到，而用 下面描述的方法在感染动物或怀疑患有传染性海绵状脑病的动物中却能清 楚地鉴定的情况。

在一个具体实施方案中，本发明方法的特征在于标记蛋白是朊病毒蛋白 PrP-sen。本发明的朊病毒蛋白PrP-sen是朊病毒蛋白的细胞同工型，其经常 被称为PrPc。PrP-sen(sen＝敏感的)可被蛋白酶彻底降解。

在一个具体实施方案中，本发明方法的特征在于标记蛋白是γ干扰素 (IFNγ)。而另一种具体实施方案中所述方法的特征在于标记蛋白是牛型γ干 扰素(IFNγ)。IFNγ(例如Vilcek，J.和Oliveira，I.C.Int Arch Allergy Immunol 1994，104：311-316)和牛型IFNγ(Keefe，R.G.等，Vet Immunol Immunopathol， 1997，56：39-51)是本领域的技术人员所熟知的。

另一个具体实施方案中，本发明方法的特征在于标记蛋白是层粘连蛋白 受体(LR)或层粘连蛋白受体前体(LRP)。层粘连蛋白受体(例如Grosso，L.E. 等，生物化学，1991，30：3346-3350)和层粘连蛋白受体前体(例如Castronovo，V. 等，生物化学杂志1991，266：20440-20446)是本领域熟知的。另一种具体实施 方案中，所述方法的特征在于标记蛋白是牛型层粘连蛋白受体(LR)或牛型层 粘连蛋白受体前体(LRP)。

以上的标记蛋白可以使用一般技术人员所熟知的方法检测。

在一个优选实施方案中，所述标记蛋白通过免疫试验测定。免疫试验使 用在本领域现有的所述标记蛋白特异性的单克隆抗体或多克隆抗血清。例 如，单克隆抗体13和单克隆抗体142可以用于标记蛋白PrPsen(Harmeyer S. 等，J Gen Virol 1998，79，937-945，见图1)。免疫试验包括了在本领域所熟知 的检测方法，如ELISA试验(酶联免疫吸附试验)或所谓的夹心ELISA试验、 斑点印迹法、免疫印迹法、放射免疫试验(RIA)，奥特洛尼(Ouchterlony)扩散 试验或火箭免疫荧光试验。另一种免疫试验是所谓的蛋白印迹(也称蛋白转移 法)。蛋白印迹的目的是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白或多肽转移到硝酸 纤维素膜或其他合适的载体上，同时保留从凝胶上获得的蛋白或多肽的相对 位置。然后让它和一种特异性结合所述蛋白或多肽的抗体保温。一般的技术 人员就能使用这些方法去完成此处描述的发明。技术人员能找到的上述方法 和其它检测方法的参考文献列出如下：放射免疫分析及有关技术入门， Elsevier Science Publishers，阿姆斯特丹，荷兰；Bullock等，免疫细胞化学技 术Academic Press，Orlando，FL Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen， 酶免疫分析的实践和理论：生物化学和分子生物实验室技术Elsevier Science Publishers，阿姆斯特丹，荷兰(1985)。

另一个最特别的实施方案中，使靶细胞和标记蛋白的特异性抗体保温， 检测由此形成的抗原/抗体复合物。

在本发明方法的一个特别优选实施方案中，利用分子生物方法检测传染 性海绵状脑病标记蛋白改变的表达。此处的分子生物方法指检测方法，其包 括：如聚合酶链反应(PCR)或者是技术人员能在标准参考书上找到的RNA或 DNA印迹(如Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实 验室出版社，冷泉港，纽约和Bertram，S.and Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)。

本发明方法的另一个实施方案中，利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 检测传染性海绵状脑病标记蛋白。在这种特殊形式的聚合酶链反应(PCR)中 首先分离出总RNA，然后使用逆转录酶把总RNA逆转录成cDNA，然后用 其进行PCR。这种检测方法是本领域的技术人员所熟知的，也是在标准参考 书上发表过的(如Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉 港实验室出版社，冷泉港，纽约和Bertram，S.and Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)。

“活体哺乳动物”实例是一般技术人员熟知的，包括如：人类，以及绵 羊、山羊、猪、牛、鹿、兔、仓鼠、大鼠、小鼠。

在一个具体实施方案中，所述方法的特征在于活体哺乳动物是所有牛科 动物的一种，最优选奶牛或绵羊。虽然其应用具体涉及牛的传染性海绵状脑 病的诊断方法，但所教授的技术同样适用于可受上述脑病病原体折磨的任何 动物，因此这种技术是包含在本发明中的。

血液样品中包含的细胞包括来自造血干细胞的所有细胞，例如淋巴细 胞、凝血细胞、血小板、或红细胞。

在另一具体实施方案中，所述方法的特征在于靶细胞是白细胞。术语白 细胞包括，如多形核白细胞和单核白细胞、肥大细胞、B细胞或B淋巴细胞、 T细胞或T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。

在一更具体的实施方案中，所述方法的特征是靶细胞是单核白细胞。术 语单核白细胞具体指单核细胞和巨噬细胞、树突细胞和郎罕氏细胞。

在另一具体实施方案中，所述方法的特征在于靶细胞是多形核白细胞。 多形核白细胞包括嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。

本发明还涉及检测海绵状脑病的诊断性检验试剂盒，其包括用本发明方 法检测传染性海绵状脑病标记蛋白改变的表达所必需的所有元件。

本发明还具体涉及一种诊断性检验试剂盒，其包括传染性海绵状脑病标 记蛋白的特异性抗体。

本发明还具体涉及一种诊断性检验试剂盒，其特征在于本发明抗体是多 克隆的。

本发明还具体涉及一种诊断性检验试剂盒，其特征在于本发明抗体是单 克隆的。

本发明还包括根据本发明的诊断性检验试剂盒，其特征在于它包括用本 发明方法检测传染性海绵状脑病标记蛋白PrP-sen改变的表达所必需的所有 元件。

本发明还包括根据本发明的诊断性检验试剂盒，其特征在于它包括用本 发明方法检测传染性海绵状脑病标记蛋白IFNγ改变的表达所必需的所有元 件。

本发明还包括根据本发明的诊断性检验试剂盒，其特征在于它包括用本 发明方法检测传染性海绵状脑病标记蛋白牛型IFNγ改变的表达所必需的所 有元件。

本发明还包括根据本发明的诊断性检验试剂盒，其特征在于它包括用本 发明方法检测传染性海绵状脑病标记蛋白层粘连蛋白受体(LR)或层粘连蛋白 受体前体(LRP)改变的表达所必需的所有元件。

本发明还包括根据本发明的诊断性检验试剂盒，其特征在于它包括用本 发明方法检测传染性海绵状脑病标记蛋白牛型层粘连蛋白受体(LR)或牛型层 粘连蛋白受体前体(LRP)改变的表达所必需的所有元件。

本发明还具体涉及一种适于进行原位免疫试验的诊断性检验试剂盒。

诊断性检验试剂盒是本发明诊断方法的所有成分的集成。实施本发明方 法的其它元件有(没有详尽列举)，容器，如96孔板或微滴板、试管、其它适 当的容器、表面和基座、膜如硝酸纤维素膜、洗涤剂和缓冲液。诊断性检验 试剂盒还可能包括可以检测结合型抗体，比如标记的二抗的试剂、发色团、 酶(例如与抗体偶联的)及其底物或其它能结合抗体的底物。

本发明还涉及一种检测传染性海绵状脑病的诊断性检验试剂盒，该试剂 盒包括能够在严谨条件下与编码传染性海绵状脑病标记蛋白的核酸杂交的 寡核苷酸，以及，实施本发明方法所需的其它元件。

本发明还涉及根据本发明的诊断性检验试剂盒，其特征在于，其包括实 施逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)的所有必要元件。所述试剂盒可包括，但 并不限于除试管或96孔板或微滴板以外的其它合适的容器，表面和基座， 膜如硝酸纤维素膜，洗涤剂和反应缓冲液(其pH值和镁浓度可能有不同)，无 菌水，矿物油，BSA(牛血清白蛋白)，MgCl2，(NH4)2SO4，DMSO(二甲亚砜)， 巯基乙醇，核苷酸(dNTP)，酶如Tag聚合酶和逆转录酶，以及作为DNA基 质的标记蛋白或其部分之DNA序列，本发明标记蛋白的特异性寡核苷酸， 对照模板，DEPC水，DNA酶和本领域技术人员已知的其它化合物。

本发明的寡核苷酸是大约15-100个核苷酸长的短核酸分子，它能够在 严谨条件下与标记蛋白的互补核酸序列结合。关于严谨条件，技术人员指选 择大于85％，最好大于90％同源性的条件(参见Sambrook等(1989)，分子克 隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Bertram，S.and Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York， 1991)。

本发明还涉及根据本发明的诊断性检验试剂盒，其包含能在严谨条件下 与编码PrP-sen的核酸杂交的寡核苷酸。

本发明还涉及根据本发明的诊断性检验试剂盒，其包含能在严谨条件下 与编码IFNγ的核酸杂交的寡核苷酸。

本发明还涉及根据本发明的诊断性检验试剂盒，其包含能在严谨条件下 与编码牛型IFNγ的核酸杂交的寡核苷酸。

本发明还涉及根据本发明的诊断性检验试剂盒，其包含能在严谨条件下 与编码层粘连蛋白受体(LR)或层粘连蛋白受体前体(LRP)的核酸杂交的寡核 苷酸。

本发明另一实施方案涉及PrP-sen特异性抗体在本发明方法中的应用。

本发明另一实施方案涉及IFNγ特异性抗体在本发明方法中的应用。

本发明另一实施方案涉及牛型IFNγ特异性抗体在本发明方法中的应 用。

本发明另一实施方案涉及层粘连蛋白受体(LR)或层粘连蛋白受体前体 (LRP)特异性抗体在本发明方法中的应用。

在另一优选实施方案中，本发明涉及能在严谨条件下与编码PrP-sen之 核酸杂交的寡核苷酸在本发明方法中的应用。

在另一优选实施方案中，本发明涉及能在严谨条件下与编码IFNγ之核 酸杂交的寡核苷酸在本发明方法中的应用。

在另一优选实施方案中，本发明涉及能在严谨条件下与编码牛型IFNγ 之核酸杂交的寡核苷酸在本发明方法中的应用。

在另一优选实施方案中，本发明涉及能在严谨条件下与编码层粘连蛋白 受体(LR)或层粘连蛋白受体前体(LRP)之核酸杂交的寡核苷酸在本发明方法 中的应用。

本发明另一优选实施方案是根据本发明的检测传染性海绵状脑病的诊 断用试验试剂在诊断人和动物的海绵状脑病，或对地方性BSE或瘙痒病进行 流行病学控制方面的应用。

                    附图说明

图1：蛋白印迹法测定标记蛋白PrPsen

该图显示，应用142单克隆抗体经蛋白印迹法测定BSE感染的牛和BSE 阴性对照动物的单核(MN)白细胞中的标记蛋白PrPsen。

细胞于2％十二烷基肌氨酸钠中匀浆。匀浆制剂以60ug/孔的浓度点样在 凝胶上。

泳道1：分子量标志

泳道2：BSE脑(BSE阳性，阳性对照)

泳道3：奶牛058193号(BSE阳性)

泳道4：奶牛5061号(BSE阳性)

泳道5：奶牛2819号(BSE阳性)

泳道6：奶牛279046号(BSE阴性，阴性对照)

泳道7：奶牛4751号(BSE阳性)

所有MN样品来自BSE感染的牛，仅4751号奶牛除外。与阴性对照 相比，所有BSE感染的牛均为PrPsen表达阳性。5061号奶牛(泳道4)的PrPsen 表达相对较弱，但显著高于阴性对照。

图2：RT-PCR法测定标记蛋白IFNγ

该图显示了应用RT-PCR法测定BSE感染的牛和BSE阴性对照动物中 的标记蛋白IFNγ。

泳道1：GAPDH对照，4372号奶牛(BSE阳性)

泳道2：IFNγ，4372号奶牛(BSE阳性)

泳道3：GAPDH对照，441号奶牛(BSE阴性)

泳道4：IFNγ，441号奶牛(BSE阴性)

图3：RT-PCR法测定标记蛋白层粘连蛋白受体

该图显示了RT-PCR法测定BSE感染的牛中的标记蛋白层粘连蛋白受 体(LR)，所述牛为疑有BSE者以及BSE阴性对照动物。

A部分)

泳道1：奶牛4471(阳性BSE)

泳道2：奶牛58193(阳性BSE)

泳道3：奶牛462(阴性对照)

泳道4：奶牛5621(可疑性BSE)

泳道5：奶牛5054(可疑性BSE)

泳道6：靶DNA对照

泳道7：空白

泳道8：分子量标志

B部分)

针对A部分)的每一条泳道都有相应的D-甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH) 的RT-PCR作为对逆转录酶不同活性的对照

本发明参照以下实施例详述。

实施例1：利用分离的白细胞中特异性标记蛋白增强的表达诊断BSE

以下实施例描述对牛中BSE的诊断，其方法是测定分离的单核(MN)或 多形核(PMN)白细胞上，标记蛋白PrP-sen或IFNγ或层粘连蛋白受体(前 体)(LR(P))的增强的表达。

从牛的全血中分离单核(MN)和多形核(PMN)白细胞

这种特殊的血细胞是通过两次离心步骤分离，后一步是密度梯度离心， 以便获得所谓的白细胞“棕黄”层，然后溶解红细胞。

步骤1：采血

血样(大约400ml)取自所述动物，然后直接置于一个特殊容器中。该容 器已经含有葡萄糖和柠檬酸盐的混合物：68mM葡萄糖，37.4mM柠檬酸三 钠，17.4mM柠檬酸，调至PH7.3，作为抗凝剂。血样和抗凝剂的比例是6： 1。将血样立即送到实验室以分离细胞。

步骤2：浓集白细胞

1.离心

准确取40ml经抗凝剂处理的牛全血，置于可封闭型无菌50ml离心管 中，在无制动的旋转离心机中以800xg室温离心20分钟。离心应每小时延 长5分钟(最多3个小时)，收集血样并保存。

第一次离心形成了三个区带；

上区带：血清

中间区带：白细胞(所谓的“棕黄层”)

下区带：红细胞

密度离心基质

可用标准市售基质分离白细胞。我们用NYCOMED LymphoprepTM，密 度是1.007g/ml。

小心取出血清，在-20℃冰冻以进一步分析。白细胞层取出后放到一个 新的离心管中。

第二次离心

从第一次离心产物中准确取出15ml白细胞，置于可封闭型无菌50ml 离心管中的35ml的NYCOMED LymphoprepTM(密度1.007g/ml)上。

离心：在无制动的离心机中以800g室温离心20分钟。

离心应每小时延长5分钟(最多3个小时)，收集血样并保存。

第二次离心形成4个区带：

从上到下：

第一区带：(残余)血清

第二区带：单核白细胞(单核细胞和淋巴细胞＝棕黄)

第三区带：基质界面

第四区带：多形核白细胞和(残余)红细胞

步骤3：单核(MN)白细胞的分离

第二区带包括单核细胞和淋巴细胞，用无菌Pasteur移液管小心吸出， 转移到一个无菌的50ml离心管中。将细胞用等体积的无菌PBS(磷酸盐缓冲 液)洗涤两次，然后以600xg于10℃离心15分钟。将沉淀的细胞重悬于 HBSS(含有NaHCO3的Hanks平衡盐溶液，无酚红)中。使用台盼蓝测定细胞 活性和细胞数。

步骤4：多形核(PMN)白细胞的分离

在吸出第二区带后，也吸去第一和第三区带。然后用三倍的无菌红细胞 裂解液(ELB，由8.9mM KHCO3，154.9mM NH4Cl和0.01mM EDTA组成) 稀释PMN/红细胞混合物，小心混匀，室温保温10分钟。

离心：800xg/10分钟/10℃

弃去上清液，细胞沉淀重悬于20ml ELB缓冲液中，混匀，静置，再离 心。

离心：800xg/10分钟/10℃

弃去上清液，沉淀用20ml HBSS(如上，但再加1mM MgCl2)洗涤。

离心：800xg/8分钟/10℃

弃去上清液，细胞重悬于HBSS中。使用台盼蓝测定细胞活性和细胞数。

结果：细胞数举例 细胞类型    细胞数/ml血液    活性 1.MN          2.25×106     ≥93％ 2.PMN         4.03×106     ≥98％

以下是对BSE感染动物中分离的单核白细胞和多形核白细胞的测定：

I、朊病毒蛋白的细胞同工型PrP-sen增加的表达

II、γ干扰素蛋白IFNγ增加的表达

III、层粘连蛋白(前体)受体(LR(P))增加的表达

I、细胞同工型PrPsen增加的表达

对照动物和BSE感染动物的分离的白细胞中PrPsen的表达率利用蛋白印 迹分析法(Harmeyer S.等，普通病毒学杂种1998，79，937-945)测量。其中利用 了发色团的显色作用。

细胞的裂解：

分离的白细胞在2％的十二烷基肌氨酸钠溶液(Sigma公司，St.Louis，USA) 中匀浆10分钟/4℃。所得匀浆制剂于15,000xg/4℃离心40分钟。上清经抽 吸过滤，并贮存在-20℃。

测定匀浆制剂的蛋白浓度，然后把所有标本校准为6mg/ml蛋白。每孔 准确装入60μg匀浆物。

使用单克隆抗体13或单克隆抗体142进行检测。在上面提到的出版物 中有这两种抗体的详细描述。抗体分别以1∶10稀释。

本实施例中使用的二抗是1∶3000稀释的AP偶联型抗体。

结果：

结果显示，与健康对照动物对比，BSE感染动物的MN白细胞和PMN 白细胞中PrP-sen的蛋白表达显著升高(也参照图1的蛋白印迹法，样品来自 其它的牛)。

案例号/样品    BSE状态    PrPsen增加的表达

4372            阳性           有

4471            阳性           有

4401            怀疑           有

                阴性

对照            阴性           无

                阴性

II、IFNγ增高的表达

用两种方法测定增高的表达

--用ELISA法测定蛋白

--用RT-PCR法测定特异性mRNA

1.用ELISA法测定IFNγ

采用澳大利亚墨尔本CSL兽医有限公司生产的ELISA试剂盒。

结果：

BSE状态    动物数    IFNγ(pg/ml)

BSE阳性      9       314.0±78.2

BSE可疑      9       504.0±109.7

BRE阴性      13        0.0±0.0

2.用RT-PCR法测定IFNγmRNA

RNA(从整个白细胞级分)的分离和后来的RT-PCR使用标准方法进行 (Yi-Jun Shi and Jing-Zhlong Liu，Genet.Anal.Tech.Appl.，1992，9，149- 150；Izraeli S.等，核酸研究1991，21，6051；Michel U.等，Anal.Biochem.1997， 249，246-247)，有以下改动。

RNA的分离：

使用Promega系统(目录号：G3191)分离总RNA。

cDNA(RT反应)

应用Promega的逆转录系统(目录号：A3500)逆转录已分离的RNA样 品。

PCR反应：

使用两次PCR反应(“嵌套式PCR”)测定特异性mRNA。

其中使用的γ干扰素的引物是：

FW1(IFNF1)5’GGAGTATTTTAATGCAAGTAGCCC 3’

FW2(IFNF2)5’GTAGCTAAGGGTGGGCCTCT 3’

RV(IFNR1)5‘GCTCTCCGGGCCTCGAAAGAGATT 3’

预期PCR产物长度应该是357个碱基对(bp)。    

结果：

通过该RT-PCR清楚地证实了IFNγELISA的结果，即BSE感染动物的 γ干扰素显著增加。

图2显示了4372和441号牛的全血样品中总白细胞的mRNA的RT- PCR。

III、层粘连蛋白受体(前体)(LR(P))增高的表达

通过RT-PCR测定表达。该反应也包括对LRP以及LR的检测。目前还 没有描述过牛型LRP或LR的序列。但是，这种蛋白在哺乳动物中是高度保 守的。人类和鼠的已公开的序列数据因此得以比较。在此数据分析的基础 上，建立了如下的引物序列：

引物：

正向：5’AAGAGGACCTGGGAGAAGCT 3’

反向：5’CCTTCTCAGCAGCAGCCCTGC 3’

预期产物：517bp

RNA分离

见II.2.的描述。

cDNA(RT反应)

见II.2.的描述。

PCR反应：

单一反应与标准方法一致。 结果：

案例号/样品    BSE状态    LRP/LR增加的表达

4471            阳性            有

58193           阳性            有

5621            可疑           (有)

5054            可疑            有

对照(462)       阴性            无

这些结果显示于图3。

IV.克隆和表达牛型层粘连蛋白受体(前体)(LR(P))以生产抗LR的特异 性抗体。

关于LR引物的研制

为了扩增LR的完整基因(Genebank登记编号：S37431)设计了针对牛 型LR的引物。引物是根据牛的c10蛋白基因(Genebank登记编号：M64923) 设计的。

在下面限定的LR引物中，方框中显示的是它们的限制性酶切位点。可 利用这些限制性酶切位点直接向大肠杆菌中克隆。

设计的LR引物将用于从牛的全血所分离的细胞总RNA中扩增LR。

三种引物的序列如下：

LRPF1  5’ATTT TGTCCGGAGCCCTTGATGTCC 3’

LRPR1  5’ATTG TTACGACCACTCGGTGGTGGT 3’

LRPR2  5’ATTT AACGACCACTCGGTGGTTCC 3’

限制性酶切位点：LRPF1引物能被Xho酶切，LRPR1引物能被Eco R1 酶切，LRPR2引物能被Xba1酶切。

牛型LR基因的RT-PCR和克隆：

LR引物以50ng/ml的终浓度重悬于无菌水中。

牛的白细胞RNA是从牛的全血中总白细胞级分中分离的。

取5μg的RNA用DNA酶(Gibco BRL)消化，然后使用逆转录试剂盒 (Promega，目录号A3500)进行逆转录。使用引物LRPF1、LRPR1和LRPR2 进行PCR反应。

PCR：35个循环，退火温度50℃。

PCR获得的扩增片段在1％的琼脂糖凝胶上电泳以测定片段大小。所得 带经凝胶纯化，再次检查其大小，然后从琼脂糖中转移出片段并重悬于10μl 的无菌水中。

把扩增的片段连接到质粒pGEM-T中(Boehringer Mannheim连接试剂 盒)。

测序所有的克隆经并证实是LR基因。

亚克隆至表达质粒pBADGm和pTrcHis(都从Invitrogen有限公司获得)， 并当即检验克隆中插入片段的存在。

设计用于抗LR研制的肽：

在抗LR抗体的研制中，利用了所设计的四种肽，这些肽是使用牛的c10 蛋白(Genebank登记编号：64923；蛋白Id.AAA62713.1)设计的。

利用能预测蛋白结构、疏水性、亲水性和抗原位点的计算机程序来设计 肽。

主要参数用于选择其中两种肽为具有亲水性的和抗原性的肽，另外两种 肽是按照它们在所述蛋白的C末端区和N末端区的位置选择的。

肽1141  MSGALDVLQMKEEDVLKFLAGC

(氨基端)对应于所述蛋白氨基端的氨基酸残基1-20。

等电点(pI)为4.32。

肽1142  RLLVVTDPRADHQPLTEASYGC

(具有抗原性)对应于所述蛋白抗原区的氨基酸残基120-140。

等电点(pI)为5.38。

肽1143 KEEQAAEKAVTKEEFQGEWGC

(亲水性并具有抗原性)对应于所述蛋白的具有亲水性和抗原性的区域中 氨基酸残基212-231。

等电点(pI)为4.48。

肽1144  FTAAQPEVADWSEGVQVPSVGC

(羧基端)对应于所述蛋白羧基端氨基酸残基238-257。

等电点(pI)为3.58。

每种肽与Imject马来酰亚胺活化的卵白蛋白载体蛋白偶联，方法如 下：

在100mM Na2HPO4(pH7.2)中溶解多肽至终浓度为10mg/ml。

在无菌水中溶解Imject马来酰亚胺活化的卵白蛋白载体蛋白至终浓度 为10mg/ml。

在室温下，使多肽和卵白蛋白偶联2小时。

随后，使已偶联的蛋白溶液对500倍体积的PBS(pH7.4)透析，然后贮存 在-20℃备用。

多克隆和单克隆抗体的制备

多克隆和单克隆抗体的制备以类似于诸如Harmeyer S.等，普通病毒学 杂志，1998的方法进行。

简述：

第0天：免疫前采血检测抗LR抗体，然后注射。

第0天：皮下注射0.5ml已偶联的肽，所述肽悬浮于完全弗氏佐剂 (Sigma-Aldrich，目录号：F-5881)。

第14天：0.5ml已偶联的肽的不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，目录号： F-5506)进行第一次加强注射。

第21天：使用不含佐剂的1ml已偶联的肽进行第二次加强注射。

第31天：取血检测已产生的抗体。

用于标记蛋白测定的ELISA系统

ELISA技术很适合BSE标记蛋白的测定。在本实例中，分离特异性血 细胞，所述细胞表面携带有这些标记蛋白。

细胞分离方法

使用免疫磁珠(Dynabeads)耗尽法进一步分离MN和PMN白细胞亚类 (靶细胞)。珠子上包被抗牛型白细胞的特异性抗体。

简述：

-血样中加入细胞特异性Dynabeads

-靶细胞的免疫捕获

-靶细胞的磁性分离

-纯化靶细胞的洗涤和浓缩

标记蛋白的ELISA测定

根据用靶细胞特异性捕获抗体对靶细胞的分离来选择ELISA系统。

-微滴板上包被靶细胞表面标记特异性的第一捕获抗体。

-与表达靶细胞表面标记的细胞一起保温。结合至第一捕获抗体。

-细胞捕获后，与直接针对BSE标记蛋白的生物素化第二抗体一起保 温。

-与酶偶联的检测蛋白一起保温。加入底物，并用ELISA读取仅测定。