神经-退行性疾病、肌肉-退行性疾病以及神经-肌肉-退行性疾病均为衰弱性 疾病，这类疾病能够损毁机体的记忆、脑功能、肌肉功能以及其它生理学功能。 该类疾病可能为遗传性疾病，也可能是由于机体暴露于环境因素及受到污染的 食物等所致。该类疾病可包括阿耳茨海默氏病、多发性硬化症(MS)、葛雷克氏 症(肌萎缩性侧索硬化症或ALS)、帕金森氏症、脊肌萎缩症(SMA)、重症肌无 力症、自闭症、肌肉萎缩症、包括牛海绵状脑病(BSE)在内的传染性海绵状脑病 (TSEs)等。
肌肉萎缩症(muscular dystrophy)为遗传障碍性疾病，该疾病的特征为进行 性的肌肉萎缩和虚弱，其是由肌肉的显微变化而开始的。肌肉随着时间的推移 而退化，因而病人的肌肉力量日渐衰退。
杜兴氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)属于肌肉萎缩症 这类疾病中的一种，该疾病的特征在于肌肉肥大。DMD是一种最普通类型的 肌肉萎缩症，其肌肉退行的发生年龄较早，并具有快速进展的特征。所有的DMD 都为X连锁，且主要侵染男性-在世界范围约有1/3500的男孩受该病困扰。
与DMD有关的基因发现于X染色体，其编码一个很大的蛋白-抗肌萎缩 蛋白。内部肌肉细胞需要抗肌萎缩蛋白作为其结构支持；据认为其是通过将内 部细胞骨架元素锚定在表面膜上来强化肌肉细胞的。若没有该蛋白，则细胞膜 变为可通透的，因而细胞外成分进入细胞，加大内部压力，最终肌肉细胞“破 裂"并死亡。随后的免疫反应也能加重损伤。
贝克型肌营养不良症(Becker muscular dystrophy，BMD)是相当温和的DMD。 该疾病通常在十几岁或成人早期发作，发病进程缓慢，较DMD更难预测。
在美国，有超过84,000名患者患有退行性肌肉萎缩症。
目前在治疗、预防、抑制或降低由神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或 神经．肌肉退行性疾病所致的组织退化、伤害或损伤的方法、或在对受到所述疾 病的不利影响的组织进行恢复的方法的方面仍有需求。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供一种治疗、预防、抑制或降低受试个体中由 神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病所致的组织退化、 伤害或损伤的处理方法、或对受到所述疾病的不利影响的组织进行恢复的方法， 所述方法包括对需要所述治疗的受试个体向所述组织中施用有效量的含有下述 肽试剂的组合物，所述肽试剂含有LKKTET或LKKTNT的氨基酸序列、其保守 变异体，或所述组合物含有刺激LKKTET或LKKTNT肽、或其保守变异体生成 的刺激剂，由此来抑制所述由神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉 退行性疾病所致的组织退化、伤害或损伤，或对受到所述疾病的不利影响的组 织进行恢复。
发明详述
尽管并未找到任何特定的理论，但诸如胸腺素β4( 或TB4)以及包括肌 动蛋白螯合肽(actin-sequestering peptide)或含有LKKTET或LKKTNT的氨基酸 序列或其保守变异体的肽片段等在内的其它试剂的肌动蛋白螯合肽可促进由神 经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经．肌肉退行性疾病所致的组织退化、伤 害或损伤的逆转或预防。
胸腺素 最初被鉴定为在体外当内皮细胞迁移和分化时被上调的蛋白。胸 腺素β4最初是由胸腺中分离出来的，是在多种组织中鉴别出的43个氨基酸、 4.9kDa的广泛存在的多肽。已知该蛋白具有多种作用，包括内皮细胞的分化和 迁移中发挥作用、在T细胞分化中发挥作用、在肌动蛋白螯合中发挥作用、以 及血管新生和创伤愈合中发挥作用。
本发明所适用的包括但不限于下述疾病：阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、葛雷克氏症(Lou Gehrig’s disease)、 帕金森氏症(Parkinson’s disease)、脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy)、重症肌无 力症(myasthenia gravis)、自闭症(autism)、肌肉萎宿症(muscular dystrophy)(包括 DMD和BMD)、包括BSE在内的传染性海绵状脑病(transmissible spongifonm encephalopathies，TSEs)等。这些疾病可能与炎症性疾患相关。相应地，本发明特 别适用于与炎症相关的神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性 疾病。根据一个实施方式，本发明适用于除肌肉萎缩症以外的神经退行性疾病、 肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病。
根据一个实施方式，本发明涉及治疗、预防、抑制或降低由神经退行性疾 病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病所致的组织退化、伤害或损伤的 处理方法，或涉及对受到所述疾病的不利影响的组织进行恢复的处理方法，所 述方法包括对需要所述治疗的受试个体向所述组织中施用有效量的含有下述肽 试剂的组合物，所述组合物可以为具有神经退行性疾病、肌肉退行性疾病和/或 神经-肌肉退行性疾病抑制活性的含有LKKTET或LKKTNT的氨基酸序列、或 其保守变异体的多肽，优选为胸腺素β4和/或Tβ4同工型、相似物或衍生物， 包括KLKKTET、LKKTETQ、Tβ4的N-末端变异体、Tβ4的C-末端变异体、以 及Tβ4的拮抗剂。本发明还可利用氧化的Tβ4。根据其它实施方式，所述试剂 不是胸腺素β4或氧化的Tβ4。
可以用于本发明的组合物的物质包括例如下述肽试剂：胸腺素β4( )和/ 或Tβ4同工型、相似物或衍生物，包括氧化的Tβ4、Tβ4的N-末端变异体、Tβ4 的C-末端变异体以及Tβ4的拮抗剂；具有神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、 或神经-肌肉退行性疾病抑制活性的含有LKKTET或其保守变异体的多肽或肽 片段或基本上由上述LKKTET或其保守变异体构成的多肽或肽片段。国际公开 No.PCT/US99/17282(将其以引用的方式并入本文中)公开了Tβ4的同工型，其 可与可用于本发明的LKKTET和其保守变异体的氨基酸序列一样在本发明中发 挥作用。国际公开No.PCT/GB99/00833(WO 99/49883，将其以引用的方式并入 本文中)公开了氧化的胸腺素β4，其可用于本发明中。尽管在下文中本发明主 要描述Tβ4和Tβ4同工型，但是可以理解下述描述同样可应用于下述成分 中：LKKTET或LKKTNT的氨基酸序列；具有神经退行性疾病、肌肉退行性疾 病、或神经-肌肉退行性疾病抑制活性的含有LKKTET或其保守变异体的多肽或 肽片段或基本上由LKKTET或其保守变异体构成的多肽或肽片段；和/或Tβ4 同工型、相似物或衍生物，包括Tβ4的N-末端变异体、Tβ4的C-末端变异体 及Tβ4的拮抗剂。本发明还可使用氧化的Tβ4。
在一个实施方式中，本发明提供治疗、预防、抑制或降低受试个体中由除 肌肉萎缩症以外的神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病 所致的组织退化、伤害或损伤的处理方法，或对受到所述疾病的不利影响的组 织进行恢复的处理方法，所述方法包括对需要所述治疗的受试个体向所述组织 中施用有效量的含有下述肽试剂的组合物，所述肽试剂含有LKKTET或 LKKTNT的氨基酸序列、其保守变异体，或该组合物含有刺激LKKTET或 LKKTNT肽、或其保守变异体生成的刺激剂，由此来抑制所述由神经退行性疾 病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病所致的组织退化、伤害或损伤， 或对受到所述疾病的不利影响的组织进行恢复。在另一个实施方式中，所述疾 病不是杜兴氏肌营养不良症。
在另一个实施方式中，本发明提供治疗、预防、抑制或降低受试个体中由 包括肌肉萎缩症在内的疾病所致的组织退化、伤害或损伤的处理方法，或对受 到所述疾病的不利影响的组织进行恢复的处理方法，所述方法包括对需要所述 治疗的受试个体向所述组织中施用有效量的含有除TB4以外的下述肽试剂的组 合物，所述肽试剂含有LKKTET或LKKTNT的氨基酸序列、其保守变异体，或 所述组合物含有刺激LKKTET或LKKTNT肽、或其保守变异体生成的刺激剂， 由此来抑制所述由神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病 所致的组织退化、伤害或损伤，或对受到所述疾病的不利影响的组织进行恢复。
在一个实施方式中，本发明提供治疗、预防、抑制或降低受试个体中由神 经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病所致的组织退化、伤 害或损伤的处理方法，或对受到所述疾病的不利影响的组织进行恢复的处理方 法，所述方法包括使所述组织与有效量的含有本文所述的肽试剂的组合物相接 触。作为非限制性实施例，所述组织可选自所述受试个体的神经和/或肌肉组织。 所述接触可以为直接性或为全身性的。直接施用的例子例如包括：通过直接敷 用(direct application)或吸入使所述组织与含有本文所述肽试剂的溶液、洗剂、 油膏、凝胶、霜剂、糊剂、喷雾剂、混悬剂、分散剂、水凝胶、软膏剂或油相 接触。全身施用的例子例如包括：将含有本文所描述的肽试剂的组合物进行静 脉内、腹膜内、肌肉内注射，所述组合物被置于水等适于进行注射的药学可接 受载体中。
本文所述的用于本发明的肽试剂可以任意有效量进行施用。例如，本文所 述的肽试剂可在约0.0001-1,000,000微克的剂量范围内进行施用，更优选在约 0.1-5,000微克的剂量范围内进行施用，最优选在约1-30微克的剂量范围内进行 施用。
本文所描述的组合物可以每天施用、隔天施用、隔周施用、隔月施用等， 在进行施用的每一天可以进行单次或多次施用，例如可在进行施用的每一天进 行2、3、4或更多次的施用。
已经鉴别出许多Tβ4同工型，其与已知的Tβ4氨基酸序列具有约70％、 或约75％、或约80％、或更高的同源性。所述同工型例如包括Tβ4ala、Tβ9、 Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。与Tβ4类似，已经发现Tβ 10和Tβ15同工型也能螯合肌动蛋白。Tβ4、Tβ10和Tβ15及其其它同工型 具有LKKTET或LKKTNT的氨基酸序列，该氨基酸序列应与肌动蛋白的螯合或 结合相关。尽管并不希望囿于任何特定理论，但是本文所述的肽试剂的活性可 能至少部分是由于所述试剂的抗炎活性所致。Tβ4还能调节肌动蛋白聚合(例 如，β-胸腺素似乎通过螯合游离的G-肌动蛋白来解聚F-肌动蛋白)。Tβ4调 节肌动蛋白聚合的能力可能与其通过LKKTET或LKKTNT序列来结合或螯合肌 动蛋白的能力有关。因此，如同Tβ4，其它具有抗炎和/或结合或螯合肌动蛋白、 或调节肌动蛋白聚合作用的蛋白，包括具有LKKTET或LKKTNT氨基酸序列 的Tβ4同工型，其单独或与本文所述的Tβ4相联合也会是有效的。
本文所述的肽试剂能够预防和/或限制脑和神经血管细胞和组织的凋亡性死 亡，该作用是通过上调诸如磷脂酰肌醇3-激酶(P13-K)/Akt蛋白激酶β)等的代谢 和信号酶的途径完成的。上调P13-K)/Akt和下游磷酸化Bad和富含脯氨酸的 Akt存活激酶可保护神经细胞。另外，本文所描述的肽试剂，诸如Tβ4和Tβ4同 工型或氧化的Tβ4通过下调诸如IL-18的炎性细胞因子、诸如IL-8的趋化因子 和诸如半胱天冬氨酸酶(caspace)2、3、8和9等酶来保护神经细胞并促进神经 组织的愈合。
本文所述的肽试剂能够降低炎性趋化因子，细胞因子和半胱天冬氨酸酶 (capase)的活性。
本文所述的肽试剂能够通过阻止谷氨酸诱导的神经毒性来阻止脑和脊髓中 的神经毒性。受损伤的脑和神经组织中兴奋性神经介质谷氨酸的不受控制的释 放是细胞中线粒体损伤和能量代谢的主要媒介，可导致数种炎性反应、机械应 力改变的营养信号(mechnical stress altered trophic signals)以及受影响的神经细 胞和组织的死亡。
因此，特别可预计本文所述的包括诸如Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、T β12、Tβ13、Tβ14和Tβ15等的Tβ4同工型的已知LKKTET或LKKTNT肽 以及还未鉴别出的Tβ4同工型都可用于本发明的方法中。同样地，本文所述的 包括Tβ4同工型的LKKTET或LKKTNT肽可用于本发明的方法中，所述方 法包括用于受试个体的方法。由此，本发明进一步提供一种药物组合物，其含 有本文所述的LKKTET或LKKTNT肽以及药学可接受载体，所述LKKTET或 LKKTNT肽包括Tβ4以及各种Tβ4同工型：Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、 Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。
此外，在适当的螯合、结合、动员(mobilization)或聚合试验中，证实具 有抗炎活性和/或具有肌动蛋白螯合或结合能力、或可动员肌动蛋白或调节肌动 蛋白聚合作用的其它试剂和蛋白，或经鉴定存在有诸如LKKTET或LKKTNT 等介导肌动蛋白结合的氨基酸序列的试剂和蛋白也能类似地用于本发明的方法 中。所述蛋白例如可包括凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、肌动蛋白抑 制蛋白、cofilin、蚕食蛋白、Dnasel、vilin、法安明、割切蛋白(severin)、加帽 蛋白、β-辅肌动蛋白和acumentine。由于所述方法包括用于受试个体的方法， 因而本发明进一步提供一种药物组合物，其含有本文所述的凝溶胶蛋白、维生 素D结合蛋白(DBP)、肌动蛋白抑制蛋白、cofilin、蚕食蛋白、Dnasel、vilin、 法安明、割切蛋白(severin)、加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和acumentine。因此， 本发明包括含有LKKTET或LKKTNT及其保守变异体的氨基酸序列的多肽的用 途。
本文所用的术语“保守变异体”或其语法上的变体指的是将其一个氨基酸残 基以另一个生物学类似的残基进行取代。保守变异体的例子包括将异亮氨酸、 缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸等疏水性残基替代另一个疏水性残基；将极性残基 替代另一个极性残基，例如将精氨酸替代赖氨酸、将谷氨酸替代天门冬氨酸、 或将谷氨酰胺替代天冬酰胺等。
Tβ4定位存在于多种类型的组织和细胞中，因此，可将本文所描述的刺激 诸如Tβ4的LKKTET或LKKTNT肽生成的试剂或者本文所述的其他肽试剂加 入至组合物中，或包含在所述组合物中，从而促使肽试剂从组织和/或细胞中生 成。该类刺激剂可以包括生长因子家族的成员，例如胰岛素样生长因子(IGF-1)、 血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胸腺素α1(Tα1)以及血管内皮生长因子 (VEGF)。更优选地，所述刺激剂为转化生长因子β(TGF-β)或TGF-β超家族的 其它成员。
根据本发明的一个实施方式，利用在受试个体中对本文所述肽试剂的生成 有刺激作用的刺激剂来对受试个体进行处理。
此外，可将有助于降低由神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉 退行性疾病所致的组织退化、伤害或损伤或有助于对受到所述疾病的不利影响 的组织进行恢复的其它试剂与本文所述的肽试剂一同加入至组合物中。例如， 可将本文描述的肽试剂单独或其组合与下述试剂中的任一种或多种组合加入至 组合物中：有效量的抗生素、VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、 IL-1、前胸腺素α和/或胸腺素α1，但并不限于此。
本发明还包括下述的药物组合物，该药物组合物包括在药学可接受载体上 具有药学有效量的本文所述的肽试剂。
用于进行处理的实际剂量、试剂、制剂或组合物可依赖于多种因素进行确 定，所述因素包括受试个体的大小及健康状况等。然而，本领域技术人员可依 据PCT/US99/17282的前文(supra)中所公开的用于确定临床剂量的对方法和 技术进行描述的教导来确定所使用的适当剂量，并将上述参考文献并入至本文 中。
适宜的制剂可包括浓度处于0.001～50重量％范围内的本文所述的肽试剂， 更优选所述浓度范围为0.01～0.1重量％，最优选的浓度为0.05重量％。
本文所述的治疗方法包括对本文所述的肽试剂进行施用或递送的多种途 径，其中包括任意常规的对受试个体的施用技术(例如，直接施用、局部施用、 吸入或全身施用，但并不限于此)。使用本文所述肽试剂的方法及含有本文所述 肽试剂的组合物可通过与药学可接受的非毒性赋形剂或载体相混合而进行配 制。
本发明包括下述抗体的使用，所述抗体与本文所述肽试剂相互作用、或者 对本文所述肽试剂具有促进或抑制作用。提供了基本上由具有不同的表位特异 性的混合单克隆抗体构成的抗体制备物以及单独的单克隆抗体制剂。单克隆抗 体是通过如PCT/US99/17282的前文中所示的本领域技术人员公知的方法由含 有蛋白的片段的抗原进行制备的。本发明中所用术语“抗体”的含义中包括单 克隆抗体和多克隆抗体。
在另外一个实施方式中，本发明提供对受试个体进行治疗的方法，其中对 受试个体施用有效量的调节基因表达的刺激剂。术语“调节”指的是当本文所 述肽试剂过表达时对所述表达进行抑制或限制；而当本文所述肽试剂低表达时 对所述表达进行诱导。术语“有效量”指的是对调节本文所述的肽试剂的基因 表达有效的刺激剂的量，从而能够降低由神经退行性疾病、肌肉退行性疾病、 或神经-肌肉退行性疾病所致的组织退化、伤害或损伤的症状，或能够对受到所 述疾病的不利影响的组织进行恢复。用于调节本文所述肽试剂的基因表达的刺 激剂例如可以为多核苷酸。所述多核苷酸可以为反义多核苷酸、三链体试剂 (triplex agent)、或为核酶。例如，可以使用靶向作用于本文所述肽试剂的 结构基因区域或启动子区域的反义多核苷酸。用于调节本文所述肽试剂的基因 表达的刺激剂也可以为小干扰RNA(siRNAs)。
在另一个实施方式中，本发明提供一种对调节本文所述肽试剂的活性的化 合物进行利用的方法。影响本文所述肽试剂的活性的化合物(例如拮抗剂和激动 剂)包括肽、拟肽、多肽、化学类化合物、锌等矿物质、以及生物试剂。
本发明提供对本文所述刺激剂进行筛选的方法，其包括：使表现出神经退行 性疾病、肌肉退行性疾病、或神经-肌肉退行性疾病的组织与候选化合物进行接 触；以及测定所述组织中LKKTET或LKKTNT肽的活性，若与未接触所述候选 化合物的相应组织中所述肽活性的水平相比，在所述组织中所述肽活性有所增 加，则说明所述化合物能够诱导所述刺激剂。
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年1月13日提交的美国临时申请No.60/643,307的优先权。