一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法
专利汇可以提供一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种异种 角 膜 移 植物 的无菌加工制备方法，采用眼球整体处理，包括两步病毒灭活——紫外线照射和 次氯酸 钠溶液浸泡、去上皮层、两步脱细胞——血清浸泡和渗透压法、削切脱 水 和甘油溶液保存步骤。本发明的制备方法不需要干燥和终端灭菌步骤，工艺简单，生产周期短，生产成本低；柔和脱细胞处理，最大程度地保持了天然角膜基质的结构和组成，透明度、 力 学强度与天然角膜基质无显著性差异，降解与新生角膜组织再生速度相匹配； 抗原 去除和病毒灭活彻底， 生物 相容性 和生物安全性高；甘油保存，结构和性能能够长期保持稳定；临床使用方便，可替代异体角膜进行角膜移植。，下面是一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法专利的具体信息内容。
1.一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法，采用眼球整体处理，包括两步病毒灭活——紫外线照射和次氯酸钠溶液浸泡、去上皮层、两步脱细胞——血清浸泡和渗透压法、削切脱水和甘油溶液保存步骤。
2.根据权利要求1所述的异种角膜移植物，其特征在于，所述异种角膜来源选用猪、马、驴、猴、猫和鸵鸟等非传染性海绵状脑病(TSE)易感动物中的一种。
3.一种如权利要求1-2中任一项所述的异种角膜移植物的无菌加工制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
步骤一、紫外线照射
将无菌的动物眼球眼表部分朝上，置于短波紫外线（200-280nm）下照射;
2
紫外线波长优选254nm，照射时间为1-8h，照射强度为0.03-0.5J/cm，优选0.1-0.3J/
2
cm;
步骤二、次氯酸钠溶液浸泡
将紫外线照射后的眼球再次用浓度为0.1-1g/l的次氯酸钠溶液进行浸泡病毒灭活，浸泡时间为10-60min，溶液用量为眼球重量的5-20倍（v/m）;然后用10-100倍量清洗液（v/m）进行振荡清洗3-10遍，每遍10-60min，去除残留次氯酸钠;
步骤三、去上皮层
用灭菌滤纸轻轻搓去上皮层，暴露出前弹力层;
步骤四、脱细胞
将去上皮的眼球先浸泡于5-20倍量（v/m）经过常规纳滤膜病毒灭活处理的动物自体血清或人血清中，于20-38℃条件下浸泡2-24h;
然后将眼球移入5-50倍量（v/m）浓度为1-5M、温度为2-25℃的高渗盐溶液中，
50-250rpm下振荡处理1-24h;完成一次高渗盐振荡处理后，再采用相同的条件进行低渗振荡清洗;如此重复高渗-低渗振荡清洗处理5-20遍;
步骤五、削切脱水在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，用角膜削切器削去后弹力层和部分基质层，再用环钻进行圆形修整;然后采用甘油溶液进行振荡脱水处理，甘油溶液的浓度为60-100%（v/v），优选75-100%，再优选85-95%；用量为角膜基质重量的
100-500倍量（v/m）；脱水时间为30-120min，优选45-60min;
步骤六、甘油溶液保存在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，将角膜基质转移至装有浓度90-100%（v/v）的无菌甘油保存液的西林瓶中，轧盖密封，获得异种角膜移植物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述异种角膜移植物厚度为
2
100-500μm，面积为60-100mm。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤二所述清洗液和步骤四所述低渗溶液可采用纯化水、注射用水、生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4左右）中的一种。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高渗盐溶液可采用氯化钠、氯化钾或二者混合物溶液中的一种。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤四所述溶液均需经过0.22μm滤膜过滤降低处理过程中的微生物污染风险。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述甘油保存液灭菌方法可采用蒸汽灭菌或滤膜过滤除菌中的一种。
一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
将无菌的动物眼球眼表部分朝上，置于短波紫外线（200-280nm）下照射。紫外线波长
2 2
优选254nm，照射时间为1-8h，照射强度为0.03-0.5J/cm，优选0.1-0.3J/cm。
2
和部分基质层，再用环钻进行圆形修整，面积为60-100mm。
脱水时间为30-120min，优选45-60min。经过脱水后的角膜基质厚度为100-500μm。
2）；
2、本发明提供了两种性质病毒灭活方式相结合进行病毒灭活的方法——紫外线照射和极低浓度的次氯酸钠浸泡相结合，不但可以将病毒风险降到最低，而且与传统的γ射线辐照、强酸强碱和表面活性剂浸泡相比，对角膜基质的结构影响最小；
3、本发明提供了在病毒灭活基础上进行整个眼球柔和脱细胞的方法，采用血清浸泡和高渗-低渗循环处理可以有效脱除细胞及残留碎片（见图3），不会引入酸碱、表面活性剂、交联剂、EDTA等有毒试剂残留风险，具有更高的安全性和良好的生物相容性（见图4）；
4、本发明提供了一种异种角膜移植物简便可行的长期保存方法，不需要进行晾干、冷冻干燥等干燥处理，不仅避免干燥工艺对角膜基质结构和透明度的影响，而且缩短了生产时间和降低了生产成本，适合产业化，还能够保持角膜基质结构与性能的长期稳定性，使得产品具有足够长的货架寿命。
具体实施方式
将获取的无菌猪眼球100个于超净工作台中，眼表朝上置于316L无菌钢盘，钢盘与
254nm紫外灯（50w）距离为30cm，打开紫外灯，照射2h。
然后用20倍量纯化水100rpm速度下振荡清洗10遍，每遍10min，获得彻底病毒灭活的眼球。
10倍量3M氯化钠高渗溶液中，4℃恒温水浴摇床中120rpm速度下振荡清洗4h。再将眼球移入到10倍量纯化水低渗液中，4℃恒温水浴摇床中120rpm速度下振荡清洗4h。重复高渗-低渗处理8遍，得到脱细胞眼球。
75%（v/v）甘油溶液中，80rpm振荡脱水100min，获得300-400μm厚的透明角膜基质。
将获取的无菌驴眼球100个于超净工作台中，眼表朝上置于316L无菌钢盘，钢盘与
254nm紫外灯（50w）距离为30cm，打开紫外灯，照射4h。
然后用30倍量纯化水120rpm速度下振荡清洗10遍，每遍10min，获得彻底病毒灭活的眼球。
20倍量3M氯化钠高渗溶液中，4℃恒温水浴摇床中180rpm速度下振荡清洗8h。再将眼球移入到20倍量纯化水低渗液中，4℃恒温水浴摇床中180rpm速度下振荡清洗8h。重复高渗-低渗处理15遍，得到脱细胞眼球。
2
钻修成圆形，面积约为95mm。将圆形的角膜基质移入到其重量500体积的85%（v/v）甘油溶液中，80rpm振荡脱水30min，获得400-500μm厚的透明角膜基质。
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