一种检测猪瘟病毒的方法
阅读：104发布：2020-05-17
专利汇可以提供一种检测猪瘟病毒的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且发明 的目的是提供一种检测 猪瘟 病毒的方法，可有效的检测猪群中 猪瘟病毒 病原体的分布情况。本发明方法中使用的检测猪瘟病毒的引物组，所述的引物组包含有用于第一次扩增的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1、下游引物序列为SEQ ID NO:2；第二次扩增的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3、下游引物序列为SEQ ID NO:4。本发明筛选了用于检测CSFV的引物组，建立CSFV的检测方法。特异性试验结果表明本发明筛选的引物组对PRV、PRRSV、PEDV、CSFV、TGEV、PCV2 6种病原不敏感，具有良好的特异性。敏感性实验结果表明能检出CSFV的cDNA的最低浓度为1.35×10-6ng/mL，比普通RT-PCR的灵敏度高出1000倍，敏感性较高，能满足临床上CSFV感染检测的要求，可以用于临床检测。，下面是一种检测猪瘟病毒的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测猪瘟病毒的引物组，其特征在于，所述的引物组包含有用于第一次扩增的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1、下游引物序列为SEQ ID NO:2；第二次扩增的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3、下游引物序列为SEQ ID NO:4。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测猪瘟病毒的制品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。
4.一种用于猪瘟病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。
5.权利要求1所述的引物组在检测猪瘟病毒中的应用。
6.一种检测猪瘟病毒的方法，所述的方法包括如下的步骤：
1)核酸样品的提取：
提取待检测样品的RNA核酸，进行反转录为cDNA备用；
2)第一次扩增：
使用权利要求1中所述的第一次扩增的引物对的上游引物和下游引物对cDNA样品进行扩增，
3)第二次RT-PCR扩增：将第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，使用使用权利要求1中所述的第二次扩增的引物对上游引物和下游引物进行扩增；
4)2.5结果判定
将第二次RT-PCR扩增PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待检样品的泳道内出现目的条带，判为CSFV核酸阳性，否则为阴性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的目的条带的大小为494bp。
一种检测猪瘟病毒的方法
技术领域
背景技术
[0002] 猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus，CSFV)引起的一种猪的高接触性、高死亡率的急性热性传染病[1]。该病呈世界性分布，感染后表现为高热稽留，全身各器官组织出现败血、梗死、坏死，母猪出现流产、死胎、木乃伊胎或弱仔等症状，给养猪业带来了巨大的经济损失，严重影响了世界各国间的猪只贸易的往来。目前国际动物性卫生组织(OIE)将其列为法定疫病之一，我国将其列为一类传染病。
[0003] 尽管我国在上世纪50年代就研制出了世界上较为有效的猪瘟兔化弱毒疫苗，并且成功控制了CSFV在我国的大规模爆发，但猪瘟并没有得到根除。近年来，猪瘟在我国的流行呈现非典型性、慢性、持续性感染和隐性感染等新特点，普通RT-PCR方法虽然具有快速、特异性强、适合做大面积的检测等优点，并且可以获得cDNA基因序列，来进行CSF的流行病学研究及CSFV的进化变异情况，有着不可替代的优势。但是目前猪瘟病毒基因组的含量一般都较低，使用常规PCR扩增得到的产物量经常不能满足后续实验的需要，且敏感性不高；另外，免疫猪群发生猪瘟的情况越来越多，且容易导致基层兽医人员误诊。因此，监测猪群中病原体的分布，及时了解猪场的CSF 疫苗免疫效果和发病情况就对于有效防治动物疫病尤为重要。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种检测猪瘟病毒的方法，可以有效的检测猪群中猪瘟病毒病原体的分布情况，从而为猪瘟早期预防诊断上起到重要作用。
[0005] 本发明首先提供一种用于检测猪瘟病毒的引物组合，包含有用于第一次扩增的外引物对(CSFV-P3)，其序列如下：
[0006] 上游引物：TAACTGGGGCACAAGGCCGGCT(SEQ ID NO:1)，
[0007] 下游引物：TTTCTTTATAGGTTCATCCCTCATG(SEQ ID NO:2)；
[0008] 第二次扩增的内引物对(CSFV-P4)，其序列如下：
[0009] 上游引物ACAGGGGGGCTAGTAAAACAATGTA(SEQ ID NO:3)，
[0010] 下游引物ACTATCAGCCACAGGACATATCTTC(SEQ ID NO:4)；
[0011] 引物组合在制备检测猪瘟病毒的制品中的应用。
[0013] 本发明再一个方面提供一种检测猪瘟病毒的方法，所述的方法包括如下的步骤：
[0014] 1)核酸样品的提取：提取待检测样品的RNA核酸，进行反转录为cDNA备用；
[0015] 2)第一次扩增：使用CSFV-P3上游引物和下游引物对cDNA样品进行扩增，
[0016] 3)第二次RT-PCR扩增：将第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，使用CSFV-P4上游引物和下游引物进行扩增；
[0017] 4)2.5结果判定
[0018] 将第二次RT-PCR扩增PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待检样品的泳道内出现494bp的目的条带，判为CSFV核酸阳性，否则为阴性。
[0019] 本发明筛选了用于检测CSFV的引物组，建立CSFV的检测方法。特异性试验结果表明本发明筛选的引物组对PRV、PRRSV、PEDV、 CSFV、TGEV、PCV2 6种病原不敏感，具有良好的特异性。敏感性实验结果表明能检出CSFV的cDNA的最低浓度为1.35×10-6ng/mL，比普通RT-PCR的灵敏度高出1000倍，敏感性较高，能满足临床上 CSFV感染检测的要求，可以用于临床检测。附图说明
[0020] 图1：CSFV E2蛋白保守性分析图；
[0021] 图2：CSFV nested RT-PCR的特异性实验图，
[0022] 其中：M、DL-2000Marker；1、PRV；2、PRRSV；3、PEDV； 4、CSFV；5、TGEV 6、PCV2；0、阴性对照；
[0023] 图3：RT-PCR的敏感性试验图，
[0024] 其中：M.DL-2 000Marker；0.阴性对照；1-10泳道依次为cDNA 稀释10－1-10－11 10倍梯度稀释浓度PCR鉴定结果；
[0025] 图4：敏感性试验图，
[0026] 其中：M.DL-2 000Marker；0.阴性对照；泳道1-10依次为 cDNA稀释10－1-10－11 10倍梯度稀释浓度PCR鉴定结果。
具体实施方式
[0027] 本发明所使用的试剂如下：
[0028] CSFV疫苗购自青岛易邦生物工程有限公司，
[0029] RNA iso Plus、premix Taq(Ex Taq Versionn 2.0plus dug)、dNTPs、 Ex Taq、5×Rever TranscriptaseM/MLV Buffer、Rever Transciptase M-MLV、DNA Marker(DL2000)、pMD19-T载体、DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；LB培养基、琼脂粉购自青岛高科园海博生物技术有限公司；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；氨苄青霉素购自Sigma公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇购自上海国药。
[0030] Eppendorf 5418离心机：上海心亮实业有限公司；超净工作台：苏州净化设备有限公司；PCR基因扩增仪：Applied Biosystems 9700， Applied Biosystems；电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器有限公司；微量振荡器：金坛市恒丰仪器厂；紫外可见分光光度计：日本岛津；全温振荡器：中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；电子天平：上海海康电子仪器厂；紫外凝胶成像系统：T2A，BIO-RAD。
[0031] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0032] 实施例1：引物的筛选
[0033] 根据GenBank上发表的CSFV基因序列(基因登录号： AY259122)，为筛选CSFV特异性引物，采用NCBI中CD-Search (Conserved Domains Search)程序对CSFV全基因序列进行分析， CSFV全基因序列共包括21个功能性蛋白，其中CSFV E2蛋白 (pestivirus_E2)序列与保守序列数据库(CDD-Conserved)中序列号为Cdd：pfam16329的保守序列相比，E-value值最小，保守性最高(图1)。为保证引物特异性，同时增加引物筛选过程中的可选择性，最终确定内引物对E2蛋白序列进行扩增(基因序列起止位点 2444-3553)。
[0034] 使用Primer premier5.0软件设计2对外引物P1、P2与两对内引物 P3、P4，其中，保证内引是对CSFV E2蛋白进行扩增(扩增位置位于2444-3553)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(见表1)。
[0035]
[0036] 对上述设计的引物采用CSFV-P1/P2、CSFV-P1/P4、CSFV-P3/P2、 CSFV-P3/P4的组合方式进行巢式PCR试验，及特异性、灵敏度和重复性试验，筛选出目的引物组：
[0037] 1、CSFV巢式PCR方法的特异性试验
[0038] 以伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒(PCV2)的核酸和ddH2O为模板进行目的基因的扩增，然后分别将PCR产物进行电泳鉴定，检验所建立的CSFV巢式PCR方法的特异性。
[0039] 2、CSFV巢式PCR方法的敏感性试验
[0040] 紫外分光光度计测定CSFV的cDNA浓度，然后将CSFV的cDNA 进行10倍比的梯度稀释，共稀释10个梯度，然后用RT-PCR方法和所建立的CSFV巢式PCR方法进行目的基因的扩增，分别将PCR产物进行电泳，观察结果以确定反应的敏感性。
[0041] 对CSFV PCR方法的退火温度和退火时间等进行优化，优化后第1次PCR体系25μL：包括cDNA 2.0μL，Ex Taq酶0.5μL，dNTP 2.0μL，CSFV p1 0.5μL，CSFV p2 0.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dd H2O补足25μL。反应体系为94℃/5min、30×(94℃/30s、55℃/30s、 72℃/
90s)、72℃/10min，最后4℃冷却10min结束反应；第2次PCR 反应体系：94℃/5min、30×(94℃/30s、52℃/30s、72℃/90s)、72℃ /10min，最后4℃冷却10min结束反应。
90s)、72℃/10min，最后4℃冷却10min结束反应；第2次PCR 反应体系：94℃/5min、30×(94℃/30s、52℃/30s、72℃/90s)、72℃ /10min，最后4℃冷却10min结束反应。
[0042] 用建立的CSFV巢式PCR方法进行PCR扩增，重复5次试验，以验证结果的可靠性。
[0043] 通过特异性和灵敏性筛选，最终确定的引物组的序列信息如下：
[0044] 表2：引物序列信息
[0045]
[0046] 其中CSFV-P3、CSFV-P4检测CSFV的效果如下：
[0047] 应用建立的CSFV nested RT-PCR方法，分别对提取的PRV、 PRRSV、PEDV、CSFV、TGEV、PCV2的核酸及ddH2O进行PCR 扩增，结果见图2。由图2可知，所确定的引物组只有在检测CSFV 的cDNA模板时会出现与试验设计相符合的494bp的特异性扩增条带，其他5种病原和阴性对照检测均没有出现目的条带；表明所筛选的引物组与猪的其他常见病原无交叉反应，说明建立的检测方法具有特异性强的特点。
[0048] 将CSFV的反转录产物用紫外分光光度计测定，cDNA浓度是135 ng/mL，将其进行10倍的梯度稀释，共稀释10个梯度，用RT-PCR 方法和所建立的CSFV巢式PCR方法进行扩增，结果见图3。由图3 可知，RT-PCR方法对CSFV能够扩增出目的片短的最大稀释度为 10×10-5ng/mL，即cDNA最小检出浓度为1.35×10-3ng/mL；由图4 可知，建立的CSFV巢式PCR方法对CSFV能够扩增出目的片段的最大稀释度为10×10-8ng/mL，即cDNA最小检出浓度为1.35×-6
10 ng/mL；所建立的CSFV巢式PCR比RT-PCR方法的灵敏性至少高 1000倍。
10 ng/mL；所建立的CSFV巢式PCR比RT-PCR方法的灵敏性至少高 1000倍。
[0049] 实施例2：
[0050] 将猪瘟病毒疫苗按照疫苗使用说明进行稀释，取适量稀释液，进行核酸的提取。
[0051] 一、病毒RNA的提取及反转录为cDNA
[0052] 1、病毒RNA的提取
[0053] (1)取250μL疫苗稀释液置于1.5mL离心管中，加入750μL RNA iso Plus，颠倒混匀6～8次，冰浴5～10min。
[0054] (2)12000g 4℃离心5min，吸上清600μL至新的1.5mL离心管中，加入150μL三氯甲烷(氯仿)，颠倒混匀后，冰浴5min.
[0055] (3)12 000rpm 4℃离心15min。
[0056] (4)吸取200μL上清放于新的1.5mL离心管中，加入200μL 异丙醇，颠倒混匀后，－20℃放置1h。
[0057] (5)12 000g 4℃离心10min。
[0058] (6)将上清弃去，用1mL 75％乙醇洗涤2次，7500g 4℃离心 5min。
[0059] (7)洗涤完成后，将洗涤液弃去，把离心管倒置在超净工作台的吸水纸上进行干燥，用20μL DEPC水将RNA溶解，置于-80℃冰箱保存备用。
[0060] 2、病毒RNA反转录为cDNA
[0061] 按照表1-2反转录体系在20μL的PCR反应管中加入试剂混匀，在42℃水浴l h，然后72℃水浴10min，将反转录好的cDNA保存在-20℃冰箱。
[0062] 表3：反转录反应体系(20μL)
[0063]
[0064] 3、CSFV nested RT-PCR方法反应条件的优化
[0065] 3.1第一次扩增
[0066] 表4：第一次RT-PCR扩增反应体系
[0067]
[0068]
[0069] 在冰盒上配置上表25ul体系，CSFV p1/CSFV p2引物用量分别为0.5和1.0μL，[0070] 对CSFV巢式PCR方法进行第一次PCR扩增引物浓度、退火温度、退火时间的优化。反应条件：预变性94℃/5min，变性94℃ /30s，退火温度共设置51、53、54、55、56、57、59℃7个梯度，延伸72℃/90s，进行30个循环。终延伸72℃/10min，最后4℃冷却10min，第一次扩增结束。
[0071] 3.2第二次RT-PCR扩增
[0072] 表5第二次RT-PCR扩增反应体系
[0073]
[0074]
[0075] 在冰盒上配置上表25ul体系，见表1-4。对CSFV巢式PCR 方法进行退火温度、退火时间的优化。反应条件：预变性95℃/5min，变性94℃/30s，退火温度共设置49、50、51、52、53、55、57、58℃ 8个梯度，延伸72℃/1min，进行30个循环。终延伸72℃/10min，最后4℃冷却
10min，第二次扩增结束。
10min，第二次扩增结束。
[0076] 4、结果判定
[0077] 二扩结束后，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。取每个扩增样5ul进行120V、45min核酸电泳，如果待检样品的泳道内出现 494bp的目的条带，判为CSFV核酸阳性，否则为阴性。
[0078] 对出现的目的条带切胶回收后，进行测序操作，测序结果表明目的条带正是对应的CSFV片段，表明本发明能够有效的检测CSFV。
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