一种新的单克隆抗体的制备方法及用途
阅读：290发布：2021-02-08
专利汇可以提供一种新的单克隆抗体的制备方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新的单克隆 抗体 的制备方法及用途。揭示了一种获得高抗体滴度的DNA 疫苗 免疫方法和基于 哺乳动物 细胞内目的蛋白特异位点 生物 素化的表达系统，开发了一种 抗原 需求量极低的酶联免疫方法。，下面是一种新的单克隆抗体的制备方法及用途专利的具体信息内容。
1.一种筛选单克隆抗体的方法，包括：
(1)提供构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；
将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液；
(2)提供构建物2，该构建物2包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因；
将构建物2免疫哺乳动物，取哺乳动物脾脏细胞制备杂交瘤细胞；
(3)将步骤(1)获得的含有生物素化抗原的裂解液与包被有亲和素的固相载体接触，从而生物素化的抗原被固定于固相载体；以该生物素化的抗原来筛选步骤(2)获得的杂交瘤细胞分泌的抗体，获得特异性抗所述抗原的单克隆抗体。
2.一种制备生物素化抗原的方法，包括：
提供构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；
将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原。
3.一种制备抗体的方法，包括：提供构建物2，该构建物2包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因；
将构建物2免疫哺乳动物，获得哺乳动物的免疫血清，其中包括抗所述抗原的多克隆抗体；或将构建物2免疫哺乳动物，获取哺乳动物的脾脏细胞，制备单克隆抗体。
4.一种评估抗体的效价的方法，包括：
提供构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；
将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液；
将获得的含有生物素化抗原的裂解液与包被有亲和素的固相载体接触，从而生物素化的抗原被固定于固相载体；以该生物素化的抗原来评估特异性抗该抗原的抗体的效价。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，表达盒1中，在启动子1与生物素连接酶BirA编码基因之间，还包括KOZAK基因；或
表达盒2中，在启动子2与AviTag编码基因之间，还包括KOZAK基因和/或纯化标签编码基因；或
表达盒3中，在启动子3与信号肽编码基因之间，还包括KOZAK基因；或
表达盒4中，在启动子4与信号肽编码基因之间，还包括KOZAK基因。
6.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的生物素连接酶BirA编码基因具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或。
所述的AviTag具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或
所述的GM-CSF编码基因具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；或
所述的信号肽是人IgE重链信号肽；更佳地，所述的IgE重链信号肽具有SEQ ID NO：3中第16-69位所示的核苷酸序列；或
所述的KOZAK基因具有SEQ ID NO：中第7-15位所示的核苷酸序列；或
所述的纯化标签是Flag标签；更佳地，所述的Flag标签编码基因具有SEQID NO：10所示的核苷酸序列。
7.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的抗原是刺激哺乳动物免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内外发生特异性结合的物质；
较佳地，所述的抗原选自：病毒蛋白，细菌蛋白；更特别地，所述的病毒蛋白包括：汉滩病毒来源的蛋白，波马拉病毒来源的蛋白，流感病毒来源的蛋白，禽流感病毒来源的蛋白，疱疹病毒来源的蛋白，猪瘟病毒来源的蛋白，黄病毒来源的蛋白，乙肝病毒来源的蛋白，呼吸道合胞病毒来源的蛋白；所述的细菌蛋白包括：幽门螺杆菌来源的蛋白，念珠菌来源的蛋白，鼠疫菌来源的蛋白，霍乱菌来源的蛋白。
8.一种DNA疫苗，包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因。
9.权利要求8所述的DNA疫苗的用途，用于制备刺激哺乳动物免疫系统使之产生特异性抗体的组合物。
10.一种用于生物素化抗原的构建物，其包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2。
11.权利要求10所述的构建物的用途，用于制备生物素化的抗原。
12.一种试剂盒a，其中包括：
构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；和/或构建物2，该构建物2包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因。
13.一种试剂盒b，其中包括：
构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、用于插入抗原编码基因的多克隆位点、终止子2；和/或
构建物2，该构建物2包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、用于插入抗原编码基因的多克隆位点。
一种新的单克隆抗体的制备方法及用途
技术领域
背景技术
[0002] 单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用，在人类和动物的免疫学诊断方面至今仍有着无可替代的重要作用。
[0003] 单克隆抗体技术的基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱导免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞来承担。肿瘤细胞在体外培养条件下可以无限传代，是永久细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经过免疫的小鼠脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种细胞的特性，一方面可以分泌特异性的抗体，一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力、可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。
[0004] 免疫方法和筛选抗原是决定能否获得高亲和力、能识别天然抗原表位的单抗的重要因素。DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，这种核酸分子是一种细菌质粒，在克隆了特异性的基因以后，能在真核细胞中表达蛋白抗原，刺激机体产生特异性的体液免疫反应和细胞免疫反应。与其他免疫的方法相比，DNA疫苗具有以下优点：没有感染的风险；诱发针对天然蛋白表位的抗体，长期持续的免疫反应；便于构建具有协同作用的细胞因子疫苗；纯化容易，生产成本低，稳定性不受温度影响。DNA免疫存在的一个关键问题是如何提高DNA疫苗的免疫原性和体液免疫反应。当前主要的研究方向集中在优化DNA疫苗的本身构建、佐剂和接种方案和途径。
[0005] 免疫动物的血清抗体效价评估和筛选能分泌特异性识别抗原的杂交瘤细胞需要高质量的抗原。利用原核和真核系统表达的重组蛋白存在着明显缺陷：大肠杆菌表达的蛋白不能被修饰和正确的折叠，筛选到的单抗往往不能识别天然结构的抗原；哺乳动物细胞表达蛋白实验周期长，产量低，成本高，一些蛋白较难表达例如转录因子。用来评价抗体滴度和筛选杂交瘤细胞的抗原的获得是限制单克隆抗体制备的瓶颈。
[0006] 因此，需要开发简易的单克隆抗体免疫策略和筛选方法，以用于大规模的制备能够识别天然抗原表位的单克隆抗体。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种新的单克隆抗体的制备方法及用途。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种筛选单克隆抗体的方法，包括：
[0009] (1)提供构建物1，该构建物1包括(5’→3’)：表达盒1，其包括(5’→3’)启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括(5’→3’)启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；
[0010] 将构建物1转染(如瞬时转染)哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液；
[0011] (2)提供构建物2，该构建物2包括(5’→3’)：表达盒3，其包括(5’→3’)启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括(5’→3’)启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因；
[0012] 将构建物2免疫哺乳动物，取哺乳动物脾脏细胞制备杂交瘤细胞；
[0013] (3)将步骤(1)获得的含有生物素化抗原的裂解液与包被有亲和素的固相载体接触，从而生物素化的抗原被固定于固相载体；以该生物素化的抗原来筛选步骤(2)获得的杂交瘤细胞分泌的抗体，获得特异性抗所述抗原的单克隆抗体。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种制备生物素化抗原的方法，包括：
[0015] 提供构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；
[0016] 将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种制备抗体的方法，包括：提供构建物2，该构建物2包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因；
[0018] 将构建物2免疫哺乳动物，获得哺乳动物的免疫血清，其中包括抗所述抗原的多克隆抗体；或将构建物2免疫哺乳动物，获取哺乳动物的脾脏细胞，制备单克隆抗体。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种评估抗体的效价的方法，包括：
[0020] 提供构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；
[0021] 将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液；
[0022] 将获得的含有生物素化抗原的裂解液与包被有亲和素的固相载体接触，从而生物素化的抗原被固定于固相载体；以该生物素化的抗原来评估特异性抗该抗原的抗体(包括多克隆抗体或单克隆抗体)的效价。
[0023] 在另一优选例中，表达盒1中，在启动子1与生物素连接酶BirA编码基因之间，还包括KOZAK基因；或
[0024] 表达盒2中，在启动子2与AviTag编码基因之间，还包括(5’→3’)KOZAK基因和/或纯化标签(包括但不限于：Flag，Myc等)编码基因；或
[0025] 表达盒3中，在启动子3与信号肽编码基因之间，还包括KOZAK基因；或[0026] 表达盒4中，在启动子4与信号肽编码基因之间，还包括KOZAK基因。
[0027] 在另一优选例中，所述的生物素连接酶BirA编码基因具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或。
[0028] 所述的AviTag具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或
[0029] 所述的GM-CSF编码基因具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；或
[0030] 所述的信号肽是人IgE重链信号肽；更佳地，所述的IgE重链信号肽具有SEQ ID NO：3中第16-69位所示的核苷酸序列；或
[0031] 所述的KOZAK基因具有SEQ ID NO：中第7-15位所示的核苷酸序列；或[0032] 所述的纯化标签是Flag标签；更佳地，所述的Flag标签编码基因具有SEQID NO：10所示的核苷酸序列。
[0033] 在另一优选例中，所述的抗原是刺激哺乳动物免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质；较佳地，所述的抗原选自(但不限于)：病毒蛋白，细菌蛋白；更特别地，所述的病毒蛋白包括(但不限于)：汉滩病毒(HTNV)来源的蛋白(如核衣壳蛋白)，波马拉病毒(Pumala)来源的蛋白(如核衣壳蛋白)，流感病毒来源的蛋白，禽流感病毒来源的蛋白，疱疹病毒来源的蛋白，猪瘟病毒来源的蛋白，黄病毒来源的蛋白，乙肝病毒来源的蛋白，呼吸道合胞病毒来源的蛋白；所述的细菌蛋白包括(但不限于)：幽门螺杆菌来源的蛋白，念珠菌来源的蛋白，鼠疫菌来源的蛋白，霍乱菌来源的蛋白。
[0034] 在另一优选例中，所述的抗原选自但不限于：人NGAL抗原(人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)，汉滩病毒HTNV型核衣壳蛋白NP蛋白，汉滩病毒HNTV型核衣壳蛋白NP与Pumala型病毒核衣壳蛋白NP融合蛋白或SEQ IDNO：1所示的蛋白。
[0035] 在另一优选例中，表达盒中各元件之间，还可包括：连接肽编码基因，或多克隆位点基因。
[0036] 在另一优选例中，所述的启动子1、启动子2、启动子3、启动子4是相同的或不同的；可以是组成型启动子(如CMV，SV40，T7，pMC1，PGK等)、诱导型启动子、或特异性表达启动子。
[0037] 在另一优选例中，所述的启动子1、启动子2、启动子3、启动子4选自(但不限于)：巨细胞病毒早早期增强子启动子(CMV启动子)，人延伸因子1亚基启动子(EF-1a启动子)。
[0038] 在另一优选例中，所述的启动子1和启动子3为CMV启动子；所述的启动子2和启动子4为EF-1a启动子。
[0039] 在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。
[0040] 在另一优选例中，所述的表达载体的骨架载体是pBudCE4.1。
[0041] 在本发明的另一方面，提供一种DNA疫苗，包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因。
[0042] 在本发明的另一方面，提供所述的DNA疫苗的用途，用于制备刺激哺乳动物免疫系统使之产生特异性抗体的组合物。
[0043] 在本发明的另一方面，提供一种用于生物素化抗原的构建物，其包括(5’→3’)：表达盒1，其包括(5’→3’)启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括(5’→3’)启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2。
[0044] 在本发明的另一方面，提供所述的构建物的用途，用于制备生物素化的抗原。
[0046] 构建物1，该构建物1包括(5’→3’)：表达盒1，其包括(5’→3’)启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括(5’→3’)启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；和/或
[0047] 构建物2，该构建物2包括(5’→3’)：表达盒3，其包括(5’→3’)启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括(5’→3’)启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因。
[0048] 在另一优选例中，所述的试剂盒a用于制备生物素化抗原、制备抗所述抗原的抗体、筛选单克隆抗体或评估抗体的效价。
[0049] 在本发明的另一方面，提供一种试剂盒b，其中包括：
[0050] 构建物1，该构建物1包括(5’→3’)：表达盒1，其包括(5’→3’)启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括(5’→3’)启动子2、AviTag编码基因、用于插入抗原编码基因的多克隆位点、终止子2；和/或
[0051] 构建物2，该构建物2包括(5’→3’)：表达盒3，其包括(5’→3’)启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括(5’→3’)启动子4、信号肽编码基因、用于插入抗原编码基因的多克隆位点。
[0052] 在另一优选例中，所述的试剂盒b用于将特定抗原插入到抗原编码基因的多克隆位点中，进而用于制备生物素化抗原、制备抗所述抗原的抗体、筛选单克隆抗体或评估抗体的效价。
[0054] 图1、pBud-Dse双启动子分泌性表达载体的改造示意图。
[0055] 图2、BirA的密码子优化后的序列。
[0056] 图3、pBirA-N载体EF-1a启动子改造的读码框序列。
[0057] 图4、Western blot检测HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)蛋白在细胞内生物素化情况。其中，泳道1为293T细胞裂解液；泳道2为转染含有HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)编码基因的重组pBirA-N质粒的细胞裂解液；3.转染含有HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)编码基因的重组Pbudce4.1质粒细胞裂解液。
[0058] 图5、ELISA法确定链霉亲和素最佳包被浓度。
[0059] 图6、ELISA法确定细胞裂解液稀释浓浓度。
[0060] 图7、HNTV-84Fli的NP全长蛋白包被，单抗活性鉴定。
[0061] 图8、将天然的NGAL全长蛋白(购自中科英沐)包被于多孔板，对抗人NGAL的单抗进行活性鉴定。
具体实施方式
[0062] 本发明人经过深入的研究，揭示了一种获得高抗体滴度的DNA疫苗免疫方法和基于哺乳动物细胞内目的蛋白特异位点生物素化的表达系统，开发了一种抗原需求量极低的酶联免疫方法。
[0063] 术语
[0064] 如本文所用，所述的“构建物”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。
[0065] 如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的蛋白所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件：启动子、编码蛋白的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
[0066] 如本文所用，所述的“生物素化”是指：在哺乳动物细胞内，借助生物素连接酶BirA的作用，带有Avitag标签的蛋白质都能被有效的、特异性地标记上生物素。
[0067] 如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0068] 如本文所用，所述的“可操作地连接”或“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
[0069] 如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0070] 高效DNA疫苗的制备
[0071] 本发明提供了一种制备DNA疫苗的方法，包括：提供构建物2，该构建物2包括(5’→3’)：表达盒3，其包括(5’→3’)启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括(5’→3’)启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因；该构建物或含有该构建物的表达载体可用于免疫哺乳动物，刺激哺乳动物产生免疫应答。
[0072] 本发明的DNA疫苗中，将GM-CSF与抗原共同表达。GM-CSF的主要作用是促进抗原递呈细胞的增殖和分化，可作为DNA疫苗的佐剂，加强抗原的递呈作用，进而增强体液免疫应答，显著增强抗原特异性抗体的产生。
[0073] 任何适于进行蛋白表达的启动子都可被选用于驱动GM-CSF编码基因或抗原编码基因的表达，包括但不限于组成型启动子(如CMV，SV40，T7，pMC1，PGK等)、诱导型启动子、或特异性表达启动子。较佳地，所述的启动子选自：CMV启动子，EF-1a启动子。更佳地，启动子3为CMV启动子；启动子4为EF-1a启动子。
[0074] 作为本发明的更优选方式，表达盒3中，在启动子3与信号肽编码基因之间，还包括KOZAK基因；或表达盒4中，在启动子4与信号肽编码基因之间，还包括KOZAK基因。KOZAK基因序列的添加有利于提高真核表达时的转录和翻译效率。
[0075] 多种信号肽可被应用于本发明，只要其能够引导GM-CSF或抗原进行分泌表达。信号肽是位于分泌蛋白(前体)的N端的一段氨基酸序列，一般由15～30个氨基酸组成，包括三个区：一个带正电信号肽的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列.以中性氨基酸为主，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点。作为本发明的更优选方式，所述的信号肽是IgE重链信号肽。
[0076] 作为本发明的更优选方式，所述的GM-CSF编码基因具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；或所述的IgE重链信号肽具有SEQ ID NO：3中第16-69位所示的核苷酸序列；或所述的KOZAK基因具有SEQ ID NO：中第7-15位所示的核苷酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述多核苷酸同源的多核苷酸，它们是与上述多核苷酸具有至少50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少90％；更佳地至少95％；更佳地至少98％或99％相同性的多核苷酸。这些多核苷酸所编码的蛋白也具有与前述多核苷酸所编码的蛋白相同的功能。此外，可以根据不同的哺乳动物体的密码子偏爱性，进行密码子优化，这种优化的序列也包含在本发明中。
[0077] 本发明为DNA疫苗的制备提供了一个平台，其中所述的抗原没有特别的限制，只要该抗原是刺激哺乳动物免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质；较佳地，所述的抗原选自但不限于：病毒蛋白，细菌蛋白；更特别地，所述的病毒蛋白包括但不限于：汉滩病毒来源的蛋白(如核衣壳蛋白)，Pumala病毒来源的蛋白(如核衣壳蛋白)，流感病毒来源的蛋白，禽流感病毒来源的蛋白，疱疹病毒来源的蛋白，猪瘟病毒来源的蛋白，黄病毒来源的蛋白，乙肝病毒来源的蛋白，呼吸道合胞病毒来源的蛋白；所述的细菌蛋白包括但不限于：幽门螺杆菌来源的蛋白，念珠菌来源的蛋白，鼠疫菌来源的蛋白，霍乱菌来源的蛋白。更佳地，所述的抗原选自但不限于：NGAL抗原，汉滩病毒NP蛋白，汉滩病毒HNTV型核衣壳蛋白NP与Pumala型病毒核衣壳蛋白NP融合蛋白或SEQ ID NO：1所示的蛋白。
[0078] 一般地，表达盒被包含在表达载体中，多种表达载体可被应用于本发明，只要其适合于表达所述的GM-CSF和抗原。较佳地，所述的表达载体是真核表达载体。较佳地，所述的表达载体包含至少2个启动子以便于建立双表达盒。
[0079] 作为本发明的更优选方式，所述的表达载体是以pBudCE4.1载体作为骨架载体改造获得。pBudCE4.1载体自带CMV启动子和EF 1-α启动子双启动子，在CMV启动子和EF1-α启动子分别引入了IgE信号肽和新的多克隆位点，载体命名为pBud-Dse，改造后的载体适用于蛋白的分泌性表达，尤其适合于将编码细胞因子(GM-CSF)的基因和和特异性抗原的基因都克隆在同一个载体中，让这两种基因在同一个细胞内表达，提高动物针对特异性抗原的免疫反应。
[0080] 可以采用本领域技术人员常用的方法将DNA疫苗免疫哺乳动物，从而刺激哺乳动物体内产生免疫应答。例如，一种免疫小鼠的方法如下：4-6周龄BALB/c雌性小鼠，于小鼠两后腿肱四头肌进行肌肉注射，每只小鼠注射80μg。每隔三周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后十天眼眶取血，ELISA法测量滴度。
[0081] 生物素化抗原的制备
[0082] 本发明还提供了一种外源蛋白在哺乳动物细胞内生物素化的表达系统，在此基础上提供了一种抗原需求量极低的酶联免疫方法，用于动物免疫血清的评价和单克隆细胞株的筛选。哺乳动物细胞外源蛋白的生物素化原理如下：
[0083]
[0084] 本发明所述的生物素化抗原的方法如下：提供构建物1，该构建物1包括(5’→3’)：表达盒1，其包括(5’→3’)启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括(5’→3’)启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液。
[0085] AviTag由17个氨基酸残基组成，在体内或体外都能被生物素连接酶BirA(如氨基酸序列GI：49175990)在赖氨酸残基上连接一个生物素分子，在哺乳动物细胞内共表达BirA酶和带有Avi标签的抗原蛋白，可以实现外源蛋白的细胞内生物素化。
[0086] 任何适于进行蛋白表达的启动子都可被选用于驱动生物素连接酶BirA编码基因的表达，包括但不限于组成型启动子(如CMV，SV40，T7，pMC1，PGK等)、诱导型启动子、或特异性表达启动子。较佳地，所述的启动子选自：CMV启动子，EF-1a启动子。更佳地，启动子1为CMV启动子；启动子2为EF-1a启动子。
[0087] 作为本发明的优选方式，在表达盒1中，在启动子1与生物素连接酶BirA编码基因之间，还包括KOZAK基因；或表达盒2中，在启动子2与AviTag编码基因之间，还包括(5’→3’)KOZAK基因和/或纯化标签(包括但不限于：Flag，Myc等)编码基因。
[0088] 一般地，表达盒被包含在表达载体中，多种表达载体可被应用于本发明，只要其适合于表达所述的生物素连接酶BirA或AviTag-抗原融合蛋白。较佳地，所述的表达载体是真核表达载体。较佳地，所述的表达载体包含至少2个启动子以便于建立双表达盒。作为本发明的更优选方式，所述的表达载体是以pBudCE4.1载体作为骨架载体改造获得。
pBudCE4.1载体自带CMV启动子和EF1-α启动子双启动子。
pBudCE4.1载体自带CMV启动子和EF1-α启动子双启动子。
[0089] 不同的生物种类有其自己的使用密码子的偏爱，本发明人还对BirA基因以及构建物中的其他元件包括亲和标签和间隔序列进行了密码子优化，以使之提高表达。
[0090] 作为本发明的优选方式，密码子优化的BirA基因，克隆到pBudCE4.1载体CMV启动子后面。将一段编码AviTag和Flag-tag及多克隆位点序列克隆到EF-1a的启动子后面，新构建的载体命名为pBirA-N。根据抗原基因结构和pBirA-N载体的克隆位点，将抗原基因克隆到EF-1α启动子后面。
[0091] 可将构建物(如表达载体)转染细胞以在细胞内表达生物素化的抗原。由于本发明的优化，仅需要少量的抗原即可实现ELISA检测。因此，可通过将构建物瞬转细胞来制备生物素化的抗原，操作便捷。
[0092] 利用生物素和链霉亲和素高度特异结合的原理，将亲和素(如链霉亲和素SA)包被在固相载体上，然后加入稀释后的细胞裂解液(细胞内表达有生物素化的抗原)，孵育。被生物素化的抗原将被预包被的亲和素高效捕获，按照间接ELISA的方法进行后续的实验。
[0093] 筛选抗体的方法
[0094] 本发明的进一步内容是将(a)DNA疫苗免疫方法和(b)基于抗原生物素化表达系统的抗原需求量极低的酶联免疫方法有效的结合起来，将这两种技术联合应用在单克隆抗体的制备过程中，降低了单克隆抗体制备的成本和难度，缩短了抗原准备阶段的实验周期，提高了单克隆抗体的质量，适合大规模商业化单克隆抗体的开发。
[0095] 本发明的筛选单克隆抗体的方法主要如下：将所述的构建物1转染(如瞬时转染)哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液，将该含有生物素化抗原的裂解液与包被有亲和素的固相载体接触，从而生物素化的抗原被固定于固相载体；同时，将所述的构建物2免疫哺乳动物，取哺乳动物脾脏细胞制备杂交瘤细胞；之后，以该生物素化的抗原来筛选杂交瘤细胞分泌的抗体，获得特异性抗所述抗原的单克隆抗体。
[0096] 基于本发明的优化技术，还提供一种评估抗体的效价的方法，包括：将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液；将获得的含有生物素化抗原的裂解液与包被有亲和素的固相载体接触，从而生物素化的抗原被固定于固相载体；以该生物素化的抗原来评估特异性抗该抗原的抗体(包括多克隆抗体或单克隆抗体)的效价。
[0097] 采用本发明的DNA疫苗免疫动物，DNA疫苗免疫血清抗体滴度高于10000，可以取代传统的用蛋白免疫的方法，结合采用本发明的抗原生物素化表达系统，将构建物瞬时转染哺乳动物细胞，重组抗原在细胞内被生物素化，省去纯化步骤，直接被包被在96孔板的亲和素捕捉。使得单克隆抗体的筛选时间大大缩短，可在两周内完成。并且，60mm培养皿的细胞所提供的生物素化抗原就可以完成单克隆抗体的筛选过程。
[0098] 本发明能做到不需要大量表达和纯化抗原进行动物免疫和筛选，实验周期短，成本低，效率高，单克隆抗体质量高，尤其适合于天然抗原较难获得的蛋白的单克隆抗体制备。采用本发明提供的制备单克隆抗体的新方法，本发明人成功制备了11株抗汉滩病毒HNTV型和PUUV型NP蛋白(N端1-119aa)的单抗。
[0099] 有益效果
[0100] 本发明提供了一种获得高抗体滴度的DNA疫苗免疫方法和基于哺乳动物细胞内目的蛋白特异位点生物素化的表达系统，开发了一种抗原需求量极低的酶联免疫方法。
[0101] 本发明提供了一种高效、经济、便捷的制备单克隆抗体的免疫和筛选新方法，克服了现有的用重组纯化的抗原进行动物免疫和筛选单克隆抗体方法在抗原准备周期长，成本高，筛选出的单克隆抗体无法识别天然结构等缺陷，尤其适合于天然抗原较难获得的蛋白的单克隆抗体的制备。
[0102] 与传统方法相比，本发明的方法避免了抗原大量表达和纯化步骤，降低了成本，缩短实验周期，用DNA疫苗代替蛋白免疫动物，可以模拟天然的抗原在动物体内引起的免疫反应，更容易获得识别天然蛋白表位的单抗，与蛋白相比，DNA疫苗具有纯化容易，生产成本低，稳定性不易受温度影响等优势，本发明提供的DNA疫苗免疫方法可以获得较高滴度的抗体，完全满足杂交瘤细胞融合对抗体滴度的要求。
[0103] 本发明的方法，从载体构建到抗原的获得在两周内可以完成，同时对抗原的需求量极低，一个60mm培养皿的细胞裂解液，不需要纯化，就可以满足整个单克隆抗体制备过程中对抗原的需求量，传统直接将抗原包被在微孔板上的方法至少需要1mg纯化的蛋白。此外，本发明提供的真核细胞生物素化系统适用于所有的哺乳动物细胞，获得的抗原能够被正确的修饰和折叠，蛋白结构与天然抗原接近。
[0104] 本发明提供的单克隆抗体的制备方法尤其适合于天然抗原较难获得的单克隆抗体制备，例如病毒蛋白，细胞转录因子等。
[0105] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0106] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0107] 实施例1、质粒构建
[0108] 载体pBudCE4.1(购自Invitrogen公司，货号：V532-20)，用作起始材料来构建多种构建物。
[0109] pBudCE4.1质粒具有双表达框，分别有两个强启动子CMV启动子和hEF1α启动子负责，可以同时表达两个外源蛋白，且两者表达不互相干扰。pBudCE4.1尤其适合于将编码细胞因子(IL-4，IL-2，IL-6，集落细胞刺激因子等)的基因和特异性抗原的基因都克隆在同一个载体中，让这两种基因在同一个细胞内表达。
[0110] 利用pBudCE4.1构建pBud-Dse双启动子分泌性表达载体，具体如下(图1)：将人的IgE重链信号肽(IgE-leader peptide)的编码序列进行密码子优化以提高表达。起始密码子ATG前引入真核细胞核糖体识别位点Kozak序列GCCGCCACC；信号肽序列后是多克隆位点，全基因合成两段优化的信号肽和多克隆位点序列，一段用限制性内切酶NotI和BglII消化，进而将其连接在pBudCE4.1载体的hEF1α启动子后面的多克隆位点，另一段核苷酸序列用限制性内切酶BamHI和HindIII消化，连接到上一步构建的载体里，通过测序检测分离的克隆，证实没有错误带入。
[0111] 最终，构建的pBud-Dse双启动子分泌性表达载体上hEF1α启动子调控的读码框序列如下(SEQ ID NO：2)：
[0112] GCGGCCGCGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGATCTTATTCCTGG
[0113] TGGCCGCCGCCACCAGGGTGCACAGC GGTACCAGCACAGTGGA
[0114] CTCGAGAGATCT
[0115] 构建的pBud-Dse双启动子分泌性表达载体上CMV-启动子调控的读码框序列如下(SEQ ID NO：3)：
[0116] AAGCTTGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGATCTTATTCCTGGTG
[0117] GCCGCCGCCACCAGGGTGCACAGC TTGCATTCCTGCAGGTCGACA
[0118] TCGATCTTAAGCAGTACTTCTAGAGGATCC
[0119] pBud-Dse-GM-CSF质粒构建如下：获得家鼠的GM-CSF基因，是在pBud-Dse双启动子分泌性表达载体基础上进一步改造的。从小鼠的组织细胞中抽提RNA，反转cDNA，特异性扩增删除信号肽编码序列的GM-CSF基因，大小375bp，利用限制性内切酶PstI和BamHI克隆到CMV启动子调控的读码框内。通过测序检测分离的克隆，证实没有错误带入。
[0120] 其中，pBud-Dse-GM-SCF中的GM-CSF序列如下(SEQ ID NO：4)：
[0121] GCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTA
[0122] GAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCAC
[0123] ATTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGA
[0124] AGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTAC
[0125] GGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGC
[0126] TACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAAC
[0127] ACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCT
[0128] GACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGTCCAAAAATGA
[0129] 扩增引物序列：
[0130] F：5’AACTGCAGGGCACCCACCCGCTCACC 3’(SEQ ID NO：5)；
[0131] R：5’CGGGATCCTTTTTGGACTGGTTTTTT 3’(SEQ ID NO：6)。
[0132] pBirA-N质粒是一种能够使外源蛋白在哺乳动物细胞内特异位点生物素化的真核表达载体，该载体是在pBudCE4.1基础上的进一步改造。将生物素连接酶BirA(氨基酸序列GI：49175990)，进行密码子优化，优化后的序列如图2(SEQID NO：7)。BirA基因全长966个碱基，234个碱基被改变。全基因合成优化的BirA基因，通过限制性内切酶BamHI和HindIII消化连接到pBudCE4.1载体CMV启动子调控的读码框内。通过测序检测分离的克隆，证实没有错误带入。
[0133] 提供17个氨基酸残基组成的短肽标签AviTag(MAGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：8))，在赖氨酸残基(K)上被BirA酶连接一个生物素分子。全基因合成一段N端编码avi标签的序列(ATGGCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAG(SEQ ID NO：9))和Flag标签序列(ATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGCTGAAG(SEQ ID NO：10))以及多克隆位点的序列，且该段基因密码子被优化以利于表达，如图3。通过限制性内切酶NotI和BglII消化连接到包含有BirA编码基因的pBudCE4.1载体的hEF1α启动子调控读码框内。感兴趣的基因克隆到Avi标签后面的多克隆位点上，瞬时转染哺乳动物细胞系，可获得胞内表达的特异位点生物素的目的蛋白。
[0134] 实施例2、真核细胞生物素化系统的建立
[0135] 1、汉滩病毒HNTV型核衣壳蛋白NP(N端1-119aa)-PUUV型(N端1-119aa)真核细胞生物素化表达载体构建
[0136] 汉滩病毒HNTV型核衣壳蛋白NP(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)采用全基因合成，通过限制性内切酶KpnI和BglII连接到pBirA-N载体上感兴趣的基因克隆位点内。以同样的方法，将此基因片段连接到Pbudce4.1载体中，作为阴性对照质粒。
[0137] HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)基因序列如下(SEQ ID NO：1)：
[0138] GAATTCATGGCAACTATGGAGGAATTACAGAGGGAAATCAATGCCCATGAGGGTCAATTAGTGATAGCCAGGCAGAAGGTGAGGGATGCAGAAAAACAGTATGAAAAGGATCCAGATGAGTTGAACAAGAGAACATTAACTGACCGAGAGGGCGTTGCAGTATCTATCCAGGCAAAAATTGATGAGTTAAAAAGGCAACTGGCAGATAGGATTGCAACTGGGAAAAACCTTGGGAAGGAACAAGATCCAACAGGGGTGGAGCCTGGAGACCATCTGAAAGAGAGGTCAATGCTCAGTTATGGTAATGTGCTGGATTTAAACCATTTGGATATTGATGAACCTACAGGACAGACAGCAGACTGG ATGAGTGACTTGACAGACATCCAAGAGGAGATAACCCGCCATGAGCAACAACTTGTTGTTGCCAGACAAAAACTCAAGGATGCAGAGAGAGCAGTGGAAGTGGACCCGGATGACGTTAACAAAAACACACTACAAGCAAGGCAACAAACAGTGTCAGCATTGGAGGATAAACTCGCAGACTACAAGAGAAGAATGGCAGATGCTGTGTCCCGGAAAAAAATGGATACTAAGCCTACTGACCCGACTGGGATCGAACCTGATGATCATCTCAAGGAGAGATCAAGCCTTAGATATGGAAATGTCCTTGATGTAAATGCCATTGACATCGAAGAACCAAGTGGTCAGACAGCAGATTGGCTCGAG
[0139] 上述序列中，两端各设置一个限制性内切酶位点(下划线标示)，汉滩病毒HNTV型核衣壳蛋白NP(N端1-119aa)编码序列与PUUV型(N端1-119aa)编码序列之间包括了15bp的碱基，用于编码柔性连接肽(Gly)5(方框标示)。
[0140] 含有HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)编码基因的重组pBirA-N质粒命名为pBirA-N-HNTV-PUUV；将含有HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)编码基因的重组pBudce4.1质粒命名为pBudce4.1-N-HNTV-PUUV(1-119aa)。将该质粒转化Trans10大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号：CD101-02)，培养。挑取阳性克隆测序，对目的读码框及载体上的Avitag标签进行比对验证，测序结果正确，大量抽提质粒，去除内毒素，OD260测量浓度。
[0141] 2、抗原的表达和生物素化
[0142] 通过脂质体(购自Invitrogen公司)法瞬时转染293T细胞，进行抗原HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)的表达和生物素化。
[0143] (1)转染前一天将1.2×106细胞接种到60mm细胞培养皿中。
[0144] (2)37℃5％CO2的细胞培养箱中培养24h，至80-90％长满。
[0145] (3)配制试剂：
[0146] Solution A：500μl Opti-MEM中加入8μg的pBirA-N-HNTV-PUUV；
[0147] Solution B：500μl Opti-MEM中加入20μl的脂质体；
[0148] Solution B在室温静置5min。
[0149] (4)混合Solution A和Solution B，温和颠倒混匀，室温放置20mins。
[0150] (5)上述混合液加入1ml Opti-MEM，混匀后加60mm皿。
[0151] (6)37℃5％CO2的细胞培养箱中培养6h。
[0152] (7)上述培养液换成含血清的培养液。血清培养液提前加入生物素混匀，终浓度是100μm。
[0153] (8)37℃5％CO2的细胞培养箱培养48h。
[0154] (9)裂解细胞。吸掉细胞上清原液，用1ml预冷的1×PBS(PH＝7.4)洗细胞两次，尽量的除掉未被结合的生物素。加入500-1000μl的细胞裂解液(预冷，加PMSF，终浓度1mM)，混匀，冰上放置5-10分钟。用细胞刮子刮掉细胞，收集细胞裂解液置离心管中，4℃10000g离心10mins，吸取上清-20℃分装保存，表达的抗原HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)包含在上清中。此外，为了后续的验证，用相同的方法平行转染pBudce4.1-N-HNTV-PUUV(1-119aa)质粒，收集细胞裂解液上清。
[0155] 3、Western Blot验证蛋白在真核细胞内生素化情况
[0156] 293T 未 转 染 细 胞、瞬 时 转 染 pBirA-N-HNTV-PUUV 的 细 胞、转 染pBudce4.1-N-HNTV-PUUV(1-119aa)的细胞分别裂解，取上清，各10μl加上样缓冲液，煮沸，上样，加入上样缓冲液，SDS电泳，转膜，封闭，洗涤后，加入HRP标记的链霉亲和素，孵育，显影。从图4中可以得出只有转染了pBirA-N-HNTV-PUUV的细胞才能将HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)蛋白生物素化。因此，本发明人成功建立了真核细胞生物素化系统。
[0157] 实施例3、DNA疫苗的构建及接种方法
[0158] 1、DNA疫苗载体构建
[0159] 扩增HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)编码基因序列，将扩增序列插入到DNA疫苗组合载体pBud-Dse-GM-SCF用KpnI和BglII中。随后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养12-16h后挑单克隆，以菌液为模板，基因引物特异性扩增目的基因，PCR产物进行核酸电泳出现目的基因大小的条带定为阳性克隆，PCR后电泳结果显示，HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)编码基因在900bp处有清晰条带，与目的条带大小一致，且测序完全正确。因此，本发明人成功构建DNA疫苗载体，命名为pBud-Dse-GM-SCF-HNTV-PUUV，其可直接作为DNA疫苗。
[0160] 2、小鼠免疫DNA疫苗
[0161] 本发明提供了用DNA疫苗诱导个体针对某种抗原的方法，包含了给予个体某种质粒的步骤。
[0162] 4-6周龄BALB/c雌性小鼠，于小鼠两后腿肱四头肌进行肌肉注射，每只小鼠注射100μl DNA疫苗混合溶液，混合溶液中pBud-Dse-GM-SCF-HNTV-PUUV(80μg DNA疫苗，溶于100μl PBS)。注射前用酒精擦拭小鼠注射部位，可以看清楚注射区域的皮肤；或者剃掉注射区域的毛，使得皮肤表面暴露，利于注射。注射时，保持针孔的平面部分朝外，缓缓推入疫苗，旋转90度然后慢慢拔出，防止疫苗泄漏到外面，每只后腿注射50μl疫苗混合溶液。注射后，马上使用5mm距离的电极，在针孔两侧插入注射区域的肌肉进行电击，电压为
100v，时长为50ms，共进行5个脉冲。电击仪器为Electro Square Porator T830M(BTX，San Diego，CA)。每隔3周免疫1次，共免疫3次。
100v，时长为50ms，共进行5个脉冲。电击仪器为Electro Square Porator T830M(BTX，San Diego，CA)。每隔3周免疫1次，共免疫3次。
[0163] 第3次免疫后10天眼眶取血，血液在37℃放置1小时后再转移至4℃放置24小时后离心，取上层无色或淡黄色血清，储存于-20℃备用。
[0164] 3、基于链酶亲和素SA的ELISA方法检测鼠血清特异抗体
[0165] (1)链酶亲和素SA包被浓度的确定
[0166] 梯度包被链酶亲和素SA，包被量从0-40μg/ml变化，100μl/孔、4℃过夜，洗涤后，质量体积比2％BSA(PBST溶液稀释)封闭，洗涤后，加入生物素标记的HRP(购自R&D)，孵育1h后，洗涤，加底物，显色，数据处理。
[0167] 结果如图5，从中可以看出链霉亲和素的饱和浓度范围在20-40μg/ml，为了节约蛋白，采用20μg/ml的包被浓度。
[0168] (2)细胞裂解液最佳稀释度的确定
[0169] 4℃过夜包被链酶亲和素，包被浓度20μg/ml，100μl/孔，洗涤后用质量体积比4％BSA(PBST溶液稀释)封闭，含生物素化HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)蛋白的细胞裂解原液(参见实施例2中“2”)用PBS稀释，稀释倍数从高到低分别为10、31.6、
100、316、1000、3160、10000、31600倍共8个梯度，加入到微孔中，100μl/孔，孵育后，洗涤，加入DNA疫苗免疫的小鼠血清，再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(购自上海中科英沐生物科技有限公司)，显色，读数。处理数据。
100、316、1000、3160、10000、31600倍共8个梯度，加入到微孔中，100μl/孔，孵育后，洗涤，加入DNA疫苗免疫的小鼠血清，再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(购自上海中科英沐生物科技有限公司)，显色，读数。处理数据。
[0170] 结果如图6，可见细胞裂解液的饱和稀释倍数在316-1000之间。
[0171] (3)基于链酶亲和素SA的ELISA方法检测DNA免疫小鼠血清的滴度
[0172] (1)包被链酶亲和素SA，20μg/ml，100μl/孔，4℃放置过夜。
[0173] (2)洗涤后加入3％BSA(PBST稀释37℃封闭2h)。
[0174] (3)洗涤后加入含生物素化HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)蛋白的细胞裂解原液，1：300倍稀释，100μl/孔，在摇床上震动1-2mins，充分混匀。37℃孵育45mins-1h。
[0175] (4)洗涤后，DNA疫苗小鼠血清作一系列梯度的稀释，100μl/孔，37℃孵育2h。
[0176] (5)洗涤后，加二抗，羊抗鼠IgG(H+L)多抗稀释1000倍，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0177] (6)洗涤后加入酶反应底物，100μl/孔，2M硫酸终止反应。
[0178] (7)读数、整理数据。
[0179] 结果如表1，可见在小鼠血清中获得的高滴度的抗体。
[0180] 表1、第三次DNA疫苗免疫之后小鼠血清中的抗体滴度
[0181]
[0182] 结果，采用本发明提供的DNA疫苗免疫方法，小鼠的血清抗体滴度在10000以上。
[0183] 实施例4、杂交瘤细胞的融合及克隆
[0184] 1、细胞准备
[0185] 骨髓瘤细胞的准备：收集经8-氮鸟嘌呤筛选过的小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0(均购自上海中科英沐生物科技有限公司)，显微镜下观察细胞活性，将活性良好的对数增殖期的细胞洗涤后计数，细胞悬浮在DMEM培养液中备用。
[0187] 脾脏细胞的准备：解剖利用前述制备的DNA疫苗(pBud-Dse-GM-SCF-HNTV-PUUV)加强免疫后小鼠，取脾脏，用机械法分散脾细胞，经滤网过滤得脾细胞悬液，DMEM培养液洗涤后计数。
[0188] 2、细胞融合
[0189] 取1×107骨髓瘤细胞(NS-1或SP2/0细胞)与5×107小鼠脾细胞(按1∶5比例)混合于50ml离心管中，加入无血清培养液，离心，1500rpm，3分钟，弃上清。振松沉淀细胞，逐滴加入50％PEG 1ml，边加边摇晃，1分钟内加完。静置90秒，让PEG继续作用。然后在2.5分钟内逐滴加入37℃预温的无血清培养液10ml，静置5分钟，终止PEG的作用。融合后细胞悬液离心，1000rpm，3分钟。弃上清，沉淀细胞轻轻打匀，加入25ml完全培养液，4
接种于加有饲养层细胞的96孔板内，50μl/孔，每孔2×10 骨髓瘤细胞。置37℃，5％C02培养箱内培养。第二天，加入2×HAT的完全培养液，100μl/孔，使孔内终浓度为1×HAT，杀死未融合的骨髓瘤细胞。
接种于加有饲养层细胞的96孔板内，50μl/孔，每孔2×10 骨髓瘤细胞。置37℃，5％C02培养箱内培养。第二天，加入2×HAT的完全培养液，100μl/孔，使孔内终浓度为1×HAT，杀死未融合的骨髓瘤细胞。
[0190] 3、杂交瘤细胞筛选
[0191] (1)ELISA检测方法的建立
[0192] 建立方法参照实施例3中“3”。
[0193] 将链霉亲和素蛋白用ELISA包被液稀释成40μg/ml包被到96孔板内，100μl/孔。用稀释液封闭后，加入生物素化HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)蛋白裂解稀释液(生物素化HNTV(N端1-119aa)-PUUV(N端1-119aa)蛋白的细胞裂解原液以PBS稀释)，孵育后洗涤去除杂蛋白，加入待测孔内杂交瘤细胞培养上清，同时加入阳性、阴性对照，阳性对照为稀释过的免疫后小鼠血清，阴性对照为新鲜培养液。随后加入HRP酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(酶标二抗)，温育后用TMB-H2O2显色，反应10分钟后，加入2mol/L H2SO4终止反应，以波长450nm测OD值。
[0194] (2)筛选单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞
[0195] 融合后10天左右，待杂交瘤细胞集落长至孔底1/5面积的时候，即用前述(1)的ELISA方法筛选融合细胞抗体阳性孔。
[0196] (3)杂交瘤细胞克隆化
[0197] 选择抗体阳性且滴度高的孔用有限稀释法对其中的杂交瘤细胞进行克隆化，一般稀释到1个细胞/孔。待细胞培养至20％板底面积时，吸取细胞培养上清用ELISA方法再次筛选抗体阳性孔。若连续3次克隆，每次克隆率小于2/3和阳性率都为100％，这样获得的细胞即为单克隆。
[0198] 表2、11株单克隆抗体融合率和阳性率
[0199]
[0200] 11株单克隆抗体的特性测定如表3。
[0201] 表3、抗汉滩NP蛋白单克隆抗体的特性
[0202]
[0203] 实施例5、抗汉滩NP蛋白单克隆抗体对于病毒株的识别能力
[0204] 参照万泰公司汉滩病毒(84Fli毒株和L99毒株)IgG抗体检测试剂盒(HFRS-IgG ELISA)中提供的检测方法，本发明人验证了11株抗体对于汉滩病毒NP蛋白全长的识别能力。
[0205] 结果如图7，可见，其中的5株抗体(OD大于0.5)能识别中国流行毒株HNTV-84Fli的NP全长蛋白。
[0206] 实施例6、抗人NGAL的单抗
[0207] 采用如前同样的方法，不同点在于将抗原替换为人NGAL(其编码基因的GenBank登录号EU644752中第67-600位)。结果，制备获得了7株抗人NGAL的单抗。
[0208] 参照万泰公司汉滩病毒IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)中提供的检测方法，本发明人验证了7株抗体对于天然的NGAL抗原(其氨基酸序列参见GenBank登录号GenBank：CAA67574.1中第20-198位)的识别能力。
[0209] 结果如图8，这7株抗体均能识别天然的NGAL抗原。
[0210] 综上，采用本发明提供的制备单克隆抗体的新方法，成功制备获得11株抗汉滩NP蛋白(N端1-119aa)的单抗。本发明人采用同样的方法制备了7株抗人NGAL的单抗，均能识别天然的NGAL抗原。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 减毒的非洲猪瘟病毒疫苗 | 2020-05-17 | 515 |
| 猪瘟病毒配体表位多肽SE241及其应用 | 2020-05-12 | 688 |
| 针对典型性猪瘟病毒的嵌合疫苗抗原 | 2020-05-14 | 560 |
| 一种猪瘟病毒E2次单位疫苗及其制备 | 2020-05-14 | 519 |
| 一种猪瘟病毒纯化方法 | 2020-05-11 | 467 |
| 非洲猪瘟病毒疫苗 | 2020-05-11 | 50 |
| 抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用 | 2020-05-17 | 777 |
| 一种猪瘟病毒抗体检测ELISA诊断试剂盒 | 2020-05-13 | 248 |
| 一种检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒 | 2020-05-16 | 455 |
| 猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途 | 2020-05-17 | 435 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈