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一种制备冷沉淀的方法及其应用

阅读：456发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种制备冷沉淀的方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种冷沉淀的制备方法，包括以下步骤：(1)取-20℃冻存的健康人血浆，24小时内升温到-15℃至-5℃；(2)在不高于37℃ 循环水条件下，使血浆完全融化，(3)将血浆温度控制在-2℃至5℃，静置3-9个小时；(4)离心，得到冷沉淀。经对比试验验证，是以普通冷沉淀为原料制备得到的人凝血因子VIII比活的约4倍，远远高于目前中国药典规定的1IU/mg的标准，本领域公知，人凝血因子VIII非常的昂贵，比活的大大提高，意味着经济效益的巨大提升，工业应用前景良好。，下面是一种制备冷沉淀的方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种冷沉淀的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取-20℃冻存的健康人血浆，24小时内升温到-15℃至-5℃；
(2)在不高于37℃循环水条件下，使血浆完全融化，
(3)将血浆温度控制在-2℃至5℃，静置3-9个小时；
(4)离心，得到冷沉淀。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的健康人血浆冻存时间不超过1年。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的血浆温度为-1至3℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述静置时间为4-7小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，离心机转速为14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：离心速度为1.5～3.5L/min.台次。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述离心采用高速管式离心机。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)提取得到的冷沉淀的冻存方法是：将冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET 包装盒中于-60至-80℃存放。
9.一种由权利要求1-8任意一项所述制备方法得到的冷沉淀。
10.权利要求9所述冷沉淀在制备人凝血因子Ⅷ中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：人凝血因子Ⅷ的制备方法是：将冷沉淀在氨丁三醇(Tris)缓冲液中溶解；使用铝胶/聚乙二醇吸附/沉淀；离心去沉淀；SD病毒灭活处理；阴离子交换层析后，超滤配制得到人凝血因子Ⅷ。

说明书全文

一种制备冷沉淀的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及血液制品的制备工艺，具体涉及一种制备高比活冷沉淀的方法，以及这种冷沉淀在生产人凝血因子VIII生产中的应用。

背景技术

[0002] 冷沉淀是由新鲜冰冻血浆制备的成分血，是新鲜冰冻血浆(FFP)在4℃下融化后残留的白色冷沉淀物，主要含有第Ⅷ因子、纤维蛋白原、血管性血友病因子(VWF)、第ⅩⅢ因子以及纤连蛋白等成分，是制备人凝血因子Ⅷ制剂的原料。

[0003] 现有的从血浆中制备冷沉淀的方法有两种：快速融化离心法和虹吸法。因为虹吸法制得的冷沉淀中人凝血因子VIII含量低，工业上通常采用快速融化离心法来制备冷沉淀，其基本步骤为：将冰冻血浆置于4℃水浴装置中融化，当血浆基本融化后，在低温环境下离心，提取冷沉淀(见李忠平，李瑞兰，“用快速融化离心法制备冷沉淀”，中国输血杂志1994年第7卷第1期，P20-22)。

[0004] 之后，在此基础上又提出了一种改良快速融化离心法，即用冰块将水浴箱内水温降至4℃，而后将新鲜冰冻血浆放入水浴箱，待新鲜冰冻血浆融化到一半多的时，将还未融化的血浆捏散成碎冰块，以加速其溶解。调控水温使之恒定在4℃继续融化。约2小时后，待新鲜冰冻血浆尚存少许碎冰块时及时取出,离心10min,离心力3000×g，温度0℃。在净化室内100级净化台上操作分离出上层血浆，下层(25ml±5ml)血浆和白色沉淀物即为冷沉淀(见巩玉梅，唐国俊，王明珠，严颂旭，“两种制备冷沉淀方法的比较及临床效果观察”，中国公共卫生管理2009年第25卷第5期，P534)。

[0005] 这种改良的思路是缩短融化时间，一边融化一边离心，但是在容量控制方面要求高，如果离心前碎冰块的量过多，冷沉淀的容量则会超量，过少则会影响冷沉淀的沉积。在实际的工业生产中，快速融化血浆常常使用到热媒，温度控制较为困难，提取冷沉淀不够均匀。而且，上述方法制得的冷沉淀的量较少，通常每吨血浆仅得到8.9kg冷沉淀，冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的比活为39.951IU/g(见营长永等，“人凝血因子VIII分离纯化工艺研究”，山东大学硕士学位论文)，而且对冷沉淀进一步分离纯化制得的人凝血因子Ⅷ制剂的量也比较少，造成血浆资源的浪费。

[0006] 因此，寻找其他方式来改良冷沉淀的制备方法，以获得稳定的、高比活的冷沉淀，并将其应用于生产人凝血因子VIII，对工业生产和提高血浆利用率都有重要的意义。

发明内容

[0007] 为解决现有技术的问题，本发明提供了一种制备冷沉淀的新方法，以及这种冷沉淀在人凝血因子VIII(即：FVIII)生产中的应用。

[0008] 本发明提供的一种冷沉淀的制备方法，包括以下步骤：

[0009] (1)取-20℃冻存的健康人血浆，24小时内升温到-15℃至-5℃；

[0010] (2)在不高于37℃循环水条件下，使血浆完全融化；

[0011] (3)将血浆温度控制在-2℃至5℃，静置3-9个小时；

[0012] (4)离心，得到冷沉淀。

[0013] 其中，步骤(1)中的健康人血浆冻存时间不超过1年；

[0014] 步骤(2)中，本领域也可以将完全融化后的血浆称为血浆池；所处理的血浆量的大小或血浆池的大小，依设计能力不同而不同，从现有处理能力来看，处理1000～9000袋血浆(590～600g/袋)，形成500～5000L的血浆池，均为合宜的；如果有适宜的设备，处理更大量的血浆，也是可能的。

[0015] 进一步的，步骤(3)所述的血浆温度为-1至3℃，所述静置时间为4-7小时；

[0016] 按照本发明步骤(3)的条件处理后得到的冷沉淀性质基本恒定。

[0017] 步骤(4)中，离心机转速为14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次，优选速度为1.5～3.5L/min.台次；

[0018] 优选的，步骤(4)中所述离心采用高速管式离心机。

[0019] 步骤(4)提取得到的冷沉淀的可以采用以下方法进行冻存：将冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET 包装盒中于-60至-80℃存放。

[0020] 本发明的另一方面涉及由本发明上述方法制备得到的冷沉淀。

[0021] 本发明还涉及所述冷沉淀在制备人凝血因子Ⅷ中的用途。

[0022] 可以采用现有方法，制备人凝血因子Ⅷ，其工艺路线为：将冷沉淀在氨丁三醇(Tris)缓冲液中溶解；使用铝胶/聚乙二醇吸附/沉淀；离心去沉淀；SD病毒灭活处理；阴离子交换层析后，超滤配制得到人凝血因子Ⅷ；如文献：离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂，罗亮等，华西药学杂志，2000,15(3)：174～176)公开的方法，但是本发明的制备方法中，不需要专门对冷沉淀进行洗涤或10℃～15℃条件下进行酸沉淀结合PEG沉淀。

[0023] 按照以上步骤，可以获得比活最高达到157IU/mg的人凝血因子Ⅷ。经对比试验验证，是以普通冷沉淀为原料制备得到的人凝血因子VIII比活的约4倍，远远高于目前中国药典规定的1IU/mg的标准，本领域公知，人凝血因子VIII非常的昂贵，比活的大大提高，意味着经济效益的巨大提升，工业应用前景良好。

[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0025] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明

[0026] 图1 工艺流程图

具体实施方式

[0027] 实施例1 本发明冷沉淀的制备方法

[0028] 1)取新鲜冰冻血浆约1800袋(590～600g/袋)

[0029] 新鲜冰冻血浆指：新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过1年；

[0030] 将新鲜冰冻血浆置于-10℃的低温冷库中，在24小时以内使血浆升温至-5至-15℃进行预融；

[0031] 2)不高于37℃循环水融化，经2小时已完全融化，形成约1000L的均一血浆(或称血浆池)；

[0032] 3)血浆(池)温度控制在-2℃至5℃，静置9小时；

[0033] 4)采用高速管式离心机离心提取冷沉淀，离心机转速14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次，弃去上清，得到冷沉淀；

[0034] 可以立即用于制备人凝血因子Ⅷ；如果不马上使用，可以用以下方法进行保存；

[0035] 5)保存

[0036] 将提取的冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET包装盒中于-60至-80℃存放。

[0037] 实施例2 本发明冷沉淀的制备方法

[0038] 1)取新鲜血浆约4200袋

[0039] 新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过1年；

[0040] 将新鲜冰冻血浆置于-10℃的低温冷库中，在24小时以内使血浆升温至-5至-15℃进行预融；

[0041] 2)不高于37℃循环水融化，经6小时形成约2500L的均一血浆池；

[0042] 3)血浆池温度控制在-1℃至3℃，静置6小时；

[0043] 4)采用高速管式离心机离心提取冷沉淀，离心机转速14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次；弃去上清，得到冷沉淀；可以立即用于制备人凝血因子Ⅷ；如果不马上使用，可以用以下方法进行保存；

[0044] 5)保存

[0045] 将提取的冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET包装盒中于-60至-80℃存放。

[0046] 实施例3 本发明冷沉淀的制备方法

[0047] 1)取新鲜血浆约4200袋

[0048] 新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过1年；

[0049] 将新鲜冰冻血浆置于-10℃的低温冷库中，在24小时以内，使血浆升温至-5至-15℃进行预融；

[0050] 2)不高于37℃循环水融化，经6小时形成约2500L的均一血浆池；

[0051] 3)血浆池温度控制在-1℃至3℃，静置3小时；

[0052] 4)采用高速管式离心机离心提取冷沉淀，离心机转速14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次；弃去上清，得到冷沉淀；可以立即用于制备人凝血因子Ⅷ；如果不马上使用，可以用以下方法进行保存；

[0053] 5)保存

[0054] (1)将提取的冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET包装盒中于-60至-80℃存放。

[0055] 实施例4 本发明方法制备的冷沉淀在制备人凝血因子Ⅷ中的应用

[0056] 1、工艺流程

[0057] 本发明高比活冷沉淀→Tris缓冲液溶解→铝胶/聚乙二醇吸附/沉淀→离心去沉淀→有机溶剂/去污剂病毒灭活→阴离子交换层析→超滤配制

[0058] 2、本工艺流程为常规人凝血因子VIII制备工艺流程。可以参照文献：参照文献：离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂，罗亮等，华西药学杂志，2000,15(3)：174～176)，但是不需要专门对冷沉淀进行洗涤或10℃～15℃条件下进行酸沉淀结合PEG沉淀。

[0059] 实施例5 本发明方法制备的冷沉淀与常规方法制备的冷沉淀的比活分析[0060] Ⅰ、原料

[0061] 本发明方法制备的冷沉淀为实施例1或2或3制备

[0062] 常规冷沉淀的制备：

[0063] 1)取新鲜血浆约4200袋

[0064] 新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过1年；

[0065] 将新鲜冰冻血浆置于-10℃的低温冷库中，在24小时以内，使血浆升温至-5至-15℃进行预融；

[0066] 2)不高于37℃循环水融化，当获得约500L血浆池后立即开始离心，即同时进行血浆融化和离心直至全部血浆离心完成。

[0067] 3)采用高速管式离心机离心提取冷沉淀，离心机转速14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次；弃去上清，得到常规方法制备的常规冷沉淀；将本发明方法及常规方法制备的两种沉淀进一步制备成溶解液：

[0068] II、制备方法：参照文献：离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂，罗亮等，华西药学杂志，2000,15(3)：174～176)，但是不需要专门对冷沉淀进行洗涤或10℃～15℃条件下进行酸沉淀结合PEG沉淀。

[0069] (1)Tris缓冲液溶解沉淀，检测溶解液FVIII效价和蛋白浓度；

[0070] (2)经铝胶/聚乙二醇吸附/沉淀→离心去沉淀→有机溶剂/去污剂病毒灭活→弱阴离子交换层析后，检测FVIII效价和蛋白浓度。

[0071] III、检测方法(参照中国药典2003版附录XN)

[0072] (1)溶解液FVIII效价检测采用ACL7000全自动血凝仪，以标化血浆为标准品，检测FVIII效价；

[0073] (2)同时检测蛋白浓度，用于比较不同原料的纯度；

[0074] (3)检测结果与相同溶解条件的冷沉淀溶解液FVIII比活进行比较；

[0075] (4)本原料优劣主要采用的判定指标为：FVIII纯度(比活性)，其计算公式如下：

[0076] 检测结果见表1：

[0077] 表1.本发明冷沉淀与常规冷沉淀质量比较

[0078]

[0079] 实验结果说明，本发明方法制备得到的冷沉淀的比活约为常规冷沉淀的2倍，弱阴离子交换层析后的产品溶液比活更是达到了常规冷沉淀的3倍，也就是说，本发明冷沉淀中FVIII的含量远远高于常规方法制备的冷沉淀，为后续工艺制备高质量的FVIII打下良好的基础。

[0080] 以下以实验例的方式来说明本发明的有益效果：

[0081] 实验例1 本发明冷沉淀的活性实验

[0082] 本发明高比活冷沉淀与普通冷沉淀均来源于血浆，通过与普通冷沉淀收率进行比较，可以估算出本方法对人凝血因子VIII活性的回收。

[0083] 表2.本发明冷沉淀的活性及与普通冷沉淀活性的比较

[0084]

[0085] 从上表可以看出，对相同量的血浆进行处理，本发明的方法制备得到的冷沉淀比常规方法制备得到的普通冷沉淀量少，但是，本发明所提取的冷沉淀FVIII总活性比普通冷沉淀FVIII总活性高约12％，换句话说，本发明冷沉淀在不损失FVIII活性甚至还有所提高的前提下，大大降低了冷沉淀中杂蛋白的含量。

[0086] 实验例2 使用本发明高比活冷沉淀作为原料，进一步制备人凝血因子VIII制剂[0087] 方法可参照文献：离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂，罗亮等，华西药学杂志，2000,15(3)：174～176)，但是不需要专门对冷沉淀进行洗涤或10℃～15℃条件下进行酸沉淀结合PEG沉淀。

[0088] 以普通冷沉淀，以及本发明高比活冷沉淀为起始原料进行人凝血因子VIII的制备，工艺流程见图1。

[0089] 将本发明冷沉淀和如实施例5中的常规方法制备的冷沉淀，用缓冲液溶解后的溶液，阴离子交换层析洗脱后的溶液，以及最后超滤配制得到的溶液，分别进行活性测定，结果如表3和表4：

[0090] 表3.普通冷沉淀制备人凝血因子VIII的纯度

[0091]

[0092]

[0093] 表4.本发明高比活冷沉淀制备人凝血因子VIII的纯度

[0094]

[0095] 由表3与表4比较可知，使用相同人凝血因子VIII的制备工艺，以普通冷沉淀为原料制备的人凝血因子VIII纯度(比活)最高可达到50IU/mg；而以本发明高比活冷沉淀制备的人凝血因子VIII纯度(比活)均高于100IU/mg。

[0096] 根据前述文献，如果对层析前样品进行特殊前处理，如在10℃～15℃条件下进行酸沉淀结合PEG沉淀，用普通冷沉淀也可以得到高纯人凝血因子VIII，其纯化效果不够稳定；若对冷沉淀进行洗涤后再行上样，增加了操作难度和生产成本，降低了大生产的可行性。

[0097] 而使用本发明冷沉淀，使用现有FVIII的生产工艺，在不增加工序和成本的条件下，就能够容易地得到高纯度的FVIII，因而具有很好的工业应用性。

[0098] 综上所述，本发明方法提取冷沉淀比活均较常规方法提取的普通冷沉淀高约2倍，同从工艺贯通的结果可知，本发明高比活冷沉淀制备的人凝血因子VIII纯度(比活)比普通冷沉淀制备的人凝血因子VIII高约3倍，达到100IU/mg以上，远远高于目前中国药典要求的1IU/mg的标准。

[0099] 本发明的方法简单，易于操作，大大降低了生产成本，同时提高了冷沉淀的比活和人凝血因子VIII纯度，具有良好的经济效益和社会效益。

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一种制备冷沉淀的方法及其应用

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