技术领域
[0001] 本
发明属于
生物制药和血液制品技术领域，具体涉及血液制品生产中一种高收率、低活性损失的
血浆冷沉淀制备方法及该方法所制备的冷沉淀在人凝血因子Ⅷ生产中的应用。
背景技术
[0002] 人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品是一种从健康人血浆中分离纯化获得的血浆蛋白制品，其对缺乏人凝血因子Ⅷ所致的凝血机能障碍具有纠正作用，主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及此类病人的手术出血
治疗。目前，我国有能
力生产人凝血因子Ⅷ的厂家不多，加之原料血浆紧张，该制品出现严重短缺，因此，人凝血因子Ⅷ的生产已引起广泛关注。
[0003] 冷沉淀是新鲜
冰冻血浆在0～4℃溶化后析出的冷不溶物。因其含有高纯度的凝血因子(vWF因子、Ⅷ因子、
纤维蛋白原等)，已成为人凝血因子Ⅷ生产的主要原料。而冷沉淀中的人凝血因子Ⅷ由于分子量大，蛋白结构不稳定，极易产生活性损失，因此，冷沉淀的
质量和收率直接影响着人凝血因子Ⅷ生产效益；而目前血浆冷沉淀的制备多采用
水浴虹吸法或融化离心法。
[0004] 水浴虹吸法：将血浆袋置于恒温水浴箱解冻，转移空袋置于水浴箱外，打开转移空袋的止流夹，启动水浴箱升温使冰冻血浆融化；利用虹吸原理，随着融化时间的延长，冷上清被虹吸至转移空袋内，而冷沉淀则留存在原血浆袋中，从而达到分离血浆与冷沉淀的目的。该方法对冷沉淀分离效果不彻底，导致制得的冷沉淀中人凝血因子Ⅷ含量较低，因此应用效果不如融化离心法。
[0005] 融化离心法：将血浆袋从-20℃冷库取出后置于0～4℃水浴装置中融化过夜，当血浆基本融化后取出进行离心，离心所得沉淀即为冷沉淀。该方法制备冷沉淀得率较高，但由于-20℃冷库取出的冷冻血浆
温度较低，直接置于水浴装置中融化，所需时间较长。有研究表明，冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的活性会随着冰冻血浆融化时间的延长而降低，12h衰减41.17％。因此，常规融化离心法血浆融化时间过长，制备的冷沉淀人凝血因子Ⅷ活性衰减较为严重。
[0006] 同时，血浆的质量决定了冷沉淀的质量，控制好血浆原料的活性衰减，对于从源头上减少冷沉淀Ⅷ因子活性损失具有重要意义，而以往冷沉淀制备工艺研究中对此关注较少。
[0007] 因此，从血浆原料控制开始，开发一种高收率、低活性损失的血浆冷沉淀制备方法，对于人凝血因子Ⅷ的生产尤为重要。
发明内容
[0008] 为克服上述
现有技术的不足，本发明提供了一种高收率、低活性损失的血浆冷沉淀制备方法，以及该方法所制备的冷沉淀在人凝血因子Ⅷ生产中的应用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
[0010] (1)新鲜人血浆速冻：新鲜人血浆采集后经低温速冻工艺冻结成形，并贮于-20℃以下的冻库，保证血浆中各种蛋白成分的活性。
[0011] (2)冷冻人血浆原料运输：采用全自动
温度控制冷冻运输车进行血浆运输，运输过程中每30分钟自动记录温度1次，运输到达后立即转入-20℃冷库贮存。
[0012] (3)冷冻人血浆原料融浆：取-20℃冷库贮存一年内的冷冻人血浆原料，经-5～-3℃预升温处理24～36h，并于0～4℃恒温融浆至完全融化。
[0013] (4)冷冻人血浆原料混合静置：温和搅拌下对完全融化的血浆进行混合，形成均一血浆原料，并于0～4℃恒温静置4～8h。
[0014] (5)血浆低温连续离心：血浆静置后于0～4℃恒温连续离心，制得冷沉淀。
[0015] 其中，步骤(1)中所述的低温速冻工艺为单袋600g新鲜血浆均采用速冻装置于30min内完全冻结至无流动性液体存在，所述速冻装置为-30℃吹
风式连续速冻装置。
[0016] 步骤(3)中，血浆原料预升温处理温度为-5～-3℃，预升温时间为24～36h；恒温融浆温度为0～4℃；
[0017] 优选的，步骤(3)中所述的预升温处理温度为-4～-2℃，预升温时间为24～28h；恒温融浆温度为1～3℃。
[0018] 步骤(4)中，血浆原料恒温静置温度为0～4℃，静置时间4～8h；
[0019] 优选的，步骤(4)中所述的恒温静置温度为1～3℃，静置时间4～5h。
[0020] 步骤(5)中，离心操作采用低温连续离心机，离心机转速1500～2500rpm，离心处理量为400～600L/h。
[0021] 本发明的另一方面涉及由上述制备方法所制备的冷沉淀在人凝血因子Ⅷ生产中的应用。
[0022] 所述人凝血因子Ⅷ可以按如下方法生产：a)含肝素钠的生理盐水溶解冷沉淀，b)质量浓度3％的Al(OH)3凝胶
吸附杂质，c)离心分离，d)上清液过滤后进行S/D病毒灭活，e)离子交换层析，f)
超滤、
透析，g)配液、分装。
[0023] 其中，步骤c)中的离心分离出液温度：10～25℃，离心机转速10000～12000rpm。
[0024] 上述人凝血因子Ⅷ生产方法生产全过程均未使用
乙醇，相较于本领域常规生产工艺更安全。
[0025] 所述人凝血因子Ⅷ也可以按我司已授权中国发明
专利201410496187.9中的方法生产。
[0026] 与现有的技术相比，本发明具有以下的有益效果；
[0027] 1.现有冷沉淀制备工艺中对血浆原料活性衰减关注较少，新鲜人血浆采集后大多直接放置于普通-20℃冷库中进行冷冻，而普通冷库为
密闭空间静态
传热，血浆容器中心降温较慢，往往几小时后还不能完全冻结；长时间处于非冻结状态会对血浆中的人凝血因子Ⅷ活性造成较大影响。本发明采用-30℃吹风式连续速冻装置对单袋600g血浆进行快速低温速冻，可在30min内将每袋血浆原料均完全冻结至无流动性液体存在，有效控制血浆中人凝血因子Ⅷ活性衰减，从而从源头上减少冷沉淀中Ⅷ因子的活性损失。检测结果显示，经低温速冻处理的血浆中人凝血因子Ⅷ效价相较于常规冷冻处理可提高30％以上。
[0028] 2.现有冷沉淀制备工艺中大多将血浆袋从-20℃冷库取出后直接置于0～4℃水浴装置中融化过夜，由于-20℃冷库取出的冷冻血浆温度较低，直接融化所需时间较长，造成制备的冷沉淀中人凝血因子Ⅷ活性衰减较为严重。而本发明通过增加-5～-3℃预升温工序大大减少了血浆融化时间，融浆时间可缩短至3h内，有效保护了血浆中的Ⅷ因子活性。
[0029] 3.有研究表明，融化后的冰冻血浆静置后再进行离心分离可有效提高冷沉淀分离效率，本发明中血浆原料于0～4℃恒温静置4～8h后，再于0～4℃恒温连续离心处理，可使可溶蛋白和不溶蛋白充分分离，显著提高冷沉淀中凝血因子Ⅷ的纯度，有助于获得低蛋白，高比活性的人凝血因子Ⅷ制品。
[0030] 4.按照本发明所述方法制备冷沉淀，并以所制备的冷沉淀为原料生产的人凝血因子Ⅷ产品具有高效价和高比活性，效价大于80％、比活性可达90IU/mg；同时，产品复溶速度快，远低于中国药典复溶时间小于30min的标准，且复溶效果好，复溶液澄清，仅微带乳光。
附图说明
[0031] 图1为本发明冷沉淀制备及以所制备的冷沉淀为原料生产人凝血因子Ⅷ的工艺
流程图；
具体实施方式
[0032] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的
实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0033] 【实施例1】本发明冷沉淀的制备
[0034] (1)新鲜人血浆速冻：单袋600g新鲜血浆采集后均采用-30℃吹风式连续速冻装置于30min内完全冻结至无流动性液体存在，并贮于-20℃以下的冻库，保证血浆中各种蛋白成分的活性。
[0035] (2)冷冻人血浆原料运输：采用全自动温度控制冷冻运输车进行血浆运输，运输过程中每30分钟自动记录温度1次，运输到达后立即转入-20℃冷库贮存。
[0036] (3)冷冻人血浆原料融浆：取-20℃冷库贮存一年内的冷冻人血浆原料1600袋，将冷冻人血浆原料置于
环境温度为-5～-3℃的预升温库中进行预升温处理24h，并于0～4℃低温库中恒温融浆，约2h内全部完全融化，。
[0037] (4)冷冻人血浆原料混合静置：对解冻完毕的血浆进行清洁破袋，并于1t血浆罐中进行混合，形成约1t均一血浆原料；开启温和搅拌，血浆罐控制在恒温0～4℃，并静置6h。
[0038] (5)血浆低温连续离心：血浆静置后采用低温连续离心机进行连续离心分离，制得冷沉淀，离心机转速2000rpm，离心处理量为500L/h，离心温度控制在0～4℃。
[0039] 所得冷沉淀可即刻应用于人凝血因子Ⅷ生产，也可放置于-30℃以下冷库中冻存，保存期限不超过1年。
[0040] 【实施例2】本发明冷沉淀的制备
[0041] (1)新鲜人血浆速冻：单袋600g新鲜血浆采集后均采用-30℃吹风式连续速冻装置于30min内完全冻结至无流动性液体存在，并贮于-20℃以下的冻库，保证血浆中各种蛋白成分的活性。
[0042] (2)冷冻人血浆原料运输：采用全自动温度控制冷冻运输车进行血浆运输，运输过程中每30分钟自动记录温度1次，运输到达后立即转入-20℃冷库贮存。
[0043] (3)冷冻人血浆原料融浆：取-20℃冷库贮存一年内的冷冻人血浆原料3200袋，将冷冻人血浆原料置于环境温度为-5～-3℃的预升温库中进行预升温处理36h，并于0～4℃低温库中恒温融浆，约1.5h内全部完全融化，。
[0044] (4)冷冻人血浆原料混合静置：对解冻完毕的血浆进行清洁破袋，并于2t血浆罐中进行混合，形成约2t均一血浆原料；开启温和搅拌，血浆罐控制在恒温0～4℃，并静置3h。
[0045] (5)血浆低温连续离心：血浆静置后采用低温连续离心机进行连续离心分离，制得冷沉淀，离心机转速2500rpm，离心处理量为400L/h，离心温度控制在0～4℃。
[0046] 所得冷沉淀可即刻应用于人凝血因子Ⅷ生产，也可放置于-30℃以下冷库中冻存，保存期限不超过1年。
[0047] 【实施例3】本发明所制备的冷沉淀用于生产人凝血因子Ⅷ
[0048] 以本发明所制备的冷沉淀为原料，按如下方法生产人凝血因子Ⅷ：
[0049] 冷沉淀溶解(注射用水：1～5L/kg冷沉淀，肝素钠注射液：1～15IU/g注射用水，pH：7.0±0.5，温度：15～25℃)；
[0050]
铝胶吸附(1～3％Al(OH)3凝胶：108g～1080g/kg冷沉淀)，0.1mol/L
醋酸调pH至：6.5±0.5，离心分离(出液温度：10～25℃)；
[0051] 上清液过滤，滤液调整(pH：7.0±0.5，温度：15～25℃)；
[0052] S/D病毒灭活(1％±0.3％Tween-80,0.3％±0.06％TNBP,25～26℃,8h)；
[0053] 经过滤、离子交换层析，超滤、透析，配液、分装，最终制得人凝血因子Ⅷ制品。
[0054] 【实施例4】以本冷沉淀为原料生产的人凝血因子Ⅷ产品检测结果[0055] 委托中国食品药品检定研究院对实施例3中以本冷沉淀为原料生产的人凝血因子Ⅷ产品进行检测，检测报告结果如下：该批次产品检验合格，且具有高效价和高比活性，效价大于80％、比活性高达108.7IU/mg；同时，产品复溶速度快，仅为3min，远低于中国药典复溶时间小于30min的标准，且复溶效果好，复溶液澄清，仅微带乳光。
[0056]
[0057]
