一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用
专利汇可以提供一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种夹心型 肺 癌 肿瘤 标志物免疫 传感器 的制备方法及在肺癌肿瘤标志物的检测中的应用，属于新型纳米功能材料和 生物 传感器 领域。本发明利用贵金属 纳米材料 金@ 银 核壳 纳米棒 作为生物模拟酶，与二抗孵化后作为标记物，同时利用的金纳米棒和还原 石墨 烯两种纳米材料作为 电极 修饰物，从而制备了一种成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测肺癌肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器。，下面是一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用专利的具体信息内容。
1.一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，所述夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰还原石墨烯（rGO）、金纳米棒溶胶（Au NRs）、壳聚糖溶液（Chs）、肺癌肿瘤标志物一抗（Ab1）、牛血清蛋白（BSA）、肺癌肿瘤标志物抗原和金@银核壳纳米棒溶胶孵化的肺癌肿瘤标志物二抗（Au@AgNRs-Ab2），所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极，所述Au NRs为20~40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液；
其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
a、制备Au@AgNRs-Ab2；
b、制备夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极；
其中，步骤a制备Au@AgNRs-Ab2的具体步骤如下：
将20mLAu NRs和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在
30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgNO3）溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，然后再加入肺癌肿瘤标志物二抗（Ab2），在4℃下震荡24h，得到Au@AgNRs-Ab2；
步骤b制备夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器工作电极的具体步骤如下：
1）对工作电极进行预处理，使其表面光洁；
2）在1）中得到的电极表面滴加5~10 µL 1~5 mg/mL的rGO水溶液，室温下自然晾干；
3）在2）中得到的电极表面滴加5~10 µL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加3~6 µL 质量分数为0.5% 的壳聚糖溶液（CHs）；
5）在4）中得到的电极表面滴加5~8 µL 10 µg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加3~6 µL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加4~6 µL 预先孵化好的Au@AgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极；
所述的Chs是将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成。
2.如权利要求1所述的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
1）将已知浓度的肺癌肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40~60 µL、pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10 µL抗原混合溶液滴涂到所制备的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和20uL 3~6 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
3.如权利要求1和2所述的夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法和应用，其特征在于所述肺癌肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA-125）、糖类抗原（CA-242）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、组织多肽抗原（TPA）、鳞状细胞癌抗原（SCC）。
一种夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用
技术领域
背景技术
发明内容
其特征在于，所述制备方法包括以下制备步骤：
（1）Au@AgNRs-Ab2的制备
将20mLAu NRs和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在
30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgNO3）溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液中，然后再加入肺癌肿瘤标志物二抗（Ab2），在4℃下震荡24h，得到Au@AgNRs-Ab2。
2）在1）中得到的电极表面滴加5~10 µL 1~5 mg/mL的rGO水溶液，室温下自然晾干；
3）在2）中得到的电极表面滴加5~10 µL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加3~6 µL 质量分数为0.5% 的壳聚糖溶液（CHs）；
5）在4）中得到的电极表面滴加5~8 µL 10 µg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加3~6 µL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加4~6 µL 预先孵化好的Au@AgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和20uL 3~6 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
具体实施方式
4℃下震荡24h，得到Au@AgNRs-Ab2。
3）在2）中得到的电极表面滴加5 µL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加3 µL 质量分数为0.5% 的壳聚糖溶液（CHs）；
5）在4）中得到的电极表面滴加5 µL 10 µg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加3 µL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加4 µL 预先孵化好的Au@AgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
3）在2）中得到的电极表面滴加810 µL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加4 µL 质量分数为0.5% 的CHs；
5）在4）中得到的电极表面滴加6 µL 10 µg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加4 µL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加5 µL 预先孵化好的Au@AgNRs-Ab2溶液， 4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
3）在2）中得到的电极表面滴加10 µL的Au NRs，室温下自然晾干；
4）在3）中得到的电极表面滴加6 µL 质量分数为0.5% 的CHs；
5）在4）中得到的电极表面滴加8 µL 10 µg/mL的Ab1溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；
6）在5）中得到的电极表面滴加6 µL 1%的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，滴上一系列浓度不同的肺癌肿瘤标志物抗原溶液；
7）在6）中得到的电极表面滴加6 µL 预先孵化好的Au@AgNRs-Ab2溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到夹心型肺癌肿瘤标志物免疫传感器的工作电极。
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入10mL pH=7.0的PBS缓冲溶液和
20uL 3 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；
根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入18mL pH=7.4的PBS缓冲溶液和
20uL 5 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；
根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
2）将作为参比电极的甘汞电极、作为对电极的铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入25mL pH=8.0的PBS缓冲溶液和
20uL 6 mol/L的过氧化氢（H2O2）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；
根据所得的电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
3）将待测样品溶液代替肺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肺癌肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。
2）按照实施例7~9所述的步骤进行检测，肺癌肿瘤标志物的检测技术指标见表1。
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