用于癌症治疗的阿片样物质和抗癌药的组合
阅读：606发布：2020-08-09
专利汇可以提供用于癌症治疗的阿片样物质和抗癌药的组合专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 治疗 癌症患者的新的策略，其基于阿片样物质受体激动剂和抗癌化合物的组合。，下面是用于癌症治疗的阿片样物质和抗癌药的组合专利的具体信息内容。
1.用于治疗癌症的阿片样物质受体激动剂和至少一种抗癌药的组合，其中
(a)将所述阿片样物质受体激动剂以一个或多个剂量施用于患者，以建立治疗有效血浆水平至少1周的期限；且
(b)施用选自化疗剂、细胞毒性剂、细胞抑制剂、免疫毒性剂和/或放疗的至少一种抗癌药以建立具有治疗有效血浆水平的期限；且
(c)所述a)和b)的期限重叠。
2.权利要求1的组合，其中同时或依次施用所述抗癌药和所述阿片样物质受体激动剂。
3.权利要求1或2的组合，其中所述阿片样物质受体激动剂能够抑制细胞增殖和/或诱导细胞死亡。
4.权利要求1-3任一项的组合，其中所述患者已经接受包含抗癌药的预先治疗。
5.上述权利要求任一项的组合，其中提供治疗相关剂量的阿片样物质受体激动剂的施用期限至少为2周，更优选4周，且甚至更优选地代表长期治疗。
6.上述权利要求任一项的组合，其中阿片样物质受体激动剂选自：
i.美沙酮类化合物，例如D/L-美沙酮、D-美沙酮、L-美沙酮、去甲美沙酮；
ii.芬太尼衍生物，例如芬太尼、舒芬太尼和卡芬太尼；
iii.吗啡烷化合物，例如吗啡、可待因、海洛因、dextrallorphane、右美沙芬、dextrophanol、二甲啡烷、左洛啡烷、levofurethylnormorphanol、左美沙芬、左芬啡烷、左啡诺、甲吗喃、吗吩醇、奥昔啡烷、非诺啡烷和佐尔啡诺；
iv.苯并吗啡烷衍生物，例如5,9-DEHB、alazocine、阿那佐辛、布马佐辛、布替佐辛、卡巴佐辛、可加佐辛、环佐辛、地佐辛、依他佐辛、乙唑辛、乙基酮环佐辛、氟溴柳胺、吉马佐辛、伊巴佐辛、酮佐辛、美他佐辛、莫沙佐辛、喷他佐辛、非那佐辛、夸达佐辛、thiazocine、托那佐辛、伏拉佐辛和8-CAC；
v.4-苯基哌啶衍生物，例如哌替啶、凯托米酮、阿尼利定、匹米诺定、苯哌利定、呋替啶、阿法罗定、三甲利定包括4-苯基吡咯烷衍生物例如普罗法多和4-苯基氮杂庚环衍生物，例如美普他酚；
vi.环己烷衍生物，例如替利定、U-50488、曲马多和他喷他多；
vii.内源性阿片样物质，例如内啡肽类、脑啡肽类、强啡肽类、痛敏肽、皮啡肽、吗啡感受素、内吗啡肽和衍生自蛋白质阿黑皮素(POMC)的片段。
7.上述权利要求任一项的组合，其中所述阿片样物质受体激动剂属于美沙酮类。
8.权利要求7的组合，其中所述阿片样物质受体激动剂是D/L美沙酮，且优选其盐酸盐形式。
9.上述权利要求任一项的组合，其中抗癌药选自：
i.嵌入物质，例如蒽环类抗生素、多柔比星、伊达比星、表柔比星和柔红霉素；
ii.拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康、托泊替康、喜树碱、层状素D、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌、安吖啶、玫瑰树碱类和金精三羧酸；
iii.亚硝基脲化合物，例如卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，链佐星；
iv.氮芥类，例如环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀、苯达莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、马磷酰胺、曲磷胺和异环磷酰胺；
v.烷基磺酸酯类，例如白消安和曲奥舒凡；
vi.烷化剂，例如丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺和噻替派；
vii.铂类似物，例如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂和四硝酸三铂；
viii.微管破坏药，例如长春碱、秋水仙胺和诺考达唑；
ix.抗叶酸剂，如甲氨蝶呤、氨基蝶呤、二氯甲氨喋呤、培美曲塞、雷替曲塞和普拉曲沙；
x.嘌呤类似物，如硫唑嘌呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和克拉立滨；
xi.嘧啶类似物，如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-氮尿嘧啶、吉西他滨；
xii.类固醇激素，如孕激素、雄激素、糖皮质激素类、地塞米松、泼尼松龙和泼尼松；
xiii.抗-癌抗体，例如单克隆抗体、放射性标记的抗体和抗体-药物缀合物；
xiv.抗-癌肽类，例如放射性标记的肽类和肽-药物缀合物；
xv.α、β或γ射线照射、电子颗粒或放射性标记的化学化合物；
xvi.紫杉烷和紫杉烷类似物，如紫杉醇和多西他赛。
10.上述权利要求任一项的组合，其中所述抗癌药是甲氨蝶呤、阿糖胞苷、顺铂、替莫唑胺、依托泊苷、长春新碱、硫鸟嘌呤、吉西他滨、β射线照射或γ射线照射，且尤其是多柔比星、顺铂、奥沙利铂、利妥昔单抗或曲妥珠单抗。
11.上述权利要求任一项的组合，其中所述患者患有如根据疾病和相关健康问题第10修订版(ICD-10)的国际统计分类所分类的肿瘤，且其中所述肿瘤选自C00-C97类的恶性肿瘤、D00-D09类的原位肿瘤、D10-D36类的良性肿瘤和不确定的或未知特性的D37-D48类的肿瘤。
12.权利要求11的组合，其中所述患者患有选自如下的肿瘤：胰腺癌、肝胚细胞瘤、结肠癌、(小细胞肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、白血病的前形式、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、启动胶质母细胞瘤的干细胞、肿瘤干细胞和多发性骨髓瘤。
13.上述权利要求任一项的组合，其中所述患者显示出内在抗性或获得性抗性。
14.权利要求13的组合，其中所述患者显示如下抗性的一种或多种：
i.细胞凋亡抗性；
ii.多重抗药性；
iii.抗癌药抗性；
iv.细胞毒性药物抗性；
v.对活性氧类别的抗性；
vi.对DNA损伤剂的抗性；
vii.对毒性抗体的抗性；
viii.多柔比星或利妥昔单抗抗性；
ix.顺铂抗性；
x.替莫唑胺抗性；
xi.对HER2靶向疗法例如曲妥珠单抗治疗的抗性；
xii.特别地对如下药物物质的一种或多种的单一或交叉抗性：甲氨蝶呤、阿糖胞苷、顺铂、依托泊苷、长春新碱、紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、替莫唑胺、硫鸟嘌呤、替尼泊苷、地塞米松、泼尼松龙、环磷酰胺、二磷酰胺、多柔比星、表柔比星、伊达比星、柔红霉素、巯嘌呤和氟达拉滨。
xiii.照射抗性(例如α、β、γ或俄歇电子)。
15.上述权利要求任一项的组合，其中给予等于或低于仅使用所述抗癌药治疗癌症的推荐剂量的剂量的抗癌药。
16.权利要求15的组合，其中给予低于仅使用所述抗癌药治疗癌症的推荐剂量的三分之一、优选低于其三十分之一且更优选低于其一百分之一的剂量的抗癌药。
17.上述权利要求任一项的组合，其中对所述患者施用至少另一种阿片样物质受体激动剂。
18.权利要求17的组合，其中将阿片样物质吗啡与另一种阿片样物质芬太尼一起施用于所述患者。
19.选择上述权利要求任一项的组合和/或所述组合中使用的药物剂量的方法，包含下列步骤：
(a)提供癌细胞、细胞系或初级细胞的体外培养物，所述细胞优选分离自癌活组织检查或液体样品(例如血液、羊膜液、胸膜液、脑脊髓液或腹膜液)；
(b)任选地测试来自步骤(a)的细胞的阿片样受体表达；
(c)用阿片样物质激动剂或至少一种抗癌药或其组合处理来自步骤(a)的细胞；
(d)分析所述细胞的细胞死亡/存活和/或阿片样受体的表达；
(e)基于期望的细胞死亡/存活或增殖抑制的程度选择阿片样受体/抗癌药组合和优选选择所述组合的剂量；和/或
(f)选择抗癌药和优选选择显示期望的阿片样受体诱导程度的所述抗癌药的剂量。
20.选择用于治疗癌症的阿片样物质受体激动剂且优选选择用于所述阿片样物质受体激动剂的治疗剂量的方法，包含下列步骤：
(a)提供癌细胞、细胞系或初级细胞的体外培养物，所述细胞优选自癌活组织检查或液体样品(例如血液、羊膜液、胸膜液、脑脊髓液或腹膜液)；
(b)任选地测试来自步骤(a)的细胞的阿片样受体表达；
(c)处理来自步骤(a)的细胞；
(d)分析所述细胞的细胞死亡/存活；
(e)基于期望的细胞死亡/存活或增殖抑制的程度选择阿片样受体/抗癌药组合和优选选择所述组合的剂量；和/或
(f)选择阿片样物质受体激动剂和优选选择显示期望的诱导细胞死亡程度的所述阿片样物质受体激动剂的剂量。
用于癌症治疗的阿片样物质和抗癌药的组合
[0001] 本发明涉及用于癌症患者治疗的新策略，其基于阿片样物质受体激动剂和抗癌化合物的组合。
背景技术
[0002] 癌症可以被定义为特征在于细胞分化缺失的组织异常生长。该术语包括一大类疾病，其中存在未分化细胞从初始部位侵害性地扩散至身体的其它部分(还发生未分化的细胞复制)，这最终干扰组织和器官的正常功能。
[0003] 癌症主要是环境性疾病，其中90-95％的病例归因于环境因素且5-10％归因于遗传学因素。作为癌症研究人员所使用的环境是指非遗传性地并不仅仅是污染的任何原因。促使癌症死亡的常见的环境因素包括烟草(25-30％)、膳食和肥胖(30-35％)、感染(15-20％)、辐射(电离和非电离，至多10％)、应激、缺乏体育活动和环境污染物。
[0004] 由于每年有超过3百万新的病例和170万死亡病例，所以癌症在欧洲代表了第二位最重要的死亡和发病原因。在全球范围内，癌症在2004年的死亡人数占740万(约占总数的13％)。
[0005] 尽管40％以上的癌症死亡可以得到预防，但是癌症是死亡的主要原因，占欧洲地区总数的20％。值得注意地，仅占世界总人口百分之一的欧洲却具有全球总癌症病例的约四分之一：有时每年有320万新患者。
[0007] 每种癌的特征在于未分化细胞增殖的部位、性质和临床原因，其中癌症发生的潜在机制仍然未得到完全理解。
[0008] 通常使用化疗、放疗和手术治疗癌症。化疗结合手术已经证实用于大量不同癌症类型，包括：乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、成骨性肉瘤、睾丸癌、卵巢癌和某些肺癌。放疗包括使用电离辐射以尝试治愈和改善癌症症状。它在大约全部病例的一半中使用且放射可以来自短距离放射治疗形式的内源或外源。辐射典型地与手术和或化疗结合使用，但对于一些类型的癌症，例如早期的头颈癌，可以单独使用。对于疼痛性的骨转移，发现它在大约70％的人中有效。
[0009] 尽管存在大量治疗策略，但是仍然存在不能用目前治疗选择有效地治疗的肿瘤。此外，放疗和化疗的有效性通常因对身体内其它组织的毒性而受限。此外，抗癌疗法通常因肿瘤细胞对放疗和/或化疗的抗性而无效。
[0010] 因此，在肿瘤学中对于赋予癌症治疗更有效的新策略存在巨大需求。特别地，本发明的目的在于提供用于治疗癌症患者的新方式。
发明内容
[0012] 在第一个方面，本发明涉及用于治疗癌症的阿片样物质受体激动剂和至少一种抗癌药的组合，其中
[0014] (b)施用选自化疗剂、细胞毒性剂、细胞抑制剂、免疫毒性剂和/或放疗的至少一种抗癌药，以建立具有治疗有效的血浆水平的期限；和
[0015] (c)所述a)和b)的期限重叠。
[0016] 这种组合疗法基于如下令人意外的发现：阿片样物质受体激动剂与抗癌药的组合更有效地杀伤癌细胞。此外，发明人可以证实阿片样物质受体激动剂与抗癌药之间的相互作用代表了如图26中所示例的自我强化反馈环。在这种环路的第一个路径中，阿片样物质受体激动剂增强细胞摄取并且抑制抗癌药流出，在所述环路的第二个路径中，蓄积的抗癌药导致癌细胞表面上的阿片样受体表达增加。因此，阿片样物质受体激动剂和抗癌药均可以将其细胞毒性潜力发挥至较高的程度。
[0017] 本发明还基于如下令人意外的发现：在癌细胞的细胞表面上表达的阿片样受体的量在不同癌症类型中是可变的且还显示个体间差异，且这种细胞表面伴随的阿片样受体表达可以因抗癌药而增加。例如，多柔比星、伊达比星、表柔比星、柔红霉素、卡铂、奥沙利铂、顺铂、依托泊苷、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、替尼泊苷、利妥昔单抗、氟达拉滨能够诱导在癌细胞的细胞表面上表达的阿片样受体的数量增加。
[0018] 通过广泛的体外和体内实验，可以显示可以对不同癌症类型实施本发明的组合疗法。此外，还证实不同抗癌药和不同阿片样物质在上述反馈环中具有活性。
[0019] 因此，本发明阿片样物质受体激动剂和抗癌药的组合疗法可以通过如下方式的一种或多种改善癌症疗法：
[0020] ·由于阿片样受体的上调，所以对先前阿片样物质不敏感性癌症类型实施阿片样物质受体激动剂疗法。
[0021] ·由于阿片样受体-激动剂-诱导的抗癌药胞内蓄积(因抗癌药摄取增加或流出减少或两者的组合)，所以治疗的效能增强。
[0022] ·这可以导致用常规治疗的抗癌方法不能治疗或无法有效治疗的癌症类型得到治疗。
[0023] ·此外，这可以允许为增强抗癌药的安全性和患者对化疗的依从性而减少剂量。
[0024] ·最终，抗性癌细胞也可能对于抗癌治疗重新恢复敏感性。
[0025] ·此外，在市场上销售的大量阿片样物质和大量抗癌药开拓了找到因效能和/或安全性增加而可能代表改善的治疗的新药组合的路径。
[0026] 在本发明的上下文中，将术语“阿片样物质受体激动剂”定义为天然、合成或半合成物质的化学上不同类别，它们在同一类型受体即所谓的阿片样受体上起激动剂作用。根据镇痛和副作用特性，已知5种类型阿片样受体：μ-受体(配体＝吗啡)、κ[κ]-受体(配体＝酮佐辛)、δ受体(配体＝δ啡肽II)、σ[σ]-受体(配体＝SKF 10081)和随后鉴定的ORL1–受体(配体＝痛敏肽)。与其它受体系统相符，结合研究和功能性研究显i示存在阿片样受体亚型。在μ-和δ-受体2型亚型中，已经描述了μ-1和μ-2和δ-1和δ-2。κ-受体包含另外的κ-3亚型。尤其是有关μ-阿片样受体，本发明中包括其2种亚型。
[0027] 本文所用的术语“阿片样物质受体激动剂”包含完全激动剂和混合激动剂/拮抗剂或部分激动剂，例如丁丙诺啡。
[0028] 阿片样物质种类包括：天然阿片样物质，例如生物碱类，如吗啡或二氢可待因；和半合成阿片样物质，其衍生自天然阿片样物质(例如氢吗啡酮或羟可酮)；或全合成阿片样物质，例如芬太尼或丁丙诺啡。还包括内源性阿片样肽类，其可以在体内天然地作为内啡肽类、强啡肽类或脑啡肽类产生，但也可以合成。
[0029] 本文所用的术语“抗癌药”包括用于治疗癌症的所有化学或物理干预。因此，它包括化疗剂例如细胞毒性剂或免疫毒性剂，而且包括放射性标记的抗体、肽类和化学物质，它们可以发射α、β和γ射线和电子。放疗还包括足够高能量的光子；带电荷的粒子，例如电子、正电子、μ介子、质子、阿尔法粒子和来自加速器的重原子核，而且包括中子和γ射线。
[0030] 将术语“治疗有效血浆水平”定义为导致致死效应的药物血浆水平与导致治疗作用的最低血浆水平之间的血浆水平。在本发明的上下文中，通过增加细胞摄取和/或抑制共施用的抗癌药的细胞流出和/或通过例如细胞凋亡、坏死、有丝分裂突变和自体吞噬诱导细胞死亡得到阿片样物质受体激动剂的治疗作用。在本发明的上下文中，抗癌药的治疗作用根据其杀伤癌细胞和/或诱导癌细胞上阿片样受体表达的能力得出。
[0031] 存在两种观察癌症治疗效果的方式。一种常用的方式是细胞死亡测量值(增加的数据是指更多的细胞死亡)。另一种方式在于测量细胞存活(减少的数据是指存在的活细胞较少或已经失去其增殖潜力)。
[0032] 作为本发明上下文中使用的措词"治疗(treat)"、"治疗(treating)"、"治疗(treatment)"是指使用本发明的组合或包含它们的任意组合物，以便以预防方式预防癌症，或缓解癌症、改善癌症或使癌症终止。除非另有明确地举出，否则它们包括治愈或康复以及缓解、减轻或预防。此外，本文所用的措词"患者"是指哺乳动物，包括人。
[0033] 根据本发明，治疗特别是指抑制癌细胞增殖和/或生长。这种活性可以包括，例如细胞生长抑制或细胞毒性活性以及阻止细胞和/或肿瘤生长。癌细胞增殖是细胞分裂抑制的结果。特别地，阿片样物质受体激动剂诱导肿瘤中的细胞死亡。在本发明的上下文中，细胞死亡包所有类型的细胞死亡。这可以包括坏死和细胞凋亡性细胞死亡或自体吞噬。在本发明的一个实施方案中，细胞死亡由胱天蛋白酶-依赖性或胱天蛋白酶-不依赖性途径活化诱导。然而，阿片样物质受体激动剂可以通过各种途经诱导细胞死亡。在本发明的一个优选的实施方案中，阿片样物质受体激动剂诱导癌细胞中的细胞凋亡。
[0034] 本文所用的术语“癌”以同义词方式用于术语“肿瘤(neoplasm)”，其是指这样的疾病，其中异常细胞不受控制地分裂并且能够侵入其它组织。癌细胞可以通过血液和淋巴系统扩散至身体的其它部分。
[0035] ·将本发明上下文中的术语“常规疗法”和“常规疗法方案”定义为治疗程序(涉及剂量、重复时间和期限)，将它们推荐为协会、联盟如Deutsche Krebshilfe、Deutsche Krebsgesellschaft、Nationacl Cancer Institute(NCI)、National Comprehensive Cancer Network(NCCN)和相应的可以是私立的非政府或联邦组织结构的健康或癌症组织机构的治疗指导原则。这还包括作为抗癌药制造商或销售者开据处方的(优选单一)抗癌药的治疗程序，它们在所述抗癌药的说明书插页中公开。
[0036] 将本发明上下文中的术语“常规疗法时间”定义为常规疗法中的时间，其中将抗癌药施用于患者，而不施用本发明的阿片样物质受体激动剂。该疗法的时间从首次施用抗癌药开始，且可以包括对癌症和抗癌药具有特异性的重复期限(例如每天施用一种剂量2次，持续1周，然后是3周的暂停期，然后再次每天施用一种剂量2次，持续1周，随后是3周的暂停期)，直到抗癌药低于患者治疗血浆水平的时间点。
[0037] 在本发明上下文中的癌症及其不同类型可以用ICD-O标准分类，该标准为ICD-10标准分类C00-C97和D00-D36的专用分类法。或者，可以施用Boecker等人2008，第6章的分类法(Pathologie,Elsevier,Urban&Fischer,p 167-218)。
[0038] 在本发明的另一个实施方案中，所述阿片样物质受体激动剂能够抑制细胞增殖。
[0039] 在本发明的一个实施方案中，同时或依次施用所述抗癌药和所述阿片样物质受体激动剂。
[0040] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述阿片样物质受体激动剂和所述抗癌药的治疗有效血浆水平期限相应地(respectively)大部分重叠。
[0041] 在本发明的另一个优选的实施方案中，抗癌药的治疗有效血浆水平的期限完全在相应的阿片样物质受体激动剂的期限内。
[0042] 当施用两种或更多种抗癌药时，通过两种或更多种抗癌药的组合期限得出部分、大部分或完全重叠的相应期限。
[0043] 在本发明的另一个实施方案中，以患者出现习惯于所述阿片样物质受体激动剂的方式给予阿片样物质受体激动剂。因此，优选等待抗癌治疗至习惯期开始甚至达到坪值为止。这种习惯可能是药物效能降低和/或副作用例如呼吸抑制减少的结果。阿片样物质受体激动剂的副作用是低血压、呼吸抑制、呕吐、便秘、头晕、镇静、欣快感和心脏效应。必须考虑到这种副作用以确定使用阿片样物质受体激动剂和癌症药物的治疗方案。这意味着以极低水平的起始剂量给予阿片样物质受体激动剂，即治疗剂量的1％，然后增加剂量(根据本领域技术人员公知和阿片样物质受体激动剂制造商或销售者公布的阿片样物质受体激动剂指导原则在足够的时间内使其递增至抗癌药和阿片样物质受体激动剂组合所需的治疗水平)。
[0044] 在本发明的一个优选的实施方案中，根据常规的治疗方案确定施用方案和由此在抗癌药治疗有效量血浆水平内的期限。
[0045] 在本发明的另一个方面，用本发明组合治疗的患者已经接受包含抗癌药的预先治疗。
[0046] 在一个更优选的实施方案中，使用抗癌药预先治疗是中断的，甚至终止。
[0047] 在另一个优选的实施方案中，预先治疗因对抗癌治疗的抗性而终止。
[0048] 在本发明的一个优选的实施方案中，具有抗癌药的治疗有效血浆水平的期限持续至少1天，优选3天，且更优选至少5天。
[0049] 在本发明的一个实施方案中，具有阿片样物质受体激动剂的治疗有效血浆水平的期限持续至少2周，更优选4周，且甚至更优选表明长期治疗。
[0050] 在本发明上下文中，将术语“长期治疗”定义为使用高于4周的施用期限的阿片样物质受体激动剂治疗，优选持续超过几个月。在另一个实施方案中，这种长期治疗不同于本领域技术人员开据处方或公知的常规治疗方案，或公布在协会或联盟如Deutsche Krebshilfe或Deutsche Krebsgesellschaft、NCCN、NCI或类似健康或癌症组织机构的治疗指导原则或用于治疗癌症的药物生产者或销售者的指导原则中的常规治疗方案。
[0051] 在本发明上下文中，至少一种抗癌药的应用是指本发明的所给予的一种或多种抗癌药与阿片样物质受体激动剂组合的应用。因此，该组合包括应用一种、两种、三种、四种、五种或甚至更多种的抗癌药。
[0052] 一般地，已知通过两种主要生化途经诱导细胞凋亡。“死亡受体途经”(或外在途经)包括TNF-受体诱导的(肿瘤坏死因子)模型和Fas-受体诱导的模型(Fas-受体也称作Apo-1或CD95)。结合这些受体导致细胞中形成诱导死亡的信号转导途经，包括胱天蛋白酶-8活化。“线粒体途经”(或内在途经)包括细胞色素c从线粒体中释放、结合Apaf-1和前胱天蛋白酶-9活化。已知几种调节剂可以活化细胞凋亡途经或使其失活，例如凋亡前体蛋白Bax和Bak或抗-细胞凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-XL或XIAP。
[0053] 在本发明的一个实施方案中，阿片样物质受体激动剂通过裂解肿瘤细胞中的胱天蛋白酶-3和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和/或裂解胱天蛋白酶-9和下调细胞凋亡蛋白X-连接抑制剂(X-linked inhibitor)(XIAP)和/或下调B-细胞淋巴瘤-超大蛋白(extra large protein)(Bcl-XL)诱导细胞凋亡。
[0054] 根据本发明的一个优选的实施方案，阿片样物质受体激动剂是美沙酮类(group)的成员，包含D-/L-美沙酮、左美沙酮、左醋美沙朵(levacetylmethadol)和哌腈米特。
[0055] 在本发明的上下文中，术语“美沙酮类”是指为3,3-二苯基丙基胺衍生物的阿片样物质。这些化合物具有如下式(I)所示的3,3-二苯基胺的核心结构：
[0056]
[0058] 美沙酮类化合物的实例的非限制性清单包括美沙酮、去甲美沙酮、右吗拉胺、异美沙酮、醋美沙多、阿醋美沙朵、左醋美沙朵(levoacetylmethadol)、premethadone、消旋吗拉胺、苯吗庚酮、右丙氧芬、地匹哌酮、氰苯咪哌啶、哌腈米特、洛哌丁胺、噻酚丁烯胺(表示3,3-二硫代苯基丙基胺)和左吗拉胺。
[0059] 所有这些阿片样物质均可以作为盐使用。D-/L-美沙酮的外消旋形式优选以盐酸盐的形式提供。在本发明的一个优选的实施方案中，阿片样物质美沙酮通过线粒体途经诱导癌细胞中的细胞凋亡。
[0060] 在本发明的一个实施方案中，所述阿片样物质受体激动剂选自美沙酮类化合物，例如D/L-美沙酮、D-美沙酮、L-美沙酮、去甲美沙酮；芬太尼衍生物，例如芬太尼、舒芬太尼、lofenantil、阿芬太尼、瑞芬太尼、羟甲芬太尼和卡芬太尼(carfentanyl)；吗啡烷化合物，例如吗啡、可待因、海洛因、dextrallorphane、右美沙芬、dextrophanol、二甲啡烷、levalorphanol、布托啡诺、levofurethylnormorphanol、左美沙芬、左芬啡烷、左啡诺、甲吗喃、吗吩醇(morphanol)、奥昔啡烷、非诺啡烷和佐尔啡诺；苯吗喃类(benzomorphane)衍生物，例如5,9-DEHB、alazocine、阿那佐辛、布马佐辛、布替佐辛、卡巴佐辛、可加佐辛、环佐辛、地佐辛、依他佐辛、乙唑辛、乙酮环佐辛、氟溴柳胺(fluorophen)、吉马佐辛、伊巴佐辛、酮佐辛、酮基环唑新(ketocyclazozine)、美他佐辛、莫沙佐辛、喷他佐辛、非那佐辛、夸达佐辛、thiazocine、托那佐辛、伏拉佐辛和8-CAC；内源性阿片样物质，例如内啡肽类(可以是α-、β-、γ-或δ-内啡肽类)；脑啡肽类，例如甲硫啡肽、亮啡肽和methorphamid；强啡肽类，例如强啡肽A、强啡肽B或α新内啡肽、痛敏肽、皮啡肽、吗啡感受素、β-caomorphine-5、DALAMID、DADLE、DADL DSLT、DSLET、DTLET、DAGO、DAMGO、DALCE、DAMME、DALDA、DPDPE、FK 33-824、[D-Met2,Pro5]脑啡肽-酰胺、biphalin和内吗啡肽，例如内吗啡肽-1和内吗啡肽-2；此外，还有所有来源于蛋白质阿黑皮素原(POMC)的片段，例如β-促脂解素、β-LPH-[61-64]、β-LPH-[61-65]-NH2、(Met(O)65)-β-LPH-[61-65]、β-LPH-[61-69]和β-LPH-[61-69]；4-苯基哌啶衍生物，例如哌替啶、凯托米酮、阿尼利定、匹米诺定、苯哌利定、呋替啶、阿法罗定、三甲利定，包括4-苯基吡咯烷衍生物，例如普罗法朵和4-苯基氮杂庚环衍生物，例如美普他酚；环己烷衍生物，例如替利定、U-50488、曲马多和他喷他多(tapentadol)。
[0061] 在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的阿片样物质受体激动剂能够抑制细胞增殖。
[0062] 在本发明的另一个实施方案中，将阿片样物质受体激动剂与至少另一种阿片样物质受体激动剂组合。作为结果，本发明的组合由两种、三种、四种或更多种阿片样物质受体激动剂组成。优选地，使用两种不同阿片样物质受体激动剂的组合。可以证实不同阿片样物质的组合应用导致对癌细胞的协同凋亡前作用(参见实施例38和图56)。
[0063] 在一个优选的实施方案中，所述阿片样物质受体激动剂的组合包含吗啡和芬太尼。优选地，所述组合由吗啡和芬太尼组成。例如，对白细胞细胞系HL60显示了吗啡和芬太尼的协同作用(参见实施例38和图56)。
[0064] 在一个优选的实施方案中，对患者给予美沙酮、优选D,L-美沙酮且最优选D,L-美沙酮的盐酸盐形式，特别地产生0.05μg/mL-3μg/mL的血浆水平。
[0065] 在另一个优选的实施方案中，对患者给予美沙酮、优选D,L-美沙酮且最优选D,L-美沙酮的盐酸盐形式，特别地产生0.01μg/mL-3μg/mL的血浆水平。
[0066] 在本发明的一个实施方案中，所述抗癌药选自：嵌入物质，例如蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、表柔比星和柔红霉素；拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康、托泊替康、喜树碱、层状素D(lamellarin D)、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌、安吖啶、玫瑰树碱类和金精三羧酸；亚硝基脲化合物，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、链佐星；氮芥类(nitrogen mustards)，例如环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、乌拉莫司汀、苯达莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、马磷酰胺、曲磷胺(trofosfamid)和异环磷酰胺(ifosfamide)；烷基磺酸酯类(alkyl sulfonates)，例如白消安和曲奥舒凡；烷化剂，例如丙卡巴肼(procarbazin)、达卡巴嗪(dacarbazin)、替莫唑胺和噻替派；铂类似物，例如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂和四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)；微管破坏药，例如长春碱、秋水仙胺和诺考达唑；抗叶酸剂，如甲氨蝶呤、氨基蝶呤、二氯甲氨喋呤、培美曲塞、雷替曲塞和普拉曲沙(pralatrexate)；嘌呤类似物，如硫唑嘌呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和克拉屈滨；嘧啶类似物，如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-氮尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨；紫杉烷和紫杉烷类似物，如紫杉醇和多西他赛；
类固醇激素，如孕激素(gestagene)、雄激素(androgene)、糖皮质激素类、地塞米松、泼尼松龙和泼尼松；抗-癌肽类，包括放射性标记的肽类(paptides)和肽-药物缀合物；
抗-癌抗体，包括放射性标记的抗体和抗体-药物缀合物，例如贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗、易普利姆玛(ipilimumab)、阿仑珠单抗、奥法
90
木单抗(ofatumumab)、吉妥珠单抗-奥佐米星、brentuximab vedotin、Y-替伊莫单抗
131
(ibritumomab tiuxetan)、I-托西莫单抗或曲妥珠单抗；α、β或γ射线照射；包括粒子辐射。
类固醇激素，如孕激素(gestagene)、雄激素(androgene)、糖皮质激素类、地塞米松、泼尼松龙和泼尼松；抗-癌肽类，包括放射性标记的肽类(paptides)和肽-药物缀合物；
抗-癌抗体，包括放射性标记的抗体和抗体-药物缀合物，例如贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗、易普利姆玛(ipilimumab)、阿仑珠单抗、奥法
90
木单抗(ofatumumab)、吉妥珠单抗-奥佐米星、brentuximab vedotin、Y-替伊莫单抗
131
(ibritumomab tiuxetan)、I-托西莫单抗或曲妥珠单抗；α、β或γ射线照射；包括粒子辐射。
[0067] 上述举出的抗癌药还包含修饰物，例如聚乙二醇化和制剂，例如脂质体的应用(即聚乙二醇化脂质体多柔比星)。
[0068] 在另一个实施方案中，所述抗癌药可以是放射性标记的化学化合物、肽、蛋白质或单克隆抗体，其中放射性标记可以发射α、β或γ射线且还可以发射电离粒子。
[0069] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述抗癌药是甲氨蝶呤、阿糖胞苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、卡铂、奥沙利铂、依托泊苷、长春新碱、氟达拉滨，尤其是顺铂、多柔比星、蒽环类抗生素、伊达比星、柔红霉素、表柔比星或α、β或γ射线照射。
[0070] 当治疗期望诱导阿片样受体的癌实体时，优选用选自多柔比星、伊达比星、表柔比星、柔红霉素、卡铂、奥沙利铂、顺铂、依托泊苷、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、替尼泊苷、吉西他滨、紫杉醇、利妥昔单抗和曲妥珠单抗的抗癌药治疗患者。
[0071] 在本发明的一个实施方案中，用本发明组合治疗的患者患有如根据国际疾病和相关健康问题统计分类第10修订版(ICD-10)分类的肿瘤，其中所述肿瘤选自C00-C97类的恶性肿瘤、D00-D09类的原位肿瘤、D10-D36类的良性肿瘤和D37-D48类的不确定或未知行为的肿瘤。
[0072] 将类别定义如下：(C00)唇的恶性肿瘤；(C01)舌基底的恶性肿瘤；(C02)舌的其它和未指定部分的恶性肿瘤；(C03)牙龈的恶性肿瘤；(C04)口腔底部的恶性肿瘤；C05)上颚的恶性肿瘤；(C06)口腔的其它和未指定部分的恶性肿瘤；(C07)腮腺的恶性肿瘤；(C08)其它和未指定的主要唾液腺的恶性肿瘤；(C09)扁桃体的恶性肿瘤；(C10)口咽的恶性肿瘤；(C11)鼻咽的恶性肿瘤；(C12)梨状隐窝的恶性肿瘤；(C13)下咽部的恶性肿瘤；(C14)唇、口腔和咽中其它和确定疾病部位的恶性肿瘤；(C15)食道的恶性肿瘤,(C16)胃的恶性肿瘤；(C17)小肠的恶性肿瘤；(C18)结肠的恶性肿瘤；(C19)直肠乙状结肠连接的恶性肿瘤；(C20)直肠的恶性肿瘤；(C21)肛门和肛管的恶性肿瘤；(C22)肝和肝内胆管的恶性肿瘤；(C23)胆囊的恶性肿瘤；(C24)胆道的其它和未指定部分的恶性肿瘤；(C25)胰腺的恶性肿瘤；(C26)其它和确定疾病的消化器官的恶性肿瘤；(C30)鼻腔和中耳的恶性肿瘤；(C31)副鼻窦的恶性肿瘤；(C32)喉头的恶性肿瘤；(C33)气管的恶性肿瘤；(C34)支气管和肺的恶性肿瘤；(C37)胸腺的恶性肿瘤；(C38)心脏、纵隔和胸膜的恶性肿瘤；(C39)呼吸系统和胸腔内器官中其它和确定疾病部位的恶性肿瘤；(C40–C41)骨和关节软骨的恶性肿瘤；(C43)皮肤恶性黑素瘤；(C44)其它的皮肤恶性肿瘤；(C45)间皮瘤；(C46)卡波西肉瘤；(C47)外周神经和自主神经系统的恶性肿瘤；(C48)腹膜后腔和腹膜的恶性肿瘤；(C49)其它结缔和软组织的恶性肿瘤；(C50)乳腺的恶性肿瘤；(C51)外阴的恶性肿瘤；(C52)阴道的恶性肿瘤；(C53)子宫颈的恶性肿瘤；(C54)子宫体的恶性肿瘤；(C55)部分未指定的子宫的恶性肿瘤；(C56)卵巢的恶性肿瘤；(C57)其它和未指定女性生殖器官的恶性肿瘤；
(C58)胎盘的恶性肿瘤；(C60)阴茎的恶性肿瘤；(C61)前列腺的恶性肿瘤；(C62)睾丸的恶性肿瘤；(C63)其它和未指定的男性生殖器官的恶性肿瘤；(C64)除肾盂外的肾的恶性肿瘤；(C65)肾盂的恶性肿瘤；(C66)输尿管的恶性肿瘤；(C67)膀胱的恶性肿瘤；(C68)其它和未指定泌尿器官的恶性肿瘤；(C69)眼和附件的恶性肿瘤；(C70)脑膜的恶性肿瘤；(C71)脑的恶性肿瘤；(C72)脊髓、脑神经和中枢神经系统其它部分的恶性肿瘤；(C73)甲状腺的恶性肿瘤；(C74)肾上腺的恶性肿瘤；(C75)其它内分泌腺和相关结构的恶性肿瘤；(C76)其它和确定疾病的部位的恶性肿瘤；(C77)继发性和未指定的淋巴结的恶性肿瘤；(C78)继发性呼吸和消化器官的恶性肿瘤；(C79)继发性其它部位的恶性肿瘤；(C80)未详述部位的恶性肿瘤；(C81)霍奇金病；(C82)滤泡非霍奇金淋巴瘤(结节)；(C83)弥漫性非霍奇金淋巴瘤；(C84)外周和皮肤T-细胞淋巴瘤；(C85)其它和未指定类型的非霍奇金淋巴瘤；(C88)恶性免疫增生疾病；(C90)多发性骨髓瘤和恶性浆细胞瘤；(C91)淋巴样白血病；
(C92)髓样白血病；(C93)单核细胞性白血病；(C94)其它指定细胞类型的白血病；(C95)未指定细胞类型的白血病；(C96)其它和未指定的淋巴样、造血和相关组织的恶性肿瘤；
(C97)非依赖性(原发性)多部位中的恶性肿瘤；(D00)口腔、食道和胃的原位癌；(D01)其它和未指定消化器官的原位癌；(D02)中耳和呼吸系统的原位癌；(D03)原位黑素瘤；(D04)皮肤原位癌；(D05)乳腺原位癌；(D06)子宫颈原位癌；(D07)其它和未指定生殖器官原位癌；(D09)其它和未指定部位的原位癌；(D10)口腔的和咽良性肿瘤；(D11)主要唾液腺的良性肿瘤；(D12)结肠、直肠、肛门和肛管的良性肿瘤；(D13)消化系统的其它和确定疾病部分的良性肿瘤；(D14)中耳和呼吸系统的良性肿瘤；(D15)其它和未指定胸腔内器官的良性肿瘤；(D16)骨和关节软骨的良性肿瘤；(D17)良性脂肪瘤；(D18)任意部位的血管瘤和淋巴管瘤；(D19)间皮组织的良性肿瘤；(D20)腹膜后腔和腹膜软组织的良性肿瘤；(D21)结缔组织和其它软组织的其它良性肿瘤；(D22)黑素细胞痣；(D23)皮肤的其它良性肿瘤；
(D24)乳腺的良性肿瘤；(D25)子宫平滑肌瘤；(D26)子宫的其它良性肿瘤；(D27)卵巢的良性肿瘤；(D28)其它和未指定女性生殖器官的良性肿瘤；(D29)男性生殖器官的良性肿瘤；
(D30)泌尿器官的良性肿瘤；(D31)眼和附件的良性肿瘤；(D32)脑膜的良性肿瘤；(D33)脑和中枢神经系统的其它部分的良性肿瘤；(D34)甲状腺的良性肿瘤；(D35)其它和未指定内分泌腺的良性肿瘤；(D36)其它和未指定部位的良性肿瘤；(D37)口腔和消化器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D38)中耳和呼吸和胸腔内器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D39)女性生殖器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D40)男性生殖器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D41)泌尿器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D42)脑膜的不确定或未知行为的肿瘤；
(D43)脑和中枢神经系统的不确定或未知行为的肿瘤；(D44)内分泌腺的不确定或未知行为的肿瘤；(D45)真性红细胞增多；(D46)骨髓增生异常综合征；(D47)淋巴样、造血和相关组织的其它不确定或未知行为的肿瘤；(D48)其它和未指定部位的不确定或未知行为的肿瘤。
(C58)胎盘的恶性肿瘤；(C60)阴茎的恶性肿瘤；(C61)前列腺的恶性肿瘤；(C62)睾丸的恶性肿瘤；(C63)其它和未指定的男性生殖器官的恶性肿瘤；(C64)除肾盂外的肾的恶性肿瘤；(C65)肾盂的恶性肿瘤；(C66)输尿管的恶性肿瘤；(C67)膀胱的恶性肿瘤；(C68)其它和未指定泌尿器官的恶性肿瘤；(C69)眼和附件的恶性肿瘤；(C70)脑膜的恶性肿瘤；(C71)脑的恶性肿瘤；(C72)脊髓、脑神经和中枢神经系统其它部分的恶性肿瘤；(C73)甲状腺的恶性肿瘤；(C74)肾上腺的恶性肿瘤；(C75)其它内分泌腺和相关结构的恶性肿瘤；(C76)其它和确定疾病的部位的恶性肿瘤；(C77)继发性和未指定的淋巴结的恶性肿瘤；(C78)继发性呼吸和消化器官的恶性肿瘤；(C79)继发性其它部位的恶性肿瘤；(C80)未详述部位的恶性肿瘤；(C81)霍奇金病；(C82)滤泡非霍奇金淋巴瘤(结节)；(C83)弥漫性非霍奇金淋巴瘤；(C84)外周和皮肤T-细胞淋巴瘤；(C85)其它和未指定类型的非霍奇金淋巴瘤；(C88)恶性免疫增生疾病；(C90)多发性骨髓瘤和恶性浆细胞瘤；(C91)淋巴样白血病；
(C92)髓样白血病；(C93)单核细胞性白血病；(C94)其它指定细胞类型的白血病；(C95)未指定细胞类型的白血病；(C96)其它和未指定的淋巴样、造血和相关组织的恶性肿瘤；
(C97)非依赖性(原发性)多部位中的恶性肿瘤；(D00)口腔、食道和胃的原位癌；(D01)其它和未指定消化器官的原位癌；(D02)中耳和呼吸系统的原位癌；(D03)原位黑素瘤；(D04)皮肤原位癌；(D05)乳腺原位癌；(D06)子宫颈原位癌；(D07)其它和未指定生殖器官原位癌；(D09)其它和未指定部位的原位癌；(D10)口腔的和咽良性肿瘤；(D11)主要唾液腺的良性肿瘤；(D12)结肠、直肠、肛门和肛管的良性肿瘤；(D13)消化系统的其它和确定疾病部分的良性肿瘤；(D14)中耳和呼吸系统的良性肿瘤；(D15)其它和未指定胸腔内器官的良性肿瘤；(D16)骨和关节软骨的良性肿瘤；(D17)良性脂肪瘤；(D18)任意部位的血管瘤和淋巴管瘤；(D19)间皮组织的良性肿瘤；(D20)腹膜后腔和腹膜软组织的良性肿瘤；(D21)结缔组织和其它软组织的其它良性肿瘤；(D22)黑素细胞痣；(D23)皮肤的其它良性肿瘤；
(D24)乳腺的良性肿瘤；(D25)子宫平滑肌瘤；(D26)子宫的其它良性肿瘤；(D27)卵巢的良性肿瘤；(D28)其它和未指定女性生殖器官的良性肿瘤；(D29)男性生殖器官的良性肿瘤；
(D30)泌尿器官的良性肿瘤；(D31)眼和附件的良性肿瘤；(D32)脑膜的良性肿瘤；(D33)脑和中枢神经系统的其它部分的良性肿瘤；(D34)甲状腺的良性肿瘤；(D35)其它和未指定内分泌腺的良性肿瘤；(D36)其它和未指定部位的良性肿瘤；(D37)口腔和消化器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D38)中耳和呼吸和胸腔内器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D39)女性生殖器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D40)男性生殖器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D41)泌尿器官的不确定或未知行为的肿瘤；(D42)脑膜的不确定或未知行为的肿瘤；
(D43)脑和中枢神经系统的不确定或未知行为的肿瘤；(D44)内分泌腺的不确定或未知行为的肿瘤；(D45)真性红细胞增多；(D46)骨髓增生异常综合征；(D47)淋巴样、造血和相关组织的其它不确定或未知行为的肿瘤；(D48)其它和未指定部位的不确定或未知行为的肿瘤。
[0073] 在本发明的一个具体的实施方案中，用本发明组合治疗的患者患有转移灶(metastases)。
[0074] 在本发明的一个优选的实施方案中，用本发明组合治疗的患者患有选自C25、C50、C56、C71、C91和C92的类别清单的肿瘤。
[0075] 在一个更优选的实施方案中，患者患有选自如下的肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(C91.0)、慢性B型淋巴细胞性白血病(C91.2)、急性早幼粒细胞白血病(C92.4)、急性髓性白血病(C92.0)、慢性髓性白血病(C92.1)、所有形式的胶质母细胞瘤(C71)、所有形式的胰腺癌(C25)、所有形式的卵巢癌(C56)、乳腺癌种类(C50)和肿瘤干细胞，例如启动胶质母细胞瘤的干细胞(glioblastoma-initiating stem cell)。
[0076] 在本发明的另一个实施方案中，患者患有对HER2-靶向疗法具有抗性的乳腺癌，例如曲妥珠单抗抗性乳腺癌。
[0077] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性成淋巴细胞性白血病(C91.0)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0078] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性成淋巴细胞性白血病(C91.0)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0079] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性成淋巴细胞性白血病(C91.0)的患者，所述组合包含D,L-美沙酮和依托泊苷或D,L-美沙酮和多柔比星。
[0080] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有慢性B型淋巴细胞性白血病(C 91.2)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0081] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有慢性B型淋巴细胞性白血病(C 91.2)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0082] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有慢性B型淋巴细胞性白血病(C 91.2)的患者，所述组合包含D,L-美沙酮和氟达拉滨或丁丙诺啡和氟达拉滨或芬太尼和氟达拉滨或吗啡和氟达拉滨。
[0083] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性早幼粒细胞白血病(C92.4)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0084] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性早幼粒细胞白血病(C92.4)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0085] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性早幼粒细胞白血病(C92.4)的患，所述组合包含D,L-美沙酮和多柔比星或丁丙诺啡和多柔比星或芬太尼和多柔比星或吗啡和多柔比星。
[0086] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性髓性白血病(C92.0)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0087] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性髓性白血病(C92.0)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0088] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有急性髓性白血病(C92.0)的患者，所述组合包含D,L-美沙酮和多柔比星或丁丙诺啡和多柔比星或芬太尼和多柔比星或吗啡和多柔比星。
[0089] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有慢性髓性白血病(C92.1)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0090] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有慢性髓性白血病(C92.1)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0091] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和伊马替尼或丁丙诺啡和伊马替尼或芬太尼和伊马替尼或吗啡和伊马替尼的组合治疗患有慢性髓性白血病(C92.1)的患者。
[0092] 在本发明的另一个优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和氟达拉滨或丁丙诺啡和氟达拉滨或芬太尼和氟达拉滨或吗啡和氟达拉滨的组合治疗患有慢性髓性白血病(C92.1)的患者。
[0093] 在本发明的另一个实施方案中，除本发明的组合外，还用至少另一种阿片样物质受体激动剂治疗患有白血病的患者。因此，用至少两种阿片样物质受体激动剂治疗患者。这种策略基于如下发现：不同阿片样物质的组合显示对癌细胞系的协同凋亡前作用(参见图56)。
[0094] 在一个优选的实施方案中，本发明的组合包含吗啡、芬太尼和至少一种抗癌药，而在另一个实施方案中，所述组合由吗啡、芬太尼和另一种抗癌药组成。例如，对白血病细胞系HL60显示吗啡和芬太尼的协同作用(参见实施例38)。
[0095] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有胶质母细胞瘤(C71)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、替莫唑胺、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0096] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有胶质母细胞瘤(C71)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0097] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和多柔比星的组合治疗患有胶质母细胞瘤(C71)的患者。
[0098] 在一个优选的实施方案中，以促进多柔比星通过血脑屏障转移的制剂形式给予所述多柔比星。对于本领域技术人员而言，存在几种可利用的能够或促进血脑屏障转移(BBB)转移的制剂策略。作为实例，多柔比星可以被填充入脂质体或与转铁蛋白结合。
[0099] 在本发明的另一个优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和柔红霉素的组合、包含D,L-美沙酮和伊达比星的组合或包含D,L-美沙酮和替莫唑胺的组合治疗患有胶质母细胞瘤(C71)的患者。
[0100] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有启动胶质母细胞瘤的干细胞的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0101] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有启动胶质母细胞瘤的干细胞的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0102] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和多柔比星的组合治疗患有启动胶质母细胞瘤的干细胞的患者。
[0103] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有胰腺癌(C25)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、替莫唑胺、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0104] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有胰腺癌(C25)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0105] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和顺铂的组合治疗患有胰腺癌(C25)的患者。
[0106] 在本发明的另一个优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和奥沙利铂的组合治疗患有胰腺癌(C25)的患者。
[0107] 在本发明的一个实施方案中，用包含D,L-美沙酮和替莫唑胺的组合治疗患有癌症的患者。
[0108] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有卵巢癌(C56)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、卡铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0109] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有卵巢癌(C56)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0110] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和顺铂的组合治疗患有卵巢癌(C56)的患者。
[0111] 在另一个实施方案中，用D,L-美沙酮和顺铂的组合治疗的患者患有顺铂抗性卵巢癌。
[0112] 在一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有乳腺癌(C50)的患者，所述组合包括抗癌药，其选自甲氨蝶呤、阿糖胞苷、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、氟达拉滨，优选顺铂、蒽环类抗生素，多柔比星、伊达比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或α、β或γ射线照射。
[0113] 在另一个优选的实施方案中，用本发明的组合治疗患有乳腺癌(C50)的患者，所述组合包括选自D,L-美沙酮、丁丙诺啡、芬太尼和吗啡的阿片样物质受体激动剂，优选D,L-美沙酮。
[0114] 在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和顺铂的组合治疗患有乳腺癌(C50)的患者。
[0115] 在本发明的另一个优选的实施方案中，用包含D,L-美沙酮和多柔比星的组合治疗患有乳腺癌(C50)的患者，其优选是对HER2靶向疗法具有抗性的乳腺癌，例如曲妥珠单抗抗性乳腺癌。
[0116] 在本发明的另一个实施方案中，用包含D,L-美沙酮和顺铂的组合治疗患有前列腺癌(C62)的患者。
[0117] 在本发明的一个实施方案中，用D,L-美沙酮和如下抗癌药之一的组合治疗患有白血病的患者：依托泊苷、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、环磷酰胺、硫鸟嘌呤、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛或长春新碱。
[0118] 在另一个实施方案中，所治疗的癌症是根据来自2000年的实际版本ICD-O-3中的肿瘤学ICD-O的疾病国际分类的肿瘤。或者，所治疗的癌症是作为在恶性肿瘤TNM分类(TNM)中包括的癌症，其代表了描述患者体内癌症程度的癌症分期系统。在另一种可选的情况中，所治疗的癌症由Boecker等人公开在2008第6章(Pathologie,Elsevier,Urban&Fischer,p.167-218)中，将该文献完整地引入参考。
[0119] 在本发明的一个优选的实施方案中，用所述组合治疗的患者患有非实体瘤，其选自白血病、乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、Ewing肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺内分泌瘤、原发性脑瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合征体型瘤(marfanoid habitus tumour)、维尔姆斯肿瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、宫颈发育不良和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤损害、蕈样真菌病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、骨源性和其它肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤和表皮样癌。
[0120] 在本发明的另一个优选的实施方案中，所治疗的患者患有肿瘤，其选自胰腺癌、肝胚细胞瘤、结肠癌(小细胞肺癌、黑素瘤、乳癌(mamma carcinoma)、卵巢癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、白血病的前形式、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、肿瘤干细胞、启动胶质母细胞瘤的干细胞和多发性骨髓瘤。
[0121] 在本发明的另一个实施方案中，患者显示内在或获得性抗性。
[0122] 因此，在本发明的上下文中，“抗性”可以是总体的或部分的；换句话说，认为可根据本发明治疗的患者可以显示出对常规的抗癌治疗的敏感性降低甚至对其完全缺乏敏感性。还可以将这些患者确定为“无应答者”或“差应答者”。
[0123] “抗性”癌或肿瘤的另一个同义词是“顽固”型癌，其也可以是完全或部分顽固型的。还可以将内在抗性确定为“原发性顽固型癌”。顽固型或抗性癌细胞的具体形式是所谓的“动态顽固性细胞”；已知来自白血病细胞的现象(例如当首先杀伤细胞时)，但几乎不能有效地治疗快速地再现。
[0124] 作为本发明上下文中所用的术语“常规”治疗或疗法是指目前可接受的和广泛使用的对一些类型癌症的治疗，其基于过去的研究工作和/或管理部门批准的结果。
[0125] 常用的抗癌药包括细胞毒性试剂和细胞抑制剂，它们杀伤癌细胞或减少和/或终止其生长或增殖。这些抗癌药的作用模式可变；实例是抗代谢药(例如阿糖胞苷、甲氨蝶呤、巯嘌呤或氯法拉滨)、DNA交联剂(例如顺铂及其衍生物)、DNA嵌入物质(例如多柔比星)、拓扑异构酶毒物(例如依托泊苷)、激酶抑制剂(例如西妥昔单抗)、类固醇(例如地塞米松)或有丝分裂抑制剂(例如长春新碱)。白血病的常规抗癌治疗的一个实例是施用多柔比星或利妥昔单抗。
[0126] 常规放疗还可以包括放疗，其是指应用来自x-射线、α、β和γ射线的高能辐射、俄歇电子、紫外线、中子、质子和其它来源杀伤癌细胞和使肿瘤萎缩。辐射可以来源于体外装置(外线束放射疗法)或它可以来源于位于体内癌细胞附近的放射源(内照射治疗)。全身放射治疗使用放射性物质，例如放射性标记的单克隆抗体，其在血流中移动至靶组织。
放射抗性癌细胞对这些治疗无或仅有部分应答。
放射抗性癌细胞对这些治疗无或仅有部分应答。
[0127] 正如上文详细概括的，根据本发明的一个实施方案，施用阿片样物质受体激动剂以克服或“破坏”癌细胞对常规抗癌治疗和/或放射治疗的内在或获得性抗性或细胞凋亡抗性。在本发明的一个实施方案中，认为可根据本发明治疗的癌细胞表达阿片样受体，特别是μ阿片样受体。
[0128] 根据本发明，将术语“抗性”、“放射抗性”或“化学抗性”定义为癌细胞对至少一种常规的癌症疗法即抗癌药或放疗的敏感性降低。将患有这样的癌症的患者确定为“抗性”癌症患者。由于抗性可以是内在的或获得性的，所以将观察到的任一敏感性降低与完全敏感性的“正常”癌细胞(相对于在治疗开始时的最初敏感性，它们对治疗有效剂量的所应用的抗癌药和/或辐射有应答)相比。在后面的情况中，抗性表现为在相同剂量(辐射或抗癌药)下肿瘤退化量减少或对等量肿瘤退化必需的剂量增加。
[0129] 在本发明的另一个实施方案中，患者表现出如下抗性的一种或多种：细胞凋亡抗性、多重抗药性、抗癌药抗性、细胞毒性药物抗性、对活性氧类别的抗性、对DNA损伤剂的抗性、对毒性抗体的抗性、多柔比星抗性、单一或交叉抗性、照射抗性(例如α、β、γ或俄歇电子)。
[0130] 在一个具体的实施方案中，患者对如下药物物质的一种或多种具有抗性：甲氨蝶呤、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、顺铂、奥沙利铂、依托泊苷、长春新碱、紫杉醇、卡铂、替尼泊苷、地塞米松、泼尼松龙、环磷酰胺、二磷酰胺、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、伊达比星、巯嘌呤、氟达拉滨、吉西他滨、替莫唑胺、抗-HER2和抗-CD20。
[0131] 在本发明的一个实施方案中，将与阿片样物质受体激动剂一起施用的抗癌药以等于或低于对于相应癌症所推荐的剂量的剂量给予。通过不施用阿片样物质受体激动剂的常规癌症疗法得到推荐剂量。优选地，根据本领域技术人员的判断的抗癌药的相应剂量代表亚最佳剂量的或亚治疗剂量，它们对于患者具有几乎无副作用的优点。主要作用在于使抗癌药在癌细胞中的摄取剂量增加，而血浆浓度处于常规疗法的水平上。这具有可以治疗对常规疗法无应答者的作用。
[0132] 在本发明的一个优选的实施方案中，以低于仅使用抗癌药治疗推荐的剂量二分之一、优选三分之一、五分之一、十分之一、三十分之一且甚至更优选低于其一百分之一的剂量给予与阿片样物质受体激动剂一起施用的抗癌药。
[0133] 在本发明的另一个优选的实施方案中，以等于或低于针对相应癌症的推荐剂量的剂量给予与阿片样物质受体激动剂一起施用的抗癌药，其中抗癌药的有效血浆水平期限完全在所述阿片样物质受体激动剂的有效血浆水平期限范围内。所推荐的剂量通过不施用阿片样物质受体激动剂的常规癌症疗法得到。
[0134] 在本发明的另一个优选的实施方案中，所述阿片样物质受体激动剂是D/L-美沙酮，且所述抗癌药是甲氨蝶呤和地塞米松。
[0135] 在本发明的另一个实施方案中，所述阿片样物质或阿片样物质受体激动剂可以作为与至少一种抗癌药的复合物(composite)使用。
[0136] 在本发明的上下文中，术语“抗-Her2”表示结合Her-2/Neu基因的基因产物并且与之发生相互作用的任意配体。这包括抗体，例如曲妥珠单抗(赫赛汀)或任意有机化合物。
[0137] 在本发明的上下文中的“复合物”是指药物制剂，其包含治疗有效量的如本发明所定义的任意阿片样物质受体激动剂(成分A)和至少另一种抗癌物质(成分B)。这种“复合物”可以构成单一组合物或至少两种组合物，可以将它们同时或依次地施用于患者。优选将上述举出的物质与美沙酮、更优选与D/L-美沙酮的盐酸盐形式组合。
[0138] 本发明的复合物可以有利地用于有效治疗癌细胞，因为它与单一组合物相比可以显示出协同作用。特别地，优选具有作为成分A的美沙酮和如下活性剂之一作为成分B的复合物：甲氨蝶呤、阿糖胞苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂、依托泊苷、长春新碱、多柔比星、伊达比星、表柔比星、柔红霉素、氟达拉滨、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、替莫唑胺、抗-CD20、抗-HER2。此外，还包含照射治疗的组合治疗也是可能的。
[0139] 另一种优选的复合物由作为成分A的美沙酮和作为成分B的替莫唑胺组成。
[0140] 在本发明的一个优选的实施方案中，阿片样物质用于治疗抗性或敏感性非实体瘤，即侵害血液、骨髓和淋巴结的所有血液学恶性肿瘤，包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病和所有白血病的前形式(pro-form)、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0141] 在另一个方面，本发明提供选择阿片样物质受体激动剂和一种或多种抗癌药的组合的方法。该方法包含下列步骤：
[0142] (a)提供癌细胞、细胞系或初级细胞的体外培养物，所述细胞优选分离自癌活组织检查或液体样品(例如血液、羊膜液、胸膜液、脑脊髓液或腹膜液)；
[0143] (b)任选地测试来自步骤(a)的细胞的阿片样受体表达；
[0144] (c)用阿片样物质激动剂或至少一种抗癌药或其组合处理来自步骤(a)的细胞；
[0145] (d)分析所述细胞的细胞死亡和/或阿片样受体的表达；
[0146] (e)基于期望的细胞死亡/存活或增殖抑制的程度选择阿片样受体/抗癌药组合和优选选择所述组合的剂量；和/或
[0147] (f)选择抗癌药和优选选择显示期望的阿片样受体诱导程度的所述抗癌药的剂量。
[0148] 体外培养的癌细胞可以是无限增殖化细胞系、异种移植的细胞、次级或初级癌细胞系或初级细胞。在一个优选的实施方案中，所述细胞系和/或细胞来源于癌的活组织检查，在更优选的实施方案中，所述活组织检查或血液采样或脑脊髓液采样或胸膜液采样或羊膜液采样或腹膜液采样取自用本发明组合治疗的患者。所述癌细胞系可以代表基于仅一种癌细胞类型的同源细胞系或包含不同细胞类型的异种癌细胞系。
[0149] 可以通过本领域技术人员公知的技术分析步骤(b)中的阿片样受体表达。非限制性的实例清单包括使用针对所述阿片样受体的抗体或抗体片段的免疫荧光、阿片样受体的免疫沉淀或标记的阿片样受体配体例如纳洛酮-荧光素的应用。
[0150] 对于步骤(c)中的细胞存活和细胞凋亡的分析，存在几种本领域技术人员公知的技术。非限制性的实例清单包括：(a)细胞溶解或膜渗漏测定，例如乳酸脱氢酶测定、碘化丙啶测定、锥虫蓝测定、7-氨基放线菌素D测定；(b)线粒体活性或胱天蛋白酶测定，例如刃天青和甲月替(Formazan)(MTT/XTT)可以测定预示细胞死亡的细胞凋亡过程中的不同阶段；(c)功能性测定，其在红细胞的情况中可以测定细胞可变形性、渗透脆性、溶血、ATP水平和血红蛋白含量；(d)包括使用DNA微阵列和蛋白质芯片分析应激途经活化的基因组和蛋白质组测定。
[0151] 在另一个优选的实施方案中，通过碘化丙啶测定法来测定细胞存活，并且通过测定亚二倍体DNA(亚G1)和通过流式细胞计量术的FSC/SSC分析测定细胞凋亡。
[0152] 在步骤(d)中，优选在平行实验中处理培养的细胞，包含使用单独的阿片样物质、单独的抗癌药和两种物质的组合。在另一个实施方案中，通过研究相应作用的剂量依赖性分析作用的效能。在可选实验中，可以将几种抗癌药组合以增加抗-细胞凋亡作用或阿片样受体表达或减少副作用特性。在另一个实施方案中，测试化合物的初步选择取决于肿瘤的特征。此外，还可以考虑患者的特征，包括年龄、性别、体重、并存病、个体代谢能力、过敏反应和不相容性、遗传素质、疾病过程和家族史。
[0153] 对于体外分析，如上所述的阿片样物质受体激动剂可以用于测试。优选地，使用D,L-美沙酮、L-美沙酮、芬太尼、丁丙诺啡、吗啡、可待因、羟可酮、曲马多和他喷他多。
[0154] 在一个优选的实施方案中，选择众所周知对相应癌细胞类型、细胞系或细胞具有作用的抗癌药。
[0155] 当单独测试抗癌药时，分析培养的细胞在抗癌治疗前和抗癌治疗后在允许比较阿片样受体表达水平条件下的阿片样受体表达。所述比较允许鉴定增加相应癌细胞上阿片样受体表达的抗癌药。
[0156] 步骤(e)中的选择区分药物组合和/或相应剂量的优先次序，以便使效能最大化，同时保留患者可接受的副作用特性。
[0157] 步骤(f)中的选择在增加癌细胞上阿片样受体表达的能力方面区分抗癌药的优先次序。作为结果，阿片样物质激动剂的抗细胞凋亡作用和抗癌药的抗细胞凋亡作用得以最大化。
[0158] 在步骤(c)的情况中，用阿片样物质受体激动剂和抗癌药的组合处理细胞培养物，在剂量组合对培养物中的细胞具有更好致死作用的方面实施所用组合的优先次序。应使用具有最高致死作用的组合，或如果观察到，则应使用在细胞致死率方面比具有对培养物中的细胞具有最高致死作用、但具有更低剂量的阿片样受体激动剂的组合低至多10％的剂量。实施例的图2c显示使用在如说明书插页中所述常规治疗剂量中的多柔比星，D,L-美沙酮剂量可以优选为0,1μg/mL。
[0159] 在另一个方面，本发明提供选择用于治疗癌症的阿片样物质受体激动剂的方法，包含下列步骤：
[0160] (a)提供癌细胞、细胞系或初级细胞的体外培养物，所述细胞优选分离自癌活组织检查或液体样品(例如血液、羊膜液、胸膜液或腹膜液或脑脊髓液)；
[0161] (b)任选地测试来自步骤(a)的细胞的阿片样受体表达；
[0162] (c)处理来自步骤(a)的细胞；
[0163] (d)分析所述细胞的细胞死亡/存活或增殖抑制；
[0164] (e)基于期望的细胞死亡的程度选择阿片样受体/抗癌药组合和优选选择所述组合的剂量；和/或
[0165] (f)选择阿片样物质受体激动剂和优选选择显示期望的细胞死亡诱导程度的所述阿片样物质受体激动剂的剂量。
[0166] 对于该方法，步骤(a)-(d)可以通过如上所述的方法和策略进行。
[0167] 分析阿片样受体表达允许选择可以用阿片样物质受体激动剂治疗的癌症类型。由于使用阿片样物质受体激动剂进行体外治疗，所以可以确定癌症体内治疗的个体剂量。
[0168] I.实验方法
[0169] 药物和试剂
[0170] 为了进行体外实验，D,L-美沙酮盐酸盐(D,L-美沙酮)和多柔比星购自Sigma(Taufkirchen,Germany)，纳洛酮购自Fagron GmbH&Co.KG(Barsbüttel,Germany)，且百日咳毒素(PTX)购自Calbiochem(Nottingham,UK)。在每次实验前，将这些物质新鲜地溶于无菌蒸馏水，以确保制备物的质量恒定。将3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,Sigma)新鲜地溶于0.01N NaOH。
[0171] 为了进行体内施用，我们使用作为购自当地药房的5mg片的D,L-美沙酮(Methaddict,Hexal,Germany)。将这些片剂粉碎并且新鲜地溶解，然后用于10％Tween 80的盐水溶液中。多柔比星(Hexal)作为注射溶液商购(5mg/ml)并且用盐水新鲜地稀释至适当浓度。
[0172] 细胞系
[0173] 人 B- 细 胞 白 血 病 (BCP-ALL) 细 胞 系 Tanoue、Reh 和 Nalm6 得 自DSMZ(Braunschweig,Germany)并且在包含10％热灭活的FCS(Lonza,Verviers,Belgium)、1mmol/L谷 氨 酰 胺(Invitrogen)、1 ％ 青 霉 素/链 霉 素 (Invitrogen)、25mmol/L HEPES(Biochrom)的RPMI 1640(Invitrogen)中在37℃、95％空气/5％CO2下培养。在实验环境中，以10,000细胞/mL的密度接种白血病细胞。
[0174] 测试阿片样受体信号转导
[0175] 用激动剂如D,L-美沙酮刺激阿片样受体(OR)导致抑制性Gi-蛋白活化。αi-亚单位使得腺苷酸环化酶(AC)失活，导致细胞内cAMP水平降低，由此导致可能由几种不同调2+
节剂介导的细胞凋亡。此外，Gi-蛋白βγ-亚单位调节不同效应物活性，如抑制Ca -和活+
化K-通道。作为阿片样受体拮抗剂的纳洛酮竞争性地抑制阿片样受体。PTx(百日咳毒素)使Gi-蛋白失活并且阻断cAMP的下调。IBMX(异丁基-1-甲基黄嘌呤)抑制磷酸二酯酶并且增加cAMP水平。
节剂介导的细胞凋亡。此外，Gi-蛋白βγ-亚单位调节不同效应物活性，如抑制Ca -和活+
化K-通道。作为阿片样受体拮抗剂的纳洛酮竞争性地抑制阿片样受体。PTx(百日咳毒素)使Gi-蛋白失活并且阻断cAMP的下调。IBMX(异丁基-1-甲基黄嘌呤)抑制磷酸二酯酶并且增加cAMP水平。
[0176] 美沙酮的血清浓度
[0177] 在使用安装气相色谱仪的质谱仪(GC/MS)进行液/液提取后进行血清样品中美沙酮的测定。作为内标，加入d9-美沙酮。质量选择检测器以电子碰撞模式运行。以选择性离子检测模式获取数据。用如下质量美沙酮的m/z 294、223、72(靶离子)和d9-美沙酮的m/z 303、226和78鉴定分析物，其中检测限为0,8ng/ml且定量限为1,2ng/ml。
[0178] 多柔比星的血清浓度
[0179] 使用这种验证的方法如上所述测定血清中的多柔比星及其主要代谢物(Hilger等人,2005；Richly等人,2006)，使用0.2ng/ml的LLQ浓度能够定量多柔比星、doxorubicinol和7-脱氧基-doxorubicinolon。
[0180] 患者来源的-ALL异种移植物
[0181] 对于体内应用，选择ALL-SCID6模型。在第0天时将来自体内传代的肿瘤的碎片经皮下植入32只雄性NOD/SCID/IL2ry裸(NSG)鼠。在随机分组后，在1天后启动使用D,L-美沙酮口服治疗(通过管饲)，并且每日以递增剂量进行至实验结束为止：第1周20mg/kg/d，第2周30mg/kg/d，第3周40mg/kg/d，第4周60mg/kg/d，第5周-第10周2×60mg/kg/注射。必需进行剂量适应以避免因D,L-美沙酮超剂量导致的毒性死亡。在所用小鼠品系中D,L-美沙酮的最大耐受剂量为2×60mg/kg/注射。在第46、53、60和76天时，经静脉内施2
用多柔比星3mg/kg。每周2次以2维测量肿瘤尺寸并且根据公式(长×宽 )/2计算肿瘤体积。每组计算平均肿瘤体积和标准偏差。通过将每一测量天每组的平均肿瘤体积与对照组建立相关性计算以百分比计的治疗与对照值之比(T/C)。作为耐受性参数，每周测定个体体重，并且通过将每组的平均值与第一天测量值建立相关性计算以百分比计的体重改变。
用多柔比星3mg/kg。每周2次以2维测量肿瘤尺寸并且根据公式(长×宽 )/2计算肿瘤体积。每组计算平均肿瘤体积和标准偏差。通过将每一测量天每组的平均肿瘤体积与对照组建立相关性计算以百分比计的治疗与对照值之比(T/C)。作为耐受性参数，每周测定个体体重，并且通过将每组的平均值与第一天测量值建立相关性计算以百分比计的体重改变。
[0182] 在第76天时的最后一次D,L-美沙酮治疗后的0.5、1、4和24小时相应地从D,L-美沙酮治疗小鼠中取血清，并且储存在-20℃下，直到测定美沙酮浓度为止。在第77天时因伦理原因处死小鼠。
[0183] 为了进行体外研究，从具有T-细胞(ALL-SCID6、ALL-SCID3)、B-细胞(ALL-SCID7)和B-细胞前体(BCP，前-B-ALL-SCID)的急性白血病的患者中获得人异种移植物-来源的-ALL-细胞的细胞混悬液并且在体外培养，且其为如所述表征的表型和基因型的(Borgmann等人,2000)。全部动物实验均得到当地负责当局(LaGeSo Berlin)批准，并且根据肿瘤学实验中有关动物福利的指定原则进行(Workman等人2000)。
[0184] 用于测定细胞表面阿片样受体的流式细胞计数测定
[0185] 用补充1％FCS的PBS洗涤细胞，离心，重新混悬于包含纳洛酮-荧光素(0.05mM,Invitrogen)的PBS/1％FCS(Hedin等人,1997)。在RT 30min温育后，用PBS/1％FCS将细胞洗涤2次，离心，重新混悬于冰冷PBS/1％FCS。使用FACSCalibur(BD,Heidelberg,Germany)进行流式细胞计量术。
[0186] 细胞凋亡的诱导
[0187] 用单独的D,L-美沙酮(≤3μg/mL治疗血浆浓度)或其与多柔比星的组合2
在175cm烧瓶或96-孔培养板中处理ALL细胞。在添加60μg/mL纳洛酮、200μM IBMX或200ng/mL PTX后同时进行另外的实验。在不同时间点后，通过流式细胞计量术测定细胞凋亡率(Carbonari等人,1994；Nicoletti等人,1991)。为了测定细胞凋亡，用如Nicoletti(Nicoletti等人,1991)所述的包含柠檬酸钠(0.1％)、Triton X-100(0.1％)和碘化丙啶(50μg/mL)的Nicoletti-缓冲液裂解细胞。通过亚二倍体DNA(subG1)或前向散射/侧面散射分析(Carbonari等人,1994)测定凋亡细胞。如下计算特异性细胞凋亡百分比：100×[实验死亡细胞(％)–培养基中自发死亡细胞(％)]/[100％-培养基中自发死亡细胞(％)]。使用细胞系的自发死亡细胞在5-10％范围内。未处理患者细胞(自发死亡细胞)的存活在24h和48h时低于35％。
在175cm烧瓶或96-孔培养板中处理ALL细胞。在添加60μg/mL纳洛酮、200μM IBMX或200ng/mL PTX后同时进行另外的实验。在不同时间点后，通过流式细胞计量术测定细胞凋亡率(Carbonari等人,1994；Nicoletti等人,1991)。为了测定细胞凋亡，用如Nicoletti(Nicoletti等人,1991)所述的包含柠檬酸钠(0.1％)、Triton X-100(0.1％)和碘化丙啶(50μg/mL)的Nicoletti-缓冲液裂解细胞。通过亚二倍体DNA(subG1)或前向散射/侧面散射分析(Carbonari等人,1994)测定凋亡细胞。如下计算特异性细胞凋亡百分比：100×[实验死亡细胞(％)–培养基中自发死亡细胞(％)]/[100％-培养基中自发死亡细胞(％)]。使用细胞系的自发死亡细胞在5-10％范围内。未处理患者细胞(自发死亡细胞)的存活在24h和48h时低于35％。
[0188] 使用zVAD.fmk的一般半胱天冬酶抑制
[0189] 为了抑制细胞凋亡，如所述(Friesen等人,2007)用胱天蛋白酶的泛胱天蛋白酶抑制剂zVAD.fmk(苯甲酰基羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮；Enzyme-Systems-Products,Dubli,USA)处理白血病细胞。在用D,L-美沙酮和多柔比星刺激前1h将50μM zVAD.fmk加入到细胞中。在不同时间点后，通过用流式细胞计量术进行FSC/SSC分析测定凋亡细胞百分比(Carbonari等人,1994)。
[0190] 蛋白质印迹分析
[0191] 如所述的进行蛋白质印迹分析(Classen等人,2003；Friesen等人,2004)。使用家兔-抗-PARP-多克隆-抗体(1:5000,Roche)、小鼠-抗-胱天蛋白酶-2-单克隆-抗体(1:1000,BD-Transduction-Laboratories,Heidelberg,Germany)、抗-XIAP-单克隆-抗体(1:1000,BD-Transduction-Laboratories)、小鼠-抗-胱天蛋白酶-3-单克隆-抗体(1:1000,Cell-Signaling,Boston,MA/USA)、家兔-抗-胱天蛋白酶-9-多克隆-抗体(1:1000,Cell-Signaling)、家兔-抗-Bcl-xL-多克隆-抗体(1:1000,Santa-Cruz,Heidelberg,Germany)和小鼠-抗-β-肌动蛋白-单克隆-抗体(1:5000,Sigma)对全细胞裂解物免疫检测PARP、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-2、XIAP、Bcl-xL和β-肌动蛋白。作为二抗，将过氧化物酶-缀合的-山羊-抗-小鼠IgG或过氧化物酶-缀合的-山羊-抗-家兔IgG(1:5000,Santa-Cruz)用于增强的化学发光系统(ECL,Amersham-Pharmacia,Freiburg,Germany)。通过β-肌动蛋白检测控制等蛋白质载量。
[0192] 多柔比星摄取和流出分析
[0193] 为了分析多柔比星摄取，将BCP-白血病细胞系Tanoue以100,000细胞/mL的密2
度接种在175cm烧瓶中并且保持未处理或与0.3μg/mL多柔比星或0.3μg/mL的多柔比星和3μg/mL D,L-美沙酮的组合在37℃/5％CO2一起温育。24h后，用冰冷PBS/1％FCS将细胞洗涤2次。使用流式细胞计量术分析细胞中的相对多柔比星摄取。
度接种在175cm烧瓶中并且保持未处理或与0.3μg/mL多柔比星或0.3μg/mL的多柔比星和3μg/mL D,L-美沙酮的组合在37℃/5％CO2一起温育。24h后，用冰冷PBS/1％FCS将细胞洗涤2次。使用流式细胞计量术分析细胞中的相对多柔比星摄取。
[0194] 为了分析多柔比星流出，在温育24h后洗涤细胞以便从培养基中除去多柔比星。接下来将细胞与不含多柔比星的新鲜培养基或包含3μg/mL D,L-美沙酮的无多柔比星的新鲜培养基一起在37℃/5％CO2一起温育，以测定多柔比星流出。在不同时间点后，收集细胞，洗涤，使用流式细胞计量术分析白血病细胞中的相对多柔比星含量。
具体实施方式
[0195] II.实施例
[0196] 实施例1：取决于阿片样受体表达，D,L-美沙酮诱导异种移植物-来源的ALL-细胞中的细胞死亡
[0197] 为了显示D,L-美沙酮在白血病治疗中的临床相关性和阿片样受体触发在细胞死亡诱导中的作用，在不同异种移植物-来源的ALL-细胞中分析D,L-美沙酮的抗-癌作用。最初从具有T-细胞(ALL-SCID6,ALL-SCID3)、B-细胞(ALL-SCID7)(Borgmann等人,2000)和B-细胞前体(BCP，前-B-ALL-SCID)急性白血病的患者建立异种移植物。首先，测定异种移植物-来源的-ALL-细胞上阿片样受体表达。观察到ALL-SCID6、ALL-SCID3和ALL-SCID7白血病细胞展示出高量的阿片样受体(图1A)，而前-B-ALL-SCID仅表达中度水平的阿片样受体(图1A)。
[0198] 为了分析使用D,L-美沙酮的细胞死亡诱导是否取决于阿片样受体表达水平，用不同浓度的D,L-美沙酮处理ALL-SCID6、ALL-SCID3、ALL-SCID7和前-B-ALL-SCID(图1B)。
[0199] 使用治疗血浆浓度的D,L-美沙酮(≤3μg/mL)，而且还使用较高浓度的10μg/mL D,L-美沙酮，因为D,L-美沙酮在淋巴组织和骨髓中的水平可能更高，但对其尚未测定(Singh等人,2011)。发现D,L-美沙酮(≤3μg/mL)的治疗血浆浓度诱导在其细胞表面上表达高量阿片样受体的异种移植物-来源的ALL-细胞中的强烈细胞死亡(图1A、B)。与这些观察结果相比，使用治疗浓度的D,L-美沙酮(图1B)仅能够轻度地杀伤具有中度阿片样受体水平的前-B-ALL-SCID(图1A)。这清楚地揭示出用D,L-美沙酮诱导细胞凋亡取决于阿片样受体表达的水平。
[0200] 实施例2：用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理杀伤和活化具有中度阿片样受体表达的ALL-细胞中的胱天蛋白酶
[0201] 在类似的研究中，测试了D,L-美沙酮对以中度水平在其细胞表面上(图2A)表达阿片样受体的BCP-ALL-细胞系(Tanoue、Reh、Nalm6)的毒性潜力。
[0202] 正如对前-B-ALL-SCID观察到的(图1B)，用D,L-美沙酮仅可以轻度地杀伤这些BCP-ALL-细胞系(图2b)。为了显示不同物质是否可以以协同方式起作用，用不同浓度的单独的D,L-美沙酮和多柔比星或它们彼此的组合处理细胞系Tanoue、Reh、Nalm6和前-B-ALL-SCID(图2B、2C)。观察到组合处理强烈地诱导BCP-ALL-细胞系和异种移植物-来源的-BCP-ALL-患者-细胞(前-B-ALL-SCID)中的细胞杀伤(图2B,C)。
[0203] 为了更详细地分析细胞杀伤的分子途经并且发现使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理如何诱导细胞凋亡，首先分析与使用单独的D,L-美沙酮或多柔比星处理细胞相比，在这种组合处理时细胞凋亡信号转导效应分子在BCP-ALL-细胞中被活化。在除使用多柔比星之外还使用D,L-美沙酮处理BCP-ALL-细胞系Tanoue 120h之后，观察到BCP-ALL-细胞中胱天蛋白酶级联的活化。分析揭示出胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-2的强烈活化和胱天蛋白酶-3、聚-(ADP-核糖)-聚合酶(PARP)的原型底物裂解(图3A)。
[0204] 使用胱天蛋白酶的广谱抑制剂zVAD.fmk进一步研究胱天蛋白酶级联在细胞凋亡诱导中的作用。将BCP-ALL-细胞与或不与50μM zVAD.fmk一起温育并且除使用多柔比星之外还使用D,L-美沙酮处理。基于对胱天蛋白酶活化的依赖性，在使用D,L-美沙酮和多柔比星在BCP-ALL-细胞中组合处理后，zVAD.fmk强烈减少细胞死亡(图3B)。
[0205] 用抗-细胞凋亡因子如XIAP和Bcl-xL严格地控制细胞凋亡机制(Fulda,2009a；Fulda,2009b)，发现这些因子在除使用多柔比星之外还使用D,L-美沙酮处理的BCP-ALL-细胞中得到强烈地下调(图3C)。这些结果表明D,L-美沙酮和多柔比星的组合敏化BCP-ALL-细胞，通过胱天蛋白酶活化和XIAP和Bcl-xL的下调用于细胞凋亡。
[0206] 实施例3：多柔比星强烈地诱导阿片样受体在白血病细胞中的表达
[0207] 在用D,L-美沙酮处理白血病细胞后的细胞凋亡途经中的效应分子的细胞死亡诱导和活化效率显然取决于在细胞表面上展示出的阿片样受体量。使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理显著地杀伤具有中度阿片样受体表达的白血病细胞，而这些细胞仅可以被单独的D,L-美沙酮或多柔比星轻度地杀伤。化疗剂增强受体如CD95在白血病细胞中的表达(Posovszky等人,1999)。为了分析多柔比星是否可以影响阿片样受体表达，用多柔比星将BCP-ALL-细胞系Tanoue处理96h。此后，通过流式细胞计量术测定与未处理细胞相比阿片样受体的相对量。发现多柔比星强烈地增加阿片样受体表达(图4A)，这启示D,L-美沙酮可以以更高量结合与多柔比星共处理的细胞。这种作用可以以推定的方式导致治疗使用D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理的较高细胞毒性潜力。
[0208] 实施例4：阿片样物质如D,L-美沙酮增强多柔比星摄取和抑制其流出[0209] 阿片样物质是牵涉多重抗药性的流出泵P-糖蛋白(P-gp)中的底物。为了分析D,L-美沙酮是否可以影响多柔比星在白血病细胞中的摄取和或流出，将BCP-ALL-细胞系Tanoue与单独的多柔比星或多柔比星和D,L-美沙酮的组合一起温育不同间隔。24h(0h)后，观察到与多柔比星和D,L-美沙酮共温育的细胞中的多柔比星浓度提高(图4B)。在从上清液中除去多柔比星后，加入新鲜培养基，不施用多柔比星和D,L-美沙酮。8h和24h后，D,L-美沙酮强烈减少多柔比星流出(图4B)，这表明D,L-美沙酮增加白血病细胞的多柔比星摄取并且抑制多柔比星的流出。这解释了D,L-美沙酮和多柔比星如何相互地增加其细胞毒性潜力。
[0210] 实施例5：用D,L-美沙酮和多柔比星细胞的凋亡诱导关键地取决于阿片样受体活化和cAMP浓度
[0211] 为了进一步分析阿片样受体触发在细胞凋亡诱导和随后细胞凋亡途经活化中的作用，用D,L-美沙酮、多柔比星或单独的阿片样受体拮抗剂纳洛酮或它们彼此不同的组合处理BCP-ALL-细胞系Tanoue(图5A、B)。
[0212] 96h后，发现用纳洛酮阻断阿片样受体强烈地减少使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理的细胞凋亡率(图5A)。此外，用纳洛酮阻断阿片样受体强烈地减少除使用多柔比星之外还使用D,L-美沙酮处理BCP-ALL-细胞后胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-3的活化和PARP裂解(图5B)。这表明阿片样受体的触发决定性地牵涉细胞凋亡诱导以及胱天蛋白酶活化(图7)。
[0213] 阿片样受体刺激活化抑制性Gi-蛋白，由此阻断减少cAMP的腺苷酸环化酶活性(图7)。CAMP是白血病细胞中的DNA-损伤-和多柔比星-诱导的细胞凋亡抑制剂(Naderi等人,2009；Safa等人,2010a)。百日咳毒素(PTX)使Gi-蛋白失活并且阻断cAMP的下调(Law等人,1985)(图7)。然而，IBMX增加cAMP水平作为磷酸二酯酶抑制的结果(图7)。为了分析cAMP在阿片样受体活化-诱导的细胞凋亡中的关键作用，用单独的D,L-美沙酮、多柔比星和IBMX或PTX或它们彼此的不同组合处理BCP-ALL-细胞系Tanoue(图5C、D)。96h后，发现IBMX上调cAMP(图5C)和PTX阻断cAMP下调(图5D)强烈地降低了使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理的细胞凋亡率。此外，IBMX上调cAMP也减少了多柔比星-诱导的细胞凋亡(图5C)。这些结果表明阿片样受体偶联Gi-蛋白的活化是诱导可能通过胞内cAMP水平调节的细胞凋亡所必需的。
[0214] 实施例6：单独的D,L-美沙酮或与除使用多柔比星之外还使用D,L-美沙酮抑制ALL-异种移植物-模型中的体内肿瘤生长
[0215] 体外结果显示D,L-美沙酮可以诱导几种白血病细胞系中的细胞凋亡并且增加多柔比星的细胞毒性。为了证实单独的D,L-美沙酮或与多柔比星组合抗-癌潜力的临床相关性并且验证迄今为止得到的结果，进行ALL-异种移植物研究。
[0216] 为了进行体内研究，使用患者-来源的-ALL-异种移植物-模型(ALL-SCID6)。具有原始患者样品的表型和基因型身份被证实(Borgmann等人,2000)。本实验在第0天时启动，使用皮下接种来自体内传代入雄性NOD/SCID/IL2ry裸(NSG)鼠的ALL-SCID6片段。随机分组后，在以递增剂量ALL-接种后的第1天时开始口服施用D,L-美沙酮。当肿瘤可触及时，开始多柔比星治疗。D,L-美沙酮和多柔比星治疗以相当的水平导致肿瘤生长得到显著抑制(图6)。
[0217] 到第70天时，使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理具有与单独的D,L-美沙酮或多柔比星类似的抗-肿瘤效能。在更晚时间点时，肿瘤抑制在D,L-美沙酮和多柔比星组合肿瘤期间是更长效的。该疗法对于所述组合而言是充分耐受的，体重改变为-10％，而对于D,L-美沙酮或多柔比星治疗分别为-8％或-4％。为了分析小鼠中D,L-美沙酮的血清浓度，最后施用D,L-美沙酮后，0.5、1、4和24小时，取血清并且通过质谱法对D,L-美沙酮定量。在D,L-美沙酮施用后0.5-4小时的时程中发现美沙酮的血清浓度为28ng/mL-138ng/mL，表明可以达到与体外浓度相当的水平。发现多柔比星的血清浓度为156ng/mL-198ng/mL。这些结果表明D,L-美沙酮和使用多柔比星和D,L-美沙酮共治疗显著地抑制体内肿瘤生长。
[0218] 实施例7：D,L-美沙酮使胶质母细胞瘤细胞对多柔比星治疗敏化
[0219] 正如通过流式细胞计量术证实的，胶质母细胞瘤细胞系A172和U118MG(参见图8)和初级胶质母细胞瘤细胞(参见图11A)和启动胶质母细胞瘤的干细胞(参见图12A)表达阿片样受体。在所有这些细胞和细胞系中，D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理以剂量-依赖性方式诱导细胞凋亡(参见图9、10、11B和12B)。正如对胶质母细胞瘤细胞系A172示例的，可以证实使用D,L-美沙酮和多柔比星共处理对神经胶质瘤细胞的细胞死亡诱导取决于胱天蛋白酶活化(参见图13)。此外，可以证实D,L-美沙酮逆转启动胶质母细胞瘤的干细胞中多柔比星对细胞凋亡途经的活化缺失(参见图14)。
[0220] 实施例8：D,L-美沙酮对多柔比星摄取和流出的作用
[0221] 使用胶质母细胞瘤细胞系A172的体外结果证实D,L-美沙酮可以促进多柔比星摄取并且还抑制其流出(参见图15)。这得出了癌细胞对使用抗癌药治疗的敏化的解释。
[0222] 实施例9：多柔比星或顺铂对癌细胞上阿片样受体表达的作用
[0223] 正如对胶质母细胞瘤细胞系A172所显示的，多柔比星导致阿片样受体表达有6-倍的增加(参见图16)。可以证实该机制对于其它癌症类型和抗癌药也保持确切，因为在前髓细胞性白血病细胞系HL60中，顺铂-治疗导致阿片样受体表达有2.1-倍的增加(参见图19)。
[0224] 实施例10：白血病、胰腺和卵巢癌细胞对使用不同抗癌药治疗的敏化[0225] 在另一种体外分析中，可以证实D,L-美沙酮使白血病癌细胞(Nalm-6)、胰腺癌细胞(Nalm6)和卵巢癌细胞(A2780)对依托泊苷或顺铂治疗敏化(参见图17)。此外，对于使用氟达拉滨的细胞凋亡治疗，还可以用D,L-美沙酮敏化慢性淋巴细胞白血病细胞(CLL)(参见图18)。
[0226] 实施例11：乳癌细胞对使用不同抗癌药治疗的敏化
[0227] 正如通过流式细胞计量术所证实的，Her2/Neu-抗性乳癌细胞系JIMT-1表达μ-阿片样受体(参见图20)。正如通过FACS分析所证实的，D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理以剂量-依赖性方式诱导JIMT-1细胞中的细胞凋亡(参见图21)。可以证实使用D,L-美沙酮和多柔比星共处理对JIMT-1细胞进行细胞死亡诱导取决于胱天蛋白酶活化(参见图22和23)。
[0228] 实施例12：通过阿片样物质芬太尼，多柔比星处理的癌细胞的敏化
[0229] 正如对T-细胞来源的白血病细胞系CEM所示例的，可以证实阿片样物质芬太尼也能够使CEM细胞对使用多柔比星的处理敏化(参见图24)。在另一种体外实验中，阿片样物质丁丙诺啡敏化因多柔比星导致的细胞凋亡的白血病细胞(HL-60)(参见图25)。
[0230] 实施例13：使用D,L-美沙酮和顺铂(CDDP)组合处理杀伤和活化不同白血病细胞中的胱天蛋白酶
[0231] D,L-美沙酮对不同白血病-细胞系的细胞死亡潜力显示在人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病、人B细胞白血病上。全部测试的细胞系均以中度水平方式在其细胞表面上表达阿片样受体(图27)。
[0232] 用D,L-美沙酮仅可以轻度地杀伤这些白血病细胞(图28，白色条)。为了证实不同抗癌药(物质)以协同方式起作用，用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(-CDDP)或顺铂或D,L-美沙酮与顺铂(+CDDP)的组合治疗人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病和人B细胞白血病(图28)。取决于顺铂或/和D,L-美沙酮浓度的不同，该组合治疗强烈地诱导不同白血病中的细胞死亡。
[0233] 更详细地显示了细胞杀伤的分子途经并且证实了使用阿片样物质受体激动剂即D,L-美沙酮和抗癌药即顺铂的组合处理如何诱导细胞凋亡。首先，证实细胞凋亡信号转导的效应分子在不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病)中被活化。将D,L美沙酮与顺铂(+CDDP)的组合处理与用单独的D,L-美沙酮(-CDDP)或顺铂处理的细胞对比。证实除使用顺铂(+CDDP)之外还使用D,L-美沙酮处理不同白血病细胞诱导白血病细胞中胱天蛋白酶级联的活化。取决于组合处理，诱导胱天蛋白酶-3(活性胱天蛋白酶-3p19、p17)、胱天蛋白酶-9(活性胱天蛋白酶-9p37)和胱天蛋白酶-2的强活化和胱天蛋白酶-3、聚-(ADP-核糖)-聚合酶(PARP)的原型底物的裂解(裂解p85和或下调PARP p116)(图29)。
[0234] 使用胱天蛋白酶的广谱抑制剂zVAD.fmk进一步研究胱天蛋白酶级联在细胞凋亡诱导中的作用。将不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病)与50μM的zVAD.fmk(+zVAD.fmk，白色条)或不与zVAD.fmk(-zVAD.fmk，黑色条)一起温育并且除使用顺铂之外还使用D,L-美沙酮处理。基于对胱天蛋白酶活化的依赖性，zVAD.fmk强烈减少在使用D,L-美沙酮和顺铂组合处理(图30)后的细胞死亡。
[0235] 用抗-细胞凋亡因子如XIAP和Bcl-xL和凋亡前因子如Bax严格地控制细胞凋亡机制(Fulda,2009a；Fulda,2009b)。取决于不同浓度的顺铂或/和不同浓度的D,L-美沙酮的不同，XIAP在除使用顺铂(+CDDP)之外还使用D,L-美沙酮处理(图29)的不同白血病细胞中被强烈地下调(p57)和或裂解(p30)。在除使用顺铂(+CDDP)之外还使用D,L-美沙酮处理后Bax(p21)的强上调在诱导到的人T细胞白血病中被诱导。D,L-美沙酮和顺铂的组合通过活化胱天蛋白酶并且通过下调和抑制抗-细胞凋亡因子例如XIAP和上调凋亡前因子例如Bax对不同白血病细胞对细胞凋亡敏化。由此证实阿片样受体是这样的受体，其诱导细胞死亡并且活化细胞凋亡途经，这些途经牵涉胱天蛋白酶活化、PARP的下调和或裂解和或抗-细胞凋亡因子的下调和或凋亡前因子的上调和或抑制性细胞凋亡蛋白(IAP)的下调和抑制。因此，阿片样受体是除诱导通常公知的细胞死亡受体/死亡的配体系统和如CD95/CD95L-系统这样的机制外具有诱导细胞死亡的新机制的新的未知方式。
[0236] 实施例14：顺铂强烈地诱导阿片样受体在白血病细胞中的表达
[0237] 在使用阿片样受体-激动剂即D,L-美沙酮处理白血病细胞后效应分子在细胞凋亡途经中的细胞死亡诱导和活化效率取决于展示在细胞表面上的阿片样受体的量。使用D,L-美沙酮和顺铂组合处理显著地杀伤具有中度阿片样受体表达的仅可以被单独的D,L-美沙酮或顺铂轻度杀伤的白血病细胞。化疗剂增强白血病细胞中属于专用已知死亡受体的受体CD95(FAS，APO-1)的表达(Posovszky等人,1999)。为了显示顺铂对阿片样受体表达具有影响，用顺铂处理不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病)。此后，通过流式细胞计量术测定阿片样受体与未处理细胞对比的相对量。证实顺铂强烈地增加阿片样受体表达(图31)。因此，阿片样受体-激动剂如D,L-美沙酮可以以更高量结合与顺铂或其它能够诱导更高水平表达的阿片样受体的抗癌药共处理的细胞。这种作用导致阿片样物质受体激动剂即D,L-美沙酮和抗癌药即顺铂的组合处理的更高的细胞死亡潜力。
[0238] 本发明中证实具有更长的最短有效性期限的阿片样物质受体激动剂如D,L美沙酮具有比具有与D,L美沙酮对比更短的最短有效性期限的阿片样物质受体激动剂如吗啡更好的效果(图33和图34。
[0239] 实施例15：用D,L-美沙酮和多柔比星的细胞凋亡诱导关键取决于胶质母细胞瘤中的阿片样受体活化
[0240] 为了显示阿片样受体触发在属于实体瘤的胶质母细胞瘤中细胞凋亡诱导中的作用，用单独的D,L-美沙酮、多柔比星或阿片样受体拮抗剂纳洛酮或它们彼此不同的组合处理胶质母细胞瘤细胞(图32)。
[0241] 120h和144h后，证实用纳洛酮阻断阿片样受体强烈地减少使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理导致的细胞凋亡率(图32)。
[0242] 实施例16：不同阿片样物质有效性的不同期限诱导使用D,L-美沙酮或吗啡与抗癌药例如多柔比星的组合在胶质母细胞瘤或白血病中的不同的细胞凋亡率
[0243] 用阿片样物质处理胶质母细胞瘤细胞或白血病细胞后的细胞死亡诱导效率取决于阿片样物质有效性的期限。美沙酮有效性的最短期限为5-7小时，而吗啡有效性的最短期限为2-4小时。使用D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理在胶质母细胞瘤细胞(图33A)和白血病细胞(图34A)中强烈诱导高细胞死亡率。相反，使用吗啡和多柔比星组合处理在胶质母细胞瘤细胞(图33B)和白血病细胞(图34B)中诱导更低的细胞死亡率。这表明阿片样物质与抗癌药组合处理后的细胞死亡的诱导率也取决于阿片样物质有效性的期限。对于其它抗癌药也发现了这种作用。
[0244] 实施例17：除使用多柔比星之外还使用D,L-美沙酮的组合处理介导胶质母细胞瘤细胞中细胞增殖抑制和G2/M细胞周期停滞
[0245] 细胞增殖由真核细胞周期控制(Sherr CJ.Caner cell cycles.Science 1996；274:1672–7)，其不仅可以被生长因子调节，而且可以被各种起抑制细胞周期进展的信号调节。大部分癌细胞具有4个细胞分裂周期阶段：门控(G1)、合成(S)、G2和有丝分裂(M)。
染色体DNA在S期过程中复制。当胶质母细胞瘤细胞分裂时，细胞周期应从S期转移至G2/M期。这种严格控制的暂时次序通过大量称作细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的蛋白激酶的依次活化得以加强，其通过与各种细胞周期蛋白形成复合物。阿片样物质受体激动剂例如美沙酮与多柔比星的组合抑制癌细胞例如胶质母细胞瘤细胞增殖并且诱导胶质母细胞瘤细胞中的S/G2–M细胞周期停滞。
染色体DNA在S期过程中复制。当胶质母细胞瘤细胞分裂时，细胞周期应从S期转移至G2/M期。这种严格控制的暂时次序通过大量称作细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的蛋白激酶的依次活化得以加强，其通过与各种细胞周期蛋白形成复合物。阿片样物质受体激动剂例如美沙酮与多柔比星的组合抑制癌细胞例如胶质母细胞瘤细胞增殖并且诱导胶质母细胞瘤细胞中的S/G2–M细胞周期停滞。
[0246] 实施例18：细胞凋亡诱导和胱天蛋白酶活化取决于诱导胶质母细胞瘤中cAMP下调的阿片样受体活化
[0247] cAMP-相关信号转导可以控制细胞凋亡诱导和细胞生长。为了分析阿片样受体活化在胶质母细胞瘤细胞中细胞凋亡诱导和胱天蛋白酶活化中的作用，用单独的阿片样物质受体激动剂D,L-美沙酮、抗癌药多柔比星或阿片样受体拮抗剂纳洛酮或不同的组合处理胶质母细胞瘤细胞A172(图36A、36B和36C)。用纳洛酮阻断阿片样受体强烈地减少使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理诱导的细胞凋亡(图36A和36B)和胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3活化和PARP的裂解(图36C)。这表明阿片样受体活化在细胞凋亡诱导和胱天蛋白酶活化中起关键作用。阿片样受体刺激活化抑制性Gi-蛋白，由此阻断减少cAMP的腺苷酸环化酶活性。然而，IBMX增加因磷酸二酯酶抑制导致的cAMP水平。为了分析cAMP在阿片样受体活化-诱导的细胞凋亡中的关键作用，用单独的D,L-美沙酮、多柔比星和IBMX或不同组合处理A172细胞(图36D)。通过IBMX上调cAMP强烈地减少因使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理导致的细胞凋亡诱导，表明通过cAMP下调的阿片样受体活化使胶质母细胞瘤细胞对多柔比星-诱导的细胞凋亡和胱天蛋白酶的活化敏化。
[0248] 实施例19：使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化抑制体内肿瘤生长
[0249] 给每只裸鼠皮下接种U87MG胶质母细胞瘤细胞。在对16只小鼠随机分组后，从第1天开始在8只小鼠中每日口服施用D,L-美沙酮，直到实验结束为止。D,L-美沙酮计量每周从60增加至120至240mg/kg/d bid。在第33天时，用D,L-美沙酮最后治疗后24h，处死小鼠。为了分析D,L-美沙酮在小鼠中的血清浓度，在最后D,L-美沙酮-施用后0.5、1和
4h，取血清，并且通过质谱法对D,L-美沙酮定量。与媒介物治疗的对照组小鼠相比，D,L-美沙酮治疗的小鼠在第19-33天时具有显著减小的肿瘤尺寸，其中最佳T/C值为49％(参见图37)。D,L-美沙酮治疗在所用剂量下得到充分耐受并且仅诱导9％的最低体重减轻。发现在D,L-美沙酮施用后0.5-4h的时程中血清浓度为136ng/ml-1608ng/mL美沙酮。这些发现表明使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化抑制体内胶质母细胞瘤生长。
4h，取血清，并且通过质谱法对D,L-美沙酮定量。与媒介物治疗的对照组小鼠相比，D,L-美沙酮治疗的小鼠在第19-33天时具有显著减小的肿瘤尺寸，其中最佳T/C值为49％(参见图37)。D,L-美沙酮治疗在所用剂量下得到充分耐受并且仅诱导9％的最低体重减轻。发现在D,L-美沙酮施用后0.5-4h的时程中血清浓度为136ng/ml-1608ng/mL美沙酮。这些发现表明使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化抑制体内胶质母细胞瘤生长。
[0250] 实施例20：短期治疗后阿片样物质例如D,L-美沙酮增加卵巢癌细胞中顺铂-诱导的细胞死亡
[0251] 用单独的顺铂(5,3μg/mL)或D,L-美沙酮(3,1μg/mL)或组合处理A2780卵巢癌细胞。正如图38中所示，通过D,L-美沙酮和顺铂共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化卵巢癌细胞中顺铂-诱导的细胞凋亡。
[0252] 实施例21：长期治疗后阿片样物质例如D,L-美沙酮增加卵巢癌细胞中顺铂-诱导的细胞死亡
[0253] 用单独的顺铂(2、1、0.5、0.3μg/mL)或D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)或组合处理A2780卵巢癌细胞。正如图39所示，通过D,L-美沙酮和顺铂共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化卵巢癌细胞中顺铂-诱导的细胞凋亡并且破坏化学抗性。
[0254] 实施例22：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加顺铂-抗性卵巢癌细胞中顺铂-诱导的细胞死亡
[0255] 用单独的顺铂(3、2、1μg/mL)或D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)或组合处理A2780cis卵巢癌细胞。正如图40所示，通过D,L-美沙酮和顺铂共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化顺铂-抗性卵巢癌细胞中顺铂-诱导的细胞凋亡。
[0256] 实施例23：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加卵巢癌细胞处理中顺铂的有效性[0257] 用单独的顺铂(2μg/ml)处理A2780卵巢癌细胞。正如图41所示，2μg/mL浓度的顺铂在144h后诱导90％的细胞死亡。然而，用0.5μg/mL顺铂与D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)组合处理诱导95％的细胞死亡。此外，根据D,L-美沙酮浓度的不同，用0.2μg/mL顺铂与D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)组合处理诱导70-85％的细胞死亡。这表明阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化卵巢癌细胞中顺铂-诱导的细胞凋亡/细胞死亡。D,L-美沙酮增加卵巢癌治疗中顺铂的有效性，这启示可以通过与D,L-美沙酮共治疗使用显著降低的抗-癌药浓度，从而得到相当的细胞死亡率，且由此观察到抗癌药的副作用较少。基于目前的数据，可以以低于针对相应癌症治疗推荐的剂量至少二分之一或三分之一且至多低于其百分之一的剂量给予抗癌药。
[0259] 在使用抗癌药或辐射处理的化学-和放射抗性卵巢癌细胞中观察到缺陷性胱天蛋白酶活化。为了澄清胱天蛋白酶活化在卵巢癌细胞中D,L-美沙酮和顺铂组合疗法-诱导的细胞凋亡中的相关性，用单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)或顺铂(5、3μg/mL)或组合处理A2780卵巢癌细胞。正如图42中所示，使用顺铂和D,L-美沙酮的组合处理通过活化胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-8和裂解聚-(ADP-核糖)-聚合酶(PARP)在卵巢癌细胞中导致强烈的胱天蛋白酶活化。这表明使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化逆转顺铂在卵巢癌细胞中的胱天蛋白酶缺陷性活化。
[0260] 实施例25：使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化在使乳腺癌细胞对多柔比星治疗的敏化中起关键作用
[0261] 为了分析阿片样受体活化在乳腺癌中的细胞凋亡诱导中的作用，用单独的阿片样物质受体激动剂D,L-美沙酮、多柔比星或阿片样受体拮抗剂纳洛酮或不同组合处理曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞JIMT-1(图43)。用纳洛酮阻断阿片样受强烈地减少通过使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理诱导的细胞凋亡。这表明阿片样受体活化在细胞凋亡诱导中起关键作用。
[0262] 实施例26：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加前列腺癌细胞中顺铂-诱导的细胞死亡
[0263] 用单独的顺铂(5、3μg/mL)或D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)或组合处理前列腺癌细胞PC-3。正如图44中所示，通过D,L-美沙酮和顺铂共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化前列腺癌细胞中顺铂-诱导的细胞凋亡。
[0264] 实施例27：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加白血病细胞中来自不同抗-癌药种类的不同抗-癌药的细胞死亡诱导
[0265] 用单独的不同抗-癌药(白色柱图)或与D,L-美沙酮的组合(黑色柱图)处理Nalm6。正如图45中所示，通过D,L-美沙酮和顺铂共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化白血病细胞中来自不同抗癌种类的不同抗癌药的细胞凋亡诱导。
[0266] 实施例28：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加胶质母细胞瘤细胞中抗-癌药-诱导的细胞
[0267] 用来自同一抗-癌药种类例如蒽环类抗生素的不同抗-癌药(多柔比星、伊达比星和柔红霉素)处理胶质母细胞瘤细胞A172。用单独的蒽环类抗生素(白色柱图)或与D,L-美沙酮的组合(黑色柱图)处理胶质母细胞瘤细胞。正如图46中所示，通过D,L-美沙酮和不同蒽环类抗生素共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化胶质母细胞瘤细胞中来自同类的不同抗癌药的细胞凋亡诱导。
[0268] 实施例29：胰腺癌细胞上的阿片样受体表达.
[0269] 通过流式细胞计量术用测定阿片样受体表达的纳洛酮荧光素染色胰腺癌细胞Colo 357。作为结果，发现阿片样受体在胰腺癌表面上存在强表达(参见图47)。
[0270] 实施例30：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加胰腺癌细胞中抗-癌药-诱导的细胞
[0271] 用来自同一抗-癌药种类的不同抗-癌药例如顺铂金属配合物(奥沙利铂、顺铂)处理胰腺癌细胞Colo 357。用单独的不同浓度的顺铂金属配合物奥沙利铂或顺铂或与D,L-美沙酮的组合处理胰腺癌细胞Colo357。正如图48中所示，通过D,L-美沙酮和铂金属配合物(A)奥沙利铂或(B)顺铂共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化胰腺癌细胞中来自同一抗-癌药种类的不同抗癌药的细胞凋亡诱导。
[0272] 实施例31：阿片样受体活化逆转胰腺癌细胞中顺铂和奥沙利铂导致的缺陷性胱天蛋白酶活化
[0273] 在使用抗癌药或辐射处理的化学-和放射抗性胰腺癌细胞Colo 357中观察到缺陷性胱天蛋白酶活化。为了澄清胱天蛋白酶活化在胰腺癌中D,L-美沙酮和顺铂-诱导的细胞凋亡或D,L-美沙酮和奥沙利铂-诱导的细胞凋亡的组合疗法中的相关性，用单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)或奥沙利铂(3、2μg/mL；参见图49A)或顺铂(0.5、0.7μg/mL；参见图49B)或与美沙酮和奥沙利铂(参见图49A)或顺铂(参见图49B)的组合处理胰腺癌细胞Colo 357。正如图49中所示，该组合处理通过活化胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和裂解聚-(ADP-核糖)-聚合酶(PARP)在胰腺癌细胞中导致强烈的胱天蛋白酶活化。这表明使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化逆转顺铂或奥沙利铂在胰腺癌细胞中导致的胱天蛋白酶缺陷性活化。
[0274] 实施例32：胱天蛋白酶活化的抑制阻断奥沙利铂-或顺铂-诱导的细胞凋亡的阿片样物质敏化的胰腺癌细胞
[0275] 为了研究胱天蛋白酶在阿片样受体活化-诱导的细胞凋亡中的关键作用，将胰腺癌细胞Colo 357与胱天蛋白酶广谱抑制剂zVAD.fmk一起温育。与zVAD.fmk温育几乎完全抑制D,L-美沙酮与奥沙利铂(参见图50A、B)或D,L-美沙酮与顺铂(参见图50C、D)组合诱导的胰腺癌细胞中的细胞凋亡，这启示胱天蛋白酶对于阿片样受体活化-介导的奥沙利铂和顺铂处理的胰腺癌细胞的敏化是关键性的。这表明阿片样受体活化例如D,L-美沙酮逆转胰腺癌细胞中奥沙利铂或顺铂对胱天蛋白酶的缺陷性活化。
[0276] 实施例33：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加胶质母细胞瘤细胞中替莫唑胺(泰道)-诱导的细胞死亡
[0277] 用单独的替莫唑胺或D,L-美沙酮(3,1μg/mL)或组合处理胶质母细胞瘤细胞A172。正如图51中所示，通过D,L-美沙酮和替莫唑胺共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示阿片样物质例如D,L-美沙酮强烈地强化胶质母细胞瘤细胞中替莫唑胺-诱导的细胞凋亡。
[0278] 实施例34：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加胰腺癌治疗中奥沙利铂和顺铂的有效性
[0279] 用单独的不同浓度的奥沙利铂(A)或顺铂(B)或与D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图，白色柱图)处理胰腺癌细胞Colo 357。正如图52中所示，通过D,L-美沙酮和不同顺铂金属配合物奥沙利铂(A)或顺铂(B)共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。
[0280] 用单独的(A)奥沙利铂(10μg/ml)处理胰腺癌细胞Colo 357。10μg/mL顺铂在120h后诱导的细胞死亡率为60％。然而，除使用D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)之外使用
3μg/mL奥沙利铂处理诱导的细胞死亡率为65％。此外，用2μg/mL奥沙利铂与D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)组合处理诱导的细胞死亡率为45％。
3μg/mL奥沙利铂处理诱导的细胞死亡率为65％。此外，用2μg/mL奥沙利铂与D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)组合处理诱导的细胞死亡率为45％。
[0281] 用单独的(B)顺铂(10μg/ml)处理胰腺癌细胞Colo 357。10μg/mL顺铂在144h后诱导的细胞死亡为70％。然而，除使用D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)之外使用0.7μg/mL顺铂处理诱导的细胞死亡率为85％。此外，除使用D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)之外使用0.5μg/mL顺铂处理诱导的细胞死亡率为60％。
[0282] 这启示，D,L-美沙酮增加胰腺癌治疗中奥沙利铂和顺铂的有效性，表明可以通过与D,L-美沙酮共处理使用显著降低的抗-癌药浓度，从而得到相当的细胞死亡率，且由此观察到抗癌药的副作用较少。此外，这表明阿片样物质例如D,L-美沙酮破坏化学抗性，因为使用抗-癌药的常规疗法因用于患者治疗的抗癌药浓度的毒性而受限。
[0283] 实施例35：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加白血病治疗中多柔比星的有效性[0284] 用单独的多柔比星或与D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理BCP-ALL细胞系(Nalm6、Reh和Tanoue)(阴影线柱图)。正如图53中所示，与D,L-美沙酮共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。这启示D,L-美沙酮增加白血病细胞处理中多柔比星的有效性，从而启示可以通过与D,L-美沙酮共处理使用显著降低的抗-癌药浓度，从而得到相当的细胞死亡率，且由此观察到抗癌药的副作用较少。
[0285] 实施例36：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加乳腺癌治疗中多柔比星的有效性[0286] 用单独的多柔比星或与D,L-美沙酮和多柔比星的组合(阴影线柱图)处理曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞(JIMT-1)。如图54所示，通过D,L-美沙酮共处理观察到强烈诱导细胞死亡。0.1μg/mL多柔比星在120h后诱导的细胞死亡率为70％。然而，取决于D,L-美沙酮浓度的不同，除使用D,L-美沙酮(10、3、1、0.1μg/mL)之外使用0.015μg/mL多柔比星处理诱导的细胞死亡为70-55％。
[0287] 这启示D,L-美沙酮增加乳腺癌细胞处理中多柔比星的有效性，从而启示可以通过与D,L-美沙酮共处理使用显著降低的抗-癌药浓度，从而得到相当的细胞死亡率，且由此观察到抗癌药的副作用较少。
[0288] 实施例37：阿片样物质例如D,L-美沙酮增加胶质母细胞瘤治疗中多柔比星的有效性
[0289] 用单独的不同浓度的多柔比星或与D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图，白色柱图)处理胶质母细胞瘤细胞A172。正如图55中所示，通过D,L-美沙酮和多柔比星共处理观察到对细胞死亡的强烈诱导。
[0290] 用单独的多柔比星(1μg/ml)处理胶质母细胞瘤细胞A172。1μg/mL多柔比星在144h后诱导的细胞死亡率为80％。然而，取决于D,L-美沙酮浓度的不同，除使用D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)之外使用0.1μg/mL多柔比星处理诱导的细胞死亡为85％-50％。
[0291] 这启示D,L-美沙酮增加胶质母细胞瘤处理中多柔比星的有效性，从而启示可以通过与D,L-美沙酮共处理使用显著降低的抗-癌药浓度，从而得到相当的细胞死亡率，且由此观察到抗癌药的副作用较少。此外，这还启示阿片样物质例如D,L-美沙酮破坏化学抗性，因为使用抗-癌药的常规疗法因用于患者治疗的抗癌药浓度的毒性而受限。
[0292] 实施例38：不同阿片样物质的组合处理在白血病细胞中显示诱导细胞死亡的协同作用
[0293] 用单独的芬太尼(3,1μg/mL)(A)或单独的吗啡(3、1μg/mL)(A)或所示浓度的芬太尼和吗啡的组合(B)处理白血病细胞HL60。正如图56中所示，通过吗啡和芬太尼(B)共处理观察到对细胞死亡的诱导以强烈协同作用方式增加。这启示不同阿片样物质的组合促进凋亡前作用并且赞同促阿片样物质的组合应用还可以应用于与另一种抗癌药的组合。
[0294] 讨论
[0295] 所述实施例提供了如下证据：取决于诱导cAMP下调的阿片样受体活化，D,L-美沙酮诱导白血病细胞中的细胞凋亡、活化胱天蛋白酶和增加多柔比星-诱导的细胞死亡。此外，可以首次证实，D,L-美沙酮可以强烈地减少异种移植物-模型中ALL的体内肿瘤生长。值得注意地，可以用D,L-美沙酮与抗癌药多柔比星的组合增强这种杀伤肿瘤的作用。
[0296] 美沙酮是结合μ-阿片样受体(如果存在于细胞上)的μ-阿片样物质受体激动剂。发现D,L-美沙酮强烈地杀伤异种移植物-来源的表达高水平阿片样受体的ALL-细胞。相反，D,L-美沙酮在异种移植物-来源的表达中等量阿片样受体的ALL-细胞和-细胞系中仅轻微诱导细胞死亡，表明D,L-美沙酮-诱导的细胞凋亡显然取决于阿片样受体在白血病细胞中表达的关键水平。
[0297] 组合处理可以证实在恶性肿瘤中是有利的，所述恶性肿瘤对单独的治疗仍然是部分有响应，因为已知不同治疗剂彼此发生相互作用，从而放大了较弱的死亡信号。用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理以协同作用方式增强了两种活性剂在表达中等水平阿片样受体的BCP-ALL-细胞中的抗-肿瘤效能，并且强烈地增加在敏感和抗性癌细胞中细胞凋亡诱导中起关键作用的胱天蛋白酶活化(Fulda,2009c)。此外，许多恶性肿瘤如ALL或NHL(Addeo等人,2005)中牵涉的抗-细胞凋亡蛋白XIAP和Bcl-xL的下调得以显著地增强。这启示D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理强烈地增加细胞凋亡诱导并且可以以协同作用方式改善起抗-肿瘤效能。
[0298] 对常用化疗药具有抗性是疗法有效性的限制因素，由此，作为药物转运蛋白例如P-gp超表达结果的多重抗药性也得到充分表征。尽管在健康细胞中P-gp表达属于正常细胞防御系统，但是在人癌细胞中，P-gp超表达与存活降低和效果差相关(Diestra等人,2003)。可以证实D,L-美沙酮是抑制其作用的P-gp的底物(Crettol等人,2007)。正如因此证实的，多柔比星与D,L-美沙酮共治疗增强多柔比星的细胞摄取并且还抑制多柔比星-流出白血病细胞，从而启示D,L-美沙酮通过增加细胞内多柔比星浓度使白血病细胞对多柔比星-诱导的细胞凋亡敏化。
[0299] 使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理在其表面上表达中等量的阿片样受体的BCP-ALL-细胞中诱导细胞凋亡和胱天蛋白酶活化。发现这种组合处理的增强的毒性还与多柔比星治疗后阿片样受体表达增加相关。因此，D,L-美沙酮可以以较高量结合与多柔比星共处理的细胞。这些结果表明用D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理中的毒性增强与多柔比星介导的阿片样受体表达的上调相关，且还与D,L-美沙酮介导的多柔比星摄取增加和流出减少相关。两种活性剂由此均可以将其细胞毒性潜力发挥至更高的程度。
[0300] 通过催化配体-依赖性核苷酸的阿片样受体信号在Gi上交换，由此抑制多重抗药性和调节N-型钙通道和G蛋白–门控型内向矫正型(GIRK)-钾离子通道，导致细胞信号转导改变(图7)。细胞凋亡诱导对阿片样受体触发的依赖性基于其抑制。用阿片样受体拮抗剂纳洛酮阻断阿片样受体信号转导以高比例抑制使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理-诱导的细胞凋亡和胱天蛋白酶活化，从而启示使用D,L-美沙酮的阿片样受体触发牵涉细胞凋亡诱导和胱天蛋白酶活化(图7)。基于这种作用机制，在不依赖于个体阿片样受体的每一阿片样物质受体激动剂应通过细胞凋亡杀伤肿瘤细胞，因为所有阿片样受体均通过Gi途经连接腺苷酸环化酶。
[0301] 另外的实验证实杀伤组合疗法的一般适用性：
[0302] 癌症的广谱。可以使用阿片样物质受体激动剂的组合治疗几种不同的癌症类型，例如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤或白血病。
[0303] 阿片样物质的广谱。根据Gi-偶联作用机制，几种结构和药理学方面不同的阿片样物质如D,L-美沙酮、丁丙诺啡和芬太尼可以使癌细胞对抗癌药敏化。
[0304] 抗癌药的广谱。对于几种结构和药理学方面不同的抗癌药，可以证实它们增加阿片样受体表达并且显示因共施用阿片样物质激动剂导致的流入增加/流出减少。
[0305] 概述
[0306] 必需强调，阿片样物质与抗癌药之间的相互作用代表如图26所示例的自我强化反馈环。在这种环路的第一个路径中，阿片样物质促进抗癌药的细胞摄取并且抑制其流出。在所述环路的第二个路径上，蓄积的抗癌药导致阿片样受体的表达增加。因此，两种活性剂均可以将其细胞毒性潜力发挥至更高的程度。
[0307] 本实施例可以验证与离体患者-来源的ALL-细胞、患者-来源的胶质母细胞瘤细胞和启动胶质母细胞瘤的干细胞的临床相关性，并且可以首次证实D,L-美沙酮作为单一疗法或与多柔比星组合导致患者-来源的白血病模型和胶质母细胞瘤异种移植物模型中的肿瘤生长得到强烈抑制。单独的D,L-美沙酮或与多柔比星组合的抗-白血病效能、胶质母细胞瘤的肿瘤生长抑制和副作用与单独的多柔比星的那些作用相当。然而，仅组合治疗能够实现更长的持续生长抑制作用。美沙酮在小鼠中的血清浓度与体外显示细胞毒性的浓度相关。
[0308] 总之，阿片样物质和抗癌药的组合疗法可以以几种方式改善癌症疗法：
[0309] ·由于阿片样受体的上调，所以先前阿片样物质无敏感性癌症类型可以进行阿片样物质疗法。
[0310] ·由于阿片样物质-诱导的胞内抗癌药蓄积，所以治疗的效能得以增强。
[0311] ·由于抗-细胞凋亡蛋白例如Bcl-XL的抑制作用和抑制型细胞凋亡蛋白例如XIAP的抑制。
[0312] ·这可以产生针对难以治疗的癌症类型的疗法。
[0313] ·此外，这可以允许抗癌药的剂量减少，从而提高安全性和患者对化疗的依从性。
[0314] ·最终，还可以使抗性癌细胞对抗癌治疗重新敏化。
[0315] ·此外，市场上销售的大量阿片样物质和大量抗癌药开创了新药组合的方式，所述的新药组合因效能和/或安全性增加而可以代表改善的治疗。
[0317] 图1:取决于阿片样受体表达关键水平，D,L-美沙酮杀伤离体ALL细胞[0318] (A)来源于异种移植的小鼠的人ALL-SCID6和ALL-SCID3、ALL-SCID7和前-B-ALL-SCID在其细胞表面上展示出不同水平的阿片样受体。用测定阿片样受体表达的纳洛酮-荧光素染色ALL-SCID6、ALL-SCID3和ALL-SCID7(OR，粗黑色曲线)并且通过流式细胞计量术分析。对照组(Co)显示为细黑色曲线。
[0319] (B)用不同浓度的D,L-美沙酮(如所示的)处理ALL-SCID6、ALL-SCID3、ALL-SCID7和前-B-ALL-SCID。24h和48h后，通过FSC/SSC-分析测定凋亡细胞百分比。如下计算特异性细胞凋亡百分比：100×[实验死亡细胞(％)-培养基中自发死亡细胞(％)]/[100％-培养基中自发死亡细胞(％)]。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0320] 图2:使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理诱导表达中等量阿片样受体的ALL-细胞中的细胞凋亡
[0321] (A)不同BCP-ALL-细胞系(Tanoue、Nalm6和Reh)在其细胞表明上表达中等数量的阿片样受体。用测定阿片样受体表达的纳洛酮-荧光素染色Tanoue、Nalm6和Reh(OR，粗黑色曲线)并且通过流式细胞计量术分析。对照组(Co)显示为细黑色曲线。
[0322] (B)用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(如所示的)(-Doxo，白色柱图)、单独的多柔比星或除多柔比星之外(+Doxo，黑色柱图)还有D,L-美沙酮(如所示的)处理BCP-ALL-细胞系(Tanoue、Nalm6和Reh)。对于细胞系Tanoue，我们使用0.06μg/mL浓度的多柔比星，对于Nalm6和Reh，我们使用0.01μg/mL浓度。刺激后120h，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞的百分比。
[0323] (C)D,L-美沙酮强烈地增强离体异种移植物-来源的-BCP-ALL-患者-细胞的多柔比星敏感性。用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(如所示的)(-Doxo，白色柱图)、单独的0.01μg/mL多柔比星或除多柔比星(+Doxo，黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮处理异种移植物-来源的-BCP-ALL-细胞(前-B-ALL-SCID)。刺激后48h，通过FSC/SSC-分析测定凋亡细胞百分比。如图1B中所示计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0324] 图3:D,L-美沙酮与多柔比星组合恢复体外表达中等量的阿片样受体的BCP-ALL-细胞中的细胞凋亡途经的缺陷性活化
[0325] (A)D,L-美沙酮和多柔比星共处理引起胱天蛋白酶活化。用单独的D,L-美沙酮(如所示的)(-Doxo)、0.06μg/mL单独的多柔比星(+Doxo)或除多柔比星之外还有D,L-美沙酮(如所示的)(+Doxo)处理BCP-ALL-细胞系Tanoue。120h后，对胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和PARP进行蛋白质印迹分析。在～48kDa检测到胱天蛋白酶-2前体的下调。在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9的活性片段，在～19kDa和～17kDa检测到胱天蛋白酶-3的活性片段，且在～85kDa检测到PARP裂解。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0326] (B)D,L-美沙酮和多柔比星-诱导的细胞凋亡取决于胱天蛋白酶活化。将细胞系Tanoue与50μM胱天蛋白酶抑制剂zVAD.fmk一起预温育1h(白色柱图)或不进行预处理(黑色柱图)，随后添加D,L-美沙酮(如所示的)与0.06μg/mL多柔比星的组合。在刺激后120h通过FSC/SSC-分析检测到细胞凋亡诱导。如图1B中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0327] (C)用D,L-美沙酮和多柔比星共处理下调XIAP和Bcl-xL。用单独D,L-美沙酮(如所示的)(-Doxo)、0.06μg/mL单独的多柔比星(+Doxo)或除多柔比星(+Doxo)之外还有D,L-美沙酮(如所示的)处理细胞系Tanoue。120h后，对XIAP和Bcl-xL进行蛋白质印迹分析。在58kDa检测到XIAP并且在～30kDa检测到Bcl-xL。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0328] 图4:多柔比星增强阿片样受体表达、而D,L-美沙酮促进多柔比星摄取并且抑制其流出
[0329] (A)多柔比星促进细胞表面上的阿片样受体表达。用0.06μg/mL多柔比星将BCP-ALL-细胞系Tanoue处理96h。在用纳洛酮-荧光素染色多柔比星-处理(+Doxo)和未处理的细胞(-Doxo)后，通过流式细胞计量术测定相对荧光强度。在扣除细胞自体荧光(-Doxo)和多柔比星荧光(+Doxo)后显示阿片样受体表达有X-倍的增加。
[0330] (B)D,L-美沙酮促进多柔比星摄取并且抑制其流出。用0.3μg/mL单独的多柔比星(Doxo)或多柔比星和10μg/mL D,L-美沙酮(Doxo+美沙酮)的组合将BCP-ALL-细胞系Tanoue预处理24h。在24h后，通过细胞中的多柔比星荧光、使用流式细胞计量术分析最大多柔比星细胞摄取(0h，最大摄取)。在洗涤多柔比星-处理的细胞后，保持细胞未处理(Doxo)或用10μg/mL D,L-美沙酮(Doxo+美沙酮)处理，并且温育不同时间点(8h，24h)。8h和24h后，通过细胞中的多柔比星荧光、使用流式细胞计量术分析多柔比星流出。数值为平均荧光强度+/-SE。
[0331] 图5:使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理疗诱导的细胞凋亡取决于通过cAMP下调的阿片样受体触发
[0332] (A)抑制阿片样受体触发抑制了由使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理介导的细胞凋亡诱导。将BCP-ALL-细胞系Tanoue与单独的60μg/mL纳洛酮(纳洛酮)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.06μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育。96h后，通过FSC/SSC-分析测定凋亡细胞百分比。
[0333] (B)抑制阿片样受体触发抑制了使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理介导的胱天蛋白酶活化。将BCP-ALL-细胞系Tanoue与单独的60μg/mL纳洛酮(纳洛酮)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.06μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育。96h温育后对胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和PARP进行蛋白质印迹分析。在～48kDa检测到胱天蛋白酶-2前体的下调。在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9的活性片段，在～19kDa和～17kDa检测到胱天蛋白酶-3的活性片段，且在～85kDa检测到PARP裂解。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0334] (C)通过抑制磷酸二酯酶活性增加cAMP水平抑制细胞死亡。将BCP-ALL-细胞系Tanoue与单独的200μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.06μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育96h。
[0335] (D)来自阿片样受体解偶联抑制性G-蛋白通过防止腺苷酸环化酶抑制来抑制细胞凋亡。将BCP-ALL-细胞系Tanoue与单独的20ng/mL百日咳毒素(PTX)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.06μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育。96h后，通过FSC/SSC-分析测定凋亡细胞百分比。通过FSC/SSC-分析测定凋亡细胞碎片。如图1B中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0336] 图6:D,L-美沙酮抑制白血病异种移植物生长并且增加多柔比星敏感性[0337] 将患者-来源的T-ALL的体内传代片段(ALL-SCID6，也参见图1)植入雄性NSG小鼠。用单独的D,L-美沙酮(n＝8,口服第1-76天,D,L-美沙酮)、单独的多柔比星(n＝8,i.v.第46、53、60、76天,多柔比星)或使用D,L-美沙酮和多柔比星组合治疗(n＝8,D,L-美沙酮+Doxo)治疗小鼠。D,L-美沙酮的使用剂量每周从20增加至120mg/kg/天，且多柔比星剂量为3mg/kg。作为对照组，用10％Tween 80的盐水溶液(n＝8,媒介物)i.v.治疗异种移植物小鼠。移植后76天，监测全部小鼠的肿瘤生长、体重和健康状况。*与媒介物相比具有显著性(p<0.05,Mann-Whitney U检验)。
[0338] 图7:阿片样受体信号转导
[0339] 用激动剂溶液如D,L-美沙酮刺激阿片样受体(OR)导致抑制性Gi-蛋白活化。αi-亚单位使腺苷酸环化酶(AC)失活，导致细胞内cAMP水平降低，由此导致可能由几种不
2+
同调节剂介导的细胞凋亡。此外，Gi-蛋白βγ-亚单位调节不同效应物活性，如抑制Ca -和+
K-通道活化。
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同调节剂介导的细胞凋亡。此外，Gi-蛋白βγ-亚单位调节不同效应物活性，如抑制Ca -和+
K-通道活化。
[0340] 图8:胶质母细胞瘤细胞上的阿片样受体表达
[0341] 用测定阿片样受体表达的纳洛酮荧光素染色胶质母细胞瘤细胞系U118MG和A172(OR,粗黑色曲线)并且通过流式细胞计量术分析。对照组(Co)显示为细黑色曲线。
[0342] 图9:D,L-美沙酮使胶质母细胞瘤细胞对多柔比星处理敏化
[0343] 将胶质母细胞瘤细胞A172与单独的3μg/mL D,L-美沙酮、单独的0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo)或3μg/mL D,L-美沙酮与0.1μg/mL多柔比星(Doxo+D,L-美沙酮)的组合一起温育。对照组代表未处理的胶质母细胞瘤细胞。144h后，取光学显微镜检查照片。A172与3μg/mL D,L-美沙酮和0.1μg/mL多柔比星共处理导致细胞与底部分离、膜起泡和细胞皱缩。
[0344] 图10:使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理诱导胶质母细胞瘤细胞中的细胞凋亡
[0345] 用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)(中间,白色柱图)、单独的多柔比星(0.1μg/mL Doxo,黑色柱图)或不同浓度的除多柔比星(0.1μg/mL Doxo,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)处理A172和U118MG胶质母细胞瘤细胞。120h和144h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。如下计算特异性细胞凋亡百分比：100×[实验死亡细胞(％)–培养基中自发死亡细胞(％)]/[100％-培养基中自发死亡细胞(％)]。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。
[0346] 图11:D,L-美沙酮使初级人胶质母细胞瘤细胞对多柔比星处理敏化
[0347] (A)用测定阿片样受体表达的纳洛酮荧光素染色初级人胶质母细胞瘤细胞(OR,粗黑色曲线)并且通过流式细胞计量术分析。对照组(Co)显示为细黑色曲线。(B)用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)(中间,白色柱图)、单独的0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo,黑色柱图)或除0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮(3、1μg/mL)处理初级人胶质母细胞瘤细胞。120h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。如图1c中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。
[0348] 图12:D,L-美沙酮使启动敏化胶质母细胞瘤的干细胞对多柔比星处理敏化[0349] (A)用测定阿片样受体表达的纳洛酮荧光素染色启动胶质母细胞瘤的干细胞(OR,粗黑色曲线)并且通过流式细胞计量术分析。对照组(Co)显示为细黑色曲线。(B)用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)(中间,白色柱图)、单独的0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo,黑色柱图)或除0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮(3、1μg/mL)处理启动胶质母细胞瘤的干细胞。144h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。如图1c中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。
[0350] 图13:使用D,L-美沙酮和多柔比星共处理的胶质母细胞瘤细胞的细胞死亡诱导取决于胱天蛋白酶活化
[0351] (A)D,L-美沙酮通过胶质母细胞瘤细胞中的多柔比星恢复缺陷性胱天蛋白酶活化。用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)、单独的0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo)或除多柔比星(0.1μg/mL Doxo)之外还有不同浓度的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)处理A172。144h后，对胱天蛋白酶-10、-2、-9、-3和PARP进行蛋白质印迹分析。在～58kDa检测到胱天蛋白酶-10前体的下调，并且在～48kDa检测到胱天蛋白酶-2前体的下调。在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9的活性片段，在～17kDa检测到胱天蛋白酶-3的活性片段，并且在～85kDa检测到PARP裂解。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。(B)用胱天蛋白酶广谱抑制剂zVAD.fmk抑制胱天蛋白酶活化阻断D,L-美沙酮和多柔比星在A172细胞中共处理诱导的的细胞凋亡。用不同浓度的D,L-美沙酮(10,3,1μg/mL)与0.1μg/mL多柔比星(+0.1μg/mL Doxo)的组合在没有(中间,黑色柱图)或有50μmol/L zVAD.fmk(白色柱图,50μmol/L zVAD.fmk)的存在下处理胶质母细胞瘤细胞A172。120h和144h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。如图1c中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。(C)使用D,L-美沙酮与多柔比星对胶质母细胞瘤细胞中XIAP和Bcl-xL的下调。用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)、0.1μg/mL单独的多柔比星(0.1μg/mL Doxo)或除多柔比星(0.1μg/mL Doxo)之外还有D,L-美沙酮(3,1μg/mL)将胶质母细胞瘤细胞A172处理144h。对XIAP和Bcl-xL进行蛋白质印迹分析。在58kDa检测到XIAP并且在30kDa检测到Bcl-xL。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0352] 图14:D,L-美沙酮通过启动胶质母细胞瘤的干细胞中的多柔比星逆转细胞凋亡途径的缺陷性活化
[0353] (A)用单独的D,L-美沙酮(3μg/mL)、单独的0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo)或除多柔比星(0.1μg/mL Doxo)之外还有D,L-美沙酮(3μg/mL)处理启动胶质母细胞瘤的干细胞。144h后，对胱天蛋白酶-10、-2、-9、-3和PARP进行蛋白质印迹分析。在～58kDa检测到胱天蛋白酶-10前体的下调并且在～48kDa检测到胱天蛋白酶-2前体的下调。在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9的活性片段，在～19kDa和～17kDa检测到胱天蛋白酶-3的活性片段，并且在～85kDa检测到PARP裂解。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。(B)用单独的D,L-美沙酮(3μg/mL)、单独的0.1μg/mL多柔比星(0.1μg/mL Doxo)或除多柔比星(0.1μg/mL Doxo)之外还有D,L-美沙酮(3μg/mL)将启动胶质母细胞瘤的干细胞处理144h。对XIAP、Bcl-xL和Bcl-xS进行蛋白质印迹分析。在58kDa检测到XIAP，在30kDa检测到Bcl-xL，并且在27kDa检测到Bcl-xS。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0354] 图15:D,L-美沙酮促进多柔比星摄取并且抑制其流出
[0355] (A)D,L-美沙酮促进多柔比星-在胶质母细胞瘤细胞系A172中蓄积。将A172与0.3μg/mL单独的多柔比星或与10μg/mL D,L-美沙酮的组合一起温育。4、8和24h温育后，使用流式细胞计量术测定多柔比星(Doxo)的荧光强度。在图中，显示了相对多柔比星-摄取量。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。(B)将A172与0.3μg/mL多柔比星一起温育4h。在将包含多柔比星的培养基洗涤掉后(0h)的不同时间点(4、8和24h)，使用流式细胞计量分析测定多柔比星的荧光强度。在图中，显示了相对多柔比星-含量。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。
[0356] 图16:1多柔比星增强细胞表面上的阿片样受体表达
[0357] (A)用0.1μg/mL多柔比星将胶质母细胞瘤细胞系A172处理106h。在用纳洛酮-荧光素(纳洛酮)染色多柔比星-处理的(多柔比星)和未处理的细胞后，通过流式细胞计量术测定相对荧光强度。(B)未处理的和多柔比星对照细胞、纳洛酮处理的细胞的表格概述，而D(纳洛酮-对照)表示扣除细胞自体荧光后的平均荧光强度(对照)。
[0358] 图17:D,L-美沙酮使白血病癌细胞(Nalm-6)、胰腺癌细胞(Colo357)和卵巢癌细胞(A2780)对依托泊苷或顺铂处理敏化
[0359] 用单独的不同浓度的D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)(中间，白色柱图)、0.03μg/mL依托泊苷或0.3μg/mL单独的顺铂或除0.03μg/mL依托泊苷(0.03μg/mL依托泊苷,黑色柱图)或0.3μg/mL顺铂(0.3μg/mL顺铂,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)处理Nalm6、Colo357和A2780细胞。120-144h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。如图1c中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。
[0360] 图18:D,L-美沙酮使慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞对氟达拉滨处理敏化[0361] 用单独的不同浓度的D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)(中间，白色柱图)、0.1μM氟达拉滨(0.1μM氟达拉滨,黑色柱图)或除0.1μM氟达拉滨(0.1μM氟达拉滨,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮(30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL)处理CLL细胞。72h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。如图1B中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。在3次独立实验中得到类似的结果。
[0362] 图19:顺铂增强HL60细胞中的阿片样受体表达
[0363] 顺铂增强前髓细胞性白血病细胞系HL60表面上的阿片样受体表达。用0.3μg/mL顺铂将HL60细胞系处理24h。在用纳洛酮-荧光素染色顺铂-处理的(+顺铂)和未处理的细胞(-顺铂)后，通过流式细胞计量术测定相对荧光强度。显示在扣除细胞自体荧光后阿片样受体表达有2.1-倍的增加。
[0364] 图20:Her2/neu-抗性乳癌细胞系JIMT-1表达高水平的μ-阿片样受体[0365] 来源于具有乳腺癌的临床表现出对赫赛汀抗性的62-岁患者的胸膜转移灶的人JIMT-1细胞系在其细胞表面上展示出阿片样受体。用测定阿片样受体表达的纳洛酮-荧光素染色JIMT-1细胞(OR,粗黑色曲线)，并且通过流式细胞计量术分析。对照组(Co)显示为细黑色曲线。
[0366] 图21:用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理的Her2/neu-抗性的乳癌细胞系JIMT-1的细胞周期分析和细胞凋亡
[0367] 用单独的1、3或10μg/mL美沙酮(1、3、10Met-Doxo)、0.015μg/mL多柔比星(Doxo)或0.015μg/mL多柔比星与1、3或10μg/mL美沙酮(1、3、10Met+Doxo)的组合处理人JIMT-1细胞系。(A)细胞的FACS分析揭示出两种物质的组合在处理后96小时时以剂量依赖性方式增加JIMT-1细胞的细胞凋亡。(B)在处理后96小时(图的左侧)和120小时(图的右侧)进行的FACS分析进一步显示因组合处理导致细胞凋亡水平增加。0或0,015μg/ml多柔比星(黑色棒形图)、1μg/mL美沙酮+0或0,015μg/ml多柔比星(白色棒形图)、3μg/mL美沙酮+0或0,015μg/ml多柔比星(阴影线棒形图)、10μg/mL美沙酮+0或0,015μg/ml多柔比星(圆点棒形图)。
[0368] 图22:使用D,L-美沙酮和多柔比星共处理的JIMT-1细胞的细胞死亡诱导取决于胱天蛋白酶活化
[0369] 用广谱胱天蛋白酶抑制剂zVAD.fmk抑制胱天蛋白酶活化阻断D,L-美沙酮和多柔比星在JIMT-1细胞中共处理诱导的细胞凋亡。用不同浓度的D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)与0.015μg/mL多柔比星(+0.015μg/mL Doxo)的组合在没有(左侧图)或有50μmol/L zVAD.fmk(右侧上的图)的存在下处理人细胞系JIMT-1。在添加所述药物组合后96小时(A)或120小时(B)时，使用流式细胞计量术分析细胞。
[0370] 图23:使用D,L-美沙酮和多柔比星共处理的JIMT-1细胞的细胞死亡诱导取决于胱天蛋白酶活化
[0371] (A)D,L-美沙酮恢复多柔比星在JIMT-1中导致的缺陷性胱天蛋白酶活化。用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10,3,1μg/mL)、0.015μg/mL单独的多柔比星或除0.015μg/ml多柔比星之外还有不同浓度的D,L-美沙酮(10,3,1μg/mL)处理A172。96h后，对胱天蛋白酶-8、-9、-3和PARP进行蛋白质印迹分析。在～43kDa检测到胱天蛋白酶-8的活性片段，在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9的活性片段，在～17kDa检测到胱天蛋白酶-3的活性片段，并且在～85kDa检测到PARP裂解。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。(B)通过使用D,L-美沙酮与多柔比星的组合下调JIMT-1细胞中的XIAP和Bcl-xL。用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)、0.015μg/mL单独的多柔比星或除多柔比星(0.015μg/mL Doxo)之外还有D,L-美沙酮(10、3、1μg/mL)，将乳癌细胞JIMT-1处理
96h。对XIAP和Bcl-xL进行蛋白质印迹分析。在57kDa检测到XIAP并且在21kDa检测到Bcl-xL。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
96h。对XIAP和Bcl-xL进行蛋白质印迹分析。在57kDa检测到XIAP并且在21kDa检测到Bcl-xL。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0372] 图24:用多柔比星和芬太尼的组合诱导T-细胞白血病CEM细胞中的细胞凋亡。
[0373] 用单独的30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL芬太尼(白色棒形图)或除0.02μg/mL多柔比星之外(黑色棒形图)还有上述的芬太尼处理人T-细胞白血病CEM细胞系(10000细胞/100μl)。48h和72h后，通过流式细胞计量术测定定量的细胞凋亡。
[0374] 图25:用多柔比星和丁丙诺啡的组合诱导人急性髓性白血病HL-60细胞中的细胞凋亡。
[0375] 用单独的20、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL丁丙诺啡(白色棒形图)或除0.003μg/mL多柔比星之外(黑色棒形图)还有上述丁丙诺啡处理人急性髓性白血病HL-60细胞(5000细胞/100μl)。144h或168h后，通过流式细胞计量术测定定量的细胞凋亡。
[0376] 图26:显示阿片样物质与抗癌药之间的相互的积极作用的示意图。
[0377] 一方面，阿片样物质促进抗癌药的细胞摄取并且抑制其流出。另一方面，抗癌药导致阿片样受体表达增加。因此，两种活性剂均可以将其细胞毒性潜力发挥至更高程度。
[0378] 图27:不同白血病的阿片样受体表达
[0379] 不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病和人B细胞白血病)在其细胞表面上表达不同中等数目的阿片样受体。用测定阿片样受体表达的纳洛酮-荧光素染色白血病细胞(OR,粗黑曲线)并且通过流式细胞计量术分析。无纳洛酮的对照组(Co)显示为细黑曲线。
[0380] 图28：阿片样物质受体激动剂和抗癌药D,L-美沙酮的组合疗法的作用强烈地增强不同白血病细胞的顺铂敏感性
[0381] 用不同浓度的D,L-美沙酮(如所示的)单独的(-CDDP,白色柱图)、单独的顺铂或除顺铂(+CDDP,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮处理不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病和人B细胞白血病)。温育后，通过FSC/SSC-分析测定凋亡细胞百分比。如图1B中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0382] 图29:D,L-美沙酮与顺铂的组合恢复白血病细胞中细胞凋亡途经的缺陷性活化[0383] D,L-美沙酮和顺铂共处理引起胱天蛋白酶活化，并且诱导XIAP下调和裂解以及Bax上调。用单独的D,L-美沙酮(如所示的)(-CDDP)、单独的顺铂(CDDP)或除顺铂(+CDDP)之外还有D,L-美沙酮(如所示的)处理不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病)。温育后，对胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3、PARP、XIAP和Bax进行蛋白质印迹分析。在～48kDa检测到胱天蛋白酶-2前体的下调。在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9的活性片段，在～19kDa和～17kDa检测到胱天蛋白酶-3的活性片段，在～116kDa检测到PARP，在～85kDa检测到PARP裂解，在～58kDa检测到XIAP和XIAP在_～30kDa裂解，且在～21kDa检测到Bax。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0384] 图30:D,L-美沙酮和顺铂-诱导的细胞凋亡取决于胱天蛋白酶活化
[0385] 将不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病)与50μM胱天蛋白酶抑制剂zVAD.fmk一起预温育1h(+zVAD.fmk,白色柱图)或不预处理(-zVAD.fmk,黑色柱图)，然后添加D,L-美沙酮(如所示的)与顺铂(如所示的)。在温育时间后通过FSC/SSC-分析检测细胞凋亡诱导。如图1B中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0386] 图31:顺铂增强阿片样受体表达
[0387] (A)顺铂增强用顺铂(如所示的)处理的不同白血病细胞(人T细胞白血病、人急性髓性白血病、人B细胞前体白血病)的细胞表面上的阿片样受体表达。用纳洛酮-荧光素染色顺铂-处理细胞(CDDP)和未处理细胞(Co)后，通过流式细胞计量术测定相对荧光强度。在扣除细胞自体荧光和顺铂荧光后显示与未处理的对照组相比阿片样受体表达有X-倍的增加。
[0388] 图32:使用D,L-美沙酮和多柔比星组合处理诱导的细胞凋亡取决于阿片样受体触发
[0389] 抑制阿片样受体触发抑制由D,L-美沙酮和多柔比星组合处理介导的细胞凋亡诱导。将胶质母细胞瘤细胞与单独的60μg/mL纳洛酮(纳洛酮)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.1μg/mL多柔比星(Doxo)或如标记+和-所示的不同组合一起温育。120h和144h后，通过FSC/SSC-分析测定凋亡细胞百分比。120h(图的左侧)和144h(图的右侧)后涉及单一棒形图下的指定物质所示的不同处理结果如图32中所示。
[0390] 图33:不同阿片样物质有效性的不同期限诱导胶质母细胞瘤细胞中不同的细胞死亡率
[0391] A)用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(如所示的)(-Doxo,白色柱图，极低且在黑色棒形图的左侧)、单独的多柔比星或除多柔比星(+Doxo,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮(如所示的)处理胶质母细胞瘤细胞，其中对于所有处理使用相同浓度的0,1μg/mL多柔比星和所示的不同浓度的D,L-美沙酮。刺激后144h，通过亚二倍体DNA分析测定细胞死亡和凋亡细胞百分比。
[0392] B)用不同浓度的单独的吗啡(如所示的)(-Doxo,白色柱图，极低且在黑色棒形图的左侧)、单独的多柔比星或除多柔比星(+Doxo,黑色柱图)之外还有吗啡(如所示的)处理胶质母细胞瘤细胞，其中对于所有处理使用相同浓度的0,1μg/mL多柔比星和所示的不同浓度的D,L-美沙酮。刺激后144h，通过亚二倍体DNA分析测定细胞死亡和凋亡细胞百分比。
[0393] 如图1B中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0394] 图34：不同阿片样物质有效性的不同期限诱导白血病细胞中不同的细胞死亡率[0395] A)用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(如所示的)(-Doxo,白色柱图，极低且在黑色棒形图的左侧)、单独的多柔比星或除多柔比星(+Doxo,黑色柱图)之外还有D,L-美沙酮(如所示的)处理白血病细胞(人B细胞白血病)，其中对于所有处理使用相同浓度的0,1μg/mL多柔比星和所示的不同浓度的D,L-美沙酮。刺激后96h，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。
[0396] B)用不同浓度的单独的吗啡(如所示的)(-Doxo,白色柱图，在黑色棒形图的左侧)、单独的多柔比星或除多柔比星(+Doxo,黑色柱图)之外还有吗啡(如所示的)处理白血病细胞(人B细胞白血病)，其中对于所有处理使用相同浓度的0,1μg/mL多柔比星和所示的不同浓度的D,L-美沙酮。刺激后96h，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。
[0397] 如图1B中所述计算特异性细胞凋亡百分比。柱图，一式三份的平均值；棒形图，SD<10％。
[0398] 图35:使用D,L-美沙酮和多柔比星的组合处理抑制胶质母细胞瘤细胞中的增殖并且诱导S/G2–M细胞周期停滞
[0399] 显示了用美沙酮和多柔比星处理的胶质母细胞瘤细胞的流式细胞计量分析。未处理的细胞(未处理的细胞)(G1峰高于G2峰)、用1μg/ml美沙酮(美沙酮)处理的细胞(G1峰高于G2峰)和除0,1μg/ml多柔比星之外还有美沙酮(美沙酮+Doxo)处理的细胞的流式细胞计量分析。在96h后，除多柔比星之外还有美沙酮处理的胶质母细胞瘤细胞中显示G2/M期时的细胞周期进展停滞(G1峰低于未处理的细胞且G2峰高于未处理的细胞)(A)。G1前的亚G1峰是片段化的DNA(细胞死亡百分比)。结果是3次独立实验的代表。
[0400] 图36:细胞凋亡诱导和胱天蛋白酶活化取决于诱导胶质母细胞瘤中cAMP下调的阿片样受体活化
[0401] CAMP的阿片样受体活化触发下调在使胶质母细胞瘤细胞对多柔比星处理敏化中起关键作用。(A,B)阻断阿片样受体活化抑制细胞凋亡诱导。将胶质母细胞瘤细胞系A172与单独的100μg/mL纳洛酮(纳洛酮)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.3μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育。(A)120h和(B)144h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。(C)抑制阿片样受体-活化抑制胱天蛋白酶活化。将A172细胞与单独的100μg/mL纳洛酮(纳洛酮)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.3μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育。120h温育后对胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和PARP进行蛋白质印迹分析。在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9的活性片段，在～19kDa和～17kDa检测到胱天蛋白酶-3的活性片段，且在～85kDa检测到PARP裂解。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。(D)通过抑制磷酸二酯酶活性增加cAMP水平抑制细胞凋亡。将A172细胞与单独的25μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、3μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.3μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育
120h。120h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。
120h。120h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。
[0402] 图37:D,L-美沙酮抑制胶质母细胞瘤的肿瘤生长.将胶质母细胞瘤细胞系U87MG(U87)植入裸鼠。每日用D,L-美沙酮(n＝8,黑色正方形)或媒介物10％Tween 80的盐水溶液(n＝8,黑色菱形)治疗小鼠。移植后，观察小鼠33天。在不同时间点(如所示的)，测定肿瘤生长和肿瘤体积。*与对照组相比具有显著性(p<0.05,Mann-Whitney U检验)。
[0403] 图38:D,L-美沙酮使卵巢癌细胞对短期顺铂处理敏化
[0404] 用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(3、1、0μg/mL)、5或3μg/mL单独的顺铂或D,L-美沙酮或5μg/mL顺铂(+5μg/ml CDDP,黑色柱图)或3μg/mL顺铂(+3μg/mL,白色柱图)的组合处理A2780卵巢癌细胞。24h、48h和72h后，测定细胞死亡/细胞凋亡百分比。
[0405] 图39:D,L-美沙酮使卵巢癌细胞对长期顺铂处理敏化
[0406] 用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)、单独的顺铂(2、1、0.5、0.3μg/mL)或D,L-美沙酮和5μg/mL顺铂的组合处理A2780卵巢癌细胞。72h、96h、120h和144h后，测定细胞死亡/细胞凋亡百分比。
[0407] 图40：D,L-美沙酮使顺铂-抗性卵巢癌细胞对顺铂处理敏化
[0408] 用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)、单独的顺铂(3、2、1μg/mL)或D,L-美沙酮和顺铂的组合处理A2780cis卵巢癌细胞。72h、96h、120h和144h后，测定细胞死亡/细胞凋亡百分比。
[0409] 图41:D,L-美沙酮强烈地使卵巢癌细胞对顺铂处理敏化
[0410] 用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)、2μg/mL单独的顺铂(黑色柱图)和0.5或0.2μg/mL顺铂(分别为阴影线和灰色柱图)与D,L-美沙酮的组合处理A2780卵巢癌细胞。144h，测定细胞死亡/细胞凋亡百分比。
[0411] 图42:使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化使卵巢癌细胞对顺铂-诱导的胱天蛋白酶活化敏化
[0412] D,L-美沙酮通过顺铂恢复卵巢癌细胞中缺陷性胱天蛋白酶活化。用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL,-CDDP)、5或3μg/mL单独的顺铂或除5或3μg/mL顺铂(+CDDP)之外还有D,L-美沙酮(3,1μg/mL)处理A2780卵巢癌细胞。24h后，进行蛋白质印迹分析。在～37kDa检测到胱天蛋白酶-9活性片段。在～19和17kDa检测到胱天蛋白酶-3活性片段，在～43和41kDa检测到胱天蛋白酶-8活性片段，并且在～85kDa检测到PARP裂解。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0413] 图43:使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化在使乳腺癌细胞对多柔比星处理敏化中起关键作用
[0414] 使用阿片样物质拮抗剂纳洛酮阻断阿片样受体活化强烈地抑制由D,L-美沙酮和多柔比星组合处理诱导的细胞凋亡。将乳腺癌细胞JIMT-1与单独的100μg/mL纳洛酮(纳洛酮)、10μg/mL D,L-美沙酮(D,L-美沙酮)和0.01μg/mL多柔比星(Doxo)或如所示的不同组合一起温育。96h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0415] 图44:D,L-美沙酮使前列腺癌细胞对顺铂处理敏化
[0416] 用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)、5或3μg/mL单独的顺铂或D,L-美沙酮和5μg/mL顺铂(+5μg/ml CDDP,黑色柱图)或3μg/mL顺铂(+3μg/mL,白色柱图)的组合处理前列腺癌细胞PC-3。96h和120h后，通过亚二倍体DNA分析测定凋亡细胞百分比。
[0417] 图45:D,L-美沙酮使白血病细胞对用不同抗癌药处理敏化
[0418] 用单独的D,L-美沙酮(3μg/mL)、如所示的单独的不同抗癌药(白色柱图)或D,L-美沙酮和不同抗癌药的组合(黑色柱图)处理白血病细胞Nalm6。96h后，测定细胞死亡/细胞凋亡百分比。
[0419] 图46:D,L-美沙酮使胶质母细胞瘤细胞对用来自同一抗-癌药种类的不同抗癌药处理敏化
[0420] 用单独的D,L-美沙酮(3μg/mL)、如所示的单独的不同抗癌药(白色柱图)或D,L-美沙酮和不同抗癌药的组合(黑色柱图)处理胶质母细胞瘤细胞A172。120h后，测定细胞死亡/细胞凋亡百分比。
[0421] 图47胰腺癌细胞上的阿片样受体表达
[0422] 通过流式细胞计量术用测定阿片样受体表达的纳洛酮荧光素染色胰腺癌细胞Colo357(OR,粗黑曲线)。对照组(Co)显示为细黑曲线。发现在胰腺癌表面上阿片样受体强烈表达。
[0423] 图48:阿片样物质例如D,L-美沙酮增加胰腺癌细胞中抗-癌药-诱导的细胞死亡
[0424] 用单独的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)、如所示的单独的奥沙利铂或顺铂或D,L-美沙酮和(A)奥沙利铂或(B)顺铂的组合处理胰腺癌细胞Colo 357。120h(A)和144(B)后，测定细胞死亡/细胞凋亡百分比。
[0425] 图49:使用D,L-美沙酮的阿片样受体活化使胰腺癌细胞对顺铂-和奥沙利铂-诱导的胱天蛋白酶活化敏感
[0426] D,L-美沙酮通过(A)奥沙利铂或(B)顺铂恢复在胰腺癌细胞中缺陷性胱天蛋白酶活化。用不同浓度的单独的D,L-美沙酮(3、1μg/mL)、(A)单独的奥沙利铂(2、3μg/mL)或(B)单独的顺铂(0.5或0.7μg/mL)或(A)除2或3μg/mL奥沙利铂之外还有D,L-美沙酮(3、1μg/mL)或(B)除0.5或0.7μg/mL顺铂之外还有D,L-美沙酮(3、1μg/mL)处理胰腺癌细胞Colo 357。120h后，进行蛋白质印迹分析。在～46kDa检测到胱天蛋白酶-9活性片段。在～19和17kDa检测到胱天蛋白酶-3活性片段，并且在～85kDa检测到PARP裂解。在～57kDa检测到胱天蛋白酶XIAP的抑制蛋白。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等蛋白加载。
[0427] 图50:胱天蛋白酶活化抑制阻断阿片样物质敏化的奥沙利铂-或顺铂-诱导的细胞凋亡的胰腺癌细胞
[0428] 用不同浓度的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)与(A)3μg/mL奥沙利铂、(B)2μg/mL奥沙利铂、(C)0.7μg/mL顺铂或(D)0.5μg/mL顺铂的组合在没有(-zVAD.fmk,黑色柱图)或添加50μmol/L zVAD.fmk(+zVAD,白色柱图)的存在下处理胰腺癌细胞Colo 357。120h和144h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0429] 图51:使用D,L-美沙酮的阿片样物质使胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺处理敏化[0430] 用不同浓度的单独的D,L-美沙酮3、1、0μg/mL)、单独的替莫唑胺或D,L-美沙酮和替莫唑胺的组合(黑色柱图)处理胶质母细胞瘤细胞A172。120h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0431] 图52:使用D,L-美沙酮的阿片样物质强烈地使胰腺癌细胞对奥沙利铂和顺铂处理敏化
[0432] (A)用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)、10μg/mL奥沙利铂(黑色柱图)、3,2μg/ml单独的奥沙利铂和3μg/mL奥沙利铂与D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图)或2μg/mL奥沙利铂与D,L-美沙酮的组合(白色柱图)处理胰腺癌细胞(Colo 357)。120h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0433] (B)用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1,0μg/mL)、10μg/mL顺铂(黑色柱图)、0.7或0.5μg/ml单独的顺铂和0.7μg/mL顺铂与D,L-美沙酮组合(阴影线柱图)或0.5μg/mL顺铂与D,L-美沙酮的组合(白色柱图)处理胰腺癌细胞(Colo357)。144h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0434] 图53:使用D,L-美沙酮的阿片样物质强烈地使白血病细胞对多柔比星处理敏化[0435] (A)用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1,0μg/mL)、0.1μg/ml单独的多柔比星(黑色柱图)、0.01μg/ml单独的多柔比星或0.01μg/mL多柔比星和D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图)处理白血病细胞(Nalm6)。120h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0436] (B)用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1,0μg/mL)、0.1μg/ml单独的多柔比星(黑色柱图)、0.01μg/ml单独的多柔比星或0.01μg/mL多柔比星和D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图)处理白血病细胞(Reh)。120h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0437] (C)用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1,0μg/mL)、0.1μg/ml单独的多柔比星(黑色柱图)、0.01μg/ml单独的多柔比星或0.01μg/mL多柔比星和D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图)处理白血病细胞(Tanoue)。120h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0438] 图54:使用D,L-美沙酮的阿片样物质强烈地使乳腺癌细胞对多柔比星处理敏化[0439] (A)用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)、0.1μg/ml单独的多柔比星(黑色柱图)或0.015μg/ml单独的多柔比星和0.015μg/mL多柔比星与D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图)处理对HER2-靶向疗法具有抗性的乳腺癌细胞(JIMT-1)。120h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0440] 图55：使用D,L-美沙酮的阿片样物质强烈地使胶质母细胞瘤细胞对多柔比星处理敏化
[0441] 用如所示的不同浓度的单独的D,L-美沙酮(10、3、1、0μg/mL)、1μg/ml单独的多柔比星(黑色柱图)、0.1μg/ml单独的多柔比星或0.1μg/mL多柔比星和D,L-美沙酮的组合(阴影线柱图)处理胶质母细胞瘤细胞(A172)。144h后，测定细胞死亡/凋亡细胞百分比。
[0442] 图56:吗啡和芬太尼的组合处理显示在白血病细胞中诱导细胞死亡的强烈协同作用
[0443] 用单独的芬太尼(3,1μg/mL)(A)或单独的吗啡(3、1μg/mL)(A)或日所示浓度的芬太尼和吗啡的组合(B)处理HL60白血病细胞。96h、120h和144h后，测定特异性细胞死亡/凋亡细胞百分比。
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