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用于肝特异性诊断的疏水性修饰肽

阅读：952发布：2020-08-07

专利汇可以提供用于肝特异性诊断的疏水性修饰肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于在体外以及体内将标记物特异性递送至肝、优选肝细胞的疏水性修饰肽。本发明涉及包含一种或更多种所述疏水性修饰肽和待特异性递送至肝的一种或更多种标记物的药物组合物。本发明还涉及本发明的疏水性修饰肽的诊断用途以及诊断肝疾病或病症的方法。，下面是用于肝特异性诊断的疏水性修饰肽专利的具体信息内容。

权利要求

1.式X-P-Y-Ro的疏水性修饰肽，
其中
P为由氨基酸序列NPLGFFP组成的肽；
X为由(K)1-3NLSTS组成的氨基酸序列，其中X与肽P的N端直接连接，并且其中所述赖氨
酸残基中的一个或更多个携带一个或更多个酰化；
Y为由氨基酸序列DHQLDP组成的肽；
Ro为酰胺并且o为0或1，
其中一种或更多种标记物与X的一个或更多个赖氨酸相偶联，并且其中所述标记物选
自
(i)荧光染料，其中所述荧光染料选自下述类别的荧光染料：呫吨、吖啶、嗪、花菁、苯
乙烯基染料、香豆素类、卟吩、金属-配体复合物、荧光蛋白、纳米晶体、二萘嵌苯和酞花菁以
及这些类别的染料的缀合物和组合
(ii)荧光发射同位素
(iii)放射性同位素和
(iv)造影剂。
2.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中所述一种或更多种标记物通过接头或间
隔子与所述肽相连接。
3.根据权利要求2所述的疏水性修饰肽，其中所述接头或间隔子被肝蛋白质从所述疏
水性修饰肽上切下。
4.根据权利要求3所述的疏水性修饰肽，其中所述接头或间隔子被选自以下的酶切割：
细胞色素P450，内吞途径的蛋白酶和裂合酶，基质金属蛋白酶MMP1、MMP2、MMP7、MMP9和
MMP12。
5.根据权利要求4所述的疏水性修饰肽，其中所述接头或间隔子包含肽序列GCHAK或
RPLALWRS。
6.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中通过使用活化酯将所述一种或更多种标
记物与X中一个或更多个赖氨酸相偶联。
7.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中通过使用选自以下的一种或更多种方法
将标记物与X的所述赖氨酸相偶联：
-通过胺与活化羧酸的反应形成酰胺；
-使用酰亚胺酯和胺形成脒；
-使用羰基和酰肼的酰肼连接；
-在还原条件下使用羰基和胺的胺连接；
-使用腈和叠氮化物形成三唑；
-使用异硫氰酸酯和胺形成硫脲；
-通过醇与活化羧酸的反应形成酯；
-通过醇与烷基卤化物的反应形成醚。
8.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中所述疏水性修饰通过酰化实现，其选自用
肉豆蔻酰基(C14)、棕榈酰基(C16)或硬脂酰(C18)酰化。
9.根据权利要求8所述的疏水性修饰肽，其中所述疏水性修饰为通过用肉豆蔻酰基
(C14)酰化。
10.根据权利要求8所述的疏水性修饰肽，其中所述疏水性修饰为通过用硬脂酰基
(C18)酰化。
11.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中所述标记物包含与二价或三价金属阳离
子形成复合物的螯合剂。
12.根据权利要求11所述的疏水性修饰肽，其中所述螯合剂选自1，4，7，10-四氮杂环十
二烷-N，N′，N，N′-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)、三亚乙基四胺(TETA)、亚氨基二乙酸、二亚乙基三胺-N，N，N′，N′，N″-五乙酸
(DTPA)和6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)。
13.根据权利要求12所述的疏水性修饰肽，其中所述螯合剂为1，4，7，10-四氮杂环十二
烷-N，N′，N，N′-四乙酸(DOTA)。
14.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中所述造影剂包含顺磁性剂。
15.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中所述标记物选自Gd、Eu、W和Mn。
16.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其中所述放射性同位素/荧光发射同位素选
自α放射性发射同位素、γ放射性发射同位素、俄歇电子发射同位素、X射线发射同位素、荧
18 51 67 68 111 99m 140 175 153 166 88 90 149
光发射同位素，其选自 F、Cr、Ga、Ga、 In、 Tc、 La、 Yb、 Sm、 Ho、Y、Y、 Pm
、177Lu、47Sc、142Pr、159Gd、212Bi、72As、728e、97Ru、109Pd、105Rh、101m15Rh、119Sb、128Ba、123I、124I、131I、197Hg、211At、169Eu、203Pb、212Pb、64Cu、67Cu、188Re、186Re、198Au和199Ag。
17.根据权利要求1所述的疏水性修饰肽，其选自：
硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP，
硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP，
硬脂酰-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP，
硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺，
硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺，
硬脂酰-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺。
18.药物组合物，包含
至少一种根据权利要求1至17中任一项的疏水性修饰肽；以及任选的可药用载体和/或
赋形剂。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的疏水性修饰肽，其用于标记物向肝的特异性递
送。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的疏水性修饰肽，其用于选自以下的医学成像：X
射线、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层造影(PET)、单光子发射计算机断层造影(SPECT)、
X射线计算机断层造影(CT)和这些方法的组合。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的疏水性修饰肽，其用于术中可视化。
22.根据权利要求1至17中任一项所述的疏水性修饰肽，其用于诊断肝疾病或病症或者
监测其治疗。
23.根据权利要求22所述的疏水性修饰肽，其中所述肝疾病或病症选自肝炎、肝硬化、
血色病。
24.根据权利要求22所述的疏水性修饰肽，其中所述肝疾病或病症为涉及病毒性或非
病毒性病原体的肝病期的疾病。
25.根据权利要求22所述的疏水性修饰肽，其中所述肝疾病或病症为热带病、疟疾、血
吸虫病、利什曼病。
26.根据权利要求22所述的疏水性修饰肽，其中所述肝疾病或病症为肝肿瘤。
27.根据权利要求22所述的疏水性修饰肽，其中所述肝疾病或病症为肝转移。
28.根据权利要求22所述的疏水性修饰肽，其中所述肝疾病或病症为代谢疾病。
29.根据权利要求19至22中任一项所述的疏水性修饰肽，其中以10pmol/kg至20μmol/
kg体重的剂量向患者施用所述疏水性修饰肽。
30.根据权利要求29所述的疏水性修饰肽，其中以100nmol至2μmol的剂量向患者施用
所述疏水性修饰肽。
31.根据权利要求30所述的疏水性修饰肽，其中对于在MRI中使用，以300nmol至
800nmol/kg体重向患者施用。
32.根据权利要求19至22中任一项所述的疏水性修饰肽，其中施用途径选自皮下、静脉
内、经口、经鼻、肌肉内、经皮、通过栓剂。
33.根据权利要求19至22中任一项所述的疏水性修饰肽，其中施用途径为吸入。
34.根据权利要求1至17和19至33中任一项所述的疏水性修饰肽在制备用于诊断肝疾
病或病症和/或监测其治疗的药物中的用途。
35.根据权利要求18所述的药物组合物，其用于标记物向肝的特异性递送。
36.根据权利要求18或35的药物组合物，其用于选自以下的医学成像：X射线、磁共振成
像(MRI)、正电子发射断层造影(PET)、单光子发射计算机断层造影(SPECT)、X射线计算机断
层造影(CT)和这些方法的组合。
37.根据权利要求18和35至36中任一项所述的药物组合物，其用于术中可视化。
38.根据权利要求18和35至37中任一项所述的药物组合物，其用于诊断肝疾病或病症
或者监测其治疗。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症选自肝炎、肝硬化、血
色病。
40.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症为涉及病毒性或非病
毒性病原体的肝病期的疾病。
41.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症为热带病、疟疾、血吸
虫病、利什曼病。
42.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症为肝肿瘤。
43.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症为肝转移。
44.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肝疾病或病症为代谢疾病。
45.根据权利要求18和35至38中任一项所述的药物组合物，其中以10pmol/kg至20μ
mol/kg体重的剂量向患者施用所述疏水性修饰肽。
46.根据权利要求18和35至45中任一项所述的药物组合物在制备用于诊断肝疾病或病
症和/或监测其治疗的药物中的用途。

说明书全文

用于肝特异性诊断的疏水性修饰肽

[0001] 本发明涉及来源于乙型肝炎病毒(HBV)之preS结构域的疏水性修饰肽，其为用于在体外以及体内将标记化合物(诊断剂，下文中为“标记物(label)”)特异性递送至肝、优选
肝细胞的通用载剂。可将任何类型的标记物特异性地靶向肝，从而在肝中被富集。这种肝靶
向还可用于靶向诊断肝疾病或病症，例如肝炎、疟疾、肝细胞癌(HCC)以及HAV、HBV、HCV和/
或HDV感染。本发明涉及包含一种或更多种所述疏水性修饰肽和待特异性递送至肝的一种
或更多种标记物的药物组合物。本发明还涉及本发明的疏水性修饰肽或包含一种或更多种
所述疏水性修饰肽的药物组合物在诊断肝疾病或病症和/或监测其治疗中的用途；以及本
发明的疏水性修饰肽在制备用于诊断肝疾病或病症和/或监测其治疗的药物中的用途；以
及诊断肝疾病或病症或者监测肝疾病或病症之治疗的方法。

背景技术

[0002] 肝(脊椎动物和其他动物中存在的器官)在新陈代谢中具有重要作用并且在体内具有许多功能，包括糖原贮存、红细胞分解、血浆蛋白质合成和解毒。肝也是人体中最大的
腺体。它位于腹的胸区中的隔膜下方。肝产生胆汁，其为通过乳化脂质来帮助消化的碱性化
合物。肝还进行和调节需要专门化组织的多种大体积生物化学反应。

[0003] 肝细胞构成70至80％的肝的胞质团(cytoplasmic mass)。肝细胞参与蛋白质合成，蛋白质贮存以及碳水化合物转化，胆固醇、胆汁盐和磷脂的合成，还有外源和内源物质
的解毒、修饰和排泄。肝细胞还起始胆汁的形成和分泌。

[0004] 有多种已知的肝疾病，例如：

[0005] -肝炎：肝的炎症，主要由多种病毒引起，但也由某些毒物、自身免疫或遗传状况引起；

[0006] -肝硬化：肝中形成纤维组织，替换死亡的肝细胞。肝细胞的死亡例如可由病毒性肝炎、酒精中毒或接触其他肝毒性化学物质所导致；

[0007] -血色病(Haemochromatosis)：导致体内铁积累并最终导致肝损伤的遗传性疾病；

[0008] -肝的癌症：原发性肝细胞癌(HCC)或胆管癌(cholangiocarcinoma)和转移癌(一般来自胃肠道的其他部分)；

[0009] -威尔逊氏病(Wilson′s disease)：导致身体保留铜的遗传性疾病；

[0010] -原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)：胆管的炎性疾病，性质上是自身免疫的；

[0011] -原发性胆汁性肝硬化：小胆管的自身免疫病；

[0012] -Budd-Chiari综合征：肝静脉阻塞；

[0013] -Gilbert综合征：胆红素代谢的遗传病症，发现于约5％的人群中；

[0014] -糖原贮积病II型：糖原的积累导致整个身体的进行性肌肉无力(肌病)并且影响多种身体组织，尤其是心脏、骨骼肌、肝和神经系统。

[0015] 还有许多儿科肝疾病，例如胆管闭锁、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、alagille综合征和进行性家族性肝内胆汁淤积症；以及代谢疾病。

[0016] 另外，数种病原体和寄生虫(尤其是热带病的病原体和寄生虫)在其生命周期中具有肝期(liver stage)。例如，疟疾是一种最常见的感染性疾病并且是巨大的公众健康问
题。疟疾由疟原虫属(Plasmodium)的原生动物寄生虫导致。该疾病的最严重形式由恶性疟
原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)所导致，而其他的相关
物种(卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和有时诺氏疟
原虫(Plasmodium knowlesi))也可感染人。

[0017] 另一个实例是乙型肝炎病毒(HBV)，其为乙型肝炎的病因。HBV是哺乳动物和禽类的小包膜DNA病毒家族的原型(11)。HBV包膜包裹三种蛋白质，称为L-(大)、M-(中)和S-(小)
(参见图1)。它们共有具有四个跨膜区的C端S结构域。M-蛋白和L-蛋白携带55个和依赖于基
因型的107或118个aa的额外N端延伸(preS2和preS1)。在病毒体中，L、M和S的化学计量比为
约1∶1∶4，而更大量分泌的非感染性亚病毒颗粒(SVP)几乎仅包含S-蛋白和仅痕量的L蛋白
(2)。在合成期间，L的preS1结构域被肉豆蔻基化并且在HBV生命周期的某时间通过ER衍生
的膜发生移位。该修饰对于感染性是必要的(13，14)。HBV的明显特性是其肝趋向性，即，肝
是特异性支持HBV生长的组织。

[0018] 慢性HBV和HCV(丙型肝炎病毒)感染也是肝中恶性改变的主要原因。一般在慢性肝病(尤其是病毒性肝炎)的情况下发展成原发性肝细胞癌(HCC)。HCC的诊断可以是困难的，
一般需要使用血清标志物和成像设备以及活检后的组织学确证。

[0019] HCC每年在全球范围导致约一百万人死亡，确诊后的中位生存期为约6至20个月(11)。其中一个原因是缺乏致病症状和肝的大的功能储备(functional reserve)(12)。结
果，诊断为肝细胞癌的大部分患者不适于进行手术切除而需要其他治疗形式，例如肝移植、
射频消融、经动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization)、冷冻消融或放射治
疗。所有这些可替换选择都因在诊断时通常有大肿瘤尺寸而功效有限。(13)因此，FDA(联邦
药品管理局)推荐在发生血清甲胎蛋白水平升高的具有引发性(underlying)肝疾病(即肝
硬化、病毒性肝炎)的患者中进行加强(intense)诊断成像。(12)一般通过肝的CT扫描和/或
 磁共振成像(MRI)进行诊断成像。然而，即使使用高分辨率成像方法，初始诊断也常常很困
难，因此在所有患者的大部分中推荐“追查(follow up)”成像。(14)新型肝特异性造影剂
(contrast agent)(例如本发明描述的造影剂)可帮助解决该问题。

[0020] 肝中恶性改变的另一个来源是其他器官原发性肿瘤的转移性扩散，最显著的是结直肠癌(CRC)的转移性扩散。CRC是全世界癌症相关死亡的第三个最常见的病因。每年约125
万的患者发生结直肠癌；每年有超过600,000的患者死亡。(来源：GLOBOCAN2008，
globocan.iarc.fr)。尽管目前CRC的发病机制已大部分清楚，并且FDA推荐对50岁以上的所
有人进行定期体检，但是发病率从1997至2008年仅略微降低。(15，16)。

[0021] 在初始诊断之后，所有患者中约80％确实显示没有任何可检测的转移，对于这些患者，手术切除是最好的治疗选择。尽管进行了切除，但是诊断为TMN II/III期的所有患者
中超过40％发生肝转移(17～21)。已表明，初始切除后的加强(intensive)高分辨率成像可
显著延长分类为TMN II/III的患者的生存期。与常规护理相比，肝中小转移的早期诊断可
在部分肝切除后将5年存活时间增加40％。然而，由于肝的无定形结构，早期诊断常常是不
可能的(22)。造影剂(例如本文中描述的造影剂)可帮助诊断早期的肝转移，允许手术干预
并借此帮助提高无病生存期。

[0022] 理想地，药物靶向应满足以下标准：1)药物(例如标记物)仅向需要的作用位点转移；2)对其余组织的影响尽可能最小；3)使用药理上无活性的载体。

[0023] 为了将标记物携带至特定组织，研究了不同的方案。例如使用前药，在靶组织中通过组织特异性酶从前药中释放药理活性部分。另一个可能是将有效的非组织特异性药物与
组织特异性但药理惰性的载体系统(例如受体亲和肽或胶体颗粒)相偶联。

[0024] 多种药物载体已被用于提高药物的肝靶向。直接的方法通过在特定载体(例如脂质体和微球)中递送药物来基于肝网状内皮系统的主动吞噬。例如，已经显示i.v.(静脉内)
注射后，整合了药物的微粒载体主要被肝的网状内皮系统捕获，导致药物靶向肝(5)。另一
方面，具有正电荷、水溶性聚合物的药物的肝靶向基于大部分水溶性物质从肝血管系统中
自由渗出以及肝细胞表面的负电荷(6)。因此，基于肝的这种解剖学和生物化学特征，聚合
物已被用作使得药物靶向肝的载体。通过使用肝细胞的去唾液酸糖蛋白受体尝试了肝的更
特异药物靶向。去唾液酸糖蛋白受体(半乳糖受体)以高密度存在于肝细胞上。另外，一旦配
体与半乳糖受体相结合，配体-受体复合物就被内化，这允许细胞摄取半乳糖基化的配体
(7)。另外，通过例如两性聚合物和病毒载体进行了使用纳米颗粒的递送方法(8)。还通过使
用生物纳米胶囊(bio-nanocapsule，BNC)进行了药物和遗传物质的递送。BNC被描述为“由
通过生物技术产生之蛋白质组成的纳米级胶囊”并且可用作器官特异性药物递送的递送系
统(9)。

[0025] US7,001,760B2公开了来源于乙型肝炎病毒(HBV)的重组载体，其可用于基因治疗，例如递送治疗基因至肝细胞并且在肝细胞中表达异源性基因。

[0026] WO2009/092612(其内容通过引用以其全部并入本文)描述了HBV的疏水性修饰preS衍生肽以及其作为载剂在化合物向肝的特异性递送中的用途。在该文献中，HBV的疏水
性修饰preS衍生肽可通过任选的锚定基团(A)与诊断或治疗活性剂相偶联，其优选为疏水
性修饰preS衍生肽的“C端”。

[0027] 本发明提供了与一种或更多种标记物缀合的疏水性修饰肽，其中该标记物与由X表示的肽的N端氨基酸序列相偶联，使其可产生较短的肽并仍保持肝特异性。出乎意料地，
可使疏水性部分与没有消除肝趋向性的肽相偶联。另外，标记物与N端位点的偶联使得活性
化合物穿过细胞膜更好地递送并且还使得在细胞膜上有活性的标记物直接靶向到作用位
点。在图3中，图示说明了疏水性修饰肽与肝细胞表面相结合的分子机制。

发明内容

[0028] 根据本发明，通过提供疏水性修饰肽解决了该目的。在图2中，图示说明了本发明的疏水性修饰肽的构造。所述疏水性修饰肽具有通式：[X-P-Y-Ro]Ap，其中P为具有氨基酸序
列NPLGFXaaP(单字母代码；其中Xaa为任意氨基酸，优选F或L，更优选F)的肽。X为具有m个氨
基酸的长度的氨基酸序列，其中X的一个或更多个氨基酸携带一个或更多个基团用于疏水
性修饰以及添加疏水性部分，所述疏水性修饰选自酰化，优选用羧酸，饱和和不饱和脂肪
酸，C8至C22 脂肪酸、具有亲脂性侧链的氨基酸，所述疏水性部分选自胆固醇、胆固醇衍生
物、磷脂、糖脂、甘油酯、类固醇、神经酰胺、异戊二烯衍生物、金刚烷、法呢醇、脂肪族基团、聚芳族化合物，并且m至少为4(m为≥4)。在一个优选的实施方案中，通过用酰基部分酰化进
行疏水性修饰，所述酰基部分优选选自肉豆蔻酰基(C14)、棕榈酰基(C16)或硬脂酰(C18)，
更优选用肉豆蔻酰基(C14)酰化或用硬脂酰基(C18)酰化。Y为具有n个氨基酸(n为0或至少
1)的长度的氨基酸序列。在上述通式中，m+n至少为11，即本发明的疏水性修饰肽总计具有
至少18个氨基酸(aa)的长度。R为所述疏水性修饰肽的C端修饰，其优选为保护免受降解的
部分，其选自酰胺、D-氨基酸、经修饰氨基酸、环氨基酸、白蛋白、天然和合成聚合物如PEG、
聚糖(glycane)(o为0或至少1)的部分。A为锚定基团，优选选自酯、醚、二硫化物、酰胺、硫
醇、硫酯，p为0或至少1。在一个优选的实施方案中，m为4至19和/或n为0至78。一种或更多种
标记物与X的一个或氨基酸相偶联。标记物可由一种物质构成或可包含两种或更多种物质，
其可通过任何类型的化学或物理键(如共价键、离子键等)连接在一起，或者标记物是复合
物的形式。

[0029] 在本发明的一个优选实施方案中，一个或更多个标记物通过接头或间隔子与所述肽相连接，其中优选地通过肝蛋白质使所述接头或间隔子从疏水性修饰肽上切下，所述肝
蛋白质优选为肝细胞蛋白水解酶，其可选自细胞色素(例如细胞色素P450)，内吞途径的蛋
白酶和裂合酶(例如酯酶(estrase))、基质金属蛋白酶MMP1、MMP2、MMP7、MMP9和MMP12，优选
MMP7。在这种情况下，所述接头或间隔子优选地包含肽序列GCHAK或RPLALWRS。

[0030] 在另一个优选的实施方案中，所述一种或更多种标记物与侧链中具有氨基的X的一个或更多个氨基酸相偶联，所述氨基酸优选地选自赖氨酸、α-氨基甘氨酸、α，γ-二氨基
丁酸、鸟氨酸、α，β-二氨基丙酸，更优选赖氨酸。侧链中具有氨基的氨基酸优选地位于X的N
端，其中优选1至11个、更优选1至3个侧链中具有氨基的氨基酸位于X的N端。

[0031] 根据本发明，还通过提供药物组合物来解决该目的，所述药物组合物包含本文中限定的至少一种疏水性修饰肽和本文中限定的待特异性递送至肝、优选至肝细胞的至少一
种标记物，以及任选地可药用载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，所述疏水性修
饰肽和/或所述药物组合物用于将一种或更多种标记物特异性递送至肝，优选地用于诊断
肝疾病或病症或者监测其治疗，更优选地用于术中可视化。

[0032] 根据本发明，通过提供本发明的疏水性修饰肽或药物组合物的使用和所述疏水性修饰肽在制备用于诊断肝疾病或病症和/或监测其治疗的药物中的用途来解决该目的。

[0033] 根据本发明，还通过提供诊断肝疾病或病症或者监测肝疾病或病症的治疗的方法来解决该目的，所述方法包括向对象施用诊断有效量的本发明的疏水性修饰肽或药物组合
物。

[0034] 在从属权利要求中限定了本发明的另一些优选的实施方案。

[0035] 本发明的一些优选实施方案的描述

[0036] 在以下更详细地描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文中描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可变。还应理解，本文中所用术语仅出于描述特定实施方案的目的，
并且不旨在限制将仅由所附权利要求限定的本发明的范围。除非另有说明，否则本文中所
用所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员一般理解相同的涵义。出于本发明的目
的，本文中引用的所有参考文献均通过引用以其全部并入本文。

[0037] 疏水性修饰肽

[0038] 如上所述，本发明提供了来源于乙型肝炎病毒(HBV)之preS结构域(也称为“preS肽”)的疏水性修饰肽。HBV的包膜包封三种蛋白质，称为L(大)、M(中)和S(小)(参见图1)。它
们共有具有四个跨膜区的C端S结构域。M蛋白和L蛋白携带55个和依赖于基因型的107或118
个氨基酸(preS2和preS1)的额外N端延伸。

[0039] 因此，根据本发明的肽指这样的肽，其具有对应于或基于HBV L蛋白N端延伸(preS1)的氨基酸序列(优选基因型A至H以及绒毛猴(WMHBV)、猩猩(orangutan)、黑猩猩
(chimpanzee)和大猩猩(gorilla)乙型肝炎病毒)，但还指其变体，优选地为C端截短变体、
氨基酸替换变体。作为不可缺少的序列，在本发明疏水性修饰肽的氨基酸序列中存在对HBV
的疏水性修饰preS衍生肽的肝趋向性而言重要的氨基酸残基，如SEQ ID NO：1(NPLGFXP)中
所示。尤其地，本发明的疏水性修饰肽基于下述序列(以单字母代码表示氨基酸；下划线为
必需结构域)。

[0040] 疏水性修饰肽的必需结构域(SEQ ID NO：1)：

[0041] NPLGFXP(其中X为任意氨基酸，优选F或L，更优选F)

[0042] preS HBV-A(ID：M57663；SEQ ID NO：2)：

[0043] MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPQA

[0044] NQVGVGAFGPGFTPPHGGVLGWSPQAQGILATVPAMPPPASTNRQSGRQPTPISPPLR

[0045] DSHPQA

[0046] preS HBV-B(ID：D00329，SEQ ID NO：3)：

[0047] MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPHKDNWPDA

[0048] HKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTSVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLR

[0049] DTHPQA

[0050] preS HBV-C(ID：AB048704，SEQ ID NO：4)：

[0051] MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPHKDNWPDA

[0052] HKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTSVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLR

[0053] DTHPQA

[0054] preS HBV-黑猩猩(ID：AB032432，SEQ ID NO：5)

[0055] MGQNLSTSNPLGFFPEHQLDPAFKANTNNPDWDFNPKKDYWPEANKVGAGAFGPGF

[0056] TPPHGGLLGWSPQAQGILTTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPQA

[0057] preS HBV-D(ID：AB048702，SEQ ID NO：6)

[0058] MGQNLSTSNP LGFFPDHQLDPAFRANTNNPDWDFNPNKDTWPDANKVGAGAFGLG

[0059] FTPPHGGLLGWSPQAQGIMQTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRTTHPQA

[0060] preS HBV-E(ID：X65657，SEQ ID NO：7)

[0061] MGLSWTVPLEWGKNISTTNPLGFFPDHQLDPAFRANTRNPDWDHNPNKDHWTEAN

[0062] KVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGMLKTLPADPPPASTNRQSGRQPTPITPPLRD

[0063] THPQA

[0064] preS HBV-F(ID：X69798@8，SEQ ID NO：8)

[0065] MGAPLSTTRRGMGQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDSWPMAN

[0066] KVGVGGYGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGVLTTLPADPPPASTNRRSGRKPTPVSPPLR

[0067] DTHPQA

[0068] preS HBV-G(ID：AF160501，SEQ ID NO：9)

[0069] MGLSWTVPLEWGKNLSASNPLGFLPDHQLDPAFRANTNNPDWDFNPKKDPWPEAN

[0070] KVGVGAYGPGFTPPHGGLLGWSPQSQGTLTTLPADPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRD

[0071] SHPQA

[0072] HBV长臂猿(ID：AJ131572，SEQ ID NO：10)

[0073] MGQNHSVTNPLGFFPDHQLDPLFRANSNNPDWDFNPNKDTWPEATKVGVGAFGPGF

[0074] TPPHGGILGWSPQAQGILTTLPAAPPPASTNRQSGRKATPISPPLRDTHPQA

[0075] HBV-H(ID：Q8JMY6，SEQ ID NO：11)

[0076] MGAPLSTARRGMGQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDNWPMAN

[0077] KVGVGGFGPGFTPPHGGILGWSPQAQGILTTSPPDPPPASTNRRSGRKPTPVSPPLRDT

[0078] HPQA

[0079] HBV猩猩(ID：AF193864，SEQ ID NO：12)

[0080] MGQNLSVSNPLGFFPEHQLDPLFRANTNNPDWDFNPNKDTWPEATKVGVGAFGPGF

[0081] TPPHGGLLGWSPQAQGVTTILPAVPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDTHPQA

[0082] HBV绒毛猴(ID：NC001896，SEQ ID NO：13)

[0083] MGLNQSTFNPLGFFPSHQLDPLFKANAGSADWDKNPNKDPWPQAHDTAVGAFGPGL

[0084] VPPHGGLLGWSSQAQGLSVTVPDTPPPPSTNRDKGRKPTPATPPLRDTH[PQA

[0085] “变体”优选地为SEQ ID NO：2～13序列的N端和/或C端截短变体、氨基酸替换或缺失变体或者延长变体，其携带疏水性修饰，其中一个或更多个标记物与疏水性修饰肽必需
结构域的N端的一个或更多个氨基酸相偶联。变体还包括含有一个或更多个经修饰氨基酸、
一个或更多个非天然氨基酸或者一个或更多个肽模拟物或者可模拟肽骨架/结构的其他化
合物的氨基酸序列。优选地，变体选自SEQ ID NO：2至13的C端截短变体；氨基酸替换或缺失
变体；包含一个或更多个经修饰氨基酸、一个或更多个非天然氨基酸或者一个或更多个肽
模拟物或者可模拟肽骨架/结构的其他化合物的变体。

[0086] 根据本发明，疏水性修饰肽的变体至少包含具有SEQ ID NO：1之序列的氨基酸并且可由上述SEQ ID NO：2至13或其变体的18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、
83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、
106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119个氨基酸组成。

[0087] N端和/或C端截短变体包含SEQ ID NO：2至13或其变体的优选至少18个连续氨基酸、更优选至少19个连续氨基酸、甚至更优选至少20个和甚至更优选至少21个连续氨基酸。

[0088] 具有m个氨基酸的长度的疏水性修饰肽的N端序列(X)包含至少4个氨基酸(即m＝4)。优选地，疏水性修饰肽的端序列(X)可由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或
19个氨基酸组成。即，m可以是4至19。

[0089] 在一个优选的实施方案中，X的一个或更多个氨基酸在侧链中具有氨基，所述氨基酸优选地选自赖氨酸、α-氨基甘氨酸、α，γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、α，β-二氨基丙酸，更优选赖氨酸。侧链中具有氨基的X的一个或更多个氨基酸优选地位于X的N端，其中一至十一(1～
11)个、优选一至三(1～3)个侧链中具有氨基的氨基酸位于X的N端。

[0090] 在一个优选的实施方案中，疏水性修饰肽的N端序列(X)优选地包含序列NX1SX2X3(SEQ ID NO：16)，其中X1、X2和X3可为任意氨基酸。优选地，SEQ ID NO：16的X1为L、I或Q，更优选L。优选地，SEQ ID NO：16的X2为T、V、A或不存在，优选T或V，更优选T。优选地，SEQ ID NO：16的X3为P、S、T或F，更优选P或S，甚至更优选S。优选地，序列NX1SX2X3(SEQ ID NO：16)直接与肽P(SEQ ID NO：1；NPLGFXaaP)的N端相连接，产生包含序列NX1SX2X3NPLGFXaaP的肽，其
中X1、X2、X3和Xaa如上所限定。

[0091] 具有n个氨基酸的长度的疏水性修饰肽的C端序列(Y)包含0个或至少1个氨基酸(即n≥0)。优选地，疏水性修饰肽的端序列(Y)可由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、
64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92或93个氨基酸组成。即n可以为0至93。

[0092] 在一个优选的方案中，疏水性修饰肽的C端序列(Y)由至少4个氨基酸组成(n＝4)，其优选地具有序列X4HQLDP(SEQ ID NO：17)，其中X4为任意氨基酸。优选地，SEQ ID NO：17的
X4为D、E或S，更优选D或E，甚至更优选D。优选地，序列X4HQLDP(SEQ ID NO：17)直接与肽P
(SEQ ID NO：1；NPLGFXaaP)的C端相连接，产生包含序列NPLGFXaaPX4HQLDP的肽，其中X4和
Xaa如上所限定。

[0093] 在一个优选的实施方案中，本发明的疏水性修饰肽包含由氨基酸序列NX1SX2X3NPLGFXaaPX4HQLDP(SEQ ID NO：18)编码的肽，其中X1、X2、X3、X4和Xaa如上所限定。

[0094] 术语“变体”还指在肝脱氧核糖核酸病毒属(hepadnavirus)的不同病毒物种、毒株或亚型(例如HBV毒株α、HBV毒株LSH(黑猩猩分离物)、绒毛猴HBV(WMHBV)或选自HBV基因型A
至H的毒株)中发现的同源序列(参见SEQ ID NO：2～13)。

[0095] 术语“变体”还指这样的同源序列，其与包含不变NPLGFXaaP结构域和SEQ ID NO：2～13邻接序列的氨基酸序列或本文中公开的任何其他氨基酸序列显示出至少50％、优选
70％、更优选80％、甚至更优选90％或95％的序列同一性。

[0096] 因此，根据本发明的一种优选疏水性修饰肽包含具有不同病毒物种、毒株或亚型(优选HBV基因型或绒毛猴HBV(WMHBV)或者其变体)之氨基酸序列的SEQ ID NO：2至13的变
体。

[0097] 只要序列仍显示出肝趋向性(优选地静脉内注射1小时之后超过10％的注射剂量在肝组织中积累)，SEQ ID NO：2至13的“变体”还包含这样的变体或“类似物(analogues)”，
其包含氨基酸缺失、氨基酸替换(例如用其他氨基酸或等排物(isostere)(与蛋白质氨基酸
具有紧密的结构和空间相似性的经修饰氨基酸)进行的保守性或非保守性替代)、氨基酸添
加或等排物添加。疏水性修饰肽或其“变体”的肝趋向性优选为1小时后80％或更多的注射
剂量/g肝组织，更优选1小时后90％或更多的注射剂量/g肝组织，甚至更优选1小时后95％
或更多的注射剂量/g肝组织。

[0098] 保守性氨基酸替换通常涉及同一类别氨基酸的替换。这些类别包括，例如

[0099] -具有不带电极性侧链的氨基酸，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；

[0100] -具有碱性侧链的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；

[0101] -具有酸性侧链的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；以及

[0102] -具有非极性侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。

[0103] “N端”指X的N端，即相应的第一氨基酸残基，但还包含紧邻N端的疏水性修饰，例如相应的氨基酸残基(-4)、(-3)、(-2)、(-1)、1、2或3或4。因此，还可通过将标记物和疏水性部
分在与X的N端接近的位点处连接来获得标记物与疏水性修饰的偶联。

[0104] 根据本发明所述的疏水性修饰肽的疏水性修饰向肽添加了疏水性部分。

[0105] 采用至少一个疏水性部分或基团来修饰X。在本发明的一些优选实施方案中，采用1、2、3、4或更多个疏水性部分或基团来修饰X。即，可采用多于一个疏水性部分或基团(例
如，2个)来修饰X。疏水性部分或基团可彼此相同或不同。根据本发明的所述肽的疏水性修
饰选自：

[0106] -酰化；

[0107] -添加疏水性部分。

[0108] 酰化优选地选自采用羧酸、脂肪酸、具有亲脂性侧链的氨基酸来酰化。优选的脂肪酸为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸、支链或非支链脂肪酸，优选地具有8至22个碳原子(C8至
C22)。更优选地，通过酰化的疏水性修饰选自采用肉豆蔻酰基(C14)、棕榈酰基(C16)或硬脂
酰基(C18)的酰化。在体内和医学应用中因其较高的安全性(例如，不显示硬脂酰的不利作
用(先天免疫应答等))而优选通过肉豆蔻酰基化的修饰。疏水性部分的添加优选选自添加
胆固醇、胆固醇衍生物、磷脂、糖脂、甘油酯、类固醇、神经酰胺、异戊二烯衍生物、金刚烷、法呢醇、脂肪族基团、聚芳族化合物。疏水性部分的连接优选地通过共价结合，其可通过氨基
甲酸酯、酰胺、醚、二硫化物或本领域技术人员技能内的任何其它连接来实现。因此，本发明
的疏水性修饰的、优选酰化的肽优选地为因其N端亲脂或疏水性基团/部分而形成的脂肽。

[0109] Y的C端修饰(R)优选为用保护免受降解(例如，体内降解)之部分进行的修饰。

[0110] “C端”指C端(即，相应的最后一个氨基酸残基)处的修饰，但还包含紧邻C端(例如倒数第二个氨基酸残基、倒数第三个或更多个氨基酸残基)的修饰(例如，引入保护载体免
受酶促降解(例如通过羧肽酶的作用)的一个D-氨基酸)。本领域技术人员将能够根据相应
的应用选择相应合适的一个或更多个部分。优选的保护免受降解的部分选自酰胺、D-氨基
酸、经修饰氨基酸、环氨基酸、白蛋白、天然和合成聚合物如PEG、聚糖。另外，o为0或者至少
1，即C端修饰(R)为任选的。优选地，o为1。在本发明的另一些实施方案中，o为1、2、3、4或更
多。即，可以用多于一个部分或基团(例如，2个)来修饰疏水性修饰肽的C端或其邻近部分。
所述部分或基团可彼此相同或不同。

[0111] 在本发明的一个实施方案中，疏水性修饰和/或R通过接头或间隔子(spacer)与肽相连接。接头或间隔子为本领域技术人员所知，例如聚丙氨酸、聚甘氨酸(polyglycin)、碳
水化合物、(CHa)n基团。因此，本领域技术人员将能够根据相应的应用选择相应合适的一种
或更多种接头或间隔子。

[0112] 任选的锚定基团(anchor group)(A)充当化合物、标签、标记物的额外连接点，并且位于Y的氨基酸处。即，在存在至少一个锚定基团(A)(即，p≥1)的情况下，Y也包含至少一
个氨基酸(即，n≥1)。在一个优选的实施方案中，锚定基团为Y的“C端”，其中“C端”指C端处
的修饰，即，相应的最后一个氨基酸残基，但还包含紧邻C端的残基，例如倒数第二个氨基酸
残基、倒数第三个或更多个氨基酸残基。在这种情况下，o可以是0，从而没有其它C端修饰R。
锚定基团A可以在Y的氨基酸侧链处或可以是Y的氨基酸侧链本身，即A可以是侧链本身或经
修饰的侧链。锚定基团还可以是引入Y的氨基酸序列以充当锚定基团的经修饰氨基酸残基。
在本发明的另一些实施方案中，锚定基团A与X的疏水性修饰和/或C端修饰R相连接。优选的
锚定基团选自酯、醚、二硫化物、酰胺、硫醇、硫酯。本领域技术人员将能够根据待连接的相
应化合物、标签、标记物等来选择相应合适的一个或更多个锚定基团。锚定基团还可适合用
于连接复合物形成组分(complex-forming component)，例如生物素/亲和素、聚精氨酸/寡
核苷酸(例如siRNA)复合物。此外，o为0或至少1，即锚定基团(A)是任选的。优选地，o为1。在
本发明的另一些实施方案中，o为1、2、3、4或更多。即，存在多于一个锚定基团，例如2个。锚
定基团可以彼此相同或不同，以允许连接若干化合物(例如一种标记物或不同标记物)。

[0113] 疏水性修饰肽的合成

[0114] 可通过本领域技术人员已知的多种方法来制备本发明的肽，一般通过合成化学方法和/或遗传工程方法进行。合成化学方法更特别地包括固相顺序和嵌段合成(Erickson和
Merrifield，1976)。从W02009/092612可获得更多细节。

[0115] 可使用已建立的自动化方法例如使用自动化肽合成仪来进行固相顺序方法。在该方法中，将[α]-氨基保护的氨基酸与树脂支持物相结合。所使用的树脂支持物可以是本领
域中常规用于固相制备(多)肽的任何合适的树脂，优选聚苯乙烯，其与聚氧乙烯共聚合以
提供与最初引入的o-氨基保护氨基酸形成酯的位点。已明确地描述了由本发明人施用的该
优化方法(参见，例如12)。一个接一个(逐步)地引入氨基酸。对应于引入一个氨基酸的各合
成循环包括去保护步骤、相继洗涤步骤、采用氨基酸活化的偶联步骤以及随后的洗涤步骤。
这些步骤的每个后均是过滤。用于偶联的反应剂为用于(多)肽合成的传统反应剂，例如二
环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐
(benzotriazil-1-yl-oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate)以及
二苯基磷酰叠氮化物。在树脂上合成多肽之后，通过在苯甲醚(anisol)、乙二硫醇或2-甲基
吲哚的存在下用强酸例如三氟乙酸处理使多肽与树脂分离。之后，通过经典的纯化技术(尤
其是通过HPLC)来纯化化合物。

[0116] 还可通过偶联被选择性地保护的(多)肽片段来获得本发明的肽，该偶联例如在溶液中进行。还可通过技术人员已知的遗传工程技术来产生该肽。真核表达系统(例如杆状病
毒系统)尤其合适。根据该方法，在用含有异源蛋白质编码核酸序列和调控核酸序列(例如
启动子)的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中表达蛋白质。数种细胞系可用于用重组杆状病
毒的感染，例如可购自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的
细胞系Sf-9(CRL1711)。在原核表达系统(例如大肠杆菌(E.coli))中表达也特别合适。

[0117] 可通过本领域技术人员已知的多种方法来实现疏水性部分到肽的引入，包括合成方法和遗传工程方法。

[0118] 或者，可通过稳定转染的真核细胞系(例如CHO和本领域已知的并且常用于产生疫苗等的其他细胞系)产生肽和/或融合肽(即，疏水性修饰肽)。由于N端47-preS1氨基酸促进
肉豆蔻酰基化蛋白质/肽分泌的固有特性，所以可以从细胞培养上清液中提取生物活性疏
水性修饰肽。

[0119] 用于肝靶向的载体和穿梭子(shuttle)

[0120] 如上所述，本发明提供了疏水性修饰肽作为载剂或穿梭子用于将化合物(标记物)特异性递送至肝的用途，其中所述标记物与本文中所述的疏水性修饰肽相偶联。

[0121] 根据本发明的用于将化合物特异性递送至肝的“载剂”或“穿梭子”指如本发明人发现的和本文中描述的疏水性修饰肽的肝趋向性(liver tropism)或肝向性
(hepatotropism)，即指它们在肝中选择性地累积的能力，优选地指在肝细胞的质膜处选择
性地累积以及选择性地进入肝细胞。本发明基于本发明人的高特异性肝累积的发现和对
HBV preS1序列中HBV肝趋向性之决定因子的鉴定。因此，本发明使用关于肝趋向性之决定
因子的知识来设计分别用于特异性肝靶向或递送的通用载体或穿梭子。本发明的疏水性修
饰肽为用于使一种或更多种化合物特异性递送至肝的通用载剂或穿梭子。

[0122] 优选地，化合物向肝的特异性递送为化合物向肝细胞的特异性递送。此外，可在体外以及在体内将化合物特异性递送至肝细胞。化合物优选地特异性递送至动物的肝，所述
动物优选为哺乳动物或人或者禽。

[0123] 待递送的标记物

[0124] 根据本发明的待特异性递送至肝的标记物可以是适合用于诊断目的的任何类型的化合物。优选地，标记物包含与二价或三价金属阳离子形成复合物的螯合剂。

[0125] 在本发明的一个优选的实施方案中，标记物选自荧光染料、放射性同位素和造影剂。根据本发明，造影剂为染料或帮助显示体内异常区域的其他物质。

[0126] 优选的放射性同位素/荧光发射同位素选自发出α放射性发射同位素、γ放射性发18
射同位素、俄歇(Auger)电子发射同位素、X射线发射同位素、荧光发射同位素，例如 F、
51Cr、67Ga、68Ga、111In、99mTc、140La、175Yb、153Sm、166Ho、88Y、90Y、149Pm、177Lu、47Sc、142Pr、159Gd、
212Bi、72As、72Se、97Ru、109Pd、105Rh、101m15Rh、119Sb、128Ba、123I、124I、131I、197Hg、211At、169Eu、203Pb、212Pb、64Cu、67Cu、188Re、186Re、198Au和199Ag。

[0127] 优选的荧光染料选自以下类别的染料：呫吨(Xanthens)(例如荧光素)、吖啶(例如吖啶黄)、嗪(例如嗪1)、花菁(Cynine)(例如Cy7/Cy3)、苯乙烯基染料(例如染料-28
(Dye-28))、香豆素类(例如Alexa Fluor350)、卟吩(例如叶绿素B)、金属-配体复合物(例如
PtOEPK)、荧光蛋白(例如APC、R-藻红蛋白)、纳米晶体(Nanocrytals)(例如
QuantumDot705)、二萘嵌苯(Perylene)(例如Lumogen Red F300)和酞花菁(例如
TM
IRDYE 700DX)以及这些类别染料的缀合物和组合。优选的造影剂选自顺磁性剂，例如Gd、
Eu、W和Mn，优选地与螯合剂复合。其他的选择为超磁性铁(Fe)复合物和颗粒、包含高原子序
数的原子的化合物(即用于计算机断层摄影(CT)的碘)、包含这些造影剂的微泡和载体(例
如脂质体)。

[0128] 螯合剂

[0129] 待特异性递送至肝细胞的标记物可以采用与螯合剂形成复合物的形式与疏水性修饰肽相结合，所述螯合剂能够与相应标记物形成复合物。在本发明的一个优选的实施方
案中，螯合剂选自1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N，N′-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸
(EDTA)、1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)、三亚乙基四胺(TETA)、亚氨基二乙酸、二亚乙基三胺-N，N，N′，N′，N″-五乙酸(DTPA)和6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)，而1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N，N′-四乙酸(DOTA)是尤其优选的。

[0130] 标记物与疏水性修饰肽的偶联

[0131] 可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行一种或更多种标记物与X的相应氨基酸的偶联。

[0132] 在本发明的一个优选实施方案中，通过使用活化酯将一种或更多种标记物与X的相应氨基酸相偶联。尤其地，在一种或更多种标记物与侧链中具有氨基之氨基酸相偶联的
情况下，可以使用该方法。或者，可使用简要概括的下述偶联方法以将一种或更多种标记物
与X的相应氨基酸相偶联。化学工作者可容易地确定用于在具有或没有接头的情况下实现
标记物与氨基酸相偶联的特定反应条件：

[0133] -通过胺与活化羧酸的反应形成酰胺，优选为NHS-酯或碳二亚胺；碳二亚胺为促进羧基与伯胺直接缀合的完全交联剂。NHS酯为通过含有羧化物基团之分子的碳二亚胺活化
形成的反应性基团。

[0134] -使用两个硫醇或特异性与吡啶基二硫化物反应的一个硫醇的二硫键连接；吡啶基二硫化物在宽pH范围(最佳为pH4～5)中与巯基反应从而形成二硫键。在反应期间，在分
子的SH-基团和2-吡啶基二硫醇基团之间发生二硫交换。因此释放了吡啶-2-硫酮。

[0135] -使用马来酰亚胺或卤乙酰和硫醇组分形成硫酯；卤乙酰与巯基在生理pH下反应。通过用来自巯基的硫原子亲核取代碘来进行碘乙酰的反应以产生稳定的硫酯连接。当反应
混合物的pH为6.5至7.5时，马来酰亚胺基团与巯基特异性反应并形成不可逆的稳定硫酯连
接。

[0136] -使用酰亚胺酯(imidoester)和胺形成脒；酰亚胺酯交联剂在碱性pH下与胺快速反应，但半衰期短。随着pH的碱性变得更强，半衰期和与胺的反应性提高；因此，与pH8相比，
在pH10下进行时交联更有效。低于pH10的反应条件可导致副反应，尽管pH8～10有利于脒形
成。

[0137] -使用羰基(例如醛)和酰肼的酰肼连接；羰基(醛和酮)在pH5～7下与酰肼和胺反应。羰基在蛋白质中不容易存在；然而，使用高碘酸钠的糖乙二醇轻度氧化使邻位羟基转化
为醛或酮。与酰肼的随后反应导致形成腙键。

[0138] -在还原条件下使用羰基和胺的胺连接；还原性胺化(也称为还原性烷化)是一种胺化形式，其涉及通过中间体亚胺使羰基转化为胺。羰基最通常为酮或醛。

[0139] -使用腈和叠氮化物的铜催化的三唑形成。将叠氮化物与末端或内部炔烃之间的Huisgen型1，3-偶极性环加成用于得到稳定的1，2，3-三唑。

[0140] -使用异硫氰酸酯和胺形成异硫脲；异硫氰酸酯与胺(即，赖氨酸的ε-氨基)之间的反应导致了稳定的硫脲键。

[0141] -通过醇与活化羧酸反应形成酯，优选酰基氯或碳二亚胺；高温反应使得醇与羧酸之间直接反应以形成稳定的酯，或者，羧酸在酸性或碱性催化条件下活化。

[0142] -通过醇与烷基卤化物反应形成醚。卤代烷烃对亲核试剂具有反应性。它们为极性分子：连接卤素的碳稍带正电，其中卤素稍带负电。这使得缺电子(亲电子)的碳不可避免地
吸引亲核试剂。

[0143] 用于标记物的接头/间隔子

[0144] 本发明的疏水性修饰肽(尤其是缀合物)优选地在肝中用于富集穿梭至肝的标记物。优选地，通过肝蛋白质(优选为肝细胞蛋白水解酶，尤其体内在肝中)将标记物从疏水性
修饰肽上切下。标记物和疏水性修饰肽形成缀合物。优选地，通过共价连接或通过复合物形
成而形成标记物与疏水性修饰肽的缀合物。连接的形式取决于标记物的类型。

[0145] 可通过使用间隔子或接头进行一种或更多种标记物与X的相应氨基酸的偶联。本领域技术人员已知接头或间隔子，例如聚丙氨酸、聚甘氨酸、碳水化合物、(CH2)n基团或氨
基酸序列。因此，本领域技术人员将能够根据相应应用选择相应合适的一种或更多种接头
或间隔子。间隔子或接头优选地包含肝细胞特异性活化的识别位点，其优选地为肝或肿瘤
特异性蛋白所识别。识别位点优选地为蛋白裂解切割位点。因此，肝蛋白质优选地为肝细胞
蛋白质，更优选肝细胞蛋白水解酶或在肿瘤中过表达的蛋白水解酶(例如MMP7)。因此，可将
缀合物施用至对象并且通过机体(例如在体液中)输送而不被切割。然而，一旦缀合物到达
其靶标(分别是肝或肝细胞)，肝蛋白质(例如肝细胞蛋白水解酶)将切割蛋白裂解切割位点
并从其穿梭子(即疏水性修饰肽)释放标记物。

[0146] 另一些优选的肝蛋白质是细胞色素，例如细胞色素P450或内吞途径的裂合酶。如用于阿德福韦(Adefovir)或Pradevofir的HepDirect(R)技术(Metabasis Technologies，
Inc.)也适合用于本发明。

[0147] 对于肿瘤疾病(例如由癌(例如结肠癌)转移引起的恶性转变)的诊断和预后而言特别重要的是恶性组织与周围组织之间的交换。需要活化健康上皮细胞和或募集免疫细
胞，这是形成原发性肿瘤远端转移的先决条件。组织分析显示，基质金属蛋白酶(MMP1、
MMP2、MMP7、MMP9和MMP12)的肿瘤特异性mRNA表达水平与肿瘤患者的不良预后相关
(Gentner B.等，Anticancer Res.2009Jan；29(1)：67-74)。在这些蛋白酶当中，尤其对MMP7
特别感兴趣，因为肿瘤细胞主要表达MMP7。将标记物与所述肽序列通过以下的接头序列连
接会允许通过上述方式经由原始肽的修饰递送非活性标记至肝，所述接头序列包含MMP7
(例如，短肽序列GCHAK或RPLALWRS)以及所有其它MMP7底物(例如，纤连蛋白、弹性蛋白、酪
蛋白等)的特异性蛋白裂解结合位点。之后，在肝中，在肿瘤组织的直接环境中优先切割经
修饰肽并使非活性标记物活化。标记物递送至肝并靶向过表达上文所列MMP之一的肝中原
发性肝细胞癌或转移(例如，结肠癌转移)的方法代表了标记物靶向肿瘤组织的新方法。

[0148] 在一个实施方案中，通过复合物形成来形成标记物与疏水性修饰衍生肽的缀合物。可用于本发明的一些优选复合物为生物素/亲和素、聚精氨酸/寡核苷酸(例如siRNA)。
本领域技术人员将能够确定合适的复合物组分并且相应地设计化合物和疏水性修饰肽。

[0149] 肝疾病的诊断

[0150] 在本发明的一个优选实施方案中，提供了上述疏水性修饰肽(尤其是其具有标记物的缀合物)用于诊断肝疾病或病症。

[0151] 根据将被诊断的肝疾病或病症，选择相应标记物并选择性地特异性地递送至肝。根据本发明的“肝疾病”或“肝病症”指对肝器官、肝组织或肝细胞有影响或涉及其的任何疾
病或病症。

[0152] 肝疾病的实例是：

[0153] -肝的癌症：原发性肝细胞癌(HCC)或胆管癌和转移癌(通常来自胃肠道的其它部分；优选结直肠癌)

[0154] -肝炎：肝的炎症，主要由多种病毒引起，但也由某些毒物、自身免疫或遗传状况引起；

[0155] -肝硬化：肝中纤维组织的形成替换死亡的肝细胞。肝细胞的死亡例如可由病毒性肝炎、酒精中毒或与接触其他肝毒性化学物质所导致；

[0156] -血色病：造成体内铁积累并最终导致肝损伤的遗传性疾病；

[0157] -威尔逊氏病：导致身体保留铜的遗传性疾病；

[0158] -原发性硬化性胆管炎：胆管的炎性疾病，性质上是自身免疫的；

[0159] -原发性胆汁性硬化：小胆管的自身免疫病；

[0160] -Budd-Chiari综合征：肝静脉阻塞；

[0161] -Gilbert综合征：胆红素代谢的遗传病症，发现于约5％的人群中；

[0162] -糖原贮积病II型：糖原的积累导致整个身体的进行性肌肉无力(肌病)并且影响多种身体组织，尤其是心脏、骨骼肌、肝和神经系统；

[0163] -儿科肝疾病，例如胆管闭锁、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、alagille综合征和进行性家族性肝内胆汁淤积症；

[0164] -代谢疾病。

[0165] 此外，还包括动物(例如宠物或家畜)的肝疾病，特别是可传播至人的疾病，例如弓形体病。

[0166] 待诊断的肝疾病或病症优选地选自原发性肝细胞癌、其他肿瘤的转移、肝炎、肝硬化、血色病，优选由甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、己型肝炎、庚型肝
炎和辛型肝炎病毒导致的肝炎。待诊断的肝疾病或病症还可以为由病毒导致的伴发肝炎，
所述病毒例如疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒，如疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、以及水
痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、黄热病毒、登革病毒
(Dengue virus)。

[0167] 待诊断的肝疾病或病症还可以是涉及病毒性或非病毒性病原体之肝病期(liver stadium)的疾病(例如，在许多热带病中)。由于一些病原体的肝病期是早期病期，所以可以
在这种早期病期中选择性地特异性治疗相应感染。这些病毒为甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝
炎、丁型肝炎、戊型肝炎、己型肝炎、庚型肝炎和辛型肝炎肝炎病毒。

[0168] 这种非病毒性病原体是细菌、寄生虫和/或蠕虫。寄生虫是例如导致疟疾的疟原虫属(Plasmodium)的原生动物寄生虫，例如恶性疟原虫、间日疟原虫和相关物种(例如，卵形
疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫[ι])。这种蠕虫是例如导致血吸虫病或裂体吸虫病的血吸
虫属(Schistosoma)的扁虫，例如曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、间插血吸虫
(Schistosoma intercalatum)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫
(Schistosomajaponicum)和湄公血吸虫(Schistosoma mekongi)。这种寄生虫还为例如造
成疾病利什曼病的白蛉属(Phlebotomus)和罗蛉属(Lutzomyia)的利什曼虫锥体虫原生动
物。因此，可通过本发明的方法诊断疟疾、血吸虫病(裂体吸虫病)和/或利什曼病。因此，可
通过本发明的方法诊断某些热带病。

[0169] 待诊断的肝疾病或病症优选地为肝肿瘤，优选肝细胞癌(HCC)或由实体肿瘤(例如，结直肠癌)转移的恶性转变。

[0170] 在本发明的一个优选实施方案中，上述疏水性修饰肽用于早期诊断和对肝的原发恶性病变进行分型，例如早期肝细胞癌。

[0171] 本发明的另一个优选实施方案是上述疏水性修饰肽用于诊断肝中早期转移病变(例如结直肠癌(CRC)转移)的用途。

[0172] 待诊断的肝疾病或病症还可以是代谢疾病，例如糖尿病、高脂血症、代谢综合征和肥胖、慢性高血糖症、代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(还参见(9))。

[0173] 在本发明的一个优选实施方案中，上述疏水性修饰肽(优选为酰化衍生肽，尤其是其具有标记物的缀合物)可用于制备用于诊断肝疾病或病症的药物。

[0174] 医学成像

[0175] 本发明的疏水性修饰肽可用于本领域技术人员已知的医学成像。合适的方法为X射线成像、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层造影(PET)、单光子发射计算机断层造影
(SPECT)、X射线计算机断层造影(CT)和这些方法的组合(例如PET-CT、CT-MRI)。进行这些医
学成像方法的特定条件为本领域技术人员所知。

[0176] 药物组合物

[0177] [91]如上所述，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文中限定的至少一种疏水性修饰肽和如本文中限定的待特异性递送至肝的至少一种化合物，以及任选地可药用
载体和/或赋形剂。

[0178] 根据本发明的药物组合物包含：

[0179] -至少一种如上文中限定的疏水性修饰肽；和

[0180] -任选地可药用载体和/或赋形剂。

[0181] [92]根据本发明的药物组合物非常适合用于本文中描述的全部用途和方法。

[0182] [93]“可药用载体或赋形剂”指任何载剂，可在其中或用其配制根据本发明的药物或疫苗组合物。其包括盐溶液，例如磷酸缓冲盐水、柠檬酸缓冲剂、NaCl、辛基葡萄糖苷和/
或poloxamere。通常，在施用方式和途径以及标准药物实践的基础上选择稀释剂或载体。

[0183] 诊断方法

[0184] [94]另外，如上所述，本发明提供了通过利用上述本发明的一种或更多种疏水性修饰肽或一种或更多种药物组合物来诊断肝疾病或病症的方法。

[0185] [95]本发明还提供了通过向对象施用如本文中限定的疏水性修饰衍生肽和标记物或药物组合物来诊断肝疾病或病症的方法。根据本发明的用于诊断肝疾病或病症的方法
包括向对象施用诊断有效量的

[0186] (a)如上文中限定的并包含如上文中限定之至少一种标记物的疏水性修饰肽，或

[0187] (b)如上文中限定的药物组合物。

[0188] 施用途径

[0189] [96]优选地，本发明的疏水性修饰肽或药物组合物的施用途径(尤其在治疗的方法中)选自皮下、静脉内、经口、经鼻、肌肉内、经皮、吸入、通过栓剂。用于经鼻施用或应用的一个优选实施方案为鼻喷雾。

[0190] [97]在另一个优选的实施方案中，将包含标记物的本发明疏水性修饰肽溶于来自患者的血清中并且通过注射施用。

[0191] 诊断有效量

[0192] [98]本发明疏水性修饰肽或药物组合物的“诊断有效量”指足以诊断相应肝疾病或病症的量。优选的诊断有效量取决于待递送的相应化合物及其相应的诊断能力。本领域
技术人员应能够确定合适的诊断有效量。在一个优选的实施方案中，诊断有效量为10pmol/
kg至20μmol/kg体重。对于用作诊断剂(即标记物与疏水性修饰肽相偶联)，向患者待施用的
量优选地为100nmol至2μmol、更优选约500nmol/kg体重。当使用MRI作为医学成像方法时，
相应疏水性修饰肽优选以300nmol至800nmol/kg体重、更优选400至600nmol/kg体重的量向
患者施用。

[0193] 本发明的一些优选疏水性修饰肽

[0194] [99]在下述中，给出了本发明的一些优选疏水性修饰肽。这些疏水性修饰肽基于氨基酸序列KKKNLSTSNPLGFFPDHQLPD(SEQ ID NO：14)或KKKNLSTSNPLGFFPDHQLDP(SEQ ID
NO：15)，其中可缺失一个或两个N端赖氨酸(K)或可将其替换为另一个氨基酸。一个示例性
优选疏水性修饰肽具有下述化学结构：

[0195]

[0196] [100]具有上述示例性化学结构的化合物的氨基酸序列为：

[0197] 硬脂酰-K(DOTA[Gd])K(DOTA[Gd])K(DOTA[Gd])NLSTSNPGLGFFPDHQLDP-酰胺，其中三个螯合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N，N′-四乙酸(DOTA)各自复合Gd阳离子并与
三个N端赖氨酸(KKK)中的一个相结合，同时还用疏水性硬脂酰基团修饰第一个N端赖氨酸。
对此，应注意，在本文中简化了本发明的疏水性修饰肽的式，使得上述示例性疏水性修饰肽
还可命名为

[0198] “硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺”

[0199] [101]在下述中，给出了本发明的一些优选疏水性修饰肽以及其在诊断肝疾病或病症中的特定用途：

[0200] -硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP

[0201] -硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP

[0202] -硬脂酰-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP

[0203] -硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD

[0204] -硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD

[0205] -硬脂酰-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD

[0206] -硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺

[0207] -硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺

[0208] -硬脂酰-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺

[0209] -硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-酰胺

[0210] -硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-酰胺

[0211] -硬脂酰-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-酰胺

[0212] 表1一些优选的疏水性修饰肽

[0213]

[0214] 硬脂酰指N端的硬脂酰化。

[0215] [102]以下实施例和附图说明了本发明，然而不对本发明进行限制。

附图说明

[0216] [103]图1：HBV颗粒以及HBV L-、M-和S-蛋白的图示。部分双链DNA与由末端蛋白(TP)、逆转录酶(RT)和RNA酶H组成的病毒聚合酶复合物共价连接。基因组由120个核心蛋白
二聚体构成的二十面体壳所包封。3种HBV表面蛋白L-、M-和S-嵌入ER衍生的脂双层中。L-和
M-蛋白包含充当膜锚定物的完全S结构域。HBV部分双链DNA基因组的图示；C＝形成病毒衣
壳的核心蛋白；X＝X蛋白，具有未明确功能的多效反式活化子；P＝病毒聚合酶；这些的
preS1/preS2/S组合形成了大(preS1/preS2/S)HBV表面蛋白(L蛋白)和中(preS2/S)HBV表
面蛋白以及小(S)HBV表面蛋白。

[0217] [104]图2：本发明的疏水性修饰肽的通式和本发明的疏水性修饰肽的实例的图示。

[0218] [105]图3：本发明的疏水性修饰肽与肝细胞表面的结合的图示。

[0219] [106]图4：患有肿瘤的大鼠的PET图像。图4A在i.v.注射后5分钟400nmol/kg的硬68
脂酰-[K(DOTA[ Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺在WAG/Rji大鼠肝中的特异性富集。图
4B初始测量24小时后使用18F-FDG的复染色，18F-FDG在消耗大量葡萄糖的器官中富集，图中
心脏(顶部灰色部分)和肿瘤富集葡萄糖(脑中富集的18F-FDG出于技术原因未示出)。图4C两
幅图像的合并，表明肽的特异性，仅使肝组织染色，而非肿瘤组织。

[0220] [107]图5示出在注射600nmol/kg体重的硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP之前(图5A)以及注射后20分钟(图5B)和30分钟(图5C)的大鼠的一系
列代表性MRI图像。

[0221] [108]图6示出了肝、肌肉组织和心脏中通过MRI测量确定的对比增强。

[0222] [109]图7：在PBS中以等克分子量(equimolar amount)(1mM)溶解的肽硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP(肽X)、卜迈维斯(Primovist)TM、美格维斯(Magnevist)TM
和钆膦维司(Vasovist)TM的R1弛豫效能(realxivity)。

[0223] [110]图8：在PBS中以以等克分子量(1mM)溶解的肽硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-TM TM
NLSTSNPLGFFPDHQLDP(肽X)、卜迈维斯(Primovist) 、美格维斯(Magnevist) 和钆膦维司
(Vasovist)TM的R2弛豫效能。

[0224] [111]图9：111In标记的疏水性修饰肽在小鼠中的器官分布。

[0225] [112]图10：硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺在非失活人血清中的稳定性。
实施例

[0226] [113]在下述实施例中，携带作为与DOTA复合之标记物的Gd、68Ga或111In的疏水性肽(硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺、硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-
NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺或硬脂酰-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺)用作
本发明的示例性产物。如果没有其他说明，通过使用WAG/Rij大鼠进行了使用不同医学成像
方法的体内实验。

[0227] 实施例1

[0228] 疏水性修饰肽的合成

[0229] [114]通过使用如(10)Gripon，P.等J Virol79，1613-1622(2005)中所述的Fmoc方法进行肽合成。

[0230] 合成DOTA-DFP

[0231] [115]将二异丙基碳二亚胺(5mmol，631mg，774μl)溶于吡啶(15ml)中并经10分钟滴加至DOTA(5mmol，2.02g)和二氟苯酚(5mmol，650mg)在水(60ml)中的溶液并搅拌。添加后
30分钟，用二氯甲烷萃取反应混合物三次，通过使用旋转蒸发器使水相蒸发至干。将粗产物
溶于水(11ml)和乙腈(3ml)的混合物中并通过制备型RP-HPLC进行纯化。通过冷冻干燥浓缩
包含产物的HPLC级分。产量：1.0633g(41％)。

[0232] 与肽偶联

[0233] [116]将肽硬脂酰-KKKNLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺(140mg，0.055mmol)溶于5ml DMF中。添加DOTA-DFP(129mg，0.25mmol)，然后再添加DIPEA(410μl，2.5mmol)。在50℃下使
混合物搅拌过夜。添加二乙醚直到沉淀；通过使用离心使沉淀分离并用二乙醚洗涤两次。通
过使用RP-HPLC纯化粗产物。通过使用水和乙腈(二者均包含0.1％三氟乙酸)的梯度来进行
纯化。通过冷冻干燥浓缩包含产物的HPLC级分。产量：112mg(55％)。

[0234] 复合Gd3+

[0235] [117]将肽硬脂酰-[K(DOTA)]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺(112mg，0.030mmol)溶于0.4M乙酸钠缓冲液(pH5)中并添加GdCl3＊6H2O(335mg，0.90mmol)。使混合物在水浴中加
热1小时同时搅拌。通过使用RP-HPLC纯化所得的产物混合物。通过使用水和乙腈(二者均包
含0.1％三氟乙酸)的梯度进行纯化。通过冷冻干燥浓缩包含产物(硬脂酰-[K(DOTA
[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺)的HPLC级分。产量：94mg(77％)。

[0236] 实施例2

[0237] PET成像

[0238] [118]将肽硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺溶于柠檬酸缓冲液(pH8.0)+4％BSA中，并在患有肿瘤的大鼠的尾静脉中i.v.注射。在测量之前10天，用1×
106个同基因结肠癌细胞(CC531细胞)原位注射大鼠。在测量当天，大鼠接受400nmol/kg体
重的浓度的肽。在实验期间，通过异氟烷麻醉大鼠并保持在37℃。使用来自Siemens的
Inveon小动物PET进行PET成像，初始测量后24小时使用硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-
NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺i.v.注射肽之后立即开始成像，用18F-FDG(氟脱氧葡萄糖(18F))
以5毫居里的浓度注射大鼠作为对照。图4A～C示出了患有肿瘤的大鼠的代表性PET图像。图
68
4A在i.v.注射后5分钟400nmol/kg的硬脂酰-[K(DOTA[ Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺
在WAG/Rji大鼠肝中的特异性富集。图4B初始测量后24小时使用18F-FDG复染色，18F-FDG在
消耗大量葡萄糖的器官中富集，图中心脏(顶部灰色部分)和肿瘤富集葡萄糖(脑中富集的
18F-FDG出于技术原因未示出)。图4C两幅成像的合并，表明肽的特异性仅使肝组织染色，而
非肿瘤组织。

[0239] 实施例3

[0240] MRI成像

[0241] [119]将肽硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺溶于柠檬酸缓冲液(pH8.0)+4％BSA中，并在大鼠的尾静脉中以600nmol/kg体重的浓度i.v.注射。在实验期
间，通过异氟烷麻醉大鼠。施用肽之后，在采用T1对比灵敏序列的
MRI中检查大鼠。采用Siemens Avanto1.5T MRI 扫描仪进行测量。图5显示了i.v.注射前以
及注射后20和30分钟健康大鼠的代表性图像。

[0242] 实施例4

[0243] 剂量递增

[0244] [120]异氟烷麻醉的大鼠在随后的i.v.注射中接受增加量的硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺。随后注射之间的间隔为20分钟。在两次注射之间的时
间中，进行采用T1对比灵敏序列的肝的连续MRI测量并且测定对比
在肝、肌肉组织和心脏中的提高。平行地，测定临床相关剂量的卜迈维斯TM的对比值。结果在
图6中示出。

[0245] 实施例5

[0246] 通过NMR测定R1/R2弛豫效能

[0247] [121]在室温下将肽硬脂酰-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP(“肽X”；1mM)、卜迈维斯TM(1mM)，美格维斯TM(1mM)以及钆膦维司TM(1mM)以等克分子量溶于PBS中，并且用
Varian300Mhz NMR测量R1/r2弛豫效能。通过使用傅立叶变换，从由实验所得的数据测定单
对比值。结果示于图7和图8中。

[0248] 实施例6

[0249] 器官分布研究

[0250] [122]对于检查器官分布，将111In标记的肽硬脂酰-[K(111In DOTA)]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP溶于柠檬酸缓冲液(pH8.0)+4％BSA中并且在小鼠的尾静脉中以
400nmol/kg体重的浓度i.v.注射。在给定的时间点处死小鼠并取得血和器官。通过使用γ-
计数器测定各个器官的放射性信号。结果示于图9中。

[0251] 实施例7

[0252] 血清中的稳定性

[0253] [123]在37℃下将硬脂酰-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-酰胺在来自健康志愿捐赠者的非失活人血清中孵育指定的时间。通过使用HPLC亲和色谱法纯化肽来进行
降解产物的检测，随后在指定的时间点采用γ计数器进行放射性测定。通过质谱分析法确
证从柱洗脱的放射性峰级分的正确质量(数据未给出)。结果示于图10中。仅见放射性衰变，
未见裂解。

[0254] [124]前述描述、权利要求和/或附图中公开的特性可分开地和以其任意组合二者以其不同形式为用于实现本发明的材料。

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