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包含去免疫化的志贺毒素A亚基 支架的HER2靶向分子

阅读：33发布：2021-01-22

专利汇可以提供包含去免疫化的志贺毒素A亚基支架的HER2靶向分子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了包含志贺毒素A亚基来源的多肽的HER2靶向分子，其具有1)去免疫化和2)降低的蛋白酶切割敏感性，同时保留志贺毒素功能，诸如，例如通过核糖体抑制的强效的细胞毒性。本发明的某些HER2靶向分子在哺乳动物中表现出降低的免疫原性潜力，并且在保留上述特征的同时被哺乳动物良好耐受。本发明的HER2靶向分子具有选择性杀伤特定细胞(例如HER阳性肿瘤细胞)的用途；用于选择性地将货物输送到特定细胞(例如，HER阳性肿瘤细胞)，以及用作治疗和诊断多种病况(包括涉及细胞表面HER2的表达或过表达的癌症和肿瘤)的治疗和/或诊断分子。，下面是包含去免疫化的志贺毒素A亚基支架的HER2靶向分子专利的具体信息内容。

权利要求

1.HER2靶向分子，其包含
i)免疫球蛋白结合区域，其能够特异性结合HER2/neu/ErbB2的细胞外部分，并且包含以下一种或更多种：
抗体可变片段、单结构域抗体片段、单链可变片段、Fd片段、抗原结合片段、自主VH结构域、来源于骆驼抗体的VHH片段、来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域、VNAR片段和免疫球蛋白新抗原受体；
和
ii)志贺毒素A亚基效应多肽，其包含志贺毒素A1片段区域和羧基末端，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽包含：
(a)嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位，其破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域；
(b)至少四个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，所述表位区域不与所述嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位重叠；和
(c)在所述志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；和其中所述志贺毒素A亚基效应多肽相对于野生型志贺毒素A亚基在其羧基末端被截短，导致一个或更多个内源B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的消除；和
其中所述志贺毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能。
2.权利要求1所述的HER2靶向分子，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽包含与选自以下的野生型志贺毒素A亚基氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸75至251；
(ii)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸1至241；
(iii)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸1-251；和
(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至261。
3.权利要求1或2所述的HER2靶向分子，其中所述破坏的弗林蛋白酶切割基序相对于野生型志贺毒素A亚基进一步包含一个或更多个突变，所述突变改变天然位于以下位置处的区域的至少一个氨基酸残基：
在志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO:1)、志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1变体序列的A亚基(SEQ ID NO:4-6)的248-251位，或
在志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2变体序列的A亚基(SEQ ID NO:
7-18)的247-250位。
4.权利要求1-3中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换。
5.权利要求4所述的HER2靶向分子，其中所述弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是用选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基置换精氨酸残基：
丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
6.权利要求5的HER2靶向分子，其中所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸置换，所述置换在志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO:1)、志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1变体的A亚基(SEQ ID NO:4-6)的天然定位的氨基酸残基248和251处；或者在志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2变体的A亚基(SEQ ID NO:7-18)的天然定位的氨基酸残基247和250处；任选地，其中所述弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是用丙氨酸残基置换精氨酸残基。
7.权利要求1-6中任一项所述的HER2靶向分子，其中至少四个内源B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏相对于野生型志贺毒素A亚基包含突变，所述突变在选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组的B细胞表位区域中：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-
48；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254-268位；
和/或在选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组的CD4+T细胞表位区域中：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的34-78；SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258位。
8.权利要求1-7中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位破坏
选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源的B细胞表位区域：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-
48；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254-268位；
和/或选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源的CD4+T细胞表位区域：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的34-78；SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258位。
9.权利要求1-8中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述HER2靶向分子具有降低的B细胞抗原性或免疫原性和/或降低的CD4+T细胞抗原性或免疫原性。
10.权利要求1-9中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述结合区域和所述志贺毒素效应多肽融合形成连续多肽，使得所述结合区域直接或间接与所述志贺毒素A亚基效应多肽的羧基末端相缔合。
11.权利要求1-10中任一项所述的HER2靶向分子，其包含对野生型志贺毒素A亚基内源的至少五个、六个、七个、八个或更多个B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏。
12.权利要求1-11中任一项所述的HER2靶向分子，其中四个所述B细胞和/或CD4+T细胞表位区域破坏中的至少三个包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
13.权利要求1-12中任一项所述的HER2靶向分子，其中至少一个置换发生在选自由以下各项组成的组的天然定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基上：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的6；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的12；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的56；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:
2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:
3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的
186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的
204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID NO:3的
250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251。
14.权利要求13所述的HER2靶向分子，其中所述至少一个置换发生在天然定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基上：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中的59；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251。
15.权利要求13或14所述的HER2靶向分子，其中至少一个置换选自由以下各项组成的组：
D至A,D至G,D至V,D至L,D至I,D至F,D至S,D至Q,D至M,D至R,E至A,E至G,E至V,E至L,E至I,E至F,E至S,E至Q,E至N,E至D,E至M,E至R,F至A,F至G,F至V,F至L,F至I,G至A,G至P,H至A,H至G,H至V,H至L,H至I,H至F,H至M,I至A,I至V,I至G,I至C,K至A,K至G,K至V,K至L,K至I,K至M,K至H,L至A,L至V,L至G,L至C,N至A,N至G,N至V,N至L,N至I,N至F,P至A,P至G,P至F,R至A,R至G,R至V,R至L,R至I,R至F,R至M,R至Q,R至S,R至K,R至H,S至A,S至G,S至V,S至L,S至I,S至F,S至M,T至A,T至G,T至V,T至L,T至I,T至F,T至M,T至S,V至A,V至G,Y至A,Y至G,Y至V,Y至L,Y至I,Y至F,Y至M,和Y至T。
16.权利要求13-15中任一项所述的HER2靶向分子，其中一个或更多个置换选自由如下各项组成的在志贺毒素A亚基中天然位置的置换的组：
K1至A,G,V,L,I,F,M和H；T4至A,G,V,L,I,F,M,和S；D6至A,G,V,L,I,F,S,Q和R；T8至A,G,V,I,L,F,和M；S8至A,G,V,I,L,F,和M；T9至A,G,V,I,L,F,M,和S；S9至A,G,V,L,I,F,和M；
K11至A,G,V,L,I,F,M和H；T12至A,G,V,I,L,F,M,S,和K；S12至A,G,V,I,L,F,和M；S33至A,G,V,L,I,F,M,和C；S43至A,G,V,L,I,F,和M；G44至A或L；S45至A,G,V,L,I,F,和M；T45至A,G,V,L,I,F,和M；G46至A和P；D47至A,G,V,L,I,F,S,M,和Q；N48至A,G,V,L,M和F；L49至A,V,C,和G；Y49至A,G,V,L,I,F,M,和T；F50至A,G,V,L,I,和T；D53至A,G,V,L,I,F,S,和Q；V54至A,G,I,和L；R55至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；G56至A和P；I57至A,G,V,和M；L57至A,V,C,G,M,和F；D58至A,G,V,L,I,F,S,和Q；P59至A,G,和F；E60至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,T,和R；E61至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,和R；G62至A；R84至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；V88至A和G；I88至A,V,C,和G；D94至A,G,V,L,I,F,S,和Q；S96至A,G,V,I,L,F,和M；T104至A,G,V,L,I,F,M；和N；A105至L；T107至A,G,V,L,I,F,M,和P；S107至A,G,V,L,I,F,M,和P；L108至A,V,C,和G；
S109至A,G,V,I,L,F,和M；T109至A,G,V,I,L,F,M,和S；G110至A；S112至A,G,V,L,I,F,和M；
D111至A,G,V,L,I,F,S,Q,和T；S112至A,G,V,L,I,F,和M；D141至A,G,V,L,I,F,S,和Q；G147至A；V154至A和G；R179至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；T180至A,G,V,L,I,F,M,和S；T181至A,G,V,L,I,F,M,和S；D183至A,G,V,L,I,F,S,和Q；D184至A,G,V,L,I,F,S,和Q；L185至A,G,V和C；S186至A,G,V,I,L,F,和M；G187至A；R188至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；S189至A,G,V,I,L,F,和M；D197至A,G,V,L,I,F,S,和Q；D198至A,G,V,L,I,F,S,和Q；R204至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R205至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H；C242至A,G和V；S247至A,G,V,I,L,F,和M；
Y247至A,G,V,L,I,F,和M；R247至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R248至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R250至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R251至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H。
17.权利要求13-16中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述一个或更多个置换选自由如下各项组成的在志贺毒素A亚基中天然位置的置换的组：
K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D197A,D198A,R204A,R205A,C242A,S247I,Y247A,R247A,R248A,R250A,和R251A。
18.权利要求17所述的HER2靶向分子，其中所述一个或更多个置换选自由以下各项组成的在志贺毒素A亚基中天然位置的置换的组：S45I,V54I,R55L,I57F,P59F,E60T,E61L,G110A,C242S,R248A,和R251A。
19.权利要求18所述的HER2靶向分子，其中所述一个或更多个置换选自由以下各项组成的在志贺毒素A亚基中天然位置的置换的组：K1A,S45I,V54I,R55L,I57F,P59F,E60T,E61L,G110A,G147A,R188A,C242S,R248A和R251A。
20.权利要求13-18所述的HER2靶向分子，其中所述一个或更多个置换包含在志贺毒素A亚基中天然位置的置换：S45I,V54I,R55L,I57F,P59F,E60T,E61L,G110A,D141A,R188A,C242S,R248A和R251A。
21.权利要求1-20中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述志贺毒素效应多肽的羧基末端截短破坏所述志贺毒素A2片段区域的羧基末端的弗林蛋白酶切割基序。
22.权利要求1-21中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽包含、基本上组成为或组成为与选自SEQ ID NO:19-21和75-89中任一个的氨基酸序列有至少
85％同一性的氨基酸序列。
23.权利要求22所述的HER2靶向分子，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽包含、基本上组成为或组成为SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列。
24.权利要求1-23中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽能够表现出一种或更多种选自如下的志贺毒素效应子功能：增加细胞内化、引导从内体区室到胞质溶胶的亚细胞按路线发送、避免细胞内降解、催化失活核糖体、实现细胞抑制作用和实现细胞毒性。
25.权利要求1-24中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽能够表现出具有10,000皮摩尔或更低的半最大抑制浓度(IC50)值的核糖体抑制活性。
26.权利要求1-23中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽包含相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基的一个或更多个突变，所述突变改变志贺毒素A亚基效应多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。
27.权利要求26所述的HER2靶向分子，其中相对于天然存在的A亚基，所述改变志贺毒素A亚基效应多肽的酶活性的突变降低或消除了所述志贺毒素A亚基效应多肽的细胞毒性。
28.权利要求1-27中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述免疫球蛋白结合区域包含来源于骆驼科抗体的单链可变片段和/或VHH片段，任选地其中所述VHH片段包含分别在SEQ ID NO:69、70和71所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；或分别在SEQ ID NO:72、73和74所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
29.权利要求1-27中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述免疫球蛋白结合区域包含含至少一个重链可变结构域多肽的单链可变片段，所述重链可变结构域多肽包含：
(i)分别在SEQ ID NO:51、52和53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和(ii)分别在SEQ ID NOs：57、58和59所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3氨基酸序列；或(iii)分别在SEQ ID NO:63、64和65所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
30.权利要求29所述的HER2靶向分子，其中所述免疫球蛋白结合区域包含至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结构域多肽包含：
(i)分别在SEQ ID NO:54、55和56所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；和(ii)分别在SEQ ID NO:60、61和62所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；或(iii)分别在SEQ ID NO:66、67和68所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
31.权利要求29或30所述的HER2靶向分子，其中所述免疫球蛋白结合区域包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链可变结构域多肽通过包含至少12个氨基酸残基的接头与至少一个轻链可变结构域多肽连接，任选地其中所述接头包含选自以下的氨基酸序列：
(G4S)3(SEQ ID NO:180),(G4S)4(SEQ ID NO:177),(G4S)5(SEQ ID NO:92),(G4S)6(SEQ ID NO:178),或(G4S)7(SEQ ID NO:179)。
32.权利要求31所述的HER2靶向分子，其中所述重链可变结构域多肽包含SEQ ID NO:26、29-30或36的氨基酸269至387；
SEQ ID NO:25的氨基酸269至397；或
SEQ ID NO:24或27的氨基酸381至500。
33.权利要求31或权利要求32所述的HER2靶向分子，其中所述轻链可变结构域多肽包含
SEQ ID NO:24或27的氨基酸269至375；
SEQ ID NO:26的氨基酸393至499；
SEQ ID NO:25的氨基酸403至513；
SEQ ID NO:36的氨基酸408至514；或
SEQ ID NO:29或30的氨基酸413至519。
34.权利要求1-33中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述免疫球蛋白结合区域包含、基本上组成为或组成为与以下氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；
SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；
SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；
SEQ ID NO:27的氨基酸269至499；
SEQ ID NO:29的氨基酸269至519；
SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；
SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；
SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；
SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；或
SEQ ID NO:36的氨基酸269至514。
35.权利要求1-34中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述免疫球蛋白结合区域和志贺毒素A亚基效应多肽通过包含一个或更多个氨基酸残基的蛋白性接头融合，任选地其中所述接头包含或组成为：
(G4S)3(SEQ ID NO:180),(G4S)4(SEQ ID NO:177),(G4S)5(SEQ ID NO:92),(G4S)6(SEQ ID NO:178),(G4S)7(SEQ ID NO:179),GSTSGSGKPGSGEGS(SEQ ID NO:93),AHHSEDPSSKAPKAP(SEQ ID NO:95),SPSTPPTPSPSTPPA(SEQ ID NO:181),EFPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO:90),和GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:96)。
36.权利要求1-35中任一项所述的HER2靶向分子，其中在将HER2靶向分子施用至第一细胞群体和第二细胞群以后，相对于所述第二细胞群体的成员，HER2靶向分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性效应为至少3倍高，其中所述第一细胞群的成员表达由所述结合区域结合的HER2，所述第二细胞群体的成员不表达由所述结合区域结合的HER2。
37.权利要求1-36中任一项所述的HER2靶向分子，其中所述HER2靶向分子与参照HER2靶向分子相比能够表现出改善的体内耐受性，其中所述参照HER2靶向分子由HER2靶向分子组成，只是其志贺毒素A亚基效应多肽由野生型志贺毒素A1多肽组成。
38.权利要求1-38中任一项所述的HER2靶向分子，其包含、基本上组成为或组成为与SEQ ID NO:24-36和97-108中任一个显示的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列。
39.权利要求1-25和28-38中任一项所述的HER2靶向分子，其包含、基本上组成为或组成为SEQ ID NO:24-27、29-31、34-36、97-104和106-108中任一个所示的氨基酸序列。
40.权利要求1-39中任一项所述的HER2靶向分子，其为药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。
41.HER2靶向分子，其包含或组成为SEQ ID NO:29或102中所示的氨基酸序列。
42.药物组合物，其包含
i)根据权利要求1-41中任一项所述的HER2靶向分子，和
ii)至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
43.药物组合物，其包含或组成为HER2靶向分子和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，所述HER2靶向分子包含SEQ ID NO:29或102中所示的氨基酸序列。
44.权利要求42或43所述的药物组合物，其中所述至少一种药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、包衣，抗微生物剂、等渗剂或吸收延迟剂；和/或其中所述药物组合物进一步包含水性或非水性载体；表面活性剂；稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、乳化剂、分散剂；等渗剂；和/或抗细菌剂或抗真菌剂。
45.权利要求43或44所述的药物组合物，其进一步包含一种或更多种：柠檬酸盐、山梨糖醇、聚山梨醇酯20、氯化物或钠。
46.诊断组合物，其包含
i)根据权利要求1-41中任一项所述的HER2靶向分子和
ii)检测促进剂。
47.能够编码权利要求1-41中任一项所述的HER2靶向分子的多核苷酸，或其互补物。
48.表达载体，其包含根据权利要求47所述的多核苷酸。
49.宿主细胞，其包含根据权利要求47的多核苷酸或根据权利要求48的表达载体。
50.杀伤HER2表达细胞的方法，所述方法包括步骤
将所述细胞与根据权利要求1-41中任一项所述的HER2靶向分子或根据权利要求42-45中任一项所述的药物组合物接触。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述接触在体内发生。
52.治疗患者的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括步骤
向有此需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的HER2靶向分子，或根据权利要求42-45中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病、病症或病况的特征在于与HER2/neu/ErbB2物理偶联的细胞。
53.权利要求52的方法，其中当向有此需要的患者施用治疗有效量的所述HER2靶向分子时，所述方法进一步包括向有此需要的患者施用治疗有效量的另外的HER2靶向治疗剂。
54.权利要求53的方法，其中所述另外的HER2靶向治疗剂包含双酪氨酸激酶抑制剂；任选地，其中所述抑制剂包含拉帕替尼和/或奈拉替尼。
55.权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述另外的HER2靶向治疗剂包含抗HER2抗体，所述抗HER2抗体结合HER2中的抗原决定簇，所述HER2中的抗原决定簇不与所述HER2靶向分子结合的HER2中的抗原决定簇重叠。
56.权利要求55所述的方法，其中所述另外的HER2靶向治疗剂包括：T-DM1、曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗。
57.权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述患者先前已经用至少一种其他的HER2靶向治疗剂治疗；任选地，其中所述至少一种其他的HER2靶向治疗剂选自：拉帕替尼、奈拉替尼、T-DM1、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
58.权利要求52-57中任一项所述的方法，其中所述患者不响应，或不受益于用至少一种其他的HER2靶向治疗剂的治疗；任选地，其中所述至少一种其他的HER2靶向治疗剂选自：
拉帕替尼、奈拉替尼、T-DM1、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
59.权利要求52-58中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病况是癌症或肿瘤；任选地，其中所述疾病、病症或病况选自：
乳腺癌、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、妇科癌、头颈癌、肾泌尿道癌和肺/胸膜癌，例如子宫内膜癌、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和睾丸癌。
60.一种用于治疗或预防癌症、肿瘤或生长异常的组合物，其包含根据权利要求1-41中任一项所述的HER2靶向分子，或权利要求42-45中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症、肿瘤或生长异常的特征在于与HER2/neu/ErbB2物理偶联的细胞。
61.根据权利要求1-49中任一项所述的物质的组合物在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤或生长异常的药物中的用途。
62.根据权利要求1-49中任一项所述的物质的组合物在疾病、病症或病况的诊断、预后或表征中的用途。
63.试剂盒，其包含根据权利要求1-49中任一项所述的物质的组合物和另外的试剂和/或药物递送装置。

说明书全文

包含去免疫化的志贺毒素A亚基支架的HER2靶向分子

技术领域

[0001] 本发明涉及包含志贺毒素效应多肽的HER2靶向分子，所述志贺毒素效应多肽来源于天然存在的志贺毒素的A亚基，所述HER2靶向分子包含提供(1)去免疫化，(2)蛋白酶敏感
性减少，和/或(3)嵌入的T细胞表位的突变组合；其中所述志贺毒素效应多肽保留一种或更
多种志贺毒素功能，如，例如强效的细胞毒性。本发明的HER2靶向分子可用于施用至多细胞
生物，例如，当需要(1)消除或减少非特异性毒性和/或(2)消除或减少某些免疫应答时。本
发明的HER2靶向分子可用于(1)选择性杀伤其他细胞中的特异性HER2阳性细胞类型和(2)
用作治疗涉及包括癌症和肿瘤的HER2表达细胞的多种疾病、病症和病况的治疗分子。

背景技术

[0002] HER2是一种特别有吸引力的用于治疗的分子靶点，因为它在肿瘤和/或癌细胞表面的过表达、其与预后不良的相关性和其在肿瘤发生和癌症发展中的功能性作用，如侵袭
性和转移，以及抗肿瘤药物抗性(Nielsen D等,Breast 22:1-12(2013)； A,
Pandiella A,Curr Pharm Des 19:808-17(2013))。

[0003] HER2(人表皮生长因子受体2)是ErbB家族的I型跨膜酪氨酸激酶受体(Yamamoto T等,Nature 319:230-4(1986)；Slamon D等,Science 235:177-82(1987))。ErbB家族的成员
是整合的糖蛋白，其通过与作为二聚体的生长因子配体结合来调节细胞生长、分化和存活
(Chantry A，J Biol Chem 270：3068-73(1995))。

[0004] HER2与某些乳腺癌以及其他癌症的发病机制、进展和预后显著相关(Citri A,Yarden Y,Nat Rev Mol Cell Biol 7:505-16(2006))。发现编码HER2的原癌基因HER2在乳
腺癌细胞中扩增和过表达(King等,Science 229:974-6(1985)；Slamon等人Science 235:
177-82(1987))。HER2的扩增和/或过表达发生在大约15-30％的乳腺癌中，并且HER2在乳腺
癌中的存在与侵袭性恶性肿瘤、疾病复发增加和预后不良密切相关(Slamon D等人,
Science244:707-12(1989))；Bernstein H,N Engl J Med 353:1652-4(2005)；Pritchard
I等,N Engl J Med 354:2103-11(2006)；Tan M,Yu D,Adv Exp Med Biol 608:119-29
(2007)；Mitri Z等,Chemother Res Pract 2012:743193(2012))。

[0005] HER2在许多其他多种癌症中过表达，并且通常可在功能上促成肿瘤发生。HER2过表达在乳腺癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，胃癌，头颈癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌和睾丸生殖细胞肿瘤细胞中观察到(Kern J等人,Cancer Res 50:5184-7(1990)；
Natali P等人,Int J Cancer45:457-61(1990)；Jaehne J等人,J Cancer Res Clin Oncol
118:474-9(1992)；Signoretti S等人,J Natl Cancer Inst 92:1918-25(2000)；Di
Lorenzo G等人,Clin Cancer Res 8:3438-44(2002)；Owens M等人,Clin Breast Cancer
5:63-9(2004)；Roskoski R,Biochem Biophys Res Commun 319:1-11(2004)；Cohen G等
人,Cancer Res 66:5656-64(2006)；Santin A等人,Int J Gynaecol Obstet 102:128–31
(2008)；Vermeij J等人,BMC Cancer 8:3(2008)；Chen P等人,J Clin Pathol 66:113-9
(2013)；Chou等人,Genome Med 5:78(2013)；Cros J等人,Ann Oncol 24:2624-9(2013)；
A等人,Anticancer Res 33:4975-82(2013)；Sugishita Y等人,Int J Oncol 42:
1589-96(2013))。另外，HER2在肿瘤细胞中的过表达可赋予抗肿瘤剂药物抗性(Koutras A
等人,Crit Rev Oncol Hematol 74:73-8(2010))。

[0006] 迫切需要新的治疗方法来补充目前对含HER2赘生物的治疗。因此，会需要具有靶向HER2的细胞毒性细胞靶向分子，其用于作为治疗分子以治疗多种疾病，例如癌症和肿瘤，
其可通过选择性杀伤HER2阳性细胞或向HER2阳性细胞中递送有益物质来治疗。特别是，会
需要具有HER2结合、细胞毒性的细胞靶向分子，其表现出低的抗原性和/或免疫原性、低脱
靶毒性和强效的细胞毒性。此外，会需要具有HER2靶向治疗和/或诊断的分子，其表现出低
抗原性和/或免疫原性、低脱靶毒性、高稳定性和/或递送肽-表位货物的能力用于通过靶细
胞的MHC I类系统的呈递。例如，会需要具有包含志贺毒素A亚基来源的组分的细胞毒性
HER2靶向分子，其维持对靶细胞的强效的细胞毒性，同时1)降低不需要的抗原性和/或免疫
原性的可能性，2)降低非特异性毒性的可能性，3)允许在宽范围的剂量下的药物耐受性，4)
允许在重复施用后的药物耐受性，和5)在一种或更多种额外的HER2靶向疗法的存在下保留
有效性。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明的HER2靶向分子的志贺毒素A亚基来源的组分各自包含特征的组合(例如，去免疫化的亚区和蛋白酶-切割抗性亚区)。本发明的某些组合志贺毒素效应多肽更有用，
因为它们在单一多肽中提供几种志贺毒素效应子功能，例如促进细胞内化，引导亚细胞按
路线发送(routing)至胞质溶胶，核糖体失活和/或将货物运送到亚细胞隔室。本发明的某
些HER2靶向分子更有用，因为它们在单个分子中提供若干特性的组合，例如有效的细胞内
化，强效的细胞靶向细胞毒性，选择性细胞毒性，去免疫化，在高剂量下非特异性毒性，高稳
定性，CD8+T细胞超免疫，和/或5)在一种或更多种另外的HER2靶向疗法存在下保留有效性。
下面参考编号为#1-3的实施方案组描述本发明的HER2靶向分子的不同实施方案。

[0009] 实施方案组#1-包含去免疫化的志贺毒素效应多肽的HER2靶向分子，所述去免疫化的志贺毒素效应多肽包含嵌入或插入的异源性T细胞表位和非重叠的去免疫化亚区

[0010] 本发明提供细胞靶向分子，每个细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子(HER2/neu/ErbB2)的结合区域和(ii)去免疫化的志贺毒素A亚基效应多肽。例如，
组#1的某些实施方案是细胞靶向分子，所述细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外
靶生物分子的结合区域和(ii)包含志贺毒素A1片段区域和羧基末端的去免疫化的志贺毒
素效应多肽，其中志贺毒素A亚基效应多肽包含：(a)至少一个插入或嵌入的异源性表位；和
(b)至少一个破坏的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域，其不与嵌入或插入的异源性T
细胞表位重叠。对于某些进一步的实施方案，志贺毒素效应多肽能够表现出至少一种志贺
毒素效应子功能，如，例如，引导细胞内按路线发送至内质网和/或存在多肽的细胞的胞质
溶胶，抑制核糖体功能，酶促失活核糖体，引起白细胞淤积和/或引起细胞毒性。相对于野生
型志贺毒素A亚基，实施方案组#1的志贺毒素效应多肽可在其羧基末端截短，导致消除一种
或更多种内源B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。实施方案组#1的志贺毒素效应多肽可以在
A1片段区域的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，与野生型志
贺毒素A亚基的羧基末端相比，通过志贺毒素效应多肽的羧基端截短破坏弗林蛋白酶切割
基序。例如，本发明提供了包含志贺毒素A1片段区域和羧基末端的志贺毒素效应多肽，其中
志贺毒素A亚基效应多肽包含：(a)嵌入或插入的异源性表位；(b)至少一种内源性B细胞和/
或CD4+T细胞表位区域的破坏；和(c)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白
酶切割基序；其中志贺毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能。在进一步的实
例中，本发明提供了包含志贺毒素A1片段区域和羧基末端的志贺毒素A亚基效应多肽，其中
志贺毒素A亚基效应多肽包含(a)嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位，其破坏内源性B细胞
和/或CD4+T细胞表位区域；(b)至少四种内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，其
不与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位重叠；和(c)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端破
坏的弗林蛋白酶切割基序；并且其中志贺毒素A亚基效应多肽相对于野生型志贺毒素A亚基
在其羧基末端截短，导致一个或更多个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的消除；其中
志贺毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能。因此，本发明提供了HER2靶向分
子，其包含：(i)免疫球蛋白结合区域，其能够特异性结合HER2/neu/ErbB2的细胞外部分，并
且包含以下一种或更多种：抗体可变片段，单一结构域抗体片段，单链可变片段，Fd片段，抗
原结合片段，自主VH结构域，来自骆驼抗体的VHH片段，来自软骨鱼抗体的重链抗体结构域，
VNAR片段和免疫球蛋白新抗原受体；和ii)包含志贺毒素A1片段区域和羧基末端的志贺毒
素A亚基效应多肽，其中志贺毒素A亚基效应多肽包含(a)嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表
位，其破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域；(b)至少四种内源性B细胞和/或CD4+T细
胞表位区域的破坏，其不与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位重叠；和(c)在志贺毒素A1
片段区域的羧基末端破坏的弗林蛋白酶切割基序；并且其中志贺毒素A亚基效应多肽相对
于野生型志贺毒素A亚基在其羧基末端截短，导致一个或更多个内源性B细胞和/或CD4+T细
胞表位区域的消除；其中志贺毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能。对于某
些进一步的实施方案，当细胞靶向分子在被引入到细胞时能够表现出与参照分子(例如，由
细胞靶向分子组成的第二细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分在其A1片段区
域的羧基末端包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相当或更好的细胞毒性。

[0011] 对于实施方案组#1的某些实施方案，与参照分子(例如野生型志贺毒素A亚基或由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分各自包含野生
型志贺毒素A1片段)相比，细胞靶向分子表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫原性。

[0012] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应多肽直接或间接连接在一起。

[0013] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域包含含有免疫球蛋白或免疫球蛋白型结合区域的多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的
多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片段(sdAb)，来源于骆驼抗体的重链抗体
结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，
免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补
决定区3片段(CDR3)，受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，小模块化免疫
药物(SMIP)结构域，抗原结合片段(Fab)，犰狳重复多肽(ArmRP)，纤连蛋白衍生的第10个纤
连蛋白III型结构域(10Fn3)，肌腱蛋白III型结构域(TNfn3)，锚蛋白重复基序结构域，低密
度脂蛋白受体衍生的A结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalin)，Kunitz结构域，蛋白
质-A-衍生的Z结构域，gamma-B晶体蛋白衍生的结构域，泛素衍生的结构域，Sac7d衍生的多
肽(affitin)，Fyn衍生的SH2结构域，小蛋白(miniprotein)，C型凝集素样结构域支架，经工
程改造的抗体模拟物，以及保留结合功能的任何前述的任何遗传操作的对应物。在某些实
施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片
段(sdAb)，衍生自骆驼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来自软
骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片
段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，Fd片段，和抗原结合片段(Fab)。在某些实施
方案中，本发明的细胞靶向分子包含能够特异性结合HER2/neu/ErbB2的细胞外部分的免疫
球蛋白结合区域，并且包含以下一种或更多种：抗体可变片段，单结构域抗体片段，单链可
变片段，Fd片段，抗原结合片段，自主VH结构域，来源于骆驼科动物抗体的VHH片段，来源于
软骨鱼抗体的重链抗体结构域，VNAR片段，和免疫球蛋白新抗原受体。在某些实施方案中，
结合区域包含单链可变片段(scFv)，基本上由或由单链可变片段(scFv)组成。在某些实施
方案中，结合区域包含单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，结合区域包含衍生自骆驼
科动物抗体的VHH片段、基本上由其组成或由其组成。

[0014] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应多肽直接或间接融合，形成连续多肽，使得结合区域直接或间接与志贺毒素效应多肽的羧基末端缔合。

[0015] 对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应多肽相当的催化活性水平，(ii)具有10,000皮
摩尔或更低的半最大抑制浓度(IC50)值的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒
素催化活性。

[0016] 对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子和/或其志贺毒素效应多肽是(i)能够表现出与参照细胞靶向分子(例如，由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向
分子，只是所有其志贺毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段)相当的亚细胞
按路线发送效率，和/或(ii)能够表现出从细胞的内体起始位置到内质网和/或胞质溶胶的
显著水平的细胞内按路线发送活性。

[0017] 对于实施方案组#1的某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用至与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，所述细胞靶向分子能够导致细
胞死亡。对于某些进一步的实施方案，将本发明的细胞靶向分子施用至两种在细胞外靶生
物分子的存在或水平方面不同的细胞类型的群体，细胞靶向分子能够导致与细胞毒性细胞
靶向分子的结合区域的细胞外靶标生物分子物理偶联的细胞类型的细胞死亡，其CD50比针
对没有与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的CD50小
至少三倍。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用至其成员与所述细胞靶
向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的第一细胞群体，以及其成员不与所述结
合区域的细胞外靶生物分子的任何一个物理偶联的第二细胞群体，细胞靶向分子对所述第
一细胞群体的成员的细胞毒性作用相对于对所述第二细胞群体的成员的细胞毒性作用至
少高3倍。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用至其成员与所述细胞靶向
分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的第一细胞群体，以及其成员不与显著量的
所述结合区域的细胞外靶生物分子的任何一个物理偶联的第二细胞群体，细胞靶向分子对
所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用相对于对所述第二细胞群体的成员的细胞毒性
作用至少3倍高。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用于靶生物分子阳性
细胞的第一群体，以及其成员不在细胞表面表达显著量的细胞靶向分子的结合区域的靶生
物分子的第二细胞群体，相对于第二细胞群体的成员，该细胞靶向分子对第一细胞群的成
员的细胞毒性作用为至少3倍高。

[0018] 对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在被引入至细胞时能够表现出具有300nM或更低的半最大抑制浓度(CD50)的细胞毒性，和/或能够表现出显著水
平的志贺毒素细胞毒性。对于某些进一步的实施方案，与参照分子(例如野生型志贺毒素A
亚基或由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分各自
包含野生型志贺毒素A1片段)相比，细胞靶向分子表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫
原性。

[0019] 在实施方案组#1的某些实施方案中，异源性T细胞表位是CD8+T细胞表位，诸如，例如关于人免疫系统。对于某些进一步的实施方案，异源性T细胞表位能够由细胞的MHC I类
分子呈递。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多
种：进入细胞，抑制核糖体功能，引起白细胞淤积，导致细胞死亡，和/或递送嵌入或插入的
异源性T细胞表位至MHC I类分子用于在细胞表面上呈递。对于某些进一步的实施方案，当
细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出与参照分子(例如，由细胞靶向分子组成的第三
细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段)相当
或更好的细胞毒性。

[0020] 对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径用于由MHC I类分子结合的表位的细
胞表面呈递。

[0021] 在实施方案组#1的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。

[0022] 对于实施方案组#1的某些实施方案，当本发明的细胞靶向分子被引入至脊索动物时能够表现出与参照分子(诸如，例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只是全
部其志贺毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域的羧基末
端上的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相比改善的体内耐受性和/或稳定性。在某些
进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽不是细胞毒性的，且分子部分是细胞毒性的。

[0023] 在实施方案组#1的某些实施方案中，细胞靶向分子包含与志贺毒素效应多肽的羧基末端缔合的分子部分。在某些实施方案中，该分子部分包含结合区域或由结合区域组成。
在某些实施方案中，分子部分包含至少一个氨基酸，且志贺毒素效应多肽与分子部分的至
少一个氨基酸残基连接。在某些进一步的实施方案中，分子部分和志贺毒素效应多肽融合
形成连续的多肽。

[0024] 在实施方案组#1的某些实施方案中，细胞靶向分子进一步包含与志贺毒素效应多肽的羧基末端缔合的细胞毒性分子部分。对于某些实施方案，细胞毒性分子部分是细胞毒
性剂，例如技术人员已知或本文所述的小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、烷
化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于某些进一步的实施方案，细
胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pM的浓度下具有细胞毒性。

[0025] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域通过至少一个不是二硫键的共价键直接或间接连接到志贺毒素效应多肽。在某些进一步的实施方案中，结合区域直接或间接
地融合至志贺毒素效应多肽的羧基末端，以形成单个连续多肽。在某些其他实施方案中，结
合区域是免疫球蛋白或免疫球蛋白型结合区域。

[0026] 在实施方案组#1的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序相对于野生型志贺毒素A亚基在最小的弗林蛋白酶切割位点包含的一个或更多个突变。在某些实施方案中，
破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部
分或全部重叠的序列的氨基末端截短。在某些实施方案中，最小的弗林蛋白酶切割位点中
的突变是R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中的至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/
或置换。在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺
毒素A亚基的至少一个突变，该突变改变天然位于(1)志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO:1)、
志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1变体序列的A亚基(例如SEQ ID NO:4-
6)的248-251处；或(2)志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2变体序列的A亚
基(例如，SEQ ID NO:7–18)的247-250处，或任何志贺毒素A亚基中的等同氨基酸序列位置
的区域中的至少一个氨基酸残基。在某些进一步的实施方案中，突变是用非带正电荷的氨
基酸残基置换精氨酸残基的氨基酸残基置换。

[0027] 在实施方案组#1的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6和37中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18和75-89中
任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1-6、37和75-89中任一个的氨基酸1-251；或(iv)
SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插
入的异源性T细胞表位和至少一个(两个、三个、四个或更多个)破坏的、内源性B细胞和/或
CD4+T细胞表位区域，所述表位区域与嵌入或插入的异源性T细胞表位不重叠。

[0028] 在实施方案组#1的某些实施方案中，当本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出与参照分子(例如，由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向分子，只是全部其志贺毒
素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段)相当的细胞毒性。

[0029] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53
中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一种轻链可变结构域多肽，所述轻链可
变结构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56中所示的
LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所
述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中所
示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一种轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结
构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所示的LCDR1、
LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链
可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所示的
HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一种轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结构域
多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68中所示的LCDR1、LCDR2
和LCDR3氨基酸序列。具有这些CDR的结合区域可以是包含单链可变片段的免疫球蛋白结合
区域。

[0030] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域可以包含含选自由以下各项组成的组的多肽的结合区域：a)仅重链可变结构域(VHH)，其包含(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO:69
或SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列或基本上由其组成；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO:70或
SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列或基本上由其组成；和(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO:71
或SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列或基本上由其组成。具有这些CDR的结合区域可以是包
含来源于骆驼科动物抗体的仅含重链的可变结构域(VHH)的免疫球蛋白结合区域。

[0031] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域可包含：(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:26、29、30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的氨基酸269至397；SEQ ID NO:24或27的氨基酸381至500；SEQ ID NO:36的氨基
酸401至522，或SEQ ID NO:28的氨基酸401至520；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其
包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:24、27或28的氨基酸269至375；SEQ ID NO:26的
氨基酸393至499；SEQ ID NO:25的氨基酸403至513；SEQ ID NO:36的氨基酸408至514；和
SEQ ID NO:29或30的氨基酸413至519。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结
构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:29的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻
链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:29的氨基酸413至519。例
如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：
SEQ ID NO:36的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组
成为或组成为：SEQ ID NO:36的氨基酸408至514。

[0032] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域包含由以下多肽序列中的任一个表示的多肽，基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的
氨基酸269至499；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基
酸268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；或SEQ ID
NO:36的氨基酸269至514。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:29的氨基酸269至519表示的多
肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:102的氨基酸268至518
表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:31的氨基酸
268至386表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:34的
氨基酸253至370表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID
NO:35的氨基酸253至367表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由
SEQ ID NO:36的氨基酸269至514表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。

[0033] 在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在实施方案组#1的某些实施
方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:29、31、34、35、36、102、104和106-108中任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶
向分子还包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子
包含SEQ ID NO:29或102中所示的多肽，基本上由其组成或由其组成。

[0034] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。

[0035] 在实施方案组#1的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些其他实施方案中，分子部分包含结合区域。

[0036] 在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些进一步的实施方案中，结
合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、
28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更高。

[0037] 在实施方案组#1的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记载的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/
或细胞内按路线发送)即可。

[0038] 在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、
30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记
载的志贺毒素生物活性即可。

[0039] 在实施方案组#1的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽的氨基末端位于细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端处和/或其邻近。在某些进一步的实施方案中，相对于志贺毒素
效应多肽，结合区域不位于细胞靶向分子的氨基末端的近侧。在某些另外的实施方案中，结
合区域和志贺毒素效应多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不位于志贺
毒素效应多肽的氨基末端的近侧。在某些进一步的实施方案中，结合区域位于更邻近志贺
毒素效应多肽的羧基末端而不是志贺毒素效应多肽的氨基末端的细胞靶向分子内。对于某
些进一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子在被引入至细胞时能够表现出比第三细胞靶
分子更大的细胞毒性，所述第三细胞靶分子具有氨基末端并包含结合区域和志贺毒素效应
多肽，所述志贺毒素效应多肽不位于第三细胞靶向分子的氨基末端或其邻近。对于某些进
一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒
性，诸如和第三细胞靶向分子的细胞毒性相比4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。对于某
些进一步的实施方案，如CD50值所测定的，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞
毒性是第三细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8
倍、9倍、10倍或更大。在某些进一步的实施方案中，第三细胞靶向分子不包含KDEL家族的任
何羧基末端内质网保留/回收信号基序(例如，SEQ ID NO:109)。

[0040] 在实施方案组#1的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽的氨基末端位于细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端处和/或其邻近。在某些进一步的实施方案中，相对于志贺毒素
效应多肽，结合区域不位于细胞靶向分子的氨基末端的近侧。在某些另外的实施方案中，结
合区域和志贺毒素效应多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不位于志贺
毒素效应多肽的氨基末端的近侧。在某些进一步的实施方案中，结合区域位于更邻近志贺
毒素效应多肽的羧基末端而不是志贺毒素效应多肽的氨基末端的细胞靶向分子内。对于某
些进一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，并且，与参照分子(例如第
五细胞靶向分子，其具有氨基末端并且包含结合区域和志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素
效应多肽不位于第五细胞靶向分子的氨基末端或其邻近)的细胞毒性相比，在被引入细胞
时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室更高的亚细胞按路线发
送效率。在某些进一步的实施方案中，第五细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基末端
内质网保留/回收信号基序。

[0041] 在实施方案组#1的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽的氨基末端位于细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端处和/或其邻近。在某些进一步的实施方案中，相对于志贺毒素
效应多肽，结合区域不位于细胞靶向分子的氨基末端的近侧。在某些另外的实施方案中，结
合区域和志贺毒素效应多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不位于志贺
毒素效应多肽的氨基末端的近侧。在某些进一步的实施方案中，结合区域位于更邻近志贺
毒素效应多肽的羧基末端而不是志贺毒素效应多肽的氨基末端的细胞靶向分子内。对于某
些进一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低细胞毒性效力(即，在被引入某些阳
性靶细胞类型时不能够表现出在细胞靶向分子浓度为1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM下
细胞群体的大于1％的细胞死亡的细胞毒性的能力)，并且，与参照细胞靶向分子(例如第五
细胞靶向分子，其具有氨基末端并且包含结合区域和志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效
应多肽不位于第五细胞靶向分子的氨基末端或其邻近)的细胞毒性相比，当被引入细胞时
能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室更高的亚细胞按路线发送
效率。在某些进一步的实施方案中，第五细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基末端内
质网保留/回收信号基序。

[0042] 在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子，或其多肽组分，包含KDEL家族成员的羧基末端内质网保留/回收信号基序。对于某些进一步的实施方案，羧基末
端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:109),HDEF(SEQ
ID NO:110),HDEL(SEQ ID NO:111),RDEF(SEQ ID NO:112),RDEL(SEQ ID NO:113),WDEL
(SEQ ID NO:114),YDEL(SEQ ID NO:115),HEEF(SEQ ID NO:116),HEEL(SEQ ID NO:117),
KEEL(SEQ ID NO:118),REEL(SEQ ID NO:119),KAEL(SEQ ID NO:120),KCEL(SEQ ID NO:
121),KFEL(SEQ ID NO:122),KGEL(SEQ ID NO:123),KHEL(SEQ ID NO:124),KLEL(SEQ ID
NO:125),KNEL(SEQ ID NO:126),KQEL(SEQ ID NO:127),KREL(SEQ ID NO:128),KSEL(SEQ
ID NO:129),KVEL(SEQ ID NO:130),KWEL(SEQ ID NO:131),KYEL(SEQ ID NO:132),KEDL
(SEQ ID NO:133),KIEL(SEQ ID NO:134),DKEL(SEQ ID NO:135),FDEL(SEQ ID NO:136),
KDEF(SEQ ID NO:137),KKEL(SEQ ID NO:138),HADL(SEQ ID NO:139),HAEL(SEQ ID NO:
140),HIEL(SEQ ID NO:141),HNEL(SEQ ID NO:142),HTEL(SEQ ID NO:143),KTEL(SEQ ID
NO:144),HVEL(SEQ ID NO:145),NDEL(SEQ ID NO:146),QDEL(SEQ ID NO:147),REDL(SEQ
ID NO:148),RNEL(SEQ ID NO:149),RTDL(SEQ ID NO:150),RTEL(SEQ ID NO:151),SDEL
(SEQ ID NO:152),TDEL(SEQ ID NO:153),SKEL(SEQ ID NO:154),STEL(SEQ ID NO:155),
和EDEL(SEQ ID NO:156)。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细
胞时能够表现出比参照分子(例如，由细胞靶向分子组成的第六细胞靶向分子，只是其不包
含KDEL家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序)的细胞毒性更大的细胞毒性。在某
些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出与第六细胞靶向分子相比具有
更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，诸如4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些
进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子与第六细胞靶向分子相比能够表现出具有更
好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，诸如4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些进
一步的实施方案中，如CD50值所测定的，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒
性是第六细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。

[0043] 实施方案组#2-包含志贺毒素效应物多肽的HER2靶向分子，所述志贺毒素效应物多肽包含(i)嵌入或插入的异源性T细胞表位和(ii)破坏的弗林蛋白酶切割基序

[0044] 本发明提供细胞靶向分子，其各自包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子(HER2/neu/ErbB2)的结合区域和(ii)包含插入或嵌入的异源性表位的志贺毒素A亚基效应
多肽；和(iii)破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包
含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含志贺毒素A1片段衍生区域
和羧基末端的志贺毒素效应多肽，其中志贺毒素效应多肽包含：(a)插入或嵌入的异源性表
位；(b)在A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。对于某些进一步的实施方
案，志贺毒素效应多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，如，例如，引导细胞内按
路线发送至存在所述多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶，抑制核糖体功能，酶促失活核糖
体，引起白细胞淤积和/或引起细胞毒性。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基的羧
基末端相比，通过志贺毒素效应多肽的羧基端截短破坏弗林蛋白酶切割基序。相对于野生
型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应多肽可在其羧基末端截短，导致一个或更多个内源B细胞
和/或CD4+T细胞表位区域的消除。实施方案组#2的志贺毒素效应多肽可以进一步包含至少
一个破坏的、内源B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。在某些实施方案中，至少一个破坏的、内
源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域不与嵌入或插入的异源性表位重叠。例如，本发明提供
了包含志贺毒素A1片段区域和羧基末端的志贺毒素效应多肽，其中志贺毒素A亚基效应多
肽包含：(a)嵌入或插入的异源性表位；(b)至少一种内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域
的破坏；和(c)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中志贺
毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能。在进一步的实例中，本发明提供了包
含志贺毒素A1片段区域和羧基末端的志贺毒素A亚基效应多肽，其中志贺毒素A亚基效应多
肽包含(a)嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位，其破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位
区域；(b)至少四个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，其不与嵌入或插入的异
源性CD8+T细胞表位重叠；和(c)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端破坏的弗林蛋白酶切割
基序；其中志贺毒素A亚基效应多肽相对于野生型志贺毒素A亚基在其羧基末端截短，导致
一个或更多个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的消除；其中志贺毒素A亚基效应多肽
能够表现出志贺毒素效应子功能。在某些进一步的实施方案中，异源性T细胞表位是CD8+T
细胞表位，诸如，例如关于人免疫系统。对于某些进一步的实施方案，异源性T细胞表位能够
由细胞的MHC I类分子呈递。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行
以下一种或更多种：进入细胞，抑制核糖体功能，引起白细胞淤积，导致细胞死亡，和/或递
送嵌入或插入的异源T细胞表位至MHC I类分子用于在细胞表面上呈递。对于某些进一步的
实施方案，当细胞靶向分子在被引入到细胞时能够表现出与参照分子(例如，由细胞靶向分
子组成的第二细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分在其A1片段区域的羧基末
端包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相当或更好的细胞毒性。

[0045] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应多肽直接或间接连接在一起。

[0046] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域包含含有免疫球蛋白或免疫球蛋白型结合区域的多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的
多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片段(sdAb)，来源于骆驼抗体的重链抗体
结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，
免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补
决定区3片段(CDR3)，受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，小模块化免疫
药物(SMIP)结构域，抗原结合片段(Fab)，犰狳重复多肽(ArmRP)，纤连蛋白衍生的第10个纤
连蛋白III型结构域(10Fn3)，肌腱蛋白III型结构域(TNfn3)，锚蛋白重复基序结构域，低密
度脂蛋白受体衍生的A结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalin)，Kunitz结构域，蛋白
质-A-衍生的Z结构域，gamma-B晶体蛋白衍生的结构域，泛素衍生的结构域，Sac7d衍生的多
肽(affitin)，Fyn衍生的SH2结构域，小蛋白(miniprotein)，C型凝集素样结构域支架，经工
程改造的抗体模拟物，以及保留结合功能的任何前述的任何遗传操作的对应物。在某些实
施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片
段(sdAb)，衍生自骆驼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来自软
骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片
段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，Fd片段，和抗原结合片段(Fab)。在某些实施
方案中，本发明的细胞靶向分子包含能够特异性结合HER2/neu/ErbB2的细胞外部分的免疫
球蛋白结合区域，并且包含以下一种或更多种：抗体可变片段，单结构域抗体片段，单链可
变片段，Fd片段，抗原结合片段，自主VH结构域，来源于骆驼抗体的VHH片段，来源于软骨鱼
抗体的重链抗体结构域，VNAR片段，和免疫球蛋白新抗原受体。在某些实施方案中，结合区
域包含、基本上组成为或组成为单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，结合区域包含单
链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，结合区域包含衍生自骆驼抗体的VHH片段、基本上
由其组成或由其组成。

[0047] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应多肽直接或间接融合，形成连续多肽，使得结合区域直接或间接与志贺毒素效应多肽的羧基末端缔合。

[0048] 在实施方案组#2的某些实施方案中，嵌入或插入的异源性T细胞表位破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域，所述表位区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素
A亚基区域：(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的
26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID
NO:3的42-48；和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66位，或志贺毒素A亚基或
其衍生物中的等同区域；(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；
和SEQ ID NO:3的210-218；和(iii)SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的262-278；SEQ ID NO:3的
281-297；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同
区域。

[0049] 在实施例组#2的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或更多个突变，该突变改变天然位于(1)志贺样毒素1的A亚基(SEQ
ID NO:1)、志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1变体序列的A亚基(例如SEQ
ID NO:4-6)的248-251处；或(2)志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2变体序
列的A亚基(例如，SEQ ID NO:7–18)的247-250处；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区
域中的至少一个氨基酸残基。在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序在
弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含相对于野生型志贺毒素A亚基的一
个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列
R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。

[0050] 在实施方案组#2的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6和37中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18和75-89中
任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1-6、37和75-89中任一个的氨基酸1-251；或(iv)
SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插
入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A片段来源区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割
基序。

[0051] 在实施方案组#2的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。

[0052] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。

[0053] 在实施方案组#2的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些其他实施方案中，分子部分包含结合区域。

[0054] 在实施方案组#2的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些进一步的实施方案中，结
合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、
28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更高。

[0055] 在实施方案组#2的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记载的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/
或细胞内按路线发送)即可。

[0056] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、
30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记
载的志贺毒素生物活性即可。

[0057] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53
中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可
变结构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56中所示的
LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所
述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中所
示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结
构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所示的LCDR1、
LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链
可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所示的
HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结构域
多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68中所示的LCDR1、LCDR2
和LCDR3氨基酸序列。具有这些CDR的结合区域可以是包含单链可变片段的免疫球蛋白结合
区域。

[0058] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域可以包含含选自由以下各项组成的组的多肽的结合区域：a)仅重链可变结构域(VHH)，其包含(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO:69
或SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列或基本上由其组成；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO:70或
SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列或基本上由其组成；和(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO:71
或SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列或基本上由其组成。具有这些CDR的结合区域可以是包
含来源于骆驼抗体的仅重链可变结构域(VHH)的免疫球蛋白结合区域。

[0059] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域可包含：(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:26、29、30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的氨基酸269至397；SEQ ID NO:24或27的氨基酸381至500；SEQ ID NO:36的氨基
酸401至522，或SEQ ID NO:28的氨基酸401至520；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其
包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:24、27或28的氨基酸269至375；SEQ ID NO:26的
氨基酸393至499；SEQ ID NO:25的氨基酸403至513；SEQ ID NO:36的氨基酸408至514；和
SEQ ID NO:29或30的氨基酸413至519。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结
构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:29的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻
链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:29的氨基酸413至519。例
如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：
SEQ ID NO:36的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组
成为或组成为：SEQ ID NO:36的氨基酸408至514。

[0060] 在实施方案组#2的某些实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为由以下多肽序列中的任一个表示的多肽：SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨
基酸269至499；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基酸
268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；或SEQ ID
NO:36的氨基酸269至514。例如，结合区域包含、基本上组成为或组成为由SEQ ID NO:29的
氨基酸269至519表示的多肽。例如，结合区域包含、基本上组成为或组成为由SEQ ID NO:
102的氨基酸268至518表示的多肽。例如，结合区域包含、基本上组成为或组成为由SEQ ID
NO:31的氨基酸268至386表示的多肽。例如，结合区域包含、基本上组成为或组成为由SEQ
ID NO:34的氨基酸253至370表示的多肽。例如，结合区域包含、基本上组成为或组成为由
SEQ ID NO:35的氨基酸253至367表示的多肽。例如，结合区域包含、基本上组成为或组成为
由SEQ ID NO:36的氨基酸269至514表示的多肽。

[0061] 在实施方案组#2的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个所示多肽。在实施方案组#2的某些实施方案
中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:29、31、34、35、36、
102、104和106-108中任一个所示多肽。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分
子还包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、
基本上组成为或组成为SEQ ID NO:29或102中所示的多肽。

[0062] 在实施方案组#2的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换。在某些进一步的实施方案
中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是用由选自以下各项组成的组的非带正电荷
的氨基酸残基置换精氨酸残基：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是用具有组氨酸置
换精氨酸残基。

[0063] 对于实施方案组#2的某些实施方案，当细胞靶向分子被引入至细胞时能够表现出与参照细胞靶向分子(诸如，例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只是全部其
志贺毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端
上的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)的毒性相当的细胞毒性。在某些进一步的实施
方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出在以下范围内的细胞毒性：第
四细胞靶向分子表现出的细胞毒性的0.1倍，0.5倍，或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、
3倍、4倍或5倍。

[0064] 在实施方案组#2的某些实施方案中，当细胞靶向分子被引入至脊索动物时能够表现出与参照分子(诸如，例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只是全部其志贺
毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端上的
野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)的体内耐受性相比改善的体内耐受性。

[0065] 在实施方案组#2的某些实施方案中，由于嵌入或插入的异源性表位，细胞靶向分子被去免疫化。在某些进一步的实施方案中，与参照分子相比(例如，由细胞靶向分子组成
的第七细胞靶向分子，只是其缺乏一个或更多个存在于细胞靶向分子中的嵌入或插入的表
位)，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。

[0066] 在实施方案组#2的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在一些进一步的实施方案中，细胞靶向分子能够表现出与参照分子(诸如，
例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分各自
包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域的羧基末端上的野生型志贺毒素弗林蛋白
酶切割位点)相比较少的相对抗原性和/或相对免疫原性。

[0067] 对于实施方案组#2的某些实施方案，与参照分子(例如野生型志贺毒素A亚基或由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分各自包含野生
型志贺毒素A1片段)相比，细胞靶向分子表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫原性。

[0068] 实施方案组#3-包含去免疫化的志贺毒素效应多肽的HER2靶向分子，所述去免疫化的志贺毒素效应多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序

[0069] 本发明提供细胞靶向分子，每个细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子(HER2/neu/ErbB2)的结合区域和(ii)去免疫化的志贺毒素A亚基效应多肽，其包
含破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特
异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含志贺毒素A1片段来源区域和羧基末端的
去免疫化的志贺毒素效应多肽，其中志贺毒素效应多肽包含：a)在A1片段区域羧基末端的
破坏的弗林蛋白酶切割基序，和(b)至少一个破坏的、内源B细胞和/或CD4+T细胞表位和/或
表位区域。对于某些进一步的实施方案，志贺毒素效应多肽能够表现出至少一种志贺毒素
效应子功能，如，例如，引导细胞内按路线发送至存在所述多肽的细胞的内质网和/或胞质
溶胶，抑制核糖体功能，酶促失活核糖体，引起白细胞淤积和/或引起细胞毒性。在某些进一
步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞，抑制核糖
体功能，引起白细胞淤积和/或引起细胞死亡。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基
的羧基末端相比，通过志贺毒素效应多肽的羧基端截短破坏弗林蛋白酶切割基序。相对于
野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应多肽可在其羧基末端截短，导致一个或更多个内源B
细胞和/或CD4+T细胞表位区域的消除。实施方案组#3的志贺毒素效应多肽可以进一步包含
插入或嵌入的异源性表位；例如嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位。嵌入或插入的异源性
CD8+T细胞表位可破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。例如，本发明提供了包含志
贺毒素A1片段区域和羧基末端的志贺毒素效应多肽，其中志贺毒素A亚基效应多肽包含：
(a)嵌入或插入的异源性表位；(b)至少一种内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏；
和(c)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；且其中志贺毒素A
亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能。在进一步的实例中，本发明提供了包含志
贺毒素A1片段区域和羧基末端的志贺毒素A亚基效应多肽，其中志贺毒素A亚基效应多肽包
含(a)嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位，其破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域；
(b)至少四种内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，其不与嵌入或插入的异源性
CD8+T细胞表位重叠；和(c)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端破坏的弗林蛋白酶切割基
序；并且其中志贺毒素A亚基效应多肽相对于野生型志贺毒素A亚基在其羧基末端截短，导
致一个或更多个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的消除；其中志贺毒素A亚基效应多
肽能够表现出志贺毒素效应子功能。

[0070] 对于实施方案组#3的某些实施方案，与参照分子(例如野生型志贺毒素A亚基或由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分各自包含野生
型志贺毒素A1片段)相比，细胞靶向分子表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫原性。

[0071] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应多肽直接或间接连接在一起。

[0072] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域包含含有免疫球蛋白或免疫球蛋白型结合区域的多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的
多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片段(sdAb)，来源于骆驼抗体的重链抗体
结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，
免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补
决定区3片段(CDR3)，受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，小模块化免疫
药物(SMIP)结构域，抗原结合片段(Fab)，犰狳重复多肽(ArmRP)，纤连蛋白衍生的第10个纤
连蛋白III型结构域(10Fn3)，肌腱蛋白III型结构域(TNfn3)，锚蛋白重复基序结构域，低密
度脂蛋白受体衍生的A结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalin)，Kunitz结构域，蛋白
质-A-衍生的Z结构域，gamma-B晶体蛋白衍生的结构域，泛素衍生的结构域，Sac7d衍生的多
肽(affitin)，Fyn衍生的SH2结构域，小蛋白(miniprotein)，C型凝集素样结构域支架，经工
程改造的抗体模拟物，以及保留结合功能的任何前述的任何遗传操作的对应物。在某些实
施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片
段(sdAb)，衍生自骆驼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来自软
骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片
段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，Fd片段，和抗原结合片段(Fab)。在某些实施
方案中，本发明的细胞靶向分子包含能够特异性结合HER2/neu/ErbB2的细胞外部分的免疫
球蛋白结合区域，并且包含以下一种或更多种：抗体可变片段，单结构域抗体片段，单链可
变片段，Fd片段，抗原结合片段，自主VH结构域，来源于骆驼抗体的VHH片段，来源于软骨鱼
抗体的重链抗体结构域，VNAR片段，和免疫球蛋白新抗原受体。在某些实施方案中，结合区
域包含单链可变片段(scFv)，基本上由或由单链可变片段(scFv)组成。在某些实施方案中，
结合区域包含单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，结合区域包含衍生自骆驼抗体的
VHH片段、基本上由其组成或由其组成。

[0073] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应多肽直接或间接融合，形成连续多肽，使得结合区域直接或间接与志贺毒素效应多肽的羧基末端缔合。

[0074] 对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在被引入至细胞时能够表现出具有300nM或更低的半最大抑制浓度(CD50)的细胞毒性，和/或能够表现出显著水
平的志贺毒素细胞毒性。对于某些进一步的实施方案，与参照分子(例如野生型志贺毒素A
亚基或由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分各自
包含野生型志贺毒素A1片段)相比，细胞靶向分子表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫
原性。

[0075] 对于某些进一步的实施方案，当细胞靶向分子被引入到细胞时能够表现出与参照分子(例如，由细胞靶向分子组成的第二细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素效应多肽组分
在其A1片段区域的羧基末端包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相当或更好的细胞
毒性。

[0076] 在实施方案组#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽在B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中包含相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述B细胞和/或CD4+T细胞表位区域
选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-
15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ
ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205和SEQ ID NO:3
的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的262-278；SEQ ID NO:3的281-297；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的285-293；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:
2的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103位；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-
168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；和SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些进
一步的实施方案中，不存在作为氨基酸残基的羧基端截短的破坏，所述氨基酸残基与至少
一个破坏的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠(其也可
破坏另外的、不同的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域)。

[0077] 在实施方案组#3的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或更多个突变，该突变改变天然位于(1)志贺样毒素1的A亚基(SEQ
ID NO:1)、志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1变体序列的A亚基(例如SEQ
ID NO:4-6)的248-251处；或(2)志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2变体序
列的A亚基(例如，SEQ ID NO:7–18)的247-250处；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区
域中的至少一个氨基酸残基。在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序在
弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含相对于野生型志贺毒素A亚基的一
个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列
R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。

[0078] 在实施方案组#3的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。

[0079] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。

[0080] 在实施方案组#3的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些其他实施方案中，分子部分包含结合区域。

[0081] 在实施方案组#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些进一步的实施方案中，结
合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、
28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更高。

[0082] 在实施方案组#3的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记载的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/
或细胞按路线发送)即可。

[0083] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、
30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记
载的志贺毒素生物活性即可。

[0084] 在实施方案组#3的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换。在某些进一步的实施方案
中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是用由选自以下各项组成的组的非带正电荷
的氨基酸残基置换精氨酸残基：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是用组氨酸置换精
氨酸残基。

[0085] 在实施方案组#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6和37中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18和75-89中
任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1-6、37和75-89中任一个的氨基酸1-251；或(iv)
SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至少一个(两个、三
个、四个或更多个)破坏、内源B细胞和/或CD4+T细胞表位和/或表位区域和在志贺毒素A片
段来源区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。

[0086] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53
中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可
变结构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56中所示的
LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所
述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中所
示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结
构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所示的LCDR1、
LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链
可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所示的
HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结构域
多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68中所示的LCDR1、LCDR2
和LCDR3氨基酸序列。具有这些CDR的结合区域可以是包含单链可变片段的免疫球蛋白结合
区域。

[0087] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域可以包含含选自由以下各项组成的组的多肽的结合区域：a)仅重链可变结构域(VHH)，其包含(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO:69
或SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列或基本上由其组成；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO:70或
SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列或基本上由其组成；和(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO:71
或SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列或基本上由其组成。具有这些CDR的结合区域可以是包
含来源于骆驼抗体的仅重链可变结构域(VHH)的免疫球蛋白结合区域。

[0088] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域可包含：(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:26、29、30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的氨基酸269至397；SEQ ID NO:24或27的氨基酸381至500；SEQ ID NO:36的氨基
酸401至522，或SEQ ID NO:28的氨基酸401至520；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其
包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:24、27或28的氨基酸269至375；SEQ ID NO:26的
氨基酸393至499；SEQ ID NO:25的氨基酸403至513；SEQ ID NO:36的氨基酸408至514；和
SEQ ID NO:29或30的氨基酸413至519。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结
构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:29的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻
链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:29的氨基酸413至519。例
如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：
SEQ ID NO:36的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组
成为或组成为：SEQ ID NO:36的氨基酸408至514。

[0089] 在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为由以下多肽序列中的任一个表示的多肽：SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨
基酸269至499；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基酸
268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；或SEQ ID
NO:36的氨基酸269至514。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:29的氨基酸269至519表示的多
肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:102的氨基酸268至518
表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:31的氨基酸
268至386表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID NO:34的
氨基酸253至370表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由SEQ ID
NO:35的氨基酸253至367表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。例如，结合区域包含由
SEQ ID NO:36的氨基酸269至514表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。

[0090] 在实施方案组#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在实施方案组#3的某些实施
方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:29、31、34、35、36、102、104和106-108中任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶
向分子还包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子
包含SEQ ID NO:29或102中所示的多肽，基本上由其组成或由其组成。

[0091] 在实施方案组#3的某些实施方案中，当细胞靶向分子被引入至细胞时能够表现出与参照分子(诸如，例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只是全部其志贺毒素
效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域的羧基末端上的野生型
志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相当的细胞毒性。在某些进一步的实施方案中，本发明的细
胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出在以下范围内的细胞毒性：第四细胞靶向分子表现
出的细胞毒性的0.1倍，0.5倍，或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍或5倍。

[0092] 在实施方案组#3的某些实施方案中，当细胞靶向分子被引入至脊索动物时能够表现出与参照分子(诸如，例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只是其全部志贺
毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域的羧基末端上的野
生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)的体内耐受性相比改善的体内耐受性。

[0093] 在实施方案组#3的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在一些进一步的实施方案中，细胞靶向分子能够表现出与参照细胞靶向分
子(诸如，例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只是其全部志贺毒素效应多肽
组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域的羧基末端上的野生型志贺毒素
弗林蛋白酶切割位点)相比较少的相对抗原性和/或相对免疫原性。

[0094] 实施方案组#1-#3的进一步的实施方案

[0095] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应多肽在其羧基末端被截短，导致一种或更多种内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域
的消除。

[0096] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽具有有羧基末端的志贺毒素A1来源区域，并且还包含在A1片段区域的羧基末端处的破坏的弗林蛋白酶切割基
序。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基的羧基末端相比，通过志贺毒素效应多肽
的羧基端截短破坏弗林蛋白酶切割基序。例如，本发明的志贺毒素效应多肽可包含志贺毒
素A1片段来源区域，其中志贺毒素A1片段区域包含在志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破
坏的弗林蛋白酶切割基序，并且其中与野生型志贺毒素A亚基的羧基末端相比，所述弗林蛋
白酶切割基序被志贺毒素效应多肽的羧基末端截短破坏。

[0097] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽进一步包含至少一个插入或嵌入的异源性表位。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包
含至少一个嵌入的异源性表位。在某些实施方案中，至少一个插入或嵌入的异源性表位是
CD8+T细胞表位。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含至少一个插入或嵌入
的异源性CD8+T细胞表位。在某些实施方案中，嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位破坏内
源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。

[0098] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽的氨基末端位于细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端处和/或其邻近。在某些进一步的实施方案中，相对于志贺
毒素效应多肽，结合区域不位于细胞靶向分子的氨基末端的近侧。在某些另外的实施方案
中，结合区域和志贺毒素效应多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不位
于志贺毒素效应多肽的氨基末端的近侧。在某些进一步的实施方案中，结合区域位于细胞
靶向分子内更邻近志贺毒素效应多肽的羧基末端而不是志贺毒素效应多肽的氨基末端。对
于某些进一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，并且，与参照分子(例
如第五细胞靶向分子，其具有氨基末端并且包含结合区域和志贺毒素效应多肽，其不位于
第五细胞靶向分子的氨基末端或其邻近)的细胞毒性相比，在被引入细胞时能够表现出从
细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室更高的亚细胞按路线发送效率。对于某
些进一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细
胞毒性，诸如和第五细胞靶向分子的细胞毒性相比4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。对
于某些进一步的实施方案，如CD50值所测定的，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的
细胞毒性是第五细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7
倍、8倍、9倍、10倍或更大。在某些进一步的实施方案中，第五细胞靶向分子不包含KDEL家族
的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序。

[0099] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。

[0100] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子，或其多肽组分，包含KDEL家族成员的羧基末端内质网保留/回收信号基序。在某些进一步的实施方案中，羧
基末端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:109),HDEF
(SEQ ID NO:110),HDEL(SEQ ID NO:111),RDEF(SEQ ID NO:112),RDEL(SEQ ID NO:113),
WDEL(SEQ ID NO:114),YDEL(SEQ ID NO:115),HEEF(SEQ ID NO:116),HEEL(SEQ ID NO:
117),KEEL(SEQ ID NO:118),REEL(SEQ ID NO:119),KAEL(SEQ ID NO:120),KCEL(SEQ ID
NO:121),KFEL(SEQ ID NO:122),KGEL(SEQ ID NO:123),KHEL(SEQ ID NO:124),KLEL(SEQ
ID NO:125),KNEL(SEQ ID NO:126),KQEL(SEQ ID NO:127),KREL(SEQ ID NO:128),KSEL
(SEQ ID NO:129),KVEL(SEQ ID NO:130),KWEL(SEQ ID NO:131),KYEL(SEQ ID NO:132),
KEDL(SEQ ID NO:133),KIEL(SEQ ID NO:134),DKEL(SEQ ID NO:135),FDEL(SEQ ID NO:
136),KDEF(SEQ ID NO:137),KKEL(SEQ ID NO:138),HADL(SEQ ID NO:139),HAEL(SEQ ID
NO:140),HIEL(SEQ ID NO:141),HNEL(SEQ ID NO:142),HTEL(SEQ ID NO:143),KTEL(SEQ
ID NO:144),HVEL(SEQ ID NO:145),NDEL(SEQ ID NO:146),QDEL(SEQ ID NO:147),REDL
(SEQ ID NO:148),RNEL(SEQ ID NO:149),RTDL(SEQ ID NO:150),RTEL(SEQ ID NO:151),
SDEL(SEQ ID NO:152),TDEL(SEQ ID NO:153),SKEL(SEQ ID NO:154),STEL(SEQ ID NO:
155),和EDEL(SEQ ID NO:156)。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被
引入细胞时能够表现出比参照分子(例如，由细胞靶向分子组成的第六细胞靶向分子，只是
其包含KDEL家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序)的细胞毒性更大的细胞毒性。
在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子和参照分子(例如，由细胞靶向分子组
成的第六细胞靶向分子，只是其包含KDEL家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序)
相比能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如，4倍、5倍、6倍、9倍或更
高的细胞毒性。在某些进一步的实施方案中，如通过CD50值所测定的，本发明的细胞靶向分
子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是第六细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性
的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。

[0101] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽还包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个破坏的内源性B细胞和/或T细胞表位区域。在某些进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个本文描述的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位和/或表位区域的破坏。在某些进一步的
实施方案中，志贺毒素效应多肽还包含至少一个(例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个)破坏的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域，所述表位区域不与至少一个插
入或嵌入的异源性表位重叠，其也可破坏另外的、不同的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表
位区域。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少三个内源性B细胞和/或CD4+T细胞
表位区域的破坏，所述内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域不与嵌入或插入的异源性CD8
+T细胞表位重叠，其也可破坏另外的、不同的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。

[0102] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中进一步包含破坏，所述内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域选自由
以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ
ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3
的179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的205和SEQ ID NO:3的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的
262-278；SEQ ID NO:3的281-297；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的285-293；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
77-103位；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的274-293；或志贺
毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些进一步的实施方案中，不存在作为氨基酸残基
的羧基端截短的破坏，所述氨基酸残基与至少一个破坏的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表
位和/或表位区域的部分或全部重叠。

[0103] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽进一步包含至少一个(诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，其中所述B细胞区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区
域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3
的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的262-278；SEQ ID NO:3的281-297；和SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如志贺毒素效
应多肽SEQ ID NO:4-18中的等同区域)；和CD4+T细胞表位区域选自由以下各项组成的天然
定位的志贺毒素A亚基区域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-
168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；和SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如志贺
毒素效应多肽SEQ ID NO:4-18中的等同区域)。在某些实施方案中，B细胞表位区域选自由
以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；
SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID
NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的
204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的210-218；和SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的243-257；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如志贺毒素效应多肽SEQ
ID NO:4-18中的等同区域)；和CD4+T细胞表位区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺
毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；或志贺毒素A
亚基或其衍生物中的等同区域(诸如志贺毒素效应多肽SEQ ID NO:4-18中的等同区域)。例
如，B细胞表位区域可以选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的179-190；和SEQ ID NO:3的179-191；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸
如志贺毒素效应多肽SEQ ID NO:4-18中的等同区域)；和CD4+T细胞表位区域为SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的236-258；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如志贺毒素效
应多肽SEQ ID NO:4-18中的等同区域)。

[0104] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少四个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，其中所述破坏包括在B细胞表位区域相对于野生型
志贺毒素A亚基的突变，所述B细胞表位区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A
亚基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的
26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID
NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-
156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的197；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；
SEQ ID NO:3的210-218；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；或志贺毒素A亚基或其
衍生物中的等同区域(诸如志贺毒素效应多肽SEQ ID NO:4-18中的等同区域)；和/或CD4+T
细胞表位区域，其选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；
和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸
如志贺毒素效应多肽SEQ ID NO:4-18中的等同区域)。

[0105] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽还包含在B细胞免疫原性氨基酸残基中的相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述B细胞免疫原性氨基酸残基
选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基的组：L49、D197、D198、R204
和R205。

[0106] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，嵌入或插入的异源性T细胞表位破坏选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B细胞和/或CD4+T细胞
表位区域：(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-
37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:
3的42-48；和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66位，或志贺毒素A亚基或其
衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和
SEQ ID NO:7-18中所示的任何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区域)，其中不存在
作为序列的氨基端截短的破坏，所述序列与至少一个破坏的表位区域的部分或全部重叠；
(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的
179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；和SEQ ID NO:3的210-218；和(iii)SEQ ID NO:3的240-260；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID
NO:3的262-278；SEQ ID NO:3的281-297；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的285-293，或志贺
毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效
应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中所示的任何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区
域)。

[0107] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含在B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中的相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述B细胞和/或CD4+T细胞
表位区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；和SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66位，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如
SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中所示的任
何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区域)，其中不存在序列的氨基端截短的破坏，
所述序列与至少一个破坏的表位区域的部分或全部重叠；(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2
或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；和
SEQ ID NO:3的210-218；和(iii)SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的262-278；SEQ ID NO:3的
281-297；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同
区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中
所示的任何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区域)，其中不存在作为序列的氨基端
截短的破坏，所述序列与至少一个破坏的表位区域的部分或全部重叠。

[0108] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位破坏选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B细胞表位区域：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；
和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的94–115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；和SEQ ID
NO:3的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的262-278；SEQ ID NO:3的281-297；和SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID
NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中所示的任何一种志
贺样毒素2效应多肽变体中的等同区域)；和/或内源性CD4+T细胞表位区域，其选自由以下
各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的128-168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
236-258；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的274-293或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同
区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中
所示的任何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区域)。

[0109] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位破坏选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B细胞表位区域：
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；
和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的94–115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；和SEQ ID
NO:3的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；或志贺
毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效
应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中所示的任何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区
域)；和/或内源性CD4+T细胞表位区域，其选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚
基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的34-78；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的160-183；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；或志贺毒素A亚基或其
衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和
SEQ ID NO:7-18中所示的任何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区域)。

[0110] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少一个内源性表位区域的破坏，所述内源表位区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基的
组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的
179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；或SEQ ID NO:3的210-218或志贺毒素A亚基中的等同区域或
其衍生物(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1效应多肽变体任一种和SEQ ID NO:7-18
中所示的志贺样毒素2效应多肽变体的任一种中)。

[0111] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽不包含异源性MHC I类限制性T细胞表位。MHC I类限制性T细胞表位是本领域已知的或能够由技术人员预测的。
术语异源是指MHC I类限制性T细胞表位，其不是天然存在于野生型志贺毒素A亚基中的，例
如与目的志贺毒素效应多肽最密切相关的野生型志贺毒素A亚基。

[0112] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个内源性B细胞和/或T细胞表位区域的破坏。在实施方
案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少四个内源性B细胞和/或T细胞
表位区域的破坏。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少五个内源性B细胞和/或
CD4+T细胞表位区域的破坏。例如，在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少六个内
源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏。在某些进一步的实施方案中，所述两个、三个、
四个、五个、六个、七个、八个或更多个破坏的表位区域不与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞
表位重叠，其也可破坏另外的、不同的、内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。

[0113] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，一种或更多种破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。

[0114] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，一个或更多个内源性B细胞和/或T细胞表位区域包含相对于野生型志贺毒素A亚基的多个氨基酸残基置换。在某些实施方案中，至
少三个、四个、五个或更多个B细胞和/或CD4+T细胞表位区域破坏包含相对于野生型志贺毒
素A亚基的氨基酸残基置换。

[0115] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，至少一个、两个、三个或四个破坏包含在内源性B细胞和/或T细胞表位区域中的相对于野生型志贺毒素A亚基的多个氨基酸残基置
换。

[0116] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，至少一个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个氨基酸残基置换，并且任选地其中至少一个置换发生在选自由以下各项组成的组的天然定位的志贺毒素A亚基
氨基酸残基上：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的6；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的11；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的12；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的46；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或
SEQ ID NO:3的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的54；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的56；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104；SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的107；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的110；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:
2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的141；SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID
NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID
NO:3的250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286；或志贺毒
素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1效应多
肽变体中的任一个的等同区域和SEQ ID NO:7-18中所示的志贺样毒素2效应多肽变体中的
任一个的等同区域)。

[0117] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，至少一个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个氨基酸残基置换，并且任选地其中至少一个置换(诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个氨基酸残基置换)发生在选自由以下各项组成的组的天然定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基
上：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的6；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8；SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的12；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
45；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47；SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的
49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的53；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的56；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或
SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2
或SEQ ID NO:3的88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的105；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:
3的112；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；SEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的189；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID NO:3的250；和
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基(诸
如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1效应多肽变体中的任一个和SEQ ID NO:7-18中所示
的志贺样毒素2效应多肽变体中的任一个的等同区域)。在某些实施方案中，所述至少一个
置换发生在天然定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2
的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的248；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251。

[0118] 在某些进一步的实施方案中，至少两个破坏各自包含相对于野生型志贺毒素A亚基的选自由以下各项组成的组的至少一个氨基酸残基置换：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:
3的8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的
94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的112；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；SEQ
ID NO:1、SEQ ID SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3
的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:3
的247；SEQ ID NO:3的250；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286；或志贺毒素A亚基或其衍生物
中的等同氨基酸残基(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1效应多肽变体中的任一个的
等同区域和SEQ ID NO:7-18中所示的志贺样毒素2效应多肽变体中的任一个的等同区域)。

[0119] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少三个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，所述表位区域选自由以下各项组成的组：(i)SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；和SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66位，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区
域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中所
示的任何一种志贺样毒素2效应多肽变体中的等同区域)，其中不存在作为氨基酸残基的氨
基端截短的破坏，所述氨基酸残基与至少一个破坏的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区
域的部分或全部重叠；(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-115；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；
SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；和SEQ ID NO:3的210-218；和(iii)
SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的262-278；SEQ ID NO:3的281-297；和SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的
任何一种志贺毒素1效应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中所示的任何一种志贺样毒素2效应
多肽变体中的等同区域)，其中不存在作为氨基酸残基的羧基端截短的破坏，所述氨基酸残
基与至少一个破坏的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠。

[0120] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少两个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，其中每个破坏包含一个或更多个氨基酸残基置换，
并且其中内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域选自以下各项组成的天然定位的志贺毒素
A亚基区域的组：SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:
4-6中显示的任何一种志贺毒素1效应多肽变体和SEQ ID NO:7-18中显示的任何一种志贺
样毒素2效应多肽变体中的等同区域)。

[0121] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，嵌入或插入的异源性T细胞表位不破坏本文所述的任何内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。

[0122] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，至少一个破坏包含相对于野生型志贺毒素A的一个或更多个氨基酸残基置换，所述一个或更多个氨基酸置换选自由如下各项组成
的组：D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、D至M、D至R、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、F至A、F至G、F至V、F至L、F至I、G至A、G至P、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、I至A、I至V、I至G、I至C、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至V、L至G、L至C、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、V至A、V至G、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、Y至M和Y至T。在某些进一步的实施方案中，所述相对于野生型志贺毒素A
亚基的一个或更多个氨基酸残基置换选自由以下各项组成的组：D至A、D至G、D至V、D至L、D
至I、D至F、D至S、D至Q、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、G至A、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至G、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F和Y至M。

[0123] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，至少一个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的选自由以下各项组成的组的一个或更多个氨基酸残基置换：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M和S；D6至A、G、V、L、I、F、S、Q和R；T8至A、G、V、I、L、F和M；S8至A、G、V、I、L、F和M；T9至A、G、V、I、L、F、M和S；S9至A、G、V、L、I、F和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M、S和K；S12至A、G、V、I、L、F和M；S33至A、G、V、L、I、F、M和C；S43至A、G、V、L、I、F和M；G44至A或L；S45至A、G、V、L、I、F和M；T45至A、G、V、L、I、F和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S、M和Q；N48至A、G、V、L、M和F；L49至A、V、C和G；Y49至A、G、V、L、I、F、M和T；F50至A、G、V、L、I和T；D53至A、G、V、L、I、F、S和Q；V54至A、G、I和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56至A和P；I57至A、G、V和M；L57至A、V、C、G、M和F；D58至A、G、V、L、I、F、S和Q；P59至A、G和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62至A；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至A和G；I88至A、V、C和G；D94至A、G、V、L、I、F、S和Q；S96至A、G、V、I、L、F和M；T104至A、G、V、L、I、F、M；和N；A105至L；T107至A、G、V、L、I、F、M和P；S107至A、G、V、L、I、F、M和P；L108至A、V、C和G；S109至A、G、V、I、L、F和M；T109至A、G、V、I、L、F、M和S；G110至A；S112至A、G、V、L、I、F和M；D111至A、G、V、L、I、F、S、Q和T；S112至A、G、V、L、I、F和M；D141至A、G、V、L、I、F、S和Q；G147至A；V154至A和G；R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、G、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、I、F、M和S；D183至A、G、V、L、I、F、S和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S和Q；L185至A、G、V和C；S186至A、G、V、I、L、F和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189至A、G、V、I、L、F和M；D197至A、G、V、L、I、F、S和Q；D198至A、G、V、L、I、F、S和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；C242至A、G和V；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R247至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；
R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，所述一个或更多个氨基酸残基置换选自由以下各项组成的在志贺毒素A亚基中的天然位置的置
换组：K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,
S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,
R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,
E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,
D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,
D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D197A,D198A,
R204A,R205A,C242A,S247I,Y247A,R247A,R248A,R250A,R251A,D264A,G264A,T286A,和
T286I。在某些实施方案中，所述一个或更多个置换选自由以下各项组成的在志贺毒素A亚
基中天然位置的置换的组：K1A、S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、E60T、E61L、G110A、D141A、G147A、R188A、C242S、R248A和R251A。在某些进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽包含
一个或更多个置换，所述置换选自由K1R和K11R组成的在志贺毒素A亚基中的天然位置的置
换的组。在某些进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽包含以下所有置换：S45I、V54I、
R55L、I57F、P59F、E60T、E61L、G110A、R188A、C242S、R248A和R251A。在某些其他的进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽包含以下所有置换：K1A、S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、
E60T、E61L、G110A、G147A、C242S、R248A和R251A。在某些其他的进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽包含以下所有置换：S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、E60T、E61L、G110A、D141A、R188A、C242S、R248A和R251A。在某些进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽包含以下所
有置换：K1R、K11R、S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、E60T、E61L、G110A、D141A、R188A、C242S、R248A和R251A。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽进一步包含一个或更多个另外的置
换，所述置换选自由以下各项组成的在志贺毒素A亚基中的天然位置的置换的组：K1A,K1M,
T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,
T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,
R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,
E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,
D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,
D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D197A,D198A,
R204A,R205A,C242S,S247I,R247A,Y247A,R248A,R250A,和R251A。

[0124] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：与选自SEQ ID NO:19-21和
75-89中任一个的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案
中，本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效应多肽包含、基本上组
成为或组成为：与选自SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列有至少85％(诸如至少
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含，所述志贺毒素效应多
肽包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:19-21和75-89中任一个所示的多肽。在某些实
施方案中，本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效应多肽包含、基
本上组成为或组成为SEQ ID NO:19-21中任一个所示的多肽。例如，志贺毒素效应多肽包
含、基本上组成为或组成为SEQ ID NO:20中所示的多肽。

[0125] 对于实施方案组#1至#3的某些实施方案，当本发明的细胞靶向分子被引入至脊索动物时能够表现出与参照分子(诸如，例如，由细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，只
是其全部志贺毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域的羧
基末端上的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相比改善的体内耐受性和/或稳定性。在
某些进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽不是细胞毒性的，且分子部分是细胞毒性的。

[0126] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应多肽直接或间接连接在一起。

[0127] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽直接或间接地(例如通过技术人员已知的接头)与结合区域融合。结合区域和志贺毒素效应多肽可以通过包含
一个或更多个氨基酸的蛋白质接头融合。例如，接头可以包含、基本上组成为或组成为选自
如下各项的氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGS(SEQ ID NO:93)、AHHSEDPSSKAPKAP(SEQ ID NO:
95)、SPSTPPTPSPSTPPA(SEQ ID NO:181)、EFPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO:90)和
GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:96)。结合区域和志贺毒素效应多肽可通过间插的单个氨
基酸残基(例如丙氨酸残基)的存在间接地融合在一起。

[0128] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含至少一个肽和/或多肽。在某些其他实施方案中，结合区域是或包含免疫球蛋白或免疫球蛋白型结合区域。在某些另
外的实施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域，单结构域
抗体片段(sdAb)，来源于骆驼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源
于软骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，
VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补决定区3片段(CDR3)，受约束的
FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，小模块化免疫药物(SMIP)结构域，抗原结合片
段(Fab)，犰狳重复多肽(ArmRP)，纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，肌
腱蛋白III型结构域(TNfn3)，锚蛋白重复基序结构域，低密度脂蛋白受体衍生的A结构域
(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalin)，Kunitz结构域，蛋白质-A-衍生的Z结构域，gamma-B
晶体蛋白衍生的结构域，泛素衍生的结构域，Sac7d衍生的多肽(affitin)，Fyn衍生的SH2结
构域，小蛋白(miniprotein)，C型凝集素样结构域支架，经工程改造的抗体模拟物，以及任
何前述的保留结合功能的任何遗传操作的对应物。在实施方案组#1至#3的某些实施方案
中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片段
(sdAb)，来源于骆驼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼
抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单
链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补的决定区3片段(CDR3)，受约束的FR3-CDR3-
FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，和抗原结合片段(Fab)。在实施方案组#1至#3的某些实施
方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片段
(sdAb)，来源于骆驼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼
抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单
链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，Fd片段，和抗原结合片段(Fab)。在实施方案组#1
至#3的某些实施方案中，结合区域包含单链可变片段(scFv)。结合区域可包含选自由以下
各项组成的组的多肽：自主VH结构域，单结构域抗体片段(sdAb)，来源于骆驼
的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域(VHH或VH结
构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段
(Fv)，互补的决定区3片段(CDR3)，受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，和
抗原结合片段(Fab)。例如，本发明的细胞靶向分子包含含有以下一种或更多种的结合区
域：抗体可变片段，单结构域抗体片段，单链可变片段，Fd片段，抗原结合片段，自主VH结构
域，来源于骆驼抗体的VHH片段，来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域，VNAR片段，和免疫球
蛋白新抗原受体。在进一步实例中，结合区域包含来源于骆驼抗体的单链可变片段和/或
VHH片段。在又进一步的实例中，结合区域包含单链可变片段。在又进一步的实例中，结合区
域包含来源于骆驼抗体的VHH片段。

[0129] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含免疫球蛋白结合区域，所述免疫球蛋白结合区域包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链可变结构域多肽通过
包含13个或更多个氨基酸残基的非分支序列的接头与至少一个轻链可变结构域多肽连接，
任选地其中所述接头包含选自以下任何一个的氨基酸序列：(G4S)3(SEQ ID NO:180)、
(G4S)4(SEQ ID NO:177)、(G4S)5(SEQ ID NO:92)、(G4S)6(SEQ ID NO:178)或(G4S)7(SEQ ID
NO:179)。

[0130] 对于实施方案组#1至#3的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应多肽相当的催化活性水平，(ii)具有10,
000皮摩尔或更低的半最大抑制浓度(IC50)值的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志
贺毒素催化活性。

[0131] 对于实施方案组#1至#3的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子和/或其志贺毒素效应多肽能够表现出与包含野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应多肽的参照
细胞靶向分子相当的亚细胞按路线发送效率和/或能够表现出从细胞的内体起始位置到内
质网和/或胞质溶胶的显著水平的细胞内按路线发送活性。

[0132] 对于实施方案组#1至#3的某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用至与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，所述细胞靶向分子能够导
致细胞死亡。对于某些进一步的实施方案，将本发明的细胞靶向分子施用至在细胞外靶生
物分子的存在或水平方面不同的细胞类型的两种不同群体，细胞靶向分子能够导致与细胞
毒性细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的细胞死亡，其
CD50比针对没有与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型
的CD50小至少三倍。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用至其成员与所述
细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的第一细胞群体，以及其成员不与
所述结合结构域的细胞外靶生物分子的任何一个物理偶联的第二细胞群体，细胞靶向分子
对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用相对于所述第二细胞群体的成员至少高3倍。
对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用至其成员与所述细胞靶向分子的结
合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的第一细胞群体，以及其成员不与显著量的所述结合
区域的细胞外靶生物分子的任何一个物理偶联的第二细胞群体，细胞靶向分子对所述第一
细胞群体的成员的细胞毒性作用相对于所述第二细胞群体的成员为至少3倍高。对于某些
实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用于靶生物分子阳性细胞的第一群体，以及其
成员不在细胞表面表达显著量的细胞靶向分子的结合区域的靶生物分子的第二细胞群体，
该细胞靶向分子对第一细胞群体的成员的细胞毒性作用相对于第二细胞群体的成员为至
少3倍高。

[0133] 对于实施方案组#1至#3的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在被引入至细胞时能够表现出具有300nM或更低的半最大抑制浓度(CD50)值的细胞毒性，和/或能够表现出
显著水平的志贺毒素细胞毒性。

[0134] 对于实施方案组#1-#3的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径用于由MHC I类分子结合的表位
的细胞表面呈递。

[0135] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，细胞靶向分子包含与志贺毒素效应多肽的羧基末端缔合的分子部分。在某些实施方案中，该分子部分包含结合区域或由结合区域
组成。在某些实施方案中，分子部分包含至少一个氨基酸，且志贺毒素效应多肽与分子部分
的至少一个氨基酸残基连接。在某些进一步的实施方案中，分子部分和志贺毒素效应多肽
融合形成连续的多肽。

[0136] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，细胞靶向分子进一步包含与志贺毒素效应多肽的羧基末端缔合的细胞毒性分子部分。对于某些实施方案，细胞毒性分子部分是细
胞毒性剂，例如技术人员已知或本文所述的小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生
素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于某些进一步的实施方
案，细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pM的浓度下具有细胞毒性。

[0137] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域通过至少一个不是二硫键的共价键直接或间接连接到志贺毒素效应多肽。在某些进一步的实施方案中，结合区域直接或
间接地融合至志贺毒素效应多肽的羧基末端，以形成单个连续多肽。在某些其他实施方案
中，结合区域是免疫球蛋白或免疫球蛋白型结合区域。例如，在本发明的细胞靶向分子中，
结合区域和志贺毒素效应多肽可以融合形成连续多肽，使得结合区域与志贺毒素A亚基效
应多肽的羧基末端缔合。

[0138] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小的弗林蛋白酶切割位点包含相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或更多个突变。在某些实施方
案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基
的部分或全部重叠的序列的氨基末端截短。在某些实施方案中，最小的弗林蛋白酶切割位
点中的突变是R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中的至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插
入和/或置换。在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型
志贺毒素A亚基的至少一个突变，该突变改变天然定位于(1)志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID
NO:1)、志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1变体序列的A亚基(例如SEQ ID
NO:4-6)的248-251处；或(2)志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2变体序列
的A亚基(例如，SEQ ID NO:7–18)的247-250处；或任何志贺毒素A亚基中的等同氨基酸序列
位置的区域中的至少一个氨基酸残基。在某些进一步的实施方案中，突变是用非带正电荷
的氨基酸残基置换精氨酸残基的氨基酸残基置换。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽
在志贺毒素A1片段来源区的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，其中所述破坏的弗
林蛋白酶切割基序包含(i)与野生型志贺毒素A亚基的羧基末端相比的羧基端截短和(ii)
在志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO:1)、志贺毒素(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1效应
多肽变体的A亚基(SEQ ID No:4-6)的天然定位的氨基酸残基248和251处；或在志贺样毒素
2的A亚基(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2效应多肽变体的A亚基(SEQ ID No:7-18)的天然定
位的氨基酸残基247和250处的相对于野生型志贺毒素A亚基在弗林蛋白酶切割位点中的至
少一个氨基酸置换。在某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含与野生型志贺毒
素A亚基相比的羧基端截短；和相对于野生型志贺毒素A亚基在弗林蛋白酶裂解基序中，在
志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO:1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)的天然定位的氨基
酸残基248和251处；或者在志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3)的天然定位的氨基酸残基
247和250处的氨基酸置换。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换
是用丙氨酸残基置换精氨酸残基的置换。

[0139] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效应多肽包含SEQ ID NO:19-21和75-89中任一个所示的多肽或基本
上由其组成。

[0140] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，当本发明的细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与参照分子(例如，由细胞靶向分子组成的第三细胞靶向分子，只是其全部的志
贺毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段)相当的细胞毒性。

[0141] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含SEQ ID NO:45-74、91-92或94中任一个所示的肽或多肽。

[0142] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为：与以下氨基酸序列有至少85％(诸如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更多)同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；SEQ ID NO:25的氨基
酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:27的氨基酸269至500；SEQ ID
NO:28的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31
的氨基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；
SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；SEQ ID NO:36的氨基
酸269至514；SEQ ID NO:97的氨基酸268至500；SEQ ID NO:98的氨基酸268至512；SEQ ID
NO:99的氨基酸268至498；SEQ ID NO:100的氨基酸268至499；SEQ ID NO:101的氨基酸268-
519；或SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸268至518。在某些实施方案中，结合区域
包含、基本上组成为或组成为：与以下氨基酸序列有至少85％(诸如90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:24的氨基酸
269至501；SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:
27的氨基酸269至500；SEQ ID NO:28的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨
基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID
NO:33的氨基酸269至499；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至
367；或SEQ ID NO:36的氨基酸269至514。在某些实施方案中，结合区域包含、基本上组成为
或组成为：与以下氨基酸序列有至少85％(诸如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID
NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31
的氨基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；
SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；或SEQ ID NO:36的氨
基酸269至514。

[0143] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含SEQ ID NO:45-74和90-96中任一个所示的肽或多肽。

[0144] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含由以下任一个代表的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；SEQ ID NO:25的氨基酸
269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:27的氨基酸269至500；SEQ ID NO:
28的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨
基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；SEQ ID
NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；SEQ ID NO:36的氨基酸269至
514；SEQ ID NO:97的氨基酸268至500；SEQ ID NO:98的氨基酸268至512；SEQ ID NO:99的
氨基酸268至498；SEQ ID NO:100的氨基酸268至499；SEQ ID NO:101的氨基酸268-519；和
SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸268至518。在某些实施方案中，结合区域包含由
以下任一个代表的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；
SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:27的氨基
酸269至500；SEQ ID NO:28的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269
至519；SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33
的氨基酸269至499；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；和
SEQ ID NO:36的氨基酸269至514。在某些实施方案中，结合区域包含由以下任一个代表的
多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基
酸269至499；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基酸268
至386；SEQ ID NO:2的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；SEQ ID NO:34的
氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；和SEQ ID NO:36的氨基酸269至514。在
某些实施方案中，结合区域包含由以下代表的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID
NO:29的氨基酸269至519、SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至
370；或SEQ ID NO:35的氨基酸253至367。在某些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:
29的氨基酸269至519表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，结合区
域包含由SEQ ID NO:31的氨基酸268至386表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某
些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:34的氨基酸253至370表示的多肽，基本上由其
组成或由其组成。在某些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:35的氨基酸253至367表
示的多肽，基本上由其组成或由其组成。

[0145] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本
发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:25-27和29-36中任一个所示多肽，基本上由其组成
或由其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:29、31、34和35中
任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子
包含SEQ ID NO:29中所示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本发明
的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:31中所示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实
施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:34中所示的多肽，基本上由其组成或由
其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:35中所示的多肽，基本
上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:102中
所示的多肽，基本上由其组成或由其组成。

[0146] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个
所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明
的细胞靶向分子包含氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ
ID NO:25-27和29-36中任一个所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#
3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、基本上由其组成或由其组
成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:29、31、34和35中任一个所示的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:29的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:31的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:34的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:35的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

[0147] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含由以下任一个代表的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；SEQ ID NO:25的氨基酸
269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:27的氨基酸269至500；SEQ ID NO:
28的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨
基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；SEQ ID
NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；SEQ ID NO:36的氨基酸269至
514；SEQ ID NO:97的氨基酸268至500；SEQ ID NO:98的氨基酸268至512；SEQ ID NO:99的
氨基酸268至498；SEQ ID NO:100的氨基酸268至499；SEQ ID NO:101的氨基酸268-519；SEQ
ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸268至518；SEQID NO:104的氨基酸267至384；SEQ ID
NO:105的氨基酸268至498；SEQ ID NO:106的氨基酸252至370；SEQ ID NO:107的氨基酸252
至366；和SEQ ID NO:108的氨基酸268至513。在某些实施方案中，结合区域包含由以下任一
个代表的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；SEQ ID NO:
25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:27的氨基酸269至500；
SEQ ID NO:28的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID
NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至
499；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；和SEQ ID NO:36
的氨基酸269至514。在某些实施方案中，结合区域包含由以下任一个代表的多肽、基本上由
其组成或由其组成：SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；
SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ
ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；SEQ ID NO:34的氨基酸253
至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；和SEQ ID NO:36的氨基酸269至514。在某些实施
方案中，结合区域包含由以下代表的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:29的氨
基酸269至519、SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；或SEQ
ID NO:35的氨基酸253至367。在某些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:29的氨基酸
269至519表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，结合区域包含由
SEQ ID NO:31的氨基酸268至386表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方
案中，结合区域包含由SEQ ID NO:34的氨基酸253至370表示的多肽，基本上由其组成或由
其组成。在某些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:35的氨基酸253至367表示的多肽，
基本上由其组成或由其组成。

[0148] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本
发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:25-27和29-36中任一个所示多肽，基本上由其组成
或由其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：SEQ ID NO:29、31、34和35中
任一个所示多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子
包含SEQ ID NO:29中所示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本发明
的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:31中所示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实
施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:34中所示的多肽，基本上由其组成或由
其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:35中所示的多肽，基本
上由其组成或由其组成。

[0149] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个
所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明
的细胞靶向分子包含氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ
ID NO:25-27和29-36中任一个所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#
3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、基本上由其组成或由其组
成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:29、31、34和35中任一个所示的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:29的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:31的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:34的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含氨基酸序列、
基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与SEQ ID NO:35的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

[0150] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。

[0151] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些其他实施方案中，分子部分包含结合区域。

[0152] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些进一步的实施方案
中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、
28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更高。

[0153] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记载的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性
和/或细胞内按路线发送)即可。

[0154] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、
30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文记
载的志贺毒素生物活性即可。

[0155] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:22-37和97-108中任一个所示的多肽或基本上由其组成，并且任选地细胞靶向分子包含氨
基端甲硫氨酸残基。

[0156] 对于实施方案组#1至#3的某些进一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低细胞毒性效力(即，在细胞靶向分子浓度为1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM下，在被引
入某些阳性靶细胞类型时不能够表现出大于1％的细胞群体的细胞死亡的细胞毒性)，并
且，与参照分子(例如第五细胞靶向分子，其具有氨基末端并且包含结合区域和志贺毒素效
应多肽，其不位于第五细胞靶向分子的氨基末端或其邻近)的细胞毒性相比，当被引入细胞
时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室更高的亚细胞按路线发
送效率。在某些进一步的实施方案中，第五细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基末端
内质网保留/回收信号基序。

[0157] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，分子部分包含来源于天然存在的志贺毒素的志贺毒素A2片段的肽和/或多肽。

[0158] 本发明的实施方案不旨在涵盖任何天然存在的志贺全毒素或志贺毒素A亚基。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含天然存在的志贺毒素
B亚基。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含任何包含天然志贺毒素
B亚基的功能性结合结构域、基本上由其组成或由其组成的多肽。相反，在本发明的细胞靶
向分子的某些实施方案中，志贺毒素A亚基来源区域在功能上与异源性结合区域缔合以实
现细胞靶向。

[0159] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少两个嵌入或插入的异源表位。

[0160] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽不包含相对于野生型志贺毒素A亚基的选自以下组的氨基酸残基置换的组：(1)R248H和R251H；(2)R248G和
R251G；(3)A246G、S247A、A253G和S254A；和(4)A246G、S247A、R248G、R251G、A253G和S254A。

[0161] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽不包含野生型志贺毒素A亚基中天然定位于247-252的区域的缺失。在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志
贺毒素效应多肽不包含野生型志贺毒素A亚基中天然定位于245-247和253-255的区域的缺
失。

[0162] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含相对于志贺毒素家族成员的天然存在的(或野生型)A亚基的一个或更多个突变，所述突变改变志贺毒素效
应多肽的酶活性，该突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些进一步的实施
方案中，相对于天然存在的A亚基的突变降低或消除了志贺毒素效应多肽的细胞毒活性，但
该志贺毒素效应多肽保留了至少一种其他志贺毒素效应子功能，例如促进细胞内化和/或
引导细胞内按路线发送至某个亚细胞区室。在某些进一步的实施方案中，相对于天然存在
的(或野生型)A亚基的突变选自至少一个氨基酸残基置换，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2
或SEQ ID NO:3中的A231E、R75A、Y77S、Y114S、E167D、R170A、R176K和/或W203A。

[0163] 对于实施方案组#1至#3的某些实施方案，志贺毒素效应多肽能够：(i)按路线发送至其中存在志贺毒素效应多肽的细胞的亚细胞区室，所述亚细胞区室选自以下：胞质溶胶、
内质网和溶酶体；(ii)将表位从早期内体区室细胞内递送至其中存在志贺毒素效应多肽的
细胞的蛋白酶体；和/或(iii)将表位细胞内递送至来自其中存在志贺毒素效应多肽的细胞
的早期内体区室的MHC I类分子。在某些进一步的实施方案中，志贺毒素效应多肽能够细胞
内递送CD8+T细胞表位，用于通过MHC I类分子在其中存在志贺毒素效应多肽的细胞表面上
呈递。

[0164] 在某些实施方案中，本发明的分子，在志贺毒素效应多肽的羧基端和/或志贺毒素A1片段区域的羧基端位置，不包含任何代表抗原和/或异源性CD8+，T细胞表位-肽的另外的
外源性物质。

[0165] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，结合区域不包含配体。

[0166] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，细胞靶向分子由于嵌入或插入的异源表位而被去免疫化，并且表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫原性。与参照分子(例如，由
细胞靶向分子组成的第七细胞靶向分子，只是其缺乏一个或更多个存在于细胞靶向分子中
的嵌入或插入的表位)相比，细胞靶向分子表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫原性。

[0167] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序破坏，细胞靶向分子被去免疫化，并且表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫原性。与参照细胞靶向分
子相比，细胞靶向分子表现出降低的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述参照细胞靶向分
子由细胞靶向分子组成，只是弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应多肽
组分由野生型志贺毒素A1片段组成。

[0168] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，由于多个破坏的B细胞和/或CD4+T细胞表位区域，细胞靶向分子被去免疫化，并且表现出降低的相对B细胞和/或CD4+T细胞抗原性
和/或降低的相对B细胞和/或CD4+T细胞免疫原性。在某些进一步的实施方案中，与参照分
子(例如野生型志贺毒素A片段或包含前述的细胞靶向分子，诸如由细胞靶向分子组成的第
三细胞靶向分子，只是其全部的志贺毒素效应多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段)
相比，细胞靶向分子表现出降低的相对B细胞抗原性和/或相对B细胞免疫原性。在某些进一
步的实施方案中，与参照细胞靶向分子相比，细胞靶向分子表现出降低的相对CD4+T细胞抗
原性和/或相对CD4+T细胞免疫原性，所述参照细胞靶向分子由细胞靶向分子组成，只是志
贺毒素效应多肽组分包含野生型志贺毒素A1片段序列。

[0169] 在实施方案组#1至#3的某些实施方案中，细胞靶向分子是药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。在本发明的某些实施方案中，是药物组合物，其包含本发明的上述志贺毒素
效应多肽中的任一个和/或本发明的任何一种上述细胞靶向分子；和至少一种药学上可接
受的赋形剂或载体。所述至少一种药学上可接受的载体可包括溶剂、分散介质、包衣，抗微
生物剂、等渗剂或吸收延迟剂；和/或其中所述药物组合物进一步包含水性或非水性载体；
表面活性剂；稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、乳化剂、分散剂；等渗剂；和/或抗菌或抗真菌剂。

[0170] 在本发明的某些实施方案中，是诊断组合物，其包含本发明的上述细胞靶向分子中的任一种和检测促进剂。某些进一步实施方案是本发明的细胞靶向分子，其中检测促进
剂是异源表位，且细胞靶向分子包含该异源表位。

[0171] 除了本发明的志贺毒素效应多肽、本发明的细胞靶向分子及其组合物，能够编码本发明的细胞靶向分子的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的表达载体和包含本发明
的任何多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞也在本发明的范围内。包含表达载体的宿主细
胞可用于，例如通过重组表达产生本发明分子或多肽组分或其片段的方法中。

[0172] 在本发明的某些实施方案中，是杀伤细胞(例如表达HER2的细胞)的方法，该方法包括使细胞与本发明的任何上述细胞靶向分子或本发明的上述药物组合物接触的步骤。在
某些实施方案中，接触细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，细胞表达muc-4和/或
CD44。在某些实施方案中，细胞对由T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)和/或曲妥珠单抗引起的
细胞毒性具有抗性。在细胞杀伤方法的进一步实施方案中，该方法能够在接触细胞混合物
时优先于其他细胞和/或细胞类型选择性地杀伤细胞和/或细胞类型，所述细胞的混合物中
的细胞在细胞靶向分子的结合区域的靶HER2/neu/ErbB2的细胞外存在和/或表达水平方面
不同。对于某些进一步的实施方案，细胞处于帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)、
和/或拉帕替尼存在下和/或先前已与帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)和/或拉
帕替尼接触过。在某些实施方案中，接触细胞的步骤发生在体内。在细胞杀伤方法的进一步
实施方案中，该方法能够在接触细胞混合物时优先于其他细胞和/或细胞类型选择性地杀
伤细胞和/或细胞类型，所述细胞的混合物中的细胞在细胞靶向分子的结合区域的细胞外
靶分子的细胞外存在和/或表达水平方面不同。

[0173] 在本发明的某些实施方案中，是杀伤细胞(例如表达HER2的细胞)的方法，该方法包括使细胞与本发明的任何上述细胞靶向分子或本发明的上述药物组合物接触的步骤。在
某些实施方案中，接触细胞的步骤在体外发生。在某些其他的实施方案中，接触细胞的步骤
发生在体内。在某些实施方案中，细胞表达muc-4和/或CD44。在某些实施方案中，细胞对由
T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)和/或曲妥珠单抗引起的细胞毒性具有抗性。在细胞杀伤方
法的进一步实施方案中，该方法能够在接触细胞混合物时优先于其他细胞和/或细胞类型
选择性地杀伤细胞和/或细胞类型，所述细胞的混合物中的细胞在细胞靶向分子的结合区
域的细胞外靶分子的细胞外存在和/或表达水平方面不同。对于某些进一步的实施方案，细
胞处于帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)、和/或拉帕替尼存在下和/或先前已与
帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)和/或拉帕替尼接触过。

[0174] 在本发明的某些实施方案中，是杀伤细胞(例如表达HER2的细胞)的方法，该方法包括使细胞与本发明的任何上述细胞靶向分子或本发明的药物组合物接触，其中所述细胞
处于帕妥珠单抗，T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)和/或拉帕替尼存在的情况下和/或先前已
与帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)和/或拉帕替尼接触过。在某些实施方案中，
接触细胞的步骤在体外发生。在某些其他的实施方案中，接触细胞的步骤发生在体内。在某
些实施方案中，细胞表达muc-4和/或CD44。在某些实施方案中，细胞对由T-DM1(曲妥珠单抗
emtansine)和/或曲妥珠单抗引起的细胞毒性具有抗性。在细胞杀伤方法的进一步实施方
案中，该方法能够在接触细胞混合物时优先于其他细胞和/或细胞类型选择性地杀伤细胞
和/或细胞类型，所述细胞的混合物中的细胞在细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶分子
的细胞外存在和/或表达水平方面不同。

[0175] 本发明进一步提供治疗患者的疾病、病症和/或病况的方法，所述方法各自包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子和/或本发明的药物组合物的步
骤。对于某些实施方案，治疗有此需要的患者的疾病、病症和/或病况的方法进一步包括向
有此需要的患者施用治疗有效量的一种或更多种如本文所述的另外的HER2靶向治疗剂。对
于某些实施方案，有此需要的患者先前已经用一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂治疗过
和/或对一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂的治疗没有反应或没有从中受益。对于某些
实施方案，使用本发明的方法治疗的疾病、病症或病况选自：癌症、肿瘤、生长异常、免疫病
症或微生物感染。在这些方法的某些实施方案中，待治疗的癌症选自：骨癌、乳腺癌、中枢/
外周神经系统癌症、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-尿路癌、肝癌，肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌，诸如乳腺癌、胃癌、尿路上皮癌、膀胱癌、尿路上皮膀胱癌、浆液性子宫癌症、肝外胆道癌或胆道癌。对于某些实施方案，所治疗的癌症是乳
腺癌和/或胃肠癌。对于这些方法的某些实施方案，待治疗的免疫病症是与选自由以下各项
组成的组的疾病相关的免疫紊乱：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移
 植物排斥、移植物抗宿主病、桥本氏甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关疾病、红斑狼
疮、多发性硬化症、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。

[0176] 本发明物质的任何组合物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常和/或免疫紊乱的用途都在本发明的范围内。在本发明的某些实施方案中，是本发明的细胞靶向分子和/或本
发明的药物组合物，其用于治疗或预防有此需要的患者的疾病、病症或病况。此外，本发明
的诊断组合物、多核苷酸、表达载体和宿主细胞是用于治疗或预防有此需要的患者的疾病、
病症或病况。在本发明的某些实施方案中，是本发明的细胞靶向分子和/或其药物组合物用
于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和/或微生物感染。在本发明的某些实施方案
中，是本发明的细胞靶向分子和/或本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防有此需要
的患者的疾病、病症或病况的药物中的用途。此外，本发明提供了本发明的诊断组合物、多
核苷酸、表达载体和宿主细胞在制备用于治疗或预防有此需要的患者的疾病、病症或病况
的药物中的用途。在本发明的某些实施方案中，是本发明的细胞靶向分子和/或其药物组合
物在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫紊乱或微生物感染的药物中的用途。
此外，本发明提供了本发明的诊断组合物、多核苷酸、表达载体和宿主细胞在制备用于治疗
或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫紊乱或微生物感染的药物中的用途。“疾病、病症或病况”或“癌症、肿瘤、生长异常、免疫紊乱或微生物感染”可以通过与HER2/neu/ErbB2物理偶联的
细胞来表征。HER2/neu/ErbB2靶生物分子能够物理偶联到细胞的表面。在某些实施方案中，
疾病、病症或病况可以通过表达HER2/neu/ErbB2靶生物分子的细胞(包括过表达HER2的细
胞)来表征。HER2/neu/ErbB2能够在细胞表面表达(包括过表达)。

[0177] 本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可用于将另外的外源物质递送到与本发明的细胞靶向分子的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞中。另外，本发明提供了将外源物
质递送至细胞内部的方法，所述方法包括使细胞在体外或体内与本发明的细胞靶向分子、
药物组合物和/或诊断组合物接触。本发明进一步提供了将外源物质递送至患者的细胞(例
如HER2表达细胞)内部的方法，该方法包括向患者施用本发明的细胞靶向分子(具有或不具
有细胞毒活性)的步骤，其中靶细胞与细胞靶向分子的细胞外靶生物分子物理偶联。

[0178] 在本发明的某些实施方案中，是向细胞(例如HER2表达细胞)递送能够由细胞的MHC I类分子呈递的T细胞表位的方法，该方法包括使所述细胞与本发明的细胞靶向分子接
触的步骤，所述细胞靶向分子与异源性T细胞表位和/或其组合物(例如，本发明的药物或诊
断组合物)缔合。

[0179] 在本发明的某些实施方案中，是用于“接种”脊索动物内的组织部位的方法，该方法包括以下步骤：向脊索动物施用本发明的细胞靶向分子，本发明的药物组合物和/或本发
明的诊断组合物(参见例如，WO2017/019623；WO 2018/140427)。对于某些进一步的实施方
案，本发明的用于“接种”组织部位的方法是用于“接种”包含恶性的、患病的或发炎的组织
的组织部位。恶性的、患病或发炎的组织可以通过与HER2/neu/ErbB2物理偶联的细胞来表
征。HER2/neu/ErbB2靶生物分子能够物理偶联到细胞的表面。对于某些实施方案，疾病、病
症或病况可以通过表达HER2/neu/ErbB2靶生物分子的细胞(包括过表达HER2的细胞)来表
征。HER2/neu/ErbB2能够在细胞表面表达(包括过表达)。对于某些进一步的实施方案，本发
明的用于“接种”组织部位的方法是用于“接种”包含选自由以下各项组成的组的组织的组
织部位：患病组织、肿瘤块、癌性生长、肿瘤、感染的组织或异常细胞块。对于某些进一步的
实施方案，本发明的用于“接种”组织部位的方法包括向脊索动物施用本发明的包含异源性
T细胞表位的细胞靶向分子、本发明的药物组合物或本发明的诊断组合物，所述异源性T细
胞表位选自由以下各项组成的组：MHC I类复合物中不通过细胞靶向分子的靶细胞天然呈
递的肽、非天然存在于靶细胞表达的任何蛋白质内的肽、非天然存在于靶细胞的蛋白质组
内的肽、非天然存在于待接种部位的细胞外微环境中的肽以及非天然存在于待靶向的肿瘤
块或感染组织部位的肽。该患病组织、肿瘤块、癌性生长、肿瘤、感染的组织或异常细胞块可
以通过与HER2/neu/ErbB2物理偶联的细胞来表征。HER2/neu/ErbB2靶生物分子能够物理偶
联到细胞的表面。对于某些实施方案，疾病、病症或病况可以通过表达HER2/neu/ErbB2靶生
物分子的细胞(包括过表达HER2的细胞)来表征。HER2/neu/ErbB2能够在细胞表面表达(包
括过表达)。

[0180] 本发明物质的任何组合物用于疾病、病症和/或病况的诊断、预后和/或表征的用途都在本发明的范围内。例如，本发明的细胞靶向分子、药物组合物、诊断组合物、多核苷
酸、表达载体和宿主细胞用于疾病、病症和/或病况的诊断、预后和/或表征的用途在本发明
的范围内。在本发明的某些实施方案中，是使用本发明的细胞靶向分子的方法，其包含本发
明的检测促进剂和/或组合物(例如诊断组合物)，用于收集对诊断、预后有用的信息，或用
于表征疾病、病症或病况。在本发明的某些实施方案中，是使用本发明的细胞靶向分子和/
或诊断组合物检测细胞(或其亚细胞区室)的方法，该方法包括使细胞与细胞靶向分子和/
或诊断组合物接触以及检测所述细胞靶向分子和/或诊断组合物的存在的步骤。在某些实
施方案中，接触细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，接触细胞的步骤在体内发生。
在某些实施方案中，检测细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，检测细胞的步骤在体
内发生。在某些进一步的实施方案中，该方法涉及在将细胞靶向分子施用至所述生物体后，
使用一种或更多种成像方法检测生物体中细胞靶向分子的位置。例如，掺入如本文所述的
检测促进剂的本发明的细胞靶向分子可用于表征潜在地通过本发明的相关药物组合物治
疗的疾病。例如，本发明的某些细胞靶向分子及其组合物(例如本发明的药物组合物和诊断
组合物)和本发明的方法可用于确定患者是否属于对本发明的药物组合物响应的组。例如，
本发明的某些细胞靶向分子及其组合物可用于鉴定在细胞表面上呈递经递送的异源性表
位-肽的细胞，和/或鉴定含有呈递通过本发明的细胞靶向分子递送的异源性表位-肽的细
胞的受试者。“疾病、病症或病况”可通过与HER2/neu/ErbB2物理偶联的细胞表征。HER2/
neu/ErbB2靶生物分子能够物理偶联到细胞的表面。在某些实施方案中，疾病、病症或病况
可以通过表达HER2/neu/ErbB2靶生物分子的细胞(包括过表达HER2的细胞)来表征。HER2/
neu/ErbB2能够在细胞表面表达(包括过表达)。

[0181] 在本发明的某些实施方案中，是产生本发明分子的方法，该方法包括使用细菌细胞壁蛋白结构域相互作用(例如，来自P.magnus的蛋白L或其衍生物和其结合结构域片段或
来自S.areus的蛋白A或其衍生物和其结合结构域片段)纯化本发明的分子的步骤。对于某
些进一步的实施方案，该方法的纯化步骤涉及包含SEQ ID NO:22-36或97-108中所示的任
何一个多肽、基本上由其组成或由其组成的细胞靶向分子。

[0182] 在本发明的某些实施方案中是试剂盒，其包含本发明物质的组合物，和任选地，使用说明书、其他试剂和/或药物递送装置。例如，本发明提供了试剂盒，其包含：(i)本发明的
细胞靶向分子，(ii)本发明的药物组合物，(iii)本发明的诊断组合物，(iv)本发明的多核
苷酸，(v)本发明的表达载体和/或(vi)本发明的宿主细胞；和任选地，使用说明书、其他试
剂和/或药物递送装置。试剂盒可以进一步包含用于检测样品或受试者中的细胞类型(例如
肿瘤细胞)的试剂和其他工具。

[0183] 参考以下描述、所附权利要求和附图，会更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点。本发明的前述要素可以单个地组合或自由地除去以便形成本发明的其它实施方
案，在下文中没有反对这样的组合或除去的任何陈述。

附图说明

[0184] 图1描绘了示例性HER2靶向分子，其包含一个或更多个去免疫化的志贺毒素A亚基效应多肽和一个或更多个HER2结合区域。这些示例性细胞靶向分子各自包含具有去免疫突
变的志贺毒素效应多肽和在志贺毒素效应多肽的羧基末端附近的破坏的弗林蛋白酶切割
位点。虚的垂直灰色线描绘了志贺毒素效应多肽的A1片段来源区域的羧基末端处的破坏的
弗林蛋白酶切割位点。“N”和“C”分别表示细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端和羧基末
端。在一个示例性HER2靶向分子中，HER2结合区域是scFv，并且显示所述scFv参与与邻近
scFv(左下)的分子间可变结构域交换。图1中示例性分子的描述是出于本发明的有限的一
组实施方案的结构特征的某些一般排列的说明性目的。应理解，这些示例性分子并不意图
也不应被解释为对于本发明分子的任何结构特征和/或组分的排列是完全确定的。已经简
化了图1的示意图中所示的相对尺寸、位置或特征数量。图1中的示意图不旨在准确地描绘
关于本发明的任何实施方案中的分子结构的相对尺寸的任何信息。

[0185] 图2显示了示例性HER2靶向分子114778(SEQ ID NO:24)、114795(SEQ ID NO:25)、114791(SEQ ID NO:26)的样品和分子量大小标记物(均在还原条件下制备用于凝胶加载)
电泳后的考马斯染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。114778(SEQ ID NO:
24)、114795(SEQ ID NO:25)和114791(SEQ ID NO:26)的样品使用涉及壳多糖结合相互作
用的色谱法制备，然后通过亲和标签(SEQ ID NO:43)的去除和洗脱从壳多糖树脂色谱柱切
割走。图2显示分子114778(SEQ ID NO:24)、114795(SEQ ID No:25)和114791(SEQ ID NO:
26)的制备物的还原样品中的主要蛋白质的大小都是大约55千道尔顿(kDa)。

[0186] 图3图示了研究HER2靶向分子114778(SEQ ID NO:24)、114795(SEQ ID NO:25)和114791(SEQ ID NO:26)的活性的细胞杀伤试验的结果。图3显示示例性HER2靶向分子
114778(SEQ ID NO:24)，114795(SEQ ID NO:25)和114791(SEQ ID NO:26)对两种不同的
HER2表达细胞类型：HCC1954和NCI/ADR-RES-HER2+细胞，表现出细胞毒性。将针对每种细胞
类型的靶阳性细胞的存活率百分比针对施用至各细胞的HER2靶向分子浓度以10为底的对
数绘图。

[0187] 图4显示了示例性HER2靶向分子114773(SEQ ID NO:22)和114791(SEQ ID NO:26)的样品和分子量大小标记物(均在非还原条件下制备用于凝胶加载)电泳后的考马斯染色
的SDS-PAGE凝胶。114773(SEQ ID No:22)和114791(SEQ ID NO:26)的样品使用Protein-L
亲和层析制备，所述样品皆包含羧基端内含肽壳多糖结合结构域(CBD)序列(SEQ ID NO:
43)。图4显示分子114773(SEQ ID NO:22)的制备物样品中主要蛋白质的大小为约100千道
尔顿(kDa)，而114791(SEQ ID NO:26)样品在该测定中缺乏蛋白质信号，可能是由于缺乏蛋
白L结合亲和力。

[0188] 图5显示了示例性HER2靶向分子114912(SEQ ID NO:28)、115111(SEQ ID NO:29)、115411(SEQ ID NO:30)的样品和分子量大小标记物(均在非还原条件下制备用于凝胶加
载)电泳后的两个考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。114912(SEQ ID NO:28)、115111(SEQ ID
NO:29)、115411(SEQ ID NO:30)的样品使用蛋白-L亲和层析且不使用任何壳多糖结合亲和
标签制备。图5显示分子115111(SEQ ID NO:29)、115411(SEQ ID No:30)和114912(SEQ ID
NO:28)的制备物的还原样品中的主要蛋白质的大小各自是大约55千道尔顿(kDa)。

[0189] 图6图示示例性HER2靶向分子114912(SEQ ID NO:28)和115111(SEQ ID NO:29)对五种不同的HER2表达细胞类型：HCC1954、NCI/ADR-RES-HER2+、JIMT-1、SK-OV-3和HCC1419
细胞表现出细胞毒性。将细胞的存活率百分比针对施用的HER2靶向蛋白质浓度的以10为底
的对数绘图。图6图示115111(SEQ ID No:29)通常比114912(SEQ ID NO:28)具有更强的细
胞毒性。图6还显示，对于大多数测试的HER2靶向分子浓度，没有观察到对表达非常低水平
的HER2的MCF7细胞的细胞毒性。114912(SEQ ID NO:28)和115111(SEQ ID NO:29)的样品使
用蛋白-L亲和层析且不使用任何壳多糖结合亲和标签制备。

[0190] 图7图示示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)、115194(SEQ ID NO:33)和115195(SEQ ID NO:32)对四种不同的HER2表达细胞类型：
HCC1954、NCI/ADR-RES-HER2+、JIMT-1和HCC1569细胞，表现出细胞毒性。将细胞的存活率百
分比针对施用的HER2靶向蛋白质浓度的以10为底的对数绘图。图7图示了115111(SEQ ID
NO:29)，115172(SEQ ID NO:23)，115194(SEQ ID No:33)和115195(SEQ ID NO:32)在测试
条件下在该测定中显示出相似的细胞毒活性。图6还显示，对于大多数测试的HER靶向分子
浓度，没有观察到对HER2阴性ST486细胞的细胞毒性。

[0191] 图8图示了本发明的示例性HER2靶向分子在体外和在一系列浓度下的蛋白质合成抑制活性。对于每个样品分子，将在测定期间以相对发光单位(RLU乘以e3)表达的萤光素酶
的发光强度针对以皮摩尔(pM)测试的HER2-靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。这些示
例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID No:23)和115411(SEQ ID NO:
30)显示出与“对照”分子相当的核糖体抑制活性，所述“对照”分子是单独的志贺毒素效应
多肽(SLTA-DI-2(SEQ ID NO:20))，不与任何靶向剂或结合区域偶联。另外，115111(SEQ ID
No:29)的蛋白质合成抑制活性与115172(SEQ ID NO:23)的活性相似，表明与SLTA-DI-2
(SEQ ID NO:20)或SLTA-FR(SEQ ID NO:37)融合的相同的scFv导致了相似的核糖体抑制活
性。

[0192] 图9图示示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)和115411(SEQ ID NO:30)对NCI/ADR-RES-HER2+细胞表现出细胞毒性。将细胞的存活率百分
比针对施用的蛋白质浓度的以10为底的对数绘图。图9还显示单独的非靶向志贺毒素效应
多肽(SLTA-DI-2(SEQ ID NO:20))在所测试的浓度范围内在该测定中没有细胞毒性。图9图
示115111(SEQ ID NO:29)和115172(SEQ ID NO:23)在一些浓度下显示出比115411(SEQ ID
NO:30)具有更强的细胞毒性。

[0193] 图10图示使用HER2阳性HCC1954细胞和流式细胞术方法，本发明的示例性HER2靶向分子的HER2结合特征。对于每个样品分子，将测量为平均荧光强度(总MFI)的FITC的荧光
信号针对以μg/mL测试的HER2靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。示例性HER2靶向分子
114912(SEQ ID NO:28)、115111(SEQ ID NO:29)、115195(SEQ ID NO:32)、115645(SEQ ID
NO:34)和115845(SEQ ID No:35)尽管具有不同的特征，但是都表现出与HER2阳性细胞的结
合。115111(SEQ ID NO:29)、115195(SEQ ID No:32)和115845(SEQ ID NO:35)似乎在该测
定条件下表现出与HCC1954细胞的最高亲和力结合。

[0194] 图11显示了人HER2蛋白结构的两个图示，其中某些残基标记为参与被HER2结合蛋白结合。在图11的左侧，涉及结合人HER2的115111(SEQ ID NO:29)的HER2残基显示为红色
和蓝色原子空间填充球。在图11的右侧，相同的HER2残基仅显示为蓝色原子空间填充球，已
知对某些已批准的抗HER2治疗性单克隆抗体的结合至关重要的HER2残基：已知对通过帕妥
珠单抗结合的结合至关重要的HER2残基显示为品红色空间填充球，且已知对曲妥珠单抗结
合至关重要的HER2残基显示为紫色原子空间填充球。图11证明由115111(SEQ ID NO:29)结
合的HER2表位在HER2细胞外结构域(ECD)内定位至结构域I(在右侧，为绿色)；由帕妥珠单
抗结合的HER2表位定位至ECD的结构域II，并且由曲妥珠单抗结合的HER2表位定位至ECD的
结构域IV。图11突出显示由115111(SEQ ID NO:29)、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗结合的HER2
表位彼此不同且彼此远离。

[0195] 图12图示了用于通过示例性HER2-靶向分子115111(SEQ ID NO:29)测试HER2结合的特异性和选择性的人膜蛋白质组阵列测定的结果。图12中显示的结果显示，从约5,300种
不同蛋白质中，仅有HER2被鉴定并被验证为被115111(SEQ ID NO:29)结合。流式细胞术用
于鉴定每种个体蛋白质的结合信号，并将数据对背景信号归一化。将非特异性荧光确定为
低于噪声之上三个标准偏差的任何值(虚线)。

[0196] 图13图示了示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)比T-DM1对两种不同的HER2表达细胞类型：HCC1954和NCI/ADR-RES-HER2+更具细胞毒性。将细胞的存活率百分比
针对施用的HER2靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。图13还显示，针对在该测定的条件
下测试的HER2-靶向分子115111(SEQ ID NO:29)接触的HER2阴性MDA-MB-468细胞，未观察
到细胞毒性。

[0197] 图14图示了在拉帕替尼存在或不存在的情况下，示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)对两种不同HER2表达细胞类型——HCC1419和HCC1954的细胞毒性。针对以下不
同条件绘制细胞的存活率百分比：用1μM的仅拉帕替尼、用20纳克/毫升(ng/mL)的115111
(SEQ ID NO:29)和用20ng/mL的115111(SEQ ID NO:29)和1μM的拉帕替尼两者处理的
HCC1419细胞；或仅用1μM的拉帕替尼、用2ng/mL的115111(SEQ ID NO:29)和用2ng/mL的
115111(SEQ ID NO:29)和1μM的拉帕替尼两者处理的HCC1954细胞。图14还显示了单独使用
志贺毒素效应多肽SLTA-DI-2(SEQ ID NO:20)的对照处理，所述志贺毒素效应多肽SLTA-
DI-2缺乏针对细胞靶向的任何特异性靶向剂或结合区域，在此测定中不导致细胞活力的改
变。

[0198] 图15图示了示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)在T-DM1存在下对HER2阳性HCC1954细胞是细胞毒性的。用单独的115111(SEQ ID NO:29)、单独的T-DM1或用相同浓
度混合在一起的115111(SEQ ID NO:29)和T-DM1处理细胞。将细胞的存活率百分比针对总
的施用的蛋白浓度(单独的115111(SEQ ID NO:29)、单独的T-DM1，或T-DM1和115111(SEQ
ID NO:29)两者的总和)的以10为底的对数作图。

[0199] 图16图示了在添加HER2靶向分子之前过量曲妥珠单抗(20μg/mL)预处理1小时存在下的HER2靶向分子的活性。将HER2阳性HCC1954细胞的存活率百分比针对施用的HER2靶
向分子浓度的以10为底的对数绘图。图16显示示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)
在过量曲妥珠单抗存在下对细胞具有细胞毒性。图16的顶部图显示示例性HER2靶向分子
114912(SEQ ID NO:28)在测试条件下在过量曲妥珠单抗存在下没有细胞毒性。图16的中间
图显示示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)对与过量曲妥珠单抗预温育的HCC1954
细胞具有细胞毒性，细胞毒性没有显著损失。下图显示T-DM1对HCC1954细胞的细胞毒活性
通过用过量曲妥珠单抗(20μg/mL)预温育细胞来降低。

[0200] 图17图示了示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)在过量曲妥珠单抗(100μg/mL)、帕妥珠单抗(100μg/mL)或两者(每种抗体100μg/mL)存在下，在加入HER2靶向分子之
前预处理1小时的细胞毒活性。将HER2阳性细胞的存活率百分比针对施用的115111(SEQ ID
NO:29)浓度的以10为底的对数绘图。图17显示示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID No:29)
在过量曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗两者存在下对细胞是细胞毒性
的。图17的顶部图显示示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)对用过量曲妥珠单抗、
帕妥珠单抗或两者预温育的HCC1954细胞是细胞毒性的。底部图显示示例性HER2靶向分子
115111(SEQ ID NO:29)对用过量的曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或两者预温育的NCI-N87细胞
是细胞毒性的。图17还显示了单独用115111(SEQ ID NO:29)处理细胞的细胞毒性。单独的
115111(SEQ ID NO:29)的细胞毒性似乎与其在过量曲妥珠单抗、过量帕妥珠单抗或过量曲
妥珠单抗和帕妥珠单抗两者存在下的细胞毒性非常相似。

[0201] 图18图示了对于更短的暴露持续时间，示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)比示例性HER2靶向分子114912(SEQ ID NO:28)对HER2表达细胞具有更强效的细胞毒
性。将HER2阳性SKBR3细胞的存活率百分比针对施用的HER2靶向分子浓度的以10为底的对
数绘图。图18的顶部图显示，在1小时暴露的条件下，在更高浓度下，示例性HER2靶向分子
115111(SEQ ID NO:29)比114912(SEQ ID NO:28)对SKBR3细胞更具细胞毒性。图18的中间
图显示，在4小时暴露的条件下，在更高浓度下，示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:
29)比114912(SEQ ID NO:28)对SKBR3细胞更具细胞毒性。底部图显示，在连续暴露条件下，
示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)和114912(SEQ ID NO:28)表现出相似的细胞
毒性。

[0202] 图19图示了针对更短的暴露持续时间，示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)比其他的示例性HER2靶向分子具有更强效的细胞毒性。将HER2阳性HCC1954细胞的存活
率百分比针对施用的HER2靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。图19的顶部图显示，在4小
时暴露的条件下，示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)比114898(SEQ ID NO:31)对
HCC1954细胞更具细胞毒性。图19的中间图显示示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:
29)和115195(SEQ ID NO:32)在4小时暴露和连续暴露的条件下都表现出彼此相似的细胞
毒性，且当将4小时(短)温育结果与连续暴露结果进行比较时，这些分子在细胞毒性效力方
面表现出最小差异。图19的底部图显示示例性HER2靶向分子115645(SEQ ID NO:34)和
115845(SEQ ID NO:35)在4小时暴露和连续暴露的条件下都表现出彼此相似的细胞毒性，
且与连续暴露数天相比，在用HER2靶向分子温育的较短4小时内，这两种HER2靶向分子的活
性在细胞毒性效力方面是降低的。

[0203] 图20图示了使用人(SEQ ID NO:39)，小鼠(SEQ ID NO:42)或食蟹猴(SEQ ID NO:40)来源的重组HER2蛋白，本发明的示例性HER2靶向分子的体外HER2结合特征。图20的顶部
部分图示了针在一系列HER2靶向分子浓度下测试的114912(SEQ ID NO:28)、115111(SEQ
ID NO:29)和115195(SEQ ID NO:32)的ELISA信号。相对于在x轴上以ng/mL表示的HER2靶向
分子浓度，以450纳米(nm)的吸光度测量的背景扣除的ELISA信号在Y轴上绘制。115111(SEQ
ID No:29)和115195(SEQ ID NO:32)以相似结合特征结合人HER2ECD蛋白(“huHER2”)和食
蟹猴HER2ECD蛋白(“cynoHER2”)，其似乎是在该测定中，在大多数浓度下的亲和力略高于由
曲妥珠单抗结合结构域来源的分子114912(SEQ ID NO:28)所显示的HER2结合。图20的底部
部分显示了针对115111(SEQ ID NO:29)与人HER2、食蟹猴HER2或小鼠HER2在10μg/mL的
HER2靶向分子的结合，在450nm处吸光度下测量的背景扣除的ELISA信号。示例性HER2靶向
分子115111(SEQ ID NO:29)在该测定中结合重组人HER2蛋白和重组食蟹猴HER蛋白两者，
但未显示出与重组小鼠HER2蛋白的可感知的结合。

[0204] 图21图示了施用重复剂量的本发明的示例性HER2靶向分子的免疫活性小鼠的体重。使用每组中小鼠的给药前体重计算的每个治疗组的平均体重变化相对于研究的天数在
Y轴上作图。BALB/c小鼠组静脉内施用仅含载体的对照或1毫克/千克(mg/kg)体重的这些示
例性HER2靶向分子之一：115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)、115195(SEQ ID
NO:32)或115194(SEQ ID NO:33)。在11594(SEQ ID NO:33)治疗组中，所有小鼠在研究第12
天时已经死亡。在115195(SEQ ID NO:32)治疗组中，除了一只小鼠之外的所有小鼠在研究
第14天时死亡。相反，115111(SEQ ID NO:29)治疗组显示出与仅含载体的对照组相似的最
小重量变化。

[0205] 图22图示了施用重复剂量的本发明的示例性HER2靶向分子的免疫活性小鼠的体重。使用每组中小鼠的给药前体重计算的每个治疗组的平均体重变化相对于研究的天数在
Y轴上作图。C57BL/6小鼠组静脉内施用仅含载体的对照或1mg/kg体重的这些示例性HER2靶
向分子之一：115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)或115411(SEQ ID NO:30)。在
115172(SEQ ID NO:23)治疗组中，所有小鼠在研究第23天时已经死亡。相反，115111(SEQ
ID NO:29)治疗组中的小鼠耐受115111(SEQ ID NO:29)用药通过了研究第45天(研究结
束)。

[0206] 图23显示施用包含去免疫化的志贺毒素效应多肽的示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)导致与115172(SEQ ID NO:23)(其包含较少去免疫化的志贺毒素效应多
肽)相比，藉由哺乳动物免疫系统的减少的体内抗体反应。将115111(SEQ ID No:29)或
115172(SEQ ID NO:23)以0.25-1mg/kg体重的剂量施用至BALB/c小鼠。图23的顶部图显示
了在115111(SEQ ID No:29)治疗组的血清中测量的抗药物抗体的量，作为在研究的不同天
测量的115172(SEQ ID NO:23)治疗组的百分比，所述研究使用通过腹膜内注射(IP)施用
0.25mg/kg体重的115111(SEQ ID No:29)或115172(SEQ ID NO:23)的BALB/c小鼠。图23的
底部图显示了作为在450nm处的吸光度测量的ELISA信号，所述信号显示了在研究的第22天
收集的血清中测量的抗药物抗体的量，所述研究使用静脉内(IV)施用1mg/kg体重的115111
(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)或仅含载体的对照的BALB/c的小鼠组。来自
115111(SEQ ID NO:29)治疗组的血清表现出比来自第22天收集的115172(SEQ ID NO:23)
处理组的血清少得多的抗药物抗体。

[0207] 图24图示了人乳腺癌的皮下HCC1954异种移植鼠模型研究的结果。图24的顶部部分图示了SCID Beige小鼠组在接受本发明的示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)
或仅含载体的对照样品后的人肿瘤负荷随时间的变化。对于每组小鼠，以立方毫米测量的
平均肿瘤体积相对于时间(肿瘤植入后的天数)作图。示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID
No:29)的施用在所有展示的剂量(在31至33天的周期中每次剂量每公斤体重0.1mg至2mg)
下延迟并减少了对于仅含载体的对照组观察到的肿瘤负荷的增加。图24的底部部分使用卡
普兰-迈耶评估(estamitor)曲线描绘与上文相同的研究中直至第84天的小鼠组的存活。在
y轴上是剂量组内小鼠的存活百分比，且x轴是研究的天数。与仅含载体的对照样品相比，以
0.1至2mg/kg体重重复施用115111(SEQ ID NO:29)提供了存活益处。

[0208] 发明详述

[0209] 在下文中使用示例性的、非限制性的实施方案和参照附图更充分地描述本发明。但是，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被理解为限于下面阐述的实施方案。相
反，提供这些实施方案使得本公开内容更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人
员。

[0210] 为了可以更容易地理解本发明，在下面定义某些术语。在发明详述内可以发现另外的定义。

[0211] 如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚地指明，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。

[0212] 如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及两个种类A和B时，术语“和/或”是指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及超过两个种类诸如
A、B和C时，术语“和/或”是指A、B、或C中的至少一种，或A、B、或C的任何组合中的至少一种(每个种类以单个或多个可能性存在)。

[0213] 贯穿本说明书，词语“包含”或变型诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组，但是不排除任何其它整数(或组分)或整数(或组分)的组。

[0214] 贯穿本说明书，术语“包括”用于指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

[0215] 如本文所用，术语“多个”意指不止一个；诸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。

[0216] 术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括指掺入蛋白质，多肽或肽中的氨基酸。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”是指物理上构成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白质”是包含一个或更多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是尺寸小于约总计15至20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”是指在物理上构成肽或
多肽(取决于长度)的一系列氨基酸或氨基酸残基。除非另有说明，本文中公开的多肽和蛋
白序列从左至右书写，代表它们从氨基端至羧基端的次序。

[0217] 术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或“多肽序列”包括天然存在的氨基酸(包括L和D异构体)，且除非另有限制，也包括能够以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的天然氨基酸的已知类似物，诸如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧
基谷氨酸、羟脯氨酸、羟丁赖氨酸、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。用如下表A中的简写名称描述
在本文中提及的氨基酸：

[0218] 表A.氨基酸命名法

[0219]名称 3-字母 1-字母
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 ASN N
天冬氨酸或天冬氨酸盐 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸或谷氨酸盐 Glu E
谷氨酰胺 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V

[0220] 关于肽、肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的氨基酸残基的短语“保守置换”是指肽、肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的氨基酸组成的变化，所述变化基本上不改变整个肽、
肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的功能和结构(参见Creighton,Proteins:Structures
and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,New York(第二版,1992)))。

[0221] 如本文所用，术语“HER2”可与术语“neu”和“ErbB2”互换使用。

[0222] 就本发明的目的而言，当提及多肽或多肽区域时，短语“来源于”意指多肽或多肽区域包含最初在“亲本”蛋白质中发现的氨基酸序列，且其现在可能包含相对于原始多肽或
多肽区域的某些氨基酸残基添加、缺失、截短、重排或其他改变，只要“亲本”分子的某些功
能和结构基本是保守的。技术人员将能够使用本领域已知的技术，例如蛋白质序列比对软
件，鉴定从其衍生的多肽或多肽区域的亲本分子。

[0223] 就要求保护的发明的目的而言并且关于志贺毒素多肽序列或志贺毒素来源的多肽，术语“野生型”通常是指在活的物种(例如，致病细菌)中发现的天然存在的志贺毒素蛋
白质序列，其中所述志贺毒素蛋白质序列是最常出现的变体之一。这与不常发生的志贺毒
素蛋白质序列形成对比，这些序列虽然仍然是天然存在的，但在对该包含至少一种志贺毒
素蛋白变体的物种的统计学上有效数目的天然存在的个体生物进行取样时，发现在给定物
种的个体生物体中不到1％。天然分离物在其天然环境之外的克隆扩增(不考虑分离物是否
是包含生物学序列信息的生物体或分子)不会改变天然存在的需求，只要该克隆扩增不引
入不存在于该物种的天然发生的群体的新序列变体和/或不改变序列变体相对于彼此的比
例即可

[0224] 关于要求保护的发明的术语“缔合的”、“缔合”、“连接的”或“连接”是指分子的两个或更多个组分被结合、附着、相连或另外偶联以形成单个分子的状态，或通过在两个分子之间产生缔合、连接、附着和/或任何其他相连使两个分子彼此缔合以形成单个分子的行
为。例如，术语“连接的”可以指通过一个或更多个原子相互作用缔合的两个或更多个组分，
使得形成单个分子，并且其中原子相互作用可以是共价的和/或非共价的。两种组分之间共
价缔合的非限制性实例包括肽键和半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。两种分子组分之间的非共
价缔合的非限制性实例包括离子键。

[0225] 就本发明的目的而言，术语“连接的”是指通过一个或更多个原子相互作用缔合的两个或更多个分子组分，使得形成单个分子，并且其中原子相互作用包括至少一个共价键。
就本发明的目的而言，术语“连接”是指产生如上所述的连接分子的行为。

[0226] 就本发明的目的而言，术语“融合的”是指通过至少一个作为肽键的共价键连接的两个或更多个蛋白性组分，无论肽键是否涉及羧酸基团的碳原子的参与或涉及另一个碳原
子，诸如例如α-碳、β-碳、γ-碳、σ-碳等。融合在一起的两种蛋白性组分的非限制性实例包括例如通过肽键(使得所得分子是单个连续的多肽)与多肽融合的氨基酸、肽或多肽。就本
发明的目的而言，术语“融合”是指产生如上所述的融合分子的行为，例如由遗传区域的重
组融合产生的融合蛋白，其在翻译时产生单个蛋白性分子。

[0227] 符号“::”意指在它之前和之后的多肽区域物理连接在一起形成连续多肽。

[0228] 如本文所用，术语“表达的”，“进行表达”或“表达”及其语法变体是指多核苷酸或核酸翻译成蛋白质。表达的蛋白质可以保留在细胞内，成为细胞表面膜的组分或分泌到细胞外空间。

[0229] 如本文所用，在至少一个细胞表面表达显著量的细胞外靶生物分子的细胞是“靶阳性细胞”或“靶+细胞”，并且是与指定的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞。

[0230] 如本文所用，符号“α”是能够结合在该符号后的生物分子的免疫球蛋白型结合区域的简写。符号“α”用于指免疫球蛋白型结合区域的功能特征，其基于其以10-5或更低的解
离常数(KD)描述的结合亲和力结合该符号之后的生物分子的能力。

[0231] 如本文所用，术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别指任何抗体VH或VL结构域(例如，人VH或VL结构域)以及保留相应的天然抗体的至少定性抗原结合能
力的任何其衍生物(例如来源于天然鼠VH或VL结构域的人源化VH或VL结构域)。VH或VL结构域
由被三个CDR或ABR中断的“框架”区域组成。框架区用于使CDR或ABR对齐用于特异性结合抗
原的表位。从氨基末端到羧基末端，VH和VL结构域均包含以下框架区(FR)和CDR区或ABR区：
FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4；或类似地FR1、ABR1、FR2、ABR2、FR3、ABR3和FR4。如本文所用，术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”分别用于指VH结构域中的CDR1、2或3，且术语“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”分别用于指VL结构域中的CDR1、2或3。如本文所用，术语
“HABR1”、“HABR2”或“HABR3”分别用于指VH结构域中的ABR1、2或3，且术语“LABR1”、“LABR2”或“LABR3”分别用于指VL域中的ABR 1、2或3。对于骆驼科动物VHH片段、软骨鱼的IgNAR、VNAR片段、某些单结构域抗体及其衍生物，存在包含相同基本排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4的单个重链可变结构域。如本文所用，术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”可分别用于指单个重链可变结构域中的CDR1、2或3。

[0232] 就本发明的目的而言，术语“效应物”意指提供生物学活性，例如细胞毒性、生物信号传导、酶促催化、亚细胞按路径发送和/或分子间结合，从而产生变构效应和/或招募一个
或更多个因子。

[0233] 就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A亚基效应多肽”、“志贺毒素效应多肽”、“志贺毒素效应多肽区域”和“志贺毒素效应区域”是指来源于志贺毒素家族成员的至少一种志贺毒素A亚基的多肽或多肽区域，其中所述多肽或多肽区域能够表现出至少一种志贺毒素
功能。例如，SEQ ID NO:19-21来源于StxA和SLT-1A。

[0234] 就本发明的目的而言，志贺毒素效应子功能是由来源于志贺毒素A亚基或原始志贺毒素A亚基的多肽区域赋予的生物学活性。志贺毒素效应子功能的非限制性实例包括促
进细胞进入；脂质膜变形；促进细胞内化；刺激网格蛋白介导的内吞作用；引导细胞内按路
线发送至各种细胞内区室，例如高尔基体、内质网和胞质溶胶；引导具有货物的细胞内按路
线发送；抑制核糖体功能；催化活性，例如N-糖苷酶活性和催化抑制核糖体；减少蛋白质合
成、诱导胱天蛋白酶活性、激活效应胱天蛋白酶、实现细胞抑制作用和细胞毒性。志贺毒素
催化活性包括例如核糖体失活、蛋白质合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸:腺苷糖苷酶活
性、RNA酶活性和DNA酶活性。志贺毒素是核糖体失活蛋白(RIP)。RIP可以对核酸、多核苷、多
核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和polyA)和病毒核酸托嘌呤(参见例如，Barbieri L等
人,Biochem J 286:1-4(1992)；Barbieri L等人,Nature372:624(1994)；Ling J等人,FEBS
Lett 345:143-6(1994)；Barbieri L等人,Biochem J 319:507-13(1996)；Roncuzzi L,
Gasperi-Campani A,FEBS Lett392:16-20(1996)；Stirpe F等人,FEBS Lett 382:309-12
(1996)；Barbieri L等人,Nucleic Acids Res 25:518-22(1997)；Wang P,Tumer N,
Nucleic Acids Res 27:1900-5(1999)；Barbieri L等人,Biochim Biophys Acta 1480:
258-66(2000)；Barbieri L等人,J Biochem 128:883-9(2000)；Brigotti M等人,Toxicon
39:341-8(2001)；Brigotti M等人,FASEB J 16:365-72(2002)；Bagga S等人,J Biol Chem
278:4813-20(2003)；Picard D等人,J Biol Chem280:20069-75(2005))。一些RIP表现出抗
病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等人,Antimicrob Agents Chemother 37:835-8
(1993)；Au T等人,FEBS Lett 471:169-72(2000)；Parikh B,Tumer N,Mini Rev Med Chem
4:523-43(2004)；Sharma N等人,Plant Physiol 134:171-81(2004))。已经在体外和体内
观察到志贺毒素催化活性。用于志贺毒素效应子活性的测定的非限制性实例测量各种活
性，例如蛋白质合成抑制活性、脱嘌呤活性、细胞生长抑制、细胞毒性、超螺旋DNA松弛活性
和核酸酶活性。

[0235] 如本文所用，志贺毒素效应子功能的保留是指能够表现出志贺毒素功能活性水平，如通过具有再现性的适当定量测定法测量，其与在相同条件下的野生型志贺毒素效应
多肽对照(例如，志贺毒素A1片段)或包含野生型志贺毒素效应多肽(例如，志贺毒素A1片
段)的细胞靶向分子相当。对于核糖体失活或核糖体抑制的志贺毒素效应子功能，通过例如
使用技术人员已知的和/或本文描述的测定法，保留的志贺毒素效应子功能在体外环境中
表现出10，000pM或更少的IC50。对于在靶阳性细胞杀伤试验中的细胞毒性的志贺毒素效应
子功能而言，保留的志贺毒素效应子功能表现出1,000nM或更低的CD50，这取决于细胞类型
及其适当的细胞外靶生物分子的表达，如图所示，例如，通过使用技术人员已知的和/或本
文描述的测定。

[0236] 就要求保护的发明的目的而言，关于核糖体抑制的术语“等同”是指经验测量的核糖体抑制活性水平，其通过具有再现性的适当定量测定法测量，其在相同条件下在参照分
子(例如，第二细胞靶向分子、第三细胞靶向分子等)活性的10％或更低的范围内是可再现
的。

[0237] 就要求保护的发明的目的而言，关于细胞毒性的术语“等同”是指经验测量的细胞毒性水平，如通过具有再现性的适当定量测定法测量，其在相同条件下在参照分子(例如，
第二细胞靶向分子、第三细胞靶向分子等)活性的10％或更低的范围内是可再现的。

[0238] 如本文所用，关于细胞毒性的术语“减毒的”是指分子表现出或表现出了在相同条件下参照分子表现出的CD50的10倍至100倍之间的CD50。

[0239] 在确定志贺毒素效应子功能活性水平时，不应考虑不准确的IC50和CD50值。对于一些样本，IC50或CD50的精确值可能无法获得，因为无法收集用于精确的曲线拟合所需的数据
点。例如，理论上，如果在给定样品的浓度系列中不发生分别超过50％的核糖体抑制或细胞
死亡，则不能确定IC50和CD50。在示例性的志贺毒素效应子功能测定(诸如，例如，在下文实
施例中所述的测定)的数据分析中描述的不足以准确拟合曲线的数据不应该被认为代表实
际的志贺毒素效应子功能。

[0240] 不能检测志贺毒素效应子功能的活性可能是由于不适当的表达、多肽折叠、和/或多肽稳定性，而不是缺少细胞进入、亚细胞按路线发送和/或酶活性。志贺毒素效应子功能
的测定可能不需要很多本发明的多肽来测量显著量的志贺毒素效应子功能活性。在凭经验
 确定效应子功能低或没有效应子功能的潜在的原因与蛋白表达或稳定性相关的程度上，本
领域技术人员可以能够利用本领域已知的蛋白化学和分子改造技术抵消这些因素，以使志
贺毒素功能性效应子活性可以被恢复并测量。例如，基于不适当的细胞的表达可以通过使
用不同的表达控制序列进行抵消；和不适当的多肽折叠和/或稳定性可以受益于稳定末端
序列、或稳定分子的三维结构的非效应子区域中的补偿性突变。

[0241] 某些志贺毒素效应子功能是不容易测量的，例如，亚细胞按路线发送功能。例如，没有途常规的定量测定法来区分志贺毒素效应多肽不是细胞毒性的和/或递送异源性表位
是否是由于不正确的亚细胞按路线发送，但是，在测试可用的时候，可以与适当的野生型志
贺毒素效应子相比，分析志贺毒素效应多肽任意显著水平的亚细胞按路线发送。然而，如果
本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应多肽组分显示出与野生型志贺毒素A亚基构建体相
当或等同的细胞毒性，则推断亚细胞按路径发送活性水平至少在测试条件下分别与野生型
志贺毒素A亚基构建体的亚细胞按路线发送活性水平可比较或等同。

[0242] 当关于个体志贺毒素功能的新测定可用时，可以分析志贺毒素效应多肽和/或包含贺毒素效应多肽的细胞靶向分子的任意水平的这些志贺毒素效应子功能，诸如是野生型
志贺毒素效应多肽的活性的1000倍或100倍以内或更小，或与功能性敲除的志贺毒素效应
多肽相比，表现出3倍至30倍或更高的活性。

[0243] 仅通过在细胞毒性测定中观察分子的细胞毒活性水平，例如基于T细胞表位呈递或基于涉及胞质和/或内质网定位的靶底物的毒素效应子功能的细胞毒性测定，可以推断
出足够的亚细胞按路线发送。

[0244] 本文中使用的“显著的”志贺毒素效应子功能的保留是指，通过具有再现性的适当定量测定所测得的与野生型志贺毒素效应多肽对照(例如，志贺毒素A1片段)相当的志贺毒
素功能活性水平。关于体外核糖体抑制，显著的志贺毒素效应子功能表现出300pM或更小的
IC50，取决于测定中使用的核糖体的来源(例如细菌、古细菌或真核生物(藻类、真菌、植物或
动物)来源)。与催化上无被破坏的SLT-1A 1-251双重突变体(Y77S/E167D)的100,000pM的
近似IC50相比，这是显著更大的抑制。关于在实验室细胞培养物中在靶阳性细胞杀死测定中
的细胞毒性，显著的志贺毒素效应子功能表现出100、50或30nM或更小的CD50，取决于结合区
域的靶生物分子和细胞类型，尤其是由所评价的分子靶向的合适的细胞外靶生物分子和/
或细胞外表位的细胞类型的表达和/或细胞表面表现。与没有靶向细胞的结合区域的仅志
贺毒素A亚基(或野生型志贺毒素A1片段，其具有100-10,000nM的CD50，取决于细胞系)相比，
这是对适当靶阳性细胞群体显著更大的细胞毒性。

[0245] 就本发明的目的和关于本发明分子的志贺毒素效应子功能而言，术语“合理活性”是指关于包含天然存在的(或野生型)志贺毒素的分子，表现出至少中等水平(例如在11倍
至1,000倍之内)的本文所定义的志贺毒素效应子活性，其中所述志贺毒素效应子活性选自
由以下各项组成的组：内化功效、亚细胞按路线发送至细胞质的功效，通过靶细胞递送的表
位呈递、核糖体抑制和细胞毒性。对于细胞毒性，合理水平的志贺毒素效应子活性包括在野
生型志贺毒素构建体的1,000倍以内，例如，当野生型志贺毒素构建体表现出0.5nM的CD50时
(例如包含野生型志贺毒素A1片段的细胞靶向分子)，表现出500nM或更低的CD50。

[0246] 就本发明的目的和关于本发明分子的细胞毒性而言，术语“最佳”是指志贺毒素催化结构域介导的细胞毒性水平在包含野生型志贺毒素A1片段(例如志贺毒素A亚基或其某
些截短变体)和/或天然存在的志贺毒素的分子的细胞毒性的2、3、4、5、6、7、8、9或10倍内。

[0247] 应当注意，即使志贺毒素效应多肽的细胞毒性相对于野生型志贺毒素A亚基或其片段是降低的，在实践中，使用减毒的志贺毒素效应多肽的应用可以与使用野生型志贺毒
素效应多肽是同样的或比其更有效，因为最高效力变体可能表现出不良作用，该不良作用
在降低的细胞毒性-效力变体中被最小化或降低。野生型志贺毒素是非常强效的，在只有一
种毒素分子已经到达中毒细胞的胞质溶胶后，或者可能在只有四十个毒素分子已经被内化
到中毒细胞后，能够杀死中毒细胞。与野生型志贺毒素效应多肽相比，具有甚至显著降低的
志贺毒素效应子功能(例如亚细胞按路线发送至或细胞毒性)的志贺毒素效应多肽对于实
际应用(例如涉及靶向细胞杀伤、异源性表位递送和/或特定细胞及其亚细胞区室的检测的
应用)仍然足够强效。另外，某些降低了活性的志贺毒素效应多肽可特别用于将货物(例如
另外的外源性物质或T细胞表位)递送至靶细胞的某些细胞内位置或亚细胞区室。

[0248] 关于分子的细胞毒活性的术语“选择性细胞毒性”是指生物分子靶阳性细胞群(例如靶向细胞型)和非靶向旁观者细胞群(例如，生物分子靶标阴性细胞类型)之间的细胞毒
性的相对水平，其可表示为靶向细胞类型的半最大细胞毒性浓度(CD50)与非靶向细胞类型
的CD50的比率，以提供细胞毒性选择性的度量或靶向细胞相对于非靶向细胞的杀伤的优先
性的指标。

[0249] 给定细胞外靶生物分子(或给定靶生物分子的细胞外表位)的细胞表面表现和/或密度可以影响最适合使用本发明的某些细胞靶向分子的应用。细胞之间给定靶生物分子的
细胞表面表现和/或密度的差异可以定量和定性地改变本发明的给定细胞靶向分子的细胞
内化效率和/或细胞毒性效力。给定靶生物分子的细胞表面表现和/或密度在靶生物分子阳
性细胞之间或甚至在细胞周期或细胞分化中的不同点处的相同细胞上可以变化很大。给定
靶生物分子的总细胞表面表现和/或特定细胞或细胞群上给定靶生物分子的某些细胞外表
位的总细胞表面表现可以使用技术人员已知的方法(诸如涉及荧光激活细胞分选(FACS)流
式细胞术的方法)确定。

[0250] 如本文所用，关于多肽内的多肽区域或特征，术语“破坏的”，“破坏”或“正在破坏”及其语法变体是指在该区域内的至少一个氨基酸的改变，或组成该破坏特征。氨基酸改变包括多种突变，例如改变多肽的氨基酸序列的缺失(例如截短)、倒位、插入或置换。氨基酸
改变也包括化学改变，例如，氨基酸官能团中的一个或更多个原子的改变或一个或更多个
原子向氨基酸官能团的添加。

[0251] 如本文所用，“去免疫化的”是指与参照分子(例如野生型肽区域、多肽区域或多肽)相比，在施用至脊索动物后减少的抗原性和/或免疫原性潜力。这包括与参照分子相比
总抗原性和/或免疫原性潜力降低，尽管引入了一个或更多个从头合成的抗原性和/或免疫
原性表位。对于某些实施方案，“去免疫化的”是指分子在施用至哺乳动物后，与衍生其的
“亲本”分子(例如野生型志贺毒素A1片段)相比，表现出降低的抗原性和/或免疫原性。在某
些实施方案中，与参照分子相比，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽能够表现出相对
抗原性，所述抗原性比通过相同的测定法(例如，技术人员已知的和/或本文所述的测定法，
如定量ELISA或Western印迹分析)在相同的条件下测量的参照分子的抗原性减少10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些实施方案中，与参照分子相比，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽能够表现出相对免疫原性，所述免疫原性比通
过相同的测定法(例如，技术人员已知的和/或本文所述的测定法，如在给定时间点接受该
分子胃肠外施用后的哺乳动物产生的抗分子抗体的定量测量)在相同的条件下测量的参照
分子的免疫原性减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更多。

[0252] 在一段时间内重复肠胃外施用后，使用用于细胞靶向分子的体内抗体应答的测定来确定示例性细胞靶向分子的相对免疫原性。

[0253] 就本发明的目的而言，短语“B细胞和/或CD4+T细胞去免疫化的”是指该分子在施用至哺乳动物后关于B细胞抗原性或免疫原性和/或CD4+T细胞抗原性或免疫原性具有降低
的抗原性和/或免疫原性潜力。对于某些实施方案，“B细胞去免疫化的”是指分子在施用至
哺乳动物后，与衍生其的“亲本”分子(例如野生型志贺毒素A1片段)相比，表现出降低的B细
胞抗原性和/或免疫原性。对于某些实施方案，“CD4+T细胞去免疫化的”是指分子在施用至
哺乳动物后，与衍生其的“亲本”分子(例如野生型志贺毒素A1片段)相比，表现出降低的CD4
+T细胞抗原性和/或免疫原性。

[0254] 关于志贺毒素效应多肽中的B细胞表位、CD4+T细胞表位、B细胞表位区域或CD4+T细胞表位区域的术语“内源性”是指野生型志贺毒素A亚基中存在的表位。

[0255] 就本发明的目的而言，短语“CD8+T细胞超免疫化的”是指，当存在于活脊索动物内的有核脊索动物细胞中时，关于CD8+T细胞抗原性或免疫原性，所述分子具有增加的抗原性
和/或免疫原性潜力。通常，CD8+T细胞免疫的分子由于固有特性或作为细胞靶向分子的组
分能够细胞内化至有核脊索动物细胞的早期内体区室。

[0256] 就本发明的目的而言，术语“异源的”意指与天然存在的志贺毒素的A亚基不同的来源，例如，异源性多肽不是天然存在为天然志贺毒素的任何A亚基的一部分。关于本发明
的多肽的T细胞表位或T细胞表位肽组分，术语“异源的”表示这样的表位或肽序列：其最初
不存在于要修饰的多肽中，但是其已经添加至所述多肽，无论是通过如本文中所述的嵌入、
融合、插入和/或氨基酸置换的方法添加，还是通过任意其它工程化方式添加。结果是修饰
的多肽，其包含对于原始的未修饰的多肽而言外来的T细胞表位，即所述T细胞表位不存在
于原始多肽中。

[0257] 关于本发明的多肽的T细胞表位或T细胞表位肽组分，术语“嵌入的”及其语法变体表示用不同的氨基酸对多肽区域内的一个或多个氨基酸的内部替换，以便产生与起始多肽
区域共享氨基酸残基相同总数目的新多肽序列。因而，术语“嵌入的”不包括任何另外氨基
酸、肽或多肽组分与开始多肽的任何外部末端融合，也不包括任何另外氨基酸残基的任何
另外的内部插入，而是仅包括对现有氨基酸的置换。所述内部替换可以仅仅通过氨基酸残
基置换或通过一系列置换、缺失、插入和/或倒位而实现。如果使用一个或多个氨基酸的插
入，那么必须在插入点后面缺失相等数目的近侧氨基酸以产生嵌入的T细胞表位。这与关于
在本发明的多肽内含有的T细胞表位的术语“插入”的使用相反，插入是指在多肽内部插入
一个或更多个氨基酸，导致新的具有与起始多肽相比增加的氨基酸残基数目的多肽。

[0258] 关于本发明的多肽内含有的T细胞表位，术语“插入”或其语法变体是指在多肽中插入一个或更多个氨基酸，导致新的具有与起始多肽相比增加的氨基酸残基数量的多肽序
列。T细胞表位-肽的“纯”插入是指所得多肽的长度增加了与整个插入的T细胞表位-肽中氨
基酸残基数相等的氨基酸残基数。关于本发明多肽中包含的T细胞表位，短语“部分插入
的”、“嵌入和插入的”及其语法变体，是指所得多肽的长度增加了但是小于与整个插入的T
细胞表位-肽的长度相等的氨基酸残基数。插入，无论是“纯的”还是“部分的”，都包括任何先前描述的插入，即使多肽的不邻近多肽内插入位点的其他区域被缺失，从而导致最终多
肽的总长度减少，因为最终的多肽仍包含多肽区域内T细胞表位-肽的一个或更多个氨基酸
的内部插入。

[0259] 如本文所用，术语“T细胞表位递送”在描述分子的功能活性时意指分子提供在细胞内定位至亚细胞区室的生物活性，该亚细胞区室能够导致包含T细胞表位-肽的分子的蛋
白性部分的蛋白酶体切割。分子的“T细胞表位递送”功能可以通过观察外源性施用该分子
的细胞的细胞表面上该分子的T细胞表位-肽货物的MHC呈递来测定，或者在其中该测定开
始于在一个或更多个其内体区室中含有该分子的细胞。通常，在“T细胞表位递送”分子的初
始位置是细胞的早期内体区室，然后，该分子经验性地显示将表位-肽递送至细胞的蛋白酶
体的情况下，可以确定分子将T细胞表位递送至蛋白酶体的能力。然而，还可以在分子在细
胞外位置开始并且经验性地直接或间接地显示将表位递送到细胞和递送到细胞的蛋白酶
体中的情况下，确定“T细胞表位递送”能力。例如，某些“T细胞表位递送”分子通过细胞的内体区室，例如在内吞进入该细胞后。备选地，可以针对开始于细胞外位置的分子观察“T细胞
表位递送”活性，从而该分子不进入细胞的任何内体区室—而是“T细胞表位递送”分子进入
细胞并递送T细胞表位-肽至细胞的蛋白酶体，大概因为该“T细胞表位递送”分子引导其自
身的按路线发送至能够导致其T细胞表位-肽组分的蛋白酶体切割的亚细胞区室。

[0260] 就本发明的目的而言，关于本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应多肽区域的位置，短语“邻近氨基末端”是指距离，其中志贺毒素效应多肽区域的至少一个氨基酸残基在
细胞靶向分子的氨基末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多，例如，多至18-20个氨基酸残基内，只要细胞靶向分子能够表现出本文所记载的适当水平的志贺毒素效应子功能活
性(例如，一定水平的细胞毒性效力)。因此，对于本发明的某些实施方案，融合至贺毒素效
应多肽的氨基端的任何氨基酸残基应不降低任何志贺毒素效应子功能(例如，通过空间阻
碍志贺毒素效应多肽区域的氨基末端附近的结构)，使得使志贺毒素效应多肽的功能活性
降低至低于本文所需的适当活性水平。

[0261] 就本发明的目的而言，与另一种组分(例如，细胞靶向，结合区域，分子部分和/或另外的外源性物质)相比，关于本发明的细胞靶向分子内志贺毒素效应多肽区域的位置的
短语“更邻近氨基末端”是指位置，其中志贺毒素效应多肽的氨基末端的至少一个氨基酸残
基与另一个参照的组分相比更靠近本发明的细胞靶向分子的线性多肽组分的氨基末端。

[0262] 就本发明的目的而言，短语“来源于志贺毒素家族成员的一个A亚基的活性酶促结构域”是指具有通过催化核糖体失活机制抑制蛋白质合成的能力。天然存在的(或野生型)
志贺毒素的酶活性可以通过使用技术人员已知的测定法(例如，涉及在没有活细胞的情况
下RNA翻译的体外测定法或涉及活细胞中RNA翻译的体内测定法)抑制蛋白质翻译的能力来
定义。使用技术人员已知的和/或本文所述的测定法，志贺毒酶活性的效力可以通过观察针
对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(例如核糖体切割测定法)直接评估，和/或通过观察核
糖体功能和/或蛋白质合成的抑制间接评估。

[0263] 就本发明的目的而言，术语“志贺毒素A1片段区域”是指基本上由志贺毒素A1片段组成和/或来源于志贺毒素的志贺毒素A1片段的多肽区域。

[0264] 就本发明的目的而言，关于细胞靶向分子的术语“末端”、“氨基末端”或“羧基末端”通常是指细胞靶向分子的多肽链(例如，单个连续多肽链)的最后一个氨基酸残基。细胞
靶向分子可以包含多于一个多肽或蛋白质，并且因此，本发明的细胞靶向分子可以包含多
个氨基端和羧基端。例如，细胞靶向分子的“氨基末端”可以由代表多肽氨基末端的多肽链
的第一个氨基酸残基限定，其通常由起始氨基酸残基表征，所述氨基酸不具有与任何下列
氨基酸残基的肽键：氨基酸残基，其涉及起始氨基酸残基的伯氨基或涉及起始氨基酸残基
的等价氮，所述氨基酸残基是N-烷基化α氨基酸残基类别的成员。类似地，细胞靶向分子的
“羧基末端”可以由代表多肽的羧基末端的多肽链的最后一个氨基酸残基定义，其通常由最
后的氨基酸残基(不具有通过肽键与其伯羧基的α-碳连接的任何氨基酸残基)表征。

[0265] 就本发明的目的而言，关于多肽区域的术语“末端”，“氨基末端”或“羧基末端”是指该区域的区域边界，无论额外的氨基酸残基是否通过该区域之外的肽键连接。换句话说，多肽区域的末端，无论该区域是否与其他肽或多肽融合。例如，包含两个蛋白性区域的融合
蛋白，例如包含肽或多肽的结合区域和志贺毒素效应多肽，可以具有志贺毒素效应多肽区
域，其具有在志贺毒素效应多肽区域的氨基酸残基251处终止的羧基末端，尽管涉及残基
251至252位的氨基酸残基的肽键代表另一个蛋白性区域(例如结合区域)的开始的。在该实
例中，志贺毒素效应多肽区域的羧基末端是指残基251，其不是融合蛋白的末端而是代表内
部区域边界。因此，对于多肽区域，术语“末端”、“氨基末端”和“羧基末端”用于指多肽区域的边界，无论边界是物理末端还是嵌入在更大的多肽链内的内部位置。

[0266] 就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A1片段的羧基末端区域”是指来源于天然存在的(或野生型)志贺毒素A1片段的多肽区域，该区域以疏水性残基(例如，StxA-A1和SLT-
1A1的V236，以及SLT-2A1的V235)开始，其后是疏水残基和在志贺毒素A1片段多肽之间保守
的弗林蛋白酶切割位点结束的区域并结束于在天然志贺毒素A亚基中的A1片段与A2片段之
间的接点。就本发明的目的而言，志贺毒素A1片段的羧基末端区域包括来源于志贺毒素A1
片段多肽的羧基末端的肽区域，例如包含志贺毒素A1片段的羧基末端、基本上由其组成或
由其组成的肽区域。来源于志贺毒素A1片段的羧基末端的肽区域的非限制性实例包括在
Stx1A(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)中从位置236至位置239、240、241、242、243、
244、245、246、247、248、249、250或251的天然定位的氨基酸残基序列；在SLT-2A(SEQ ID
NO:3)中从位置235到位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250的天然定位的氨基酸残基序列。

[0267] 就本发明的目的而言，关于连接的分子部分和/或结合区域的短语“邻近A1片段多肽的羧基末端”是指在来自限定志贺毒素A1片段多肽的最后的残基的氨基酸残基的1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基内。

[0268] 就本发明的目的而言，短语“空间覆盖A1片段来源的区域的羧基末端”包括连接和/或融合至A1片段来源的区域的羧基末端中的氨基酸残基的大小为4.5kDa或更大的任何
分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)，所述羧基末端中的氨基酸残基为例如，来源于天
然定位于Stx1A(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)的位置236至251或SLT-2A(SEQ ID
NO:3)中位置235至250中任何一个的氨基酸残基的氨基酸残基。就本发明的目的而言，短语
“空间覆盖A1片段来源的区域的羧基末端”也包括大小为4.5kDa或更大的任何分子部分(例
如，免疫球蛋白型结合区域)，其连接和/或融合至A1片段来源的区域的羧基末端中的氨基
酸残基，例如，最后的氨基酸A1片段来源区域和/或志贺毒素效应多肽的羧基末端的氨基酸
残基。就本发明的目的而言，短语“空间覆盖A1片段来源的区域的羧基末端”也包括大小为
4.5kDa或更大的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)，其物理上防止A1片段来源
的区域的羧基末端的细胞识别，例如，通过真核细胞的ERAD机制识别。

[0269] 就本发明的目的而言，包含含有至少40个氨基酸并且与包含A1片段来源的区域的志贺毒素效应多肽区域的羧基末端连接(例如，融合)的多肽的结合区域(例如免疫球蛋白
结合区域或免疫球蛋白类型结合区域)是“空间覆盖A1片段来源的区域的羧基末端”的分子
部分。

[0270] 就本发明的目的而言，包含含有至少40个氨基酸并且与包含A1片段来源的区域的志贺毒素效应多肽区域的羧基末端连接(例如，融合)的多肽的结合区域(例如免疫球蛋白
结合区域或免疫球蛋白类型结合区域)是“阻碍A1片段来源的区域的羧基末端”的分子部
分。

[0271] 就本发明的目的而言，术语“志贺毒素家族成员的A1片段”是指志贺毒素A亚基在弗林蛋白酶切割位点上由弗林蛋白酶蛋白水解后剩余氨基端片段，所述弗林蛋白酶切割位
点在志贺毒素A亚基之间是保守的并位于野生型志贺毒素A亚基中的A1片段和A2片段之间。

[0272] 为了要求保护的发明的目的，短语“在A1片段区域羧基末端的弗林蛋白酶切割基序”是指志贺毒素A亚基之间保守并桥接天然存在的志贺毒素A亚基中的A1片段和A2片段之
间的接点的特异性弗林蛋白酶切割基序。

[0273] 就本发明的目的而言，短语“邻近A1片段区域羧基末端的弗林蛋白酶切割位点”是指任何可识别的弗林蛋白酶切割位点，其具有在限定A1片段区域或A1片段来源的区域中的
最后一个氨基酸残基的氨基酸残基的小于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个的氨基酸残基的距离内的氨基酸残基，包括位于A1片段区域或A1片段来源的区域的羧基端的弗林
蛋白酶切割基序，例如，在A1片段来源的区域与该分子的另一组分(例如，本发明的细胞靶
向分子的分子部分)的连接邻近的位置。

[0274] 出于本发明的目的，短语“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是指(i)如本文IB部分所述的具体的弗林蛋白酶切割基序和(ii)所述的具体的弗林蛋白酶切割基序，其包含突变
和/或截短，所述突变和/或截短能够赋予分子与参照分子相比，弗林蛋白酶切割减少，例
如，与在相同条件下在相同测定中观察到的参照分子的弗林蛋白酶切割相比，可重复地观
察到弗林蛋白酶切割减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更少(包括100％不切割)。与参照分子相比，弗林蛋白酶切割的百分比可以表示为目标分
子的切割的：未切割的物质除以参照分子的切割的：未切割的物质的比例(参见例如，WO
2015/191764；WO2016/196344)。合适的参照分子的非限制性实例包括某些分子，所述分子
包含如本文所述的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点和/或
在下文实施例中用作参照分子的分子。

[0275] 就本发明的目的而言，短语“弗林蛋白酶切割抗性”意指其分子或特定多肽区域可重复地表现出与以下相比更少的弗林蛋白酶切割：(i)野生型志贺毒素A亚基中的志贺毒素
A1片段的羧基末端，或(ii)构建体的志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端，其中天然定
位在A1和A2片段之间的接点处的天然存在的弗林蛋白酶切割位点未被破坏；如通过任何对
技术人员来说可用的方法进行测定，包括使用本文所述的方法。

[0276] 就本发明的目的而言，短语“来源于志贺毒素家族成员的A亚基的活性酶促结构域”是指具有通过基于志贺毒素的酶活性通过核糖体的催化失活来抑制蛋白质合成的能力
的多肽结构。分子结构表现出蛋白质合成的抑制活性和/或核糖体的催化失活的能力可以
使用技术人员已知的各种测定法来观察，例如，涉及在没有活细胞的情况下RNA翻译测定的
体外测定法或涉及活细胞的核糖体的体内测定法。例如，使用技术人员已知的测定法，基于
志贺毒素酶活性的分子的酶活性可以通过观察针对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性直接
评估，例如核糖体切割测定法，和/或通过观察核糖体功能、RNA翻译和/或蛋白质合成的抑
制间接地评估。

[0277] 如本文所使用的，关于志贺毒素效应多肽，“组合”描述了包含两个或更多个子区域的志贺毒素效应多肽，其中每个子区域包含以下中的至少一个：(1)在内源性表位或表位
区域中的破坏；(2)嵌入的异源性T细胞表位肽；(3)插入的异源性T细胞表位肽；和(4)在A1
片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。

[0278] 如本文所用，术语“另外的HER2靶向治疗剂”意指靶向HER2以产生治疗效果或益处的另外的治疗剂(例如分子)。该另外的HER2靶向治疗剂与本发明的细胞靶向分子互补，并
且在其HER2靶向活性中不与细胞靶向分子直接竞争。另外的HER2靶向治疗剂可包含、基本
上组成为或组成为：干扰HER2信号传导的抗HER2抗体或小分子抑制剂。例如，另外的HER2靶
向治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：双酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼和/或奈拉
替尼。另外的HER2靶向治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：抗HER2抗体治疗剂，所述抗
HER2抗体治疗剂结合抗原决定簇，所述抗原决定簇不与由本发明的细胞靶向分子结合的抗
原决定簇重叠，或所述抗HER2抗体治疗剂以这样的方式结合HER2分子：当结合另外的HER2-
靶向治疗剂时不会阻止该HER2分子被本发明的细胞靶向分子结合。例如，另外的HER2靶向
治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：抗HER2单克隆抗体疗法和/或抗HER2抗体药物缀合
疗法，例如T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)、曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗。另外的HER2靶向
治疗剂可以选自拉帕替尼、奈拉替尼、T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)、曲妥珠单抗和/或帕
妥珠单抗中的任何一种或组合。

[0279] 如本文关于本发明的分子所使用的，“细胞靶向分子”可与“HER2靶向分子”或“HER2结合分子”互换使用。所有上述分子类型包括各种“HER2结合蛋白”。

[0280] 前言

[0281] 本发明提供了包含一种或更多种志贺毒素效应多肽和至少一种HER2结合区域的多种细胞靶向分子。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案包含志贺毒素效应多肽，所述
贺毒素效应多肽组合了多个结构要素，导致在单个分子中的两种或更多种性质，例如1)与
缺乏要素的那个特定组合的分子变体相比，表现出降低的抗原性和/或免疫原性的能力，2)
与缺乏要素的那个特定组合的分子变体相比，表现出降低的蛋白酶切割，3)与缺乏要素的
那个特定组合的分子变体相比，在某些剂量下对多细胞生物体表现出降低的非特异性毒
性，和/或5)表现出强效的细胞毒性。本发明的细胞靶向分子可用作支架以产生多种细胞靶
向分子，例如HER2靶向的细胞毒性治疗分子；HER2靶向的、无毒的、运载工具；和HER2靶向诊
断分子。

[0282] I.本发明的细胞靶向分子的一般结构

[0283] 本发明提供各种细胞靶向分子，各个细胞靶向分子包含(1)细胞靶向结合区域和(2)志贺毒素效应多肽组分。本发明的志贺毒素效应多肽可以与各种不同的细胞靶向组分
(例如分子部分和/或试剂)缔合和/或偶联，以产生本发明的细胞靶向分子。本发明的细胞
靶向分子包含(1)能够特异性结合靶生物分子的细胞外部分的结合区域和(2)能够表现出
一种或更多种志贺毒素A亚基效应子功能的志贺毒素效应多肽。本发明的细胞靶向结合区
域与志贺毒素效应多肽的缔合使得能够工程改造具有所需特征的治疗和诊断分子，例如去
免疫化，强效的细胞毒性，有效的细胞内按路线发送，T细胞超免疫、分子稳定性、和与某些
参照分子相比在高剂量下的体内耐受性。

[0284] 本发明提供各种HER2靶向分子，各个细胞靶向分子包含(1)能够结合HER2的细胞靶向结合区域和(2)能够表现出志贺毒素效应子功能的志贺毒素A亚基效应多肽。志贺毒素
效应多肽可以与各种不同的HER2靶向组分(例如分子部分和/或试剂)缔合和/或偶联，以产
生本发明的细胞靶向分子。本发明的细胞靶向分子包含(1)能够特异性结合HER2靶生物分
子的细胞外部分的结合区域和(2)包含能够表现出一种或更多种的志贺毒A亚基效应子功
能的志贺毒素效应多肽的志贺毒素效应多肽区域，所述效应子功能为例如白细胞淤积，细
胞毒性，催化活性，促进细胞内化，引导细胞内按路线发送至某个或某些亚细胞区室，以及
细胞内递送物质。例如，本发明的细胞靶向分子可包含含志贺毒素A1片段来源的区域的志
贺毒素A亚基效应多肽组分，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽包含：(a)嵌入或插入的、异
源性CD8+T细胞表位，其破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域；和(b)至少三个内源性
B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，所述区域不与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位
重叠；其中志贺毒素效应多肽在志贺毒素A1片段区域的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切
割基序，其中与野生型志贺毒素A亚基的羧基末端相比，所述弗林蛋白酶切割基序被志贺毒
素A1片段区域的羧基末端截短破坏；其中志贺毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效
应子功能。

[0285] 本发明的志贺毒素效应多肽可以与一个或更多个细胞靶向结合区域连接，所述细胞靶向结合区域通过对靶生物分子的细胞外部分(例如，物理偶联到细胞的细胞表面的
HER2靶生物分子)的结合特异性介导细胞靶向。本发明的细胞靶向分子的一个非限制性实
例是与蛋白性、细胞靶向结合区域(例如免疫球蛋白或免疫球蛋白型结合区域)融合的本发
明的志贺毒素效应多肽。例如，本发明的细胞靶向分子可包含能够特异性结合HER2/neu/
ErbB2的细胞外部分的免疫球蛋白结合区域，并且包含含以下一种或更多种的多肽：抗体可
变片段，单结构域抗体片段，单链可变片段，Fd片段，抗原结合片段，自主VH结构域，来源于
骆驼抗体的VHH片段，来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域，VNAR片段，和免疫球蛋白新抗
原受体。

[0286] A.HER2/neu/ErbB2结合区域

[0287] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是细胞靶向组分，例如，能够以高亲和力特异性结合细胞表面上的HER2/neu/ErbB2靶生物分子的细胞外部分(即细胞
外靶生物分子)的结构域、分子部分或试剂。有许多类型的技术人员已知的结合区域，或者
技术人员可以使用本领域已知的技术发现的结合区域。例如，表现出本文所述必备的结合
特征的任何细胞靶向组分可用作在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中的结合区域。

[0288] 靶生物分子的细胞外部分是指当分子与细胞物理偶联时(例如靶生物分子被细胞表达在细胞表面时)暴露于细胞外环境的其结构的一部分。在这种情况下，暴露于细胞外环
境意味着靶生物分子的一部分是通过以下各项可及的：例如抗体或至少小于抗体的结合部
分，诸如单结构域抗体结构域、来源于骆驼科动物或软骨鱼类的重链抗体结
构域、单链可变片段或针对免疫球蛋白的任何数量的经工程改造的备选支架(见下文)。可
以使用本领域熟知的方法由技术人员凭经验确定与细胞物理偶联的一部分靶生物分子对
细胞外环境的暴露或可及性。

[0289] HER2，在本领域中也被认为是受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2，是一种跨膜蛋白，所述跨膜蛋白作为细胞表面受体起作用，用于将信号穿过细胞膜转导至细胞增殖和凋亡的细
胞内调节子。HER2在本领域中也被认为是Neu,erbB-2、p185、CD340、NGL和HER2/neu
(Coussens L等人,Science 230:1132-39(1985)；King C等人,Science 229:974-6(1985)；
Semba K等人,Proc Natl Acad Sci USA 82:6497-501(1985)；Yamamoto T等人,
Nature319:230-234(1986)；Kokai Y等人,Proc Natl Acad Sci USA 85:5389-93(1988)；
Disis M等人,Cancer Res 54:16-20(1994)；Yoshino I等人,J Immunol 152:2393-400
(1994)参见，例如GenBank Acc.Nos.X03363；M17730；NM_004448；SEG_HUMHER20)。虽然HER2
的名称可能是指具有来自不同物种的相关结构和多肽序列的多种蛋白质，但出于本节的结
构实例的目的，术语“HER2”是指人类中存在的表皮生长因子受体蛋白，其确切序列可能根
据同种型和从个体到个体略有不同。例如，HER2是指由示例性多肽序列UniProt P04626和
NCBI登录号NP_004439.2、NP_001005862.1、NP_001276865.1、NP_001276866.1和NP_
001276867.1表示的人蛋白质；然而，由于剪接、多态性和/或突变，存在不同的同种型和变
体(参见例如Siddig A等人,Ann N Y Acad Sci 1138:84-94(2008)；Poole E等人,Int J
Mol Epidemiol Genet 2:300-15(2011)；WO 2000/020579)。技术人员将能够鉴定人中的其
他HER2蛋白，即使它们与参照序列不同。

[0290] HER2被许多癌细胞过表达，特别是乳腺癌细胞，并且其过表达与转移增加，疾病复发增加和预后不良密切相关(参见例如Slamon D等人，Science 235：177-82(1987))。

[0291] 本领域技术人员已知有许多HER2结合区域，其可与本发明的志贺毒素效应多肽缔合以产生本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“HER2结合区域”是指能够以
高亲和力(例如具有对HER2的解离常数为每升10-5至10-12摩尔)特异性结合HER2分子的细胞
外部分的分子部分(例如蛋白质分子)或试剂。如本文所用，HER2结合是指结合人HER2的同
种型或变体的细胞外部分(也称为neu或ErbB2)的能力。

[0292] 本发明的细胞靶向分子的结合区域可以是例如配体、肽、免疫球蛋白型结合区域、单克隆抗体、经工程改造的抗体衍生物或抗体的经工程改造的替代物。例如，所述结合区域
是免疫球蛋白结合区域。

[0293] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是能够以高亲和力特异性结合靶生物分子的细胞外部分的蛋白性部分。本发明的细胞靶向分子的结合区域可包含一
个或更多个各种肽类或多肽部分，诸如随机产生的肽序列、天然存在的配体或其衍生物、免
疫球蛋白来源的结构域，合成改造的支架作为免疫球蛋白结构域的替代物，等等(参见例
WO2005/092917；WO 2007/033497；Cheung M等人,Mol Cancer 9:28(2010)；US 2013/
0196928；WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/
191764)。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合区域，所述结合区域包含一
种或更多种能够选择性和特异性结合细胞外靶生物分子的多肽。

[0294] 本领域已知有许多结合区域可用于通过其结合特征将分子靶向HER2的细胞外部分，诸如某些单克隆抗体、经工程改造的抗体衍生物和抗体的经工程改造的替代物。

[0295] 根据一个具体但非限制性的方面，结合区域可包含免疫球蛋白型结合区域。如本文所用的术语“免疫球蛋白型结合区域”是指能够结合一种或更多种靶生物分子(诸如抗原
或表位)的多肽区域。结合区域可以通过它们结合靶分子的能力在功能上限定。免疫球蛋白
型结合区域通常来源于抗体或抗体样结构；然而，来自其他来源的替代支架在该术语的范
围内考虑。在某些实施方案中，结合区域可包含来源于抗体或抗体样结构的免疫球蛋白结
合区域。

[0296] 免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被称为Ig结构域的结构域。Ig结构域的长度范围为约70-110个氨基酸残基并且拥有特征性Ig折叠，其中典型地7-9个反平行的β链排列为两个形
成夹心-样结构的β片层。Ig折叠通过夹心的内表面上的疏水氨基酸相互作用和链中半胱氨
酸残基之间的高度保守的二硫键来稳定。Ig结构域可以是可变的(IgV或V-set)、恒定的
(IgC或C-set)或中间的(IgI或I-set)。一些Ig结构域可以与互补决定区(CDR)缔合，也称为
“互补决定区”，其对于结合其表位的抗体的特异性是重要的。Ig-样结构域也存在于非免疫
球蛋白蛋白中，并且基于此被分类为Ig蛋白超家族的成员。HUGO基因命名委员会(HGNC)提
供了含有Ig-样结构域的家族的成员的清单。

[0297] 免疫球蛋白型结合区域可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中氨基酸序列不同于天然抗体或非免疫球蛋白蛋白的Ig样结构域，例如通过分子工程改造或通过文库
筛选进行选择。因为重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区域的产生中的关
联性，可以重新设计抗体以获得期望的特征，诸如较小的尺寸、细胞进入(cell entry)、或
其它针对体内和/或治疗应用的改善。可能的变化有很多，并且范围可以为从仅一个氨基酸
的改变到例如可变区的完全重新设计。典型地，将做出可变区的改变以便改善抗原结合特
征、改善可变区稳定性、或降低免疫原性应答的可能。

[0298] 存在众多预见到作为本发明的组分的免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区域来源于免疫球蛋白结合区域，诸如能够结合细胞外靶生物分子
的抗体互补位。在某些其它实施方案中，免疫球蛋白型结合区域包含经工程改造的多肽，所
述经工程改造的多肽并非来源于任何免疫球蛋白结构域，而是通过提供对细胞外靶生物分
子的高亲和力结合而像免疫球蛋白结合区域一样发挥作用。这种经工程改造的多肽可任选
地包括包含、组成为或基本上组成为来自如本文中所述的免疫球蛋白的互补决定区的多肽
支架。

[0299] 还存在众多现有技术中的结合区域，其可用于通过它们的高亲和力结合特性将多肽靶向特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域选自包括以
下各项的组：自主VH结构域、单结构域抗体结构域(sdAb)、来源于骆驼科动物的重链抗体结
构域(VHH片段或VH结构域片段)、来源于骆驼科动物VHH片段或VH结构域片段的重链抗体结
构域、来源于软骨鱼类的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链
可变(scFv)片段、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、单链Fv-CH3微抗体、二聚
体CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcabs)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受约
束的框架区3、CDR3、框架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块化免疫药物(SMIP)结构域、scFv-
Fc融合体、多聚化scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)，二硫键稳定的抗体可变(Fv)片段、由
VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定化的抗原结合(Fab)片段、二价
微抗体、二价F(ab')2片段(Fab二聚体)、双特异性串联VHH片段、双特异性串联scFv片段、
双特异性微抗体、以及保留其互补位和结合功能的前述任何遗传
操作的对应物(参见Ward E等人,Nature 341:544-6(1989)；Davies J,Riechmann L,
Biotechnology(NY)13:475-9(1995)；Reiter Y等人,Mol Biol 290:685-98(1999)；
Riechmann L,Muyldermans S,J Immunol Methods 231:25-38(1999)；Tanha J等人,J
Immunol Methods 263:97-109(2002)；Vranken W等人,Biochemistry 41:8570-9(2002)；
Jespers L等人,J Mol Biol 337:893-903(2004)；Jespers L等人,Nat Biotechnol 22:
1161-5(2004)；To R等人,J Biol Chem 280:41395-403(2005)；Saerens D等人,Curr Opin
Pharmacol 8:600-8(2008)；Dimitrov D,MAbs 1:26-8(2009)；Weiner L,Cell 148:1081-4
(2012)；Ahmad Z等人,Clin Dev Immunol 2012:980250(2012))。例如，本发明的细胞靶向
分子包含结合区域，其包含以下一种或更多种、基本上由其组成或由其组成：抗体可变片
段，单结构域抗体片段，单链可变片段，Fd片段，抗原结合片段，自主VH结构域，来源于骆驼
抗体的VHH片段，来源于软骨鱼抗体的重链抗体结构域，VNAR片段，和免疫球蛋白新抗原受
体。在进一步实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为：来源于骆驼抗体的单链
可变片段和/或VHH片段。在某些实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为单链可
变片段。在某些进一步的实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为衍生自骆驼抗
体的VHH片段。

[0300] 存在多种结合区域，其包含来源于免疫球蛋白恒定区域的多肽，例如经工程改造的二聚的Fc结构域、单体Fcs(mFcs)、scFv-Fc、VHH-Fc、CH2结构域、单体CH3s结构域(mCH3s)、合成的重编程的免疫球蛋白结构域和/或免疫球蛋白结构域与配体的杂合融合体(Hofer T
等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.105:12451-6(2008)；Xiao J等人,J Am Chem Soc 131:
13616–13618(2009)；Xiao X等人,Biochem Biophys Res Commun 387:387-92(2009)；
Wozniak-Knopp G等人,Protein Eng Des Sel 23 289-97(2010)；Gong R等人,PLoS ONE
7:e42288(2012)；Wozniak-Knopp G等人,PLoS ONE 7:e30083(2012)；Ying T等人,J Biol
Chem 287:19399-408(2012)；Ying T等人,J Biol Chem 288:25154-64(2013)；Chiang M等
人,J Am Chem Soc 136:3370-3(2014)；Rader C,Trends Biotechnol 32:186-97(2014)；
Ying T等人,Biochimica Biophys Acta 1844:1977-82(2014))。

[0301] 根据某些其他实施方案，结合区域包含针对免疫球蛋白结构域的经工程改造的替代支架。经工程改造的替代性支架是本领域已知的，其表现出与免疫球蛋白来源的结构相
似的功能特征，例如靶生物分子的高亲和力和特异性结合，并且可以为某些免疫球蛋白结
构域提供改善的特征，例如更高的稳定性或降低的免疫原性。通常，免疫球蛋白的替代支架
小于20千道尔顿，由单个多肽链组成，缺乏半胱氨酸残基，并且表现出相对高的热力学稳定
性。

[0302] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自包括以下各项的组的替代支架：自主VH结构域、单结构域抗体结构域(sdAb)、来源于骆驼科动物的重链
抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)、来源于骆驼科动物VHH片段或VH结构域片段的重链
抗体结构域、来源于软骨鱼类的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片
段、单链可变(scFv)片段、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、排列的Fv
(pFv)、单链Fv-CH3微抗体、二聚体CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcabs)、分离
的互补决定区3(CDR3)片段、受约束的框架区3、CDR3、框架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块
化免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、多聚化scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)，二
硫键稳定的抗体可变(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定的抗原结合
(Fab)片段、二价微抗体、二价F(ab')2片段(Fab二聚体)、双特异性串联
VHH片段、双特异性串联scFv片段、双特异性微抗体、以及保留其结
合功能性的前述任何遗传操作的对应物( A,Plückthun A,J Mol Biol 305:989-
1010(2001)；Xu L等人,Chem Biol 9:933-42(2002)；Wikman M等人,Protein Eng Des Sel
17:455-62(2004)；Binz H等人,Nat Biotechnol 23:1257-68(2005)；Hey T等人,Trends
Biotechnol 23:514-522(2005)；Holliger P,Hudson P,Nat Biotechnol 23:1126-36
(2005)；Gill D,Damle N,Curr Opin Biotech 17:653-8(2006)；Koide A,Koide S,
Methods Mol Biol 352:95-109(2007)；Byla P等人,J Biol Chem 285:12096(2010)；
Zoller F等人,Molecules 16:2467-85(2011)；Alfarano P等人,Protein Sci 21:1298-
314(2012)；MadhurantakamC等人,Protein Sci 21:1015-28(2012)；Varadamsetty G等人,
J Mol Biol 424:68-87(2012)；Reichen C等人,J Struct Biol 185:147-62(2014))。

[0303] 例如，已经鉴定了许多替代支架，其与人细胞表面受体HER2的细胞外部分结合(参见例如Wikman M等人,Protein Eng Des Sel 17:455-62(2004)；Orlova A等人Cancer Res
66:4339-8(2006)；Ahlgren S等人,Bioconjug Chem 19:235-43(2008)；Feldwisch J等人,
J Mol Biol 398:232-47(2010)；U.S.专利5,578,482；5,856,110；5,869,445；5,985,553；
6,333,169；6,987,088；7,019,017；7,282,365；7,306,801；7,435,797；7,446,185；7,449,
480；7,560,111；7,674,460；7,815,906；7,879,325；7,884,194；7,993,650；8,241,630；8,
349,585；8,389,227；8,501,909；8,512,967；8,652,474；和U.S.专利申请2011/0059090)。
除了备选的抗体形式之外，抗体样结合能力可以由非蛋白性化合物，例如寡聚物、RNA分子、
DNA分子、碳水化合物和杯芳烃糖萼(glycocalyxcalixarenes)(参见例如Sansone F,
Casnati A,Chem Soc Rev42:4623-39(2013))或部分蛋白性化合物，例如与肽和杯芳烃-肽
组合物偶联的苯酚-甲醛环状低聚物(参见例如U.S.5,770,380)赋予。

[0304] 在某些实施方案中，HER2结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，免疫球蛋白型HER2结合区域来源于免疫球蛋白HER2结合区域，诸如能够结合HER2的细胞外
部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，免疫球蛋白型HER2结合区域包含经工程改造
的多肽，所述经工程改造的多肽并非来源于任何免疫球蛋白结构域，而是通过提供对HER2
的细胞外部分的高亲和力结合而如免疫球蛋白HER2结合区域一样发挥作用。该经工程改造
的多肽可任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含、组成为或基本上组成为:互补决定区
(例如，重链可变结构域和/或轻链可变结构域)和/或来自如本文所述的免疫球蛋白的抗原
结合区域。

[0305] 存在众多预见到作为本发明的组分的HER2结合区域。免疫球蛋白型HER2结合区域的非限制性实例包括HER2结合单克隆抗体及其衍生物，例如抗ErbB2、4D5、2C4、7F3、7C2、
mumAb 4D5、chmAb 4D5、(rhu)mAb4D5、huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7、huMAb4D5-8、曲妥珠单抗、人源化520C9、4D5Fc8、无铰链rhu4D5、具有突变的半胱氨酸残基的非糖基化rhu4D5，帕妥珠单抗和人源化2C4
(Hudziak R等人,Mol Cell Biol 9:1165-72(1989)；McKenzie S等人,Oncogene 4:543-8
(1989)；Bacus S等人,Molecular Carcinogenesis 3:350-62(1990)；Hancock M等人,
Cancer Res 51:4575-80(1991)；Maier L等人,Cancer Res 51:5361-5369(1991)；
Stancovski I等人,Proc Natl Acad Sci USA 88:8691-5(1991)；Tagliabue E等人,Int J
Cancer 47:933-937(1991)；Bacus S等人,Cancer Res 52:2580-9(1992)；Carter P等人,
Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-89(1992)；Harwerth I等人J Biol Chem 267:15160-7
(1992)；Kasprzyk P等人,Cancer Res 52:2771-6(1992)；Lewis G等人,Cancer Immunol
Immunother 37:255-63(1993)；Xu F等人,Int J Cancer 53:401-8(1993)；Arteaga C等
人,Cancer Res 54:3758-65(1994)；Shawver L等人,Cancer Res 54:1367-73(1994)；
Klapper L等人Oncogene 14:2099-109(1997)；WO 1993/21319；WO 1994/00136；WO1997/
00271；WO 1998/77797；US 5,772,997；US 5,783,186；US 5,821,337；US 5,840,525；US 6,
949,245；和US 7,625,859)。

[0306] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合区域，所述结合区域包含选择用于特异性和高亲和力结合人HER2和/或HER2阳性细胞的细胞表面的免疫球蛋白型多肽
(例如免疫球蛋白多肽)。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含至少
一个重链可变(VH)结构域；和/或至少一个轻链可变(VL)结构域。如本文所述，所述至少一种
重链可变结构域多肽可以通过接头(例如本文所述的接头或域间接头)与所述至少一种轻
链可变结构域多肽连接。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含单结
构域抗体片段，例如仅含重链可变(VHH)结构域(例如来源于骆驼抗体)。

[0307] 本发明的细胞靶向分子的结合区域可以通过参考其CDR，例如SEQ ID NO:45-74中定义的那些CDR来定义。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含选自由
以下各项组成的组的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HCDR1，其包含或基本上组成
为如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列之一；
(ii)HCDR2，其包含或基本上组成为如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58或SEQ
ID NO:64所示的氨基酸序列之一；(iii)HCDR3，其包含或基本上组成为如SEQ ID NO:47、
SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列之一；和/或b)轻链可变
(VL)结构域，其包含(i)LCDR1，其包含或基本上组成为如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、SEQ
ID NO:60或SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列之一；(ii)LCDR2，其包含或基本上组成为如
SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列之一；和
(iii)LCDR3，其包含或基本上组成为如SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62或SEQ
ID NO:68中所示的氨基酸序列之一。在某些实施方案中，结合区域包含至少一个重链可变
结构域多肽，所述重链可变结构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ
ID NO:53中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；(ii)分别在SEQ ID NO:57、SEQ ID
NO:58和SEQ ID NO:59所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；或(iii)分别在SEQ ID NO:
63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。在某些实施方
案中，结合区域包含至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结构域多肽包含(i)分别
在SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序
列；(ii)分别在SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所示的LCDR1、LCDR2和
LCDR3氨基酸序列；或(iii)分别在SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68中所示的
LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。

[0308] 在某些实施方案中，结合区域包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中所示的HCDR1、
HCDR2和HCDR3；(ii)分别在SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59所示的HCDR1、
HCDR2和HCDR3氨基酸序列；或(iii)分别如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65所
示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结
构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示的LCDR1、LCDR2
和LCDR3氨基酸序列；(ii)分别在SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62所示的
LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；或(iii)分别在SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID
NO:68所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结
构域多肽，所述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID
NO:53中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻
链可变结构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56中所示的
LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所
述重链可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中所
示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结
构域多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所示的LCDR1、
LCDR2和LCDR3氨基酸序列。例如，结合区域可包含至少一个重链可变结构域多肽，所述重链
可变结构域多肽包含(i)分别在SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所示的
HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；和至少一个轻链可变结构域多肽，所述轻链可变结构域
多肽包含：(i)分别在SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68中所示的LCDR1、LCDR2
和LCDR3氨基酸序列。具有这些CDR的结合区域可以是包含单链可变片段的免疫球蛋白结合
区域。

[0309] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：a)仅重链可变结构域(VHH)，其包含(i)HCDR1，其包含或基本上组成为SEQ ID
NO:69或SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；(ii)HCDR2，其包含或基本上组成为SEQ ID NO:
70或SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列；和(iii)HCDR3，其包含或基本上组成为SEQ ID NO:
71或SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。在某些另外的实施方案中，结合区域包含选自由以
下各项组成的组的多肽：a)仅重链可变结构域(VHH)，其包含(i)HCDR1，其包含或基本上组
成为SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；(ii)HCDR2，其包含或基本上组成为
SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列；和(iii)HCDR3，其包含或基本上组成为
SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。具有这些CDR的结合区域可以是包含来
源于骆驼抗体的仅重链可变结构域(VHH)的免疫球蛋白结合区域(参见例如实施例1，见下
文)。

[0310] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为：与下列氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多)的同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；SEQ ID
NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的氨基酸269至499；SEQ ID NO:28
的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基
酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；SEQ ID
NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；SEQ ID NO:36的氨基酸269至
514；SEQ ID NO:99的氨基酸268至498；SEQ ID NO:100的氨基酸268至499；SEQ ID NO:97的
氨基酸268至500；SEQ ID NO:98的氨基酸268至512；SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨
基酸268至518；SEQ ID NO:101的氨基酸268–519；SEQ ID NO:104的氨基酸267至384；SEQ
ID NO:105的氨基酸268至498；SEQ ID NO:106的氨基酸252至370；SEQ ID NO:107的氨基酸
252至366；和SEQ ID NO:108的氨基酸268至513。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案
中，结合区域包含、基本上组成为或组成为：与以下氨基酸序列有至少85％(诸如90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30
的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；
SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；或SEQ ID NO:36的氨基酸269至514。在本发明的细胞靶
向分子的某些实施方案中，结合区域包含、基本上组成为或组成为：与SEQ ID NO:29或SEQ
ID NO:30的氨基酸269至519有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

[0311] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含由下列多肽序列中的任何一个表示的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:24的氨基酸269至501；SEQ
ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的氨基酸269至499；SEQ ID
NO:28的氨基酸269-520；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519；SEQ ID NO:31
的氨基酸268至386；SEQ ID NO:32的氨基酸269至499；SEQ ID NO:33的氨基酸269至499；
SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；SEQ ID NO:36的氨基
酸269至514；SEQ ID NO:99的氨基酸268至498；SEQ ID NO:100的氨基酸268至499；SEQ ID
NO:97的氨基酸268至500；SEQ ID NO:98的氨基酸268至512；SEQ ID NO:102或103的氨基酸
268至518；SEQ ID NO:101的氨基酸268–519；SEQ ID NO:104的氨基酸267至384；SEQ ID
NO:105的氨基酸268至498；SEQ ID NO:106的氨基酸252至370；SEQ ID NO:107的氨基酸252
至366；和SEQ ID NO:108的氨基酸268至513。在本发明的某些实施方案中，结合区域包含由
以下多肽序列中的任一个表示的多肽，基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:25的氨基
酸269至513；SEQ ID NO:26的氨基酸269至499；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269
至519；SEQ ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:35
的氨基酸253至367；和SEQ ID NO:36的氨基酸269至514。在本发明的细胞靶向分子的某些
实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸269至519表示的多
肽，基本上由其组成或由其组成。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包
含由以下代表的多肽、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:29的氨基酸269至519、SEQ
ID NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；或SEQ ID NO:35的氨基酸
253至367。在某些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:29的氨基酸269至519表示的多
肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:31的氨基
酸268至386表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，结合区域包含由
SEQ ID NO:34的氨基酸253至370表示的多肽，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方
案中，结合区域包含由SEQ ID NO:35的氨基酸253至367表示的多肽，基本上由其组成或由
其组成。在某些实施方案中，结合区域包含由SEQ ID NO:36的氨基酸269至514表示的多肽，
基本上由其组成或由其组成。

[0312] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：与以下任一项所示的氨基酸序列有至少85％
(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID NO:31
的氨基酸268至386；SEQ ID NO:26、29、30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的氨基酸
269至397；SEQ ID NO:24或27的氨基酸381至500；和SEQ ID NO:28的氨基酸401至520。在某
些进一步的实施方案中，结合区域包含至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成
为或组成为：SEQ ID NO:35的氨基酸253至367；SEQ ID NO:34的氨基酸253至370；SEQ ID
NO:31的氨基酸268至386；SEQ ID NO:26、29、30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的氨
基酸269至397；SEQ ID NO:24或27的氨基酸381至500；和SEQ ID NO:28的氨基酸401至520。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含至少一个重链可变(VH)结构
域，其包含、基本上组成为或组成为：与以下任一项所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至
少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO:26、29、30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的氨基酸269至397；SEQ ID
NO:24或27的氨基酸381至500；和SEQ ID NO:28的氨基酸401至520。在本发明的细胞靶向分
子的某些实施方案中，结合区域包含至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为
或组成为：与以下任一项所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:24、27或28的氨基酸269至375；SEQ ID NO:26的氨基酸393至499；SEQ ID NO:25的氨基酸403至513；SEQ
ID NO:36的氨基酸408至514；和SEQ ID NO:29或30的氨基酸413至519。在本发明的细胞靶
向分子的某些实施方案中，结合区域包含至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组
成为或组成为：SEQ ID NO:24、27或28的氨基酸269至375；SEQ ID NO:26的氨基酸393至
499；SEQ ID NO:25的氨基酸403至513；SEQ ID NO:36的氨基酸408至514；和SEQ ID NO:29
或30的氨基酸413至519。本文描述的任何重链可变结构域多肽可以与本文描述的任何轻链
可变结构域多肽组合使用。

[0313] 在某些实施方案中，结合区域可包含：(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:26、29、30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的氨
基酸269至397；SEQ ID NO:24或27的氨基酸381至500；SEQ ID NO:36的氨基酸401至522，或
SEQ ID NO:28的氨基酸401至520；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组
成为或组成为：SEQ ID NO:24、27或28的氨基酸269至375；SEQ ID NO:26的氨基酸393至
499；SEQ ID NO:25的氨基酸403至513；SEQ ID NO:36的氨基酸408至514；和SEQ ID NO:29
或30的氨基酸413至519。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、
基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:24的氨基酸381至500；和(b)至少一个轻链可变(VL)结
构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:24的氨基酸269至375。例如，结合区域可
包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:25的
氨基酸269至397；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：
SEQ ID NO:25的氨基酸403至513。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构
域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:26的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻链
可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:26的氨基酸393至499。例如，
结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ
ID NO:27的氨基酸381至500；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为
或组成为：SEQ ID NO:27的氨基酸269至375。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变
(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:28的氨基酸401至520；和(b)至少
一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:28的氨基酸269至
375。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组
成为：SEQ ID NO:29的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本
上组成为或组成为：SEQ ID NO:29的氨基酸413至519。例如，结合区域可包含(a)至少一个
重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:30的氨基酸269至387；
和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:30的氨
基酸413至519。例如，结合区域可包含(a)至少一个重链可变(VH)结构域，其包含、基本上组
成为或组成为：SEQ ID NO:36的氨基酸269至387；和(b)至少一个轻链可变(VL)结构域，其
包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:36的氨基酸408至514。

[0314] 在某些实施方案中，结合区域包含或基本上组成为SEQ ID NO:102的氨基酸269-520。

[0315] 在某些实施方案中，结合区域包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含或基本上组成为SEQ ID NO:26、29-30或36的氨基酸269至387；SEQ ID NO:25的269至397；SEQ
ID NO:27的381至500；或SEQ ID NO:36的401至522。在某些另外的实施方案中，结合区域包
含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含或基本上组成为SEQ ID NO:27的氨基酸269
至375；SEQ ID NO:26的氨基酸393至499；SEQ ID NO:25的403至513；SEQ ID NO:36的408至
514；SEQ ID NO:29或30的413至519。在某些进一步的实施方案中，结合区域包含或基本上
组成为SEQ ID NO:25的氨基酸269至513；SEQ ID NO:26的269至499；SEQ ID NO:29的269至
519；SEQ ID NO:30的269至519；SEQ ID NO:31的268至386；SEQ ID NO:32的269至499；SEQ
ID NO:33的269至499；SEQ ID NO:34的253至370；SEQ ID NO:35的253至367；SEQ ID NO:36
的269至514。

[0316] 天然配体或其衍生物可以用作用于本发明的细胞靶向分子的HER2结合区域。已知天然HER2与ErbB家族的其他成员在结合配体如表皮生长因子如表皮调节素和调蛋白时异
二聚化(Moasser M,Oncogene 26:6469-87(2007)；Riese D,CullumR,Semin Cell Dev
Biol 28:49-56(2014)；Sollome J等人,Cell Signal 26:70-82(2014))。结合ErbB家族成
员的ErbB配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β细胞素、HB-EGF、表皮调节素、HER2-68和HER2-
100、调蛋白、赫司他汀(herstatin)、NRG-2、NRG-3和NRG-4(Justman Q等人,J Biol Chem
277:20618-24(2002)；Jhabvala-Romero F.,等人,Oncogene 22:8178-86(2003))。ErbB配
体的实例包括调蛋白(HRG)，诸如美国专利5，641，869和Marchionni M等人,Nature362:
312-8(1993)中公开的原型调蛋白。调蛋白的实例包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和
调蛋白-β3(Holmes W等人,Science 256:1205-10(1992)；US 5,641,869)；神经分化因子
(NDF)(Peles等人,Cell 69:205-16(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls D等人,
Cell 72:801-15(1993))；神经胶质生长因子(GGFs)(Marchionni M等人,Nature 362:312-
8(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho W等人,J Biol Chem 270:14523-32
(1995))；γ-调蛋白(Schaefer G等人,Oncogene 15:1385-94(1997))。

[0317] 根据本发明的ErbB配体也可以是合成的ErbB配体。合成配体可以对特定的ErbB受体是特异性的，或者可以识别特定的ErbB受体复合体。合成配体的实例是合成的调蛋白/
EGF嵌合体双调蛋白((Jones J等人,FEBS Lett,447:227-31(1999))和EGF样结构域片段
HRGβ1177-244。与HER2或其衍生物相互作用的ErbB配体或ErbB配体的一部分可以与本发明
的志贺毒素效应多肽融合，以构建结合HER2的细胞外部分的本发明的HER2靶向的细胞靶向
分子。

[0318] 结合HER2的细胞外部分的合成肽可用作用于靶向的结合区域。已经描述了许多能够结合HER2的肽(参加例如美国专利5,578,482；5,856,110；5,869,445；5,985,553；6,333,
169；6,987,088；7,019,017；7,282,365；7,306,801；7,435,797；7,446,185；7,449,480；7,
560,111；7,674,460；7,815,906,7,879,325；7,884,194；7,993,650；8,241,630；8,349,
585；8,389,227；8,501,909；8,512,967；8,652,474；和US 2011/0059090)。

[0319] 在某些实施方案中，结合HER2的细胞外部分的小分子可以用作用于靶向的结合区域。已经描述了许多能够结合HER2的小分子，例如酪氨酸激酶抑制剂、AZD8931、拉帕替尼、
奈拉替尼(HKI-272)、达克替尼(PF-00299804)、阿法替尼(BIBW 2992)(BarlaamB等人,ACS
Med Chem Lett4:742-6(2013)；Yu H,Riley G,J Natl Compr Canc Netw 11:161-9
(2013)；Roskoski R,Pharmacol Res 87C:42-59(2014))。结合HER2的细胞外部分的其他小
分子可以使用本领域技术人员熟知的方法鉴定，例如通过衍生已知的EGFR结合物如吉非替
尼、厄洛替尼、AEE788、AG1478、AG1571(SU-5271)、AP26113、CO-1686、XL647、vandetanib和BMS-690514(Kurokawa H,Arteaga C,Clin Cancer Res 7:4436s-4442s(2001)；Yigitbasi
O等人,Cancer Res 64:7977-84(2004)；Yu H,Riley G,J Natl Compr Canc Netw 11:161-
9(2013)；Roskoski R,Pharmacol Res 87C:42-59(2014))。

[0320] 任何上文提到的HER2结合分子可适合用作HER2结合区域或经修饰以产生一个或更多个HER2结合区域用于本发明的细胞靶向分子。任何上述结合区域结构可以用作本发明
的分子的组分，只要结合区域组分具有对HER2分子的细胞外部分10-5至10-12摩尔/升，优选
小于200纳摩尔(nM)的解离常数即可。

[0321] 由结合区域结合的HER2/neu/ErbB2靶生物分子

[0322] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含能够特异性结合HER2生物分子的细胞外部分或细胞外HER2生物分子的蛋白性区域，优选其物理偶联于感兴趣的
细胞类型(例如癌细胞和/或肿瘤细胞)表面。

[0323] 术语“靶生物分子”是指生物分子，通常是蛋白性分子或通过翻译后修饰(例如糖基化)修饰的蛋白质，其被本发明的细胞靶向分子的结合区域结合，导致细胞靶向分子靶向
多细胞生物体内的特定细胞、细胞类型和/或位置。

[0324] 就本发明的目的而言，关于靶生物分子的术语“细胞外”是指其结构的至少一部分暴露于细胞外环境的生物分子。可以使用本领域熟知的方法由技术人员凭经验确定与细胞
偶联的一部分靶生物分子对细胞外环境的暴露或可及性。细胞外靶生物分子的非限制性实
例包括细胞膜组分、跨膜蛋白、细胞膜锚定的生物分子、细胞表面结合的生物分子和分泌的
生物分子。

[0325] 关于本发明，短语“物理偶联”当用于描述靶生物分子时，是指共价和/或非共价分子间相互作用将靶生物分子或其一部分偶联到细胞外，诸如，靶生物分子和细胞之间的多
个非共价相互作用，其中每个单一相互作用的能量在至少约1-5千卡的量级(例如，静电键、
氢键、离子键、范德华相互作用、疏水力等)。可以发现所有整联膜蛋白与细胞膜、以及周围
膜蛋白物理偶联。例如，细胞外靶生物分子可能包含跨膜区域、脂质锚、糖脂锚和/或与包含
前述任一种的因子非共价地缔合(例如通过非特异性疏水相互作用和/或结合脂质的相互
作用)。

[0326] 靶生物分子的细胞外部分可包括各种表位，包括未修饰的多肽，通过添加生物化学官能团修饰的多肽，和糖脂(参见例如US 5,091,178；EP2431743)。

[0327] 本发明的细胞靶向分子的结合区域可以基于许多标准设计或选择，例如其HER2靶标的细胞类型特异性表达，关于特定细胞类型的其HER2靶生物分子的物理定位和/或其靶
HER2生物分子的特性。例如，本发明的某些细胞靶向分子包含能够结合细胞表面HER2靶生
物分子的结合区域，所述细胞表面HER2靶生物分子仅在细胞表面仅由物种的一种细胞类型
表达或在多细胞生物内仅由一种细胞类型表达。期望但非必要的是，细胞外靶HER2生物分
子在与本发明的细胞靶向分子相互作用时被固有地内化或易于被迫内化。

[0328] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域来源于用于特异性和高亲和性结合至癌症或肿瘤细胞表面的HER2抗原而选择的免疫球蛋白型多肽，其中所示抗原局
限于在癌症或肿瘤细胞中的表达(参加Glokler J等人,Molecules 15:2478-90(2010)；Liu
Y等人,Lab Chip 9:1033-6(2009)。根据其他实施方案，选择用于特异性和高亲和性结合至
癌症细胞的细胞表面的HER2的细胞外部分的结合区域，其中与非癌细胞相比，HER2由癌细
胞过表达或优先表达。

[0329] 技术人员将理解，任何需要的靶HER2生物分子可用于设计或选择与志贺毒素效应多肽缔合和/或偶联的合适结合区域，以产生本发明的细胞靶向分子。

[0330] 本文所述的任何上述结合区域可单独使用或与本发明的每个单独的实施方案(包括本发明的方法)组合使用。

[0331] 本发明的细胞靶向分子的一般结构是模块式的，因为多个多样性的HER2靶向结合区域可以与本发明的各种志贺毒素效应多肽缔合，以产生本发明的不同的细胞靶向分子，
由于它们的结合区域的差异，它们的细胞靶向活性表现出差异。这使得本发明的细胞靶向
分子的不同实施方案能够展示多种细胞靶向活性，使得不同的实施方案靶向具有志贺毒素
效应子功能(例如白细胞淤积，细胞毒性和外源性物质的细胞内递送)的不同类型的细胞。
此外，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案由于它们各自的志贺毒素效应多肽区域的差
异而表现出某些特征，例如当施用于脊索动物时的低抗原性和/或免疫原性，通过某些蛋白
酶对蛋白水解切割的抗性，当施用于多细胞生物体时的高稳定性、高剂量下的体内耐受性，
将货物递送至细胞内位置的能力、和/或将T细胞表位递送至MHC I类分子用于在细胞表面
呈递的能力。

[0332] 就本发明的目的而言，志贺毒素效应多肽区域和细胞靶向HER2结合区域的特定顺序或方向相对于彼此或在本发明的细胞靶向分子内不是固定的，除非明确指出。例如，当本
发明的细胞靶向分子是具有氨基端和羧基端的融合蛋白时，本发明组分的各种排列可能是
合适的(参见例如图1)。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，其组分相对于彼此或
在细胞靶向分子内的排列如本文所述受到限制。例如，某些内质网保留/回收信号基序(参
见例如WO 2015/138435)通常位于本发明的细胞靶向分子的羧基末端和/或本发明的细胞
靶向分子的蛋白质组分的羧基末端。

[0333] B.志贺毒素A亚基效应多肽的一般结构

[0334] 本发明的细胞靶向分子包含至少一种来源于野生型志贺毒素A亚基的志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效应多肽进一步包含一个或更多个结构修饰，例如突变，如截短和/
或氨基酸残基置换。对于某些实施方案，本发明涉及改善的志贺毒素A亚基效应多肽的工程
改造，其包含两种或更多种以下志贺毒素效应多肽亚区的组合：(1)去免疫化的亚区，(2)志
贺毒素A1片段区的羧基末端附近的蛋白酶切割抗性亚区，和(3)T细胞表位-肽嵌入或插入
亚区。例如，本发明的志贺毒素效应多肽可以包含以下组合：(1)去免疫化的亚区，(2)志贺
毒素A1片段区域的羧基末端邻近的蛋白酶切割抗性亚区，和(3)不与去免疫化的亚区重叠
的T细胞表位-肽嵌入或插入亚区。

[0335] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效应多肽包含志贺毒素A1片段区域，其中所述志贺毒素A亚基效应多肽包含：(a)嵌入的
或插入的异源性CD8+T细胞表位，其破坏内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域(诸如志贺
毒素A1片段区域内的区域)；(b)至少三个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域(诸如志贺
毒素A1片段区域内的三个或更多个区域)的破坏，其不与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表
位重叠；和(c)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中志贺
毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能。在某些进一步的实施方案中，所述志
贺毒素A亚基效应多肽相对于野生型志贺毒素A亚基在其羧基末端被截短，导致一个或更多
个内源B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的消除。在某些进一步的实施方案中，与野生型志贺
毒素A亚基的羧基末端相比，弗林蛋白酶切割基序包含羧基末端截短。在某些进一步的实施
方案中，与野生型志贺毒素A亚基的羧基末端相比，弗林蛋白酶切割基序被羧基末端截短破
坏。对于某些实施方案，与参照分子相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/
或相对免疫原性，参照分子为例如包含志贺毒素A1片段区域的野生型志贺毒素A效应多肽，
包含含志贺毒素A1片段区域的野生型志贺毒素A效应多肽的参照细胞靶向分子，或由细胞
靶向分子组成的参照细胞靶向分子，只是它缺乏细胞靶向分子中存在的以下特征的任何组
合：(1)嵌入或插入的CD8+T细胞表位，(2)至少三个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域
的破坏，和/或(3)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端破坏的弗林蛋白酶切割基序。

[0336] 就本发明的目的而言，志贺毒素效应多肽是来源于志贺毒素家族的志贺毒素A亚基成员的多肽，其能够表现出一种或更多种志贺毒素功能(参见例如,Cheung M等人,Mol
Cancer 9:28(2010)；WO 2014/164693；WO2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；
WO 2015/191764)并且包含具有羧基末端的志贺毒素A1片段来源的区域。志贺毒素功能包
括例如增加细胞内化、引导从内体区室到胞质溶胶的亚细胞按路线发送、避免细胞内降解、
催化失活核糖体以及实现细胞抑制和/或细胞毒性作用。

[0337] 志贺毒素家族的蛋白质毒素由结构和功能相关的各种天然存在的毒素(例如志贺毒素、志贺样毒素1和志贺样毒素2(Johannes L, W,Nat Rev Microbiol 8:105-16
(2010)))组成。志贺毒素家族的全毒素成员含有靶向结构域，所述靶向结构优先结合存在
于一些宿主细胞表面上的特定鞘糖脂和能够一旦在细胞内则在细胞内永久失活核糖体的
酶结构域(Johannes L, W,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺毒素家族的
成员共享相同的总体结构和作用机制(Engedal N等人,Microbial Biotech 4:32-46
(2011))。例如，Stx、SLT-1和SLT-2在无细胞系统中显示出难以区分的酶活性(Head S等人,
J Biol Chem 266:3617-21(1991)；Tesh V等人,Infect Immun 61:3392-402(1993)；
Brigotti M等人,Toxicon 35:1431–1437(1997))。

[0338] 志贺毒素家族包括从痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)血清型1分离的真正志贺毒素(Stx)、从肠出血性大肠杆菌(E.coli)的血清型分离的志贺样毒素1A亚基变体(SLT1或
Stx1或SLT-1或Slt-I)以及从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或
Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx仅有一个氨基酸残基不同，并且二者被称为维罗细胞毒素
(Verocytotoxins)或维罗毒素(Verotoxins)(VTs)(O’Brien A,Curr Top Microbiol
Immunol 180:65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体彼此在主要的氨基酸序列水平上仅约
53-60％相似，但是它们共有志贺毒素家族成员所共有的酶活性和细胞毒性机制
(Johannes, W，Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的
志贺毒素，诸如限定的亚型Stx1a、Stx1c、Stx1d和Stx2a-g(Scheutz F等人，J Clin
Microbiol 50:2951-63(2012))。志贺毒素家族的成员天然地不受任何细菌物种的限制，因
为志贺毒素编码基因可以通过水平基因转移在细菌物种中传播(Strauch E等人,Infect
Immun 69:7588-95(2001)；Bielaszewska M等人,Appl Environ Micrbiol 73:3144-50
(2007)；Zhaxybayeva O,Doolittle W,Curr Biol 21:R242-6(2011))。作为物种之间转移
的实例，在从患者分离的溶血不动杆菌(A.haemolyticus)菌株中发现志贺毒素(Grotiuz G
等，J Clin Microbiol 44:3838-41(2006))。当编码志贺毒素的多核苷酸进入新的亚种或
物种时，推测志贺毒素氨基酸序列由于基因漂变和/或选择压力能够发展少量序列变化，同
时仍然保留志贺毒素家族成员共有的细胞毒性机制(参见Scheutz，J Clin Microbiol 50:
2951-63(2012))。

[0339] 1.去免疫化的志贺毒素A亚基效应多肽

[0340] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽是去免疫化的，例如，与野生型志贺毒素、野生型志贺毒素多肽和/或仅包含野生型多肽序列的志贺毒素效应多肽相比。本发
明的去免疫化的志贺毒素效应多肽各自包含至少一个(例如，至少两个、三个、四个、五个、
六个、七个、八个、九个或更多个)假定的内源性表位区域的破坏，以便在将多肽施用于脊索
动物后降低志贺毒素效应多肽的抗原性和/或免疫原性潜力。志贺毒素效应多肽和/或志贺
毒素A亚基多肽，无论是否天然存在，可通过本文所述的方法(如WO 2015/113005和/或WO
2015/113007中所述，和/或技术人员已知的)去免疫化，其中所得分子保留或表现出一种或
更多种志贺毒素A亚基功能。

[0341] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含诸如B细胞和/或CD4+T细胞表位的内源性表位或表位区域的破坏。在某些进一步的实施方案中，本发明的志贺毒素效
应多肽包含至少一个(诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包
含本文所述的至少一个(例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)内源
性表位区域的破坏，其中在将多肽施用于脊索动物后，该破坏降低了志贺毒素效应多肽的
抗原性和/或免疫原性潜力，并且其中志贺毒素效应多肽能够表现出一种或更多种志贺毒
素A亚基功能，例如，显著水平的志贺毒素细胞毒性。例如，本发明的志贺毒素效应多肽包含
至少三个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏(例如，由于相对于野生型志贺毒素
A亚基的两个或更多个突变和一个或更多个截短)。

[0342] 术语“破坏的”或“破坏”与表位区域相关用在本文时，是指表位区域中至少一个(诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)氨基酸残基的缺失，两个以上氨基酸残基的倒位，其中至少一个倒位的氨基酸残基是在表位区域，在表位区域内插入至
少一个(诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)氨基酸，和表位区域至少一个氨基酸残基的置换。通过突变进行的表位区域破坏包括用非标准氨基酸和/或非天
然氨基酸进行的氨基酸置换。表位区域可以备选地通过突变破坏，所述突变包括通过加入
掩蔽表位区域的至少一个氨基酸的共价连接的化学结构修饰氨基酸，例如，参见聚乙二醇
化(参见Zhang C等人，BioDrugs 26:209-15(2012)、小分子辅助物(Flower D，Expert Opin
Drug Discov 7:807-17(2012)和位点特异性白蛋白化(albumination)(Lim S等人,J
Control Release 207-93(2015))。

[0343] 在本文中参照序列表中提供的天然志贺毒素A亚基的特定氨基酸位置指出某些表位区域和破坏，注意，天然存在的志贺毒素A亚基可以包含在其氨基端含有约22个氨基酸的
信号序列的前体形式，所述信号序列被去除，产生成熟的志贺毒素A亚基，并且可被技术人
员认识到。此外，在本文中，参照在天然志贺毒素A亚基内的特定位置天然存在的特定氨基
酸(例如，S表示丝氨酸残基)(例如，S33表示从氨基末端开始位置33的丝氨酸残基)，接着是
在所讨论的特定突变用于置换该残基的氨基酸(例如，S33I表示在从氨基末端开始氨基酸
残基33的丝氨酸置换为异亮氨酸的氨基酸置换)，来表示特定的表位区域破坏。

[0344] 在某些进一步的实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含至少一个(诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)本文提供的表位区域的破
坏。例如，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽可包含本文提供的至少三个表位区域的
破坏。在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含本文提供的至少四
个表位区域的破坏。在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含本文
提供的至少五个表位区域的破坏。在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应
多肽包含至少一个WO 2015/113005或WO2015/113007中描述的表位区域的破坏。如本文所
述，当志贺毒素效应多肽还包含嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位时，至少一些破坏的、
内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域不与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位重叠。

[0345] 在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含或基本上组成为全长志贺毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-2A(SEQ ID
NO:3))，所述全长志贺毒素A亚基包含选自由以下各项组成的天然定位的氨基酸的组的氨
基酸序列的至少一个破坏：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1–15；SEQ ID NO:3的3–14；SEQ
ID NO:3的26–37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27–37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39–
48；SEQ ID NO:3的42–48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53–66；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94–115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141–153；SEQ ID
NO:3的140–156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179–190；SEQ ID NO:3的179–191；SEQ ID
NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的210–218；SEQ ID NO:3的
240–258；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243–257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254–268；
SEQ ID NO:3的262–278；SEQ ID NO:3的281–297；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的285–
293，或志贺毒素A亚基多肽中的等同位置，保守的志贺毒素效应多肽亚区域和/或非天然的
志贺毒素效应多肽序列(例如SEQ ID NO:4-18中所示的志贺毒素效应多肽)。

[0346] 在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：全长或截短的志贺毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)、
SLT-2A(SEQ ID NO:3)或SEQ ID NO：7-18中的任一个，其进一步包含至少一个(诸如至少两
个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的
破坏，其中B细胞区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94-
115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的205；和SEQ ID NO:3的210-218；SEQ ID NO:3的240-260；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:
2的243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的254-268；SEQ ID NO:3的262-278；SEQ ID NO:3
的281-297；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等
同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1A亚基变体和SEQ ID NO:7-18中所示的志
贺样毒素2A亚基变体中任何一种的等同区域)；和CD4+T细胞表位区域选自由以下各项组成
的天然定位的志贺毒素A亚基区：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
128-168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；
和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸
如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1A亚基变体和SEQ ID NO:7-18中所示的志贺样毒素2A
亚基变体中任何一种的等同区域)。在某些实施方案中，B细胞表位区域选自由以下各项组
成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:
3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-
66，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94–115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的
179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的210-218和
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如
SEQ ID No:4-6中所示的志贺毒素1A亚基变体和SEQ ID No:7-18中所示的志贺样毒素2A亚
基变体中任何一种的等同区域)；且CD4+T细胞表位区域选自由以下各项组成的天然定位的
志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；或志贺
毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1A亚基变体和
SEQ ID NO:7-18中所示的志贺样毒素2A亚基变体的中的任何一种的等同区域)。

[0347] 在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：全长或截短的志贺毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)、
志贺毒素1A亚基变体效应多肽(SEQ ID NO:4-6)、SLT-2A(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2A亚
基变体效应多肽(SEQ ID NO：7-18))，其包含至少三个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区
域的破坏，其中所述破坏包含在B细胞表位区域的相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所
述B细胞表位区域选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的1-15；SEQ ID NO:3的3-14；SEQ ID NO:3的26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的39-48；SEQ ID NO:3的42-48；SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的53-66，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94–115；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141-153；SEQ ID NO:3的140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的179-190；SEQ ID NO:3的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的205；SEQ ID NO:3的210-218和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的243-257；或志贺毒素A亚基
或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1A亚基变体和SEQ ID
NO:7-18中所示的志贺样毒素2A亚基变体中任何一种的等同区域)；和/或CD4+T细胞表位区
域，其选自由以下各项组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的4-33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的34-78；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的77-103；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的128-168；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的160-183；和SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的236-258；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域(诸如SEQ ID
NO:4-6中所示的志贺毒素1A亚基变体和SEQ ID NO:7-18中所示的志贺样毒素2A亚基变体
中的任何一个的等同区域)。在某些实施方案中，至少三个B细胞和/或CD4+T细胞表位区域
中的每一个包含含相对于野生型志贺毒素A亚基序列的氨基酸残基置换的破坏。

[0348] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为截短的志贺毒素A亚基。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位区域的缺失而不影响志贺毒
素效应子功能。显示表现出显著酶活性的最小的志贺毒素A亚基片段是由StxA的残基75-
247组成的多肽(Al-Jaufy A等，Infect Immun 62：956-60(1994))。截短SLT-1A、StxA或
SLT-2A的羧基末端至氨基酸1-251去除两个预测的B细胞表位区域、两个预测的CD4阳性的
(CD4+)T细胞表位和一个预测的不连续的B细胞表位。截短SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端
至75-293去除至少三个预测的B细胞表位区域和三个预测的CD4+T细胞表位。截短SLT-1A、
StxA或SLT-2A的氨基端和羧基端二者至75-251缺失了至少五个预测的B细胞表位区域、四
个推定的CD4+T细胞表位；和一个预测的不连续的B细胞表位。

[0349] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可以包含、基本上组成为或组成为：在提供的表位区域具有至少一个(例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)突变(例如，缺失、插入、倒位或置换)的全长或截短的志贺毒素A亚基。在某些进一
步的实施方案中，所述多肽包含含有表位区域内至少一个氨基酸的缺失的破坏。在某些进
一步的实施方案中，所述多肽包含含有在表位区域内至少一个氨基酸的插入的破坏。在某
些进一步的实施方案中，所述多肽包含含有氨基酸倒位的破坏，其中至少一个倒位的氨基
酸位于表位区域内。在某些进一步的实施方案中，多肽包含含有在表位区域内的至少一个
(例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个)氨基酸的置换的破坏。在某些其他实施方案中，所述多肽包含含有突变的破坏，所述突变诸如氨基酸置换为非标准氨基
酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸。下文的实例中提供了单个氨基酸置换的多个实例。

[0350] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可包含、组成为或基本上组成为：与天然序列相比具有一个或更多个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基，所述全长或截短
的志贺毒素A亚基包含选自由以下各项组成的组的至少一个氨基酸置换：A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H和K。在某些进一步的实施方案中，所述多肽可包含、组成为或基本上组成为：与天然序列相比具有单个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基，其中所述置换选自由以
下各项组成的组：D至A,D至G,D至V,D至L,D至I,D至F,D至S,D至Q,E至A,E至G,E至V,E至L,E
至I,E至F,E至S,E至Q,E至N,E至D,E至M,E至R,G至A,H至A,H至G,H至V,H至L,H至I,H至F,H至
M,K至A,K至G,K至V,K至L,K至I,K至M,K至H,L至A,L至G,N至A,N至G,N至V,N至L,N至I,N至F,
P至A,P至G,P至F,R至A,R至G,R至V,R至L,R至I,R至F,R至M,R至Q,R至S,R至K,R至H,S至A,S
至G,S至V,S至L,S至I,S至F,S至M,T至A,T至G,T至V,T至L,T至I,T至F,T至M,T至S,Y至A,Y至
G,Y至V,Y至L,Y至I,Y至F,和Y至M。

[0351] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含、组成为或基本上组成为：与天然氨基酸残基序列相比，具有一个或更多个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基，其包含
免疫原性残基的和/或表位区域内的至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个置换发生在
选自由以下各项组成的组的天然定位的氨基酸组上：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的56；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:
2的62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的88；SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的
109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111；SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141；SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID
NO:3的250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286；或志贺毒
素A亚基多肽中的等同位置，保守的志贺毒素效应多肽亚区和/或非天然的志贺毒素效应多
肽序列(诸如SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1A亚基变体效应多肽或SEQ ID NO:7-18中
所示的志贺样毒素2A亚基变体效应多肽)。

[0352] 在某些进一步的实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含、组成为或基本上组成为：具有免疫原性残基的和/或表位区域内的至少一个置换的全长或截短的志贺毒素A
亚基，其中至少一个氨基酸置换是相对于定位在以下天然位置的天然存在的氨基酸对非保
守氨基酸(参见，例如表C，下文)：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8；SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的56；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或
SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的84；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的107；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的
179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的189；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的205；SEQ ID NO:3的241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID NO:3的250；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286；或志贺毒素A亚基的等同位置，
保守的志贺毒素效应多肽亚区和/或非天然的志贺毒素效应多肽序列(诸如SEQ ID NO:4-
18中任一个的志贺毒素效应多肽)。

[0353] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：与天然氨基酸残基序列相比具有一个或更多个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基，所述全
长或截短的志贺毒素A亚基包含免疫原性残基的和/或在表位区域内的至少一个氨基酸置
换，其中所述至少一个置换发生在选自由以下各项组成的组的天然定位的氨基酸位置：SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的45；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2
的141；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
251。

[0354] 在某些进一步的实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含或基本上组成为：具有选自由以下各项组成的组的至少一个氨基酸置换的全长或截短的志贺毒素A亚基：K1
至A,G,V,L,I,F,M和H；T4至A,G,V,L,I,F,M,和S；D6至A,G,V,L,I,F,S,和Q；S8至A,G,V,I,L,
F,和M；T8至A,G,V,I,L,F,M,和S；T9至A,G,V,I,L,F,M,和S；S9至A,G,V,L,I,F,和M；K11至A,
G,V,L,I,F,M和H；T12至A,G,V,I,L,F,M,和S；S33至A,G,V,L,I,F,和M；S43至A,G,V,L,I,F,
和M；G44至A和L；S45至A,G,V,L,I,F,和M；T45至A,G,V,L,I,F,和M；G46至A和P；D47至A,G,V,
L,I,F,S,和Q；N48至A,G,V,L,和M；L49至A或G；F50；A51至V；D53至A,G,V,L,I,F,S,和Q；V54
至A,G,和L；R55至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；G56至A和P；I57至A,G,M,和F；L57至A,G,M,和
F；D58至A,G,V,L,I,F,S,和Q；P59至A,G,和F；E60至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,和R；E61至A,
G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,和R；G62至A；D94至A,G,V,L,I,F,S,和Q；R84至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,
K,和H；V88至A和G；I88至A,G,和V；D94；S96至A,G,V,I,L,F,和M；T104至A,G,V,I,L,F,M,和
S；A105至L；T107至A,G,V,I,L,F,M,和S；S107至A,G,V,L,I,F,和M；L108至A,G,和M；S109至
A,G,V,I,L,F,和M；T109至A,G,V,I,L,F,M,和S；G110至A；D111至A,G,V,L,I,F,S,和Q；S112
至A,G,V,L,I,F,和M；D141至A,G,V,L,I,F,S,和Q；G147至A；V154至A和G；R179至A,G,V,L,I,
F,M,Q,S,K,和H；T180至A,G,V,L,I,F,M,和S；T181至A,G,V,L,I,F,M,和S；D183至A,G,V,L,
I,F,S,和Q；D184至A,G,V,L,I,F,S,和Q；L185至A,G,和V；S186至A,G,V,I,L,F,和M；G187至
A；R188至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；S189至A,G,V,I,L,F,和M；D197至A,G,V,L,I,F,S,和
Q；D198至A,G,V,L,I,F,S,和Q；R204至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R205至A,G,V,L,I,F,M,
Q,S,K和H；C242至A,G,V,和S；S247至A,G,V,I,L,F,和M；Y247至A,G,V,L,I,F,和M；R247至A,
G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R248至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R250至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,
K,和H；R251至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；C262至A,G,V,和S；D264至A,G,V,L,I,F,S,和Q；
G264至A；和T286至A,G,V,L,I,F,M,和S。

[0355] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应包含、组成为或基本上组成为：具有至少一个(例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个)以下氨基酸置换的全长或截短的志贺毒素A亚基：K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,
T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,
D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,
I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,
V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,
G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,
S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,
Y247A,R247A,R248A,R250A,R251A,或D264A,G264A,T286A,和/或T286I。在某些进一步的实
施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：具有至少一个(例如
至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个)以下氨基酸置换的全长或截短的志贺毒素A亚基：K1A、S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、
E60T、E61L、G110A、D141A、G147A、R188A、C242S、R248A和R251A。这些表位破坏性置换可以组合形成去免疫化的志贺毒素效应多肽，所述去免疫化的志贺毒素效应多肽具有每个表位区
域的多个置换和/或多个表位区域被破坏但仍然保留志贺毒素效应子功能。例如，在以下天
然定位的置换：K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,
G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,
D53G,V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,
E60T,E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,
S109V,T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,
D183G,D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,
S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,Y247A,R247A,R248A,R250A,R251A,或D264A,
G264A,T286A和/或T286I可以在可能的情况下与在天然定位的残基的置换组合：K1A,K1M,
T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,
T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,V54L,V54I,R55A,
R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,E60R,E61A,E61V,
E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,
D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184A,
D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,
R205A,C242S,S247I,Y247A,R247A,R248A,R250A,R251A,或D264A,G264A,T286A,和/或
T286I以产生本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽。例如，本发明的志贺毒素效应多肽可
包含、基本上组成为或组成为全长或截短的志贺毒素A亚基，其包含在志贺毒素A亚基中的
天然位置的以下置换：K1A、S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、E60T、E61L、G110A、G147A、C242S、R248A和R251A。这些置换对应于SEQ ID NO:24-27和97-100中任一个所示的示例性细胞靶
向分子的志贺毒素效应多肽中存在的置换。例如，本发明的志贺毒素效应多肽可包含、基本
上组成为或组成为：在志贺毒素A亚基的天然位置包含以下置换的全长或截短的志贺毒素A
亚基：S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、E60T、E61L、G110A、R188A、C242S、R248A和R251A。这些置换对应于SEQ ID NO:28–29、31–32、34、36、101–102、104–105、106和108中任一个所示的示例性细胞靶向分子的志贺毒素效应多肽中存在的置换。例如，本发明的志贺毒素效应多肽
可包含、基本上组成为或组成为：在志贺毒素A亚基的天然位置包含以下置换的全长或截短
的志贺毒素A亚基：S45I、V54I、R55L、I57F、P59F、E60T、E61L、G110A、D141A、R188A、C242S、R248A和R251A。这些置换对应于SEQ ID NO:30或103中任一个所示的示例性细胞靶向分子
的志贺毒素效应多肽中存在的置换。

[0356] 本文所述的任何去免疫化的志贺毒素效应多肽亚区和/或表位破坏突变可单独使用或与本发明的每个单独的实施方案组合使用，包括本发明的方法。

[0357] 2.蛋白酶-切割抗性的志贺毒素A亚基效应多肽

[0358] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段来源的区域和(2)在志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基
序。提高细胞靶向分子的志贺毒素组分与其他组分(例如，细胞靶向结合区域)之间的连接
的稳定性可以通过减少由连接破坏和细胞靶向的丧失(例如，由于蛋白水解作用)引起的非
特异性毒性来改善它们在施用于生物体后的毒性特征。在某些实施方案中，与野生型志贺
毒素A亚基的羧基末端相比，本发明的蛋白酶切割抗性志贺毒素效应多肽具有羧基末端截
短。

[0359] 志贺毒素家族的成员的志贺毒素A亚基包含在对志贺毒素功能重要的其A1片段区域的羧基末端的保守的弗林蛋白酶切割位点。弗林蛋白酶切割位点基序和弗林蛋白酶切割
位点可由技术人员使用标准技术和/或通过使用本文的信息来鉴定。

[0360] 志贺毒素细胞毒性的模型是在中毒细胞中通过弗林蛋白对志贺毒素A亚基的细胞内蛋白水解加工对于以下各项是必要的：1)A1片段从志贺全毒素的剩余部分的释放，2)通
过暴露A1片段的羧基末端的疏水结构域，A1片段从内质网的逃逸，和3)A1片段的酶促活化
(参见Johannes L, W,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺毒素A1片段从中
毒细胞的内质网中志贺全毒素的A2片段和剩余组分中的有效释放对于以下各项是必要的：
细胞内按路径发送到胞质溶胶、最大酶活性、有效核糖体失活和实现最佳细胞毒性，即与野
生型志贺毒素相当(见例如WO2015/191764和其中的参考文献)。

[0361] 在志贺毒素中毒过程中，A亚基在保守的精氨酸残基的羧基键被弗林蛋白酶蛋白水解切割(例如，在StxA和SLT-1A中位置251的精氨酸残基和在Stx2A和SLT-2A中位置250的
精氨酸残基)。志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割发生在内体和/或高尔基区室中。弗林蛋白
酶是一种由宽泛种类的细胞型、在所检验的所有人组织中和由大部分动物细胞表达的专门
的丝氨酸内切蛋白酶。弗林蛋白酶切割包含通常以最小的、二元共有基序R-x-(R/K/x)-R为
中心的可及基序的多肽。志贺毒素家族成员的A亚基包含保守的、表面暴露的、延伸的环结
构(例如，在StxA和SLT-1A中的242-261，和在SLT-2中的241-260)，该结构具有被弗林蛋白
酶切割的保守的S-R/Y-x-x-R基序。位于StxA中氨基酸残基242-261处的表面暴露的、延伸
的环结构是弗林蛋白酶诱导的StxA切割所需要的，包括最小的、弗林蛋白酶切割基序R-x-
x-R侧翼的特征。

[0362] 志贺毒素A亚基和志贺毒素效应多肽中的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点可由本领域技术人员使用标准方法和/或通过使用本文的信息鉴定。弗林蛋白酶切割
最小的共有基序R-x-x-R(Schalken J等人,J Clin Invest 80:1545-9(1987)；Bresnahan
P等人,J Cell Biol 111:2851-9(1990)；Hatsuzawa K等人,J Biol Chem 265:22075-8
(1990)；Wise R等人,Proc Natl Acad Sci USA 87:9378-82(1990)；Molloy S等人,J Biol
Chem 267:16396-402(1992))。与此一致，许多弗林蛋白酶抑制剂包含含有基序R-x-x-R的
肽。弗林蛋白酶的合成抑制剂的实例是包含肽R-V-K-R(SEQ ID NO:157)的分子(Henrich S
等人，Nat Struct Biol 10：520-6(2003))。通常，包含具有被两个氨基酸残基隔开的两个
带正电荷的氨基酸的表面可及的二元氨基酸基序的肽或蛋白质，可被预测为对弗林蛋白酶
切割敏感，具有在此基序的最后一个碱性氨基酸的羧基键处发生的切割。

[0363] 由弗林蛋白酶切割的底物中的共有基序已经被鉴定出具有一定程度特异性。弗林蛋白酶切割位点基序已被描述，其包含可以标记为P14至P6'(使用Schechter I,Berger,A,
Biochem Biophys Res Commun 32:898-902(1968)中描述的命名法)的20个连续的氨基酸
残基区域(Tian S等人,Int J Mol Sci 12:1060-5(2011))。根据这个命名法，弗林蛋白酶
切割位点位于指定为P1的氨基酸残基的羧基键上，并且将弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残
基，从该参照P1残基朝向氨基末端的方向，编号为P2、P3、P4等。从P1参照残基朝向羧基末端
的基序的氨基酸残基用撇符号P2'、P3'、P4'等编号。使用该命名法，P6至P2'区域描绘了由
弗林蛋白酶的酶结构域结合的弗林蛋白酶切割基序的核心底物。两个侧翼区域P14至P7和
P3'至P6'通常富含极性氨基酸残基，以增加位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的可
及性。

[0364] 一般的弗林蛋白酶切割位点通常由对应于P4-P3-P2-P1的共有基序R-x-x-R描述；其中“R”代表精氨酸残基(参见上表A)，短划线“-”代表肽键，且小写“x”代表任何氨基酸残基。然而，其他残基和位置可能有助于进一步限定弗林蛋白酶切割基序。略微更精确的弗林
蛋白酶切割位点共有基序通常被报道为共有基序R-x-[K/R]-R(其中正斜杠“/”意指“或”，
并且分开在同一位置上备选的氨基酸残基)，其对应于P4-P3-P2-P1，原因在于观察到弗林
蛋白酶具有切割包含该基序的底物的强优先性。

[0365] 除了最小的弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R，还已经描述了较大的弗林蛋白酶切割基序，其在某些位置具有特定氨基酸残基偏好性。通过比较多种已知的弗林蛋白酶底物，已
经对20个氨基酸残基长的弗林蛋白酶切割位点基序中的氨基酸残基表征了某些物理化学
特性。弗林蛋白酶切割基序的P6至P2’区域勾画出核心弗林蛋白酶切割位点，其与弗林蛋白
酶的酶结构域物理性相互作用。两个侧翼区P14至P7和P3’至P6’通常是亲水性的，富含极性
的氨基酸残基，以增加位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的表面可及性。

[0366] 通常，从位置P5到P1的弗林蛋白酶切割基序区域倾向于包含具有正电荷和/或高等电点的氨基酸残基。特别地，标记弗林蛋白酶解位置的P1位置通常被精氨酸占据，但是在
该位置可能出现其他带正电荷的氨基酸残基。位置P2和P3倾向于被柔性氨基酸残基占据，
特别是P2倾向于被精氨酸、赖氨酸占据，或者有时被非常小且柔性氨基酸残基如甘氨酸占
据。在弗林蛋白酶底物中，P4位置倾向于被带正电荷的氨基酸残基占据。然而，如果P4位置
被脂族氨基酸残基占据，那么缺乏带正电荷的官能团可以通过位于位置P5和/或P6的带正
电荷的残基补偿。位置P1’和P2’通常被脂族和/或疏水性氨基酸残基占据，其中P1’位置最
常被丝氨酸占据。

[0367] 两个亲水性侧翼区倾向于被极性的亲水性的且具有较小的氨基酸官能团的氨基酸残基占据；然而，在某些验证的弗林蛋白酶底物中，侧翼区不含有任何亲水性氨基酸残基
(参见Tian S,Biochem Insights 2:9-20(2009))。

[0368] 在志贺毒素A1片段和A2片段之间的连接处的天然志贺毒素A亚基中发现的二十个氨基酸残基的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点在某些志贺毒素中得到充分表
征。例如，在StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:1)或另一种志贺毒素1A亚基效应多
肽(例如，SEQ ID NO：4-6)中，该弗林蛋白酶切割基序天然地位于L238至F257，且在SLT-2A
(SEQ ID NO:3或基于志贺样毒素2A亚单位变体的志贺毒素效应多肽(例如，SEQ ID NO:7-
18)，该弗林蛋白酶切割基序天然定位于V237至Q256。基于本文所述的氨基酸同源性、实验
和/或弗林蛋白酶切割测定，技术人员可以鉴定在其他天然志贺毒素A亚基或志贺毒素效应
多肽中的弗林蛋白酶切割基序，其中所述基序是真实的弗林蛋白酶切割基序或者预计导致
在真核细胞内的这些分子的弗林蛋白酶切割后A1和A2片段的产生。

[0369] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段来源的多肽和(2)在志贺毒素A1片段来源的多肽的羧基末端破坏的弗林蛋白酶切
割基序。志贺毒素A1片段来源的多肽的羧基末端可以由本领域技术人员通过使用本领域已
知的技术鉴定，例如通过使用蛋白质序列比对软件鉴定(i)天然存在的志贺毒素的保守的
弗林蛋白酶切割基序，(ii)天然存在的志贺毒素保守的表面暴露的、延伸的环，和/或(iii)
主要是疏水的一段氨基酸残基(即疏水性“贴片”)，其可以被ERAD系统识别。

[0370] 本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽(1)可以在其志贺毒素A1片段区域的羧基末端完全缺乏任何弗林蛋白酶切割基序和/或(2)包含在其志贺毒素A1片段区域的
羧基末端和/或来源于志贺毒素A1片段的羧基末端的区域的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的各种改变，诸如，例
如翻译后修饰、氨基酸官能团中一个或更多个原子的改变、向氨基酸官能团添加一个或更
多个原子、与非蛋白性部分的缔合和/或诸如产生支链蛋白质结构的与氨基酸残基、肽、多
肽的连接。

[0371] 蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽可使用本文所述的方法、WO2015/191764中所述的方法和/或技术人员已知的的方法，从志贺毒素效应多肽和/或志贺毒素A亚基多肽
中生成，无论是否天然存在，其中所得分子仍然保留一种或更多种志贺毒素A亚基功能。

[0372] 就本发明的目的而言，关于弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序，术语“破坏”或“破坏的”是指天然存在的弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的改变，诸
如，例如，突变，与野生型志贺毒素A亚基的或来源于野生型志贺毒素A亚基的仅包含野生型
多肽序列的多肽的弗林蛋白酶切割相比，所述改变导致在邻近志贺毒素A1片段区域的羧基
末端或来源于其的可鉴定区域的弗林蛋白酶切割的减少。弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残
基的改变包括弗林蛋白酶切割基序中的突变，例如弗林蛋白酶切割基序的缺失、插入、倒
位、置换和/或羧基末端截短，以及翻译后修饰，例如，由于涉及将分子与氨基酸残基的官能
团缀合或连接的糖基化、白蛋白化等。因为弗林蛋白酶切割基序由大约20个氨基酸残基组
成，理论上，涉及这20个位置的任何一个的一个或更多个氨基酸残基的改变、修饰、突变、缺
失、插入和/或截短可能导致弗林蛋白酶切割敏感性的降低(Tian S等人,Sci Rep 2:261
(2012))。弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的破坏可增加或可不增加通过其
他蛋白酶(例如哺乳动物的血管系统中常见的胰蛋白酶和细胞外蛋白酶)的切割的抗性。给
定破坏对给定蛋白酶的切割敏感性的影响可以由技术人员使用本领域已知的技术测试。

[0373] 就本发明的目的而言，“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是弗林蛋白酶切割基序，其包含来源于代表保守的弗林蛋白酶切割基序的20个氨基酸残基区域的一个或更多个氨基
酸残基的改变，所述保守的弗林蛋白酶切割基序天然志贺毒素A亚基中在志贺毒素A1片段
和A2片段区域之间的连接处被发现并定位，使得志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割导致A1
和A2片段的产生；其中与包含野生型志贺毒素A1片段区域的参照分子相比，破坏的弗林蛋
白酶切割基序以实验上可再现的方式表现出减少的弗林蛋白酶切割，所述野生型志贺毒素
A1片段区域与足够大的羧基端多肽融合以使用本领域技术人员已知和/或本文所述的适当
测定法监测弗林蛋白酶切割。

[0374] 能够破坏弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序的突变类型的实例是氨基酸残基缺失、插入、截短、倒位和/或置换，包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸的置换。
另外，弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序可以通过包含氨基酸修饰的突变而被破
坏，通过添加掩蔽该位点或基序中的至少一个氨基酸的共价连接的结构，例如，作为PEG化
的结果，小分子佐剂的偶联和/或位点特异性白蛋白化进行所述修饰。

[0375] 如果弗林蛋白酶切割基序已经被突变和/或非天然氨基酸残基的存在破坏，则某些破坏的弗林蛋白酶切割基序可能不容易被识别为与任何弗林蛋白酶切割基序相关；然
而，志贺毒素A1片段来源区的羧基端是可识别的，并且将限定如果其不被破坏时所述弗林
蛋白酶切割基序的位置。例如，与志贺毒素A亚基和/或志贺毒素A1片段相比，破坏的弗林蛋
白酶切割基序由于羧基端截短可以包含弗林蛋白酶切割基序的少于20个的氨基酸残基。

[0376] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段来源的多肽和(2)在志贺毒素A1片段多肽区的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割
基序；其中志贺毒素效应多肽(和包含它的任何细胞靶向分子)与参照分子(例如包含A1片
段的羧基末端的野生型志贺毒素多肽和/或A1和A2片段之间的保守的弗林蛋白酶切割基
序)相比更具弗林蛋白酶抗性。例如，与参照分子相比，一种分子的弗林蛋白酶切割的减少
可以使用下述实施例中所述的体外弗林蛋白酶切割测定来确定，所述测定使用相同的条件
进行，然后进行由切割产生的任意片段的条带密度的定量以定量测量弗林蛋白酶切割的变
化。

[0377] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，志贺毒素效应多肽在体外和/或体内对弗林蛋白酶切割更具抗性。

[0378] 通常，本发明的细胞靶向分子的蛋白酶切割敏感性通过将其与具有其弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽替换为包含志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应多肽的
相同分子进行比较来测试。在某些实施方案中，包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的本发明
的分子与包含在其羧基端与肽或多肽融合的野生型志贺毒素A1片段的参照分子(诸如例
如，下文实施例2中所述的参照分子SLT-1A-WT::scFv-1)相比，表现出30％、40％、50％、
60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或更多的体外弗林蛋白酶切割减少。

[0379] 已经描述了几种弗林蛋白酶切割基序破坏。例如，在最小R-x-x-R基序中将两个保守的精氨酸突变为丙氨酸，完全阻断了弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶样蛋白酶的加工(参见
例如Duda A等，J Virology 78:13865-70(2004))。因为弗林蛋白酶切割位点基序由大约20
个氨基酸残基组成，理论上，涉及这20个氨基酸残基位置中的任何一个的一个或更多个的
某些突变可能会消除弗林蛋白酶切割或降低弗林蛋白酶切割效率(参见例如，Tian S等，
Sci Rep 2：261(2012))。

[0380] 在某些实施方案中，本发明的分子包含来源于志贺毒素家族成员的至少一个A亚基的志贺毒素效应多肽，其中志贺毒素效应多肽包含来源于志贺毒素A亚基的保守的高度
可及的蛋白酶切割敏感环的一个或更多个氨基酸中的破坏。例如，在StxA和SLT-1A中，这种
高度可及的蛋白酶敏感环天然地位于氨基酸残基242至261之间，并且在SLT-2A中，此保守
环天然地位于氨基酸残基241至260。基于多肽序列同源性，技术人员可以鉴定其他志贺毒
素A亚基中的此保守的高度可及的环结构。此环中氨基酸残基的某些突变可以降低环内某
些氨基酸残基对蛋白水解切割的可及性，这可能降低弗林蛋白酶切割敏感性。

[0381] 在某些实施方案中，本发明的分子包含含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应多肽，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含志贺毒素A亚基之间保守的表面暴露的蛋
白酶敏感环中的突变。在某些进一步的实施方案中，本发明的分子包含含破坏的弗林蛋白
酶切割基序的志贺毒素效应多肽，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含志贺毒素A亚基的
该蛋白酶敏感环中的突变，该突变降低该环内某些氨基酸的表面可接近性使得弗林蛋白酶
切割敏感性降低。

[0382] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽的破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P1和P4中的一个或两个的存在、位置或官能团方面的破坏，例如，最小
弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R的位置1和4的氨基酸残基。例如，将最小的弗林蛋白酶共有
位点R-x-x-R中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将破坏弗林蛋白酶切割基
序并防止该位点处的弗林蛋白酶切割。类似地，将最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R中的一
个或两个精氨酸残基置换为技术人员已知的任意非保守氨基酸残基的氨基酸残基置换将
降低该基序的弗林蛋白酶切割敏感性。特别地，将精氨酸置换为缺乏正电荷的任意非碱性
氨基酸残基(诸如，例如，A，G，P，S，T，D，E，Q，N，C，I，L，M，V，F，W，和Y)的氨基酸残基置换将导致破坏的弗林蛋白酶切割基序。

[0383] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽的破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P4和P1之间的间隔中的破坏，即，间插的氨基酸残基的数目不是两个，
由此将P4和/或P1变成不同的位置，并且消除P4和/或P1指定。例如，在最小的弗林蛋白酶切
割位点的弗林蛋白酶切割基序或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切
割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。

[0384] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基置换。在某些进一步的实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶
切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基置换，诸
如，例如，对于StxA和SLT-1A(和其他志贺毒素1A亚基变体)来源的志贺毒素效应多肽，天然
定位的氨基酸残基R248被任意不带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R251被任意不带正电
荷的氨基酸残基置换；并且对于SLT-2A(和其他志贺样毒素2A亚基变体)来源的志贺毒素效
应多肽，天然定位的氨基酸残基R/Y247被任意不带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R250被
任意不带正电荷的氨基酸残基置换。在某些进一步的实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶
切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基置换，诸
如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应多肽(和其他志贺毒素1A亚基变体)，天然
定位的氨基酸残基R248和R251被丙氨酸残基置换；并且对于SLT-2A来源的志贺毒素效应多
肽(和其他志贺样毒素2A亚基变体)，天然定位的氨基酸残基R/Y247和R250被丙氨基酸残基
置换。

[0385] 在某些实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未破坏的最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R，但是不包含破坏的侧翼区，例如，在天然定位于例如，241-247和/或
252-259的弗林蛋白酶切割基序侧翼区域中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸残基置换。
在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含位于弗林蛋白酶切割基序的
P1-P6区域中的一个或更多个氨基酸残基的置换；将P1'突变成庞大的氨基酸，例如R、W、Y、F
和H；并将P2'突变为极性和亲水性氨基酸残基；用一个或更多个庞大且疏水的氨基酸残基
置换位于弗林蛋白酶切割基序的P1'-P6'区域的一个或更多个氨基酸残基。

[0386] 在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序的破坏包括在弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒位和/或突变。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切
割抗性的志贺毒素效应多肽可包含天然定位于如下位置的氨基酸序列的破坏：志贺样毒素
1的A亚基(SEQ ID NO:1)、志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1A亚基变体
的A亚基(例如，SEQ ID NO：4-6)的248-251，或志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID No:3)或志贺
样毒素2变体的A亚基(例如，SEQ ID NO:7–18)的247–250或在保守的志贺毒素效应多肽和/
或非天然志贺毒素效应多肽序列中的等同位置。在某些进一步的实施方案中，蛋白酶切割
抗性的志贺毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含在弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨
基酸的缺失。在某些进一步的实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含破坏，
所述破坏包含在蛋白酶切割基序区域内的至少一个氨基酸的插入。在某些进一步的实施方
案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含氨基酸的倒位，其中至
少一个倒位氨基酸在蛋白酶基序区域内。在某些其他实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺
毒素效应多肽包含含有突变的破坏，所述突变诸如置换为非标准氨基酸或具有化学修饰的
侧链的氨基酸的氨基酸置换。下文的实施例中提供了单个氨基酸置换的实例。

[0387] 在本发明的分子的某些实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序内的九个、十个、十一个或更多个羧基端氨基酸残基的缺失。在这些实施方
案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序将不包含弗林蛋白酶切割位点，也不包含最小的弗
林蛋白酶切割基序。换言之，某些实施方案缺少在A1片段区的羧基端的弗林蛋白酶切割位
点。

[0388] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换两者。在某些进一步的实施方案中，所述破坏的
弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残
基缺失和置换，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A(和其他志贺毒素1A亚基变体)来源的志贺毒
素效应多肽，天然定位的氨基酸残基R248被任意不带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R251
被任意不带正电荷的氨基酸残基置换；并且对于SLT-2A(和其他志贺样毒素A亚基2变体)来
源的志贺毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基R/Y247被任意不带正电荷的氨基酸残基置
换，和/或R250被任意不带正电荷的氨基酸残基置换。

[0389] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基端截短。在某些进一步的实施方案中，
所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多
个氨基酸残基缺失和置换，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A(和其他志贺毒素1A亚基变体)来
源的志贺毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基R248被任意不带正电荷的氨基酸残基置
换，和/或R251被任意不带正电荷的氨基酸残基置换；并且对于SLT-2A(和其他志贺样毒素A
亚基2变体)来源的志贺毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基R/Y247被任意不带正电荷的
氨基酸残基置换，和/或R250被任意不带正电荷的氨基酸残基置换。

[0390] 在某些其他实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比,破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸置换和羧基端截短二者，诸如，
例如，针对StxA和SLT-1A(和其他的志贺毒素1A亚基变体)来源的志贺毒素效应多肽，截短
在天然氨基酸残基位置249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,
263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,
282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大处终止，并且，适当时，包含被任意不
带正电荷的氨基酸残基置换的天然定位的氨基酸残基R248和/或R251；并且针对SLT-2A(和
其他的志贺毒素A亚基2变体)来源的志贺毒素效应多肽，截短在天然氨基酸位置：248,249,
250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,
269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,
288,289,290,291或更大处终止，并且，适当时，包含被任意不带正电荷的氨基酸残基置换
的天然定位的氨基酸残基R/Y247和/或R250。在某些进一步的实施方案中，与野生型志贺毒
素A亚基的羧基末端相比，所述弗林蛋白酶切割基序通过志贺毒素A1片段区域的羧基末端
截短破坏；其中羧基末端截短在天然氨基酸位置249,250,251,252,253,254,255,256,257,
258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,
277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大的位置终止；
并且其中所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含用丙氨酸残基替换：志贺样毒素1的A亚基
(SEQ ID NO:1)、志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:2)或另一种志贺毒素1A亚基变体的A亚基
(例如，SEQ ID NO：4-6)的天然定位的氨基酸残基R248和/或R251,或志贺样毒素2的A亚基
(SEQ ID No:3)或志贺样毒素2A亚基效应多肽变体的A亚基(例如，SEQ ID NO:7-18)的天然
定位的氨基酸残基R/Y247和/或R250。在某些进一步的实施方案中，与野生型志贺毒素A亚
基的羧基末端相比，弗林蛋白酶切割基序通过志贺毒素A1片段区域的羧基末端截短破坏；
其中羧基末端截短在天然氨基酸位置250、249、248、247或更小的位置终止。在某些实施方
案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、
258、259、260或261处终止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置250处终
止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置251处终止。在某些实施方案中，羧
基末端截短在天然氨基酸位置252处终止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸
位置253处终止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置254处终止。在某些实
施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置255处终止。在某些实施方案中，羧基末端截短
在天然氨基酸位置256处终止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置257处
终止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置258处终止。在某些实施方案中，
羧基末端截短在天然氨基酸位置259处终止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基
酸位置260处终止。在某些实施方案中，羧基末端截短在天然氨基酸位置261处终止。

[0391] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个氨基酸残基的插入，只要插入的氨基残基不从头产生弗林蛋白酶切割位
点。在某些实施方案中，一个或多个氨基酸残基的插入破坏在最小的弗林蛋白酶切割位点
R/Y-x-x-R中精氨酸残基之间的天然间隔，诸如，例如，包含在249或250并且由此在R248和
R251之间的一个或多个氨基酸残基的插入的StxA和SLT-1A(和其他的志贺毒素1A亚基变
体)来源的多肽；或包含在248或249并且由此在R/Y247和R250之间的一个或多个氨基酸残
基的插入的SLT-2A来源多肽(和其他志贺样毒素2A亚基变体)。

[0392] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和羧基端截短二者。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相
比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基置换两者。在某些
实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残
基插入和氨基酸残基缺失两者。

[0393] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。

[0394] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、插入、置换和羧基端截短。

[0395] 在某些实施方案中，包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应多肽通过肽键直接融合在包含氨基酸、肽和/或多肽的分子部分上，其中所述融合的结构包含单一的连
续多肽。在这些融合物实施方案中，在所述破坏的弗林蛋白酶切割基序后的氨基酸序列不
应该在融合接点处从头产生弗林蛋白酶切割位点。

[0396] 任何上述蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽亚区和/或破坏的弗林蛋白酶切割基序可以单独使用或与本发明的每个单独的实施方案(包括本发明的方法)组合使用。

[0397] 3.T细胞超免疫化的志贺毒素A亚基效应多肽

[0398] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含嵌入或插入的表位-肽和志贺毒素A1片段来源的区域。在某些进一步的实施方案中，所述表位-肽是异源性T细胞表位-
肽，诸如被认为与志贺毒素A亚单位异源性的表位。在某些进一步实施方案中，本发明的志
贺毒素效应多肽包含在志贺毒素A1片段区域的嵌入或插入的表位-肽。在某些进一步的实
施方案中，表位-肽是CD8+T细胞表位。在某些进一步的实施方案中，CD8+T细胞表位-肽对
-4
MHC I类分子具有其特征在于10 摩尔或更低的解离常数(KD)的结合亲和力，和/或所得的
MHC I类表位-肽复合物对T细胞受体(TCR)具有特征在于10-4摩尔或更低的解离常数(KD)结
合亲和力。

[0399] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含嵌入或插入的异源性T细胞表位，例如人CD8+T细胞表位。在某些进一步的实施方案中，嵌入或插入异源T细胞表位，以
破坏天然存在的志贺毒素多肽或本发明的志贺毒素效应多肽来源于其的亲本志贺毒素效
应多肽中可鉴定的内源表位或表位区域(例如B细胞表位和/或CD4+T细胞表位)。例如，本发
明的志贺毒素效应多肽可包含嵌入或插入的异源CD8+T细胞表位，所述嵌入或插入的异源
CD8+T细胞表位破坏志贺毒素A1片段来源的区域内的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区
域。

[0400] 对于本发明的某些实施方案，志贺毒素效应多肽(和包含它的任何细胞靶向分子)是CD8+T细胞超免疫化的，例如，与野生型志贺毒素多肽相比。本发明的CD8+T细胞超免疫化
的志贺毒素效应多肽各自包含嵌入或插入的T细胞表位-肽。超免疫化的志贺毒素效应多肽
可使用本文所述的方法、WO 2015/113005中所述的方法和/或技术人员已知的的方法，从志
贺毒素效应多肽和/或志贺毒素A亚基多肽中生成，无论是否天然存在，其中所得分子仍然
保留一种或更多种志贺毒素A亚基功能。

[0401] 就要求保护的发明的目的而言，T细胞表位是由抗原肽包含的分子结构，并且可以由线性氨基酸序列表示。通常，T细胞表位是大小为8至11个氨基酸残基的肽(Townsend A,
Bodmer H,Annu Rev Immunol 7:601-24(1989))；然而，某些T细胞表位-肽的长度小于8个
或大于11个氨基酸长(参见例如Livingstone A,Fathman C,Annu Rev Immunol 5:477-501
(1987)；Green K等人,Eur J Immunol 34:2510-9(2004))。在某些实施方案中，嵌入或插入
的表位长度为至少7个氨基酸残基。在某些实施方案中，嵌入或插入的表位以如下表征的结
合亲和力被TCR结合:使用Stone J等人,Immunology 126:165-76(2009)中的公式计算的小
于10mM(例如，1-100μM)的KD。然而，应该注意的是，MHC表位和TCR之间给定范围内的结合亲
和力可能与抗原性和/或免疫原性不相关(参见例如Al-Ramadi B等人,J Immunol 155:
662-73(1995))，诸如由于如MHC-肽-TCR复合物稳定性，MHC-肽密度和TCR辅助因子如CD8的
MHC非依赖性功能等因素(Baker B等人,Immunity 13:475-84(2000)；Hornell T等人,J
Immunol 170:4506-14(2003)；Woolridge L等人,J Immunol 171:6650-60(2003))。

[0402] 异源T细胞表位是尚不存在于野生型志贺毒素A亚基中表位；天然存在的志贺毒素A亚基；和/或亲本的志贺毒素效应多肽，用作通过本文所述的、描述于WO 2015/113005中的
和/或技术人员已知的方法进行修饰的源多肽。

[0403] 通过技术人员已知的众多方法，可以将异源T细胞表位肽掺入源多肽中，所述方法包括，例如，在源多肽内产生一个或更多个氨基酸置换的方法，将一个或更多个氨基酸与源
多肽融合的方法，将一个或更多个氨基酸插入源多肽中的方法，将肽连接至源多肽的方法，
和/或前述方法的组合。这种方法的结果是产生源多肽的修饰变体，所述修饰变体包含一个
或更多个嵌入或插入的异源T细胞表位肽。

[0404] T细胞表位可以选自或来源于用于本发明的许多源分子。T细胞表位可以产生或来源于各种天然存在的蛋白质。T细胞表位可以选自或来源于哺乳动物外源的各种天然存在
的蛋白质，诸如，例如微生物蛋白质。T细胞表位可以产生或来源于突变人蛋白和/或由恶性
人细胞异常表达的人蛋白。T细胞表位可以合成产生或来源于合成分子(参见例如Carbone
F等人,J Exp Med 167:1767-9(1988)；Del Val M等人,J Virol 65:3641-6(1991)；
Appella E等人,Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84(1995)；Perez S等人,
Cancer 116:2071-80(2010))。

[0405] 尽管预期任何T细胞表位-肽被用作本发明的异源T细胞表位，但某些表位可基于所需特性选择。本发明的一个目的是产生用于施用至脊椎动物的CD8+T细胞超免疫的志贺
毒素效应多肽，这意味着异源性T细胞表位是高度免疫原性的，并且当与细胞表面的MHC I
类分子复合展示时能够在体内引发强烈的免疫应答。在某些实施方案中，本发明的志贺毒
素效应多肽包含一个或更多个嵌入或插入的异源性T细胞表位，其是CD8+T细胞表位。包含
异源CD8+T细胞表位的本发明的志贺毒素效应多肽被认为是CD8+T细胞超免疫的志贺毒素
效应多肽。

[0406] 本发明的T细胞表位组分可以选自或源自已知能够引发脊椎动物免疫应答的许多来源分子。T细胞表位可以来源于针对脊椎动物是外来的各种天然存在的蛋白质，例如病原
微生物的蛋白质和非自身的癌症抗原。特别是，传染性微生物可含有许多具有已知抗原性
和/或免疫原性的蛋白质。进一步地，传染性微生物可含有许多具有已知抗原性和/或免疫
原性的亚区或表位的蛋白质。

[0407] 例如，具有哺乳动物宿主的细胞内病原体的蛋白是T细胞表位的来源。存在众多具有充分研究的抗原性蛋白或肽的细胞内病原体，诸如病毒、细菌、真菌和单细胞真核生物。
从人病毒或其它细胞内病原体(诸如，例如，细菌如分枝杆菌属、真菌如弓形虫属和原生生
物如锥虫)可以选择或鉴别T细胞表位。

[0408] 例如，存在许多来自对人具有感染性的病毒的病毒蛋白的免疫原性病毒肽组分。已经将众多人T细胞表位定位至来自甲型流感病毒的蛋白内的肽，诸如蛋白HA糖蛋白FE17、
S139/1、CH65、C05、血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、非结构蛋白1和2(NS1和NS 2)、基质蛋白1和2(M1和M2)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA))中的肽，并且这些肽中的许多已经被证实会引
起人免疫应答，诸如通过使用离体测定。类似地，已经将众多人T细胞表位定位至来自人巨
细胞病毒(HCMV)的蛋白的肽组分，诸如蛋白pp65(UL83)、UL128-131、立即早期1(IE-1；
UL123)、糖蛋白B、tegument蛋白中的肽，并且这些肽中的许多已经被证实会引起人免疫应
答，诸如通过使用离体测定。

[0409] 另一个例子是人体中的许多免疫原性癌症抗原。癌症和/或肿瘤细胞抗原的CD8+T细胞表位可以由技术人员使用本领域已知的技术鉴定，例如差异基因组学、差异蛋白质组
学、免疫蛋白质组学，预测然后验证和遗传学方法如反向遗传转染(参见例如，Admon A等
人,Mol Cell Proteomics 2:388-98(2003)；Purcell A,Gorman J,Mol Cell Proteomics
3:193-208(2004)；Comber J,Philip R,Ther Adv Vaccines 2:77-89(2014))。存在在已经
鉴定或预测在人癌症和/或肿瘤细胞中发生的许多抗原性和/或免疫原性T细胞表位。例如，
已经在通常在瘤细胞中突变或过表达的人蛋白质中预测了T细胞表位，例如ALK、CEA、N-乙
酰葡糖胺基转移酶V(GnT-V)、HCA587、HER2/neu、MAGE、Melan-A/MART-1、MUC-1、p53和TRAG-
3(参见例如,van der Bruggen P等人,Science 254:1643-7(1991)；Kawakami Y等人,J
Exp Med 180:347-52(1994)；Fisk B等人,J Exp Med 181:2109-17(1995)；Guilloux Y等
人,J Exp Med 183:1173(1996)；Skipper J等人,J Exp Med 183:527(1996)；Brossart P
等人,93:4309-17(1999)；Kawashima I等人,Cancer Res 59:431-5(1999)；Papadopoulos
K等人,Clin Cancer Res 5:2089-93(1999)；Zhu B等人,Clin Cancer Res 9:1850-7
(2003)；Li B等人,Clin Exp Immunol 140:310-9(2005)；Ait-Tahar K等人,Int J Cancer
118:688-95(2006)；Akiyama Y等人,Cancer Immunol Immunother 61:2311-9(2012))。此
外，已经生成了来自人癌细胞的T细胞表位的合成变体(参见例如,Lazoura E,
Apostolopoulos V,Curr Med Chem 12:629-39(2005)；Douat-Casassus C等人,J Med
Chem 50:1598-609(2007))。

[0410] 虽然任何T细胞表位可用于本发明的多肽和分子中，但基于其已知的和/或经验确定的特征，某些T细胞表位可能是优选的。例如，在许多物种中，其基因组中的MHC等位基因
编码多种MHC-I分子变体。因为MHC I类蛋白多态性可以影响CD8+T细胞对抗原-MHC I类复
合物的识别，所以可以基于关于某些MHC I类多态性的知识和/或某些抗原-MHC I类复合物
被不同基因型的T细胞识别的能力，选择T细胞表位用于本发明。

[0411] 存在这样的明确定义的肽-表位：其已知是免疫原性的、MHC I类限制的和/或与特定人白细胞抗原(HLA)变体匹配。对于在人类中或涉及人靶细胞的应用，技术人员使用本领
域已知的标准技术可以选择或鉴别HLA-I类-限制的表位。肽的结合人MHC I类分子的能力
可以用于预测假定的T细胞表位的免疫原性潜力。使用软件工具，可以将肽的结合人MHC I
类分子的能力评分。基于在某些人群中更流行的等位基因编码的HLA变体的肽选择性，可以
选择T细胞表位用作本发明的异源T细胞表位组分。例如，由于从个体到个体的HLA基因的不
同等位基因，人群对于MHC I类分子的α链而言是多态的。某些T细胞表位可以被特定HLA分
子更有效地呈递，诸如，例如，由HLA-A等位基因组HLA-A2和HLA-A3编码的通常存在的HLA变
体。

[0412] 当选择T细胞表位用作本发明的异源T细胞表位组分时，可以考虑许多因子，所述因子可以影响表位产生和向接受性MHC I类分子运输，诸如，例如，靶细胞中的以下因子的
存在和表位特异性：蛋白酶体、ERAAP/ERAP1、tapasin和TAPs。

[0413] 当选择T细胞表位用作本发明的异源T细胞表位组分时，可以选择最佳地匹配存在于要靶向的细胞类型或细胞群体中的MHC I类分子的表位。不同的MHC I类分子表现出与特
定肽序列的优先结合，且特定肽-MHC I类变体复合物被效应T细胞的T细胞受体(TCR)特异
性地识别。技术人员可以使用关于MHC I类分子特异性和TCR特异性的知识以优化在本发明
中使用的异源T细胞表位的选择。

[0414] 此外，用于MHC I类呈递的多个免疫原性T细胞表位可以包埋在本发明的相同的志贺毒素效应多肽中，例如用于多个T细胞表位同时靶向递送。

[0415] 任何本文所述的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽亚区和/或破坏的弗林蛋白酶切割基序可以单独使用或与本发明的每个单独的实施方案(包括本发明的方法)组合使
用。

[0416] C.另外的外源性物质

[0417] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含另外的外源性物质。如本文所用的“另外的外源性物质”是指一种或更多种原子或分子，通常不存在于志贺毒素和天然靶细
胞两者中，其中本发明的细胞靶向分子可用于特异性地将这种物质转运至细胞的内部。在
一个意义上，本发明的整个细胞靶向分子是将进入细胞的外源物质；因而，“另外的”外源物
质是与核心细胞靶向分子之外的分子连接的异源物质。另外的外源物质的非限制性实例是
放射性核素、肽、检测促进剂、蛋白质、小分子化学治疗剂和多核苷酸。

[0418] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，另外的外源性物质是一种或更多种放射性核素，例如211At,131I,125I,90Y,111In,186Re,188Re,153Sm,212Bi,32P,60C和/或镥的放射性同位素。

[0419] 在某些实施方案中，另外的外源性物质包括促凋亡肽、多肽或蛋白质，例如BCL-2、胱天蛋白酶(例如，半胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6的片段)、细胞色素、粒酶B、凋亡诱导因
子(AIF)、BAX、tBid(截短的Bid)和促凋亡片段或其衍生物(参见例如,Ellerby H等人,Nat
Med 5:1032-8(1999)；Mai J等人,Cancer Res 61:7709-12(2001)；Jia L等人,Cancer Res
63:3257-62(2003)；Liu Y等人,Mol Cancer Ther 2:1341-50(2003)；Perea S等人,Cancer
Res 64:7127-9(2004)；Xu Y等人,J Immunol 173:61-7(2004)； B等人,Cell Death
Differ 13:576-85(2006)；Wang T等人,Cancer Res 67:11830-9(2007)；Kwon M等人,Mol
Cancer Ther 7:1514-22(2008)；Qiu X等人,Mol Cancer Ther 7:1890-9(2008)；Shan L等
人,Cancer Biol Ther 11:1717-22(2008)；Wang F等人,Clin Cancer Res 16:2284-94
(2010)；KimJ等人,J Virol 85:1507-16(2011))。

[0420] 在某些实施方案中，另外的外源性物质包含含有酶的蛋白质或多肽。在某些其他实施方案中，另外的外源性物质是核酸，例如，作为小抑制RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)起
作用的核糖核酸。在某些实施方案中，另外的外源物质是抗原，诸如来源于病原体、细菌蛋
白质、病毒蛋白质、癌症中突变的蛋白质、癌症中异常表达的蛋白质或T细胞互补决定区的
抗原。例如，外源性物质包括抗原，诸如被细菌感染的抗原呈递细胞所特有的那些抗原，和
能够作为外源性抗原起作用的T细胞互补决定区。包含多肽或蛋白质的外源性物质可任选
地包含无论是技术人员已知的还是未知的一种或更多种抗原。

[0421] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与志贺毒素效应多肽相关的所有异源抗原和/或表位在细胞靶向分子中以志贺毒素效应多肽的志贺毒素A1片段区域的氨基端
至羧基末端排列。在某些进一步的实施方案中，与志贺毒素效应多肽相关的所有异源性抗
原和/或表位直接或间接地与志贺毒素效应多肽在志贺毒素效应多肽的志贺毒素A1片段区
域的氨基端至羧基末端的位置相关。在某些另外的实施方案中，为抗原的所有另外的外源
物质排列在志贺毒素效应多肽的氨基端，例如直接或间接地与志贺毒素效应多肽的氨基末
端融合。

[0422] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，另外的外源物质是细胞毒性剂，例如小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂
和/或微管蛋白抑制剂。适用于本发明的细胞毒性剂的非限制性实例包括氮丙啶、顺铂、四
嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、长春花生物碱、紫杉烷、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、阿柔比星、蒽环类抗生素、放线菌素、鹅膏蕈碱、鹅膏蕈毒素、博来霉素、centanamycin(吲哚甲酰胺)、普卡霉素、丝裂霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、多拉司
他汀、美坦辛、美登木素生物碱(maytansionoids)、duromycin、多西他赛、卡霉素、阿霉素、卡奇霉素、耳他汀、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯二聚体
(PBDs)、卡铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、丝裂霉素C、紫杉醇、1,3-双(2-氯乙基)-1-亚
硝基脲(BCNU)、利福平、顺铂、甲氨蝶呤、吉西他滨、醋葡醛内酯、乙酸配质(例如布拉它辛
(bullatacin)和布拉它辛酮)、aclacinomysins、AG1478、AG1571、醛磷酰胺糖苷、烷基磺酸
盐(例如白消安、英丙舒凡和嗪消安)、烷基化剂(例如噻替派和环磷酰胺
(cyclosphosphamide))、氨基乙酰丙酸、氨基蝶呤、安吖啶、安西他滨、安曲霉素、阿糖胞苷、氮杂胞苷、偶氮丝氨酸、氮丙啶(例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa)、氮尿苷、
bestrabucil、比山群、二膦酸盐(例如氯膦酸盐)、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素、放线菌素C、callystatin、carabicin、去甲柔红霉素、卡莫氟、卡氮芥、嗜癌霉素、CC-1065、苯丁酸氮芥、chloranbucil、萘氮芥、氯脲菌素、chromomycinis、色蛋白烯二炔抗生素发色团、CPT-
11、cryptophycins(例如cryptophycin 1和cryptophycin 8)、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪
胺、放线菌素D、道诺霉素、地磷酰胺、地美可辛、地托比星、地吖醌、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、二脱氧尿苷、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、去氧氟尿苷、阿霉素(例如吗啉代多柔比星
(morpholinodoxorubicin))、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉多柔比星和脱氧基多柔比
星)、蒽环类抗生素、依达曲沙(edatraxate)、依达曲沙(edatrexate)、艾榴塞洛素、
elformithine、醋酸羟哔咔唑、烯二炔抗生素(例如刺孢霉素)、恩尿嘧啶、依诺他滨、表柔比
星、埃坡霉素、依索比星、埃斯培拉霉素、磷雌氮芥、氮丙啶、2-乙酰肼、环氧甘醚、氟达拉滨、叶酸类似物(例如，二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特)、叶酸补充剂(例如亚叶酸)、福
替目丁、氟维司群、gacytosine、硝酸镓、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊班膦酸盐、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、厄洛替尼、氟维司群、来曲唑、PTK787/ZK 222584(诺华，巴塞尔，
CH)、奥沙利铂、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、lonafarnib、索拉非尼、甲基拉美胺
(methylamelamines)(例如，六甲密胺、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三亚乙
基磷酰胺(triethy lenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺)、
pancratistatins、sarcodictyins、spongistatins、氮芥(nitrogen mustards)(例如、苯丁
酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、氮芥、氧化氮芥盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺和尿嘧啶氮芥)、亚硝基脲类(nitrosureas)(如卡莫司汀、福替目丁、洛莫
司汀、尼莫司汀和ranimnustine)、蒽环类抗生素、新制癌菌素生色团、安曲霉素、地托比星、表柔比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C))、霉酚酸、诺加拉霉素(nogalamycins)、橄
榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、potfiromycins、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、乌苯
美司、净司他丁、佐柔比星、嘌呤类似物(如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤)、
嘧啶类似物(如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮尿苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、和氟尿苷)、醋葡醛内酯、香菇多糖、lonidainine、美登木素(例如maytansins和安丝菌素)、米托胍
腙、米托蒽醌、mopidanmol、nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼脂酸、2-乙酰肼(2-ethylhydrazide)、根霉素、sizofuran、螺旋锗、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、2,2',2"三
氯-三乙胺、单端孢霉烯类(例如，T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)、氨基甲
酸乙酯、长春地辛、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、阿糖胞苷、环磷酰胺、类毒素类(如紫杉醇和多烯紫杉醇(doxetaxel))、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、铂、铂类似物(例如、
顺铂和卡铂)、依托泊苷(VP-16)、米托蒽醌、长春瑞滨、诺消灵、柔红霉素、希罗达、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、类视黄醇(例如视黄酸)、卡培他滨、洛莫司汀、洛索蒽醌、巯嘌呤、尼莫
司汀、硝胺嘧啶(nitraerine)、雷帕霉素、雷佐生、杆孢菌素A、spongistatins、链黑菌素、链脲菌素、索坦、T-2毒素、硫咪嘌呤、噻替派、类毒素(例如紫杉醇和多烯紫杉醇
(doxetaxel))、杀结核菌素、verracurin A、长春碱、长春新碱、和任何前述的结构类似物
(例如，合成类似物)和/或任何上述衍生物(参见例如，Lindell T等人,Science 170:447-9
(1970)；Remillard S等人,Science 189:1002-5(1975)；Ravry M等人,Am J Clin Oncol
8:148-50(1985)；Ravry M等人,Cancer Treat Rep 69:1457-8(1985)；Sternberg C等人,
Cancer 64:2448-58(1989)；Bai R等人,Biochem Pharmacol 39:1941-9(1990)；Boger D,
Johnson D,Proc Natl Acad Sci USA 92:3642-9(1995)；Beck J,Leuk Lymphoma 41:117-
24(2001)；Cassady J等人,Chem Pharm Bull(Tokyo)52:1-26(2004)；Sapra P等人,Clin
Cancer Res 11:5257-64(2005)；Okeley N等人,Clinc Cancer Res 16:888-97(2010)；
Oroudjev E等人,Mol Cancer Ther 9:2700-13(2010)；Ellestad G,Chirality 23:660-71
(2011)；Kantarjian H等人,Lancet Oncol 13:403-11(2012)；Moldenhauer G等人,J Natl
Cancer Inst 104:622-34(2012)；Meulendijks D等人,Invest New Drugs 34:119-28
(2016))。

[0423] D.本发明的细胞靶向分子的结构-功能关系

[0424] 对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，已经观察到特定的结构-功能关系，例如组分相对取向对细胞毒性效力的影响；弗林蛋白酶切割敏感性在某些剂量下对体内耐
受性的影响；弗林蛋白酶切割敏感性对体外稳定性的影响；弗林蛋白酶切割敏感性对体内
半衰期的影响；和弗林蛋白酶切割敏感性对多细胞生物体内的非特异性毒性的影响。

[0425] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽区域和结合区域的特定顺序或方向是固定的，使得结合区域在细胞靶向分子内位于与志贺毒素效应多肽区
域的氨基末端相比更邻近志贺毒素效应多肽区域的羧基末端。在本发明的细胞靶向分子的
某些实施方案中，细胞靶向分子内的志贺毒素效应多肽区域的排列限于在细胞靶向分子的
多肽组分的氨基末端处和/或与其邻近(见图1)。例如，本发明的细胞靶向分子的某些实施
方案包括1)在细胞靶向分子内定向于志贺毒素效应多肽区羧基端位置的结合区域，2)在远
离志贺毒素效应多肽区的氨基末端(例如50个、100个、200个或250个氨基酸残基的距离或
更长的距离)的位置的与志贺毒素效应多肽区域相关的结合区域，3)不在空间上覆盖志贺
毒素效应多肽区的氨基末端的结合区域，和/或4)不在空间上阻碍志贺毒素效应多肽区域
的氨基末端附近的结构的结合区域(参见例如图1；WO 2015/138452)。在某些进一步的实施
方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出更优化的细胞毒性效力，例如表现出是包含相
同志贺毒素A亚基效应多肽区域和结合区域的相关细胞靶向参照分子的3倍、4倍、5倍、6倍、
7倍、8倍、9倍、10倍或更高的CD50值，其中结合区域是1)志贺毒素A亚基效应多肽区域的氨基
端，2)与在邻近志贺毒素效应多肽区域的氨基末端的位置的志贺毒素效应多肽区域相关
(例如小于50、40、30、20或10个氨基酸残基或更少的距离)，3)不在空间上覆盖志贺毒素效
应多肽区域的氨基末端，和/或4)不在空间上阻碍志贺毒素效应多肽区域的氨基末端附近
的结构(参见例如图1；WO 2015/138452)。

[0426] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素A亚基效应多肽包含志贺毒素A1片段来源的区域，所述志贺毒素A1片段来源的区域包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端处
的破坏的弗林蛋白酶切割基序(诸如位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋
白酶切割位点(参见例如图1；WO 2015/191764)。在某些进一步的实施方案中，与相关的参
照分子(例如，包含野生型志贺毒素A亚基或志贺毒素A1片段的分子(参见例如WO 2015/
191764))相比，志贺毒素效应多肽具有更强的弗林蛋白酶切割抗性。在某些进一步的实施
方案中，本发明的志贺毒素效应多肽表现出可重复地观察到的比在相同的条件下在相同的
测定中观察到的参照分子的弗林蛋白酶切割减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、
95％、97％、98％、99％或更少(包括100％，代表没有切割)的弗林蛋白酶切割。在某些进一
步的实施方案中，与相关的参照分子(例如，包含野生型志贺毒素A亚基或志贺毒素A1片段
的分子)相比，志贺毒素效应多肽对蛋白酶而非弗林蛋白酶具有更强的切割抗性。

[0427] 尽管对于志贺毒素效应多肽中破坏的弗林蛋白酶切割基序缺乏任何代偿性结构特征，本发明的某些细胞靶向分子表现出在包含野生型志贺毒素效应多肽区域的参照分子
的100倍、20倍、10倍、5倍或更小的细胞毒性效力。对于包含不保持弗林蛋白酶切割事件的
志贺毒素A亚基来源的区域的细胞靶向分子，即包含不被靶细胞内的弗林蛋白酶切割的志
贺毒素A亚基来源的组分的分子，用于保留最大细胞毒性的一种备选方案是补偿。细胞毒性
分子中志贺毒素A亚基区域缺乏弗林蛋白酶切割的补偿可以以“预处理”的形式通过呈递志
贺毒素A亚基区域完成。例如，可以构建包含志贺毒素A亚基区域的细胞靶向分子，使得志贺
毒素A亚基来源的多肽的羧基末端1)邻近分子的羧基末端并且2)匹配或类似于在弗林蛋白
酶切后的天然志贺毒素A1片段(参见WO 2015/191764)。在本发明的某些细胞靶向分子中不
需要这种补偿，而是有意避免这种补偿以提供一种或更多种功能，诸如，在某些剂量下改善
的体内耐受性；增加的体外稳定性；延长的体内半衰期；和/或多细胞生物中降低的体内非
特异性毒性。对于某些实施方案，与包含野生型志贺毒素效应多肽的参照分子相比，存在这
些有益功能而本发明的细胞靶向分子的细胞毒性效力没有任何显著降低。

[0428] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素A亚基效应多肽，所述志贺毒素A亚基效应多肽包含志贺毒素A1片段来源的区域，所述志贺毒素A1片段来源的区域
包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端处破坏的弗林蛋白酶切割基序(诸如位于志
贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割位点)(参见例如图1；WO2015/
191764)但不包含邻近志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的和/或在志贺毒素效应多
肽和相对大的分子部分(例如大小大于4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、
28kDa、30kDa、41kDa或50kDa的结合区域)之间取向的任何补偿性蛋白酶切割位点。在某些
进一步的实施方案中，与相关的参照分子(例如，包含野生型志贺毒素A亚基或志贺毒素A1
片段的分子(参见例如WO 2015/191764))相比，本发明的细胞靶向分子包含具有更强的弗
林蛋白酶抗性的志贺毒素效应多肽。在某些进一步的实施方案中，本发明的细胞靶向分子
表现出比在相同条件下在相同测定中观察到的参照分子的弗林蛋白酶切割减少30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的弗林蛋白酶切割，而细胞靶向分子表现出在包含野生型志贺毒素效应多肽区域的参照分子的100倍、20倍、10倍、5
倍或更小的细胞毒性效力。在某些进一步的实施方案中，与包含在其志贺毒素A1片段区域
的羧基末端处具有野生型弗林蛋白酶切割基序和/或野生型弗林蛋白酶切割位点的志贺毒
素效应多肽的相关参照分子相比，本发明的细胞靶向分子表现出体内耐受性的改善(参见
例如WO 2015/191764)。例如，体内耐受性的增加可以通过比较以相同剂量不同分子施用的
实验动物组的死亡率、发病迹象和/或某些临床体征的测量值来确定(参见例如下文的实施
例；WO 2015/191764；WO2016/196344)。

[0429] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素A亚基效应多肽，所述志贺毒素A亚基效应多肽包含志贺毒素A1片段来源的区域，所述志贺毒素A1片段来源的区域
包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端处的破坏的弗林蛋白酶切割基序(诸如位于
志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割位点(参见例如图1；WO2015/
191764)。对于某些进一步的实施方案，本发明的细胞靶向分子包含细胞毒性组分，与更加
蛋白酶切割敏感变体相比，该细胞靶向分子表现出降低的非特异性毒性，所述变体具有更
大的分裂倾向，从而从结合区域释放细胞毒成分，特别是当施用于活体材料时，例如细胞群
体、组织和/或生物体时。此外，基于通过在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏
的弗林蛋白酶切割基序赋予细胞靶向分子的蛋白酶切割抗性，与蛋白酶切割更敏感性变体
相比，本发明的某些蛋白酶切割抗性的细胞靶向分子在施用于活体材料(例如，某些脊索动
物)后可表现出增加的体内半衰期。

[0430] III.连接本发明的组分和/或它们的亚组分的接头

[0431] 本发明的单个细胞靶向结合区域，志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子的组分可以通过本领域熟知和/或本文所述的一种或更多种接头适当地彼此连接。结合区域的各
个多肽亚组分，例如重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、CDR和/或ABR区域，可以通过本领域
众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接。本发明的蛋白性组分，例
如，多链结合区域，可以通过本领域众所周知的一个或更多个接头适当地彼此连接或连接
至本发明的其它多肽组分。本发明的肽组分，例如，KDEL家族内质网保留/回收信号基序，可
以通过本领域众所周知的一个或更多个接头(诸如蛋白性接头)适当地连接至本发明的另
一个组分。

[0432] 合适的接头通常是允许本发明的每种多肽组分以三维结构折叠的那些，所述三维结构非常类似于单独产生的多肽组分而没有任何接头或其他组分。合适的接头包括单个氨
基酸、肽、多肽和缺乏前述任一种的接头，诸如各种非蛋白性的碳链，无论是分支的还是环
状的.

[0433] 合适的接头可以是蛋白性的，且包含一个或多个氨基酸、肽、和/或多肽。蛋白性的接头适合用于重组融合蛋白和化学连接的缀合物。蛋白性的接头典型地具有约2至约50个
氨基酸残基，例如，约5至约30个或约6至约25个氨基酸残基。选择的接头的长度取决于多种
因素，诸如，例如，选择所述接头所期望的一种或多种性质。在某些实施方案中，接头是蛋白
性的并且在本发明的蛋白质组分的末端附近连接，通常在末端的约20个氨基酸内。

[0434] 合适的接头可以是非蛋白性的，诸如，例如化学接头。本领域已知的各种非蛋白质接头可用于将细胞靶向结合区域与本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应多肽组分连接，
诸如通常用于将免疫球蛋白多肽与异源多肽缀合的接头。例如，可使用它们的氨基酸残基
的功能侧链和碳水化合物部分(例如，羧基、胺、巯基、羧酸、羰基、羟基和/或环状环基)连接多肽区域。例如，二硫键和硫醚键可以用于连接两个或更多个多肽。另外，非天然氨基酸残
基可以与其他功能性侧链，例如酮基一起使用。非蛋白性化学接头的例子包括，但不限于：
N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，S-(N-琥珀酰亚胺基)硫代乙酸酯(SATA)，N-
琥珀酰亚胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亚胺基4-
(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP)，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯
(SMCC或MCC)，磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，4-琥珀酰亚胺基-氧基羰
基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯，磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰
氨基)己酸酯，N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基6(3(-
(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰
氨基)己酸酯，马来酰亚胺基己酰基(MC)，马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄
氧基羰基(MC-vc-PAB)，3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，α-烷基衍生物，
磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀酰亚胺基N-[3-(乙酰基硫基)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])，磺基
二氯苯酚，2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)，3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰基酰肼，
Ellman氏试剂，二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。

[0435] 合适的接头(无论是蛋白性的还是非蛋白性的)可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头。

[0436] 可以选择蛋白性的接头用于掺入本发明的重组融合细胞靶向分子中。对于本发明的重组融合细胞靶向蛋白，接头典型地包含约2-50个氨基酸残基，优选约5-30个氨基酸残
基。通常，蛋白性的接头包含大多数具有极性的、不带电荷的和/或带电荷的残基的氨基酸
残基，诸如，例如，苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。蛋白性的接头的非限制性例子包括丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE(SEQ ID NO:158))、缬氨
酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G2-4S)xAM，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，且x是
1-10的整数(SEQ ID NO:159)。

[0437] 可以基于期望的性能选择蛋白性的接头。技术人员可以记住特定特征来选择蛋白性的接头，诸如以优化融合分子的折叠、稳定性、表达、溶解度、药代动力学性能、药效动力
学性能和/或在融合构建体的背景下融合的结构域的活性(相对于相同结构域自身的活性)
中的一种或更多种。例如，可以基于柔性、刚度和/或切割性选择蛋白性的接头。技术人员在
选择接头时可以使用数据库和接头设计软件工具。可以选择某些接头以优化表达。可以选
择某些接头以促进相同多肽或蛋白之间的分子间相互作用以形成同型多聚体或不同多肽
或蛋白之间的分子间相互作用以形成异型多聚体。例如，可以选择蛋白性的接头，其允许本
发明的细胞靶向分子的多肽组分之间的期望的非共价相互作用，诸如，例如，与二聚体和其
它更高级多聚体的形成有关的相互作用

[0438] 柔性的蛋白性的接头经常具有大于12个氨基酸残基的长度，且富含小的、非极性的氨基酸残基、极性的氨基酸残基和/或亲水的氨基酸残基，诸如，例如，甘氨酸、丝氨酸和
苏氨酸。可以选择柔性的蛋白性的接头以增加组分之间的空间分离和/或允许组分之间的
分子内相互作用。例如，多种“GS”接头是技术人员已知的，且由多个甘氨酸和/或一个或多
个丝氨酸组成，有时在重复单元中，例如，(GxS)n(SEQ ID NO:160)，(SxG)n(SEQ ID NO:
161)，(GGGGS)n(SEQ ID NO:162)和(G)n，其中x是1-6，且n是1-30(SEQ ID NO:163)。柔性的
蛋白性的接头的非限制性例子包括GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:164),EGKSSGSGSESKEF(SEQ
ID NO:165),GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:166),GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:167),
GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:96),SRSSG(SEQ ID NO:168),和SGSSC(SEQ ID NO:169)。

[0439] 刚性的蛋白性的接头经常是坚硬的α-螺旋结构且富含脯氨酸残基和/或一个或更多个在战略上放置的脯氨酸。可以选择刚性的接头以防止连接的组分之间的分子内相互作
用。

[0440] 可以选择合适的接头以允许组分的体内分离，例如，由于切割和/或环境特异性的不稳定性。体内可切割的蛋白性的接头能够通过蛋白水解加工和/或还原环境(经常在生物
体内的特定部位或在特定细胞类型内)而解连接。体内可切割的蛋白性的接头经常包含蛋
白酶敏感的基序和/或由一个或更多个半胱氨酸对形成的二硫键。可以将体内可切割的蛋
白性的接头设计成对仅存在于生物体中的某些位置、细胞内的隔室的蛋白酶敏感，和/或仅
在某些生理学或病理学状况下变得有活性(诸如，例如包含具有异常高水平的蛋白酶，在某
些疾病部位过表达的蛋白酶，和由病原性微生物特异性地表达的蛋白酶)。例如，存在本领
域已知的蛋白性的接头，其被仅存在于细胞内的蛋白酶、仅存在于特定细胞类型内的蛋白
酶和仅在病理学状况(如癌症或炎症)下存在的蛋白酶切割，例如，R-x-x-R基序和
AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(SED ID NO:170)。

[0441] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，可以使用这样的接头：其包含一个或多个蛋白酶敏感的位点以提供存在于靶细胞内的蛋白酶的切割。在本发明的细胞靶向分
子的某些实施方案中，可以使用不可切割的接头以在施用给脊椎动物生物体以后降低不希
望的毒性。

[0442] 合适的接头可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头，无论是蛋白性的还是非蛋白性的(参见例如,
Doronina S等人,Bioconjug Chem 17:114-24(2003)；Saito G等人,Adv Drug Deliv Rev
55:199-215(2003)；Jeffrey S等人,J Med Chem 48:1344-58(2005)；Sanderson R等人,
Clin Cancer Res11:843-52(2005)；Erickson H等人,Cancer Res 66:4426-33(2006)；
Chen X等人,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。合适的可切割的接头可以包括含
有本领域已知的可切割基团的接头。

[0443] 合适的接头可包括pH敏感的接头。例如，可以由于它们在较低pH环境中的不稳定性而选择某些合适的接头以提供在靶细胞的亚细胞隔室内的解离(见例如，van Der
Velden V等人,Blood 97:3197-204(2001)；Ulbrich K,Subr V,Adv Drug Deliv Rev 56:
1023-50(2004))。例如，包含一个或更多个三苯甲基、衍生化的三苯甲基、双马来酰亚胺氧
基丙烷基团(bismaleimideothoxy propane groups)、己二酸二酰肼基和/或酸不稳定的转
铁蛋白基团的接头可以提供本发明的细胞靶向分子的组分(例如多肽组分)在具有特定pH
范围的环境中的释放。可以选择在pH范围被切割的某些接头，所述pH范围对应于组织之间
的生理pH差异，诸如，例如，肿瘤组织的pH低于健康组织中的pH。

[0444] 光可切割的接头是在暴露于某些波长范围的电磁辐射(诸如可见范围内的光)后被切割的接头。光可切割的接头可以用于在暴露于某些波长的光以后释放本发明的细胞靶
向分子的组分(例如多肽组分)。光可切割的接头的非限制性例子包括硝基苄基(作为半胱
氨酸的光可切割的保护基)、硝基苄氧基碳酰氯交联剂、羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨
酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物。光可切割的接头可以特别用于连接组分以
形成本发明的细胞靶向分子，其被设计成用于治疗可以使用纤维光学暴露于光的疾病、病
症和病况。

[0445] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，使用任意数目的技术人员已知的方式，包括共价键和非共价键，将细胞靶向结合区域连接至本发明的志贺毒素效应多肽。

[0446] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述分子包含结合区域，所述结合区域是具有连接重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的接头的scFv。存在众多本领
域已知的适合用于此目的的接头，诸如，例如，15-残基(Gly4Ser)3肽(SED ID NO:171)。可
用于形成非共价多价结构的合适的scFv接头包括GGS,(SEQ ID NO:172)，GGGGS(SEQ ID
NO:94)，GGGGSGGG(SEQ ID NO:173)，GGSGGGG(SEQ ID NO:174)，GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ
ID NO:175)和GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO:176)。

[0447] 用于连接本发明的细胞靶向分子的组分的合适方法可以是通过目前本领域已知的用于实现该目的的任意方法，只要所述连接不会实质上阻碍细胞靶向结合区域的结合能
力、志贺毒素效应多肽组分的细胞内化和/或当适当时通过适当测定(包括本文描述的测
定)测量的期望的志贺毒素效应子功能即可。

[0448] 细胞靶向分子的组分，例如，志贺毒素A亚基效应多肽和/或免疫球蛋白型HER2结合区域可以被工程改造以提供合适的连接部分用于连接额外组分，例如，另外的外源性物
质(参见例如WO2018/106895)。

[0449] 就本发明的细胞靶向分子的目的而言，对于组分的特定的顺序或方向是不固定的：志贺毒素效应多肽，结合区域和任何任选的接头，相对于彼此或整个细胞靶向分子，除
非特别说明。本发明的细胞靶向分子的组分可以以任何顺序排列，条件是不消除结合区域
和志贺毒素效应多肽的所需要的活性。

[0450] IV.本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的结构变化的实例

[0451] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可包含截短的志贺毒素A亚基，由其组成或基本上由其组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位和/或表位区域、B细胞
表位、CD4+T细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失而不影响志贺毒素效应子功能，例
如催化活性和细胞毒性。显示出完全的酶活性的最小的志贺毒素A亚基片段是由Stx1A的残
基1-239组成的多肽(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。显示表现出显
著酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由StxA的残基75-247组成的多肽(Al-Jaufy A等人,
Infect Immun 62:956-60(1994))。

[0452] 尽管本发明的志贺毒素效应多肽通常可小于全长志贺毒素A亚基，但优选本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应多肽区域保持从氨基酸位置77至239的多肽区域(SLT-1A
(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)或志贺毒素1A亚基变体，例如SEQ ID NO：4-6)或志贺
毒素家族成员的其他A亚基中的等同物(例如SEQ ID NO:3和7-18的77至238))。例如，在本
发明的分子的某些实施方案中，来源于SLT-1A的本发明的志贺毒素效应多肽可包含、基本
上组成为或组成为：SEQ ID NO:1的氨基酸75至251、SEQ ID NO:1的氨基酸1至241、SEQ ID
NO:1的氨基酸1至251或SEQ ID NO:1的氨基酸1至261，进一步包含相对于野生型志贺毒素A
亚基在内源性表位和/或表位区域内的至少一个突变的或已被缺失的氨基酸残基，和/或其
中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端存在破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。类似
地，来源于志贺毒素1A亚基变体的志贺毒素效应多肽区域(例如Stx1cA、Stx1dA和Stx1eA)
可包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NO:4-6的氨基酸75至251、SEQ ID NO:4-6中的氨
基酸1至241、或SEQ ID NO:4-6中的氨基酸1至251，进一步包含相对于野生型志贺毒素A亚
基在内源性表位和/或表位区域内的至少一个突变或已被缺失的氨基酸残基，和/或其中在
志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端存在破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。另外，来源
于SLT-2的志贺毒素效应多肽区域可包含、组成为或基本上组成为：SEQ ID NO:3的氨基酸
75至251、SEQ ID NO:3的氨基酸1至241、SEQ ID NO:3的氨基酸1至251或SEQ ID NO:3的氨
基酸1至261，进一步包含相对于野生型志贺毒素A亚基在内源性表位和/或表位区域内的至
少一个突变的或已被缺失的氨基酸残基，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基
末端存在破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。同样，来源于志贺样毒素2A亚基变体(例如
Stx2cA变体1、Stx2cA变体2、Stx2cA变体3、Stx2cA变体4、Stx2cA变体5、Stx2cA变体6、
Stx2dA变体1、Stx2dA变体2、Stx2dA变体3、Stx2eA变体1、Stx2eA变体2和Stx2fA)的志贺毒
素效应多肽区可包含、基本上组成为或组成为SEQ ID NO:7-18的氨基酸1至241，进一步包
含相对于野生型志贺毒素A亚基在内源性表位和/或表位区域内的至少一个突变或已被缺
失的氨基酸残基，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端存在破坏的弗林蛋
白酶切割基序区域。

[0453] 在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸1至241；(iii)
SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸1-251；和/或(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至
261。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:
1-6中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ
ID NO:1-6中任一个的氨基酸1至251；和/或(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至261，
其中相对于野生型志贺毒素A亚基在内源性表位和/或表位区域内的至少一个突变或已被
缺失的氨基酸残基，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端存在破坏的弗林
蛋白酶切割基序区域。

[0454] 本发明进一步提供了本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的变体，其中志贺毒素效应多肽与天然存在的志贺毒素A亚基相差仅为或者高达1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，
15，20，25，30，35，40或更多个氨基酸残基(但不超过保留至少85％，90％，95％，99％或更多氨基酸序列同一性的氨基酸残基)。因此，来源于志贺毒素家族成员的A亚基的本发明分子
可包含来自原始序列的添加、缺失、截短或其他改变，只要保留与天然存在的志贺毒素A亚
基至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性，并且其中相对于野生型志贺毒素A亚基至少一个氨基酸残基在内源表位和/或表
位区域中被突变或已被缺失，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端存在破
坏的弗林蛋白酶切割基序区域。

[0455] 因此，在某些实施方案中，本发明的分子的志贺毒素效应多肽包含、组成为或基本上组成为:与天然存在的志贺毒素A亚基(或其片段)有至少55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％的全序列同一性的氨基酸序列,诸如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)、Shiga toxin 1A亚基变体(例如SEQ ID
NO:4–6)、SLT-2A(SEQ ID NO:3)、和/或志贺样毒素2A亚基变体(例如SEQ ID NO:7–18)，其
中相对于野生型志贺毒素A亚基至少一个氨基酸残基在内源表位和/或表位区域中被突变
或已被缺失，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端存在破坏的弗林蛋白酶
切割基序区域。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：选自
以下各项的与野生型志贺毒素A亚基氨基酸序列有至少85％同一性(诸如至少90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％同一性)的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸1至
241；(iii)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸1-251；和(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基
酸1至261。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：选自以下
各项的与野生型志贺毒素A亚基氨基酸序列至少有85％同一性(诸如至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％同一性)的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至241；
(iii)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1-251；或(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1
至261。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：选自以下各项
的与野生型志贺毒素A亚基氨基酸序列有至少85％同一性(诸如至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％同一性)的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:1的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1的氨基酸
1至251；或(iv)SEQ ID NO:1的氨基酸1至261。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、
基本上组成为或组成为：选自以下各项的与野生型志贺毒素A亚基氨基酸序列有至少85％
同一性(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或
99.7％同一性)的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:2的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:2的氨基
酸1至241；(iii)SEQ ID NO:2的氨基酸1至251；或(iv)SEQ ID NO:2的氨基酸1至261。在某
些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：选自以下各项的与野生型
志贺毒素A亚基氨基酸序列有至少85％同一性(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％同一性)的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:3的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:3的氨基酸1-251；或
(iv)SEQ ID NO:3的氨基酸1至261。

[0456] 任选地，志贺毒素A亚基的全长或截短形式可包含本发明的分子的志贺毒素效应多肽区域，其中志贺毒素来源的多肽包含与天然存在的志贺毒素相比一个或更多个突变
(例如置换、缺失、插入或倒位)。在本发明的某些实施方案中，优选志贺毒素效应多肽与天
然存在的(或野生型)志贺毒素A亚基具有足够的序列同一性，以在进入细胞后保持细胞毒
性，或者通过宿主细胞转化、转染、感染或诱导的众所周知的方法，或通过由与志贺毒素效
应多肽连接的细胞靶向结合区域介导的内化。志贺毒素A亚基中酶活性和/或细胞毒性的最
关键残基已经定位至以下残基-位置：天冬酰胺-75，酪氨酸-77，谷氨酸-167，精氨酸-170和
精氨酸-176等(Di R等人,Toxicon 57:525-39(2011))。在本发明的任何一个实施方案中，
志贺毒素效应多肽可以优选但不一定在如下位置保持一个或更多个保守氨基酸：诸如在
StxA、SLT-1A中的位置77、167、170和176发现的那些，或在志贺毒素家族的其他成员中的等
同保守位置，其通常是细胞毒活性所需的。本发明的细胞毒性分子引起细胞死亡的能力，例
如，其细胞毒性，可以使用本领域熟知的许多测定法中的任何一种或更多种来测量。

[0457] A.去免疫化的志贺毒素效应多肽的实例

[0458] 在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽可以基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺毒素A亚基组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位
和/或表位区域、B细胞表位、CD4+T细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失而不影响志
贺毒素效应子功能，例如催化活性和细胞毒性。截短SLT-1A、StxA或SLT-2A的羧基末端至氨
基酸1-251去除两个预测的B细胞表位区域、两个预测的CD4阳性的(CD4+)T细胞表位和一个
预测的不连续的B细胞表位。这些表位也不存在于SEQ ID NO:4-18中所示的志贺毒素效应
多肽中。SEQ ID NO:4-6中所示的志贺毒素1A亚基效应多肽涉及在251位已经截短的野生型
志贺毒素A亚基变体的片段，且SEQ ID NO:7-18中所示的志贺样毒素2A亚基效应多肽涉及
已经在250位截短的志贺样毒素2A亚基变体的片段。截短SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端至
75-293去除至少三个预测的B细胞表位区域和三个预测的CD4+T细胞表位。截短SLT-1A、
StxA或SLT-2A的氨基端和羧基端二者至75-251缺失了至少五个预测的B细胞表位区域、四
个推定的CD4+T细胞表位和一个预测的不连续的B细胞表位。

[0459] 在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽可在提供的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中包含、组成为或基本上组成为具有至少一个(相对于野生
型志贺毒素多肽的)突变(例如缺失、插入、倒位或置换)的全长或截短的志贺毒素A亚基。在
某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含突变(相对于野生型
志贺毒素多肽)，所述突变包括在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域内的至少一个氨基
酸残基的缺失。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含在
内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域内的至少一个氨基酸残基的插入。在某些实施方案
中，本发明的志贺毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含氨基酸残基的倒位，其中所述至少
一个倒位的氨基酸残基在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域内。在某些实施方案中，本
发明的志贺毒素效应多肽包含破坏，其包含突变(相对于野生型志贺毒素多肽)，例如氨基
酸置换、氨基酸置换为非标准氨基酸、和/或具有化学修饰侧链的氨基酸残基。适用于本发
明的去免疫化的志贺毒素效应子亚区的非限制性实例描述于WO 2015/113005、WO2015/
113007和WO 2015/191764中。在实施例中提供了包含氨基酸置换的本发明的志贺毒素效应
多肽的许多非限制性实例。

[0460] 在其他实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含截短的志贺毒素A亚基，其短于全长志贺毒素A亚基，其中在天然定位的B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中至
少一个氨基酸残基被破坏。

[0461] 为了产生去免疫化的志贺毒素效应多肽，原则上通过各种方法修饰所提供的表位区域中的任何氨基酸残基可导致表位的破坏，例如代表相对于野生型志贺毒素多肽的侧链
的缺失、插入、倒位、重排、置换和化学修饰的修饰。然而，修饰某些氨基酸残基并使用某些
氨基酸修饰更可能成功地降低抗原性和/或免疫原性，同时保持一定水平的志贺毒素效应
子功能。例如，末端截短和内部氨基酸置换是优选的，因为这些类型的修饰维持志贺毒素效
应多肽中氨基酸残基的总间距，因此更可能维持志贺毒素效应多肽结构和功能。

[0462] 在本发明的某些实施方案中，去免疫化的志贺毒素效应多肽包含、组成为或基本上组成为：SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基
酸75至251，其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区域中被破坏。在某些其他的实施
方案中是去免疫化的志贺毒素效应多肽，其包含或基本上组成为：SLT-1A(SEQ ID NO:1)、
StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1至241，其中至少一个氨基酸残
基在天然定位的表位区域中被破坏。进一步的实施方案是去免疫化的志贺毒素效应多肽，
其包含、组成为或基本上组成为：SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A
(SEQ ID NO:3)的氨基酸1至251，其中至少一个氨基酸残基在所提供的天然定位的表位区
域中被破坏。进一步的实施方案是志贺毒素效应多肽，其包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA
(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1至261，其中至少一个氨基酸残基在
天然定位的表位区域中被破坏。在本发明的某些实施方案中，去免疫化的志贺毒素效应多
肽包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NOs:1–6中任一个的氨基酸75至251，其中至少一
个氨基酸残基在天然定位的表位区域中被破坏。在某些其他的实施方案中是去免疫化的志
贺毒素效应多肽，其包含或基本上组成为或组成为：SEQ ID NOs:1–18的氨基酸1至241，其
中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区域中被破坏。进一步的实施方案是去免疫化的
志贺毒素效应多肽，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NOs:1-6的氨基酸1至251，其
中至少一个氨基酸残基在所提供的天然定位的表位区域中被破坏。进一步的实施方案是志
贺毒素效应多肽，其包含SEQ ID NO:1–3的氨基酸1至261，其中至少一个氨基酸残基在天然
定位的表位区域中被破坏。在某些实施方案中，去免疫化的志贺毒素效应多肽包含、基本上
组成为或组成为：SEQ ID NOs:1–6中任一个的氨基酸75至251，其中至少一个氨基酸残基在
天然定位的表位区域中被破坏。在某些进一步的实施方案中，是去免疫化的志贺毒素效应
多肽，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NOs:1-6的氨基酸1至241，其中至少一个氨
基酸残基在天然定位的表位区域中被破坏。进一步的实施方案是去免疫化的志贺毒素效应
多肽，其包含、基本上组成为或组成为：SEQ ID NOs:1-6的氨基酸1至251，其中至少一个氨
基酸残基在所提供的天然定位的表位区域中被破坏。进一步的实施方案是志贺毒素效应多
肽，其包含SEQ ID NO:1–3的氨基酸1至261，其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区
域中被破坏。

[0463] 有许多不同的内部氨基酸置换可用于生成本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽。在表位区域内使用的可能的置换氨基酸中，预测下列置换氨基酸残基最有可能降低表
位的抗原性和/或免疫原性--G、D、E、S、T、R、K和H。除甘氨酸外，这些氨基酸残基可全部归类为极性和/或带电残基。在置换用的可能的氨基酸中，预计下列氨基酸A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H和K最有可能降低抗原性和/或免疫原性，同时提供显著水平的志贺毒素效应子
功能的保留，这取决于置换的氨基酸。通常，置换应该将极性和/或带电荷的氨基酸残基改
变为非极性和不带电荷的残基(参见例如，WO 2015/113007)。此外，减少氨基酸残基的R-基
团功能侧链的总体大小和/或长度可能有益于表位破坏(参见例如，WO2015/113007)。然而，
尽管这些置换的一般性最可能赋予表位破坏，但是，由于目的是保留显著的志贺毒素效应
子功能，因此，如果其与要被置换的氨基酸相似(诸如，例如，用相似尺寸的非极性和/或不
带电荷的残基置换极性和/或带电荷的残基)，置换氨基酸更可能保留志贺毒素效应子功
能。

[0464] 在以下实施例和WO 2015/113007中，已经凭经验测试了许多突变对各种志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的志贺毒素效应子功能的影响。表B总结了WO 2015/113007和WO
2016/196344中描述的结果，其中单独或与一个或更多个其他置换组合的氨基酸置换不阻
止强效水平的志贺毒素效应子功能的显示。表B使用WO 2016/196344中描述的表位区域编
号方案。

[0465] 表B.志贺毒素效应物多肽中的氨基酸置换

[0466]

[0467]

[0468]

[0469]

[0470] 基于WO 2015/113007和WO 2016/196344中的经验性证据，预测志贺毒素的A亚基中的某些氨基酸位置耐受表位破坏，同时仍保留显著的志贺毒素效应子功能。例如，下述天
然存在的位置耐受氨基酸置换(单独的或组合的)，同时保留志贺毒素效应子功能(诸如细
胞毒性)—SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:
2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47；SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID NO:
1或SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的56；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的105；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108；SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1
或SEQ ID NO:2的141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的241；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID NO:3的250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265；和SEQ
ID NO:1或SEQ ID NO:2的286位。

[0471] WO 2015/113007和WO 2016/196344中的经验数据指出能够降低志贺毒素效应多肽的抗原性和/或免疫原性同时保留志贺毒素效应多肽表现出显著的志贺毒素效应子功能
的能力的其他的表位破坏性置换和表位破坏性置换的组合，诸如，例如，前述截短和位置耐
受置换的新组合以及在相关志贺毒素A亚基中相同的位置或保守位置的新置换。

[0472] 可以预测针对本文测试的置换的保守官能团的氨基酸残基的其他氨基酸置换可以减低抗原性和/或免疫原性同时保留显著的志贺毒素效应子功能。例如，技术人员已知的
类似于K1A,K1M,T4I,D6R,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,T12K,S33I,S33C,S43N,G44L,
S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,D47G,N48V,N48F,L49A,F50T,A51V,D53A,D53N,D53G,
V54L,V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,P59F,E60I,E60T,
E60R,E61A,E61V,E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,A105L,T107P,L108M,S109V,
T109V,G110A,D111T,S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,
D184A,D184A,D184F,L185V,L185D,S186A,S186F,G187A,G187T,R188A,R188L,S189A,
D198A,R204A,R205A,C242S,R247A,S247I,Y247A,R248A,R250A,R251A,或D264A,G264A,
T286A和/或T286IT286I中的任何一种的其他置换可破坏内源性表位而维持至少一种志贺
毒素效应子功能。特别是，类似于K1A,K1M,T4I,S8I,T8V,T9I,S9I,K11A,K11H,S33I,S33C,
S43N,G44L,S45V,S45I,T45V,T45I,G46P,D47M,N48V,N48F,L49A,A51V,D53A,D53N,V54L,
V54I,R55A,R55V,R55L,G56P,I57F,I57M,D58A,D58V,D58F,P59A,E60I,E60T,E61A,E61V,
E61L,G62A,R84A,V88A,D94A,S96I,T104N,T107P,L108M,S109V,T109V,G110A,D111T,
S112V,D141A,G147A,V154A,R179A,T180G,T181I,D183A,D183G,D184A,D184F,L185V,
S186A,S186F,G187A,R188A,R188L,S189A,D198A,R204A,R205A,C242S,S247I,Y247A,
R247A,R248A,R250A,R251A,D264A,G264A,T286A和T286I的保守氨基酸残基的氨基酸置换
可具有相同或相似的效果。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可包含与经验
测试的置换相似的保守氨基酸置换，诸如，例如K1至G,V,L,I,F,和H；T4至A,G,V,L,F,M,和
S；S8至A,G,V,L,F,和M；T8至A,G,V,I,L,F,和M；T9至A,G,L,F,M,和S；S9至A,G,L,I,F,和M；
K11至G,V,L,I,F,和M；S33至A,G,V,L,F,和M；S43至A,G,V,L,I,F,和M；S45至A,G,L,F,和M；
T45至A,G,L,F,和M；D47至A,V,L,I,F,S,和Q；N48至A,G,L,和M；L49至G；Y49至A；D53至V,L,
I,F,S,和Q；R55至G,I,F,M,Q,S,K,和H；D58至G,L,I,S,和Q；P59至G；E60至A,G,V,L,F,S,Q,
N,D,和M；E61至G,I,F,S,Q,N,D,M,和R；R84至G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；V88至G；I88至G；D94
至G,V,L,I,F,S,和Q；S96至A,G,V,L,F,和M；T107至A,G,V,L,I,F,M,和S；S107至A,G,V,L,I,
F,和M；S109至A,G,I,L,F,和M；T109至A,G,I,L,F,M,和S；S112至A,G,L,I,F,和M；D141至V,
L,I,F,S,和Q；V154至G；R179至G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；T180至A,V,L,I,F,M,和S；T181至
A,G,V,L,F,M,和S；D183至V,L,I,F,S,和Q；D184至G,V,L,I,S,和Q；S186至G,V,I,L,和M；
R188至G,V,I,F,M,Q,S,K,和H；S189至G,V,I,L,F,和M；D197至V,L,I,F,S,和Q；D198至A,V,
L,I,F,S,和Q；R204至G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R205至G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H；S247至A,G,
V,I,L,F,和M；Y247至A,G,V,L,I,F,和M；R247至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R248至G,V,L,
I,F,M,Q,S,K,和H；R250至G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R251至G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；D264
至A,G,V,L,I,F,S,和Q；和T286至A,G,V,L,I,F,M,和S。

[0473] 类似地，去除电荷、极性和/或减少侧链长度的氨基酸置换可以破坏表位，同时保持至少一种志贺毒素效应子功能。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可包含
一个或更多个通过置换破坏的表位，使得侧链电荷被去除、极性被去除和/或侧链长度减
少，诸如，例如用选自下组的适当的氨基酸A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H或K来置换在下述位置的氨基酸残基：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的4；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的6；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的
8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:
3的11；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的12；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
56；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的
60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的84；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2
或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ
ID NO:2的104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3
的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111；SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141；SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID
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的181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ
ID NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID
NO:3的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID
NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的241；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的248；SEQ ID NO:3的250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251；SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2或SEQ ID NO:3的264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的286。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可包含一个或更多个下列氨基
酸置换：K1至A,G,V,L,I,F,M和H；T4至A,G,V,L,I,F,M,和S；D6至A,G,V,L,I,F,S,和Q；S8至
A,G,V,I,L,F,和M；T8至A,G,V,I,L,F,M,和S；T9至A,G,V,I,L,F,M,和S；S9至A,G,V,L,I,F,
和M；K11至A,G,V,L,I,F,M和H；T12至A,G,V,I,L,F,M,和S；S33至A,G,V,L,I,F,和M；S43至A,
G,V,L,I,F,和M；G44至A和L；S45至A,G,V,L,I,F,和M；T45至A,G,V,L,I,F,和M；G46至A和P；
D47至A,G,V,L,I,F,S,和Q；N48至A,G,V,L,和M；L49至A或G；F50；A51至V；D53至A,G,V,L,I,
F,S,和Q；V54至A,G,和L；R55至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；G56至A和P；I57至A,G,M,和F；
L57至A,G,M,和F；D58至A,G,V,L,I,F,S,和Q；P59至A,G,和F；E60至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,
M,和R；E61至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,和R；G62至A；D94至A,G,V,L,I,F,S,和Q；R84至A,G,
V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；V88至A和G；I88至A,G,和V；D94；S96至A,G,V,I,L,F,和M；T104至A,
G,V,I,L,F,M,和S；A105至L；T107至A,G,V,I,L,F,M,和S；S107至A,G,V,L,I,F,和M；L108至
A,G,和M；S109至A,G,V,I,L,F,和M；T109至A,G,V,I,L,F,M,和S；G110至A；D111至A,G,V,L,
I,F,S,和Q；S112至A,G,V,L,I,F,和M；D141至A,G,V,L,I,F,S,和Q；G147至A；V154至A和G；
R179至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；T180至A,G,V,L,I,F,M,和S；T181至A,G,V,L,I,F,M,和
S；D183至A,G,V,L,I,F,S,和Q；D184至A,G,V,L,I,F,S,和Q；L185至A,G,和V；S186至A,G,V,
I,L,F,和M；G187至A；R188至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；S189至A,G,V,I,L,F,和M；D197至
A,G,V,L,I,F,S,和Q；D198至A,G,V,L,I,F,S,和Q；R204至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R205
至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H；C242至A,G,V,和S；S247至A,G,V,I,L,F,和M；Y247至A,G,V,L,
I,F,和M；R247至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R248至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R250至A,
G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R251至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；C262至A,G,V,和S；D264至A,
G,V,L,I,F,S,和Q；G264至A；和T286至A,G,V,L,I,F,M,和S。

[0474] 另外，在志贺毒素效应多肽的一个表位区中破坏表位同时保留显著的志贺毒素效应子功能的氨基酸置换可以与在相同或不同表位区中任意其他破坏表位同时保留显著的
志贺毒素效应子功能的氨基酸置换组合，以形成具有多个被破坏的表位区同时仍然保留显
著水平的志贺毒素效应子功能的去免疫化志贺毒素效应多肽。在某些实施方案中，本发明
的志贺毒素效应多肽可包含两种或更多种上述置换和/或WO 2015/113007和/或WO2016/
196344中描述的置换的组合。

[0475] 基于实施例中的和WO 2015/113007和WO 2016/196344中的经验性证据，预测志贺毒素的A亚基中的某些氨基酸区域耐受表位破坏，同时仍保留显著的志贺毒素效应子功能。
例如，天然定位于1-15、39-48、53-66、55-66、94-115、180-190、179-190和243-257的表位区域同时耐受多个氨基酸置换组合而不损害志贺毒素的酶活性和细胞毒性。

[0476] 在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包含氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列是与选自SEQ ID NO:19-21和75-89中任一个的
氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更多)同一性的氨基酸序列。例如，本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽包括以下
任何一组置换：(i)K1A,S45I,V54I,R55L,I57F,P59F,E60T,E61L,G110A,G147A,C242S,
R248A,和R251A；(ii)S45I,V54I,R55L,I57F,P59F,E60T,E61L,G110A,R188A,C242S,R248A,
和R251A；或(iii)S45I,V54I,R55L,I57F,P59F,E60T,E61L,G110A,D141A,R188A,C242S,
R248A,和R251A。

[0477] B.弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽的实例

[0478] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可以包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点。在某些进一
步的实施方案中，志贺毒素效应多肽不包含任何已知的可提供邻近志贺毒素A1片段来源的
区域的羧基末端的弗林蛋白酶切割的补偿结构。WO 2015/191764中描述了适用于本发明的
用途的破坏的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点的非限制性实例。

[0479] 在本文中参照序列表中提供的天然志贺毒素A亚基的特定氨基酸位置表示特定弗林蛋白酶切割基序破坏，注意，天然存在的志贺毒素A亚基可以包含在其氨基端含有约22个
氨基酸的信号序列的前体形式，所述信号序列被去除以产生成熟的志贺毒素A亚基，并且可
被技术人员识别。此外，在本文中，参照在天然志贺毒素A亚基内的特定位置天然存在的特
定氨基酸(例如，R表示精氨酸残基)(例如，R251表示在氨基末端位置251的精氨酸残基)，在
该氨基酸后是所讨论的以特定的突变置换的残基(例如，R251A表示从氨基端氨基酸残基
251的精氨酸置换为丙氨酸的氨基酸置换)，来表示包含突变的特定的弗林蛋白酶切割基序
破坏。

[0480] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含志贺毒素A1片段来源的区域，其中志贺毒素A1片段来源的区域包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏
的弗林蛋白酶切割基序，并且此类实施方案在本文中称为“弗林蛋白酶切割抗性”或“蛋白
酶切割抗性”志贺毒素效应多肽以描述它们相对于野生型志贺毒素A亚基和/或野生型志贺
毒素A1片段融合蛋白的性质。

[0481] 在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺毒素A亚基组成。

[0482] 在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含在具有A、G或H的最小的弗林蛋白酶切割位点共有基序中含有一个或两个精氨酸残基的氨基酸残基
置换(相对于野生型志贺毒素多肽)的破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本
发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含在弗林蛋白酶切割基序区域含有氨基酸
置换的破坏，其中所述置换发生在选自由以下各项组成的组的天然定位的氨基酸：SEQ ID
NO:3的247、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248、SEQ ID NO:3的250、SEQ ID NO:1或SEQ ID
NO:2的251，或保守的志贺毒素效应多肽和/或非天然志贺毒素效应多肽序列中的等同位
置，诸如，例如SEQ ID NO:7-18的247、SEQ ID NO:4-6中的248、SEQ ID NO:7-18的250或SEQ
ID NO:4-6的251位。在某些进一步的实施方案中，置换是对于任何非保守氨基酸，并且置换
发生在天然定位的氨基酸残基位置。在某些进一步的实施方案中，突变包含选自由以下各
项组成的组的氨基酸置换：R247A、R248A、R250A R251A，或在保守的志贺毒素效应多肽和/
或非天然志贺毒素效应多肽序列中的等同位置。

[0483] 在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含含作为缺失的突变的破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶
切割基序包含作为突变，所述突变是StxA(SEQ ID NO:2)、SLT-1A(SEQ ID NO:1)、和其他志
贺毒素1A亚基变体(例如SEQ ID NO：4-6)中天然定位在247-252的区域，或SLT-2A(SEQ ID
No:3)和志贺样毒素2A亚基变体(例如，SEQ ID NO:7-18)中天然定位在246-251的区域的缺
失；StxA(SEQ ID NO:2)、SLT-1A(SEQ ID NO:1)和其他志贺毒素1A亚基变体(例如SEQ ID
No：4-6)中天然定位在244-246的区域，或SLT-2A(SEQ ID NO:3)和志贺样毒素2A亚基变体
(例如，SEQ ID NO:7-18)中天然定位在243-245的区域的缺失；或StxA(SEQ ID NO:2)和
SLT-1A(SEQ ID NO:3)中天然定位在253-259的区域、或SLT-2A(SEQ ID NO:3)中天然定位
在252-258的区域的缺失。

[0484] 在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含志贺毒素A1片段区域，所述志贺毒素A1片段区域包含在志贺毒素A1片段区域的羧基末端处破坏的弗
林蛋白酶切割基序，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序与野生型志贺毒素A亚基的羧基末端
相比通过羧基末端截短破坏，并且其中所述截短导致，与野生型志贺毒素A亚基相比，在弗
林蛋白酶切割基序内的一个或更多个氨基酸残基的缺失。在某些进一步的实施方案中，破
坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小切割位点Y/RxxR内缺失一个或更多个氨基酸残基的
羧基端截短，例如，针对StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应多肽，截短在天然氨基酸残基位
置250、249、248、247、246、245、244、243、242、241、240或更小处终止的；且针对SLT-2A来源的志贺毒素效应多肽，截短在天然氨基酸残基位置249、248、247、246、245、244、243、242、
241或更小处终止。在可能的情况下，某些进一步的实施方案包含含任何前述突变的组合的
破坏的弗林蛋白酶切割基序。

[0485] 在某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是弗林蛋白酶切割基序的部分羧基末端截短；然而，本发明的某些分子不包含破坏的弗林蛋白酶切割
基序，所述弗林蛋白酶切割基序是整个20个氨基酸残基弗林蛋白酶切割基序的完整羧基末
端截短。例如，本发明的某些志贺毒素效应多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述破坏
的弗林蛋白酶切割基序包含志贺毒素A1片段区域的部分羧基端截短直至StxA(SEQ ID NO:
2)、SLT-1A(SEQ ID No:1)，或另一种志贺毒素1A亚基变体(例如，SEQ ID NO:4-6)中的天然
位置240，但不是在位置239或更小的羧基端截短。相似地，本发明的某些志贺毒素效应多肽
包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含志贺毒素A1片段区
域的部分羧基端截短直至SLT-2A(SEQ ID NO:3)或志贺样毒素2A亚基变体(例如，SEQ ID
NO:7-18)中的天然位置239，但不是在位置238或更少的羧基端截短。在本发明的弗林蛋白
酶切割抗性的志贺毒素效应多肽的最大羧基端截短中，仍然存在包含破坏的弗林蛋白酶切
割基序的,弗林蛋白酶切割基序的位置P14和P13的突变。

[0486] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基置换和羧基端截短二者。在某些实施方案中,
与野生型志贺毒素A亚基相比,破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割
位点R/Y-x-x-R内的氨基酸残基置换和羧基端截短二者，诸如，例如，针对StxA和SLT-1A来
源的志贺毒素效应多肽(和志贺毒素1A亚基变体)，截短在天然氨基酸残基位置249,250,
251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,
270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,
289,290,291或更大的位置终止，并且，适当时，包含被任意不带正电荷的氨基酸残基置换
的天然定位的氨基酸残基R248和/或R251；并且针对SLT-2A来源的志贺毒素效应多肽(和志
贺样毒素A2亚基变体)，截短在天然氨基酸残基位置：248,249,250,251,252,253,254,255,
256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,
275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大的位
置终止，并且，适当时，包含被任意不带正电荷的氨基酸残基置换的天然定位的氨基酸残基
R/Y247和/或R250。在某些实施方案中，包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的截短的志贺毒素
效应多肽还包含弗林蛋白酶切割基序，位置P9、P8和/或P7处的氨基酸残基，以维持最佳细
胞毒性。

[0487] 在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含作为一个或多个内部的氨基酸残基缺失的突变。在某些其他实施方案中，所述破坏
的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内具有一个或多个氨基
酸残基缺失的突变。例如，StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应多肽(和其他志贺毒素1A亚基
变体)，其包含天然定位的氨基酸残基R248和/或R251的内部缺失，其可以与周围残基(例
如，249、250、247、252等)的缺失组合；和SLT-2A来源的志贺毒素效应多肽(和志贺样毒素2A
亚基变体)，其包含天然定位的氨基酸残基R/Y247和/或R250的内部缺失，其可以与周围残
基(例如，248、249、246、251等)的缺失组合。在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白
酶切割基序包含突变，该突变是四个连续的氨基酸残基的缺失，所述缺失删除最小的弗林
蛋白酶切割位点R/YxxR，例如，缺乏R248-R251的StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应多肽
(和其他志贺毒素1A亚基变体)和缺乏R/Y247-R250的SLT-2A来源的志贺毒素效应多肽(和
志贺样毒素2A亚基变体)。在某些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在
核心弗林蛋白酶切割基序侧翼的氨基酸残基中具有一个或更多个氨基酸残基缺失的突变，
例如在SLT-1A、StxA或另一志贺毒素1A亚基变体中的244-247和/或252-255的缺失。在某些
进一步的实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突
变，所述突变是整个表面暴露的蛋白酶切割敏感环的内部缺失，例如，针对于StxA和SLT-1A
来源的志贺毒素效应多肽(和其他志贺毒素1A亚基变体)，天然定位的氨基酸残基241-262
的缺失；和针对SLT-2A来源的志贺毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基240-261的缺失。

[0488] 在某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含，与野生型志贺毒素A亚基相比，在弗林蛋白酶切割基序内是内部氨基酸残基缺失的突变和是羧基端截短的突变。在某
些进一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含，与野生型志贺毒素A亚基相比，
在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸残基缺失的突变和是羧基端截短的突
变。例如，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽可包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述破
坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是天然定位的以下氨基酸残基的缺失：在截
短的StxA或SLT-1A多肽(或另一种志贺毒素1A亚基变体)中的氨基酸残基248-249和/或
250-251，其仍然具有氨基酸残基247和/或252，或在截短的SLT-2A(或志贺样毒素2A亚基变
体)中的氨基酸残基247-248和/或249-250，其仍然具有氨基酸残基246和/或251。在某些进
一步的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含具有四个连续氨基酸残基的缺失，所
述缺失与野生型志贺毒素A亚基相比，缺失了最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R和羧基
末截短，例如，针对StxA和SLT-1A(和其他志贺毒素1A亚基变体)来源的志贺毒素效应多肽，
截短在天然氨基酸残基位置252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,
265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,
284,285,286,287,288,289,290,291或更大处终止且缺少R248-R251；针对SLT-2A来源的志
贺毒素效应多肽(和志贺毒素2A亚基变体)，截短在天然氨基酸残基位置251,252,253,254,
255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,
274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291或更大
处终止且缺少R/Y247-R250。

[0489] C.具有嵌入的表位的志贺毒素效应多肽的实例

[0490] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽可包含一个或更多个嵌入或插入的异源性T细胞表位，用于去免疫化和/或递送至靶细胞的MHC I类呈递途径。对于某些实施
方案和/或某些志贺毒素效应多肽亚区，嵌入或部分嵌入T细胞表位可能优于插入T细胞表
位，因为例如嵌入型修饰更可能在志贺毒素效应多肽的多种亚区域中成功，而成功的插入
可能更局限于志贺毒素效应多肽亚区域的较小子集。术语“成功”在此用于表示对志贺毒素
效应多肽的修饰(例如引入异源T细胞表位)导致修饰的志贺毒素效应多肽，其在必须水平
的活性上保留一种或更多种志贺毒素效应子功能，无论是单独还是作为细胞靶向分子的组
分。

[0491] WO 2015/113007中描述的任何志贺毒素效应多肽亚区域可适用于本发明的某些实施方案，并且WO 2015/113007中描述的任何志贺毒素效应多肽可以修饰为本发明的志贺
毒素效应多肽，例如，通过添加一个或更多个用于去免疫化的新表位区域破坏(如本文所述
的那种)和/或弗林蛋白酶切割基序破坏(例如本文所述的一种)。

[0492] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽基本上由截短的志贺毒素A亚基组成，所述截短的志贺毒素A亚基包含嵌入或插入的异源性T细胞表位和一个或更多个其他
突变。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含嵌入或插入的异源性T细胞表位
并且小于全长志贺毒素A亚基，例如来源于由SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)
的氨基酸77至239或志贺毒素家族成员的其他A亚基中的等同物(例如SLT-2A(SEQ ID NO:
3)的氨基酸77至238))。例如，包含嵌入或插入的异源性T细胞表位的本发明的志贺毒素效
应多肽可包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:19-
21和75-89中任一个的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性。例如，包含嵌入的异源性表位的本发明的志贺毒素效应多肽包含：V54I、R55L、I57F、P59F、E60T和E61L。

[0493] D.组合志贺毒素效应多肽的实例

[0494] 本发明的志贺毒素效应多肽的组合包含两个或更多个亚区(即，非重叠亚区)，其每个亚区包含以下中的至少一个：(1)在内源性表位或表位区域中的破坏；(2)嵌入的异源
性T细胞表位肽；(3)插入的异源性T细胞表位肽；和(4)在志贺毒素A1片段来源区域的羧基
末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些进一步的实施方案中，组合志贺毒素效应多肽
包含相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短。在某些进一步的实施方案中，所述羧基端
截短导致在未截短的野生型志贺毒素A亚基中存在的一个或更多个内源性B细胞和/或CD4+
T细胞表位区域的去除。

[0495] 本发明的志贺毒素效应多肽的组合的某些实施方案包括(1)在内源性表位或表位区域中的破坏和(2)在A1片段来源的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序两者。
预测WO 2015/113007和WO 2016/196344中描述的任何个体的去免疫化的志贺毒素效应子
亚区(参见例如表B，同上)通常可以与任何包含本文所述的、描述于WO 2015/191764的和/
或本领域已知的破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子亚区组合，以产生本发明的
志贺毒素效应子多肽。

[0496] 在本发明的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽基本上由SEQ ID NO:37中所示的多肽组成，SEQ ID NO:37中所示的多肽进一步包含至少一个内源性B细胞和/或T细胞表位
区域的破坏，所述内源性B细胞和/或T细胞表位区域与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位
不重叠；其中所述破坏包含相对于野生型志贺毒素的一个或更多个氨基酸残基置换。在某
些进一步的实施方案中，置换选自由以下各项组成的组：K1至A,G,V,L,I,F,M和H；T4至A,G,
V,L,I,F,M,和S；D6至A,G,V,L,I,F,S,Q和R；S8至A,G,V,I,L,F,和M；T8至A,G,V,I,L,F,和M；
T9至A,G,V,I,L,F,M,和S；S9至A,G,V,L,I,F,和M；K11至A,G,V,L,I,F,M和H；T12至A,G,V,I,
L,F,M,S,和K；S12至A,G,V,I,L,F,和M；S33至A,G,V,L,I,F,M,和C；S43至A,G,V,L,I,F,和M；
G44至A或L；S45至A,G,V,L,I,F,和M；T45至A,G,V,L,I,F,和M；G46至A和P；D47至A,G,V,L,I,
F,S,M,和Q；N48至A,G,V,L,M和F；L49至A,V,C,和G；Y49至A,G,V,L,I,F,M,和T；F50至A,G,V,
L,I,和T；D53至A,G,V,L,I,F,S,和Q；V54至A,G,I,和L；R55至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；
G56至A和P；I57至A,G,V,和M；L57至A,V,C,G,M,和F；D58至A,G,V,L,I,F,S,和Q；P59至A,G,
和F；E60至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,T,和R；E61至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,和R；G62至A；
R84至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；V88至A和G；I88至A,V,C,和G；D94至A,G,V,L,I,F,S,和Q；
S96至A,G,V,I,L,F,和M；T104至A,G,V,L,I,F,M；和N；A105至L；T107至A,G,V,L,I,F,M,和P；
S107至A,G,V,L,I,F,M,和P；L108至A,V,C,和G；S109至A,G,V,I,L,F,和M；T109至A,G,V,I,
L,F,M,和S；G110至A；S112至A,G,V,L,I,F,和M；D111至A,G,V,L,I,F,S,Q,和T；S112至A,G,
V,L,I,F,和M；D141至A,G,V,L,I,F,S,和Q；G147至A；V154至A和G.R179至A,G,V,L,I,F,M,Q,
S,K,和H；T180至A,G,V,L,I,F,M,和S；T181至A,G,V,L,I,F,M,和S；D183至A,G,V,L,I,F,S,
和Q；D184至A,G,V,L,I,F,S,和Q；L185至A,G,V和C；S186至A,G,V,I,L,F,和M；G187至A；R188
至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；S189至A,G,V,I,L,F,和M；D198至A,G,V,L,I,F,S,和Q；R204
至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R205至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H；S247至A,G,V,I,L,F,和M；
Y247至A,G,V,L,I,F,和M；R247至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R248至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,
K,和H；R250至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R251至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；D264至A,G,
V,L,I,F,S,和Q；G264至A；和T286至A,G,V,L,I,F,M,和S。在某些进一步的实施方案中，存在
多个内源性B细胞和/或CD8+T细胞表位区域的多个破坏，其中每个破坏涉及至少一个选自
以下各项组成的组的氨基酸残基置换：K1至A,G,V,L,I,F,M和H；T4至A,G,V,L,I,F,M,和S；
D6至A,G,V,L,I,F,S,Q和R；S8至A,G,V,I,L,F,和M；T9至A,G,V,I,L,F,M,和S；S9至A,G,V,L,
I,F,和M；K11至A,G,V,L,I,F,M和H；T12至A,G,V,I,L,F,M,S,和K；S12至A,G,V,I,L,F,和M；
S33至A,G,V,L,I,F,M,和C；S43至A,G,V,L,I,F,和M；G44至A或L；S45至A,G,V,L,I,F,和M；
T45至A,G,V,L,I,F,和M；G46至A和P；D47至A,G,V,L,I,F,S,M,和Q；N48至A,G,V,L,M和F；L49
至A,V,C,和G；Y49至A,G,V,L,I,F,M,和T；F50至A,G,V,L,I,和T；A51至V；D53至A,G,V,L,I,
F,S,和Q；V54至A,G,I,和L；R55至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；G56至A和P；I57至A,G,V,和M；
L57至A,V,C,G,M,和F；D58至A,G,V,L,I,F,S,和Q；P59至A,G,和F；E60至A,G,V,L,I,F,S,Q,
N,D,M,T,和R；E61至A,G,V,L,I,F,S,Q,N,D,M,和R；G62至A；R84至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和
H；V88至A和G；I88至A,V,C,和G；D94至A,G,V,L,I,F,S,和Q；S96至A,G,V,I,L,F,和M；T104至
A,G,V,L,I,F,M；和N；A105至L；T107至A,G,V,L,I,F,M,和P；S107至A,G,V,L,I,F,M,和P；
L108至A,V,C,和G；S109至A,G,V,I,L,F,和M；T109至A,G,V,I,L,F,M,和S；G110至A；S112至
A,G,V,L,I,F,和M；D111至A,G,V,L,I,F,S,Q,和T；S112至A,G,V,L,I,F,和M；D141至A,G,V,
L,I,F,S,和Q；G147至A；V154至A和G.R179至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；T180至A,G,V,L,I,
F,M,和S；T181至A,G,V,L,I,F,M,和S；D183至A,G,V,L,I,F,S,和Q；D184至A,G,V,L,I,F,S,
和Q；L185至A,G,V和C；S186至A,G,V,I,L,F,和M；G187至A；R188至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和
H；S189至A,G,V,I,L,F,和M；D198至A,G,V,L,I,F,S,和Q；R204至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和
H；R205至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K和H；S247至A,G,V,I,L,F,和M；Y247至A,G,V,L,I,F,和M；
R247至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R248至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；R250至A,G,V,L,I,
F,M,Q,S,K,和H；R251至A,G,V,L,I,F,M,Q,S,K,和H；D264至A,G,V,L,I,F,S,和Q；G264至A；
和T286至A,G,V,L,I,F,M,和S。

[0497] 本发明的志贺毒素效应多肽的某些实施方案包括(1)嵌入的或插入的异源性T细胞表位-肽和(2)在A1片段来源的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。包含下文
实施例或WO 2015/113007中描述的嵌入或插入的异源性T细胞表位的任何志贺毒素效应多
肽亚区通常可与任何蛋白酶切割抗性志贺毒素效应多肽亚区(例如，本文所述的经修饰的
志贺毒素A亚基亚区，其描述于WO 2015/191764，和/或本领域已知)组合，以产生组合，志贺
毒素效应多肽，其作为细胞靶向分子的组分，是蛋白酶切割抗性的并且能够将异源性T细胞
表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径。此类型的组合志贺毒素效应多肽的非限制性实例
显示于SEQ ID NO:19-21和75-89。

[0498] 在本发明的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。例如在某
些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽来源于SEQ ID NO:1的氨基酸75至251、SEQ ID
NO:1的氨基酸1至241、SEQ ID NO:1的氨基酸1至251、或SEQ ID NO:1的氨基酸1至261，其中
志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A1片段来源
的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。类似地，在其他实施方案中，本发明的志
贺毒素效应多肽来源于SEQ ID NO:2的氨基酸75至251、SEQ ID NO:2的氨基酸1至241、SEQ
ID NO:2的氨基酸1至251、或SEQ ID NO:2的氨基酸1至261，其中志贺毒素效应多肽包含至
少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏
的弗林蛋白酶切割基序。另外，志贺毒素效应多肽可来源于SEQ ID NO:3的氨基酸75至251、
SEQ ID NO:3的氨基酸1至241、SEQ ID NO:3的氨基酸1至251、或SEQ ID NO:3的氨基酸1至
261，其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A1
片段来源的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，志贺毒素
效应多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸75至251；
(ii)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸
1-251；和(iv)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至少
一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A片段来源区域的羧基末端的破坏的弗
林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：
(i)SEQ ID NO:1-6的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID
NO:1-6的氨基酸1-251；或(iv)SEQ ID NO:1-3的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包
含至少一个嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位和在志贺毒素A片段来源区域的羧基末端
的破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为
或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18和75-89中
任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1-6和75-89中任一个的氨基酸1-251；或(iv)SEQ
ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的
异源性T细胞表位和在志贺毒素A片段来源区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6中
任一个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18和75-89中任一个的氨基酸1至241；(iii)
SEQ ID NO:1-6和75-89中任一个的氨基酸1-251；或(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸
1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒
素A片段来源区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。

[0499] 本发明的组合志贺毒素效应多肽的某些实施方案包括(1)在内源性表位或表位区域中的破坏和(2)嵌入的异源性T细胞表位肽两者。然而，包含本文或WO 2015/191764中描
述的插入或嵌入的异源性T细胞表位的志贺毒素效应子亚区通常不与本文所述的每个去免
疫化的志贺毒素效应子亚区组合，除非根据经验显示为成功组合的使得所得组合分子保留
足够水平的志贺毒素效应子功能。本文的公开内容显示了如何制作和测试这些实施方案以
凭经验证明成功。

[0500] 这里使用的术语“成功的”是指志贺毒素效应多肽中的两个或更多个氨基酸残基置换导致功能特征，例如去免疫化，减少弗林蛋白酶切割和/或递送嵌入或插入的表位能
力，而修饰的志贺毒素效应多肽保留一种或更多种志贺毒素效应子功能。本文描述的方法
和测定法显示如何设计、制作和凭经验测试本发明的实施方案，所述实施方案代表组合、志
贺毒素效应多肽和包含其的细胞靶向分子。

[0501] 例如，在本发明的某些实施方案中，志贺毒素效应多肽来源于SEQ ID NO:1的氨基酸75至251、SEQ ID NO:1的氨基酸1至241、SEQ ID NO:1的氨基酸1至251、或SEQ ID NO:1的
氨基酸1至261，其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和至
少一个氨基酸在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域是破坏的且其中所述破坏的氨基酸
与嵌入或插入的表位不重叠。类似地，在其他实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽来源
于SEQ ID NO:2的氨基酸75至251、SEQ ID NO:2的氨基酸1至241、SEQ ID NO:2的氨基酸1至
251、或SEQ ID NO:2的氨基酸1至261，其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的
异源性T细胞表位和至少一个氨基酸在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域是破坏的且
其中所述破坏的氨基酸与嵌入或插入的表位不重叠。另外，志贺毒素效应多肽可来源于SEQ
ID NO:3的氨基酸75至251、SEQ ID NO:3的氨基酸1至241、SEQ ID NO:3的氨基酸1至251、或
SEQ ID NO:3的氨基酸1至261，其中志贺毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源性T
细胞表位和至少一个氨基酸在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域是破坏的且其中所述
破坏的氨基酸与嵌入或插入的表位不重叠。在某些实施方案中，志贺毒素效应多肽来源于
多肽，所述多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸75至
251；(ii)SEQ ID NO:1-18中任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基
酸1-251；和(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至
少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中至少
一个氨基酸是破坏的，且其中所述破坏的氨基酸与嵌入或插入的表位不重叠。在某些实施
方案中，志贺毒素效应多肽来源于多肽，所述多肽包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID
NO:1-6的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18的氨基酸1至241；(iii)SEQ ID NO:1-6的氨
基酸1-251；或(iv)SEQ ID NO:1-3的氨基酸1至261；其中志贺毒素效应多肽包含至少一个
嵌入或插入的异源性T细胞表位和在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中至少一个氨
基酸是破坏的，且其中所述破坏的氨基酸与嵌入或插入的表位不重叠，且其中所述嵌入或
插入的异源性T细胞表位破坏另外的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。

[0502] 本发明的组合志贺毒素效应多肽组合它们各自亚区的特征，例如弗林蛋白酶切割基序破坏、单个表位破坏和/或异源性T细胞表位货物，且这些组合有时导致与其部分去免
疫化的亚区的总和相比具有免疫原性的协同降低的志贺毒素效应多肽。特别地，由于两个
或更多个亚区的组合，SEQ ID NO:19-21和75-89中所示的示例性志贺毒素效应多肽被协同
去免疫化，其中一个亚区包含嵌入的异源性T细胞表位且另一个包含被一个或更多个氨基
酸残基置换破坏的内源性表位。

[0503] 在某些实施方案中，包含本发明的嵌入的T细胞表位的组合的去免疫化的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含一个或更多个选自由K1R和K11R组成志贺毒素A的亚基
的天然位置的置换的组的置换。

[0504] 在某些实施方案中，包含本发明的嵌入的T细胞表位的组合的去免疫化的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应多肽包含、组成为或基本上组成为：SEQ ID NO:19-21和75-89中
任一个所示的多肽序列表示，由SEQ ID NO:35的氨基酸2至252表示，或由SEQ ID NO:107的
氨基酸1-251表示的多肽之一。

[0505] 在某些浓度下没有表现出细胞毒性或表现出细胞毒性降低的本发明的去免疫化的志贺毒素效应多肽，例如，包含R179A的志贺毒素效应多肽，仍可用作用于将外源性物质
递送到细胞中的去免疫化的志贺毒素效应多肽。类似地，在某些浓度下没有表现出细胞毒
性或表现出细胞毒性降低的本发明的CD8+T细胞超免疫的志贺毒素效应多肽，例如，包含嵌
入其催化结构域的表位的志贺毒素效应多肽(参见例如WO 2015/113005，实施例1-F)，可用
于将T细胞表位递送至其中存在志贺毒素效应多肽的细胞的所需亚细胞区室或用作用于将
T细胞表位递送到靶细胞中的细胞-靶向分子的组分。

[0506] E.本发明的细胞靶向分子的实例

[0507] 本文所描述的志贺毒素效应多肽可用作靶向各种HER2靶生物分子和前述的表位的细胞靶向分子的组分。以下实例更详细地描述了本发明的示例性细胞-靶分子的某些结
构，所述靶细胞在细胞表面与HER2物理偶联，例如表达HER2的细胞。本发明的HER2靶向分子
可以是包含以下的HER2靶向分子：(i)免疫球蛋白结合区域，其能够特异性结合HER2/neu/
ErbB2的细胞外部分，并且包含以下一种或更多种：抗体可变片段，单一结构域抗体片段，单
链可变片段，Fd片段，抗原结合片段，自主VH结构域，来自骆驼抗体的VHH片段，来自软骨鱼
抗体的重链抗体结构域，VNAR片段和免疫球蛋白新抗原受体；和ii)包含志贺毒素A1片段区
域的志贺毒素A亚基效应多肽，其中志贺毒素A亚基效应多肽包含(a)嵌入或插入的异源性
CD8+T细胞表位，其破坏在志贺毒素A1片段区域的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域；
和(b)在志贺毒素A1片段区域内的多个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏，所述
表位区域不与嵌入或插入的异源性CD8+T细胞表位重叠；其中所述志贺毒素A1片段区域包
含在志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中志贺毒素A亚基
效应多肽与野生型志贺毒素A亚基的羧基末端相比包含羧基末端截短；其中所述羧基末端
截短导致一个或更多个本文所述的内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的消除；其中志
贺毒素A亚基效应多肽能够表现出志贺毒素效应子功能(例如，催化活性)；其中所述HER2靶
向分子具有降低的B细胞抗原性或免疫原性以及降低的CD4+T细胞抗原性或免疫原性；且其
中结合区域和志贺毒素效应多肽融合形成连续多肽，使得结合区域与志贺毒素A亚基效应
多肽的羧基末端缔合。

[0508] 其他结构变化

[0509] 使用本发明的含有针对靶生物分子的任何细胞外部分的功能性结合位点的并且甚至优选地能够以高亲和力(例如，如KD所示)结合靶生物分子的细胞靶向分子的片段、变
体和/或衍生物在本发明的范围内。例如，具有10-5至10-12摩尔/升，优选小于200nM的解离常
数(KD)的结合靶生物分子的细胞外部分的任何结合区域，可以被替代用于制备本发明的细
胞靶向分子和进行本发明的方法。

[0510] 技术人员将认识到，可以对本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子以及编码任何前者的多核苷酸做出变化，而不会减弱它们的生物活性，例如通过维持志贺毒素效应
多肽的整体结构和功能，诸如与一种或更多种以下各项结合:1)内源性表位破坏，其降低抗
原性和/或免疫原性潜力，2)弗林蛋白酶切割基序破坏，其减少蛋白水解切割，和/或3)嵌入
或插入的表位，其降低抗原性和/或免疫原性潜力或能够被递送至MHC I分子用于在细胞表
面上呈递。例如，一些修饰可以促进表达、促进纯化、改善药代动力学性质和/或改善免疫原
性。这些修饰是本领域技术人员公知的，并包括，例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始
位点，在位于任一末端放置的另外的氨基酸以产生方便定位的限制性位点或终止密码子，
以及融合至任一末端以提供方便的检测和/或纯化的生化亲和标签。用于改善使用非脊索
动物系统(例如原核细胞)产生的多肽的免疫原性的常见修饰是在产生多肽后除去起始甲
硫氨酸残基，其可在生产过程中被甲酰化，例如，在细菌宿主系统中，因为例如N-甲酰甲硫
氨酸(fMet)的存在可能在脊索动物中诱导不希望的免疫应答。

[0511] 在本文中还预见到在本发明的志贺毒素效应多肽、本发明的细胞靶向分子或本发明的细胞靶向分子的蛋白性组分的氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸残基，诸如表位
标签或其它部分的序列。所述另外的氨基酸残基可以用于多种目的，包括，例如，促进克隆、
促进表达、翻译后修饰、促进合成、纯化、促进检测和施用。表位标签和部分的非限制性例子
是：壳多糖结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、因子Xa切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、聚组
氨酸标签、ReAsH标签、strep-标签、strep-标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝
血酶切割位点和V5表位标签。

[0512] 在某些以上实施方案中，本发明的志贺毒素效应子区多肽和/或细胞靶向分子的多肽序列不同在于多肽区中的一个或多个保守氨基酸置换，只要所有需要的结构特征仍然
存在并且志贺毒素效应多肽能够表现出任何所需的功能，无论是单独或作为细胞靶向分子
的组分。本文中使用的术语“保守置换”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学上相似的氨
基酸残基替换。实例包括具有相似特征的氨基酸残基的置换，例如，小氨基酸、酸性氨基酸、
极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸(参见，例如，表C)。使用通常不存
在于内源哺乳动物肽和蛋白中的残基的保守置换的一个例子是利用例如鸟氨酸、刀豆氨
酸、氨基乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于与肽
和蛋白中表型上沉默的置换相关的其它信息，参见，例如，Bowie J等,Science 247:1306-
10(1990)。

[0513] 表C.保守氨基酸置换的例子

[0514]

[0515] 在表C的保守置换方案中，氨基酸的示例性的保守置换根据物理化学性质进行分组——I：中性的、亲水的；II：酸和酰胺；III：碱性的；IV：疏水的；V：芳族的、庞大氨基酸，VI亲水的、不带电荷的，VII脂族不带电荷的，VIII非极性的不带电荷的，IX环烯基相关的、X疏
水的，XI极性的，XII小的，XIII允许旋转的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置换包括下述：
1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和
6)H可以置换N。

[0516] 另外的保守氨基酸置换包括下述：1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和6)H可以置换N。

[0517] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽和细胞靶向分子可以包含本文所述的本发明的多肽区域的功能片段或变体，与本文引用的多肽序列相比，所述功能片段
或变体最多具有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换(其并且保留与本文所述的多肽序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性)，只要其(1)包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位并且至少一个氨基酸在内源性B-细胞
和/或CD4+T细胞表位区域中被破坏，其中被破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠；(2)
包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端
破坏的弗林蛋白酶切割基序；(3)包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏的
弗林蛋白酶切割基序，并且包含至少一个在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中被破
坏的氨基酸，其中破坏的氨基酸不与破坏的弗林蛋白酶切割基序重叠；或(4)包含至少一个
嵌入或插入的异源性T细胞表位，至少一个在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中的氨
基酸被破坏，其中所述破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠，和在志贺毒素A1片段来
源的区域的羧基末端处的破坏的弗林蛋白酶切割基序。本发明的志贺毒素效应多肽和细胞
靶向分子的变体在本发明的范围，由于通过诸如在结合区域或志贺毒素效应多肽区域内改
变一个或更多个氨基酸残基或缺失或插入一个或更多个氨基酸残基而改变本文所述的多
肽，以获得所需的性质，诸如改变的细胞毒性、改变的细胞抑制作用、改变的免疫原性和/或
改变的血清半衰期。本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子可以进一步具有或不具有
信号序列。

[0518] 因此，在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22-36和97-108中任一个所示的氨基酸序列具有
至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，所述氨
基酸序列与SEQ ID NO:25-31、34-36、97-104和106-108中任一个所示的氨基酸序列有至少
85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，所述
氨基酸序列与SEQ ID NO:29、31、34、35、36、102、104和106–108任一个所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，
所述氨基酸序列与SEQ ID NO:29或102中任一个所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与
SEQ ID NO:31或104中任一个所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34或106
中任一个所示的氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多)同一性。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:35或107中任一个所示的
氨基酸序列有至少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更多)同一性。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含、基本上组成为或组
成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36或108中任一个所示的氨基酸序列有至
少85％(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

[0519] 因此，在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽包含、基本上组成为或组成为：与天然存在的(例如，野生型)志贺毒素A亚基或其片段有至少55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的全序列同一性的氨基酸序列，例如志贺毒素A亚基，诸如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)、SLT-2A(SEQ ID NO:3)、Stx1cA
(SEQ ID NO:4)、Stx1dA(SEQ ID NO:5)、Stx1eA(SEQ ID NO:6)、Stx2cA变体1(SEQ ID NO:
7)、Stx2cA变体2(SEQ ID NO:8)、Stx2cA变体3(SEQ ID NO:9)、Stx2cA变体4(SEQ ID NO:
10)、Stx2cA变体5(SEQ ID NO:11)、Stx2cA变体6(SEQ ID NO:12)、Stx2dA变体1(SEQ ID
NO:13)、Stx2dA变体2(SEQ ID NO:14)、Stx2dA变体3(SEQ ID NO:15)、Stx2eA变体1(SEQ ID
NO:16)、Stx2eA变体2(SEQ ID NO:17)和/或Stx2fA(SED NO:18)，其中所述志贺毒素效应多
肽(1)包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和至少一个氨基酸在内源性B细胞和/
或CD4+T细胞表位区域被破坏，且其中所述破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠；(2)
包含至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端
破坏的弗林蛋白酶切割基序；或(3)包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏
的弗林蛋白酶切割基序，并且包含至少一个在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域中被
破坏的氨基酸，且其中所述破坏的氨基酸不与破坏的弗林蛋白酶切割基序重叠；或(4)包含
(i)至少一个嵌入或插入的异源性T细胞表位，(ii)在内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区
域中至少一个氨基酸被破坏，其中破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠，和(iii)在志
贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。如本文所描述的，志
贺毒素A亚基的片段可包含、基本上组成为或组成为：(i)SEQ ID NO:1-6、37和75–89中任一
个的氨基酸75至251；(ii)SEQ ID NO:1-18、37和75–89中任一个的氨基酸1至241；(iii)SEQ
ID NO:1-6、37和75–89中任一个的氨基酸1-251；或(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的氨基酸1
至261。例如，志贺毒素A亚基的片段可包含、基本上组成为或组成为以下氨基酸：(i)SEQ ID
NO:75–89中任一个的75至251；(ii)SEQ ID NO:75–89中任一个的1至241；(iii)SEQ ID NO:
75–89中任一个的1-251；或(iv)SEQ ID NO:1-3中任一个的1至261。

[0520] 在本发明的志贺毒素效应多肽的某些实施方案中，可以突变、插入或缺失一个或更多个氨基酸残基，以增加志贺毒素效应多肽的酶活性。在本发明的志贺毒素效应多肽的
某些实施方案中，可以突变或缺失一个或更多个氨基酸残基，以降低或消除志贺毒素效应
多肽的催化和/或细胞毒活性。例如，志贺毒素家族成员的A亚基的催化和/或细胞毒活性可
通过突变或截短减弱或消除。

[0521] 志贺毒素家族成员的A亚基的细胞毒性可以通过突变和/或截短来改变、降低或消除。标记酪氨酸-77，谷氨酸-167，精氨酸-170，酪氨酸-114和色氨酸-203的位置已显示对
Stx，Stx1和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等人,Proc Natl Acad Sci USA 85:2568-
72(1988)；Deresiewicz R等人,Biochemistry 31:3272-80(1992)；Deresiewicz R等人,
Mol Gen Genet241:467-73(1993)；Ohmura M等人,Microb Pathog 15:169-76(1993)；Cao
C等人,Microbiol Immunol 38:441-7(1994)；Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9
(1998))。将谷氨酸-167和精氨酸-170突变会消除Slt-I A1在无细胞核糖体失活测定中的
酶活性(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在另一个使用Slt-I A1在
内质网中的从头表达的方案中，将谷氨酸-167和精氨酸-170突变在该表达水平消除Slt-I
A1片段细胞毒性(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短分析证实，
StxA的从残基75-268的片段仍然保留显著的体外酶活性(Haddad J等人,J Bacteriol
175:4970-8(1993))。通过胞质溶胶中的从头表达，含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段
显示出显著的体外酶活性和细胞毒性(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18
(2005))。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达不是细胞毒性的，因为其不
能逆转移至胞质溶胶(LaPointe P等人,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。

[0522] 志贺毒素A亚基中酶活性和/或细胞毒性的最关键残基定位至以下残基-位置：天冬酰胺-75，酪氨酸-77，酪氨酸-114，谷氨酸-167，精氨酸-177和精氨酸-176和色氨酸-203
等(Di R等人,Toxicon 57:525-39(2011))。具体地，含有谷氨酸-E167-至-赖氨酸和精氨
酸-176-至-赖氨酸突变的Stx2A的双突变构建体被完全失活；而Stx1和Stx2中的许多单一
突变显示出细胞毒性的10倍降低。此外，将Stx1A截短至1-239或1-240会降低它的细胞毒
性，并且类似地，将Stx2A截短至保守疏水残基降低它的细胞毒性。在志贺毒素A亚基中对于
结合真核核糖体和/或真核核糖体抑制而言最关键的残基已经定位至以下残基-位置：精氨
酸-172、精氨酸-176、精氨酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、缬氨酸-191和亮氨酸-233等
(McCluskey A等人,PLoS One 7:e31191(2012)。然而，某些修饰可以增加由本发明的志贺
毒素效应多肽表现出的志贺毒素功能活性。例如，将Stx1A中的残基-位置丙氨酸-231突变
成谷氨酸增加了Stx1A的体外酶活性(Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9
(1998))。

[0523] 在来源于SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的本发明的志贺毒素效应多肽的某些实施方案中，突变的一个或更多个氨基酸残基包括下列各项的置换：在位置75
的天冬酰胺、在位置77的酪氨酸、在位置114的酪氨酸，在位置167的谷氨酸、在位置170的精
氨酸、在位置176的精氨酸，和/或在位置203的色氨酸的置换。基于现有技术，这样的置换的
实例对技术人员来说是已知：例如将在位置75的天冬酰胺置换为丙氨酸，将在位置77的酪
氨酸置换为丝氨酸，将在位置114位的酪氨酸置换为丝氨酸，将位置167的谷氨酸置换为谷
氨酸，将位置170位精氨酸置换为丙氨酸，将位置176的精氨酸置换为赖氨酸，将位置203的
色氨酸置换为丙氨酸，和/或将在位置231处的丙氨酸用谷氨酸置换。增强或降低志贺毒素
酶活性和/或细胞毒性的其他突变也在本发明的范围内，并且可以使用本文公开的熟知技
术和测定来确定。

[0524] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子可以是单价的和/或单体的。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子可以不是多价的和/或更多聚体的。如本申请的实施例所
证明的，某些细胞靶向分子的单价和/或单体形式在体内使用时可表现出低水平的毒性，同
时仍对HER2表达细胞表现出强效的细胞毒性。

[0525] 本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子可任选地与一种或更多种另外的试剂缀合，所述另外的试剂可包括治疗剂、诊断剂和/或本领域已知的其他外源性物质，包括
本文所述的此类药剂。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽或细胞靶向分子是
PEG化的或白蛋白化的，例如，以提供去免疫化，通过掩蔽在志贺毒素A1片段来源区域的羧
基末端的延伸的环和/或弗林蛋白酶切割基序来破坏弗林蛋白酶切割，改善药代动力学性
质和/或改善免疫原性(参见例如，Wang Q等人,Cancer Res 53:4588-94(1993)；Tsutsumi
Y等人,Proc Natl Acad Sci USA 97:8548-53(2000)；Buse J,El-Aneed A,Nanomed 5:
1237-60(2010)；Lim S等人,J Control Release 207-93(2015))。

[0526] V.本发明的细胞靶向分子的一般功能

[0527] 本发明的志贺毒素效应多肽与细胞靶向结合区域的功能性缔合使得能够产生细胞靶向分子，所述细胞靶向分子选择性地杀伤特定细胞类型、抑制特定细胞类型的生长，将
外源性物质递送至特定细胞类型和/或检测特定细胞类型。与先前的志贺毒素效应多肽相
比，本发明的志贺毒素效应多肽的特性使得能够在脊索动物中产生具有改善的治疗窗的细
胞靶向分子。

[0528] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在施用于脊索动物后，提供以下各项的一种或更多种：1)在低施用剂量下靶细胞(例如感染或恶性细胞)的强效和选择性杀伤，
2)当细胞靶向分子存在于细胞外空间时，细胞靶向结合区域和志贺毒素效应多肽区域之间
的连接稳定性，3)低水平的脱靶细胞死亡和/或不需要的组织损伤，和4)用于通过靶细胞的
呈递以启动所需的T细胞介导的免疫应答(例如，CD8+T细胞的招募和组织部位处的细胞因
子的局部释放)的异源CD8+T细胞表位的细胞靶向递送。

[0529] 本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子可用于涉及例如以下的各种应用：细胞杀伤；细胞生长抑制；细胞内货物递送；生物信息收集；免疫应答刺激，和/或健康状况的
补救。本发明的志贺毒素效应多肽可用作各种治疗和/或诊断分子，例如，配体-毒素融合，
免疫毒素和/或免疫缀合物的组分。本发明的细胞靶向分子可用作治疗和/或诊断分子，例
如作为细胞靶向的细胞毒性的治疗性分子；细胞靶向的无毒的运载工具；和/或细胞靶向的
诊断分子；例如，涉及用于诊断或治疗多种疾病(包括癌症，免疫紊乱和微生物感染)的特定
细胞类型的体内靶向的应用。

[0530] 根据实施方案，本发明的志贺毒素效应多肽或细胞靶向分子可具有或提供以下一种或更多种特征或功能：(1)去免疫化，(2)蛋白酶切割抗性，(3)在一定浓度下的强效细胞
毒性，(4)由另外的物质(例如异源性T细胞表位)组成的货物的细胞内递送，(4)选择性细胞
毒性，(6)在一定剂量或用量下多细胞生物中的低脱靶毒性，(7)异源性T细胞表位至靶细胞
的MHC I类呈递途径的递送，和/或(8)CD8+T细胞免疫应答的刺激。本发明的志贺毒素效应
多肽和细胞靶向分子的某些实施方案是多功能的，因为所述分子具有本文所描述的两种或
更多种特征或功能。本发明的细胞靶向分子的某些进一步的实施方案在单个分子中提供所
有上述特征和功能。

[0531] 细胞靶向结合区域与本发明的志贺毒素效应多肽的缔合、偶联和/或连接使得能够工程化改造具有志贺毒素功能的细胞靶向分子，该分子在以某些剂量或用量施用至多细
胞生物如哺乳动物后，可产生较少的副作用。副作用的非限制性实例包括脱靶毒性、非靶向
细胞毒性和/或不需要的免疫应答。本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的某些实
施方案特别适用于涉及将志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子施用于脊索动物的应用，
因为其功能特性，例如，去免疫化，降低的脱靶毒性和/或所需的免疫应答的靶向刺激，诸如
通过细胞靶向分子递送的CD8+T细胞表位的细胞表面呈递。

[0532] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够结合与特定细胞类型的细胞表面缔合的细胞外靶生物分子并进入那些细胞。一旦在靶细胞类型内化，本发明的细胞靶向分
子的某些实施方案能够将酶活性的细胞毒性的志贺毒素效应多肽片段按路径发送到靶细
胞的胞质溶胶中并最终杀死细胞。或者，本发明的细胞靶向分子的无毒或毒性降低的变体
可用于将额外的外源性物质递送到靶细胞中，例如表位、肽、蛋白质、多核苷酸和检测促进
剂。该系统是模块化的，因为任何数量的不同结合区域可用于将本发明的志贺毒素效应多
肽靶向各种不同的细胞类型。

[0533] A.针对涉及施用至脊索动物的应用的去免疫化

[0534] 本发明的志贺毒素效应多肽的去免疫化通过工程化改造志贺毒素A亚基或志贺毒素效应多肽的一个或更多个内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域的破坏来实现，包括通
过突变和/或截短或通过共价连接的化学结构的缀合。因为B细胞表位通常与成熟CD4+T细
胞的表位一致或重叠，所以内源性B细胞表位区域的破坏通常同时破坏内源性CD4+T细胞表
位，反之亦然。

[0535] 本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的某些实施方案是针对一种或更多种B细胞和/或CD4+T细胞表位去免疫化的，意味着这些分子与之前的志贺毒素效应多肽和
细胞靶向分子相比(其缺乏与相同B细胞和/或CD4+T细胞表位或表位区域的相同破坏和/或
缺乏对相同B细胞/或CD4+T细胞表位或表位区域的任何破坏)表现出降低的抗原性和/或免
疫原性潜力。某些进一步的实施方案尽管存在提供去免疫化特性的多个突变，但仍显示出
强效的即使不是野生型水平的志贺毒素A亚基催化结构域依赖性细胞毒性。本发明的去免
疫化的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子可用于涉及将志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向
分子肠胃外施用至脊索动物(例如哺乳动物、两栖动物、鸟、鱼、爬行动物或鲨鱼)的应用，因
为由该施用的分子引起的产生不良免疫反应的可能性降低。

[0536] 当施用于各种脊索动物物种时，本发明的各种去免疫化的志贺毒素效应多肽的抗原性谱可能不同，但本发明的所有去免疫化多肽在至少一种生物中表现出降低的抗原性
和/或免疫原性，如通过至少一种定量测定法测量。特别地，针对哺乳动物受体去免疫化本
发明的细胞靶向分子的某些实施方案，例如，当被施用至那个哺乳动物时，与参照(例如包
含野生型志贺毒素A1片段的相关细胞靶向分子)分子相比，该分子引起较低数量和/或频率
的“抗细胞靶向分子”抗体。此外，预期具有多个内源性表位区域破坏的本发明的志贺毒素
效应多肽可以更大程度地降低在这种多肽的脊索动物受体中发生不希望的免疫应答的可
能性。

[0537] 对于本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的某些实施方案，去免疫化特性是结构变化的结果，其包括在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶
切割基序。

[0538] 对于本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的某些实施方案，去免疫化特性是结构变化的结果，其包括嵌入和/或插入T细胞表位，所述嵌入和/或插入T细胞表位破坏
了内源性B细胞和/或CD4+T细胞表位区域。

[0539] 对于某些实施方案，保留了衍生去免疫化的志贺毒素效应多肽的亲本志贺毒素多肽的所需生物学功能，例如促进细胞内化、指导细胞内按路径发送和强效的细胞毒性的志
贺毒素A亚基功能。保留是指如本文所述的最低水平的活性的保留。

[0540] B.降低蛋白酶-切割敏感性

[0541] 与包含野生型志贺毒素A1片段区域的相关分子相比，本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的某些实施方案表现出降低的蛋白酶切割敏感性。某些进一步的实施方案
表现出强效的(如果不是最佳的)志贺毒素A亚基催化结构域依赖性细胞毒性，尽管这降低
蛋白酶切割敏感性并且在中毒细胞内缺乏规范的弗林蛋白酶切割事件。

[0542] 与包含野生型志贺毒素A1片段区域的相关分子相比，本发明的蛋白酶切割抗性的细胞靶向分子的某些实施方案(即包含志贺毒素效应多肽的细胞靶向分子，所述志贺毒素
效应多肽在其志贺毒素A1片段区域的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序)表现出改
善的体内耐受性。某些进一步的实施方案表现出强效的(如果不是最佳的)志贺毒素A亚基
催化结构域依赖性细胞毒性，尽管这降低蛋白酶切割敏感性并且在中毒细胞内缺乏规范的
弗林蛋白酶切割事件。

[0543] 先前认为，包含志贺毒素A1片段催化区域的细胞毒性志贺毒素A亚基构建体必须在中毒细胞内维持或以某种方式补偿通过弗林蛋白酶的天然存在的蛋白水解加工，以针对
有效和强效的细胞毒性保持志贺毒素的天然适应性。意外地发现，弗林蛋白酶切割事件不
是强效细胞毒性所必需的，因为在野生型志贺毒素对照构建体的水平上的强效志贺毒素细
胞毒性是在志贺毒素A1片段的羧基末端不存在任何弗林蛋白酶切割事件的情况下实现的，
尽管存在羧基末端部分(参见例如，WO 2015/191764；WO2016/196344)。在中毒细胞内弗林
蛋白酶切割事件的缺乏可能阻止志贺毒素A1片段样区域的有效释放，并因此导致相对大的
部分(例如，大小大于28kDa)与志贺毒素A1片段区域的连续连接。然而，尽管存在这种可能
性，但是用包含志贺毒素效应多肽区域且缺乏任何已知的补偿特征(例如，提供邻近志贺毒
素A1片段来源的区域的羧基末端的细胞内切割)的弗林蛋白酶切割缺陷构建体实现了强效
的志贺毒素细胞毒性(参见例如WO2015/191764；WO 2016/196344)。

[0544] 这表明与A1片段区域连接的相对大的分子部分的持久性和/或低效释放不一定降低志贺毒素细胞毒性的效力。这是令人惊讶的，因为最佳的志贺毒素中毒过程被认为需要
从所有其他大分子部分释放志贺毒素A1片段，以有效地将释放的A1片段从内质网逆转移至
胞质溶胶中，其中A1片段可以形成催化失活中毒细胞的核糖体的酶活性结构。特别地，预期
覆盖志贺毒素A1片段的羧基末端的相对大的分子部分的持久性和/或低效释放会干扰志贺
毒素A1片段有效获得接近细胞溶质的天然机制，其涉及暴露A1片段的疏水性羧基末端结构
域并通过ERAD系统识别该结构域(参见Di R等人,Toxicon 57:525-39(2011)；Li S等人,
PLoS One 7:e41119(2012))。

[0545] 对于包含志贺毒素A亚基衍生物的分子缺乏中毒细胞介导的弗林蛋白酶切割事件可以假设地得到补偿。潜在的补偿方法的非限制性实例包括:1)使构建体的一个羧基端以
志贺毒素A1片段样多肽区的羧基端终止，2)制备志贺毒素来源的构建体，以使志贺毒素A亚
基多肽在其志贺毒素A1片段样多肽的羧基端附近已带切口(nicked)，3)工程改造异源的
和/或异位的蛋白酶位点，其可以在功能上替代天然的志贺毒素弗林蛋白酶切割事件的缺
乏，和4)方法3和方法4的组合。

[0546] 在第一种方法中，志贺毒素A1片段样多肽的羧基端没有被任何羧基端结构部分覆盖，并且由此，志贺毒素A1片段样多肽的羧基端永久性地暴露，用以被内质网中的ERAD机制
识别。在后三种方法中，可以将志贺毒素A1片段样多肽设计成这样：当分子到达中毒细胞的
内质网时，在细胞内与构建体的一个或更多个其他成分解离，从而在内质网中，所述志贺毒
素A1片段样多肽的羧基端变为暴露的，用以被ERAD机制识别。例如，包含志贺毒素A亚基效
应多肽的细胞毒性分子可以在接触靶细胞之前用蛋白酶预处理，以将A1片段样区域的羧基
末端附近的多肽区域切开。备选地，细胞毒性分子可以被工程改造以包含被靶细胞的细胞
内蛋白酶切割的蛋白酶位点。

[0547] 这些用于设计补偿缺乏中毒细胞介导的弗林蛋白酶切割事件的志贺毒素A亚基效应多肽的假设方法,与野生型志贺全毒素或仅包含包括最佳的天然存在的弗林蛋白酶切割
位点的野生型序列的志贺毒素A亚基构建体相比，可以显著改变细胞毒性的效率和效力。例
如,目前还没有已知依赖于除弗林蛋白酶外的靶细胞的内切蛋白酶的补偿方法，所述补偿
方法可以提供与弗林蛋白酶切割等价的完全的补偿性细胞毒性，并且，已经证明针对弗林
样钙蛋白酶的备选的细胞蛋白酶在促进志贺毒素细胞毒性方面的有效性较低(Garred O等
人,Exp Cell Res 218:39-49(1995)；Garred O等人,J Biol Chem 270:10817-21(1995)；
Kurmanova A等人,Biochem Biophys Res Commun 357:144-9(2007))。

[0548] 本发明提供了弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应多肽，其是强效地细胞毒性的，无论是由于补偿了中毒细胞中弗林蛋白酶切割事件的缺乏还是由于某些未解释的
原因。本发明的某些细胞靶向分子至少与包含蛋白酶切割敏感的野生型志贺毒素效应多肽
区域的细胞靶向分子是同样有效和强效地细胞毒性的(参见例如，WO 2016/196344)。

[0549] C.改善稳定性和体内耐受性

[0550] 在某些实施方案中，与更加弗林蛋白酶切割敏感性类似物和/或更少去免疫的类似物(类似物是缺乏本发明的一种或更多种结构特征的密切相关的分子)相比，本发明的分
子(例如，本发明的细胞靶向分子)表现出增加的稳定性和/或改善的体内耐受性。

[0551] 与参照分子相比，细胞靶向分子的增加的稳定性可以在体外和/或体内表现出来。治疗或诊断分子随时间的稳定性是一个重要特征，并且可以影响可实际采用该分子用于哪
些应用。分子稳定性包括体外和体内，例如，在施用后和在一系列温度和浓度下储存期间，
生物体内的稳定性。对于某些免疫毒素或配体-毒素融合，毒素和其他组分之间的连接的稳
定性可以在生物体内随时间影响由非靶向毒素的存在和/或数量引起的非特异性毒性的
量。

[0552] 与更加蛋白酶切割敏感性变体相比，本发明的某些细胞靶向分子在体内表现出降低的非特异性毒性，表现为体内耐受性增加。体内耐受性能够由本领域技术人员使用本领
域已知的和/或本文所述的技术确定。除了使用死亡率评估体内耐受性之外，发病率的迹象
可用于评估体内耐受性，例如体重、身体外观，可测量的临床体征，无端行为和对外部刺激
的反应的方面(参见例如Morton D,Griffiths P,Vet Rec 116:431-43(1985)；Montgomery
C,Cancer Bull 42:230-7(1990)；Ullman-CulleréM,Foltz C,Lab Anim Sci 49:319-23
(1999)；Clingerman K,Summers L,J Am Assoc Lab Anim Sci 51:31-6(2012))。安乐死可
以用于响应发病率和/或病态的体征，并因此产生死亡时间点。例如，在啮齿动物中，在2-3
天内体重减少15-20％可用作发病体征，并且用作安乐死的判断(参见，例如Institute of
Laboratory Animal Research 2011.Guide for the care and use of laboratory
animals,第8版,Washington,DC,U.S.:National Academies Press)

[0553] 与更多弗林蛋白酶切割敏感性类似物相比，本发明的示例性细胞靶向分子的观察到的改善的体内耐受性表明，与包含弗林蛋白酶切割敏感的志贺毒素效应多肽区域的相关
分子的剂量相比，本发明的这些细胞靶向分子的更高剂量可以安全地施用于哺乳动物。与
更多蛋白酶切割敏感性的变体相比，本发明的某些细胞靶向分子可能表现出降低的非特异
性毒性，原因在于蛋白酶耐受性起作用保护并且保留志贺毒素效应子成分与细胞靶向性结
构部分成分之间的连接。

[0554] 此外，本发明的细胞靶向分子的体内耐受性可能与给定细胞靶向分子的去免疫化特性有关。因此，与包含“未去免疫化”或较少去免疫化的志贺毒素效应多肽的相关分子(例
如野生型志贺毒素A1片段)的剂量相比，可以将更高剂量的本发明的这种去免疫化的细胞
靶向分子安全地施用于哺乳动物。

[0555] 此外，与更加蛋白酶切割敏感性变体相比，本发明的某些分子在体外和/或体内都表现出增加的半衰期。分子稳定性能够通过测定目标分子关于其组分缔合的半衰期来测
定。与弗林蛋白酶切割敏感性变体相比，本发明分子的某些实施方案将具有更长的半衰期，
特别是在志贺毒素效应多肽组分与一种或更多种其他组分的持续缔合方面。例如，与弗林
蛋白酶切割敏感变体相比，本发明分子的某些实施方案关于志贺毒素效应多肽组分与另一
种组分(例如，细胞靶向结合区域)的持续缔合具有更长的半衰期，其中弗林蛋白酶切割敏
感位点位于那两种组分之间。

[0556] D.通过志贺毒素A亚基细胞毒性的细胞杀伤

[0557] 本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的。本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案仅由于存在一种或更多种志贺毒素效应多肽组分
而是细胞毒性的。志贺毒素家族成员的A亚基各自包含能够一旦在细胞的胞质溶胶中就杀
伤真核细胞的酶活性多肽区域。因为志贺毒素家族的成员适于杀伤真核细胞，所以来源于
志贺毒素的分子，例如包含本发明的志贺毒素效应多肽的某些实施方案的分子可以表现出
强效的细胞杀伤活性。

[0558] 对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，一旦与细胞靶向分子(例如靶阳性细胞)的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞接触，细胞靶向分子就能够引起细
胞死亡。对于某些进一步的实施方案，细胞靶向分子的CD50值小于5、2.5、1、0.5或0.25nM，其远比非靶向的野生型志贺毒素效应多肽(例如SEQ ID NO:1–18)更强效。

[0559] 细胞杀伤可以在靶细胞的不同条件下使用本发明的分子完成，例如，离体操作的靶细胞，体外培养的靶细胞，体外培养的组织样品中的靶细胞，或如在多细胞生物体内的体
内环境中的靶细胞。

[0560] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子包含(1)去免疫化的志贺毒素效应亚区，(2)志贺毒素A1片段来源区的羧基末端附近的蛋白酶切割抗性区，
(3)羧基末端，内质网保留/回收信号基序；和/或(4)异源性T细胞表位嵌入或插入的区域；
然而，对于某些进一步的实施方案，与包含野生型志贺毒素A亚基多肽的参照分子(例如野
生型志贺毒素A1片段)相比，这些结构修饰不会显著改变志贺毒素细胞毒性的效力。因此，
去免疫化的抗蛋白酶切割和/或携带嵌入或插入的异源性表位的本发明的志贺毒素效应多
肽和细胞靶向分子可以保持有效的细胞毒性，同时提供一种或更多种其他功能或性质。

[0561] 包含志贺毒素效应多肽的已有细胞毒性细胞靶向分子可以由本领域技术人员使用本文提供的信息和方法工程改造以更具细胞毒性和/或具有通过完全不同的机制操作的
冗余的备份细胞毒性。这些多种细胞毒性机制可以通过其功能的多样性(诸如通过细胞杀
伤的直接和间接的两种机制以及对局部区域进行免疫刺激的机制提供强效杀伤)，冗余地
彼此支持(诸如，在没有其他机制—像如果靶细胞对先前活性机制的子集具有抗性或获得
一定免疫力—的情况下提供一种细胞杀伤机制)，和/或保护免于发展的抗性(通过将抗性
限于恶性的或受感染的细胞的更少可能的情形，以同时阻断多种不同的细胞杀伤机制)而
互补。

[0562] E.在细胞表面上递送用于MHC I类呈递的T细胞表位

[0563] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子包含T细胞表位，其能够工程化具有表位-肽货物的几乎无限制的选择的“T细胞表位递送”分子，用于通过有
核的脊索动物细胞递送和细胞表面呈递。对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应多肽
和细胞靶向分子各自能够将与志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子缔合的一种或更多种
T细胞表位递送至细胞的蛋白酶体。然后将递送的T细胞表位进行蛋白水解加工，并通过细
胞表面上的MHC I类途径呈递。通过将MHC I类表位工程化到细胞靶向分子内，可以实现免
疫刺激抗原的靶向递送和呈递，以便驾驭和指导脊索动物免疫系统的有益功能。

[0564] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将T细胞表位递送至细胞的MHC I类分子用于细胞表面呈递。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽或细胞靶向分
子包含异源性T细胞表位，无论是作为另外的外源性物质还是嵌入或插入志贺毒素效应多
肽中。对于某些进一步的实施方案，本发明的志贺毒素效应多肽或细胞靶向分子能够将嵌
入或插入的T细胞表位递送至MHC I类分子用于细胞表面呈递。

[0565] 对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应多肽能够将嵌入或插入志贺毒素效应多肽的T细胞表位递送至细胞的MHC I类分子，其中存在志贺毒素效应多肽用于在细胞表面
上通过MHC I类分子呈递T细胞表位。对于某些进一步的实施方案，T细胞表位是异源性T细
胞表位。对于某些进一步的实施方案，T细胞表位作为CD8+T细胞表位起作用，无论是已知的
还是将来使用本领域技术人员目前常规的方法鉴定。

[0566] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将与细胞靶向分子缔合的T细胞表位递送至用于在细胞表面上通过MHC I类分子的T细胞表位呈递的细胞的MHC I类分子。
对于某些进一步的实施方案，T细胞表位是嵌入或插入志贺毒素效应多肽的异源性T细胞表
位。对于某些进一步的实施方案，T细胞表位作为CD8+T细胞表位起作用，无论是已知的还是
将来使用本领域技术人员目前常规的方法鉴定。

[0567] 对于某些实施方案，一旦将细胞与本发明的细胞靶向分子结合，该细胞靶向分子就能够将与细胞靶向分子缔合的T细胞表位-肽递送至细胞的MHC I类分子用于在细胞表面
上通过MHC I类分子呈递T细胞表位。对于某些进一步的实施方案，T细胞表位-肽是嵌入或
插入志贺毒素效应多肽的异源性T细胞表位。对于某些进一步的实施方案，T细胞表位-肽作
为CD8+T细胞表位起作用，无论是已知的还是将来使用本领域技术人员目前常规的方法鉴
定。

[0568] 在将异源性表位添加到本发明的细胞靶向分子中，或本发明的细胞靶向分子中存在异源性表位，是否作为另外的外源性物质还是在志贺毒素效应多肽中嵌入的或插入的，
都能够使得使用这种细胞靶向分子用于所选择的表位的细胞靶向递送用于通过脊索动物
内的有核靶细胞进行细胞表面呈递的方法。

[0569] 本发明的某些CD8+T细胞超免疫化的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的一个功能是将一种或更多种T细胞表位-肽递送至MHC I类分子用于通过细胞的MHC I类分子呈递。
将外源性T细胞表位-肽递送至靶细胞的MHC I类系统可用于诱导靶细胞以呈递与细胞表面
上的MHC I类分子缔合的T细胞表位-肽，其随后导致CD8+效应T细胞的活化以攻击靶细胞。

[0570] 使用本领域已知技术的技术人员可以将本发明的某些志贺毒素效应多肽与各种其他细胞靶向结合区域缔合、偶联和/或连接以产生本发明的细胞靶向分子，所述本发明的
细胞靶向分子靶向与细胞物理偶联并促进这些细胞靶向分子的靶细胞内化的特异性细胞
外靶生物分子。据信所有有核脊椎动物细胞都能够使用MHC I类系统呈递细胞内表位。因
此，本发明的细胞靶向分子的细胞外靶生物分子原则上可以靶向任何有核脊椎动物细胞用
于将T细胞表位递送至这种细胞的MHC I类呈递途径。

[0571] 本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的表位递送功能可以通过本领域技术人员已知的和/或本文描述的多种标准方法检测和监测。通过本领域技术人员已知的多
种标准方法，可以检测和监测这些功能。例如，使用多种体外和体内测定法，可以研究本发
明的细胞靶向分子递送T细胞表位肽并驱动靶细胞的MHC I类系统对表位肽的呈递的能力，
所述测定法包括，例如，MHC I类/肽复合物的直接检测/可视化、测量异源T细胞表位肽对
MHC I类分子的结合亲合力和/或通过监测细胞毒性-T淋巴细胞(CTL)应答测量靶细胞上的
MHC I类-肽复合物呈递的功能后果(参见例如实施例，下文)。

[0572] 用于监测本发明的多肽和分子的这种功能的某些测定法涉及在体外或离体直接检测特定MHC I类/肽抗原复合物。用于肽-MHC I类复合物的直接可视化和定量的常见方法
涉及技术人员已知的多种免疫检测试剂。例如，可以开发特异性的单克隆抗体来识别特定
MHC/I类/肽抗原复合物。类似地，可溶性的多聚体T细胞受体诸如TCR-STAR试剂(Altor
Bioscience Corp.,Mirmar,FL,U.S.)可以用于直接显示或量化特定MHC I/抗原复合物
(Zhu X等人,J Immunol 176:3223-32(2006))。这些特异性的mAb或可溶性的多聚体T细胞
受体可以与多种检测方法(包括，例如免疫组织化学、流式细胞术和酶联免疫测定(ELISA))
一起使用。

[0573] 用于直接鉴别和定量MHC I/肽复合物的一种替代方法涉及质谱法分析，例如，ProPresent Antigen Presentation Assay(ProImmune,Inc.,Sarasota,FL,U.S.)，其中从
细胞表面提取肽-MCH I类复合物，然后通过测序质谱法纯化和鉴别所述肽(Falk K等人,
Nature 351:290–6(1991))。

[0574] 在监测本发明的多肽和分子的T细胞表位递送和MHC I类呈递功能的某些测定中涉及计算和/或实验方法以监测MHC I类和肽结合和稳定性。几种软件程序可供技术人员使
用，用于预测肽对MHC I类等位基因的结合应答，例如，The Immune Epitope Database and
Analysis Resource(IEDB)Analysis Resource MHC-I结合预测Consensus tool(KimY等
人,Nucleic Acid Res 40:W525-30(2012)。几种实验性测定已经常规地应用，例如，细胞表
面结合测定和/或表面等离振子共振测定，以定量和/或比较结合动力学(Miles K等人,Mol
Immunol 48:728-32(2011))。另外，已经开发了其它MHC-肽结合测定(例如，来自
ProImmmune,Inc.的MHC-肽结合测定)，与已知的对照对比，其基于肽稳定给定MHC I类等位
基因的三元MHC-肽复合物的能力的量度。

[0575] 备选地，通过监测对特定复合物的细胞毒性T细胞(CTL)应答，可以执行细胞表面上的MHC I类/肽抗原复合物呈递的后果的测量。这些测量包括用MHC I类四聚体或五聚体
试剂直接标记CTL。四聚体或五聚体直接结合特定特异性的T细胞受体，取决于主要组织相
容性复合物(MHC)等位基因和肽复合物。另外，通常测定通过ELISA或酶联免疫斑点
(ELIspot)对释放的细胞因子(诸如干扰素γ或白介素)的定量以鉴别特定CTL应答。使用许
多测定，包括经典的51铬(Cr)释放测定或替代性的非放射性的细胞毒性测定(例如，
非放射性的试剂盒和CellToxTM 试剂盒，可得自Promega
Corp.,Madison,WI,U.S.)、Granzyme B ELISpot、Caspase Activity Assays或LAMP-1易位
流式细胞计数测定，可以测量CTL的细胞毒性能力。为了特异性地监测靶细胞的杀伤，羧基
荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)可以用于容易地和快速地标记目标细胞群体用于体外
或体内研究以监测表位特异性的CSFE标记的靶细胞的杀伤(Durward M等人,J Vis Exp
45pii 2250(2010))。

[0576] 可以如下跟踪对MHC I类呈递的体内应答：施用MHC I类/抗原促进剂(例如，肽、蛋白质或失活的/减弱的病毒疫苗)，然后用活性剂(例如病毒)攻击，并监测对该活性剂的应
答，典型地与未接种疫苗的对照进行对比。用与前述的那些(例如CTL细胞毒性测定和细胞
因子释放的定量)类似的方法，可以针对CTL活性监测离体样品。

[0577] 使用免疫亲和力(例如，抗MHC抗体“下拉(pulldown)”纯化)在裂解后从中毒细胞中分离HLA-A、HLA-B和/或HLA-C分子且相关肽(即，分离的MHC分子呈递的肽)从纯化的复合
物中回收。通过测序质谱法分析回收的肽。将质谱数据与蛋白质数据库文库进行比较，所述
蛋白质数据库文库由外源性(非自身)肽(T细胞表位X)的序列和国际人类蛋白索引(代表
“自身的”或非免疫原性的肽)组成。根据概率数据库，将所述肽按照重要性排序。将所有检
测的抗原(非自身)肽序列列出。通过检索乱序诱饵数据库来验证数据以减少伪命中(参见
例如Ma B,Johnson R,Mol Cell Proteomics 11:O111.014902(2012))。结果将证实，来自T
细胞表位X的肽在MHC复合物中呈递到中毒靶细胞的表面上。

[0578] 由于表达的抗原-特异性的HLA分子，呈递的肽-抗原-MHC复合物的集合可以在细胞之间变化。T细胞然后可以使用具有不同抗原特异性的不同TCR分子识别在细胞表面上展
示的特定肽-抗原-MHC复合物。

[0579] 因为本发明的细胞靶向分子可以递送多个T细胞表位，例如，通过将两个或更多个不同的T细胞表位嵌入在单个蛋白酶体递送效应物多肽中，所以本发明的单个细胞靶向分
子可以在具有不同MHC类别变体的相同物种的脊索动物中(例如，在具有不同HLA等位基因
的人类中)是有效的。这可允许基于MHC复合物蛋白多样性和多态性在不同的受试者亚群中
在具有不同有效性的不同T细胞表位的单个分子内组合。例如，人MHC复合物蛋白、HLA蛋白
基于遗传世系在人类中变化，例如非洲人(亚撒哈拉)、美国印第安人、高加索人、蒙古人、新
几内亚人和澳大利亚人或太平洋岛人。

[0580] 涉及递送本发明的多肽和分子的T细胞表位的应用是广阔的。哺乳动物生物体中的每个有核细胞都能够实现在其细胞外表面上MHC I类途径呈递与MHC I类分子复合的免
疫原性T细胞表位-肽。此外，T细胞表位识别的灵敏性如此精确以致于只需要呈递少量MHC-
I肽复合物即可产生免疫反应，例如，即使呈递单个复合物也足以通过效应T细胞识别
(Sykulev Y等人,Immunity 4:565–71(1996))。

[0581] T细胞应答的活化是某些抗癌、抗赘生物、抗肿瘤和/或抗-微生物生物药物的期望特征，以刺激患者自身的针对靶向细胞的免疫系统。稳健的和强烈的T细胞应答的活化也是
许多疫苗的期望特征。生物体内靶细胞对T细胞表位的呈递可以导致针对生物体靶细胞和/
或它的一般场所的稳健免疫应答的活化。因而，可以利用用于呈递的T细胞表位的靶向递送
作为在治疗方案期间活化T细胞应答的机制。

[0582] 通过MHC I类系统对T细胞免疫原性表位-肽的呈递靶向呈递细胞用于通过CTL介导的裂解来杀伤并且还引发局部微环境中的免疫刺激。通过在靶细胞内化治疗分子的志贺
毒素效应多肽组分内工程化免疫原性表位序列，可以实现免疫刺激抗原的靶向递送和呈
递。免疫刺激性非自身抗原(例如具有高免疫原性的已知病毒抗原)的通过靶细胞的呈递，
向其他免疫细胞发出信号以破坏靶细胞以及向该区域招募更多的免疫细胞。

[0583] 免疫原性T细胞表位-肽的通过MHC I类复合物的呈递靶向呈递细胞用于通过CTL介导的细胞溶解进行杀伤。免疫刺激性非自身抗原(例如具有高免疫原性的已知病毒表位-
肽)的通过靶细胞的呈递能够向其他免疫细胞发出信号以破坏靶细胞以及在脊索动物内的
靶细胞位点招募更多的免疫细胞。

[0584] 因此，已经是细胞毒性分子，例如包含志贺毒素效应多肽的治疗性或潜在治疗性分子，可使用本发明的方法经工程改造成更具细胞毒性的分子和/或具有通过T细胞表位的
递送、呈递和效应T细胞的刺激而起作用的另外的细胞毒性机制。这些多种细胞毒性机制可
以互补(诸如通过提供直接靶细胞杀伤和间接(CTL-介导的)细胞杀伤、冗余地彼此支持(诸
如在没有其它存在下提供一种细胞杀伤机制)和/或保护免于治疗剂抗性的发展(通过将抗
性限于恶性的或受感染的细胞演化的更少可能的情形，以同时阻断两种不同的细胞杀伤机
制)。

[0585] 此外，本领域技术人员可以使用常规方法将包含表现出基于催化的细胞毒性的志贺毒素效应多肽区域的细胞毒性分子经工程改造成酶失活的变体。例如，细胞毒性分子的
细胞毒性志贺毒素效应多肽组分可以通过引入一个或突变和/或截短而赋予降低的活性
和/或无活性，使得所得分子通过其递送T细胞表位至靶细胞的MHC I类系统的能力以及随
后到靶细胞的表面的呈递仍然可以是细胞毒性的。在另一个实例中，可以将T细胞表位插入
或嵌入志贺毒素效应多肽中，使得志贺毒素效应多肽通过该添加的表位而失活(参见例如
WO 2015/113005)。该方法除去一种细胞毒性机制，同时保留或添加另一种细胞毒性机制，
并且还可以提供能够通过递送的T细胞表位呈递或“抗原接种”对生物体内的靶细胞的局部
区域表现出免疫刺激的分子。此外，包含嵌入或插入的异源性T细胞表位的本发明的细胞靶
向分子的非细胞毒性变体可用于涉及脊索动物内的免疫刺激和/或用MHC I类分子展示的
表位标记脊索动物内靶细胞的应用中。

[0586] 递送本发明的某些志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的T细胞表位的能力可以在各种条件下以及在非靶向旁观者细胞的存在下完成，例如，离体操作的靶细胞，体外培养的
靶细胞，体外培养的组织样品中的靶细胞，或如在多细胞生物体内的体内环境中的靶细胞。

[0587] F.通过靶向细胞毒性和/或细胞毒性T细胞的参与杀伤细胞

[0588] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子可以提供1)用于通过靶细胞的MHC I类呈递的T细胞表位的递送和/或2)强效的细胞毒性。对于本发明的细胞靶向分子的某些实
施方案，一旦接触与细胞靶向结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，本发明的细
胞靶向分子就能够导致细胞死亡。细胞杀伤的机制可以是直接的，例如通过毒素效应多肽
区域的酶活性，或是间接的，通过CTL介导的细胞溶解。

[0589] 1.通过T细胞表位递送和MHC I类呈递的间接细胞杀伤

[0590] 本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的，因为它们包含能够被递送至靶细胞的MHC I类呈递途径并呈递在靶细胞的细胞表面上的CD8+T细胞表位。例如，在有
或没有内源性表位去免疫化的情况下，本发明的T细胞表位递送的、CD8+T细胞超免疫化的
志贺毒素效应多肽，可用作涉及间接细胞杀伤的应用的细胞靶向分子的组分。

[0591] 在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，一旦接触与细胞靶向结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，本发明的细胞靶向分子就能够间接导致细胞死亡，例如
通过靶细胞的一种或更多种T细胞表位的呈递以及随后的杀伤靶细胞的CTL的招募。

[0592] 通过细胞呈递与MHC I类分子复合的抗原肽使呈递细胞敏化以通过细胞毒性T细胞(CTL)通过诱导细胞凋亡、裂解和/或坏死进行靶向杀伤。此外，识别靶细胞的CTL可释放
免疫刺激细胞因子，例如γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF)、巨噬细胞炎性蛋白-1β
(MIP-1β)和白细胞介素诸如IL-17、IL-4和IL-22。此外，通过识别所呈递的表位而激活的
CTL可以不加选择地杀伤邻近呈递细胞的其他细胞，而不管那些邻近细胞所呈递的肽-MHC
I类复合物库(Wiedemann A等人,Proc Natl Acad Sci USA 103:10985-90(2006))。

[0593] 由于不同物种内的MHC等位基因多样性，仅包含单个表位的本发明的细胞靶向分子可以对相同物种的不同患者或受试者表现出不同的有效性。然而，本发明的细胞靶向分
子的某些实施方案可各自包含能够同时递送至靶细胞的MHC I类系统的多个T细胞表位。因
此，对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，细胞靶向分子用于治疗在其MHC分子的表
位-肽结合亲和力存在显著差异(即其MHC等位基因和/或MHC基因型中的显著差异)的不同
的受试者。此外，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案通过同时使用多种细胞杀伤机制
降低或防止靶细胞适应性以逃避(例如靶癌细胞突变以逃避治疗有效性或“突变体逃逸”)
杀伤(例如，直接杀伤和同时通过多种不同的T细胞表位的间接杀伤)。

[0594] 2.通过细胞靶向的志贺毒素细胞毒性的直接细胞杀伤

[0595] 本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的，因为它们包含催化活性的志贺毒素效应多肽，并且不管该分子中是否存在免疫原性的CD8+T细胞表位。例如，在有或
没有内源性表位去免疫化的情况下本发明的CD8+T细胞超免疫化的志贺毒素效应多肽可用
作涉及直接细胞杀伤的应用的细胞靶向分子的组分，例如，通过志贺毒素效应多肽的核糖
毒性的酶活性，或核糖体结合以及由于非催化机制的核糖体功能的干扰。

[0596] 对于本发明的CD8+T细胞的超免疫化的细胞靶向分子的某些实施方案，一旦接触与细胞靶向结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，本发明的细胞靶向分子就能够
直接导致细胞死亡，例如不涉及非靶向的细胞毒性T细胞(参见上文第VD节)。

[0597] G.细胞类型之间的选择性细胞毒性

[0598] 本发明的某些细胞靶向分子具有在非靶向旁观者细胞存在下选择性杀伤特定靶细胞的用途。通过经细胞靶向结合区域将本发明的志贺毒素效应多肽递送到特定细胞，本
发明的细胞靶向分子可以表现出细胞类型特异性的受限制的细胞杀伤活性，导致在存在非
靶向细胞的情况下排他性或优先杀伤所选择的细胞类型。类似地，通过靶向免疫原性T细胞
表位至靶细胞的MHC I类途径的递送，随后的T细胞表位的呈递和由本发明的细胞靶向分子
诱导的靶细胞的CTL介导的细胞溶解可以在非靶向细胞存在下，限制至排他性或优先杀伤
所选择的细胞类型。此外，细胞毒性的志贺毒素效应多肽区域和免疫原性T细胞表位的细胞
靶向递送均可通过本发明的单个细胞靶向分子实现，使得在非靶向细胞存在下，两种潜在
细胞毒性组分的递送排他性或优先局限于靶细胞。

[0599] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在某些浓度下是细胞毒性的。在某些实施方案中，将本发明的细胞靶向分子施用于细胞类型的混合物时，和不与细胞外靶生物
分子物理偶联的细胞类型相比，该细胞毒性细胞靶向分子就能够选择性地杀伤与那些细胞
外靶生物分子物理偶联的细胞。对于某些实施方案，本发明的细胞毒性细胞靶向分子能够
在两种或更多种不同细胞类型的混合物中选择性地或优先地引起特定细胞类型的死亡。这
使得能够将细胞毒性活性以高优先性靶向特定细胞类型，例如为不表达靶生物分子的“旁
观者”细胞类型3倍的细胞毒性效应。备选地，结合区域的靶生物分子的表达可以对一种细
胞类型是非排他性的，如果该靶生物分子以足够低的量表达和/或以低量与不被靶向的细
胞类型物理偶联。这使得特定细胞类型的靶向细胞杀伤与不表达显著量的靶生物分子或不
与显著量的靶生物分子物理偶联的“旁观者”细胞类型相比能够具有高优先性，诸如3倍细
胞毒性效应。

[0600] 在某些进一步实施方案中，在将细胞毒性细胞靶向分子施用给两种不同的细胞型群体后，细胞毒性细胞靶向分子能够造成细胞死亡，如通过关于靶细胞群体(其成员表达细
胞毒性细胞靶向分子的结合区的细胞外靶生物分子)的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所确
定的，其剂量比相同细胞毒性细胞靶向分子对于其成员不表达细胞毒性细胞靶向分子的结
合区的细胞外靶生物分子的细胞群体的CD50剂量低至少3倍。

[0601] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子对与细胞外靶生物分子物理偶联的细胞型的群体的细胞毒活性比对不与结合区的任何细胞外靶生物分子物理偶联的细胞型群
体的细胞毒活性高至少3倍。根据本发明，可以以下述比率(a/b)的方式定量选择性的细胞
毒性：(a)对与结合区的靶生物分子物理偶联的特定细胞型的细胞群体的细胞毒性与(b)对
不与结合区的靶生物分子物理偶联的细胞型的细胞群体的细胞毒性的比率。在某些实施方
案中，所述细胞毒性比率表明相对于没有与结合区的靶生物分子物理偶联的细胞或细胞型
的群体，对与结合区的靶生物分子物理偶联的细胞或细胞型的群体选择性的细胞毒性为至
少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或
1000倍高。

[0602] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子的优先细胞杀伤功能或选择性细胞毒性是由于在本发明的志贺毒素效应多肽中存在另外的外源性物质(例如细胞毒性物质)和/
或异源性T细胞表位，且不一定是志贺毒素效应多肽区域的催化活性的结果。

[0603] 这种优先的细胞杀伤功能允许在不同条件下和存在非靶向旁观者细胞时，被靶向的细胞被本发明的某些细胞毒性细胞靶向分子杀伤，例如离体操作的细胞类型混合物、具
有细胞类型混合物的体外培养组织或在多种细胞类型存在下的体内(例如原位或在多细胞
生物体内的天然位置)。

[0604] H.将额外的外源性物质递送到被靶向的细胞的内部

[0605] 除了细胞毒性、细胞抑制和免疫刺激应用之外，本发明的细胞靶向分子任选地可以用于被靶向的细胞内递送功能，例如，在涉及信息收集和诊断功能的应用中。

[0606] 因为本发明的细胞靶向分子，包括其降低的细胞毒性和/或无毒形式，能够进入与细胞靶向分子的结合区域识别的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，本发明的细胞靶向分
子的某些实施方案可用于将另外的外源性物质递送到被靶向的细胞类型的内部。例如，本
发明的细胞毒性细胞靶向分子的无毒变体或任选的细胞毒性变体，用于将另外的外源性物
质递送至和/或标记与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞内
部。用于接收外源物质的本发明的细胞靶向分子可以靶向表达靶生物分子到至少一个细胞
表面的不同类型的细胞和/或细胞群体。本发明的功能组分是模块化的，原因在于各种志贺
毒素效应多肽，另外的外源性物质和结合区域可以彼此缔合以提供适合于涉及货物递送的
多种应用(诸如，例如肿瘤细胞的非侵入性体内成像)的细胞靶向分子。

[0607] 本发明的某些细胞靶向分子的外源性物质功能的此递送可以在各种条件下以及在非靶向旁观者细胞的存在下完成，例如，离体操作的靶细胞，体外培养的靶细胞，体外培
养的组织样品中的靶细胞，或如在多细胞生物体内的体内环境中的靶细胞。此外，通过本发
明的某些细胞靶向分子，外源性物质至某些细胞的选择性递送可以在各种条件下和在非靶
向旁观者细胞存在下完成，诸如离体操作的细胞类型混合物、具有细胞类型混合物的体外
培养组织或在多种细胞类型存在下的体内(例如原位或在多细胞生物体内的天然位置)。

[0608] 不能(例如一定浓度范围)杀伤靶细胞和/或递送嵌入或插入的表位用于通过靶细胞的MHC分子的细胞表面呈递的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子，仍然可用于将外源性
物质递送到细胞中，例如检测促进剂。

[0609] 对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应多肽表现出低至零的细胞毒性，因此在本文中称为“非细胞毒性和/或降低的细胞毒性”。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向
分子表现出低至零的细胞毒性，并且可以称为“非细胞毒性”和/或“降低的细胞毒性的变
体”。例如，本发明的分子的某些实施方案没有表现出显著水平的基于志贺毒素的细胞毒
性，其中在小于1000nM、500nM、100nM、75nM、50nM的剂量下，与合适的参照分子相比，没有显著量的细胞死亡，例如通过技术人员已知的和/或本文所述的测定法测量。对于某些进一步
的实施方案，本发明的分子在1-100μg/kg哺乳动物受体的剂量下不表现出任何毒性。降低
的细胞毒性变体在某些浓度或剂量下仍可能是细胞毒性的，但表现出降低的细胞毒性，例
如，在某些情况下不能表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。

[0610] 本发明的志贺毒素效应多肽和包含其的某些细胞靶向分子可以呈现为非细胞毒性的，例如通过添加技术人员已知的一种或更多种氨基酸置换以使志贺毒素A亚基和/或志
贺毒素效应多肽失活，包括本文所述的示例性置换。本发明的细胞靶向分子的非细胞毒性
和降低的细胞毒性的变体在某些情况下可能比更具细胞毒性的变体更适合于递送另外的
外源性物质。

[0611] 用于诊断功能的信息收集

[0612] 在本发明的某些细胞靶向分子中具有在体外和/或体内检测特定细胞、细胞类型和/或细胞群，以及任何前述的特定亚细胞区室的用途。与检测促进剂缀合的本发明细胞毒
性细胞靶向分子的降低的细胞毒性和/或无毒形式任选地可用于诊断功能，诸如用于与包
含相同或相关结合区域(例如，与相同的靶生物分子、重叠表位和/或相同表位具有高亲和
力结合的结合区域)的治疗方案结合使用的伴随诊断。

[0613] 在某些实施方案中，本文所描述的细胞靶向分子用于诊断和治疗，或单独用于诊断。当相同的细胞毒性细胞靶向分子用于诊断和治疗时，对于本发明的某些实施方案，掺入
用于诊断的检测促进剂的细胞靶向分子变体可以经由一种或更多种氨基酸置换(包括本文
所描述的示例性置换)通过其志贺毒素效应多肽区域的催化失活降低其细胞毒性或导致其
无毒。例如，在施用小于1mg/kg的剂量后，本发明的细胞靶向分子的某些无毒变体表现出小
于5％、4％、3％、2％或1％的靶细胞死亡。降低的细胞毒性变体在某些浓度或剂量下仍可能
是细胞毒性的，但表现出降低的细胞毒性，例如，不能表现出显著水平的如本文所述志贺毒
素细胞毒性。

[0614] 将本领域已知的检测促进剂与本发明的各种细胞靶向分子缀合的能力会提供用于检测某些细胞，诸如癌症、肿瘤、免疫和/或被感染的细胞的有用组合物。通过本领域已知
的各种成像技术和测定，本发明的细胞靶向分子的这些诊断实施方案可以用于信息收集。
例如，通过患者或活组织检查样品中各个癌细胞、免疫细胞和/或受感染的细胞的细胞内细
胞器(例如内吞隔室、高尔基体、内质网和细胞溶质隔室)的成像，本发明的细胞靶向分子的
诊断实施方案可以用于信息收集。

[0615] 使用本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可以收集不同类型的信息，无论用于诊断用途还是其它用途。该信息可用于，例如，诊断赘生性细胞类型，确定患者的疾病的治
疗敏感性，测定抗肿瘤治疗随时间的进展，测定免疫调节治疗随时间的进展，测定抗微生物
治疗随时间的进展，评价受感染的细胞在移植材料中的存在，评价不希望的细胞类型在移
植材料中的存在，和/或评价肿瘤块的外科手术切除以后残余肿瘤细胞的存在。

[0616] 例如，使用用本发明的细胞靶向分子的诊断变体收集的信息，可以确定患者亚群，然后可以基于使用那些诊断实施方案揭示的他们的独特特征将各个患者进一步分类成亚
群。例如，特定药物或治疗的有效性可能是用于定义患者亚群的判据。例如，可以使用本发
明的特定细胞毒性细胞靶向分子的无毒诊断变体区分哪些患者属于预期对本发明的那个
细胞靶向分子的细胞毒性变体做出阳性应答的患者的类别或亚群。因此，使用本发明的细
胞靶向分子(包括本发明的细胞毒性细胞靶向分子的无毒变体)进行患者鉴别、患者分级和
诊断的有关方法被认为是在本发明范围内

[0617] 细胞对靶生物分子的表达不需要是天然的，以便通过本发明的细胞靶向分子进行细胞靶向，例如，用于直接细胞杀伤、间接细胞杀伤、外源性物质如T细胞表位的递送和/或
信息收集。靶生物分子的细胞表面表达可以是感染、病原体的存在和/或细胞内微生物病原
体的存在的结果。靶生物分子的表达可以是人工的，例如，在用病毒表达载体感染后通过强
制或诱导表达，参见例如，腺病毒、腺伴随病毒和逆转录病毒系统。HER2的表达可以通过将
细胞暴露于电离辐射来诱导(Wattenberg M等人,Br J Cancer 110:1472-80(2014))。

[0618] VI.本发明的志贺毒素效应多肽和包含其的细胞靶向分子的生产、制备和纯化

[0619] 本发明的志贺毒素效应多肽和某些细胞靶向分子可以使用对本领域技术人员来说公知的技术生产。例如，本发明的志贺毒素效多肽和细胞靶向分子可以通过标准合成方
法、利用重组表达系统，或者通过任何其他适合的方法生产。因此，本发明的志贺毒素效应
多肽和细胞靶向分子可以以多种方式合成，包括，例如包括下列各项的方法：(1)使用标准
固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成细胞靶向分子的多肽或多肽组分，并且将
最终的多肽化合物产物分离并纯化；(2)在宿主细胞中表达编码本发明的细胞靶向分子的
蛋白质或蛋白质组分的多核苷酸并且从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；或
(3)进行编码本发明的细胞靶向分子的多肽或多肽组分的多核苷酸的无细胞体外表达，并
且回收表达产物；或者通过方法(1)、(2)或(3)的任意组合以获得蛋白组分的片段，随后将
肽或多肽片段结合(例如连接(ligating))以获得多肽组分，并且回收多肽组分。

[0620] 可以优选通过固相或液相肽合成来合成本发明的志贺毒素效应多肽或本发明的细胞靶向分子或本发明的细胞靶向分子的蛋白组分。本发明的多肽和细胞靶向分子可以适
合地通过标准合成方法生产。因此，可以通过例如这样的方法来合成肽，所述方法包括通过
标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成肽，并且将最终的肽产物分离并纯化。
在该情形中，可以参考WO 1998/011125，或尤其是Fields G等，Principles and Practice
of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides，Grant G编，Oxford
University Press，U.K.，第2版，2002)以及其中的合成实例。

[0621] 本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子可以使用在本领域内公知的重组技术制备(生产和纯化)。通常，通过培养转化或转染有包含编码多核苷酸的载体的宿主细胞
并且从细胞培养物中纯化或回收蛋白质来制备蛋白质的方法被描述于，例如Sambrook J
等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，
NY，U.S.，1989)；Dieffenbach C等，PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring
Harbor Laboratory Press，N.Y.，U.S.，1995)。任何适合的宿主细胞均可以用于生产本发
明的多肽和/或细胞靶向蛋白质。宿主细胞可以是用一种或更多种驱动本发明的多肽表达
的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。此外，可以通过修饰编码本发明的
多肽或细胞靶向蛋白的多核苷酸来生产本发明的志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子，
所述修饰导致改变一个或更多个氨基酸或者缺失或插入一个或更多个氨基酸，以便实现所
需性质，如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用和/或改变的血清半衰期。

[0622] 存在宽泛种类的可以选择用于生产本发明的细胞靶向蛋白的表达系统。例如，用于表达本发明的细胞靶向蛋白的宿主生物体包括原核生物，诸如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌
(B.subtilis)，真核细胞，诸如酵母和丝状真菌(如酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤
酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))，藻类(如衣藻
(C.reinhardtii))，昆虫细胞系，哺乳动物细胞(如CHO细胞)，植物细胞系，和真核生物体，
如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)和本生烟草(N.benthamiana))。

[0623] 因此，本发明还提供用于根据以上所述方法并且使用下述来生产本发明的志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子的方法：编码本发明的多肽或本发明的细胞靶向蛋白的蛋
白组分的部分或全部的多核苷酸，包含当被引入到适当的宿主细胞中时能够编码本发明的
多肽或细胞靶向蛋白的部分或全部的本发明的至少一种多核苷酸的表达载体，和/或包含
本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。

[0624] 当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达蛋白时，有利的是从其他组分如宿主细胞因子中分离(或纯化)所需的蛋白，从而获得高纯度的或基本均质的制剂。纯化可
以通过在本领域内公知的方法完成，如离心技术，提取技术，层析和分级分离技术(例如，通
过凝胶过滤的尺寸分离、通过离子交换柱的电荷分离、疏水相互作用层析法、反相层析法、
在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE等上的层析法、层析聚焦、和蛋白A琼脂糖层析法，以
用于去除污染物)，以及沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。任何数量的生物化学纯化
技术均可以用于增加本发明的多肽和/或细胞靶向分子的纯度。在某些实施方案中，本发明
的多肽和细胞靶向分子可以任选地以同型多聚体形式(例如，包含两个或更多个本发明的
多肽或细胞靶向分子的分子复合物)纯化。

[0625] 在以下实施例中的是对用于生产本发明的示例性的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的方法的非限制性实例的描述，以及制备方法的具体但非限制性的方面。

[0626] VII.包含本发明的细胞靶向分子的药物和诊断组合物

[0627] 本发明提供这样的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子，其在药物组合物中单独地或与一种或多种另外的治疗剂组合用于治疗或预防以下更详细描述的病况、疾病、病症、或
症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染)。对于某些实施
方案，一种或更多种另外的治疗剂包含一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂，如本文所描
述的。另外的HER2靶向治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：干扰HER2信号传导的抗HER2
抗体治疗或小分子抑制剂。另外的HER2靶向治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：干扰
HER2信号传导的小分子抑制剂。例如，另外的HER2靶向治疗剂可包含、基本上组成为或组成
为：双酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼和/或奈拉替尼。例如，另外的HER2靶向治疗剂可包
含、基本上组成为或组成为拉帕替尼。例如，另外的HER2靶向治疗剂可以包含、基本上组成
为或组成为奈拉替尼。另外的HER2靶向治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：抗HER2抗体
治疗，所述抗HER2抗体治疗结合抗原决定簇，所述抗原决定簇不与由本发明的细胞靶向分
子结合的抗原决定簇重叠，或所述抗HER2抗体治疗以这样的方式结合HER2分子：当结合另
外的HER2-靶向治疗剂时不会阻止该HER2分子被本发明的细胞靶向分子结合。例如，另外的
HER2靶向治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：抗HER2单克隆抗体治疗和/或抗HER2抗体
药物缀合疗法。例如，另外的HER2靶向治疗剂可以包含、基本上组成为或组成为：T-DM1、曲
妥珠单抗和/或帕妥珠单抗。例如，另外的HER2靶向治疗剂可包含、基本上组成为或组成为：
T-DM1。例如，另外的HER2靶向治疗剂可以包含、基本上组成为或组成为：曲妥珠单抗和/或
帕妥珠单抗。例如，另外的HER2靶向治疗剂可以包含、基本上组成为或组成为曲妥珠单抗。
例如，另外的HER2靶向治疗剂可以包含、基本上组成为或组成为帕妥珠单抗。

[0628] 在某些实施方案中，药物组合物还包含至少一种如本文所描述的药学上可接受的载体、赋形剂或运载体。本发明进一步提供药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的
志贺毒素多肽或细胞靶向分子或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可
接受的载体、赋形剂或运载体。在某些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂可包括溶
剂、分散介质、包衣，抗微生物剂、等渗剂或吸收延迟剂；和/或其中所述药物组合物进一步
包含水性或非水性载体；表面活性剂；稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、乳化剂、分散剂；等渗剂；和/或抗细菌剂或抗真菌剂。

[0629] 在某些实施方案中，本发明的药物组合物可包含本发明的志贺毒素效应多肽或细胞靶向分子的同多聚体和/或异多聚体形式。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可包
含本发明的细胞靶向分子的单体和/或单价形式。在某些实施方案中，本发明的药物组合物
可以富含本发明的细胞靶向分子的单体和/或单价形式。如本申请的实施例所证明的，包含
某些细胞靶向分子的占主导地位的单价和/或单体形式的组合物在体内使用时可表现出低
水平的毒性，同时仍对HER2表达细胞表现出强效的细胞毒性。本发明的药物组合物可用于
治疗、减轻或预防下文进一步详细描述的疾病、病况、病症或症状的方法中。疾病、病症或病
况可以通过与HER2物理偶联的细胞来表征。HER2靶生物分子能够物理偶联到该细胞的表
面。在某些实施方案中，疾病、病症或病况可以通过表达HER2靶生物分子的细胞(包括过表
达HER2的细胞)来表征。HER2能够在细胞表面表达(包括过表达)。关于根据本发明的药物组
合物的用途，每种这样的疾病、病况、病症或症状被预期为单独的实施方案。本发明进一步
提供了用于至少一种根据本发明的治疗方法的药物组合物，如下文更详细描述的。

[0630] 如在本文中所使用的，术语“患者”和“受试者”可互换使用，以指代任何生物，通常是脊椎动物如人和动物，其表现出至少一种疾病、病症、或病况的症状、体征、和/或指征。这些术语包括哺乳动物如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、宠物(例如猫、狗等)以及实验动物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性实例。

[0631] 如在本文中所使用的，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”以及它们的语法变体是指用于获得有益或所需的临床结果的方法。该术语可以指延缓病况、病症或疾病的发病或发展速度，减轻或缓解与其有关的症状，产生病况的全部或部分消
退，或者以上任何的某种组合。对于本发明的目的来说，有益或所需的临床结果包括，但不
限于，无论是否是可检测的或不可检测的，症状的减轻或缓解、疾病程度降低、疾病状态的
稳定(例如不恶化)、疾病发展的推迟或延缓、疾病状态的改善或缓和、以及康复(无论是部
分的或全部的)。“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”还可以意指相对于在不接受治疗的情况下的预期存活时间延长存活。需要治疗的受试者(例如人)因此可
以是已经遭受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“治疗(treat)”、“治疗
(treating)”、或“治疗(treatment)”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理状态或
症状的严重性的增加，并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病况完全停止。关于肿瘤
和/或癌症，治疗包括整体肿瘤负担和/或个体肿瘤尺寸的减小。

[0632] 如在本文中所使用的，术语“防止(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”以及它们的语法变体是指用于预防病况、疾病、或病症的发展或者改变病
况、疾病、或病症的病理学的方法。因此，“预防”可以指预防或防止的措施。对于本发明的目的来说，有益或所需的临床结果包括，但不限于，(无论是否是可检测的或不可检测的)预防
或延缓疾病的症状、进展或发展。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未遭受所讨论
的疾病或病症折磨的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况延缓疾病的发病，
并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病况的永久性预防。因此在某些情形中病况的
“预防(preventing)”或“预防(prevention)”可以是指降低发展病况的风险，或者预防或推
迟与该病况有关的症状的发展。

[0633] 如在本文中所使用的，“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种所需治疗效果(如预防或治疗目标病况或有益地缓解与该病况有关的症状)的组合物(例如治疗
组合物、化合物或药剂)的量或剂量。最合乎需要的治疗有效量是将会产生由本领域技术人
员为需要其的给定受试者选择的具体治疗的所需功效的量。这种量将会根据各种技术人员
理解的多种因素变化，包括但不限于，治疗性组合物的特性(包括活性、药代动力学、药效
学、和生物利用度)，受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、总体身体状
况、对给定剂量的响应性、和药物的类型)，可药用载体或制剂中载体的性质，以及给药途
径。临床和药理学技术的人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对
施用组合物的响应并且相应地调节剂量(参见，例如，Remington:The Science and
Practice of Pharmacy(Gennaro A，编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，U.S.，第19版，
1995))。

[0634] 本发明的诊断组合物包含本发明的细胞靶向分子和一种或更多种检测促进剂。当生产或制备本发明的诊断组合物时，本发明的细胞靶向分子可以直接或间接地与一种或更
多种检测促进剂连接。本领域技术人员已知有许多标准技术用于将各种检测促进剂掺入，
粘附和/或缀合到蛋白或分子的蛋白组分，尤其是免疫球蛋白和免疫球蛋白来源的结构域。

[0635] 技术人员已知有许多检测促进剂，例如同位素，染料，比色剂，反差增强剂，荧光剂，生物发光剂和磁性剂，其可与本发明的多肽或细胞靶向分子可操作地连接用于信息收
集方法，诸如用于生物体的疾病，病症或病况的诊断和/或预后应用(参见例如Cai W等人,J
Nucl Med 48:304-10(2007)；Nayak T,Brechbiel M,Bioconjug Chem 20:825-41(2009)；
Paudyal P等人,Oncol Rep 22:115-9(2009)；Qiao J等人,PLoS ONE 6:e18103(2011)；
Sano K等人,Breast Cancer Res 14:R61(2012))。这些试剂可以在任何合适的位置与本发
明的多肽或细胞靶向分子缔合、连接和/或掺入其中。例如，检测促进剂的连接或掺入可以
经由本发明分子的氨基酸残基或通过本领域已知的某种类型的连接，包括通过接头和/或
螯合剂。以这种方式掺入试剂使得能够在筛选、测定、诊断程序和/或成像技术中检测诊断
组合物的存在。

[0636] 类似地，存在技术人员已知的众多成像方案，诸如在医学领域中常用的非侵入性体内成像技术，例如：计算机X射线照相术成像(CT扫描)、光学成像(包括直接的、荧光的和
生物发光的成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机X射线
断层术(SPECT)、超声和x-射线计算机X射线断层术成像。

[0637] VIII.产生或制备包含本发明的细胞靶向分子的药物和/或诊断组合物

[0638] 任何本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子的可药用盐或溶剂化物在本发明的范围内。

[0639] 本发明上下文中的术语“溶剂化物”是指在溶质(在本情况下，为根据本发明的蛋白性化合物或其可药用盐)和溶剂之间形成的确定的化学计量的复合物。相关的溶剂可以
是，例如，水、乙醇或另一种可药用的、通常为小分子有机种类，如，但不限于，乙酸或乳酸。
当所讨论的溶剂是水时，这种溶剂化物通常被称为水合物。

[0640] 本发明的多肽和蛋白质或其盐可以被配制为为储存或施用而制备的药物组合物，所述药物组合物通常包含在可药用载体中的治疗有效量的本发明的分子或其盐。术语“可
药用载体”包括任何标准药物载体。用于治疗分子用途的可药用载体是制药领域中公知的，
并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.
(A.Gennaro，编，1985)。如在本文中所使用的，“可药用载体”包括任何和所有生理学上可接受的，即相容的溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂、等渗剂、和吸收延缓剂等。可药用载体或稀释剂包括在适用于口服、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、和经皮)施用
的制剂中使用的那些。示例性的可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于无菌可注射溶
液或分散体的即时制备的无菌粉末。可以在本发明的药物组合物中采用的适合的水性和非
水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它们的适合的混合
物，植物油如橄榄油，以及可注射有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在
分散体情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在
某些实施方案中，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射
或输注)。根据所选择的给药途径，可以将所述蛋白质或其他药物组分包衣在物质中用于保
护化合物免受当通过特定给药途径施用于患者时所述活性蛋白可能会遇到的低pH和其他
天然失活条件的作用。

[0641] 本发明的药物组合物的制剂可以以单位剂型方便地提供并且可以通过任何在药学领域内公知的方法制备。以这种形式，将组合物分为含有适合量的活性组分的单位剂量。
单位剂型可以是包装的制剂，所述包装含有离散量的制剂，例如，小包片剂、胶囊剂、和小药
瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊剂、扁囊剂(cachet)、或片剂本身，或者其可
以是适合数量的这些包装形式中的任何一种。其可以以单剂量可注射形式，例如以笔(pen)
的形式提供。可以将组合物配制为用于任何适合的施用途径和方式。皮下或经皮施用方式
可以特别适用于在本文中所描述的治疗性蛋白。

[0642] 本发明的药物组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作，以及通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山
梨酸等，可以确保防止存在微生物。组合物中的等渗剂，如糖类、氯化钠等，也可以是合乎需
要的。此外，通过包含延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶，可以产生可注射药物形式的延
长的吸收。

[0643] 本发明的药物组合物还任选地包含可药用抗氧化剂。示例性的可药用抗氧化剂是：水溶性抗氧化剂如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；
油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、
卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

[0644] 在另一个方面中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的不同的多肽和/或细胞靶向分子或前述任一种的酯、盐或酰胺中的一种或组合，以及至少一种可药用载体。

[0645] 治疗性组合物在制造和储存条件下通常是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其他规则结构。载体可以是溶剂或分散介质，含
有，例如，水、醇如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、或任何适合的混合
物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用
表面活性剂，根据本领域内公知的制剂化学，可以维持适当的流动性。在某些实施方案中，
等渗剂，例如糖类和多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠可以是在组合物中合乎需要
的。可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来产生可注射组合
物的延长吸收。

[0646] 用于皮内或皮下施用的溶液或悬浮液通常包括下列各项中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非发挥性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂
如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；
缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张力调节剂如，例如，氯化钠或葡萄糖。可以用酸
或碱，如盐酸或氢氧化钠，或者具有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。此类制剂
可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小药瓶中。

[0647] 通过以所需的量将本发明的多肽或细胞靶向分子以及上述成分中的一种或组合加入适合的溶剂中，当需要时，继之以进行灭菌微过滤，可以制备无菌可注射溶液。通过将
活性化合物掺入至含有分散介质和其他成分(如上述那些)的无菌运载体中，可以制备分散
体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻
干)，其产生活性成分以及来自其无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。

[0648] 当将治疗有效量的本发明的多肽和/或细胞靶向分子设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时，结合剂将会是无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。考虑到适合
的pH、等渗性、稳定性等，用于制备肠胃外可接受的蛋白质溶液的方法属于本领域技术。除
了结合剂之外，用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选的药物组合物将含有等渗运载体，如
氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射
液、乳酸林格氏注射液、或在本领域中已知的其他运载体。本发明的药物组合物还可以含有
稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、或对本领域技术人员来说公知的其他添加剂。

[0649] 如在本文中其他地方描述的，本发明的多肽和/或细胞靶向分子可以用保护活性治疗剂免于快速释放的载体来制备，如受控释放制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递
送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、
胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。许多用于制备这种制剂的方法被授予了专利或是本领域技
术人员通常已知的(参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems(Robinson J，编，Marcel Dekker，Inc.，NY，U.S.，1978))。

[0650] 在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含缓冲剂，例如柠檬酸盐、柠檬酸、组氨酸、磷酸盐、琥珀酸盐和/或琥珀酸。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含防腐
剂、抗细菌剂或抗真菌剂，例如甘露醇或山梨糖醇。在某些实施方案中，本发明的药物组合
物包含去污剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，本发明的药物组合
物包含冷冻保护剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，本发明的药物
组合物包含赋形剂，例如精氨酸、精氨酸硫酸盐、甘油、甘露醇、甲硫氨酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、山梨糖醇、蔗糖和/或海藻糖。在某些另外的实施方案中，本发明的药物组合物
包含一种或更多种(包括全部)：柠檬酸盐、聚山梨醇酯20、钠、山梨糖醇和氯化物。在某些另
外的实施方案中，药物组合物包含20毫摩尔浓度的柠檬酸盐，200毫摩尔浓度的山梨糖醇和
0.2％聚山梨醇酯20。在某些进一步的实施方案中，在室温(例如约25℃)下，药物组合物具
有约5.3至5.7之间的pH、p5.4至5.6之间的pH和/或5.5的pH。

[0651] 在某些实施方案中，可以配制本发明的组合物(例如药物和/或诊断组合物)以确保本发明的细胞靶向分子的所需体内分布。例如，血脑屏障排除许多大型和/或亲水性化合
物。为了将本发明的治疗性分子或组合物靶向至特定的体内位置，例如，可以将它们配制在
可以包含被选择性地运输至特定细胞或器官的一个或多个结构部分的脂质体中，从而增强
靶向药物递送。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素；甘露糖苷；抗体；表面活性剂蛋白A受
体；p120联蛋白等。

[0652] 药物组合物包括被设计成用作植入物或微粒系统的胃肠外制剂。植入物的例子是由聚合的或疏水的组分(诸如乳剂、离子交换树脂和可溶性的盐溶液)组成的贮库制剂。微
粒系统的例子是微球、微粒、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒(参见例如Honda M等，Int J
Nanomedicine 8:495-503(2013)；Sharma A等，Biomed Res Int 2013:960821(2013)；
Ramishetti S，Huang L，Ther Deliv 3:1429-45(2012))。使用对离子敏感的聚合物，诸如，
例如，脂质体、泊洛沙姆407和羟基磷灰石，可以制备控释制剂。

[0653] 本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体可包含：生理学上可接受的溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂、等渗剂、吸收延迟剂、无菌水溶液或分散体、或无菌粉末；含水或非含水载体，诸如水、醇(如乙醇)，多元醇(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)及其混合物；植物
油；或可注射的有机酯，如油酸乙酯。本发明的药物组合物可进一步包含佐剂，诸如防腐剂、
润湿剂、乳化剂或分散剂；抗细菌剂或抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚或山梨
酸；等渗剂，诸如糖，多元醇诸如甘露醇或山梨糖醇或氯化钠；吸收延迟剂，诸如单硬脂酸铝
或明胶；包衣，诸如卵磷脂；药学上可接受的抗氧化剂；表面活性剂；缓冲剂；和/或稳定剂。
在某些实施方案中，药学上可接受的抗氧化剂是水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸
盐酸盐，硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠或亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯，丁
基化羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯或α-生育酚；或金属
螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸或磷酸。

[0654] IX.本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞

[0655] 除了本发明的多肽和细胞靶向分子之外，编码本发明的多肽和细胞靶向分子或其功能部分的多核苷酸也包括在本发明的范围内。术语“多核苷酸”等同于术语“核酸”，各自
包括以下一种或更多种：脱氧核糖核酸(DNAs)的聚合物、核糖核酸(RNAs)的聚合物、利用核
苷酸类似物产生的这些DNA或RNA的类似物、以及它们的衍生物、片段和同系物。本发明的多
核苷酸可以是单链的、双链的或三链的。例如，考虑RNA密码子的第三位中可容忍的但是作
为不同的RNA密码子编码相同氨基酸的摆动性(wobble)(参见Stothard P，Biotechniques
28:1102-4(2000))，这种多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码示例性蛋白质的多核苷
酸。

[0656] 在一个方面中，本发明提供编码本发明的志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子、或其片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可以包括，例如，编码与包含本发明的多肽或细胞
靶向分子的氨基酸序列中的一个的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、99％或更高的同一性的多肽的核酸序列。本发明还包括包含与编码本发
明的志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子、或其片段或衍生物的多核苷酸在严格条件下
杂交的核苷酸序列，或者任何这种序列的反义序列或互补序列的多核苷酸。

[0657] 本发明分子的衍生物或类似物(例如，本发明的志贺毒素效应多肽和包含其的细胞靶向分子)包括，尤其是，具有与所述多核苷酸(或本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶
向分子)基本上同源的区域的多核苷酸(或多肽)分子，例如与相同尺寸的多核苷酸(或多
肽)序列相比，或者当与比对的序列(其中所述比对由本领域中已知的计算机同源性程序进
行)比对时，至少约45％、50％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或甚至99％的同一性(并且优选的同一性为80-99％)。示例性的程序是使用默认设置的GAP程序
(WisconsinSequence Analysis Package，Version 8for UNIX，Genetics Computer
Group，University Research Park，Madison，WI，U.S.)，其使用Smith T，Waterman M，
Adv.Appl.Math.2:482-9(1981)的算法。还包括能够与编码本发明的细胞靶向蛋白的序列
的互补序列在严格条件下杂交的多核苷酸(参见例如Ausubel F等，Current Protocols in
Molecular Biology(John Wiley&Sons，New York，NY，U.S.，1993))，以及以下。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在例如Current Protocols in Molecular Biology(John
Wiley&Sons，NY，U.S.，Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。

[0658] 本发明还提供包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。可以使用本领域内公知的物质和方法将能够编码本发明的志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子的多核苷酸插入
至包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体在内的已知载体中以产生表达载体。这种表达载
体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如pTxb1和pIVEX2.3)中产生本
发明预期的志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子所需的多核苷酸。用于特定类型的宿主
细胞或无细胞表达系统的包含表达载体的特定多核苷酸是本领域普通技术人员所公知的，
可以使用常规实验来确定，和/或可以购买。

[0659] 如在本文中所使用的，术语“表达载体”是指包含一个或更多个表达单元的线性或环形的多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够提供核酸区段在宿主细胞中
的表达的多核苷酸区段。表达单元通常包含均处于可操作构型的转录启动子、编码目标多
肽的开放阅读框、和转录终止子。表达载体包含一个或更多个表达单元。因此，在本发明的
上下文中，编码包含单一多肽链的本发明的志贺毒素效应多肽和/或细胞靶向分子的表达
载体至少包括单一多肽链的表达单元，而包含，例如两条或更多条多肽链(例如，包含VL结
构域的一条链和包含与毒素效应多肽连接的VH结构域的第二条链)的蛋白质包括至少两个
表达单元，各自用于所述蛋白质的两条多肽链中的每一个。对于本发明的多链细胞靶向蛋
白的表达，用于每条多肽链的表达单元还可以单独地包含在不同的表达载体中(例如，可以
利用已经向其中引入用于每条多肽链的表达载体的单一宿主细胞实现表达)。

[0660] 能够引导多肽和蛋白质的瞬时或稳定表达的表达载体是在本领域内公知的。表达载体通常包括，但不限于下列各项中的一种或多种：异源信号序列或肽、复制起点、一个或
多个标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列，其中的每一个均为在本领域内公知
的。任选的调节控制序列、整合序列、和可以采用的可用标记物是在本领域中已知的。

[0661] 术语“宿主细胞”是指可以支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，或者真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类、或哺乳动物细胞)。可以使用本领域已知的标准技术实现包含本发明多核苷酸或能够产生本发明多肽和/或细胞
靶向分子的宿主细胞系的创建和分离。

[0662] 在本发明的范围内的志贺毒素效应多肽和/或蛋白质可以是在本文中所描述的多肽和分子的变体或衍生物，其是这样产生的：通过改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入
一个或多个氨基酸来修饰编码多肽和/或细胞靶向分子的蛋白性组分的多核苷酸以可以使
其更适用于实现所需性质，如通过宿主细胞的更优的表达。

[0663] X.被固定化在固体基质上的本发明的分子

[0664] 本发明的某些实施方案包括被固定化在固体基质上的本发明的分子(例如本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分子、融合蛋白或多核苷酸)或其任何效应子片段。本文考
虑的固体基质包括但不限于微珠，纳米颗粒，聚合物，基质材料，微阵列，微量滴定板或本领
域已知的任何固体表面(参见例如US 7,771,955)。根据这些实施方案，使用技术人员已知
的技术，可以将本发明的分子共价地或非共价地连接至固体基质，例如，珠子、颗粒或平板
(参见例如Jung Y等人,Analyst 133:697-701(2008))。本发明的固定化分子(例如，包含、
组成为或基本上组成为SEQ ID NO:29、36、102和108中的任一个的HER2靶向分子)可以使用
本领域已知的技术用于筛选应用(见例如Bradbury A等人,Nat Biotechnol 29:245-54
(2011)；Sutton C,Br J Pharmacol 166:457-75(2012)；Diamante L等人,Protein Eng
Des Sel26:713-24(2013)；Houlihan G等人,J Immunol Methods 405:47-56(2014))。

[0665] 在其上固定本发明分子的固体基质的非限制性实例包括：微珠、纳米颗粒、聚合物、纳米聚合物、纳米管、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠、链霉抗生物素蛋白包被的珠、反相磁珠、羧基封端珠、肼终止珠、二氧化硅(硅酸钠)珠和亚氨基二乙酸(IDA)修饰珠、醛修饰珠、环氧
活化珠、二氨基二丙胺(DADPA)修饰珠(具有伯胺表面基团的珠)、可生物降解的聚合物珠、
聚苯乙烯基质、氨基-聚苯乙烯颗粒、羧基-聚苯乙烯颗粒、环氧-聚苯乙烯颗粒、二甲基氨
基-聚苯乙烯颗粒、羟基-聚苯乙烯颗粒、有色颗粒、流式细胞术颗粒、磺酸盐-聚苯乙烯颗
粒、硝化纤维素表面、增强硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃表面、活性玻璃表面、活性石英表面、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、聚丙烯酰胺基质、聚氯乙烯基质、聚甲基丙烯酸甲酯基质、聚(二甲
基硅氧烷)基质和含有能够形成共价连接的光反应性种类(如氮烯、碳烯和羰自由基)的光
聚合物。可以固定本发明分子的固体基质的其他实例通常用于分子展示系统，例如细胞表
面、噬菌体和病毒颗粒。

[0666] XI.递送装置和试剂盒

[0667] 在某些实施方案中，本发明涉及一种装置，其包含用于递送给需要其的受试者的本发明的物质的一种或多种组合物，诸如药物组合物和诊断组合物。因而，包含本发明的一
种或多种组合物的递送装置可以用于通过多种递送方法向患者施用本发明的物质的组合
物，所述递送方法包括：静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射；口服施用；透皮施用；经肺或经粘膜施用；通过植入物、渗透泵、筒或微量泵施用；或通过本领域技术人员公知的其它方式。

[0668] 试剂盒也在本发明范围内，所述试剂盒包含本发明的物质的至少一种组合物和任选的包装和使用说明书。例如，本发明提供了试剂盒，其包含：(i)本发明的HER2靶向分子，
(ii)本发明的药物组合物，(iii)本发明的诊断组合物，(iv)本发明的多核苷酸，(v)本发明
的表达载体和/或(vi)本发明的宿主细胞；以及可选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药
物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可以任选地包含至少一种另外的试剂(例如，
标准品、标志物等)。试剂盒典型地包括标签，所述标签指示试剂盒的内容物的预期用途。所
述试剂盒还可以包含用于检测在样品中或在受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)或用于
诊断患者是否属于对利用本发明的化合物、组合物或有关方法的治疗策略，例如，诸如本文
所述的方法做出应答的群体的试剂和其它工具。

[0669] XII.使用本发明的细胞靶向分子和/或其药学和/或诊断组合物的方法

[0670] 通常，本发明的一个目的是提供药理学上有活性的试剂、以及包含它们的组合物，它们可以用于预防和/或治疗疾病、病症和病况，诸如某些癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症、或在本文中提及的其它病理学状况。因此，本发明提供了使用本发明的多肽、细胞靶向分子
和药物组合物的方法，其用于靶向杀伤细胞，用于将另外的外源性物质递送进被靶向的细
胞中，用于标记被靶向的细胞的内部，用于收集诊断信息，用于递送T细胞表位至靶细胞的
MHC I类呈递途径和用于治疗如本文中所述的疾病、病症和病况。例如，本发明的方法可用
于预防或治疗癌症、癌症起始、肿瘤起始、转移和/或疾病复发。

[0671] 具体地，本发明的一个目的是提供这样的药理学上有活性的试剂、组合物和/或方法，其与本领域目前已知的试剂、组合物和/或方法相比具有某些优点。因此，本发明提供了
使用具有特定蛋白质序列的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子及其药物组合物的方法。例
如，本文所述的任何氨基酸序列可以具体地用作以下方法中使用的细胞靶向分子的组分或
使用本领域技术人员已知的细胞靶向分子的任何方法，诸如，例如，WO2014/164680、WO
2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO
2015/191764、US20150259428、WO 2016/196344、WO 2017/019623和WO 2018/140427中描述
的各种方法。

[0672] 本发明提供了杀伤细胞的方法，所述方法包括下述步骤：在体外或体内使细胞与本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分子或药物组合物接触。在使一个或多个细胞与要
求保护的物质的组合物之一接触以后，本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分子和药物
组合物可以用于杀伤特定细胞类型。对于某些实施方案，细胞与HER2物理偶联。对于某些实
施方案，细胞表达(包括过表达)HER2。HER2可以在细胞表面表达(包括过表达)。对于某些实
施方案，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可用于杀伤不同细胞类型的混合物中的特定
细胞类型，诸如包含癌细胞、受感染细胞和/或血液细胞的混合物。对于某些实施方案，本发
明的细胞靶向分子或药物组合物可用于杀伤不同细胞类型的混合物中的癌细胞。对于某些
实施方案，本发明的细胞毒性志贺细胞靶向分子或药物组合物可用于杀伤不同细胞类型的
混合物中的特定细胞类型，例如移植前组织。对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应多
肽、细胞靶向分子或药物组合物可用于杀伤细胞类型混合物中的特定细胞类型，例如用于
治疗目的的预施用组织材料。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可
用于选择性杀伤被病毒或微生物感染的细胞，或以其他方式选择性杀伤表达特定细胞外靶
生物分子的细胞，诸如细胞表面定位的HER2变体。本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分
子和药物组合物具有多种应用，包括例如在体外或体内从组织中除去不希望的细胞类型，
和用于净化移植组织的不希望的细胞类型。对于某些实施方案，细胞表达muc-4和/或CD44。
对于某些实施方案，细胞对由T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)和/或曲妥珠单抗引起的细胞
毒性具有抗性。对于某些进一步的实施方案，细胞处于帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗
emtansine)、拉帕替尼和/或奈拉替尼存在的情况下；和/或先前已与帕妥珠单抗、T-DM1(曲
妥珠单抗emtansine)、拉帕替尼和/或奈拉替尼接触过。在本发明的某些实施方案中，是杀
伤细胞(例如表达HER2的细胞)的方法，其包括使细胞与本发明的细胞靶向分子或本发明的
药物组合物接触的步骤，其中细胞处于帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)、拉帕替
尼和/或奈拉替尼存在的情况下；和/或先前已与帕妥珠单抗、T-DM1(曲妥珠单抗
emtansine)、拉帕替尼和/或奈拉替尼接触过。对于某些进一步的实施方案，细胞处于T-DM1
(曲妥珠单抗emtansine)存在的情况下。对于某些进一步的实施方案，细胞处于帕妥珠单抗
存在的情况下。对于某些进一步的实施方案，细胞处于拉帕替尼存在的情况下。对于某些进
一步的实施方案，细胞处于奈拉替尼存在的情况下。对于某些进一步的实施方案，细胞先前
已与帕妥珠单抗接触过。对于某些进一步的实施方案，细胞先前已与T-DM1(曲妥珠单抗
emtansine)接触过。对于某些进一步的实施方案，细胞先前已与拉帕替尼接触过。对于某些
进一步的实施方案，细胞先前已与奈拉替尼接触过。

[0673] 对于某些实施方案，本发明的某些志贺毒素效应多肽，细胞靶向分子和药物组合物单独或与其他化合物或药物组合物组合，当在体外或体内施用于在受试者(例如需要治
疗的患者)的细胞群体时可显示出强效的细胞杀伤活性。通过使用高亲和力结合区域将酶
活性志贺毒素A亚基效应多肽和/或T细胞表位的递送靶向特定细胞类型，细胞杀伤活性可
以限制至特异性和选择性地杀伤生物体内的某些细胞类型，诸如某些癌细胞、肿瘤细胞、恶
性细胞、非恶性肿瘤细胞和/或感染的细胞。

[0674] 本发明提供了在有需要的患者中杀伤细胞的方法，该方法包括向患者施用至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的步骤。

[0675] 对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子或其药物组合物可通过靶向被发现与癌症或肿瘤细胞物理偶联的细胞外生物分子而用于杀伤患者中的癌细胞。术语“癌细胞”或
“癌性细胞”表示以异常加速和/或不受调节的方式生长和分裂的各种赘生性细胞，且是技
术人员显而易见的。术语“肿瘤细胞”包括恶性的和非恶性的细胞。通常，癌症和/或肿瘤可
以定义为适合治疗和/或预防的疾病、病症或病况。由可受益于本发明的方法和组合物的癌
细胞和/或肿瘤细胞构成的癌症和肿瘤(恶性的或非恶性的)是技术人员显而易见的。肿瘤
细胞通常与以下一种或更多种相关：不受调节的生长、缺乏分化、局部组织侵入、血管生成
和转移。可以受益于靶向某些癌细胞和/或肿瘤细胞的本发明的方法和组合物的由癌症和/
或肿瘤(恶性或非恶性)引起的疾病、病症和病况对于技术人员是清楚的。例如，疾病、病症
或病况可以通过与HER2物理偶联的细胞来表征。HER2靶生物分子可以物理偶联到该细胞的
表面。对于某些实施方案，疾病、病症或病况可以通过表达HER2靶生物分子的细胞(包括过
表达HER2的细胞)来表征。HER2可以在细胞表面表达(包括过表达)。

[0676] 在患者已经接受HER2靶向治疗剂后，本发明的细胞靶向分子和组合物的某些实施方案可用于治疗该患者的疾病、病症或病况(例如，HER2阳性癌症和/或肿瘤)。在许多情况
下，在治疗性治疗(例如使用抗HER2单克隆抗体疗法或抗HER2抗体药物缀合物疗法的HER2
靶向疗法，或使用酪氨酸激酶抑制剂的化学治疗剂疗法)之后，细胞表面HER2表达在疾病进
展期间持续存在。因此，HER2仍然作为恶性/靶细胞表面上的靶标存在，并且可用于通过本
发明的细胞靶向分子靶向用于细胞表面对接和细胞内化。此外，如实施例所证明的，本发明
的细胞靶向分子(和包含所述细胞靶向分子的组合物)可以与其他HER2靶向治疗剂(诸如结
合HER2的非重叠抗原决定簇的抗HER2抗体疗法；或酪氨酸激酶抑制剂，其对本发明的细胞
靶向分子具有不同的HER2靶向活性)组合使用。因此，用在本发明的方法中的至少一种细胞
靶向分子或其药物组合物施用的“有此需要的患者”包括先前已经用另外的HER2靶向治疗
剂治疗的患者；和/或正在用另外的HER2靶向治疗剂进行治疗的患者。对于某些实施方案，
患者先前已经用如本文所述的另外的HER2靶向治疗剂治疗。对于某些实施方案，患者正在
经历如本文所述的另外的HER2靶向治疗剂的治疗。对于某些实施方案，“有此需要的患者”
对一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂的治疗没有反应或没有受益。例如，这尤其可能是
由于获得性和/或内在抗性。对于某些实施方案，另外的HER2靶向治疗剂包括酪氨酸激酶抑
制剂、抗HER2单克隆抗体疗法或抗HER2抗体药物缀合物疗法。对于某些实施方案，所述另外
的HER2靶向治疗剂包括下列的一种或更多种：帕妥珠单抗，曲妥珠单抗，T-DM1(曲妥珠单抗
emtansine)，拉帕替尼和/或奈拉替尼。对于某些实施方案，另外的HER2靶向治疗剂是帕妥
珠单抗。对于某些实施方案，另外的HER2靶向治疗剂是曲妥珠单抗。对于某些实施方案，另
外的HER2靶向治疗剂是T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)。对于某些实施方案，另外的HER2靶
向治疗剂是拉帕替尼。对于某些实施方案，另外的HER2靶向治疗剂是奈拉替尼。

[0677] 如本文所用，“先前已经用另外的HER2靶向治疗剂治疗”的“有需要的患者”的提及包括在用本发明的细胞靶向分子或药物组合物治疗之前，最后用另外的HER2靶向治疗剂治
疗至少6个月(诸如至少5个月、4个月、3个月、2个月或1个月)，至少6周(诸如至少5周、4周、3周、2周或1周)或至少144小时(诸如至少120小时、96小时、72小时、48小时、24小时、12小时
或6小时)的患者。

[0678] 如本文所用，“正经历用另外的HER2靶向治疗剂进行治疗”的“有此需要的患者”的提及包括用本发明的细胞靶向分子或药物组合物和另外的HER2靶向治疗剂同时或相继施
用的患者。患者可以在本发明的细胞靶向分子或药物组合物治疗之前或之后，用另外的
HER2靶向治疗剂施用至少1小时(诸如至少6小时、12小时、24小时，48小时、72小时、96小时、
120小时或144小时)，1周(诸如至少2周、3周、4周、5周或6周)或1个月(诸如至少2个月、3个
月、4个月、5个月或6个月)。

[0679] 如本文所用，对用一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂的治疗不反应或不受益的“有此需要的患者”的提及包括对一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂是抗性的或已产生
抗性的患者。例如，药物抗性可能起因于药物外排泵或细胞色素P450酶(例如CYP3A4)的表
达以及阻止HER2表位结合的障碍(例如对HER2靶向治疗剂结合的表位进行HER2表位掩蔽)。
例如，药物抗性可能起因于HER2信号传导或HER2活性下游的活化的存活/增殖途径的存在，
从而绕过HER2。例如，耐药性可能起因于HER2中存在改变药物有效性的突变，例如由HER2抑
制剂结合的ATP结合口袋中的突变。与另外的HER2靶向治疗剂作用机制相关的抗性机制可
以通过实现不同作用机制的本发明的HER2靶向分子来避免。

[0680] 在受试者已经接受HER2靶向治疗后，本发明的细胞靶向分子和组合物的某些实施方案可用于治疗受试者中的癌症和/或肿瘤。在许多情况下，在治疗性治疗(例如使用抗
HER2单克隆抗体疗法或抗HER2抗体药物缀合物疗法的HER2靶向疗法，或使用酪氨酸激酶抑
制剂的化学治疗剂疗法)之后，HER2在疾病进展期间持续存在。因此，HER2仍然作为恶性/靶
细胞表面上的靶标存在，并且可用于通过本发明的细胞靶向分子进行靶向。

[0681] 本发明的细胞靶向分子和组合物的某些实施方案可用于杀伤癌症干细胞、肿瘤干细胞、恶变前的癌症起始细胞和肿瘤起始细胞，其通常是缓慢分裂和对如化疗和放射等癌
症治疗是抵抗的。

[0682] 由于基于志贺毒素A亚基的作用机制，本发明的物质组合物可以更有效地用于涉及它们与其他疗法(例如化学疗法、免疫疗法、辐射、干细胞移植和免疫检查点抑制剂)组合
或互补的方法中，和/或有效对抗化学抗性/抗辐射和/或静息肿瘤细胞/肿瘤起始细胞/干
细胞。类似地，本发明的物质组合物可以更有效地用于涉及与针对相同疾病病症或病况的
非重叠的或不同靶标上的相同表位以外的其他细胞靶向疗法组合的方法。这些其他疗法或
其他细胞靶向疗法包括本文所述的另外的HER2靶向治疗剂。

[0683] 本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案，可通过靶向被发现与免疫细胞物理偶联的细胞外生物分子而用于杀伤患者中的免疫细胞(无论是健康的还是恶性
的)。

[0684] 对于本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案，可通过靶向被发现与被感染细胞物理偶联的细胞外生物分子而用于杀伤患者中的感染细胞。

[0685] 对于本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案，可以用于“接种”于在具有非自身T细胞表位-肽呈递细胞的“脊索动物”内的部位，以便激活免疫系统以增强对
该部位的监管。对于本发明的这种“接种”方法的某些进一步的实施方案，所述部位是肿瘤
块或感染的组织部位。在本发明的这种“接种”方法的优选实施方案中，非自身T细胞表位肽
选自由以下各项组成的组：尚未被细胞靶向分子的靶细胞呈递的肽、不存在于由靶细胞表
达的任何蛋白质中的肽、不存在于靶细胞的蛋白质组或转录物组内的肽、不存在于待接种
部位的细胞外微环境中的肽以及不存在于待靶向的肿瘤块中或感染组织部位的肽。

[0686] 这种“接种”方法的功能是用一个或多个MHC I类呈递的T细胞表位标记脊索动物内的一个或多个靶细胞，用于被效应T细胞识别和下游免疫应答活化。通过利用本发明的细
胞靶向分子的细胞内化功能、细胞内按路线发送功能和T细胞表位递送功能，展示递送的T
细胞表位的靶细胞被利用来诱导宿主T细胞对呈递靶细胞的识别和其它免疫应答的诱导，
包括CTL对靶细胞的杀伤。使用本发明的细胞靶向分子的这种“接种”方法可以通过诱导适
应性免疫应答以攻击接种的微环境(例如，肿瘤块或感染的组织部位，无论是否呈递细胞靶
向分子递送的T细胞表位)内的细胞来提供暂时的疫苗接种效应。这种“接种”方法还可以诱
导对脊索动物内的靶细胞群体、肿瘤块和/或感染的组织部位的免疫耐受性的破坏。

[0687] 涉及用一种或更多种抗原性和/或免疫原性表位在脊索动物中的部位的接种的本发明的某些方法可以与免疫佐剂的施用组合，无论是局部施用还是全身施用，以刺激对某
些抗原的免疫应答，例如，本发明的组合物与一种或更多种免疫佐剂如细胞因子、细菌产物
或植物皂苷的共同给药。可适用于本发明方法的免疫佐剂的其他实例包括铝盐和油，例如
明矾、氢氧化铝、矿物油、角鲨烯、石蜡油、花生油和硫柳汞。

[0688] 另外，本发明提供治疗患者的疾病、病症或病况的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的步骤。疾病、病症
或病况可以通过与HER2/neu/ErbB2物理偶联的细胞来表征。HER2/neu/ErbB2可以物理偶联
到该细胞的表面。对于某些实施方案，疾病、病症或病况可以通过表达(包括过表达)HER2/
neu/ErbB2的细胞来表征。HER2/neu/ErbB2可以在细胞表面表达(包括过表达)。可以使用该
方法治疗的预期的疾病、病症和病况包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫紊乱
和微生物感染。癌症、肿瘤、生长异常、免疫紊乱或微生物感染可以通过与HER2/neu/ErbB2
物理偶联的细胞来表征。HER2/neu/ErbB2可以物理偶联到该细胞的表面。对于某些实施方
案，癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染可以通过表达(包括过表达)HER2/neu/
ErbB2的细胞来表征。HER2/neu/ErbB2可以在细胞表面表达(包括过表达)。施用“治疗有效
剂量”的本发明组合物的可导致疾病症状严重程度降低，疾病无症状期的频率和持续时间
增加，或预防由于疾病引起的损伤或残疾痛苦。“其中的患者”如本文所述。对于某些实施方
案，“有此需要的患者”先前已经用一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂治疗；和/或正在经
历用一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂治疗。对于某些实施方案，“有此需要的患者”先
前已经用一种或更多种如本文所述的另外的HER2靶向治疗剂治疗。对于某些实施方案，“有
此需要的患者”正在经历用一种或更多种如本文所述的另外的HER2靶向治疗剂进行治疗。
对于某些实施方案，“有此需要的患者”对一种或更多种如本文所述的另外的HER2靶向治疗
剂的治疗没有反应或没有受益。一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂如本文所述。例如，另
外的HER2靶向治疗剂可包含双酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼和/或奈拉替尼。例如，另
外的HER2靶向治疗剂可包含抗HER2抗体，所述抗HER2抗体结合HER2中的抗原决定簇，所述
HER2中的抗原决定簇不与所述HER2靶向分子结合的HER2中的抗原决定簇重叠，例如T-DM1、
曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗。例如，另外的HER2靶向治疗剂可包含抗HER2抗体药物缀合物
疗法；例如T-DM1。对于某些实施方案，一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂选自：拉帕替
尼、奈拉替尼、T-DM1、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。

[0689] 本发明组合物的治疗有效量将取决于施用途径，所治疗的生物的类型和所考虑的特定患者的体格特征。这些因素以及它们与确定这种量的关系是医学领域的技术从业人员
众所周知的。这种量和施用方法可以进行调节以实现最佳效力，并且可以取决于医学领域
的技术人员众所周知的因素，如重量、饮食、并存的药物和其它因素。最适用于人类用途的
剂量大小和定量施用方案可以由通过本发明得到的结果指导，并且可以在适当地设计的临
床试验中确认。通过常规方式，在实验动物中以低剂量开始并且然后在监测效果的同时增
加剂量、以及系统性地改变给药方案，可以确定有效剂量和治疗方案。当为给定受试者确定
最佳剂量时，临床医师可以考虑许多因素。这些考虑因素是技术人员已知的。

[0690] 可接受的施用途径可以表示在本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼、口服、肠胃外、直肠、阴道或透皮(例如，乳膏、凝胶或软膏的局部施用，或借助于透皮贴剂)。“肠胃外施用”典型地与在预期作用部位处的注射有关或与预期作用部位
连通，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、透粘膜或经气管施用。

[0691] 关于本发明的药物组合物的施用，剂量范围通常将为约0.001-10毫克/千克(mg/kg)宿主体重，并且更通常为0.001-0.5mg/kg宿主体重。示例性剂量可以是0.001mg/kg体
重、0.005mg/kg体重、0.0075mg/kg体重、0.015mg/kg体重、0.020mg/kg体重或0.025mg/kg体
重或在0.001至0.030mg/kg的范围内。示例性剂量可以是0.01mg/kg体重、0.03mg/kg体重、
0.05mg/kg体重、0.075mg/kg体重或0.1mg/kg体重或在0.01至0.1mg/kg的范围内。一个示例
性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，
每四周一次，每月一次，每两个月或三个月一次或者每三至六个月一次。剂量可以由熟练的
健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使对于特定患者而言的治疗益处最大化。

[0692] 本发明的药物组合物典型地将会在多种情形下施用给相同患者。单次剂量之间的间隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每两个月或三个月、每六个月、或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其它标志物，施用之间的间隔也可以是不规律的。本发明组合物
的给药方案包括向受试者静脉内施用每千克(kg)体重1至50μg的HER2靶向分子，该组合物
每周施用一次或两次，持续连续三周或更长时间，诸如持续四或五周。本发明组合物的示例
性的给药方案包括向受试者静脉内施用每kg体重1至25μg的HER2靶向分子，该组合物每周
施用一次或两次，持续连续三周或更长时间，诸如持续四或五周。本发明组合物的给药方案
包括向受试者静脉内施用每kg体重10至50μg的HER2靶向分子，该组合物每周施用一次或两
次，持续连续三周或更长时间，诸如持续四或五周。本发明组合物的给药方案包括静脉内施
用0.01至1mg/kg体重或0.03至3mg/kg体重，该组合物每2至4周施用6个剂量，然后每3个月
施用0.01至3mg/kg体重或0.01至0.03mg/kg体重。

[0693] 可以使用本领域已知的多种方法中的一种或更多种，通过一种或更多种施用途径施用本发明的药物组合物。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或模式将根据期望的
结果而变化。本发明的细胞靶向分子和药物组合物的施用途径包括，例如静脉内、肌肉内、
真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。对于其他实施
方案，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以通过非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或
粘膜施用途径，例如，鼻内地、口服地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。

[0694] 本发明的治疗性细胞靶向分子或药物组合物可以用本领域已知的多种医疗装置中的一种或多种施用。例如，在一个实施方案中，可以利用无针皮下注射装置施用本发明的
药物组合物。可用于本发明的众所周知的植入物和模块的例子在本领域中，包括例如，用于
受控速率递送的可植入微量输液泵；用于穿过皮肤施用的装置；用于以精确的输注速率递
送的输液泵；用于连续药物递送的可变流可植入输注装置；以及渗透药物递送系统。这些和
其它这样的植入物、递送系统、和模块是本领域技术人员已知的。

[0695] 本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以单独施用或与一种或更多种其他治疗剂或诊断剂组合施用。组合疗法可包括与至少一种其他治疗剂组合的本发明的细胞靶向分
子或其药物组合物，所述其他治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病况而选择。其它这样
的药剂的例子包括，尤其是，细胞毒性的抗癌剂或化学治疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物
或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体
或其片段、或调节一个或多个信号传导途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性治疗方案
中互补的或在其它方面有益的类似调节性治疗分子。

[0696] 本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以单独施用或与一种或更多种其他的HER2靶向治疗剂组合施用。本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以单独施用或与一种或
更多种另外的HER2靶向治疗剂组合施用，例如T-DM1(曲妥珠单抗)、曲妥珠单抗、帕妥珠单
抗和/或拉帕替尼。组合疗法可包括与至少一种其他治疗剂组合的本发明的细胞靶向分子
或其药物组合物，所述其他治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病况而选择。其它这样的
药剂的例子包括，尤其是，细胞毒性的抗癌剂或化学治疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物或
抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或
其片段、或调节一个或多个信号传导途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性治疗方案中
互补的或在其它方面有益的类似调节性治疗分子。对于某些实施方案，用于在有此需要的
患者中治疗疾病、病症或病况的本发明的方法可进一步包括向患者施用治疗有效量的一种
或更多种另外的HER2靶向治疗剂。另外的HER2靶向治疗剂如本文所述。例如，另外的HER2靶
向治疗剂可包含双酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼和/或奈拉替尼。例如，另外的HER2靶
向治疗剂可包含抗HER2抗体，所述抗HER2抗体结合HER2中的抗原决定簇，所述HER2中的抗
原决定簇不与所述HER2靶向分子结合的HER2中的抗原决定簇重叠，例如针对包含、组成为
或基本上组成为SEQ ID NO:29、36、102和108中任一个的HER2靶向分子的T-DM1、曲妥珠单
抗和/或帕妥珠单抗。例如，另外的HER2靶向治疗剂可包含抗HER2抗体药物缀合物疗法；例
如T-DM1。

[0697] 用本发明的细胞靶向分子或药物组合物对患者的治疗优选地导致靶细胞的细胞死亡和/或靶细胞的生长抑制。这样，本发明的细胞毒性细胞靶向分子和包含它们的药物组
合物将可用在治疗多种病理学病症(其中杀伤或除去靶细胞可能是有益的，例如尤其是癌
症、肿瘤、其他生长异常、免疫病症和受感染的细胞)的方法中。本发明提供用于抑制细胞增
殖和治疗涉及HER2表达细胞的细胞病症(包括瘤形成)的方法。

[0698] 在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和药物组合物用于治疗或预防有此需要的患者的疾病、病症或病况。该疾病、病症或病况的特征可以是与HER2物理上偶联的细胞
(例如细胞表达HER2，使得HER2在细胞表面表达)。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分
子和药物组合物用于在此需要的患者中治疗或预防癌症、肿瘤(恶性和非恶性)、生长异常、
免疫紊乱和/或微生物感染。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和药物组合物用于
在此需要的患者中治疗或预防癌症、肿瘤(恶性和非恶性)和/或生长异常。在某些实施方案
中，本发明的细胞靶向分子和药物组合物用于在此需要的患者中治疗或预防癌症和/或肿
瘤(恶性和非恶性)。癌症、肿瘤、生长异常、免疫紊乱和/或微生物感染可以通过与HER2物理
偶联的细胞(例如细胞表达HER2，使得HER2在细胞表面表达)来表征。“有此需要的患者”如
本文所述。在某些实施方案中，“有此需要的患者”先前已经用一种或更多种另外的HER2靶
向治疗剂治疗；和/或正在经历用一种或更多种另外的HER2靶向治疗剂治疗。对于某些实施
方案，“有此需要的患者”先前已经用一种或更多种如本文所述的另外的HER2靶向治疗剂治
疗。对于某些实施方案，“有此需要的患者”正在经历用一种或更多种如本文所述的另外的
HER2靶向治疗剂治疗。对于某些实施方案，“有此需要的患者”对一种或更多种如本文所述
的另外的HER2靶向治疗剂的治疗没有反应或没有受益。对于某些实施方案，在有此需要的
患者中治疗或预防疾病、病症或病况可进一步包括向患者施用治疗有效量的一种或更多种
另外的HER2靶向治疗剂的步骤。另外的HER2靶向治疗剂如本文所述。

[0699] 在某些实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物受试者诸如人的恶性肿瘤或赘生物和其他血细胞相关癌症的方法，该方法包括向有需要其的受试者施用治疗有效量的本发
明的细胞毒性细胞靶向分子或药物组合物的步骤。

[0700] 本发明的细胞靶向分子和药物组合物具有不同的应用。本发明的细胞靶向分子和药物组合物通常是抗肿瘤剂——意味着它们能够通过抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或造
成癌症或肿瘤细胞的死亡而治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟或扩散。然而，本
发明的细胞靶向分子或药物组合物的某些实施方案用于治疗免疫紊乱，例如T细胞、B细胞，
浆细胞或抗体介导的疾病或病症。

[0701] 本发明的细胞靶向分子和药物组合物的某些实施方案可用于治疗癌症的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物。对于本
发明方法的某些实施方案，所治疗的癌症选自由以下各项组成的组：骨癌(诸如多发性骨髓
瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞
瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌)、腺癌(诸如胰腺
癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜
癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、
卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)和子宫癌。对
于某些实施方案，待治疗的癌症选自由如下各项组成的组：乳腺癌、胃癌、尿路上皮癌、膀胱
癌、尿路上皮膀胱癌，浆液性子宫癌，肝外胆管癌和胆管癌(biliary carcinoma)。对于某些
实施方案，所治疗的癌症是乳腺癌和/或胃肠癌。

[0702] 在本发明的某些实施方案中，使用本发明的志贺毒素效应多肽或细胞靶向分子作为药物组合物或药物的组分，用于治疗或预防癌症、肿瘤、其他生长异常、免疫紊乱和/或微
生物感染。例如，可以用这种药物治疗皮肤肿瘤，以努力减小肿瘤大小或完全消除肿瘤。

[0703] 在本发明的某些实施方案中，是使用本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物标记或检测赘生性细胞的内部的方法。该方法可以基于本发
明的某些细胞靶向分子进入特定细胞类型并通过逆向细胞内运输在细胞内按路线发送至
特定细胞类型的内部区室用于标记检测的能力。这可以在患者内在细胞上原位执行，或在
从生物体取出的细胞和组织(例如活组织检查材料)上执行。

[0704] 为了关于疾病、病况和/或病症的信息收集的目的，在本发明的某些实施方案中，是使用本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物来检测细
胞类型的存在的方法。疾病、病症或病况可以通过与HER2物理偶联的细胞来表征。HER2靶生
物分子可以物理偶联到该细胞的表面。对于某些实施方案，疾病、病症或病况可以通过表达
HER2靶生物分子的细胞(包括过表达HER2的细胞)来表征。HER2可以在细胞表面表达(包括
过表达)。所述方法包括使细胞与诊断上足够量的本发明的细胞靶向分子接触，以通过测定
或诊断技术检测所述分子。短语“诊断足够量”表示为了信息收集目的通过利用的特定测定
或诊断技术提供充分检测和准确测量的量。通常，对于完整生物体内诊断用途，诊断上足够
的量将是每位受试者0.001至10毫克本发明的检测促进剂连接的细胞靶向分子/kg受试者
的非累积剂量。典型地，在这些信息收集方法中使用的本发明的细胞靶向分子的量将尽可
能低，前提条件是,它仍然是诊断足够量。例如，对于生物体内的体内检测，施用给受试者的
本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分子或药物组合物的量将尽可能地低。

[0705] 本发明细胞靶向分子的细胞类型特异性靶向与检测促进剂组合提供了检测并成像细胞的方式，所述细胞与本发明分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联。使用本
发明的细胞靶向分子对细胞成像可以通过本领域已知的任何合适的技术在体外或体内进
行。可以使用本领域已知的各种方法收集诊断信息，包括生物体的全身成像或使用取自生
物体的离体样品。本文中使用的术语“样品”表示任意数目的物品，但不限于，流体诸如血
液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液，以及通过活组织检查操作得到的组织。例如，通过技术诸如磁共振成像(MRI)、光学方法(诸如直接的、荧光的和生物发光
的成像)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、超声、x-射线计
算机断层扫描和前述技术的组合，多种检测促进剂可以用于非侵入性体内肿瘤成像(关于
综述，参见Kaur S等，Cancer Lett 315:97-111(2012))。

[0706] 在本发明的某些实施方案中，是在诊断组合物中使用本发明的志贺毒素效应多肽、细胞靶向分子或药物组合物以标记或检测血细胞、癌细胞、肿瘤细胞、受感染的细胞和/
或免疫细胞的内部的方法(参见例如Koyama Y等人,Clin Cancer Res 13:2936-45(2007)；
Ogawa M等人,Cancer Res 69:1268-72(2009)；Yang L等人,Small 5:235-43(2009))。基于
本发明的某些细胞靶向分子进入特定细胞类型并通过逆向细胞内运输在细胞内按路线发
送的能力，特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者内在细胞上原位执行，
或在从生物体取出的细胞和组织(例如活组织检查材料)上执行。

[0707] 本发明的诊断组合物可以用于将疾病、病症或病况表征为本发明的有关药物组合物潜在地可治疗的。本发明的物质的某些组合物可以用于确定患者是否属于对利用如本文
中所述的本发明的化合物、组合物或有关方法的治疗策略做出应答或非常适合使用本发明
的递送装置的组。

[0708] 可以在检测出疾病(例如癌症)以后使用本发明的诊断组合物，以便更好地表征它，诸如以监测远距离转移、异质性和癌症进展阶段。疾病病症或感染的表型评估可以帮助
在做出治疗决策的过程中的预后和预测。在疾病复发中，本发明的某些方法可用于确定是
局部还是全身问题。

[0709] 本发明的诊断组合物可以用于评估对治疗剂的应答，无论治疗的类型，例如小分子药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如，本发明的诊断的某些实施方案可以用于测量肿
瘤大小的变化、抗原阳性细胞群体(包括数目和分布)的变化、或监测已经施用给患者的疗
法所靶向的抗原以外的不同标志物(参见Smith-Jones P等，Nat.Biotechnol 22:701-6
(2004)；Evans M等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:9578-82(2011))。

[0710] 用于检测细胞型的存在的方法的某些实施方案可以用于收集关于疾病、病症和病况的信息，所述疾病、病症和病况诸如，例如，骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺
癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌
或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌)、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细
胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、
淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞
肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤或滑膜肉
瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)、子宫癌、急性淋巴母细胞白血病
(acute lymphoblastic leukemia)(ALL)、T急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓性
白血病、急性髓样白血病(acute myeloid leukemia)(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-
CLL)、B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)(BL)、慢性淋巴细胞
白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML-BP)、慢性髓样白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤
泡型淋巴瘤(follicular lymphoma)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、霍奇金
淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)(HL)、血管内大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病
(lymphomatoid granulomatosis)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、
MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、多发性骨髓瘤(MM)、天然杀伤细胞白
血病、结节边缘B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞白血病、浆细胞瘤
(plasmacytoma)、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma)、幼淋巴细胞白血病
(pro-lymphocytic leukemia)、早幼粒细胞性白血病(promyelocytic leukemia)、小淋巴
细胞淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤(splenic marginal zone lymphoma)、T细胞淋巴瘤(TCL)、重
链疾病(heavy chain disease)、单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy)、单克隆
免疫球蛋白沉积病、骨髓增生异常综合征(myelodusplastic syndromes)(MDS)、郁积型多
发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom
macroglobulinemia)。

[0711] 在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应多肽和细胞靶向分子或其药物组合物用于诊断和治疗，或单独用于诊断。在一些情况下，会期望在选择本发明的细胞靶向分子用
于治疗之前确定或验证受试者和/或来自受试者例如需要治疗的患者的患病组织中表达的
HLA变体和/或HLA等位基因。

[0712] 本发明的志贺毒素效应多肽和本发明的细胞靶向分子的任何实施方案(例如，概述中的实施方案组#1-3的实施方案)可以与本发明的所述方法的各个单独的实施方案一起
使用。

[0713] 通过以下：1)本发明的志贺毒素效应多肽，2)本发明的细胞靶向分子，和3)本发明的细胞毒性的细胞靶向分子，其包含上述多肽并且能够特异性靶向某些细胞类型的非限制
性实施例进一步说明本发明。
实施例

[0714] 以下实施例证实了本发明的某些实施方案。但是，应当理解，这些实施例仅仅用于解释目的，且不意图、也不应当解释为对本发明的条件和范围的一概限制。除了另外描述以
外，使用本领域技术人员众所周知的且常规的标准技术进行以下实施例中的实验。

[0715] 以下实施例描述了包含本发明的志贺毒素效应多肽的几种示例性细胞毒性志贺毒素A亚基来源的多肽支架。实施例中的志贺毒素效应多肽被去免疫化，同时保留有效的细
胞毒活性。

[0716] 以下实施例还描述了几种细胞毒性细胞靶向分子，每个分子包含志贺毒素效应多肽，其直接或间接连接至细胞靶向结合区域，所述细胞靶向结合区域能够特异性结合与细
胞的细胞表面物理缔合的HER2靶生物分子的细胞外部分。下文描述的示例性细胞毒性细胞
靶向分子与被靶向的肿瘤细胞类型表达的细胞表面靶生物分子结合并进入那些靶细胞。内
化的细胞靶向分子有效地将它们的志贺毒素效应多肽按路径发送至靶细胞的细胞溶胶，其
中志贺毒素效应多肽使核糖体失活并随后引起靶细胞的凋亡性死亡。

[0717] 另外，示例性细胞靶向分子中的一些包含蛋白酶切割抗性去免疫化的志贺毒素效应多肽，与包含弗林蛋白酶切割抗性志贺毒素效应多肽的亲本细胞毒性分子(其未通过额
外的内源性表位区域的破坏而进一步去免疫化)相比，所述蛋白酶切割抗性去免疫化的志
贺毒素效应多肽显示出改善的体内免疫原性谱(抗体应答的降低)。此外，与包含更加蛋白
酶切割敏感的志贺毒素效应多肽区域的相关细胞靶向分子相比，这些示例性的蛋白酶切割
抗性的去免疫化细胞靶向分子表现出改善的体内耐受性。

[0718] 以下实施例描述了本发明的某些细胞靶向分子及其性质。某些实施例描述了本发明的细胞靶向分子，其中志贺毒素效应多肽组分(1)被去免疫化；(2)位于或邻近细胞靶向
分子的多肽组分的氨基末端；(3)是弗林蛋白酶抗性的；和/或(4)包含嵌入或插入的T细胞
表位。

[0719] 实施例1包含弗林蛋白酶切割抗性志贺毒素A亚基来源的多肽的HER2靶向分子

[0720] 被构建并测试多种HER2靶向分子用于杀伤HER2阳性癌细胞，每个HER2靶向分子包含(1)靶向HER2的至少一个免疫球蛋白型结合区域和(2)至少一个志贺毒素A亚基效应多
肽。

[0721] A.HER2靶向分子的构建和产生

[0722] 使用各种志贺毒素A亚基效应多肽(每种能够提供一种或更多种志贺毒素A亚基功能)和各种免疫球蛋白型结合区域(每个能够结合人HER2的细胞外部分，诸如细胞靶向结合
区域)，设计靶向HER2的细胞毒性细胞靶向分子。这些HER2靶向分子的免疫球蛋白型结合区
域要么是单链抗体可变片段要么是骆驼科VHH，其以高亲和力、特异性和选择性结合至物理
偶联于人癌细胞表面的细胞表面HER2靶生物分子。构建编码包含上述组分：(1)至少一种抗
HER2抗体可变片段和(2)至少一种志贺毒素A亚基效应多肽的融合蛋白的多核苷酸。这些多
核苷酸用于产生本发明的细胞毒性细胞靶向分子，包括114773(SEQ ID NO:22),115172
(SEQ ID NO:23),114778(SEQ ID NO:24),114795(SEQ ID NO:25),114791(SEQ ID NO:
26),114912(SEQ ID NO:28),115111(SEQ ID NO:29),115411(SEQ ID NO:30),114898(SEQ
ID NO31),115195(SEQ ID NO:32),115194(SEQ ID NO:33),115645(SEQ ID NO:34),和
115845(SEQ ID NO:35)。在该实施例的实验中测试的所有细胞靶向分子，包括参照细胞靶
向分子，都在细菌系统中产生，并使用本领域技术人员熟知的技术通过柱色谱法纯化。通过
使用融合亲和标签，例如壳多糖结合结构域(SEQ ID NO:43)或6xHis多组氨酸标签(SEQ ID
NO:44)，促进了本发明的某些示例性HER2靶向分子的纯化。

[0723] 1.基于壳多糖亲和力的纯化

[0724] 对于该实施例的某些示例性HER2结合蛋白，基本上如IMPACTTM的制造商手册中所描述的(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)
system(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.A.)进行克隆和纯化。用于纯化本实施例
的一些HER2靶向分子的亲和标签是内含肽壳多糖结合结构域(CBD)序列(SEQ ID NO:43)，
其使用大肠杆菌表达载体pTxb1(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.A.)与本实施例
的一些融合蛋白的羧基末端融合。这些CBD融合蛋白在细菌中表达，从可溶性级分中提取，
然后使其与壳多糖柱结合。然后通过与二硫苏糖醇(DTT)一起温育将内含肽从融合蛋白上
切下，并在去除CBD亲和标签(SEQ ID NO:43)后将目的HER2结合蛋白从壳多糖柱上洗脱掉。

[0725] 表达本发明的示例性HER2靶向融合蛋白114778(SEQ ID NO:24)、114795(SEQ ID NO:25)和114791(SEQ ID NO:26)，并通过SDS-PAGE分析样品(图2)。所有这三种蛋白质样品
主要包含在还原条件下通过SDS-PAGE测量的约55kDa的蛋白质种类(图2)。

[0726] 然后使用以下细胞毒性测定法测试这些示例性HER2靶向分子的细胞毒活性。将某些人肿瘤细胞系细胞铺板在384孔板中的20μL细胞培养基中(通常每孔1–2x 103细胞用于
贴壁细胞，在添加HER2靶向分子的前一天或当天铺板)。在合适的缓冲液中制备待测分子的
一系列稀释液(通常为10倍)，并将5μL稀释液或仅含缓冲液的对照加入到铺板的细胞中。仅
含细胞培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与HER2靶向分子或仅缓冲液在37℃和
5％二氧化碳(CO2)的空气中温育3或5天。总细胞存活率或存活百分比根据制造商的说明书
使用发光细胞存活力测定法(Promega Corp.,Madison,WI,U.S.A.)使用发
光读数测定。测试的人细胞包括来自HCC1954和NCI/ADR-RES细胞系的细胞，其中用HER2表
达载体转染NCI/ADR-RES细胞的某些样品以使它们以足够的量表达HER2至细胞表面以使它
们是HER2阳性的(本文称为“NCI/ADR-RES-HER2+”)。

[0727] 使用以下等式计算实验孔中细胞的活力百分比:(测试RLU-平均培养基RLU)÷(平均细胞RLU-平均培养基RLU)×100。细胞靶向分子蛋白浓度与百分比存活率的对数在Prism
(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.A.)中作图，且log(抑制剂)与响应(3参数)分析或
log(抑制剂)与归一化响应分析用于测定测试分子的半数最大细胞毒性浓度(CD50)值。在可
能时，计算每种测试分子的CD50值。当CD50值无法根据测试浓度曲线的形状计算时，则注意
到CD50值超出最大测试浓度。用GraphPad Prism完成所有图和非线性回归，并用FloJo软件
分析流式细胞术数据。

[0728] 细胞毒性测定的结果报告如下(参见表1和图3)。示例性HER2靶向分子114778(SEQ ID NO:24)、114795(SEQ ID NO:25)和114791(SEQ ID NO:26)对HER2阳性细胞是细胞毒性
的(表1；图3)。在一些实验中，HER2阴性细胞也在稀释系列中用最大浓度的HER2-靶向分子
处理，并且在这些条件下，与仅含缓冲液的对照相比，HER2阴性细胞的活力没有显示任何变
化。

[0729] 表1.使用壳多糖结合亲和标签和远离该标签的内含物介导的切割纯化的本发明的示例性HER2靶向分子的细胞毒性

[0730]

[0731]

[0732] 该数据证明了在114795(SEQ ID NO:25)，114778(SEQ ID NO:24)和114791(SEQ ID NO:26)中的相似的细胞毒性效力，所有这些都是使用IMPACTTM CBD内含肽亲和标签，壳
多糖结合纯化系统纯化的融合蛋白。

[0733] 2.基于蛋白L亲和力的纯化

[0734] 使用基于蛋白L结合亲和力的蛋白质纯化的备选方法，并与上文涉及IMPACTTM系统使用的内含肽-CBD亲和标签方法进行比较。细菌蛋白L和某些scFv之间的结合亲和力用于
纯化本发明的示例性HER2靶向分子：包含羧基末端内含肽-CBD标签(SEQ ID NO:43)的
114773(SEQ ID NO:22)、114912(SEQ ID NO:28)、115111(SEQ ID No:29)和115411(SEQ ID
NO:30)。图4-5显示了使用蛋白L结合亲和法纯化后，114773(SEQ ID NO:22)、114791(SEQ
ID NO:26)、114912(SEQ ID NO:28)、115111(SEQ ID NO:29)和115411(SEQ ID NO:30)的样
品的SDS-PAGE分析。

[0735] 图4显示了使用蛋白L结合亲和方法纯化后，114773(SEQ ID NO:22)(具有羧基末端内含肽-CBD标签(SEQ ID No:43))和114791(SEQ ID NO:26)(具有羧基末端内含肽-CBD
标签(SEQ ID NO:43)样品的SDS-PAGE分析。图5显示了114912(SEQ ID NO:28)(没有任何内
含肽-DCM标签)、115111(SEQ ID NO:29)(没有任何内含肽-CBD标签)和115411(SEQ ID NO:
30)(没有任何内含肽-CBD标签)的SDS-PAGE分析。

[0736] 使用蛋白L结合纯化的示例性HER2靶向分子114912(SEQ ID No:28)和115111(SEQ ID No:29)使用如上所述的针对使用CBD内含肽系统纯化的样品的测定法测试细胞毒性。细
胞毒性测定的结果报告如下(参见表2和图6)。

[0737] 表2.使用蛋白L结合亲和力纯化的本发明的示例性HER2靶向分子

[0738] 的细胞毒性

[0739]

[0740] 示例性HER2靶向融合蛋白114912(SEQ ID NO:28)和115111(SEQ ID NO:29)对HER2阳性细胞是细胞毒性的(表2；图6)。该数据证明115111(SEQ ID No:29)与114912(SEQ
ID NO:28)相比具有更高的细胞毒性效力，两者均使用蛋白L亲和纯化。对于大多数测试的
HER2-靶向分子浓度，观察到对表达非常低水平的HER2的MCF-7细胞没有细胞毒性(图6)。

[0741] 使用上述细胞毒性测定法测试与115111(SEQ ID NO:29)相关的本发明的另外的示例性HER2靶向分子对HER2阳性细胞系的细胞毒活性。蛋白质115172(SEQ ID NO:23)、
115195(SEQ ID No:32)和115194(SEQ ID No:33)与115111(SEQ ID NO:29)相关，因为它们
各自包含相同的重可变结构域和轻可变结构域。

[0742] 技术人员将理解，scFv中可变结构域之间的接头(或“结构域间接头”)长度可以影响非共价多聚体多价分子的自发组合。通常，长度在三个氨基酸残基和十二个氨基酸残基
之间的接头(例如五聚体G4S(SEQ ID NO:94))通过分子间可变结构域交换促进双抗体形
成；而较长的接头(例如(G4S)5(SEQ ID NO:92))允许分子内重链和轻链配对，产生占主导地
位的单体分子(参见例如WO 2018/140427)。115111(SEQ ID NO:29)包含25-聚体结构域间
接头，并证实其主要形成单价单体。115195(SEQ ID NO:32)包含五聚体结构域间接头，并证
实主要形成二价二聚体。115194(SEQ ID NO:33)包含与具有相同五聚体结构域间接头的
115195(SEQ ID NO:32)相同scFv，并且预测形成二价二聚体如115195(SEQ ID NO:32)。
115172(SEQ ID No:23)和115194(SEQ ID No:33)与115111(SEQ ID NO:29)和115195(SEQ
ID NO:32)的不同之处在于其志贺毒素A亚基效应多肽SLTA-FR(SEQ ID NO:37)主要包含野
生型序列，所述野生型序列仅在A1片段的羧基末端的最小弗林蛋白酶切割位点具有突变，
并且破坏表位区域#8(表B，同上)。这些分子的细胞毒性数据报告如下(见表3和图7)。

[0743] 表3.115111和相关HER2靶向分子的细胞毒性

[0744]

[0745] 来自该细胞毒性实验的数据表明单体115111(SEQ ID No:29)、二聚体115195(SEQ ID No:32)、预测的单体115172(SEQ ID NO:23)和预测的二聚体115194(SEQ ID NO:33)都
在体外表现出相似的细胞毒活性(参见例如表3和图7)。对于大多数测试的HER2靶向分子浓
度(例如浓度低于100ng/mL)，未观察到对HER2阴性细胞的细胞毒性。

[0746] B.测试本发明的示例性HER2靶向分子的体外活性

[0747] 1.核糖体抑制活性

[0748] 纯化后，使用如上所述的蛋白L结合测试本发明的示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID No:29)和115411(SEQ ID NO:30)的酶活性。将它们关于核糖体失活的催化活性与
仅去免疫化的SLT-1A1片段(DI-2(SEQ ID NO:20))和包含大多数野生型SLT-1A1序列(SEQ
ID NO:37)的HER2靶向分子115172(SEQ ID NO:23)比较，所述大多数野生型SLT-1A1序列具
有仅突变弗林蛋白酶切割基序(SLTA-FR)和破坏表位区域#8(表B，同上)的改变。

[0749] 核糖体抑制测定使用用快速偶联转录/翻译试剂盒(L1170Promega Madison,WI,U.S.A.)的无细胞的体外蛋白质翻译测定法。该试剂盒包括萤光素酶T7对照
DNA(L4821Promega Madison,WI,U.S.A.)和 Quick Master Mix。根据制造商说明书
制备核糖体活性反应。在适当的缓冲液中制备一系列(通常10倍)稀释液，并为每种稀释液
生成一系列相同的TNT反应混合物组分。将蛋白质样品与每种TNT反应混合物以及萤光素酶
T7对照DNA组合。将测试样品在30℃下温育1.5小时。孵育后，将萤光素酶测定试剂
(E1483Promega,Madison,WI,U.S.A.)加入到所有测试样品中，并根据制造商说明书通过发
光测量萤光素酶蛋白质翻译的量。通过总蛋白的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线
性回归分析，确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)，
使用Prism软件在标题剂量-响应-抑制下的log(抑制剂)相对于响应(三参数)的函数[Y＝
底部+((顶部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]计算每个样品的半数最大抑制浓度(IC50)值。
核糖体抑制测定的结果报告如下(参见表4和图8)。

[0750] 表4.使用蛋白L结合亲和力纯化的示例性HER2靶向分子的核糖体抑制活性和细胞毒性

[0751]

[0752] 本发明的示例性HER2靶向融合蛋白115172(SEQ ID NO:23)、115111(SEQ ID No:29)和115411(SEQ ID NO:30)以高效力抑制核糖体，例如，在低皮摩尔(pM)范围内(见表4；
图8)。针对115111(SEQ ID NO:29)测量的核糖体抑制的IC50值为24.2pM(表4)。志贺毒素效
应多肽SLTA-DI-2(SEQ ID NO:20)和示例性HER2靶向分子115172(SEQ ID NO:23)、115111
(SEQ ID No:29)和115411(SEQ ID NO:30)显示出的相似水平的蛋白质核糖体抑制，证明了
这些分子保留了作为融合蛋白的预期作用机制(蛋白质合成的催化抑制)，其中志贺毒素A
亚基效应多肽组分115111(SEQ ID NO:29)或115411(SEQ ID NO:30)或115172(SEQ ID NO:
23)与免疫球蛋白型HER2靶向结合区域融合。

[0753] 还测试了示例性HER2靶向分子115172(SEQ ID NO:23)、115111(SEQ ID No:29)和115411(SEQ ID NO:30)对如上所述的用HER2转染的HER2阳性的NCI/ADR-RES细胞的细胞毒
活性，结果在此处报道，在上表4和图9中。将这些示例性HER2靶向融合蛋白的细胞毒活性与
单独的去免疫化SLT-1A1片段(SLTA-DI-2(SEQ ID NO:20))和HER2靶向分子115172(SEQ ID
NO:23)进行比较，所述HER2靶向分子115172包含志贺样毒素A1片段SLTA-FR(SEQ ID NO:
37)，所述志贺样毒素A1片段SLTA-FR具有突变弗林蛋白酶切割基序和破坏表位区域#8的改
变(表B，同上)。来自该实验的细胞毒性数据证明HER2靶向部分是杀伤靶细胞所必需的，因
为使用非靶向的SLTA-DI-2构建体(SEQ ID NO:20)，在浓度高达2,000μg/mL时没有细胞毒
性作用(见图9)。对于NCI/ADR-RES-HER2+细胞，为115111(SEQ ID NO:29)测量的细胞毒性
CD50值为1.2ng/mL。

[0754] 2.HER2结合活性

[0755] 为了研究本发明的示例性HER2靶向分子的细胞结合特性，使用基于流式细胞术的方法测量HER2靶向分子对人HER2阳性HCC1954细胞的结合活性。将正在测试的每种HER2靶
向分子的稀释系列加入细胞中，洗涤细胞，并使用与FITC缀合的抗SLTA-DI-2单克隆抗体
(mAb)检测细胞结合的HER2靶向蛋白，所述mAb识别去免疫化的志贺毒素效应多肽(例如SEQ
ID NO:20)。使用流式细胞术测量FITC信号以生成每个样品的平均荧光强度(MFI)值。将MFI
值作为对数转化的HER2靶向分子浓度的函数作图，以使用非线性曲线回归分析(Prism
(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.A.,Prism software function sigmoidal 4PL))确
定Bmax和KD。该研究的结果报告如下(参见表5和图10)。

[0756] 表5.HER2靶向分子与HER2阳性HCC1954细胞的结合

[0757]

[0758] 本发明的示例性HER2靶向融合蛋白115111(SEQ ID NO:29)、115845(SEQ ID NO:35)和115195(SEQ ID NO:32)在体外表现出与HCC1954细胞相似的结合。115111(SEQ ID
NO:29)以0.42μg/mL的KD结合HER2阳性HCC1954细胞，且11584以0.32μg/mL的KD结合HER2阳
性HCC1954细胞。在该结合测定中，与其他测试的HER2靶向分子相比，114912(SEQ ID NO:
28)对HCC1954细胞的结合亲和力略低。在该测定中，115645(SEQ ID NO:34)表现出相似的
KD，但与其他测试的HER2靶向分子相比具有降低的Bmax。

[0759] a.通过示例性HER2靶向分子115111结合的HER2表位定位

[0760] 使用通过Integral Molecular(Philadelphia,PA,U.S.A.)的鸟枪诱变方法定位由115111(SEQ ID NO:29)结合的人HER2的细胞外表位以鉴定接触残基。为了确定用于筛选
HER2表位结合的115111(SEQ ID NO:29)的最佳浓度，用设计为表达靶人HER2蛋白(UniProt
ID:P04626(SEQ ID NO:38))的野生型(WT)构建体的载体或单独的载体以384孔形式转染
HEK-293T细胞。通过高通量流式细胞术测试115111(SEQ ID NO:29)的系列稀释对表达WT
HER2靶蛋白(SEQ ID NO:38)或仅载体的细胞的免疫反应性。基于原始信号值和信号-至-背
景计算确定针对该结合测定的115111(SEQ ID NO:29)的最佳筛选浓度。进行相同的过程以
确定对照HER2结合抗体曲妥珠单抗的最佳筛选浓度。

[0761] 创建基于上述人HER2蛋白(SEQ ID NO:38)的丙氨酸扫描诱变文库，并通过高通量流式细胞术一式两份的筛选115111(SEQ ID NO:29)结合。对于每个测试点，从原始数据中
减去背景荧光，然后将其归一化至与WT HER2蛋白(SEQ ID NO:38)结合的115111(SEQ ID
NO:29)。鉴定了与115111(SEQ ID NO:29)与WT HER2(SEQ ID NO:38)的结合相关的关键诱
变克隆。对于115111(SEQ ID NO:29)结合至HER2(SEQ ID No:38)的主要关键残基是当时与
115111(SEQ ID NO:29)测试时针对115111(SEQ ID NO:29)结合其突变减少的残基，但用于
测试曲妥珠单抗结合(HER2结合，阳性对照mAb)时，其与WT HER2靶蛋白对照相似。针对在WT
人HER2(SEQ ID No:38)中所选择的关键残基位点所得平均结合反应性值列于表6中，所述
平均结合反应性值表示为用此表位定位测定法测量的与115111(SEQ ID NO:29)结合的WT
HER2的百分比。

[0762] 表6.参与结合115111的HER2中的某些关键的和次要的残基

[0763]

[0764] 使用上述方法，由115111(SEQ ID NO:29)结合的HER2表位似乎包含Y112、Q178和L181，它们全部定位于HER2细胞外结构域(ECD)的结构域I(NCBI登录号NP_004439.2，氨基
酸残基23至653)(SEQ ID NO:39)。一个残基，G152，在表位定位测定中鉴定为次级残基，因
为它不符合“关键”的阈值指导，但是G152A突变确实导致与WT HER2(SEQ ID NO:38)相比
115111(SEQ ID NO:29)结合的大量降低。与表达G152A的克隆的结合显示为WT结合的39％
的结合水平，与将G152分类为主要关键残基所需的35％阈值水平相对。HER2中的G152位置
与使用该测定法定位的主要关键残基非常邻近，这表明它也可以是由115111(SEQ ID NO:
29)结合的人HER2(SEQ ID NO:38)中的表位的一部分。

[0765] 图11显示了人HER2的图，其具有标记以突出显示如通过上述方法测量的由115111(SEQ ID NO:29)结合的关键和次级残基。图11中左侧，基于HER2的晶体结构(PDB 1S78,
Franklin M等人,Cancer Cell 5:317-28(2004))，将对与HER2(SEQ ID NO:38)结合的
115111(SEQ ID NO:29)的关键的主要残基可视化为红色球体以及将次级残基可视化为蓝
色球体。图11中右侧，基于以上数据和Cho H等人,Nature 421:756-60(2003)；Franklin M
等人,Cancer Cell 5:317-28(2004)中的信息，对于115111(SEQ ID NO:29)结合的关键
HER2结合残基显示为蓝色球体，对于帕妥珠单抗结合显示为品红色球体，并且对于曲妥珠
单抗结合显示为紫色球体。由115111(SEQ ID NO:29)结合的HER2表位在HER2细胞外结构域
(ECD)(SEQ ID NO:39)内定位至结构域I；相反，帕妥珠单抗结合至定位至HER2的ECD的结构
域II的表位，并且曲妥珠单抗结合至定位到HER2的ECD的结构域IV的表位(SEQ ID NO:39)
(参见图11)。因此，115111(SEQ ID NO:29)结合HER2中的表位，所述表位不同于曲妥珠单抗
和帕妥珠单抗结合的表位。

[0766] b.示例性HER2靶向分子115111的HER2结合特异性

[0767] 本发明的示例性HER2靶向融合蛋白115111(SEQ ID NO:29)的结合特异性、亲和力和选择性通过分析该纯化的融合蛋白与膜蛋白质组阵列的结合来测试，所述膜蛋白质组阵
列包含了待在HEK-293T细胞的细胞表面表达的转染的5,300种不同蛋白质(Integral
Molecular,Inc.,Philadelphia,PA,U.S.A.)。图12中显示的结果显示，在5,300种蛋白质中
仅鉴定和验证了HER2作为115111(SEQ ID NO:29)的选择性结合靶标。

[0768] 3.细胞毒活性

[0769] 1.与其他药物相比的体外细胞毒活性

[0770] 115111(SEQ ID NO:29)对HER2阳性细胞的细胞毒性与参照HER2靶向治疗剂(包括T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)相比较并与其组合进行评价。由
于所有这些治疗性分子特异性结合人HER2的细胞外部分，这些分子可能彼此竞争HER2结合
或其他方面相互作用以便在组合时改变其功能活性。例如，当组合施用不同的细胞毒性
HER2靶向分子时，可观察到针对HER2阳性细胞的细胞毒性活性的降低或升高。在另一个实
例中，当组合施用不同的细胞毒性HER2靶向分子时，由于对细胞毒性的累加或协同作用，可
观察到HER2表达细胞死亡的增加。

[0771] 为了研究不同细胞类型的细胞的细胞表面上可能的HER2受体的数量，进行实验以量化每个细胞结合的HER2靶向抗体分子的数量。该实验涉及了将细胞与缀合藻红蛋白(PE)
的抗HER2抗体(抗HER2-PE、克隆24D2、Biolegend,San Diego,CA,U.S.A.)一起温育。然后使
用流式细胞术分析样品以定量结合。使用具有已知PE负载的BD QuantibriteTMPE珠子生成
的标准曲线将MFI信号值转换为针对每个样品的每个细胞结合的抗体的数量。然后将这些
HER2阳性细胞用于基本上如上所述进行的细胞毒性测定中，以比较115111(SEQ ID NO:29)
对T-DM1和拉帕替尼的细胞毒活性。来自这些细胞毒性测定的结果报告于下文和表7中，并
且T-DM1的代表性数据集显示在图13中。

[0772] 表7.与T-DM1和拉帕替尼相比，115111的每个细胞HER2阳性细胞结合位点和体外细胞毒活性

[0773]

[0774]

[0775] ‘*’表示该测定中高于20％的细胞存活率平台；DNT＝没有测试

[0776] 115111(SEQ ID NO:29)对在该实验中测试的所有HER2+细胞显示出强效的细胞毒性：HCC1954、NCI-N87、HCC1569、HCC1419、AU565和JIMT-1细胞(表7；还参见表2-3，8-10；图
6-7和13-19)。

[0777] 115111(SEQ ID NO:29)和T-DM1均对HCCC1954、NCI-N87、HCC1569、HCC1419和AU565细胞具有强效的细胞毒性(表7)，其中115111比T-DM1对HCCC1954、NCI-N87、HCC1569
和HCC1419细胞表现出更高的细胞毒性效力(表7；参见例如图13)。115111(SEQ ID NO:29)
表现出比T-DM1对NCI/ADR-RES-HER2+和JIMT-1细胞更强效的细胞毒性(表7；参见图13)。

[0778] 由于MDR1表达，NCI/ADR-RES细胞被认为对T-DM1是抗性的。因为115111(SEQ ID NO:29)杀伤HER2阳性NCI/ADR-RES细胞(表2-3和7；图6-7，9和13)，115111(SEQ ID No:29)
可能对表达p-糖蛋白1(Pgp)型多药抗性外排泵的其他HER2阳性细胞是细胞毒性的。

[0779] 由于通过MUC-4和/或CD44表达表位掩蔽，JIMT-1细胞被认为对曲妥珠单抗是抗性的(参见例如Wilken J,Maihle N,Ann N Y Acad Sci 1210:53-65(2010))。因为115111
(SEQ ID NO:29)杀伤JIMT-1细胞(表1-2和7；图6-7)，MUC-4和/或CD44的存在不预防115111
(SEQ ID NO:29)细胞毒性，例如，通过表位掩蔽(参见例如图6-7和表7)。

[0780] 由于115111(SEQ ID NO:29)结合HER2的细胞外部分并内化到靶细胞中以寻找其核糖体用于失活，115111(SEQ ID NO:29)的细胞毒活性不依赖于HER2的激酶结构域的结合
或失活。相反，拉帕替尼是一种双酪氨酸激酶抑制剂，其通过与其激酶结构域结合并抑制激
酶活性来靶向HER2和EGFR。依赖于拉帕替尼等药物的癌症疗法可能变得不太有效，因为抗
性机制的发展，例如HER2的激酶催化结构域中的保护性突变或从头异常导致组成型/不受
调节的HER2-信号传导途径激活或在HER2下游的点的HER2-信号传导途径过度活化，从而在
诸如没有HER2激酶活性或甚至HER2表达的情况下绕过受体。因此，本发明的某些HER2靶向
分子(例如115111(SEQ ID NO:29))可以在难治性或无应答的治疗抗性环境(例如，对涉及
酪氨酸激酶抑制剂(例如拉帕替尼和/或奈拉替尼)的治疗有抗性的肿瘤)中有效。

[0781] 2.其他药物存在下的细胞毒活性

[0782] a.拉帕替尼和T-DM1

[0783] 使用基本上如上所述进行的细胞毒性测定，与拉帕替尼或T-DM1组合评价115111(SEQ ID NO:29)对HER2阳性细胞的细胞毒性。与1μM拉帕替尼或一系列T-DM1浓度相结合的
一系列浓度范围的115111(SEQ ID NO:29)的细胞毒性显示在图14和15中。在该体外细胞杀
伤测定中观察到的组合均未显示出对由115111(SEQ ID NO:29)对HER2阳性细胞引起的细
胞毒性有害。此外，这些实验的结果显示115111(SEQ ID NO:29)与其他试剂的组合可能对
HER2表达细胞实现更强效的细胞毒性。

[0784] 图14显示使用HER2阳性HCC1419或HCC1954细胞的细胞毒性测定的结果，其中将115111(SEQ ID NO:29)、拉帕替尼或两者的组合施用至细胞。选择115111(SEQ ID NO:29)
和拉帕替尼的浓度，使得单一药剂对每种细胞系产生约50％的活力。该实验的结果显示
115111(SEQ ID NO:29)可以与拉帕替尼一起施用以实现比单独施用更具细胞毒性。图14中
的数据显示通过组合115111(SEQ ID No:29)和拉帕替尼比单独用拉帕替尼或115111(SEQ
ID NO:29)的处理杀死更高百分比的细胞。这些结果显示115111(SEQ ID NO:29)可以与拉
帕替尼(laptinib)组合和/或可以在拉帕替尼存在下施用而对HER2阳性细胞的115111(SEQ
ID NO:29)细胞杀伤活性没有显著损失。此外，这些结果表明，115111(SEQ ID NO:29)(或本
发明的类似HER2靶向分子)和拉帕替尼的组合的施用比在相同的各自剂量下单独使用任一
种可杀死更多的HER2阳性细胞。

[0785] 图15显示使用HER2阳性HCC1954细胞的细胞毒性测定的结果，其中将115111(SEQ ID NO:29)、T-DM1或两者的组合施用至细胞。图15中的数据显示通过组合115111(SEQ ID
No:29)和T-DM1比单独用T-DM1或115111(SEQ ID NO:29)的处理杀死更高百分比的细胞。这
些结果显示115111(SEQ ID NO:29)可以与T-DM1组合和/或可以在T-DM1存在下施用而对
HER2阳性细胞的115111(SEQ ID NO:29)细胞杀伤活性没有显著损失。此外，这些结果表明，
115111(SEQ ID NO:29)(或本发明的类似HER2靶向分子)和T-DM1的组合的施用比在相同的
各自剂量下单独使用任一种可杀死更多的HER2阳性细胞。

[0786] b.T-DM1和曲妥珠单抗

[0787] 使用基本上如上所述进行的细胞毒性测定，在过量曲妥珠单抗存在下评价114912(SEQ ID No:28)和115111(SEQ ID NO:29)对HER2阳性HCC1954细胞的细胞毒活性，不同之
处在于在加入其他HER2靶向分子之前，用曲妥珠单抗(20μg/mL)预处理细胞1小时。图16显
示了使用HER2阳性HCC1954细胞的细胞毒性测定的结果，其中在不存在曲妥珠单抗和存在
多余的曲妥珠单抗时，与T-DM1相比，评价114912(SEQ ID No:28)和115111(SEQ ID NO:29)
细胞毒活性。用过量曲妥珠单抗预处理HER2阳性癌细胞不改变115111(SEQ ID NO:29)的细
胞毒活性(参见图16，中间)。这与过量曲妥珠单抗与T-DM1或示例性HER2靶向分子114912
(SEQ ID NO:28)的组合形成对比，两者均包含曲妥珠单抗抗原结合区域的重可变结构域和
轻可变结构域。这些数据表明本发明的HER2靶向分子可以在存在结合非重叠表位并且不竞
争或干扰HER2靶向分子的作用机制的其他HER2结合治疗剂的情况下杀伤细胞(参见图11，
曲妥珠单抗与定位到ECD的结构域IV的表位结合，而115111(SEQ ID NO:29)与ECD的结构域
I相互作用)。单克隆抗体曲妥珠单抗在该体外细胞毒性测定中不显示细胞毒性(仅涉及
HER2阳性癌细胞和培养基)。

[0788] c.曲妥珠单抗和帕妥珠单抗

[0789] 使用基本上如上文描述进行的细胞毒性测定，在存在过量曲妥珠单抗、过量帕妥珠单抗或过量曲妥珠单抗和帕妥珠单抗两者的情况下评价115111(SEQ ID NO:29)对HER2
阳性细胞在一系列浓度下的细胞毒活性，除了在加入其他HER2靶向分子前，用曲妥珠单抗
(100μg/mL)，帕妥珠单抗(100μg/mL)或曲妥珠单抗(100μg/ml)和帕妥珠单抗(100μg/ml)
(总共200μg/ml抗体)预处理细胞1小时。图17和表8显示使用HER2阳性HCC1954或NCI-N87细
胞的细胞毒性测定的结果，其中在过量曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或两者的存在下评价了
115111(SEQ ID NO:29)活性。HER2靶向融合蛋白115111(SEQ ID NO:29)在过量曲妥珠单抗
存在下杀伤HCC1954细胞(图16-17)。115111(SEQ ID NO:29)在过量曲妥珠单抗和过量帕妥
珠单抗或过量两者存在下杀伤HCC1954细胞和NCI-N87细胞(图17)。单克隆抗体曲妥珠单抗
或帕妥珠单抗在该体外细胞毒性测定中不显示细胞杀伤活性(仅涉及癌细胞和培养基)。

[0790] 表8.在过量的曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗两者存在下115111的细胞毒活性

[0791]

[0792] 图17和表8中的数据显示，在高达20μg/mL的浓度下测试的HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)在过量的曲妥珠单抗或帕妥珠单抗(单独地100μg/mL或每种100μg/mL，总
共200μg/mL同时暴露)存在下对HER2表达细胞是细胞毒性的，从而表明涉及施用115111
(SEQ ID NO:29)和另一种HER靶向治疗剂(诸如具有非重叠HER2结合表位的单克隆抗体如
曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)的潜在组合疗法(参见例如图11)。因此，示例性HER2靶向分子
115111(SEQ ID NO:29)具有与其他HER2靶向疗法组合有效杀伤HER2表达癌细胞的潜力，只
要它们的HER2结合表位不同即可。

[0793] 本发明的HER2靶向分子的作用机制—内化和靶向核糖体失活—不同于靶向HER2的单克隆抗体(结合HER2的曲妥珠单抗诱导ADCC并抑制HER2信号传导)(结合HER2的帕妥珠
单抗抑制二聚化)，并且与抗体药物缀合物如T-DM1(靶向微管抑制)不同。依赖于使用不同
于HER2靶向分子所使用的作用机制的药物的癌症疗法可能变得不太有效，因为对这些其他
作用机制中的一种或更多种特异性的抗性机制的发展。例如，肿瘤可能对涉及结合特定
HER2表位的单克隆抗体(例如T-DM1、曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗，和/或涉及酪氨酸激酶
抑制剂，例如拉帕替尼和/或奈拉替尼)的治疗变得是抗性的。本发明的某些HER2靶向分子
(例如115111(SEQ ID NO:29))可以在难治性或无应答的治疗抗性环境(例如，对涉及T-
DM1、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼和/或奈拉替尼的治疗有抗性的肿瘤)中有效。此
外，本发明的HER2靶向分子的独特作用机制可以为有益-治疗抗性的/无应答患者的单一疗
法以及组合不同和/或互补作用机制的组合疗法(例如与T-DM1、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、
拉帕替尼和/或奈拉替尼的组合)提供新的机会。

[0794] 3.基于暴露持续时间的示例性HER2靶向分子的细胞毒性

[0795] 为了研究本发明的示例性HER2靶向分子的细胞毒性作用，进行动力学细胞杀伤实验。这里使用上文描述的细胞杀伤测定法，但HER2表达细胞暴露于HER2靶向分子的持续时
间不同。在该研究中，将HER2阳性SKBR3或HCC1954暴露于HER2靶向分子一段特定的和短的
持续时间(例如1或4小时)，然后洗涤细胞并更换培养基(“冲洗”)。在整个实验过程中，对照
样品用HER2靶向分子连续不断地温育(“不洗涤”)。通过将结果与在相同条件下单独用载体
处理的样品进行比较，将所有数据归一化。该研究的结果显示在表9-10和图18-19中。

[0796] 表9.在不同暴露持续时间后，示例性HER2靶向分子对HER2阳性SKBR3细胞的细胞毒性

[0797]

[0798]

[0799] *'N/A'表示不适用

[0800] 表10.在不同暴露持续时间下，HER2阳性HCC1954细胞的细胞毒性

[0801]

[0802] 在连续暴露下，115111(SEQ ID NO:29)对HER2阳性HCC1954细胞表现出5.6ng/mL的CD50值，其类似于针对115195(SEQ ID No:32)测量的3.9ng/mL的CD50值。在连续暴露下，
115111(SEQ ID NO:29)对HCC1954细胞表现出5.6和37.3ng/mL的CD50值，其类似于针对
115845(SEQ ID NO:35)测量的25.3ng/mL的CD50值和针对115645(SEQ ID No:34)测量的
41.5ng/mL的CD50值。然而，较短的暴露条件揭示了在115111(SEQ ID No:29)和115195(SEQ
ID NO:32)与测试的其他HER2靶向分子之间的一些令人惊讶的差异。

[0803] 来自这些实验的数据证明，当暴露于HER2表达细胞持续短时间(1至4小时)时，115111(SEQ ID NO:29)具有强效的细胞毒活性(参见表9-10和图18-19)。二聚体/二价
115195(SEQ ID No:32)与单体/单价115111(SEQ ID No:29)相关，仅在于接头(其影响多聚
化)不同，在连续和冲洗条件下表现出与115111(SEQ ID NO:29)相似的活性(表10，图19)。
相反，其他HER2靶向分子如114912(SEQ ID NO:28)、114898(SEQ ID NO:31)、115645(SEQ
ID No:34)和115845(SEQ ID NO:35)在较短的暴露持续时间内，与连续暴露相比，表现出在
细胞毒活性上更大的降低(参见例如表9-10和图18-19)。

[0804] 上文显示的HER2结合和催化活性数据没有提供明确的以下指示，即与测试的其他HER2靶向分子(例如基于曲妥珠单抗的114912(SEQ ID NO:28))相反，对于115111(SEQ ID
No:29)和115195(SEQ ID NO:32)，在相对短的暴露持续时间下细胞毒性效力最高。此外，在
连续暴露(例如，3至5天)的条件下收集的上述细胞毒性测定数据没有提供关于哪些HER2靶
向分子会在较短暴露持续时间(例如，4小时或更短时间)的条件下更强效的任何指示。

[0805] 比较不同的HER2靶向分子，显然结合亲和力并不总是与细胞毒活性相关。例如，115645(SEQ ID No:34)和115845(SEQ ID NO:35)对HER2阳性HCC 1954具有相似的细胞毒
活性(表10；图19)，但在通过Bmax测量的HER2结合方面则不同(表5和图10)。相反，115111
(SEQ ID No:29)比115845(SEQ ID NO:35)对HCC1954细胞有更强效的细胞毒性(参见表7-
9；图6-7和18-19)，但这两种HER2靶向分子证明了与那些细胞相似的Bmax和KD结合特征(参
见表5和10；图10)。较短持续时间的暴露揭示了分子之间的相当大的差异，并且这一发现无
法通过HER2结合数据、催化数据和连续暴露数据预测。

[0806] 4.HER2结合的物种交叉反应性

[0807] 在动物研究的准备中，体外结合测定用于研究115111(SEQ ID NO:29)与来自不同物种的重组HER2蛋白的结合。酶联免疫吸附测定(ELISA)板的孔用来源于人(SEQ ID NO:
38)、食蟹猴物种(GenBank EHH58073.1和NCBI参考XP_001090430.1(SEQ ID NO：40-41))和
小鼠(UnitProt P70424(SEQ ID NO:42))的重组HER2胞外结构域(ECD)蛋白包被。将孔封
闭、洗涤，然后与示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)、115195(SEQ ID No:32)或
114912(SEQ ID NO:28)之一温育。通过洗涤除去未结合的蛋白质，并使用识别这些分子中
的志贺毒素效应多肽组分的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的mAb抗SLTA-DI-2检测HER2结合的
HER2靶向分子。这些结合测定的结果报告如下(参见表11和图20)。

[0808] 表11.与来自不同物种的重组HER2蛋白的结合

[0809]

[0810] 表11和图20中的数据显示115111(SEQ ID No:29)、相关分子115195(SEQ ID NO:32)(其是单价115111(SEQ ID No:29)的二价二聚体变体(仅接头不同)和曲妥珠单抗结合
结构域来源的分子114912(SEQ ID NO:28)都与人和食蟹猴重组HER2ECD蛋白结合(北京义
翘神州科技有限公司(Sino Biological Inc.)，北京，中国，目录号分别为10004-H02H和
90295-C02H)。在该测定中，114912(SEQ ID NO:28)不结合小鼠HER2ECD蛋白(Sino
Biological Inc.(北京义翘神州科技有限公司(Sino Biological Inc.)，北京，中国，目录
号50714-M02H)。在该测定中，115111(SEQ ID NO:29)不与小鼠HER2ECD蛋白结合(图20)。如
表11和图20所示，单体/单价115111(SEQ ID No:29)和相关的二聚体/二价115195(SEQ ID
NO:32)表现出与人和食蟹猴重组HER2ECD蛋白类似的结合。尽管114912(SEQ ID NO:28)与
115111(SEQ ID No:29)和115195(SEQ ID No:32)在Bmax方面以相似的亲和力结合人和食
蟹猴HER2ECD蛋白(参见表11；图20)，与115111(SEQ ID No:29)和115195(SEQ ID No:32)两
者相比，基于曲妥珠单抗的114912(SEQ ID NO:28)显示出略高的KD(2至5倍)(参见表11)。

[0811] 体外数据总结：

[0812] 基于上述体外数据，测试的最有希望的HER2靶向分子是114912(SEQ ID NO:28)、115111(SEQ ID NO:29)、115195(SEQ ID NO:32)、115172(SEQ ID NO:23)、115194(SEQ ID
NO:33)、115411(SEQ ID NO:30)、115645(SEQ ID NO:34)和115845(SEQ ID NO:35)(参见表
1-3和9-10；图3、6-7和18-19)。这些HER2靶向分子在连续暴露的条件下在体外表现出强效
的细胞毒活性。在体外核糖体抑制测定中，在测试的HER2靶向分子之间未观察到显著差异。
在体外细胞结合测定中，在测试的HER2靶向分子之间观察到一些差异；然而，结合特征不一
定与细胞毒性效力相关(参见上文关于115645(SEQ ID No:34)和115845(SEQ ID NO:35)的
讨论)。上述体外细胞毒性数据未给出115111(SEQ ID NO:29)、115195(SEQ ID NO:32)、
115172(SEQ ID NO:23)、115194(SEQ ID NO:33)和115411(SEQ ID NO:30)中的哪个(些)分
子在体内是最有效和安全的指示。然而，115172(SEQ ID No:23)和115194(SEQ ID NO:33)
中的志贺毒素A亚基效应多肽组分比其他有希望的HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)、
115411(SEQ ID No:30)和115195(SEQ ID NO:32)的志贺毒素A亚基效应多肽组分的去免疫
化更少。因此，预期向动物施用115111(SEQ ID NO:29)、115411(SEQ ID No:30)或115195
(SEQ ID No:32)比施用115172(SEQ ID No:23)或115194(SEQ ID NO:33)更好地耐受。开展
了涉及以不同剂量施用不同示例性HER2靶向分子的动物研究，特别是用于辨别它们的安全
性特征和/或治疗癌症的功效的任何差异，并挑选最有希望的候选者进入人临床试验。上述
体外数据和115111(SEQ ID No:29)是单价的而115195(SEQ ID NO:32)形成二聚体二价分
子的事实都不表明这两种示例性HER2靶向分子中的哪一种可能在体内表现得更好。

[0813] C.本发明的示例性HER靶向分子的体内研究

[0814] 用动物模型来研究本发明的示例性HER靶向分子的体内作用。不同的小鼠品系用于在健康的免疫活性小鼠和免疫受损小鼠的异种移植肿瘤的施用之后测试115111(SEQ ID
NO:29)的作用，所述免疫受损小鼠由向那些小鼠注射在其细胞表面上表达HER2的人肿瘤细
胞而产生。非人灵长类动物用于研究115111(SEQ ID NO:29)向健康的非人灵长类动物静脉
内施用后的作用。观察到示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)比在动物中测试的其
他HER2靶向分子具有更好的耐受性。令人惊讶的是，观察到115111(SEQ ID NO:29)施用比
施用密切相关的候选HER2靶向分子115195(SEQ ID NO:32)更好地耐受。

[0815] 1.血清暴露

[0816] 免疫活性C57BL/6小鼠用于研究在1mg/kg体重的单剂量的静脉内(IV)施用后115111(SEQ ID No:29)和115195(SEQ ID NO:32)的血清暴露(药代动力学)。将HER2靶向分
子115111(SEQ ID No:29)和115195(SEQ ID NO:32)各自在磷酸缓冲盐水(PBS)中稀释，并
通过IV施用至小鼠，每个治疗组有三只小鼠。在每个时间点，从每只小鼠收集血清，并通过
中尺度发现测定法(Cambridge Biomedical Inc.,Boston,MA,U.S.A.)，使用重组人HER2蛋
白以捕获任何HER2结合分子并使用抗SLTA-DI-2mAb用于定量存在的HER2-靶向分子(均使
用标准曲线定量)，来测量HER2靶向分子的浓度。该研究的结果如表12所示。

[0817] 表12.在重复给药后的C57BL/6小鼠中对示例性HER2靶向分子的血清暴露

[0818]

[0819] 表12中的数据表明115195(SEQ ID No:32)的血清暴露显著长于小鼠中115111(SEQ ID NO:29)的血清暴露。

[0820] 2.耐受性

[0821] a.免疫活性小鼠中的耐受性

[0822] 免疫活性BALB/c小鼠用于研究示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)、115195(SEQ ID NO:32)和115194(SEQ ID NO:33)在重复施用至相
同小鼠(每只小鼠总共6个剂量)后，随着时间的推移的毒性和免疫原性。将115111(SEQ ID
NO:29)、115172(SEQ ID NO:23),115195(SEQ ID NO:32)和115194(SEQ ID NO:33)在PBS中
稀释并施用至小鼠(在第1、3、5、8、10和12天给药，以1mg/kg体重的剂量，每组n＝6，以静脉注射(IV))。作为对照，将仅含运载体的样品施用至阴性对照治疗组。在研究期间监测小鼠
的体重和健康状况。该研究的治疗耐受性结果显示在表13和图21中，体重和死亡的变化作
为耐受性的指标。与第0天相比，治疗组的平均体重百分比变化与治疗组中每种总动物的动
物死亡数一起显示。

[0823] 表13.重复给药后在BALB/c小鼠中示例性HER2靶向分子的效果

[0824]

[0825] *'N/A'表示不适用

[0826] 来自该研究的数据证明，115111(SEQ ID NO:29)是所测试的示例性HER靶向分子中最良好耐受的分子(参见表13和图21)。接受115111(SEQ ID NO:29)的小鼠组没有表现出
与对照组相比体重的减轻且没有动物死亡。相反，施用115195(SEQ ID NO:32)的小鼠组平
均每只小鼠体重减轻超过20％，并且在研究的前两周期间，6只小鼠中的5只(83％)死亡。这
表明单体/单价115111(SEQ ID No:29)比相关的二聚体/二价分子115195(SEQ ID NO:32)
具有更好的耐受性。此外，与包含SLTA-FR(SEQ ID NO:37)组分的115172(SEQ ID NO:23)相
比，包含SLTA-DI-2(SEQ ID NO:20)的115111(SEQ ID NO:29)分子具有更好的耐受性。这可
能是预期的，因为与115172(SEQ ID No:23)相比，115111(SEQ ID NO:29)包含更多去免疫
化的志贺毒素效应多肽组分。接受了115172(SEQ ID NO:23)的小鼠组具有平均9.5％的体
重减轻并且没有动物死亡，所有小鼠在给药完成后恢复体重。该研究中耐受性最差的分子
是115194(SEQ ID NO:33)，其是二聚体/二价并且包含SLTA-FR志贺毒素效应多肽组分(SEQ
ID NO:37)。接受115194(SEQ ID NO:33)的小鼠组具有最大的体重减轻，导致第4剂量后给
药的暂停；然而，在该给药组中的所有小鼠(6个中的6个(100％))在研究的第12天死亡。

[0827] 总之，这些数据表明115111(SEQ ID NO:29)是研究中最良好耐受的HER2靶向分子。基于115111(SEQ ID No:29)和115195(SEQ ID No:32)的血清暴露数据，可以预期施用
115195(SEQ ID NO:32)导致血清中游离的志贺毒素较少，因此耐受性更好。然而，115195
(SEQ ID NO:32)由于尚未完全阐明的原因而导致更高的毒性。

[0828] 免疫活性C57BL/6小鼠用于研究115111(SEQ ID No:29)在重复施用至相同小鼠(2个周期，每只小鼠总共12个剂量)后，随时间的推移的耐受性。将115111(SEQ ID NO:29)样
品在PBS中稀释，并以0.1mg/kg体重的剂量静脉内(IV)施用至小鼠(每组n＝6-10只小鼠)。
作为对照，在同一研究中平行研究较少去除免疫化的115172(SEQ ID NO:23)(参见例如
WO2016/196344)和115411(SEQ ID NO:30)的体内作用。作为对照，将仅含运载体的样品施
用至阴性对照治疗组。在研究期间监测小鼠的体重和健康状况，并且以每次剂量1mg/kg给
药的小鼠的结果显示在表14和图22中。

[0829] 表14.重复给药后示例性HER2靶向分子在C57BL/6小鼠中的作用

[0830]

[0831]

[0832] *'N/A'表示不适用

[0833] 表14中的体重和动物死亡结果显示115111(SEQ ID No:29)和115411(SEQ ID No:30)比115172(SEQ ID NO:23)具有更好的耐受性。在研究的前22天，115111(SEQ ID No:29)
或115411(SEQ ID NO:30)治疗组中没有一只小鼠死亡，而115172(SEQ ID NO:23)治疗组中
6只小鼠中的6只(100％)死亡。图22中的体重数据显示115111(SEQ ID No:29)比115172
(SEQ ID NO:23)耐受性更好。这些结果表明，与115172(SEQ ID NO:23)(其包含较少去去免
疫化的SLTA-FR志贺毒素效应多肽组分(SEQ ID NO:37))相比，包含SLTA-DI-2(SEQ ID No:
20)的115111(SEQ ID No:29)和115411(SEQ ID NO:30)分子被更好的耐受。

[0834] b.免疫原性

[0835] 免疫活性BALB/c小鼠用于研究115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)、115195(SEQ ID NO:32)和115194(SEQ ID NO:33)在重复施用至相同的小鼠(每只小鼠共6
剂)后，随着时间的推移的免疫原性。在一项研究中，将115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ
ID NO:23)、115195(SEQ ID NO:32)和115194(SEQ ID NO:33)在PBS中稀释并以1mg/kg体重
的静脉内(IV)剂量施用至小鼠(每组n＝6)。在该研究中测量的免疫应答结果报告于下文和
图23中。在另一项研究中，以0.25mg/kg体重的剂量通过腹膜内(IP)注射向小鼠(每组n＝6)
施用115111(SEQ ID NO:29)、115172(SEQ ID NO:23)或仅含载体的对照样品。

[0836] 在这些研究期间监测小鼠中针对HER2靶向分子的抗药物抗体(ADA)的量。通过从小鼠中取血清样品，稀释样品，并将稀释的样品与测试的HER2-靶向分子(115111(SEQ ID
No:29)或115172(SEQ ID NO:23))一起温育过夜以形成免疫复合物来监测抗药物抗体水
平。然后，使用涉及用重组人HER2蛋白包被的平板的ELISA方法捕获包含人HER2结合结构域
的分子(例如，本发明的HER2靶向分子)。然后使用与辣根过氧化物酶(IgG-HRP)缀合的抗小
鼠免疫球蛋白G估计每个样品中存在的免疫复合物的量，以定量通过人HER2ELISA方法捕获
的抗小鼠IgG的数量。该抗药物抗体(ADA)测定的结果显示在图23中。

[0837] 图23的顶部图显示更多去免疫化的115111SEQ ID No:29)在涉及0.25mg/kg体重的腹膜内(IP)给药的研究的前36天期间导致比115172SEQ ID NO:23)更低的IgG抗药物抗
体(ADA)ELISA信号。图23的底部图显示施用更去免疫化的115111(SEQ ID NO:29)在涉及
1mg/kg体重的IV给药的研究的第22天导致比施用115172(SEQ ID NO:23)更低的IgG ADA
ELISA信号。这些结果并非是预料不到的，因为与115172(SEQ ID No:23)相比，115111(SEQ
ID NO:29)包含更去免疫化的志贺毒素效应多肽组分。

[0838] C.非人类灵长类动物

[0839] 在食蟹猴中进行两项毒理学研究，该研究涉及以六次静脉内(IV)推注给药，每周三次，持续2周，施用115111(SEQ ID NO:29)，以评估在3周(或低剂量研究18天)的给药后观
察期后的任何发现的潜在的可逆性、进展或延迟进展。

[0840] “高剂量”良好实验室实践(GLP)研究测试了50、150和300μg/kg体重的剂量。这些“高”剂量不能被很好地耐受。

[0841] “低剂量”GLP研究测试了1、5和25μg/kg体重的剂量。这些“低”剂量显示了被认为对动物健康不产生不利影响的作用，因此这两项研究的未观察到的不良反应水平(NOAEL)
和最高非严重毒性剂量(HNSTD)为25μg/kg体重(即“低剂量”研究中测试的最高剂量)。

[0842] 3.HER2表达肿瘤异种移植物功效

[0843] 使用人乳腺癌的小鼠模型来测试腹膜内(IP)施用后115111(SEQ ID NO:29)的作用。首先，将在其细胞表面上表达HER2的人肿瘤细胞注射到小鼠中，然后用115111(SEQ ID
NO:29)处理小鼠。

[0844] 在使用携带皮下的人HER2阳性肿瘤的SCID Beige小鼠的皮下肿瘤模型中研究115111(SEQ ID NO:29)的活性。将来自人乳腺癌来源的细胞系的HCC1954细胞皮下植入，然
后当肿瘤达到平均100-150mm3时开始治疗，从而确定研究第0天。在研究第1、3、5、8、10、12、
22、24、26、29、31天(和33天，针对0.1或0.5mg/kg的剂量施用的组)以0.1、0.5或2mg/kg体重的剂量静脉内施用两个循环的115111(SEQ ID NO:29)至小鼠。在治疗期间监测肿瘤体积，
并且结果显示从第0天至第60天(最新点，其中所有组中的动物大于50％是存活的)显示于
图24中。此外，该研究的存活结果显示在图24中的第0天至第84天(研究结束)。

[0845] 该研究显示，以0.1、0.5和2mg/kg体重重复施用115111(SEQ ID NO:29)导致肿瘤生长延迟并且通过研究第84天提供存活益处(参见例如图24)。在施用2mg/kg体重的剂量的
115111(SEQ ID No:29)治疗组中观察到的体重减轻导致最后安排的剂量(第33天)被禁止，
并且在2mg/kg115111(SEQ ID NO:29)治疗组中的两只小鼠在研究期间死亡。

[0846] 总结

[0847] 令人惊讶的是，示例性HER2靶向分子115111(SEQ ID NO:29)以1至2mg/kg体重之间的剂量施用至动物比本实施例中测试的任何其他示例性HER2靶向分子更安全。该安全性
结果无法从上述体外数据预测。特别令人惊讶的是，单体115111(SEQ ID No:29)比二聚体
115195(SEQ ID NO:32)具有更好的耐受性，因为这两种分子具有相同的组分：志贺毒素效
应多肽、重链可变链、轻链可变链，且在这些分子中，志贺毒素效应多肽和HER2结合区域之
间的接头是相同的。此外，体外数据揭示这些分子之间没有显著差异，只是115195(SEQ ID
No:32)是二聚体和二价体，而115111(SEQ ID NO:29)是单体和单价体。例如，115195(SEQ
ID No:32)和115111(SEQ ID NO:29)在体外表现出相似的细胞毒性(参见表3和10；图19)和
对HER2阳性细胞相似的结合特征(参见表5和11；图10)。与连续暴露相比，115111(SEQ ID
NO:29)和115195(SEQ ID NO:32)均在较短的暴露持续时间内维持细胞毒性效力(参见表9-
10和图18-19)。在涉及连续或较短暴露的条件下，115111(SEQ ID No:29)表现出比114912
(SEQ ID NO:28)更高的细胞毒性效力(参见表2和9；和图6和18)。HER2靶向分子114912(SEQ
ID No:28)和114778(SEQ ID NO:24)，两者都部分基于广泛使用的药物曲妥珠单抗
都不在本文测试的最有效的HER2靶向分子中。

[0848] 实施例2用于本发明的HER2靶向分子的治疗性用途的受试者反应预测和适当的受试者鉴定

[0849] 将示例性HER2靶向分子(诸如上文在实施例1中描述的分子)施用至患者来源的体外细胞系，以鉴定不同疾病、病症和/或病况的最敏感或抗性的组织学和/或组织学亚型。然
后，使用技术人员已知的方法将患者分类到不同的亚群中。例如，使用实施例1中描述的细
胞毒性测定法或技术人员已知的其他方法在体外测试乳腺癌来源的细胞系(备选地胃、卵
巢、肺、结肠直肠、黑素瘤或胰腺)的组。此外，这些细胞毒性测定与另外的HER2靶向治疗剂
组合进行，例如包括T-DM1(曲妥珠单抗emtansine)，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，和/或影响
HER2功能的另外的药物，例如，拉帕替尼和/或奈拉替尼。细胞毒性结果揭示了某些关联，所
述关联可用于鉴定或预测哪些适应症，细胞类型，组织学，组织学亚型和/或受试者可对本
发明的特定HER2靶向分子和/或本发明的HER2靶向分子和另外的治疗剂的特定组合响应或
是抗性的，所述另外的治疗剂诸如本文描述的另外的HER2靶向治疗剂，所述鉴定或预测基
于关于每种细胞系的信息，例如分子标记(包括生物标记表达、基因拷贝数、突变和多态性、
促增殖途径激活或生长抑制剂途径抑制、代谢活动、基因分型)；对标准化学治疗剂/细胞毒
性剂，激素剂(例如雌激素、雌二醇等)和生物制剂(例如免疫检查点抑制剂)的反应；在塑料
和软琼脂上生长的能力，以及在体内皮下和原位生长的能力。此外，使用技术人员已知的常
规方法测试来自个体患者或循环肿瘤细胞的癌症的恶性组织样本中是否存在敏感性/抗性
的生物标记物。基于这种生物标志物关联、组织学关联和体外细胞特征，将患者选择或分类
作为适当的候选者(或不适当的)以接受HER2靶向分子疗法(包括联合疗法)作为其恶性肿
瘤治疗方案的一部分。

[0850] 尽管已经通过举例说明的方式描述了本发明的一些实施方案，显而易见，可利用许多修改、变化和改编以及利用在本领域技术人员范围内的众多等同或替代方案实施本发
明，而不背离本发明的精神或超出权利要求的范围。

[0851] 所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入的程度。国际专利申请公开WO
2014/164680、WO 2014/164693、WO2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO
2015/113007、WO 2015/191764、WO 2016/196344、WO 2017/019623和WO 2018/140427各自
通过引用整体并入本文。美国专利申请US2015/259428、US2016/17784、US2017/143814和
US62/659,116的公开各自通过引用整体并入本文。来自GenBank(National Center for
Biotechnology Information，U.S.)的所有电子可获得的生物学序列信息的完整公开内容
各自通过引用整体并入本文。

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