一种高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法
专利汇可以提供一种高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种高效快速的多糖蛋白结合 疫苗 纯化分析方法，首先利用 超滤 系统将多糖蛋白结合物中未结合的载体蛋白及其他小分子物质去除，得到多糖蛋白结合物和未参与结合的游离多糖，然后使超滤液经过阴离子交换 树脂 ，游离的多糖穿过凝胶柱而多糖蛋白结合物 吸附 在凝胶基质上，洗脱并浓缩洗脱液即得纯化后的多糖蛋白结合物。本发明具有快速、高效、处理量大、设备要求简单、操作简便等诸多优点，解决了目前 肺 炎多糖结合疫苗试验室研究、中试开发及工业化生产中纯化时间长、效率低、成本高等诸多问题。，下面是一种高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法专利的具体信息内容。
1.一种高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，在疫苗生产过程中用于多糖蛋白结合物的纯化制备，其特征在于：该方法首先利用超滤系统将多糖蛋白结合物中未结合的载体蛋白及其他小分子物质去除，得到多糖蛋白结合物和未参与结合的游离多糖，然后使超滤液经过阴离子交换树脂，游离的多糖穿过凝胶柱而多糖蛋白结合物吸附在凝胶基质上，洗脱并浓缩洗脱液即得纯化后的多糖蛋白结合物。
2.根据权利要求１所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、利用Minimate TFF超滤系统去除未反应的载体蛋白及小分子物质，所述Minimate TFF超滤系统的分子截留量设定为1000kDa；
B、利用DEAE离子交换柱层析去除游离未结合的多糖，层析柱采用0.5M的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，经浓缩即得纯化后的多糖蛋白结合物，用于后续检测分析。
3.根据权利要求１或2所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：所述多糖蛋白结合物为肺炎荚膜多糖CPS9V与CRM197载体蛋白的结合物。
4.根据权利要求3所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：步骤A所使用的多糖蛋白结合物反应液的制备方法为：称量40mg 肺炎荚膜多糖CPS9V干粉溶解于8mL pH7.0的磷酸缓冲液中配置成浓度为5mg/mL的多糖溶液，多糖溶液中加入高碘酸钠氧化，然后加入乙烯基乙二醇终止反应，将上述反应液转移至透析袋中室温透析，每次透析1小时共透析3次；在上述透析液中加入载体蛋白CRM197，混匀后加入100mM的氰基硼氢化钠室温反应5天，反应结束后在加入100mM硼氢化钠去除反应液中剩余的醛基，即得多糖蛋白结合物反应液，将反应液冻干储存用于后续纯化操作。
5.根据权利要求3所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：步骤A中，所述Minmate超滤系统的参数设置为：蠕动泵采用R300A，蠕动泵转速设定为250rpm；
膜包采用改性聚醚砜超滤膜，膜包总面积为200cm2；压力表参数设定为为0.15MPa，最高不超过0.2MPa；超滤膜片之间连接方式为并联；进样初始总体积为500mL；超滤过程中磁力搅拌器设定转速为800rpm。
6.根据权利要求3所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：步骤A中，所述Minmate超滤系统的操作流程包括：
超滤前准备，用0.15M PBS pH7.0缓冲液清洗整个管路，清洗终点为回流管内液体经过pH计检测显示为中性；
将需要超滤的样品倒入超滤杯中进行上样；
启动蠕动泵开关，设定转速250rpm,调节压力为0.15MPa，调节磁力搅拌器设定转速为
800rpm；
同时开启0.15M PBS pH7.0缓冲液蠕动泵，及时补充超滤杯中的溶液，保持其总体积不变；
超滤50倍体积缓冲液后，停止补给0.15M PBS pH7.0的缓冲液，继续超滤至总体积为达到50mL；
转移超滤液至50mL无菌的离心管中等待进一步纯化；
使用超纯水清洗Minmate系统管路及膜包；
使用0.1M NaOH溶液清洗Minmate系统管路及膜包，直至整个管路系统浸泡在碱性环境中。
7.根据权利要求3所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：步骤B中，DEAE阴离子交换柱层析参数设置为：基质：选择6%交联琼脂糖，基质粒径：45-165μm，耐压度：0.3MPa，层析柱体积：10mL，层析柱清洗缓冲液：0.15M磷酸缓冲液溶液pH 7.0，层析柱平衡缓冲液：0.15M磷酸缓冲液溶液pH 7.0，层析柱多糖蛋白结合物洗脱液：0.5M氯化钠溶液pH 7.0。
8.根据权利要求3所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：步骤B中，DEAE阴离子交换柱层析的操作步骤为：
装柱：⑴让所有的材料和试剂达到室温，同时配制清洗缓冲液、平衡缓冲液和洗脱液；
⑵根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉20%乙醇，抽干，按凝胶:清洗缓冲液=3:1的体积比例配制匀浆，匀浆作脱气处理；⑶将柱内及柱子底端用纯水或清洗缓冲液润湿并保持一小段液位，使液面高于滤膜，确保底端无气泡；⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，确保勿产生气泡，打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头；⑸打开蠕动泵，让清洗缓冲液以2mL/min的流速流过，稳定柱床,用100mL的平衡缓冲液平衡柱子；
平衡：让平衡缓冲液匀速流过柱子，直至流出液电导和pH不变；
上样：品用平衡缓冲液配制，CPS9V-CRM197样品经离心和0.22μm膜过滤后上样；CPS9V-CRM197产品结合在柱子上，用平衡缓冲液洗去杂质；
洗脱：DEAE介质用0.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱样，收集纯的CPS9V-CRM197结合物。
9.根据权利要求3所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：对步骤B所得多糖蛋白结合物进行检测分析以确认多糖蛋白结合物的纯化效能，具体操作步骤包括：
C-1、 CPS9V-CRM197多糖蛋白结合物的定量分析：使用苯酚-硫酸法测定荚膜多糖的含量，蛋白质的含量通过BCA方法测定，结合物的纯度通过CL-4B层析分离，在紫外光280nm和
206nm双波长检测吸收峰值；
C-2、动态光散射分析：使用BI-200SM检测仪测量CPS9V-CRM197和CRM197的分子半径，进一步分析确认多糖蛋白质的结合情况；
C-3、层析色谱测定分子量：CPS9V-CRM197的分子量通过CL-4B色谱检测，层析柱使用前用0.15M NaCl溶液室温预处理，设定流速为0.5mL/mL。
10.根据权利要求9所述的高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法，其特征在于：
对经步骤C分析之后的多糖蛋白结合物进行进一步的试验分析，具体操作步骤包括：
D、对多糖蛋白结合物进行蛋白酶酶裂解敏感性分析，CPS9V-CRM197结合物和CRM197使用胰酶消化，胰酶与CRM197蛋白质溶液的质量比例按照1:40配置；
E、对所得多糖蛋白结合物进行免疫原性测定：
E-1、将体重为15-22g的5周龄BALB/c小鼠随即平均分成4组，每组小鼠分别接受CPS9V、CPS9V-CRM197、CRM197、PBS皮下免疫，小鼠在第一次接受免疫后14天给予第二次免疫；血样分别在第0、7、14、21天采集，血清被分离储后存于-20℃冰箱中；
E-2、使用CPS9V的盐溶液孵育96孔板过夜Corning，次日使用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗96孔板，然后使用包含1%BSA的PBS溶液在25℃封闭处理90分钟；再次使用PBS缓冲液清洗96孔板，分别加入CPS9V、CPS9V-CRM197、CRM197、PBS免疫的血清37℃孵育90分钟；弃去板内液体使用PBS溶液清洗3次，使用2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体
37℃孵育90分钟；孵育结束后，弃去板内液体用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗3次；加入100微升包含0.015%TMB的底物溶液37℃孵育30分钟，然后加入25微升2M的H2SO4终止反应，最终溶液用酶标仪测定于450nm处吸收值，CPS9V和CRM197特异性抗原滴度数据使用GraphPadPrism软件进行统计学分析，完成对经纯化的多糖蛋白结合物的效能确认。
一种高效快速的多糖蛋白结合疫苗纯化分析方法
技术领域
背景技术
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发明内容
B、利用DEAE离子交换柱层析去除游离未结合的多糖，层析柱采用0.5M的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，经浓缩即得纯化后的多糖蛋白结合物，用于后续检测分析。
200cm2；压力表参数设定为为0.15MPa，最高不超过0.2MPa；超滤膜片之间连接方式为并联；
进样初始总体积为500mL；超滤过程中磁力搅拌器设定转速为800rpm。
将需要超滤的样品倒入超滤杯中进行上样；
启动蠕动泵开关，设定转速250rpm,调节压力为0.15MPa，调节磁力搅拌器设定转速为
800rpm；
同时开启0.15M PBS pH7.0缓冲液蠕动泵，及时补充超滤杯中的溶液，保持其总体积不变；
超滤50倍体积缓冲液后，停止补给0.15M PBS pH7.0的缓冲液，继续超滤至总体积为达到50mL；
转移超滤液至50mL无菌的离心管中等待进一步纯化；
使用超纯水清洗Minmate系统管路及膜包；
使用0.1M NaOH溶液清洗Minmate系统管路及膜包，直至整个管路系统浸泡在碱性环境中。
7.0，层析柱多糖蛋白结合物洗脱液：0.5M氯化钠溶液pH 7.0。
⑵根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉20%乙醇，抽干，按凝胶:清洗缓冲液=3:1的体积比例配制匀浆，匀浆作脱气处理；⑶将柱内及柱子底端用纯水或清洗缓冲液润湿并保持一小段液位，使液面高于滤膜，确保底端无气泡；⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，确保勿产生气泡，打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头；⑸打开蠕动泵，让清洗缓冲液以2mL/min的流速流过，稳定柱床,用100mL的平衡缓冲液平衡柱子；
平衡：让平衡缓冲液匀速流过柱子，直至流出液电导和pH不变；
上样：品用平衡缓冲液配制，CPS9V-CRM197样品经离心和0.22μm膜过滤后上样；CPS9V-CRM197产品结合在柱子上，用平衡缓冲液洗去杂质；
洗脱：DEAE介质用0.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱样，收集纯的CPS9V-CRM197结合物。
206nm双波长检测吸收峰值。
E-2、使用CPS9V的盐溶液孵育96孔板过夜Corning，次日使用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗96孔板，然后使用包含1%BSA的PBS溶液在25℃封闭处理90分钟；再次使用PBS缓冲液清洗96孔板，分别加入CPS9V、CPS9V-CRM197、CRM197、PBS免疫的血清37℃孵育90分钟；弃去板内液体使用PBS溶液清洗3次，使用2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体
37℃孵育90分钟；孵育结束后，弃去板内液体用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗3次；加入100微升包含0.015%TMB的底物溶液37℃孵育30分钟，然后加入25微升2M的H2SO4终止反应，最终溶液用酶标仪测定于450nm处吸收值，CPS9V和CRM197特异性抗原滴度数据使用GraphPadPrism软件进行统计学分析，完成对经纯化的多糖蛋白结合物的效能确认。
具体实施方式
206nm双波长检测吸收峰值。
1:40配置。
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