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由具孔表面介导的生物分子的细胞内递送

阅读：28发布：2021-03-29

专利汇可以提供由具孔表面介导的生物分子的细胞内递送专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开文本涉及用于将化合物递送到细胞中的方法和装置，其包括使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中该孔使该细胞 变形 ，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与该化合物 接触 。，下面是由具孔表面介导的生物分子的细胞内递送专利的具体信息内容。

1.一种用于将化合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中所述孔使该细胞变形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与该化合物接触。
2.权利要求1的方法，其中该表面是膜。
3.权利要求1的方法，其中该表面是过滤器。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中该表面是曲折路径表面。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯、石墨和陶瓷。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中孔尺寸是细胞直径的函数。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中孔横截面宽度是细胞直径的约20％、约30％、约
40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中孔横截面宽度是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
14.权利要求1-11中任一项的方法，其中孔横截面宽度是约200μm。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中该孔在尺寸上是不均匀的。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中不均匀的孔横截面宽度从10％-20％变化。
17.权利要求1-14中任一项的方法，其中该孔在尺寸上是均匀的。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中该孔具有相同的入口角和出口角。
19.权利要求1-17中任一项的方法，其中该孔具有不同的入口角和出口角。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
21.权利要求1-19中任一项的方法，其中孔横截面形状选自圆柱形或圆锥形。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中孔边缘是平滑的。
23.权利要求1-21中任一项的方法，其中孔边缘是锋利的。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中孔道是直的。
25.权利要求1-23中任一项的方法，其中孔道是弯曲的。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中该孔占总表面积的约10％-80％。
5 30
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中该表面包含约1.0x10至约1.0x10 个总孔。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中该表面的每mm2表面积包含约10至约1.0x1015个孔。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中该孔是平行分布的。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中多个表面串联分布。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中孔分布是有序的。
32.权利要求1-30中任一项的方法，其中孔分布是随机的。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中表面厚度是一致的。
34.权利要求1-32中任一项的方法，其中表面厚度是可变的。
35.权利要求1-34中任一项的方法，其中该表面是约0.01μm至约5m厚。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中该表面是约10μm厚。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其中该表面涂覆有材料。
38.权利要求37的方法，其中该材料是Teflon。
39.权利要求37的方法，其中该材料包含与细胞结合的粘合涂层。
40.权利要求37的方法，其中该材料包含表面活性剂。
41.权利要求37的方法，其中该材料包含抗凝剂。
42.权利要求37的方法，其中该材料包含多肽。
43.权利要求37的方法，其中该材料包含粘附分子。
44.权利要求37的方法，其中该材料包含抗体。
45.权利要求37的方法，其中该材料包含调节细胞功能的因子。
46.权利要求37的方法，其中该材料包含核酸。
47.权利要求37的方法，其中该材料包含脂质。
48.权利要求37的方法，其中该材料包含碳水化合物。
49.权利要求37的方法，其中该材料包含复合物。
50.权利要求49的方法，其中该复合物是脂质-碳水化合物复合物。
51.权利要求37的方法，其中该材料包含跨膜蛋白。
52.权利要求37-51中任一项的方法，其中该材料共价地附接到该表面。
53.权利要求37-51中任一项的方法，其中该材料非共价地附接到该表面。
54.权利要求1-53中任一项的方法，其中该表面是亲水的。
55.权利要求1-53中任一项的方法，其中该表面是疏水的。
56.权利要求1-55中任一项的方法，其中该表面是带电的。
57.权利要求1-56中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
58.权利要求1-57中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含混合细胞群。
59.权利要求1-58中任一项的方法，其中该细胞悬浮液是全血。
60.权利要求1-58中任一项的方法，其中该细胞悬浮液是淋巴液。
61.权利要求1-58中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
62.权利要求1-57中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含经纯化的细胞群。
63.权利要求1-58或62中任一项的方法，其中该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。
64.权利要求63的方法，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。
65.权利要求1-64中任一项的方法，其中该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。
66.权利要求1-64中任一项的方法，其中该细胞是人细胞。
67.权利要求1-66中任一项的方法，其中该化合物包含核酸。
68.权利要求1-67中任一项的方法，其中该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。
69.权利要求1-68中任一项的方法，其中该化合物是质粒。
70.权利要求1-66中任一项的方法，其中该化合物包含多肽-核酸复合物。
71.权利要求1-66或70中任一项的方法，其中该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。
72.权利要求1-67中任一项的方法，其中该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。
73.权利要求1-66中任一项的方法，其中该化合物包含蛋白质或肽。
74.权利要求1-66或73中任一项的方法，其中该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。
75.权利要求1-66或73中任一项的方法，其中该化合物是抗体。
76.权利要求1-66或73中任一项的方法，其中该化合物是转录因子。
77.权利要求1-66中任一项的方法，其中该化合物是小分子。
78.权利要求1-66中任一项的方法，其中该化合物是纳米粒子。
79.权利要求1-66中任一项的方法，其中该化合物是嵌合抗原受体。
80.权利要求1-79中任一项的方法，其中该化合物是荧光标记分子。
81.权利要求1-66中任一项的方法，其中该化合物是脂质体。
82.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述细胞悬浮液在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。
83.权利要求1-81中任一项的方法，其中待递送的该化合物被涂覆在该表面上。
84.权利要求1-83中任一项的方法，其中该方法在0℃-45℃之间进行。
85.权利要求1-84中任一项的方法，其中使该细胞靠正压或负压穿过该孔。
86.权利要求1-85中任一项的方法，其中使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。
87.权利要求1-86中任一项的方法，其中使用注射器施加压力。
88.权利要求1-86中任一项的方法，其中使用泵施加压力。
89.权利要求1-86中任一项的方法，其中使用真空施加压力。
90.权利要求1-86中任一项的方法，其中使该细胞靠毛细管压穿过该孔。
91.权利要求1-86中任一项的方法，其中使该细胞靠血压穿过该孔。
92.权利要求1-86中任一项的方法，其中使该细胞靠重力穿过该孔。
93.权利要求1-92中任一项的方法，其中使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。
94.权利要求1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。
95.权利要求1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。
96.权利要求1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。
97.权利要求1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。
98.权利要求1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。
99.权利要求1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。
100.权利要求1-99中任一项的方法，其中流体流引导该细胞通过该孔。
101.权利要求100的方法，其中流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。
102.权利要求100的方法，其中通过该孔的流体流是层流。
103.权利要求100的方法，其中流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。
104.权利要求1-103中任一项的方法，其中该细胞以一致的细胞速度穿过该孔。
105.权利要求1-103中任一项的方法，其中该细胞以变动的细胞速度穿过该孔。
106.权利要求1-105中任一项的方法，其中该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围内的速度穿过该孔。
107.权利要求1-106中任一项的方法，其中该表面被包含在较大的组件内。
108.权利要求1-107中任一项的方法，其中该表面被包含在注射器内。
109.权利要求1-108中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含水性溶液。
110.权利要求109的方法，其中该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。
111.权利要求110的方法，其中影响肌动蛋白聚合的该试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。
112.权利要求110的方法，其中该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。
113.权利要求1-112中任一项的方法，其中该细胞悬浮液的粘度在从约8.9x10-4Pa.s至约4.0x10-3Pa.s的范围内。
114.权利要求1-113中任一项的方法，其中该方法进一步包括使该细胞穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场的步骤。
115.一种用于将化合物递送到细胞中的装置，其包含含有孔的表面，其中所述孔被配置为使得悬浮在溶液中的细胞可以穿过，其中所述孔使该细胞变形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞。
116.权利要求115的装置，其中该表面是膜。
117.权利要求115的装置，其中该表面是过滤器。
118.权利要求115-117中任一项的装置，其中该表面是曲折路径表面。
119.权利要求115-118中任一项的装置，其中该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯、石墨和陶瓷。
120.权利要求115-119中任一项的装置，其中该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。
121.权利要求115-120中任一项的装置，其中使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
122.权利要求115-121中任一项的装置，其中孔尺寸是细胞直径的函数。
123.权利要求115-122中任一项的装置，其中孔横截面宽度是细胞直径的约20％、约
30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
124.权利要求115-123中任一项的装置，其中表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。
125.权利要求115-124中任一项的装置，其中孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。
126.权利要求115-125中任一项的装置，其中孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。
127.权利要求115-126中任一项的装置，其中孔横截面宽度是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
128.权利要求115-125中任一项的装置，其中孔横截面宽度是约200μm。
129.权利要求115-128中任一项的装置，其中该孔在尺寸上是不均匀的。
130.权利要求115-129中任一项的装置，其中不均匀的孔横截面宽度从10％-20％变化。
131.权利要求115-128中任一项的装置，其中该孔在尺寸上是均匀的。
132.权利要求115-131中任一项的装置，其中该孔具有相同的入口角和出口角。
133.权利要求115-131中任一项的装置，其中该孔具有不同的入口角和出口角。
134.权利要求115-133中任一项的装置，其中孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
135.权利要求115-133中任一项的装置，其中孔形状选自圆柱形或圆锥形。
136.权利要求115-135中任一项的装置，其中孔边缘是平滑的。
137.权利要求115-135中任一项的装置，其中孔边缘是锋利的。
138.权利要求115-137中任一项的装置，其中孔道是直的。
139.权利要求115-137中任一项的装置，其中孔道是弯曲的。
140.权利要求115-139中任一项的装置，其中该孔占总表面积的约10％-80％。
141.权利要求115-140中任一项的装置，其中该表面包含约1.0x105至约1.0x1030个总孔。
142.权利要求115-141中任一项的装置，其中该表面的每mm2表面积包含约10至约
1.0x1015个孔。
143.权利要求115-142中任一项的装置，其中该孔是平行分布的。
144.权利要求115-143中任一项的装置，其中多个表面串联分布。
145.权利要求115-144中任一项的装置，其中孔分布是有序的。
146.权利要求115-144中任一项的装置，其中孔分布是随机的。
147.权利要求115-146中任一项的装置，其中表面厚度是一致的。
148.权利要求115-146中任一项的装置，其中表面厚度是可变的。
149.权利要求115-148中任一项的装置，其中该表面是约0.01μm至约5m厚。
150.权利要求115-149中任一项的装置，其中该表面是约10μm厚。
151.权利要求115-150中任一项的装置，其中该表面涂覆有材料。
152.权利要求151的装置，其中该材料是Teflon。
153.权利要求151的装置，其中该材料包含与细胞结合的粘合涂层。
154.权利要求151的装置，其中该材料包含表面活性剂。
155.权利要求151的装置，其中该材料包含抗凝剂。
156.权利要求151的装置，其中该材料包含多肽。
157.权利要求151的装置，其中该材料包含粘附分子。
158.权利要求151的装置，其中该材料包含抗体。
159.权利要求151的装置，其中该材料包含调节细胞功能的因子。
160.权利要求151的装置，其中该材料包含核酸。
161.权利要求151的装置，其中该材料包含脂质。
162.权利要求151的装置，其中该材料包含碳水化合物。
163.权利要求151的装置，其中该材料包含复合物。
164.权利要求163的装置，其中该复合物是脂质-碳水化合物复合物。
165.权利要求151的装置，其中该材料包含跨膜蛋白。
166.权利要求151-165中任一项的装置，其中该材料共价地附接到该表面。
167.权利要求151-165中任一项的装置，其中该材料非共价地附接到该表面。
168.权利要求115-167中任一项的装置，其中该表面是亲水的。
169.权利要求115-167中任一项的装置，其中该表面是疏水的。
170.权利要求115-169中任一项的装置，其中该表面是带电的。
171.权利要求115-170中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
172.权利要求115-171中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含混合细胞群。
173.权利要求115-172中任一项的装置，其中该细胞悬浮液是全血。
174.权利要求115-172中任一项的装置，其中该细胞悬浮液是淋巴液。
175.权利要求115-172中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
176.权利要求115-171中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含经纯化的细胞群。
177.权利要求115-172或176中任一项的装置，其中该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。
178.权利要求177的装置，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。
179.权利要求115-178中任一项的装置，其中该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。
180.权利要求115-178中任一项的装置，其中该细胞是人细胞。
181.权利要求115-180中任一项的装置，其中该化合物包含核酸。
182.权利要求115-181中任一项的装置，其中该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。
183.权利要求115-182中任一项的装置，其中该化合物是质粒。
184.权利要求115-180中任一项的装置，其中该化合物包含多肽-核酸复合物。
185.权利要求115-180或184中任一项的装置，其中该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。
186.权利要求115-181中任一项的装置，其中该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。
187.权利要求115-180中任一项的装置，其中该化合物包含蛋白质或肽。
188.权利要求115-180或187中任一项的装置，其中该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。
189.权利要求115-180或187中任一项的装置，其中该化合物是抗体。
190.权利要求115-180或187中任一项的装置，其中该化合物是转录因子。
191.权利要求115-180中任一项的装置，其中该化合物是小分子。
192.权利要求115-180中任一项的装置，其中该化合物是纳米粒子。
193.权利要求115-180中任一项的装置，其中该化合物是嵌合抗原受体。
194.权利要求115-193中任一项的装置，其中该化合物是荧光标记分子。
195.权利要求115-180中任一项的装置，其中该化合物是脂质体。
196.权利要求115-195中任一项的装置，其中所述细胞悬浮液在穿过该孔之
前、与此同时或之后与该化合物接触。
197.权利要求115-195中任一项的装置，其中待递送的该化合物被涂覆在该表面上。
198.权利要求115-197中任一项的装置，其中该装置在0℃-45℃之间。
199.权利要求115-198中任一项的装置，其中使该细胞靠正压或负压穿过该孔。
200.权利要求115-199中任一项的装置，其中使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。
201.权利要求115-200中任一项的装置，其中使用注射器施加压力。
202.权利要求115-200中任一项的装置，其中使用泵施加压力。
203.权利要求115-200中任一项的装置，其中使用真空施加压力。
204.权利要求115-200中任一项的装置，其中使该细胞靠毛细管压穿过该孔。
205.权利要求115-200中任一项的装置，其中使该细胞靠血压穿过该孔。
206.权利要求115-200中任一项的装置，其中使该细胞靠重力穿过该孔。
207.权利要求115-206中任一项的装置，其中使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。
208.权利要求115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。
209.权利要求115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。
210.权利要求115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。
211.权利要求115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。
212.权利要求115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。
213.权利要求115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。
214.权利要求115-213中任一项的装置，其中流体流引导该细胞通过该孔。
215.权利要求214的装置，其中流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。
216.权利要求214的装置，其中通过该孔的流体流是层流。
217.权利要求214的装置，其中流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。
218.权利要求115-217中任一项的装置，其中该细胞以一致的细胞速度穿过该孔。
219.权利要求115-217中任一项的装置，其中该细胞以变动的细胞速度穿过该孔。
220.权利要求115-219中任一项的装置，其中该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围内的速度穿过该孔。
221.权利要求115-220中任一项的装置，其中该表面被包含在较大的组件内。
222.权利要求115-221中任一项的装置，其中该表面被包含在注射器内。
223.权利要求115-222中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含水性溶液。
224.权利要求223的装置，其中该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。
225.权利要求224的装置，其中影响肌动蛋白聚合的该试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。
226.权利要求224的装置，其中该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。
227.权利要求115-226中任一项的装置，其中该细胞悬浮液的粘度在从约8.9x10-4Pa.s至约4.0x10-3Pa.s的范围内。
228.权利要求115-227中任一项的装置，其中该装置包含多个表面。
229.权利要求115-228中任一项的装置，其中该表面是Transwell。
230.权利要求115-229中任一项的装置，其中至少一个电极邻近于该表面以产生电场。
231.一种包含扰动的细胞，其中该细胞通过使该细胞穿过含有孔的表面而产生，其中该孔使该细胞变形，从而引起该扰动，使得化合物能够进入该细胞。
232.权利要求231的细胞，其中该表面是膜。
233.权利要求231的细胞，其中该表面是过滤器。
234.权利要求231-233中任一项的细胞，其中该表面是曲折路径表面。
235.权利要求231-234中任一项的细胞，其中该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯、石墨和陶瓷。
236.权利要求231-235中任一项的细胞，其中该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。
237.权利要求231-236中任一项的细胞，其中使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
238.权利要求231-237中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是细胞直径的函数。
239.权利要求231-238中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是细胞直径的约20％、约
30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
240.权利要求231-239中任一项的细胞，其中表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。
241.权利要求231-240中任一项的细胞，其中孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。
242.权利要求231-241中任一项的细胞，其中孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。
243.权利要求231-242中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
244.权利要求231-241中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是约200μm。
245.权利要求231-244中任一项的细胞，其中该孔在尺寸上是不均匀的。
246.权利要求231-245中任一项的细胞，其中不均匀的孔横截面宽度从10％-20％变化。
247.权利要求231-244中任一项的细胞，其中该孔在尺寸上是均匀的。
248.权利要求231-247中任一项的细胞，其中该孔具有相同的入口角和出口角。
249.权利要求231-247中任一项的细胞，其中该孔具有不同的入口角和出口角。
250.权利要求231-249中任一项的细胞，其中孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
251.权利要求231-249中任一项的细胞，其中孔形状选自圆柱形或圆锥形。
252.权利要求231-251中任一项的细胞，其中孔边缘是平滑的。
253.权利要求231-251中任一项的细胞，其中孔边缘是锋利的。
254.权利要求231-253中任一项的细胞，其中孔道是直的。
255.权利要求231-253中任一项的细胞，其中孔道是弯曲的。
256.权利要求231-255中任一项的细胞，其中该孔占总表面积的约10％-80％。
257.权利要求231-256中任一项的细胞，其中该表面包含约1.0x105至约1.0x1030个总孔。
258.权利要求231-257中任一项的细胞，其中该表面的每mm2表面积包含约10至约
1.0x1015个孔。
259.权利要求231-258中任一项的细胞，其中该孔是平行分布的。
260.权利要求231-259中任一项的细胞，其中多个表面串联分布。
261.权利要求231-260中任一项的细胞，其中孔分布是有序的。
262.权利要求231-260中任一项的细胞，其中孔分布是随机的。
263.权利要求231-262中任一项的细胞，其中表面厚度是一致的。
264.权利要求231-262中任一项的细胞，其中表面厚度是可变的。
265.权利要求231-264中任一项的细胞，其中该表面是约0.01μm至约5m厚。
266.权利要求231-265中任一项的细胞，其中该表面是约10μm厚。
267.权利要求231-266中任一项的细胞，其中该表面涂覆有材料。
268.权利要求267的细胞，其中该材料是Teflon。
269.权利要求267的细胞，其中该材料包含与细胞结合的粘合涂层。
270.权利要求267的细胞，其中该材料包含表面活性剂。
271.权利要求267的细胞，其中该材料包含抗凝剂。
272.权利要求267的细胞，其中该材料包含多肽。
273.权利要求267的细胞，其中该材料包含粘附分子。
274.权利要求267的细胞，其中该材料包含抗体。
275.权利要求267的细胞，其中该材料包含调节细胞功能的因子。
276.权利要求267的细胞，其中该材料包含核酸。
277.权利要求267的细胞，其中该材料包含脂质。
278.权利要求267的细胞，其中该材料包含碳水化合物。
279.权利要求267的细胞，其中该材料包含复合物。
280.权利要求279的细胞，其中该复合物是脂质-碳水化合物复合物。
281.权利要求267的细胞，其中该材料包含跨膜蛋白。
282.权利要求267-281中任一项的细胞，其中该材料共价地附接到该表面。
283.权利要求267-281中任一项的细胞，其中该材料非共价地附接到该表面。
284.权利要求231-283中任一项的细胞，其中该表面是亲水的。
285.权利要求231-283中任一项的细胞，其中该表面是疏水的。
286.权利要求231-285中任一项的细胞，其中该表面是带电的。
287.权利要求231-286中任一项的细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞。
288.权利要求231-287中任一项的细胞，其中该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。
289.权利要求288的细胞，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。
290.权利要求231-289中任一项的细胞，其中该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。
291.权利要求231-289中任一项的细胞，其中该细胞是人细胞。
292.权利要求231-291中任一项的细胞，其中该化合物包含核酸。
293.权利要求231-292中任一项的方法，其中该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。
294.权利要求231-293中任一项的细胞，其中该化合物是质粒。
295.权利要求231-291中任一项的细胞，其中该化合物包含多肽-核酸复合物。
296.权利要求231-291或295中任一项的细胞，其中该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。
297.权利要求231-292中任一项的细胞，其中该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。
298.权利要求231-291中任一项的细胞，其中该化合物包含蛋白质或肽。
299.权利要求231-291或298中任一项的细胞，其中该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。
300.权利要求231-291或298中任一项的细胞，其中该化合物是抗体。
301.权利要求231-291或298中任一项的细胞，其中该化合物是转录因子。
302.权利要求231-291中任一项的细胞，其中该化合物是小分子。
303.权利要求231-291中任一项的细胞，其中该化合物是纳米粒子。
304.权利要求231-291中任一项的细胞，其中该化合物是嵌合抗原受体。
305.权利要求231-304中任一项的细胞，其中该化合物是荧光标记分子。
306.权利要求231-291中任一项的细胞，其中该化合物是脂质体。
307.权利要求231-306中任一项的细胞，其中所述细胞在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。
308.权利要求231-306中任一项的细胞，其中待递送的该化合物被涂覆在该表面上。
309.权利要求231-308中任一项的细胞，其中使该细胞在0℃-45℃之间穿过该孔。
310.权利要求231-309中任一项的细胞，其中使该细胞靠正压或负压穿过该孔。
311.权利要求231-310中任一项的细胞，其中使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。
312.权利要求231-311中任一项的细胞，其中使用注射器施加压力。
313.权利要求231-311中任一项的细胞，其中使用泵施加压力。
314.权利要求231-311中任一项的细胞，其中使用真空施加压力。
315.权利要求231-311中任一项的细胞，其中使该细胞靠毛细管压穿过该孔。
316.权利要求231-311中任一项的细胞，其中使该细胞靠血压穿过该孔。
317.权利要求231-311中任一项的细胞，其中使该细胞靠重力穿过该孔。
318.权利要求231-317中任一项的细胞，其中使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。
319.权利要求231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。
320.权利要求231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。
321.权利要求231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。
322.权利要求231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。
323.权利要求231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。
324.权利要求231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。
325.权利要求231-324中任一项的细胞，其中流体流引导该细胞通过该孔。
326.权利要求325的细胞，其中流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。
327.权利要求325的细胞，其中通过该孔的流体流是层流。
328.权利要求325的细胞，其中流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。
329.权利要求231-328中任一项的细胞，其中该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围内的速度穿过该孔。
330.权利要求231-329中任一项的细胞，其中该表面被包含在较大的组件内。
331.权利要求231-330中任一项的细胞，其中该表面被包含在注射器内。
332.权利要求231-331中任一项的细胞，其中该细胞在包含水性溶液的细胞悬浮液中。
333.权利要求332的细胞，其中该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。
334.权利要求333的细胞，其中影响肌动蛋白聚合的该试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。
335.权利要求333的细胞，其中该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。
336.权利要求231-335中任一项的细胞，其中使该细胞进一步穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场。

说明书全文

由具孔表面介导的生物分子的细胞内递送

[0001] 对相关申请的交叉援引
[0002] 本申请要求2015年9月4日提交的美国临时申请号62/214,820和2016年5月3日提交的美国临时申请号62/331,363的优先权，将其全部通过引用以其全部内容而特此并入。
发明领域
[0003] 本公开文本总体上涉及用于通过使细胞悬浮液通过含有孔的表面而将化合物递送到细胞中的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 细胞内递送是新颖疗法研究和开发的中心步骤。旨在细胞内递送分子的现有技术依赖于电场、纳米粒子或成孔化学物质。然而，这些方法受制于许多复杂状况，包括非特异性分子递送、对有效载荷分子的修饰或损害、高细胞死亡、通常可能不被认为安全(GRAS)材料的材料使用、低通量和/或难以实施。此外，这些细胞内递送方法在将分子递送到敏感细胞类型(如原代免疫细胞和干细胞)方面是无效的。因此，对于在将一系列分子递送到多种
细胞类型方面非常有效的细胞内递送技术的需求尚未得到满足。此外，允许快速、高通量细胞内递送的技术可以更有效地应用于大规模临床、制造和药物筛选应用。描述了使用通道
将化合物递送到细胞的方法的参考文献包括WO 2013059343和WO 2015023982。
[0006] 本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其全部内容而并入。
[0007] 发明概述
[0008] 本公开文本的某些方面包括用于将化合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中所述孔使该细胞变形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与该化合物接触。在一些实施方案中，该表面是膜。在一些实施方案中，该表面是过滤器。在一些实施方案中，该表面是微筛。在一些实施方案中，该表面是曲折路径表面。在一些实施方案中，该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯和陶瓷。在一些实施方案中，该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。在一些实施方案中，使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵(polymeric-sponge)、直接发泡、挤出和热压印。
[0009] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，孔尺寸是细胞直径的函数。在一些实施方案中，孔尺寸是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约
80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。在一些实施方案中，孔尺寸是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。在一些实施方案中，孔尺寸是约200μm。在一些实施方案中，该孔在尺寸上是不均匀的。在一些实施方案中，不均匀的孔尺寸从10％-20％变化。在一些实施方案中，该孔在尺寸上是均匀的。
[0010] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该孔具有相同的入口角和出口角。在一些实施方案中，该孔具有不同的入口角和出口角。在一些实施方案中，孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，该孔入口处的横截面形状不同于该孔出口处的横截面形状(例
如，入口处为环状并且出口处为方形)。在一些实施方案中，孔横截面形状选自圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，孔边缘是平滑的。在一些实施方案中，孔边缘是锋利的。在一些实施方案中，孔道是直的。在一些实施方案中，孔道是弯曲的。在一些实施方案中，该孔占总表
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面积的约10％-80％。在一些实施方案中，该表面包含约1.0x 10至约1.0x 10 个总孔。在
一些实施方案中，该表面的每mm2表面积包含约10至约1.0x 1015个孔。在一些实施方案中，该孔是平行分布的。在一些实施方案中，具孔表面彼此堆叠。在一些实施方案中，多个表面串联分布。在一些实施方案中，孔分布是有序的。在一些实施方案中，孔分布是随机的。在一些实施方案中，表面厚度是一致的。在一些实施方案中，表面厚度是可变的。在一些实施方案中，该表面是约0.01μm至约5m厚。在一些实施方案中，该表面是约10μm厚。在一些实施方案中，该表面<1μm厚。
[0011] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该表面涂覆有材料。在一些实施方案中，该材料是Teflon。在一些实施方案中，该材料包含与细胞结合的粘合涂层。在一些实施方案中，该材料包含表面活性剂。在一些实施方案中，该材料包含抗凝剂。在一些实施方案中，该材料包含蛋白质。在一些实施方案中，该材料包含粘附分子。在一些实施方案中，该材料包含抗体。在一些实施方案中，该材料包含调节细胞功能的因子。在一些实施方案中，该材料包含核酸。在一些实施方案中，该材料包含脂质。在一些实施方案中，该材料包含碳水化合物。在一些实施方案中，该材料包含复合物。在一些实施方案中，该复合物是脂质-碳水化合物复合物。在一些实施方案中，该材料包含跨膜蛋白。在一些实施方案中，该材料共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该材料非共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该表面是亲水的。在一些实施方案中，该表面是疏水的。在一些实施方案中，该表面是带电的。
[0012] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含混合细胞群。在一些实施方案中，该细胞悬浮液是全血。在一些实施方案中，该细胞悬浮液是淋巴液。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含外周血单核细胞。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含经纯化的细胞群。在一些实施方案中，该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元、红细胞或血小板。在一些实施方案中，该免疫细胞是淋巴细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。
[0013] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该化合物包含核酸。在一些实施方案中，该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。在一些实施方案中，该化合物是肽核酸。在一些实施方案中，该化合物包含转座子。在一些实施方案中，该化合物是质粒。在一些实施方案中，该化合物包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。在一些实施方案中，该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体
DNA。在一些实施方案中，该化合物包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。在一些实施方案中，该化合物是抗体。在一些实施方案中，该化合物是转录因子。在一些实施方案中，该化合物是小分子。在一些实施方案中，该化合物是纳米粒子。在一些实施方案中，该化合物是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，该化合物是荧光标记分子。在一些实施方案中，该化合物是脂质体。在一些实施方案中，该化合物是病毒。
[0014] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞悬浮液在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。在一些实施方案中，待递送的化合物被涂覆在该表面上。在一些实施方案中，该方法在0℃-45℃之间进行。在一些实施方案中，使该细胞靠正压或负压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，使该细胞靠毛细管压穿过该孔。在一些实施方案
中，使该细胞靠静水压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠血压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠重力穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在从约0.05psi至约
500psi范围内的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约2psi的压力下穿过该
孔。在一些实施方案中，使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约5psi的压力下穿过该
孔。在一些实施方案中，使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，流体流引导该细胞通过该孔。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。在一些实施方案中，通过该孔的流体流是层流。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。在一些实施方案中，该细胞以一致的细胞速度穿过该孔。在一些实施方案中，该细胞以变动的细胞速度穿过该孔。
在一些实施方案中，该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围内的速度穿过该孔。在一些实施
方案中，该表面被包含在较大的组件内。在一些实施方案中，该表面被包含在注射器内。
[0015] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该细胞悬浮液包含水性溶液。在一些实施方案中，该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。在一些实施方案中，该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。在一些实施方案中，该细胞悬浮液的粘度在从约8.9x 10-4Pa.s至约4.0x 10-3Pa.s的范围内。在一些实施方案中，该方法进一步包括使该细胞穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场的步骤。
[0016] 本公开文本的某些方面包括用于将化合物递送到细胞中的装置，其包含含有孔的表面，其中所述孔被配置为使得悬浮在溶液中的细胞可以穿过，其中所述孔使该细胞变形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞。在一些实施方案中，该表面是膜。在一些实施方案中，该表面是过滤器。在一些实施方案中，该表面是曲折路径表面。在一些实施方案中，该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯和陶瓷。在一些实施方案中，该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。在一些实施方案中，使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
[0017] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，孔尺寸是细胞直径的函数。在一些实施方案中，孔尺寸是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约
80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。在一些实施方案中，孔尺寸是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。在一些实施方案中，孔尺寸是约200μm。在一些实施方案中，该孔在尺寸上是不均匀的。在一些实施方案中，不均匀的孔尺寸从10％-20％变化。在一些实施方案中，该孔在尺寸上是均匀的。
[0018] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该孔具有相同的入口角和出口角。在一些实施方案中，该孔具有不同的入口角和出口角。在一些实施方案中，孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，孔横截面形状选自圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，孔边缘是平滑的。在一些实施方案中，孔边缘是锋利的。在一些实施方案中，孔道是直的。在一些实施方案中，孔道是弯曲的。在一些实施方案中，该孔占总表面积的约10％-80％。在一些实施方案中，该表面包含约1.0x 105至约1.0x 1030个总孔。在一些实施方案中，该表面的每mm2表面积包含约10至约1.0x 1015个孔。在一些实施方案中，该孔是平行分布的。在一些实施方案中，具孔表面彼此堆叠。在一些实施方案中，多个表面串联分布。在一些实施方案中，孔分布是有序的。在一些实施方案中，孔分布是随机的。在一些实施方案中，表面厚度是一致的。
在一些实施方案中，表面厚度是可变的。在一些实施方案中，该表面是约0.01μm至约5m厚。
在一些实施方案中，该表面是约10μm厚。
[0019] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该表面涂覆有材料。在一些实施方案中，该材料是Teflon。在一些实施方案中，该材料包含与细胞结合的粘合涂层。在一些实施方案中，该材料包含表面活性剂。在一些实施方案中，该材料包含抗凝剂。在一些实施方案中，该材料包含蛋白质。在一些实施方案中，该材料包含粘附分子。在一些实施方案中，该材料包含抗体。在一些实施方案中，该材料包含调节细胞功能的因子。在一些实施方案中，该材料包含核酸。在一些实施方案中，该材料包含脂质。在一些实施方案中，该材料包含碳水化合物。在一些实施方案中，该材料包含复合物。在一些实施方案中，该复合物是脂质-碳水化合物复合物。在一些实施方案中，该材料包含跨膜蛋白。在一些实施方案中，该材料共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该材料非共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该表面是亲水的。在一些实施方案中，该表面是疏水的。在一些实施方案中，该表面是带电的。
[0020] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含混合细胞群。在一些实施方案中，该细胞悬浮液是全血。在一些实施方案中，该细胞悬浮液是淋巴液。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含外周血单核细胞。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含经纯化的细胞群。在一些实施方案中，该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。在一些实施方案中，该免疫细胞是淋巴细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。
[0021] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该化合物包含核酸。在一些实施方案中，该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。在一些实施方案中，该化合物是肽核酸。在一些实施方案中，该化合物包含转座子。在一些实施方案中，该化合物是质粒。在一些实施方案中，该化合物包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。在一些实施方案中，该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体
DNA。在一些实施方案中，该化合物包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。在一些实施方案中，该化合物是抗体。在一些实施方案中，该化合物是转录因子。在一些实施方案中，该化合物是小分子。在一些实施方案中，该化合物是纳米粒子。在一些实施方案中，该化合物是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，该化合物是荧光标记分子。在一些实施方案中，该化合物是脂质体。在一些实施方案中，该化合物是病毒。
[0022] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞悬浮液在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。在一些实施方案中，待递送的化合物被涂覆在该表面上。在一些实施方案中，该装置在0℃-45℃之间。在一些实施方案中，使该细胞靠正压或负压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，使该细胞靠毛细管压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠血压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠重力穿过该孔。在一些实施方案
中，使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约2.5psi的压力下穿
过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，流体流引导该细胞通过该孔。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。在一些实施方案中，通过该孔的流体流是层流。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。在一些实施方案中，该细胞以一致的细胞速度穿过该孔。在一些实施方案中，该细胞以变动的细胞速度穿过该孔。在一些实施方案中，该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围
内的速度穿过该孔。在一些实施方案中，该表面被包含在较大的组件内。在一些实施方案
中，该表面被包含在注射器内。
[0023] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该细胞悬浮液包含水性溶液。在一些实施方案中，该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。在一些实施方案中，该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。在一些实施方案中，该细胞悬浮液的粘度在从约8.9x 10-4Pa.s至约4.0x 10-3Pa.s的范围内。在一些实施方案中，该装置包含多个表面。在一些实施方案中，该表面是Transwell。在一些实施方案中，至少一个电极邻近于该表面以产生电场。
[0024] 本公开文本的某些方面包括包含扰动的细胞，其中该细胞通过使该细胞穿过含有孔的表面而产生，其中该孔使该细胞变形，从而引起该扰动，使得化合物能够进入该细胞。
在一些实施方案中，该表面是膜。在一些实施方案中，该表面是过滤器。在一些实施方案中，该表面是曲折路径表面。在一些实施方案中，该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯和陶瓷。在一些实施方案中，该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。在一些实施方案中，使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
[0025] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，孔尺寸是细胞直径的函数。在一些实施方案中，孔尺寸是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约
80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。在一些实施方案中，孔尺寸是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。在一些实施方案中，孔尺寸是约200μm。在一些实施方案中，该孔在尺寸上是不均匀的。在一些实施方案中，不均匀的孔尺寸从10％-20％变化。在一些实施方案中，该孔在尺寸上是均匀的。
[0026] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该孔具有相同的入口角和出口角。在一些实施方案中，该孔具有不同的入口角和出口角。在一些实施方案中，孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，孔横截面形状选自圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，孔边缘是平滑的。在一些实施方案中，孔边缘是锋利的。在一些实施方案中，孔道是直的。在一些实施方案中，孔道是弯曲的。在一些实施方案中，该孔占总表面积的约10％-80％。在一些实施方案中，该表面包含约1.0x 105至约1.0x 1030个总孔。在一些实施方案中，该表面的每mm2表面积包含约10至约1.0x 1015个孔。在一些实施方案中，该孔是平行分布的。在一些实施方案中，具孔表面彼此堆叠。在一些实施方案中，多个表面串联分布。在一些实施方案中，孔分布是有序的。在一些实施方案中，孔分布是随机的。在一些实施方案中，表面厚度是一致的。
在一些实施方案中，表面厚度是可变的。在一些实施方案中，该表面是约0.01μm至约5m厚。
在一些实施方案中，该表面是约10μm厚。
[0027] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该表面涂覆有材料。在一些实施方案中，该材料是Teflon。在一些实施方案中，该材料包含与细胞结合的粘合涂层。在一些实施方案中，该材料包含表面活性剂。在一些实施方案中，该材料包含抗凝剂。在一些实施方案中，该材料包含蛋白质。在一些实施方案中，该材料包含粘附分子。在一些实施方案中，该材料包含抗体。在一些实施方案中，该材料包含调节细胞功能的因子。在一些实施方案中，该材料包含核酸。在一些实施方案中，该材料包含脂质。在一些实施方案中，该材料包含碳水化合物。在一些实施方案中，该材料包含复合物。在一些实施方案中，该复合物是脂质-碳水化合物复合物。在一些实施方案中，该材料包含跨膜蛋白。在一些实施方案中，该材料共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该材料非共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该表面是亲水的。在一些实施方案中，该表面是疏水的。在一些实施方案中，该表面是带电的。
[0028] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。在一些实施方案中，该免疫细胞是淋巴细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。
[0029] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该化合物包含核酸。在一些实施方案中，该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。在一些实施方案中，该化合物是肽核酸。在一些实施方案中，该化合物包含转座子。在一些实施方案中，该化合物是质粒。在一些实施方案中，该化合物包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，该化合物包含Cas蛋白和指导
RNA或供体DNA。在一些实施方案中，该化合物包含编码Cas蛋白的核酸和指导RNA或供体
DNA。在一些实施方案中，该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。在一些实施方案中，该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。在一些实施方案中，该化合物包
含蛋白质或肽。在一些实施方案中，该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。在一些实施方案中，该化合物是抗体。在一些实施方案中，该化合物是转录因子。在一些实施方案中，该化合物是小分子。在一些实施方案中，该化合物是纳米粒子。在一些实施方案中，该化合物是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，该化合物是荧光标记分子。在一些实施方案中，该化合物是脂质体。在一些实施方案中，该化合物是病毒。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含含有细胞壁的细
胞。在一些实施方案中，该细胞是植物、酵母、真菌、藻类或细菌细胞。
[0030] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。在一些实施方案中，待递送的化合物被涂覆在该表面上。在一些实施方案中，使该细胞在0℃-45℃之间穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠正压或负压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，使该细胞靠毛细管压穿过该孔。在一些实施方案
中，使该细胞靠血压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠重力穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。在一些实施方案
中，使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案
中，使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。在一些实施方案中，流体流引导该细胞通过该孔。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之前是湍
流。在一些实施方案中，通过该孔的流体流是层流。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。在一些实施方案中，该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围内的速度穿
过该孔。在一些实施方案中，该表面被包含在较大的组件内。在一些实施方案中，该表面被包含在注射器内。
[0031] 在可以与之前的实施方案组合的一些实施方案中，该细胞在包含水性溶液的细胞悬浮液中。在一些实施方案中，该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。在一些实施方案中，该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。在一些实施方案中，使该细胞进一步穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场。
[0032] 附图简述
[0033] 以下附图形成了本说明书的一部分并且被包括以进一步证实本公开文本的某些方面。本公开文本可以通过结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，参考这些附图中的
一个或多个而被更好的理解。
[0034] 图1A示出了用于在所述实施例中使用的示例性聚碳酸酯过滤器的照片。图1B示出了示例性聚碳酸酯过滤器孔的照片。
[0035] 图2A-G示出了示例性FACS图，其显示了在低压(5psi、10psi或20psi)下通过8μm、10μm、12μm或14μm尺寸的过滤器孔3kDa PacBlue和10kDaAlexa 488葡聚糖颗粒向HeLa细胞
6
(2x 10个细胞/mL)的递送。图2A-C描绘了在5psi的压力下穿过14μm(图2A)、12μm(图2B)和
10μm(图2C)尺寸的过滤器孔的细胞。图2E和G描绘了在10psi(图2E)和20psi(图2G)的压力
下穿过12μm过滤器孔的细胞。图2D和F描绘了胞吞对照(图2D)和阴性对照(图2F)图。
[0036] 图3A和3B示出了FACS图，其显示了在通过注射器手动施加的压力下(图3A)或在5psi的恒定压力下(图3B)通过5μm尺寸的过滤器孔3kDaPacBlue和10kDa Alexa 488葡聚糖
颗粒向新鲜分离的人T细胞(4x 106个细胞/mL)的递送。指示了细胞活力频率。
[0037] 图4示出了由商业(COTS)过滤器或定制注射器过滤器介导的3kDa PacBlue葡聚糖颗粒向HeLa细胞递送后的递送效率和细胞活力。
[0038] 图5A和B示出了代表性流式细胞术直方图，其显示了在3psi下COTS(图5A)或定制注射器过滤器(图5B)介导的3kDa PacBlue葡聚糖颗粒向HeLa细胞的递送的平均荧光强度
(MFI)值。图5C示出了在2psi和3psi下COTS或定制注射器过滤器介导的3kDa PacBlue葡聚
糖颗粒向HeLa细胞的递送的平均相对荧光强度均值(rMFI)值。
[0039] 图6示出了在2psi、2.5psi和3psi下由COTS过滤器介导的3kDa PacBlue葡聚糖颗粒和EGFP mRNA向HeLa细胞递送后的递送效率、细胞活力和rMFI值。
[0040] 图7A和B示出了示例性流式细胞术直方图，其描绘了与胞吞对照相比，IgG抗体(图7A)和葡聚糖颗粒(图7B)向人RBC的收缩介导的递送(SQZ)后的荧光。
[0041] 图8A示出了IgG抗体和葡聚糖颗粒向人RBC的收缩介导的递送后的递送效率。图8B示出了IgG抗体和葡聚糖颗粒向人RBC的收缩介导的递送后的估计的细胞活力。
[0042] 图9A示出了示例性流式细胞术直方图，其描绘了IgG抗体向小鼠RBC的收缩介导的递送后的荧光。图9B示出了IgG抗体向小鼠RBC的收缩介导的递送后的估计的细胞活力。图
9C示出了IgG抗体向小鼠RBC的收缩介导的递送后的递送效率。
[0043] 图10A-I示出了示例性FACS图，其显示了与胞吞(图10A)、阴性对照(图10B)和无材料对照(图10C)相比，在2psi(图10D)、4psi(图10E)、6psi(图10F)、10psi(图10G)、20psi(图
10H)下或使用手动注射器压力(图10I)葡聚糖颗粒向小鼠RBC的递送。
[0044] 图11A示出了葡聚糖颗粒向小鼠RBC的收缩介导的递送后的估计的细胞活力。图11B示出了IgG抗体或葡聚糖颗粒向小鼠RBC的收缩介导的递送后的递送效率。图11C示出了
IgG抗体或葡聚糖颗粒向小鼠RBC的收缩介导的递送后的几何均值荧光。
[0045] 图12A示出了示例性流式细胞术直方图，其描绘了葡聚糖颗粒向小鼠RBC的收缩介导的递送后的荧光。图12B示出了葡聚糖颗粒向小鼠RBC的收缩介导的递送后的估计的细胞
活力。图12C示出了葡聚糖颗粒向小鼠RBC的收缩介导的递送后的递送效率。图12D示出了葡聚糖颗粒向小鼠RBC的收缩介导的递送后的几何均值荧光。
[0046] 图13A示出了葡聚糖颗粒向HeLa细胞的微筛介导的递送后的细胞活力。图13B示出了葡聚糖颗粒向HeLa细胞的微筛介导的递送后的递送效率。图13C和图13D示出了示例性流
式细胞术直方图，其描绘了使用AQUAMARIJN微筛(图13C)或STERLITECHTM微筛(图13D)葡聚
糖颗粒向HeLa细胞的收缩介导的递送后的荧光。
[0047] 图14A示出了葡聚糖颗粒向T细胞的微筛介导的递送后的细胞活力和递送效率。图14B示出了示例性流式细胞术直方图，其描绘了使用AQUAMARIJN微筛葡聚糖颗粒向T细胞的
收缩介导的递送后的荧光。
[0048] 发明详述
[0049] 本文描述的公开文本的某些方面是基于令人惊讶的发现，即细胞内递送化合物可以通过使细胞悬液通过含有孔的表面来实现。本公开文本的某些方面涉及用于将化合物递
送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中所述孔使该细胞变
形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与该化合物接
触。本公开文本的某些方面涉及用于将化合物递送到细胞中的装置，所述装置包括含有孔
的表面，其中所述孔被配置为使得悬浮在溶液中的细胞可以穿过，其中所述孔使该细胞变
形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞。在一些实施方案中，该表面是过滤器。
在一些实施方案中，该表面是膜。在一些实施方案中，该表面是微筛。
[0050] I.一般技术
[0051] 本领域技术人员通常熟知并且通常使用常规方法来使用本文描述或引用的技术和程序，例如像描述在以下项中的广泛使用的方法：Molecular Cloning:A Laboratory 
Manual(Sambrook et al.,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(DOI:10.1002/
0471142727)；系列丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A 
Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.,1995)；
Antibodies,A Laboratory Manual(E.A.Greenfield,eds.,2013)；Culture of Animal 
Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,
th
6  ed.,J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotides and Analogues(F.Eckstein,ed.,
1992)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory 
Handbook(J.E.Celis,ed.,Academic Press,2005)；Introduction to Cell and Tissue 
Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,Springer,2013)；Cell and Tissue Culture:
Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,J.Wiley and 
Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,
eds.,1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and 
M.P.Calos,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,
1994)；Current Protocols in Immunology(DOI:10.1002/0471142735)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,J.Wiley and Sons,2002)；Janeway’s 
Immunobiology(K.Murphy and C.Weaver,Garland Science,2016)；Antibodies(P.Finch,
1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；
Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford 
University Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow and 
D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；Making and Using Antibodies:
A Practical Handbook(G.C.Howard and M.R.Kaser,eds.,CRC Press,2013)；The 
Antibodies Vol.1-7(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,
1995-2007)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita et al.,
eds.,J.B.Lippincott Company,2011)。
[0052] II.定义
[0053] 出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。在下文列出的任何定义与通过引用并入本文的任何文献发生
冲突的情况下，应该以列出的定义为准。
[0054] 如本文使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非另外指明。
[0055] 应该理解，本文描述的公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)”、“由......组成(consisting)”和“基本上由......组成(consisting essentially of)”方面和实施方案。
[0056] 对于本文描述的所有组合物以及使用本文描述的组合物的所有方法，该组合物可以包含列出的组分或步骤，或者可以“基本上由”列出的组分或步骤“组成”。当组合物被描述为“基本上由”列出的组分“组成”时，该组合物含有列出的组分，并且可以含有实质上不影响所公开的方法的其他组分，但是不含有实质上影响所公开的方法的不同于明确列出的
那些组分的任何其他组分；或者，如果该组合物确实含有不同于列出的那些的实质上影响
所公开的方法的额外组分，则该组合物不包含足够浓度或量的额外组分以致实质上影响所
公开的方法。当方法被描述为“基本上由”列出的步骤“组成”时，该方法包含列出的步骤，并且可以包含实质上不影响所公开的方法的其他步骤，但是该方法不包含实质上影响所公开
的方法的不同于明确列出的那些步骤的任何其他步骤。作为非限制性的具体例子，当组合
物被描述为“基本上由”某一组分“组成”时，该组合物可以另外含有任何量的实质上不影响所公开的方法的药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂和其他此类组分。
[0057] 如本文使用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知晓的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述了)针对该值或参数本身的实施方
案。
[0058] 如本文使用的术语“孔”是指开口，包括但不限于材料内的洞、裂缝、空腔、穴、破裂、间隙或穿孔。在一些例子中(在指明的情况下)，该术语是指本公开文本的表面内的孔。在其他例子中(在指明的情况下)，孔可以指细胞膜中的孔。
[0059] 如本文使用的术语“膜”是指包含孔的选择性屏障或片材。该术语包括用作边界或衬里的柔韧的片状结构。在一些例子中，该术语是指包含孔的表面或过滤器。此术语不同于术语“细胞膜”。
[0060] 如本文使用的术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔制品。在一些例子中，该术语是指包含孔的表面或膜。
[0061] 如本文使用的术语“不均匀的”是指在结构或组成上混合的或不一致的物质。在一些例子中，该术语是指在给定表面内具有不同尺寸、形状或分布的孔。
[0062] 如本文使用的术语“均匀的”是指在结构或组成上始终一致或一直一致的物质。在一些例子中，该术语是指在给定表面内具有一致尺寸、形状或分布的孔。
[0063] 如本文使用的术语“异源的”是指来源于不同生物体的分子。在一些例子中，该术语是指在给定生物体内通常不发现或表达的核酸或蛋白质。
[0064] 如本文使用的术语“同源的”是指来源于相同生物体的分子。在一些例子中，该术语是指在给定生物体内通常发现或表达的核酸或蛋白质。
[0065] 如本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的聚合体形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体、或包含嘌呤碱和嘧啶碱或其他天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱的聚合物。多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基团(正如通常可以在RNA或DNA中所见的)或者经修饰或取代的糖或磷酸基团。可替代地，多核苷酸的主链可以包含合成亚基(如氨基磷酸酯)的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。此外，可以通过合成互补链并且在适当
的条件下使该链退火，或通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链，从化学合成的单链多核苷酸产物获得双链多核苷酸。
[0066] 术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。该定义涵盖了全长蛋白及其片段两者。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指这样的蛋白质，其包括对天然序列的修饰(如缺失、添加和取代)(在本质上通常是保守的)，只要该蛋白质保持期望的活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过
定点诱变)，或可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错
误)。
[0067] 对于本文描述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法在本领域是已知的。
[0068] III.具有孔的表面
[0069] 在某些方面中，本公开文本涉及用于将化合物递送到细胞中的方法，其包括以下步骤：使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中该孔使该细胞变形，引起该细胞扰动；和使该细胞悬浮液与该化合物接触；例如在该悬浮液中的细胞穿过该孔之前、期间或之后，其中该化合物进入该细胞。如本文公开的表面可以由多种材料中的任一种制成，并且采取多种形
式中的任一种。在一些实施方案中，该表面是膜。在一些实施方案中，该表面是过滤器。过滤器和膜通常用于从溶液中分离材料，从而获得渗余物。在该表面是过滤器或膜的实施方案
中，该过滤器或膜可替代地用于通过以下方式将化合物递送到细胞中：使细胞悬浮液穿过
该过滤器或膜孔，从而引起该细胞扰动，使得化合物进入该细胞。在一些实施方案中，该表面是STERLITECHTM聚碳酸酯过滤器(PCT8013100)。在一些实施方案中，该过滤器是切向流过滤器。在一些实施方案中，该表面是海绵或海绵状基质。在一些实施方案中，该表面是基质。
在一些实施方案中，该表面是微筛。在一些实施方案中，该表面不是网。
[0070] 在一些实施方案中，该表面是曲折路径表面。在一些实施方案中，该曲折路径表面包含醋酸纤维素。在一些实施方案中，该表面包含选自但不限于以下各项的材料：合成或天然聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金属、合金、硝酸纤维素、银、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合纤维素酯、瓷器、石墨和陶瓷。
[0071] 本公开文本的表面可以使用本领域已知的任何技术来制造，包括但不限于蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、注射成型、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。蚀刻涉及使用如强酸等的化学物质以期望的图案切割成金属表面的过程。径迹蚀刻的
膜是通过用颗粒轰击固体膜形成的，所述颗粒通过膜形成受损材料的径迹。然后使膜经受
选择性地蚀刻受损的径迹以形成通过膜的穿孔的化学试剂。孔的横截面宽度可以通过蚀刻
剂在膜上的孵育时间来控制。光刻可以包括微光刻、纳米光刻和X射线光刻。在光刻中，光刻设备将期望的图案施加到衬底的目标部分上。例如，在X射线光刻中，使用X射线将图案从掩模转移到期望衬底上的光敏化学光致抗蚀剂上。在光刻法(photolithography)中，使用光
将期望的图案从光掩模转移到衬底上的光敏光致抗蚀剂上。随后的化学物质应用被用于将
图案雕刻到光致抗蚀剂下方的衬底材料中。激光烧蚀是通过用激光束照射从固体表面去除
材料的过程，而注射成型涉及将材料注射到期望的模具中，然后它在其中冷却并硬化成期
望的结构。冲压和微孔冲孔方法利用工具将期望的形式切割或压印到衬底材料中。为了生
产陶瓷过滤器膜，聚合物海绵法涉及用陶瓷浆料使聚合物海绵饱和，然后将其烧尽以留下
多孔陶瓷。在直接发泡方法中，处理含有期望的陶瓷成分和有机材料的化学混合物以产生
气体。然后在该材料中产生气泡，使其发泡。然后将得到的多孔陶瓷材料干燥并烧制。为了产生蜂窝状或细胞状结构，使用称为挤出的塑性成形方法，其中陶瓷粉末和添加剂的混合
物被强制通过成型模具。热压印涉及将图案冲压到过将聚合物的温度升高至刚好高于其玻
璃化转变温度而软化的聚合物中。
[0072] 在一些实施方案中，该表面是纳米结构膜。在一些实施方案中，使用相变来生产纳米结构的膜。相变方法包括但不限于从气相沉淀、干-湿相转化和热诱导的相分离。在从气相沉淀的方法中，将由聚合物和溶剂组成的浇铸聚合物溶液引入用溶剂蒸气饱和的非溶剂蒸气环境中。饱和的溶剂蒸气抑制了溶剂从膜中蒸发。非溶剂分子随后扩散到膜中，导致聚合物凝固。在干-湿相转化法中，制备由聚合物和溶剂组成的聚合物溶液。将溶液浇铸在合适的表面上，并且在部分蒸发溶剂后，将流延膜浸入明胶中。然后，非溶剂通过薄固体层扩散到聚合物溶液膜中，同时溶剂扩散出来，形成多孔膜。在热诱导的相分离法中，聚合物在高温下与溶剂混合并将聚合物溶液浇铸成膜。当溶液冷却时，由于溶解能力的丧失，溶液进入不混溶区域。
[0073] 在一些实施方案中，该表面是嵌段共聚物。嵌段共聚物由通过共价键连接的两个或更多个不同聚合单体的嵌段组成。嵌段共聚物组分可以微相分离以形成周期性纳米结
构。在此过程中，由于嵌段之间不相容，嵌段共聚物发生相分离，形成纳米尺寸的结构。
[0074] 在一些实施方案中，该表面是微筛。在一些例子中，微筛用于细胞分离、CTC分离或微滴乳化技术中。在一些实施方案中，通过光刻在具有硅载体的陶瓷衬底上产生微筛的孔。在一些实施方案中，该微筛由聚碳酸酯制成。微筛可以从Aquamarijn或Sterlitech获得。在一些实施方案中，该微筛具有从约4μm至约10μm的范围内的孔尺寸。在一些实施方案中，该微筛具有大于约5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％的任一者或大于约
50％的孔隙率。
[0075] 本文公开的表面可以具有本领域已知的任何形状；例如三维形状。该表面的二维形状可以是但不限于环状、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。在一些实施方案中，该表面的形状是圆形。在一些实施方案中，表面三维形状是圆柱形、圆锥形或立方形。
[0076] 术语“孔尺寸”和“孔横截面宽度”可互换使用，并且如本文使用的是指穿过孔的最小横截面宽度。在一些实施方案中，该孔是环状的或大致环状的，并且孔尺寸或孔横截面宽度。在一些实施方案中，该孔的形状是多边形(例如，方形、矩形、五边形、六边形等)，并且孔尺寸或孔横截面宽度是多边形的最小宽度。本领域技术人员将理解，三角形孔可以不具有宽度，而是以基部和高度来描述。在一些实施方案中，三角形孔的孔尺寸或孔横截面宽度是三角形的最小高度(基部与其相对角之间的最小距离)。
[0077] 该表面可以具有各种横截面宽度和厚度。在一些实施方案中，表面横截面宽度在约1mm与约3m之间或其间的任何横截面宽度或横截面宽度范围。在一些实施方案中，表面横截面宽度在约1mm至约750mm、约1mm至约500mm、约1mm至约250mm、约1mm至约100mm、约1mm至约50mm、约1mm至约25mm、约1mm至约10mm、约1mm至约5mm或约1mm至约2.5mm的任一者之间。
在一些实施方案中，表面横截面宽度在约5mm至约1m、约10mm至约1m、约25mm至约1m、约50mm至约1m、约100mm至约1m、约250mm至约1m、约500mm至约1m或约750mm至约1m的任一者之间。
[0078] 在一些实施方案中，该表面具有限定的厚度。在一些实施方案中，表面厚度是一致的。在一些实施方案中，表面厚度是可变的。例如，在一些实施方案中，该表面的部分该表面的其他部分更厚或更薄。在一些实施方案中，表面厚度变化约1％-90％或其间的任何百分比或百分比范围。在一些实施方案中，表面厚度变化约大约1％至约90％、约1％至约80％、约1％至约70％、约1％至约60％、约1％至约50％、约1％至约40％、约1％至约30％、约1％至约20％、约1％至约10％或约1％至约5％中的任一者。在一些实施方案中，表面厚度变化约
5％至约90％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约
50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％或约80％至约90％中的任一者。在一些实施方案中，该表面是约0.01μm至约5mm之间厚或其间的任何厚度或厚度范围。在一些实施方案中，该表面是约0.01μm至约5mm、约0.01μm至约2.5mm、约0.01μm至约1mm、约0.01μm至约
750μm、约0.01μm至约500μm、约0.01μm至约250μm、约0.01μm至约100μm、约0.01μm至约90μm、约0.01μm至约80μm、约0.01μm至约70μm、约0.01μm至约60μm、约0.01μm至约50μm、约0.01μm至约40μm、约0.01μm至约30μm、约0.01um至约20μm、约0.01μm至约10μm、约0.01μm至约5μm、约0.01μm至约1μm、约0.01μm至约0.5μm、约0.01μm至约0.1μm或约0.01μm至约0.05μm之间厚。在一些实施方案中，该表面是约0.01μm至约5mm、约0.05μm至约5mm、约0.1μm至约5mm、约
0.5μm至约5mm、约1μm至约5mm、约5μm至约5mm、约10μm至约5mm、约20um至约5mm、约30μm至约
5mm、约40μm至约5mm、约50μm至约5mm、约60μm至约5mm、约70μm至约5mm、约80μm至约5mm、约
90μm至约5mm、约100μm至约5mm、约250μm至约5mm、约500μm至约5mm、约750μm至约5mm、约1mm至约5mm或约2.5mm至约5mm之间厚。在一些实施方案中，该表面是约10μm厚。
[0079] 在一些实施方案中，通过该表面的流速在约0.001mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec之间或期间的任何速率或速率范围。在一些实施方案中，流速在约0.001mL/cm2/sec至约75L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约50L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约25L/cm2/sec、约
0.001mL/cm2/sec至约10L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约7.5L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约5.0L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约2.5L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约1L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约0.1L/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约75mL/cm2/sec、约
0.001mL/cm2/sec至约50mL/cm2/sec、约0.001mL/cm2/sec至约25mL/cm2/sec、约0.001mL/
2 2 2 2 2
cm/sec至约10mL/cm/sec、约0.001mL/cm/sec至约1mL/cm/sec、约0.001mL/cm/sec至约
0.1mL/cm2/sec或约0.001mL/cm2/sec至约0.01mL/cm2/sec之间。在一些实施方案中，流速在约0.001mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约0.01mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约0.1mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约1mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约10mL/cm2/sec至约100L/cm2/
2 2 2 2 2
sec、约50mL/cm/sec至约100L/cm /sec、约0.1L/cm/sec至约100L/cm/sec、约0.5L/cm /
sec至约100L/cm2/sec、约1L/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约2.5L/cm2/sec至约100L/cm2/
sec、约5L/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约7.5L/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约10L/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约25L/cm2/sec至约100L/cm2/sec、约50L/cm2/sec至约100L/cm2/sec或约
2 2
75L/cm/sec至约100L/cm/sec之间。
[0080] 该孔的横截面宽度与待处理细胞的类型有关。在一些实施方案中，孔尺寸是待处理细胞的直径的函数。在一些实施方案中，孔尺寸使得细胞在通过该孔时受到扰动。在一些实施方案中，孔尺寸小于该细胞的直径。在一些实施方案中，孔尺寸是该细胞直径的约
20％-99％。在一些实施方案中，孔尺寸是该细胞直径的约20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％或99％中的任一者或其间的任何值。最佳孔尺寸可以根据应用和/或细胞类型而变化。许多细胞的直径在约5-15μm之间，例如，树突细胞的直径为7-8μm。例如，该孔的横截面宽度小于约4.5、5、5.5、6或6.5μm中的任一者用于处理单细胞。在另一个例子中，用于处理人卵的孔的横截面宽度在约6.2μm与约8.4μm之间，尽管更大和更小的孔也是可能的(人卵子的直径大约120μm)。在一些实施方案中，使用约12μm与约17μm之间的孔横截面宽度处理细胞簇(例如，胚胎)，条件是该细胞簇在穿过该孔时不被破坏。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01μm至约300μm的范围内或其间的任何尺寸或尺寸范围。在一些实施方案中，孔横截面宽度尺寸在从约0.01μm至约250μm、约0.01μm至约200μm、约0.01μm至约
150μm、约0.01μm至约100μm、约0.01μm至约50μm或约0.01μm至约25μm的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约1μm至约300μm、约25μm至约300μm、约50μm至约300μm、约100μm至约300μm、约150μm至约300μm、约200μm至约300μm或约250μm至约300μm的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度在从约0.01至约35μm的范围内。在一些实施方案中，孔横截面宽度是或小于约0.4μm、约5μm、约10μm、约12μm或约14μm中的任一者。在一些实施方案中，孔横截面宽度是至少约1μm、2μm、3μm、4μm或5μm。在一些实施方案中，孔横截面宽度是或小于约
200μm。在一些实施方案中，横跨给定表面，该孔的横截面宽度是不均匀的或横截面宽度是均匀的。在一些实施方案中，不均匀的孔横截面宽度从10％-20％或其间的任何百分比或百分比范围变化。在一些实施方案中，该孔使该细胞变形至约该细胞直径的约5％、10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％中的任一者或其间的任何值。在一些实施方案中，该细胞的尺寸是悬浮液中该细胞的尺寸。
[0081] 在一些实施方案中，该孔的横截面积是该细胞横截面积的函数。在一些实施方案中，该孔的二维形状是环状、椭圆形、方形、矩形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形，并且该孔的横截面积是该细胞横截面积的函数。在一些实施方案中，孔横截面积是至少约1μm2、4μm2、9μm2、16μm2、25μm2、50μm2、100μm2、150μm2、200μm2、250μm2 500μm2或
1000μm2。在一些实施方案中，横跨给定表面，该孔的截面面积是不均匀的或截面面积是均匀的。在一些实施方案中，不均匀的截面面积从10％-20％或其间的任何百分比或百分比范围变化。在一些实施方案中，该孔使该细胞变形至约该细胞横截面积的约5％、10％、20％、
30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％中的任一者或其间的任何值。在一些实施方案中，该细胞的尺寸是悬浮液中该细胞的尺寸。
[0082] 孔道的入口和出口可以具有多个角度。孔角度可以被选择为使在细胞穿过时该孔的堵塞最小化。例如，入口或出口部分的角度可以在约0与约90度之间。在一些实施方案中，该孔具有相同的入口角和出口角。在一些实施方案中，该孔具有不同的入口角和出口角。在一些实施方案中，孔边缘是平滑的，例如圆形的或弯曲的。平滑的孔边缘具有连续、平坦且平整的表面，没有隆起、脊或不平整部分。在一些实施方案中，孔边缘是锋利的。锋利的孔边缘具有尖的或呈锐角的薄边。在一些实施方案中，孔道是直的。直的通道不包含曲线、弯曲、角度或其他不规则性。在一些实施方案中，孔道是弯曲的。弯曲的孔道是弯曲的或偏离直
线。在一些实施方案中，孔道具有多个曲线，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10或个或更多个曲线。
[0083] 该孔可以具有本领域已知的任何形状，包括二维或三维形状。孔形状(例如，横截面形状)可以是但不限于环状、椭圆形、圆形、矩形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，该孔的横截面的形状是圆形。在一些实施方案中，该孔的三维形状是圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，该孔具有凹槽的入口和出口形状。在一些实施方案中，给定表面内的孔之间的孔形状是均匀的(即一致的或规则的)。在一些实施方案中，给定表面内的孔之间的孔形状是不均匀的(即混合的或变化的)。
[0084] 本文描述的表面可以具有一系列总孔数。在一些实施方案中，该孔占总表面积的约10％-80％。在一些实施方案中，该表面含有约1.0x 103至约1.0x1030个总孔或其间的任何数目或数目范围。例如，该表面可以含有至少约1.0x 103、1.0x 104、1.0x 105、1.0x 106、
1.0x 107、1.0x 108、1.0x 109、1.0x 1010、1.0x 1015、1.0x 1020、1.0x 1025、1.0x 1030或更多中的任一者的总孔。在一些实施方案中，该表面的每mm2表面积包含约10与约1.0x 1015个之间的孔。例如，该表面的每mm2表面积可以含有约1.0x 102至约1.0x 1015、约1.0x 103至约
1.0x 1015、约1.0x 105至约1.0x 1015、约1.0x 107至约1.0x 1015、约1.0x1010至约1.0x 
1015、约1.0x 1012至约1.0x 1015个孔。在一些实施方案中，该表面的mm2表面积可以含有约
15 12 10 7
10至约1.0x 10 、约10至约1.0x 10 、约10至约1.0x 10 、约10至约1.0x 10、约10至约
1.0x 105、约10至约1.0x 103或约10至约1.0x 102个孔。在一些实施方案中，具有13mm半径的表面包含约6.0x105个孔。
[0085] 该孔可以在给定表面内以多种方式分布。在一些实施方案中，该孔在给定表面内是平行分布的。在一些实施方案中，具孔表面彼此堆叠。在一个这样的例子中，该孔在给定表面内以相同方向并排分布并且相距相同的距离。在一些实施方案中，孔分布是有序的或
均匀的。在一个这样的例子中，该孔在给定表面内以规则的系统的模式分布或相距相同的
距离。在一些实施方案中，孔分布是随机的或不均匀的。在一个这样的例子中，该孔在给定表面内以不规则的无序的模式分布或相距不同的距离。在一些实施方案中，该表面中的孔
以不规则模式排列。在一些实施方案中，该表面中的孔在尺寸上是不均匀的。在一些实施方案中，该表面中的孔在形状上是不均匀的。在一些实施方案中，该表面中的孔以不规则模式排列并且尺寸是不均匀的。在一些实施方案中，该表面中的孔以不规则模式排列并且形状
是不均匀的。在一些实施方案中，该表面中的孔在尺寸上是不均匀的并且形状是不均匀的。
在一些实施方案中，该表面中的孔以不规则模式排列，尺寸是不均匀的，并且形状是不均匀的。
[0086] 在一些实施方案中，多个表面串联分布。该多个表面在表面尺寸、形状和/或粗糙度方面可以是均匀的或不均匀的。该多个表面可以进一步含有具有均匀或不均匀孔尺寸、
形状和/或数目的孔，从而使得能够将一系列化合物同时递送到不同细胞类型中。在一些实施方案中，该多个表面是堆叠的。在一些实施方案中，该细胞悬浮液穿过多个表面。
[0087] 在一些实施方案中，单独的孔具有均匀的宽度尺寸(即，沿着孔道长度宽度恒定)。在一些实施方案中，单独的孔具有可变的宽度(即，沿着孔道长度宽度增大或减小)。在一些实施方案中，给定表面内的孔具有相同的单独孔深度。在一些实施方案中，给定表面内的孔具有不同的单独孔深度。在一些实施方案中，该孔彼此直接相邻。在一些实施方案中，该孔彼此隔开一定距离。在一些实施方案中，该孔彼此隔开约0.001μm至约30mm的距离或其间的任何距离或距离范围。例如，该孔可以彼此隔开约0.001μm至30mm、约0.01μm至约30mm、约
0.05μm至约30mm、约0.1μm至约30mm、约0.5μm至约30mm、约1μm至约30mm、约5μm至约30mm、约
10μm至约30mm、约50μm至约30mm、约100μm至约30mm、约250μm至约30mm、约500μm至约30mm、约1mm至约30mm、约10mm至约30mm或约20mm至约30mm中的任一者之间的距离。在一些实施方案中，该孔可以彼此隔开约0.001μm至0.01μm、约0.001μm至约0.05μm、约0.001μm至约0.1μm、约0.001μm至约0.5μm、约0.001μm至约1μm、约0.001μm至约5μm、约0.001μm至约10μm、约
0.001μm至约50μm、约0.001μm至约100μm、约0.001μm至约250μm、约0.001μm至约500μm、约
0.001μm至约1mm、约0.001μm至约10mm或约0.001μm至约20mm中的任一者之间的距离。
[0088] 在一些实施方案中，该表面涂覆有材料。该材料可以选自本领域已知的任何材料，包括但不限于Teflon、粘合涂层、表面活性剂、抗凝剂(如肝素、EDTA、柠檬酸盐和草酸盐)、蛋白质、粘附分子、抗体、调节细胞功能的因子、核酸、脂质、碳水化合物、复合物(如脂质-碳水化合物复合物)或跨膜蛋白。在一些实施方案中，该表面涂覆有聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，该材料共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该材料非共价地附接到该表面。在一些实施方案中，该表面分子在该细胞穿过该孔时被释放。
[0089] 在一些实施方案中，该表面具有经修饰的化学性质。在一些实施方案中，该表面是亲水的。在一些实施方案中，该表面是疏水的。在一些实施方案中，该表面是带电的。在一些实施方案中，该表面是带正电荷的和/或带负电荷的。在一些实施方案中，该表面可以在一些区域中带正电荷并且在其他区域中带负电荷。在一些实施方案中，该表面具有总体正电荷或总体负电荷。在一些实施方案中，该表面可以是光滑的、电抛光的、粗糙的或等离子体处理中的任一者。在一些实施方案中，该表面包含两性离子或偶极化合物。
[0090] IV.细胞悬浮液
[0091] 在某些方面中，本公开文本涉及使细胞悬浮液穿过含有孔的表面。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含动物细胞。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含青蛙、鸡、昆虫或线虫细胞。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。
[0092] 在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含含有细胞壁的细胞。在一些实施方案中，该细胞是植物、酵母、真菌、藻类或细菌细胞。在一些实施方案中，该细胞是植物细胞。在一些实施方案中，该植物细胞是作物、模式、观赏植物、植物、豆科、松柏科植物或草本植物细胞。在一些实施方案中，该细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，该酵母细胞是假丝酵母属
(Candida)或酵母属(Saccharomyces)细胞。在一些实施方案中，该细胞是真菌细胞。在一些实施方案中，该真菌细胞是曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)细胞。在一些实
施方案中，该细胞是藻类细胞。在一些实施方案中，该藻类细胞是衣藻属(Chlamydomonas)、杜氏藻属(Dunaliella)或小球藻属(Chlorella)细胞。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含细菌细胞。在一些实施方案中，该细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞。革兰氏阳性细菌具有包含厚的肽聚糖层的细胞壁。在一些实施方案中，该细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。革兰氏阴性细菌具有包含内胞质细胞膜与外膜之间的薄肽聚糖层的细胞壁。在一些实施方案
中，该细菌细胞是链球菌属(Streptococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属
(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属
(Klebsiella)或沙门氏菌属(Salmonella)细胞。
[0093] 该细胞悬浮液可以是混合或经纯化的细胞群。在一些实施方案中，该细胞悬浮液是混合的细胞群，如全血、淋巴液和/或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，该细胞悬浮液是经纯化的细胞群。在一些实施方案中，该细胞是原代细胞或细胞系细胞。在一些实施方案中，该细胞是血细胞。在一些实施方案中，该血细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，该免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，该免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)、NKT细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或DC2.4树突细胞。在一些实施方案中，该免疫细胞是原代人T细胞。在一些实施方案中，该血细胞是红细胞。在一些实施方案中，该细胞是癌细胞。在一些实施方案中，该癌细胞是癌细胞系细胞，如HeLa细胞。在一些实施方案中，该癌细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，该癌细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施方案中，该细胞是干细胞。示例性干细胞包括但不限于诱导性多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、肝干细胞、心脏干细胞、神经干细胞和造血干细胞。在一些实施方案中，该细胞是成纤维细胞，如原代成纤维细胞或新生人包皮成纤维细胞(Nuff细胞)。在一些实施方案中，该细胞是永生化细胞系细胞，如
HEK293细胞或CHO细胞。在一些实施方案中，该细胞是皮肤细胞。在一些实施方案中，该细胞是生殖细胞，如卵母细胞、卵子或合子。在一些实施方案中，该细胞是神经元。在一些实施方案中，该细胞是一簇细胞(如胚胎)，条件是该簇细胞在穿过该孔时不被破坏。
[0094] 该细胞悬浮液的组成(例如，渗透压、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)可以影响该化合物的递送。在一些实施方案中，该悬浮液包含全血。可替代地，该细胞悬浮液是细胞在生理盐水溶液或血液以外的生理介质中的混合物。在一些实施方案中，该细胞悬浮液包含水性溶液。在一些实施方案中，该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。此外，溶液缓冲液可以包括一种或多种可被设计成减少或消除表面堵塞并改善细胞活力的润滑剂
(普朗尼克或其他表面活性剂)。示例性表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚山梨醇酯、糖(如甘露醇)、动物来源的血清和白蛋白蛋白质。
[0095] 在用某些类型的细胞的一些配置中，该细胞可以在一种或多种有助于将该化合物递送到该细胞内部的溶液中孵育。在一些实施方案中，该水性溶液包含影响肌动蛋白聚合
的试剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。例如，该细胞可以在解聚溶液(如拉春库林A)(0.lμg/ml)中孵育1小时，然后递送以解聚肌动蛋白细胞骨架。作为另一个例子，该细胞可以在10μM秋水仙碱(Sigma)中孵育2小时，然后递送以解聚微管网络。
[0096] 该细胞悬浮液的粘度也可以影响本文公开的方法。在一些实施方案中，该细胞悬浮液的粘度在从约8.9x 10-4Pa.s至约4.0x 10-3Pa.s的范围内或其间的任何值或值范围。
-4 -3 -4
在一些实施方案中，粘度范围在约8.9x 10 Pa.s至约4.0x 10 Pa.s、约8.9x 10 Pa.s至约
3.0x 10-3Pa.s、约8.9x 10-4Pa·s至约2.0x 10-3Pa·s或约8.9x 10-3Pa.s至约1.0x 10-
3Pa.s中的任一者之间。在一些实施方案中，粘度范围在约0.89cP至约4.0cP、约0.89cP至约
3.0cP、约0.89cP至约2.0cP或约0.89cP至约1.0cP中的任一者之间。在一些实施方案中，观察到剪切稀化效应，其中该细胞悬浮液的粘度在剪切应变条件下降低。粘度可以通过本领
域已知的任何方法测量，包括但不限于粘度计(如玻璃毛细管粘度计)或流变仪。粘度计在
一种流动条件下测量粘度，而流变仪用于测量随流动条件变化的粘度。在一些实施方案中，测量剪切稀化溶液(如血液)的粘度。在一些实施方案中，在约0℃与约45℃之间测量粘度。
例如，在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至
45℃或或更高)、降低的温度(例如，约0℃至约4℃)或这些示例性温度之间的温度下测量粘度。
[0097] V.待递送的化合物
[0098] 在某些方面中，本公开文本涉及用于将化合物递送到细胞中的方法。在一些实施方案中，该化合物是单个化合物。在一些实施方案中，该化合物是化合物的混合物。在一些实施方案中，该化合物包含核酸。在一些实施方案中，该化合物是核酸。示例性核酸包括但不限于重组核酸、DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、saRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA、自扩增mRNA和肽核酸。在一些实施方案中，该核酸与该细胞中的核酸同源。在一些实施方案中，该核酸与该细胞中的核酸异源。在一些实施方案中，该核酸包含转座子，以及任选地编码转座酶的序列。在一些实施方案中，该化合物是质粒。在一些实施方案中，该核酸是治疗性核酸。在一些实施方案中，该核酸编码治疗性多肽。在一些实施方案中，该核酸编码报道分子或选择性标记。示例性报道分子标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、发光蛋白(auquorin)、β-半乳糖苷酶、尿卟啉原(urogen)III甲基转移酶(UMT)和萤光素酶。示例性的选择性标记包括但不限于杀稻瘟菌素、G418/遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、博莱霉素、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶和胸苷激酶。
[0099] 在一些实施方案中，该化合物包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，该化合物是蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，在基因组编辑应用中使用蛋白质-核酸复
合物，如规则间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas9。这些复合物含有序列特异性DNA结
合结构域以及非特异性DNA切割核酸酶。这些复合物使得能够进行靶向基因组编辑，包括添加、破坏或改变特定基因的序列。在一些实施方案中，有缺陷的(disabled)CRISPR用于阻断或诱导靶基因的转录。在一些实施方案中，该化合物含有Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。在一些实施方案中，该化合物包括编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。在一些实施方
案中，该化合物包括转座酶蛋白和包含转座子的核酸。
[0100] 在一些实施方案中，该化合物包含蛋白质或多肽。在一些实施方案中，该化合物是蛋白质或多肽。在一些实施方案中，该蛋白质或多肽是治疗性蛋白、抗体、融合蛋白、抗原、合成蛋白、报道分子标记或选择性标记。在一些实施方案中，该蛋白质是基因编辑蛋白或核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。在一些实施方案中，该融合蛋白可以包括但不限于嵌合蛋白药物(如抗体药物缀合物)或重组融合蛋白(如用GST或链霉亲和素标记的蛋白质)。在一些实施方案中，该化合物是转录因子。示例性转录因子包括但不限于Oct5、Sox2、c-Myc、Klf-4、T-bet、GATA3、FoxP3和RORγt。
[0101] 在一些实施方案中，该化合物包含抗原。在一些实施方案中，该化合物是抗原。抗原是刺激特定免疫应答(如细胞或抗体介导的免疫应答)的物质。抗原结合至由对特定抗原具有特异性的免疫细胞表达的受体(如T细胞受体(TCR))。抗原受体结合随后触发细胞内信
号传导通路，其导向下游免疫效应子通路，如细胞活化、细胞因子产生、细胞迁移、细胞毒性因子分泌和抗体产生。在一些实施方案中，抗原来源于外来来源，如细菌、真菌、病毒或过敏原。在一些实施方案中，抗原来源于内部来源，如癌细胞或自身蛋白(即自身抗原)。自身抗原是生物体自身细胞上存在的抗原。自身抗原通常不会刺激免疫应答，但在自身免疫性疾
病(如I型糖尿病或类风湿性关节炎)的情况下可能。在一些实施方案中，该抗原是新抗原。
新抗原是不存在于正常人类基因组中，但由于导致新颖蛋白质序列形成的肿瘤特异性DNA
修饰而在致癌细胞内产生的抗原。
[0102] 在一些实施方案中，该蛋白质或多肽是报道子或选择性标记。示例性报道分子标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、发光蛋白、β-半乳糖苷酶、尿卟啉原(urogen)III甲基转移酶(UMT)和萤光素酶。示例性的选择性标记包括但不限于杀稻瘟
菌素、G418/遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、博莱霉素、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶和胸苷激酶。
[0103] 在一些实施方案中，该化合物包含抗体。在一些实施方案中，该化合物是抗体。在一些实施方案中，该抗体是全长抗体或抗体片段。用于在本公开文本中使用的抗体包括但不限于人或人源化抗体、抗体变体、标记抗体、抗体片段(如Fab或F(ab)2片段)、单结构域抗体、单链抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白和免疫粘附素。该抗体可以是本领域已知的任何同种型，包括IgA、IgG、IgE、IgD或IgM。
[0104] 在一些实施方案中，该化合物包含小分子。在一些实施方案中，该化合物是小分子。示例性小分子包括但不限于荧光标记、染料、药剂、代谢物、佐剂或放射性核苷酸。在一些实施方案中，该药剂是治疗性药物和/或细胞毒性剂。在一些实施方案中，该佐剂包括但不限于CpG、寡脱氧核苷酸、R848、脂多糖(LPS)、rhIL-2、抗CD40或CD40L、IL-12环二核苷酸和干扰素基因刺激剂(STING)的激动剂。
[0105] 在一些实施方案中，该化合物包含纳米粒子。纳米粒子的例子包括金纳米粒子、量子点、碳纳米管、纳米壳、树状聚合物和脂质体。在一些实施方案中，该纳米粒子含有治疗性分子。在一些实施方案中，该纳米粒子含有核酸，如mRNA。在一些实施方案中，该纳米粒子含有标记，如荧光或放射性标记。
[0106] 在一些实施方案中，该化合物包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，该化合物是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，该CAR是细胞外识别结构域(例如，抗原结合结构域)、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的融合物。在抗原接合后，该CAR的细胞内信号传导部分可以在免疫细胞中启动活化相关的应答，如细胞因子或溶细胞
分子的释放。在一些实施方案中，该CAR是嵌合T细胞抗原受体。在一些实施方案中，该CAR含有对肿瘤抗原具有特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，该CAR抗原结合结构域是单链抗体可变片段(scFv)。
[0107] 在一些实施方案中，该化合物包含荧光标记分子。在一些实施方案中，该化合物是荧光标记分子，如用太平洋蓝(pacific blue)、Alexa 288、Cy5或级联蓝(cascade blue)标记的分子。在一些实施方案中，该化合物是放射性核苷酸、葡聚糖颗粒、磁珠或不可渗透的染料。在一些实施方案中，该化合物是用PacBlue标记的3kDa葡聚糖颗粒。在一些实施方案中，该化合物是用Alexa488标记的10kDa葡聚糖颗粒。在一些实施方案中，该化合物是小分子荧光团标记的蛋白质。在一些实施方案中，该化合物是用Alexa647标记的小分子。
[0108] 在一些实施方案中，该化合物包含病毒或病毒样颗粒。在一些实施方案中，该化合物是病毒或病毒样颗粒。在一些实施方案中，该病毒是逆转录病毒。在一些实施方案中，该病毒是治疗性病毒。在一些实施方案中，该病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，该病毒或病毒样颗粒含有编码治疗性分子(如治疗性多肽)的核酸。
[0109] 在一些实施方案中，待递送的化合物是经纯化的。在一些实施方案中，该化合物按重量(干重)计是至少约60％的感兴趣的化合物。在一些实施方案中，经纯化的化合物是感兴趣的化合物的至少约75％、90％或99％。在一些实施方案中，经纯化的化合物是感兴趣的化合物的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)。纯度通过任何已知的方法测定，包括但不限于柱层析、薄层层析、HPLC分析、NMR、质谱或SDS-PAGE。经纯化的DNA或RNA被定义为不含外源核酸、碳水化合物和脂质的DNA或RNA。
[0110] VI.细胞扰动
[0111] 在某些方面中，本公开文本涉及使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中该孔使该细胞变形，引起该细胞扰动。变形可以由例如由机械应变和/或剪切力引起的压力引起。该细胞中的扰动是该细胞中的缺口，其允许来自该细胞外的物质移动进入该细胞(例如，洞、裂缝、空腔、穴、孔、破裂、间隙、穿孔)。在一些实施方案中，扰动是细胞膜内的扰动。在一些实施方案中，扰动是瞬时的。在一些实施方案中，细胞扰动持续从约1.0x 10-9秒至约2小时或其间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x 10-9秒至约1秒、-9
约1秒至约1分钟或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x 10 至约
1.0x 10-1、约1.0x 10-9至约1.0x 10-2、约1.0x 10-9至约1.0x 10-3、约1.0x 10-9至约1.0x 
10-4、约1.0x 10-9至约1.0x 10-5、约1.0x10-9至约1.0x 10-6、约1.0x 10-9至约1.0x 10-7或约
1.0x 10-9至约1.0x 10-8秒中的任一者之间。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x 10-8-1 -7 -1 -6 -1 -5
至约1.0x 10 、约1.0x 10 至约1.0x 10 、约1.0x 10 至约1.0x 10 、约1.0x 10 至约
1.0x10-1、约1.0x 10-4至约1.0x 10-1、约1.0x 10-3至约1.0x 10-1或约1.0x 10-2至约1.0x 
10-1秒中的任一者之间。由本文描述的方法产生的细胞扰动(例如，孔或洞)不是由于蛋白质亚基组装形成多聚体孔结构(如由补体或细菌溶血素产生的)的结果而形成。
[0112] 当该细胞穿过该表面的孔时，变形暂时对细胞膜造成伤害，导致材料通过扰动被动扩散。在一些实施方案中，使该细胞仅变形大约100μs的短暂的时间段以使通过细胞信号传导机制激活凋亡途径的机会最小化，虽然其他持续时间也是可能的(例如，从纳秒至数小时的范围内)。在一些实施方案中，使该细胞变形从约1.0x 10-9秒至约2小时或其间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，使该细胞变形约1.0x 10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，使该细胞变形约1.0x 10-9至约1.0x 10-1、约-9 -2 -9 -3 -9 -4
1.0x 10 至约1.0x 10 、约1.0x 10 至约1.0x 10 、约1.0x 10 至约1.0x10 、约1.0x 
10-9至约1.0x 10-5、约1.0x 10-9至约1.0x 10-6、约1.0x 10-9至约1.0x 10-7或约1.0x 10-9至约1.0x 10-8秒中的任一者之间。在一些实施方案中，使该细胞变形约1.0x 10-8至约1.0x 
10-1、约1.0x 10-7至约1.0x 10-1、约1.0x10-6至约1.0x 10-1、约1.0x 10-5至约1.0x 10-1、约-4 -1 -3 -1 -2 -1
1.0x 10 至约1.0x 10 、约1.0x 10 至约1.0x 10 或约1.0x 10 至约1.0x 10 秒中的任
一者之间。在一些实施方案中，使该细胞变形包括使该细胞变形从约1μs至约750ms，例如至少约1μs、10μs、50μs、100μs、500μs或750μs的范围内的但不限于此的时间。
[0113] 在一些实施方案中，该化合物进入该细胞与该细胞穿过该孔和/或该细胞扰动同时发生。在一些实施方案中，该化合物进入该细胞在该细胞穿过该孔之后发生。在一些实施方案中，该化合物进入该细胞在该细胞穿过该表面的孔之后大约数分钟发生。在一些实施
方案中，该化合物进入该细胞在该细胞穿过该孔之后从约1.0x 10-2秒至约30分钟发生。例如，该化合物进入该细胞在该细胞穿过该孔之后从约1.0x 10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟或约1分钟至约30分钟发生。在一些实施方案中，该化合物进入该细胞在该细胞穿过该孔之后约1.0x 10-2秒至约10分钟、约1.0x 10-2秒至约5分钟、约1.0x 10-2秒至约1分钟、约1.0x 
10-2秒至约50秒、约1.0x 10-2秒至约10秒、约1.0x 10-2秒至约1秒或约1.0x 10-2秒至约0.1秒发生。在一些实施方案中，该化合物进入该细胞在该细胞穿过该孔之后约1.0x 10-1秒至约10分钟、约1秒至约10分钟、约10秒至约10分钟、约50秒至约10分钟、约1分钟至约10分钟或约5分钟至约10分钟发生。在一些实施方案中，在该细胞穿过该孔其中的扰动在该细胞穿过该孔之后约5分钟内被纠正。
[0114] 在一些实施方案中，在穿过该表面的孔之后的细胞活力是约10％至约100％。在一些实施方案中，在穿过该表面的孔之后的细胞活力是至少约10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，在该细胞穿过该孔之后从约1.0x 10-2秒至约10天测量细胞活力。例如，在该细胞穿过该孔之后从约1.0x 10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约30分钟或约30分钟至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在该细胞穿过该孔之后约1.0x 10-2秒至约2小时、约1.0x 10-2秒至约1小
-2 -2 -2
时、约1.0x 10 秒至约30分钟、约1.0x 10 秒至约1分钟、约1.0x 10 秒至约30秒、约1.0x 
10-2秒至约1秒或约1.0x 10-2秒至约0.1秒测量细胞活力。在一些实施方案中，在该细胞穿过该孔之后约1.5小时至约2小时、约1小时至约2小时、约30分钟至约2小时、约15分钟至约2小时、约1分钟至约2小时、约30秒至约2小时或约1秒至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在该细胞穿过该孔之后约2小时至约5小时、约5小时至约12小时、约12小时至约24小时或约24小时至约10天测量细胞活力。
[0115] VII.递送参数
[0116] 在某些方面中，本公开文本涉及用于将化合物递送到细胞中的方法，其包括以下步骤：使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中该孔使该细胞变形，引起该细胞扰动；和使该细胞悬浮液与该化合物接触。该细胞悬浮液可以在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化
合物接触。该细胞可以穿过悬浮在包括待递送的化合物的溶液中的孔，尽管该化合物可以
在该细胞穿过该孔之后被加入该细胞悬浮液中。在一些实施方案中，待递送的化合物被涂
覆在该表面上。
[0117] 几个参数可以影响该化合物向该细胞中的递送。例如，该孔的尺寸、该孔的入口角、该孔的表面性质(例如粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，细胞到孔的通过时间)、细胞浓度、该化合物在该细胞悬浮液中的浓度以及该细胞在穿过该孔之后回收或孵育的时间量可以影响被递送的化合物通过该细胞。影响该化合物向该细胞中的递送
的其他参数可以包括该细胞在该孔中的速度、该孔中的剪切速率、垂直于流速的速度分量
该孔中的时间。可以将此类参数设计成控制该化合物的递送。在一些实施方案中，细胞浓度在从约10至约1012个细胞/ml的范围内或其间的任何浓度或浓度范围。例如，细胞浓度在从约10至约1010个细胞/ml、约10至约108个细胞/ml、约10至约106个细胞/ml、约10至约104个细胞/ml或约10至约102个细胞/ml的范围内。在一些实施方案中，细胞浓度在从约102至约1012
4 12 6 12 8 12
个细胞/ml、约10至约10 个细胞/ml、约10至约10 个细胞/ml、约10至约10 个细胞/ml或
约1010至约1012个细胞/ml的范围内。递送化合物浓度可以在从约10ng/ml至约约1g/mL的范围内或其间的任何浓度或浓度范围。例如，化合物浓度可以在从约10ng/ml至约500mg/ml、约10ng/ml至约250mg/ml、约10ng/ml至约1mg/ml、约10ng/ml至约500μg/ml、约10ng/ml至约
250μg/ml、约10ng/ml至约1μg/ml、约10ng/ml至约500ng/ml、约10ng/ml至约250ng/ml或约
10ng/ml至约100ng/ml的范围内。在一些实施方案中，化合物浓度可以在从约10ng/ml至约
1g/ml、约250ng/ml至约1g/ml、约500ng/ml至约1g/ml、约1μg/ml至约1g/ml、约250μg/ml至约1g/ml、约500μg/ml至约1g/ml、约1mg/ml至约1g/ml、约250mg/ml至约1g/ml、约500mg/ml至约1g/ml或约750mg/ml至约1g/ml的范围内。递送化合物浓度可以在从约1pM至约2M的范
围内。例如，化合物浓度可以在从约1pM至约1M、约1pM至约500mM、约1pM至约250mM、约1pM至约1mM、约1pM至约500μM、约1pM至约250μM、约1pM至约1μM、约1pM至约500nM、约1pM至约
250nM、约1pM至约100nM、约1pM至约10nM、约1pM至约5nM、约1pM至约1nM、约1pM至约750pM、约1pM至约500pM、约1pM至约250pM、约1pM至约100pM、约1pM至约50pM、约1pM至约25pM或约
1pM至约10pM的范围内。在一些实施方案中，化合物浓度可以在从约5pM至约2M、约10pM至约
2M、约25pM至约2M、约50pM至约2M、约100pM至约2M、约250pM至约2M、约500pM至约2M、约
750pM至约2M、约1nM至约2M、约10nM至约2M、约100nM至约2M、约500nM至约2M、约1μM至约2M、约500μM至约2M、约1mM至约2M或约500mM至约2M的范围内。
[0118] 可以调整本公开文本的方法中使用的温度以影响化合物递送和细胞活力。在一些实施方案中，该方法在约-5℃与约45℃之间进行。例如，该方法可以在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或或更高)或降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)或这些示例性温度之间的温度下进行。
[0119] 可以利用各种方法来驱动该细胞通过该孔。例如，可以通过入口侧的泵(例如，气瓶或压缩机)施加压力，可以通过出口侧的真空泵施加真空，可以通过管施加毛细管作用，和/或该系统可以通过重力给料。也可以使用基于位移的流动系统(例如，注射泵、蠕动泵、手动注射器或移液器、活塞等)。在一些实施方案中，使该细胞靠正压或负压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，该泵是蠕动泵。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，使细胞靠毛细管压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠血压穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞靠重力穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在从约0.05psi至约500psi或其间的任何压力或压力范围的压
差下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在从约0.05psi至约500psi、约0.05psi至约
400psi、约0.05psi至约300psi、约0.05psi至约200psi、约0.05psi至约100psi、约0.05psi至约50psi、约0.05psi至约25psi、约0.05psi至约10psi、约0.05psi至约5psi或约0.05psi至约1psi之间的范围内的压差下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在至少或小于约
5psi、约10psi或约20psi的压差下穿过该孔。在一些实施方案中，使该细胞在至少或小于约
2psi、约2.5psi或约3psi的压差下穿过该孔。
[0120] 在一些实施方案中，流体流引导该细胞通过该孔。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。湍流是在给定点处的速度在数值和方向上变化不定的流体流。在一些实施方案中，通过该孔的流体流是层流。层流涉及在固体边界附近的流体中的不间
断流动，其中每个点处的流动方向保持不变。在一些实施方案中，流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。
[0121] 该细胞穿过该孔的速度可以变化。在一些实施方案中，该细胞以一致的细胞速度穿过该孔。在一些实施方案中，该细胞以变动的细胞速度穿过该孔。该细胞以至少约0.1mm/s至约5m/s的速率或其间的任何速率或速率范围穿过该孔。在一些实施方案中，该细胞以约
0.1mm/s至约5m/s、约1mm/s至约5m/s或约1m/s至约5m/s的范围穿过该孔。在一些实施方案
中，该细胞以约0.1mm/s至约4m/s、约0.1mm/s至约3m/s、约0.1mm/s至约2m/s、约0.1mm/s至约1m/s、约0.1mm/s至约750mm/s、约0.1mm/s至约500mm/s、约0.1mm/s至约250mm/s或约
0.1mm/s至约1mm/s的范围穿过该孔。在一些实施方案中，该细胞能以大于约5m/s的速率穿
过该孔。细胞通量可以从小于约1个细胞/秒/孔到多于约1020个细胞/秒/孔之间变化。在一些实施方案中，该表面允许大约数十亿个细胞/秒或分钟的高通量细胞处理。
[0122] 在一些实施方案中，该细胞以一个方向穿过该孔。在一些实施方案中，该细胞以多于一个方向穿过该孔；例如，可以迫使该细胞以一个方向通过该孔，然后迫使其在另一个方向通过该孔；例如，通过使用注射器将该细胞拉过该孔，然后通过该孔排出。在一些实施方案中，使该细胞穿过具孔表面超过一次。
[0123] 在一些实施方案中，该表面被包含在较大的组件内。在一些实施方案中，该表面被包含在注射器(如塑料或玻璃注射器)内。在一些实施方案中，该表面被包含在塑料过滤器夹持器内。在一些实施方案中，该表面被包含在移液器吸头内。
[0124] VIII.应用
[0125] 在一些实施方案中，将化合物或化合物的混合物递送到细胞以产生期望的作用。在一些实施方案中，将抗原和/或免疫刺激分子递送到细胞以产生与常规刺激方法相比具
有改善的活性水平的专职抗原呈递细胞，例如树突细胞。在一些实施方案中，将抗原混合物递送到细胞。在一些实施方案中，使树突细胞、T细胞或B细胞穿过含有孔的表面并与包含靶抗原的溶液接触。该细胞可以在穿过含有孔的表面之前、期间和/或之后与该抗原接触。在一些实施方案中，该靶抗原是癌细胞抗原或癌细胞抗原的混合物。在一些实施方案中，该抗原是传染性疾病抗原。在一些实施方案中，该抗原是自身蛋白抗原。例如，被递送的抗原可以是已知与特定疾病相关的通常表达的蛋白质或从活组织检查获得的患者特异性抗原。在
一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的抗原呈递细胞有助于提高针对靶抗原的T细
胞和B细胞介导的免疫水平。因此，这种方法可以用作激活免疫系统以响应癌症或感染的手段或用于疫苗开发。本发明主题的一个实施方案包括一种系统，其中从患者的血液中分离
的树突细胞、T细胞或B细胞通过本公开文本的方法离体地处理以激活它们抵抗特定抗原，
然后重新引入该患者的血流中。在一些实施方案中，该癌抗原来自患有血癌(如B细胞淋巴
瘤或)患有癌症(如黑素瘤或胰腺癌)的患者。在一些实施方案中，将癌抗原直接递送到DC细胞质，从而利用MHC-1抗原呈递途径并在该患者体内诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。这些活化的T细胞然后寻找并破坏任何表达该靶抗原的癌细胞。在一些实施方案中，该方法可以在具有最低限度训练的技术人员的典型医院实验室中实施。在一些实施方案中，可以使
用患者操作的治疗系统。在一些实施方案中，使用在线血液处理系统实施该方法，其中血液直接从患者转移，穿过含有孔的表面，导致化合物递送到血细胞，并且在处理后直接输注回该患者体内。
[0126] 本公开文本的方法可用于基因治疗应用。在一些实施方案中，本公开文本的方法用于纠正遗传疾病、替换缺陷基因产物或提供治疗性核酸。在一些实施方案中，基因治疗涉及将核酸递送到编码功能性治疗性基因的细胞中以替换经突变的基因。该基因是被认为有
用的任何基因。代表性例子包括编码例如蛋白质或有用的RNA的哺乳动物来源的基因；病毒蛋白(如疱疹胸苷激酶)和用于细胞毒性治疗的细菌霍乱毒素。在一些实施方案中，将核酸
(如DNA或RNA)递送到细胞。可以将核酸递送到难以递送的细胞(如干细胞、原代细胞和免疫细胞)中。核酸可以包括核酸或非常大的核酸，如质粒或染色体。将已知量的基因构建体定量递送到细胞中以研究感兴趣基因的表达水平及其对浓度的敏感性也可以容易地实现。在
一些实施方案中，已知量的DNA序列连同已知量的增强DNA重组的酶的递送可以用于实现更
有效的稳定递送、同源重组和位点特异性诱变。
[0127] 本文描述的方法和装置也可用于RNA的定量递送用于更有效且确定的RNA研究。一些实施方案包括将小干扰RNA(siRNA)递送到细胞的细胞质中。在一些实施方案中，可以将
RNA递送到细胞中用于RNA沉默而不需要脂质体。可以递送已知量的RNA分子连同已知量的
dicer分子，以在不同条件下在多个细胞系中实现标准化的有效的RNA水平。在一些实施方
案中，可以将mRNA递送到细胞中以研究在转录后水平调节的基因表达的方面。在一些实施
方案中，递送到细胞的已知量的标记RNA可以用于研究细胞中RNA的半衰期。在一些实施方
案中，将自扩增RNA(saRNA)递送到细胞。saRNA通过在细胞质中复制它们的序列而不整合到宿主基因组中来表达感兴趣的蛋白质。在一些实施方案中，被递送的saRNA编码感兴趣的抗原。在一些实施方案中，该saRNA用于例如通过表达抑制性、刺激性或抗凋亡蛋白来持续修饰细胞功能。
[0128] 用于筛选、成像或诊断目的，本公开文本的方法可以用于标记细胞。在一些实施方案中，可以递送已知量的标记蛋白以研究细胞环境中的蛋白质-蛋白质相互作用。可以将标记抗体递送到活细胞中用于免疫染色和基于荧光的Western印迹。标记细胞的方法通过使细胞穿过含有孔的表面并使该细胞与包含可检测标记的溶液接触来进行。在一些实施方案
中，该可检测标记包含荧光分子、放射性核素、量子点、金纳米粒子或磁珠。在一些实施方案中，递送工程化的纳米材料用于活细胞成像应用。在一些实施方案中，该化合物是用荧光标记标记的小分子，用于在荧光共振能量转移(FRET)测定中使用。FRET测定可以用于测量蛋
白质相互作用用于药物发现应用。
[0129] 在一些实施方案中，通过引入蛋白质、mRNA、DNA和/或生长因子以诱导细胞重编程并产生iPSC、转基因干细胞系或转基因生物来实现靶向细胞分化。本文描述的方法(例如，干细胞或祖细胞如诱导性多能干细胞(iPSC))穿过含有孔的表面可以用于将分化因子递送到此类细胞中。在一些实施方案中，在摄入引入的因子后，该细胞在由引入的因子决定的分化途径上行进。
[0130] 在一些实施方案中，将糖递送到细胞中以改善细胞(如卵母细胞)的冷冻保存。
[0131] IX.另外的实施方案
[0132] 上述任何方法在体外、离体或体内进行。对于体内应用，该装置可以植入血管内腔，例如动脉或静脉内的内嵌式支架。在一些实施方案中，该方法用作床边系统的一部分，用于离体治疗患者细胞并立即将该细胞重新引入该患者体内。
[0133] 在其他实施方案中，使用组合治疗，例如本文描述的方法，之后或之前是电穿孔(一种类型的渗透转染，在其中使用电流在细胞膜中产生临时孔，允许核酸或大分子进入)。
在一些实施方案中，使该细胞穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场。在一些实
施方案中，电极位于该表面的一侧。在一些实施方案中，电极位于该表面的两侧。在一些实施方案中，该电场在约0.1kV/m至约100MV/m或之间或其间的任何数字或数字范围。在一些
实施方案中，使用集成电路来提供电信号以驱动该电极。在一些实施方案中，使细胞暴露于该电场持续约1ns至约1s之间的脉冲宽度和约100ns至约10s之间的时间或其间的任何时间
或时间范围。
[0134] 还可以采用各种预处理和后处理检测技术，从而使得能够开发用于药物筛选和诊断的连续高通量检测。在一些实施方案中，本文公开的方法可以与荧光激活细胞分选
(FACS)模块串联实施。这可以实现在同一系统上实时递送和分选期望的细胞。例如，本文公开的方法和装置还可以包括分选器和/或传感器模块(例如，光学的、电的和磁的)。在一些实施方案中，将粗滤器或尺寸分选器放置在该表面的上游以在细胞穿过该表面之前将其分
离。例如，如本文描述的表面可以符合从血液样品中分离白细胞的去白细胞装置。在另一个实施方案中，本文公开的表面可以并入液体处理器或移液管内。在一些实施方案中，该表面以用于细胞培养和/或生物分子制造的生物反应器形式实施。通过本公开文本的方法修饰
的细胞可以用于药物或其他治疗性分子的生物生产。
[0135] 在一些实施方案中，该表面被成形为细胞悬浮液流经的管。在一些实施方案中，成形为管的表面含有沿其长度的孔尺寸梯度，允许在该细胞悬浮液流经时选择性递送到不同的细胞类型。
[0136] 本公开文本的一些方面涉及包含扰动的细胞，其中该细胞通过使该细胞穿过含有孔的表面而产生，其中该孔使该细胞变形，从而引起该扰动，使得化合物能够进入该细胞。
在一些实施方案中，使该细胞穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场。
[0137] X.装置和试剂盒
[0138] 本公开文本的一些方面涉及用于将化合物递送到细胞中的装置，其包括含有孔的表面，其中所述孔被配置为使得悬浮在溶液中的细胞可以穿过，其中所述孔使该细胞变形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞。该装置可以包括针对上文公开的方法描
述的任何实施方案，包括具有孔的表面、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数和/或应用等。在一些实施方案中，至少一个电极邻近于该表面以产生电场。
[0139] 在一些实施方案中，该装置是TRANSWELLTM或可渗透支撑件。在一些实施方案中，TRANSWELLTM可以用于高通量筛选应用。例如，可以使用多孔TRANSWELLTM过滤器系统筛选用于特定功能或治疗终点的不同候选药物化合物。在一些实施方案中，每个孔含有待测试的
TM
不同化合物。细胞穿过TRANSWELL 过滤器孔，获得细胞扰动，并随后进入含有要递送的化合物或化合物混合物的基底外侧溶液。这些方法可以作为筛选潜在治疗性化合物的高通量方
法以鉴定新颖的治疗或了解疾病机制。例如，可以使用96孔TRANSWELLTM格式通过本公开文本的方法进行高通量筛选。
[0140] 在一些实施方案中，该装置包含串联的多个表面。该多个表面在尺寸、形状和孔尺寸和/或数目上可以是均匀的或不均匀的，从而使得能够将一系列化合物同时递送到不同细胞类型中。
[0141] 还提供了用于在本文公开的方法中使用的试剂盒或制品。在一些实施方案中，该试剂盒包含在合适的包装中的组合物(例如含有孔的表面、细胞悬浮液和/或待递送的化合
物)。合适的包装材料在本领域是已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿瓶、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。可以进一步对这些制品消毒和/或密封。
[0142] 本公开文本还提供了包含本文描述的方法的组分的试剂盒，并且可以进一步包含用于执行所述方法的说明书。本文描述的试剂盒可以进一步包括其他材料，包括其他缓冲
剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和包装说明书与用于执行本文描述的任何方法的说明书。
[0143] XI.示例性实施方案
[0144] 1.一种用于将化合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液穿过含有孔的表面，其中所述孔使该细胞变形，从而引起该细胞扰动，使得该化合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与该化合物接触。
[0145] 2.实施方案1的方法，其中该表面是膜。
[0146] 3.实施方案1的方法，其中该表面是过滤器。
[0147] 4.实施方案1-3中任一项的方法，其中该表面是曲折路径表面。
[0148] 5.实施方案1-4中任一项的方法，其中该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、石墨、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯和陶瓷。
[0149] 6.实施方案1-5中任一项的方法，其中该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。
[0150] 7.实施方案1-6中任一项的方法，其中使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
[0151] 8.实施方案1-7中任一项的方法，其中孔尺寸是细胞直径的函数。
[0152] 9.实施方案1-8中任一项的方法，其中孔横截面宽度是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
[0153] 10.实施方案1-9中任一项的方法，其中表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。
[0154] 11.实施方案1-10中任一项的方法，其中孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。
[0155] 12.实施方案1-11中任一项的方法，其中孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。
[0156] 13.实施方案1-12中任一项的方法，其中孔横截面宽度是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
[0157] 14.实施方案1-11中任一项的方法，其中孔横截面宽度是约200μm。
[0158] 15.实施方案1-14中任一项的方法，其中该孔在尺寸上是不均匀的。
[0159] 16.实施方案1-15中任一项的方法，其中不均匀的孔横截面宽度从10％-20％变化。
[0160] 17.实施方案1-14中任一项的方法，其中该孔在尺寸上是均匀的。
[0161] 18.实施方案1-17中任一项的方法，其中该孔具有相同的入口角和出口角。
[0162] 19.实施方案1-17中任一项的方法，其中该孔具有不同的入口角和出口角。
[0163] 20.实施方案1-19中任一项的方法，其中孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
[0164] 21.实施方案1-19中任一项的方法，其中孔横截面形状选自圆柱形或圆锥形。
[0165] 22.实施方案1-21中任一项的方法，其中孔边缘是平滑的。
[0166] 23.实施方案1-21中任一项的方法，其中孔边缘是锋利的。
[0167] 24.实施方案1-23中任一项的方法，其中孔道是直的。
[0168] 25.实施方案1-23中任一项的方法，其中孔道是弯曲的。
[0169] 26.实施方案1-25中任一项的方法，其中该孔占总表面积的约10％-80％。
[0170] 27.实施方案1-26中任一项的方法，其中该表面包含约1.0x 105至约1.0x 1030个总孔。
[0171] 28.实施方案1-27中任一项的方法，其中该表面的每mm2表面积包含约10至约1.0x 1015个孔。
[0172] 29.实施方案1-28中任一项的方法，其中该孔是平行分布的。
[0173] 30.实施方案1-29中任一项的方法，其中多个表面串联分布。
[0174] 31.实施方案1-30中任一项的方法，其中孔分布是有序的。
[0175] 32.实施方案1-30中任一项的方法，其中孔分布是随机的。
[0176] 33.实施方案1-32中任一项的方法，其中表面厚度是一致的。
[0177] 34.实施方案1-32中任一项的方法，其中表面厚度是可变的。
[0178] 35.实施方案1-34中任一项的方法，其中该表面是约0.01μm至约5m厚。
[0179] 36.实施方案1-35中任一项的方法，其中该表面是约10μm厚。
[0180] 37.实施方案1-36中任一项的方法，其中该表面涂覆有材料。
[0181] 38.实施方案37的方法，其中该材料是Teflon。
[0182] 39.实施方案37的方法，其中该材料包含与细胞结合的粘合涂层。
[0183] 40.实施方案37的方法，其中该材料包含表面活性剂。
[0184] 41.实施方案37的方法，其中该材料包含抗凝剂。
[0185] 42.实施方案37的方法，其中该材料包含蛋白质。
[0186] 43.实施方案37的方法，其中该材料包含粘附分子。
[0187] 44.实施方案37的方法，其中该材料包含抗体。
[0188] 45.实施方案37的方法，其中该材料包含调节细胞功能的因子。
[0189] 46.实施方案37的方法，其中该材料包含核酸。
[0190] 47.实施方案37的方法，其中该材料包含脂质。
[0191] 48.实施方案37的方法，其中该材料包含碳水化合物。
[0192] 49.实施方案37的方法，其中该材料包含复合物。
[0193] 50.实施方案49的方法，其中该复合物是脂质-碳水化合物复合物。
[0194] 51.实施方案37的方法，其中该材料包含跨膜蛋白。
[0195] 52.实施方案37-51中任一项的方法，其中该材料共价地附接到该表面。
[0196] 53.实施方案37-51中任一项的方法，其中该材料非共价地附接到该表面。
[0197] 54.实施方案1-53中任一项的方法，其中该表面是亲水的。
[0198] 55.实施方案1-53中任一项的方法，其中该表面是疏水的。
[0199] 56.实施方案1-55中任一项的方法，其中该表面是带电的。
[0200] 57.实施方案1-56中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
[0201] 58.实施方案1-57中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含混合细胞群。
[0202] 59.实施方案1-58中任一项的方法，其中该细胞悬浮液是全血。
[0203] 60.实施方案1-58中任一项的方法，其中该细胞悬浮液是淋巴液。
[0204] 61.实施方案1-58中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
[0205] 62.实施方案1-57中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含经纯化的细胞群。
[0206] 63.实施方案1-58或62中任一项的方法，其中该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。
[0207] 64.实施方案63的方法，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。
[0208] 65.实施方案1-64中任一项的方法，其中该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。
[0209] 66.实施方案1-64中任一项的方法，其中该细胞是人细胞。
[0210] 67.实施方案1-66中任一项的方法，其中该化合物包含核酸。
[0211] 68.实施方案1-67中任一项的方法，其中该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。
[0212] 69.实施方案1-68中任一项的方法，其中该化合物是质粒。
[0213] 70.实施方案1-66中任一项的方法，其中该化合物包含蛋白质-核酸复合物。
[0214] 71.实施方案1-66或70中任一项的方法，其中该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。
[0215] 72.实施方案1-67中任一项的方法，其中该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。
[0216] 73.实施方案1-66中任一项的方法，其中该化合物包含蛋白质或肽。
[0217] 74.实施方案1-66或73中任一项的方法，其中该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。
[0218] 75.实施方案1-66或73中任一项的方法，其中该化合物是抗体。
[0219] 76.实施方案1-66或73中任一项的方法，其中该化合物是转录因子。
[0220] 77.实施方案1-66中任一项的方法，其中该化合物是小分子。
[0221] 78.实施方案1-66中任一项的方法，其中该化合物是纳米粒子。
[0222] 79.实施方案1-66中任一项的方法，其中该化合物是嵌合抗原受体。
[0223] 80.实施方案1-79中任一项的方法，其中该化合物是荧光标记分子。
[0224] 81.实施方案1-66中任一项的方法，其中该化合物是脂质体。
[0225] 82.实施方案1-81中任一项的方法，其中所述细胞悬浮液在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。
[0226] 83.实施方案1-81中任一项的方法，其中待递送的该化合物被涂覆在该表面上。
[0227] 84.实施方案1-83中任一项的方法，其中该方法在0℃-45℃之间进行。
[0228] 85.实施方案1-84中任一项的方法，其中使该细胞靠正压或负压穿过该孔。
[0229] 86.实施方案1-85中任一项的方法，其中使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。
[0230] 87.实施方案1-86中任一项的方法，其中使用注射器施加压力。
[0231] 88.实施方案1-86中任一项的方法，其中使用泵施加压力。
[0232] 89.实施方案1-86中任一项的方法，其中使用真空施加压力。
[0233] 90.实施方案1-86中任一项的方法，其中使该细胞靠毛细管压穿过该孔。
[0234] 91.实施方案1-86中任一项的方法，其中使该细胞靠血压穿过该孔。
[0235] 92.实施方案1-86中任一项的方法，其中使该细胞靠重力穿过该孔。
[0236] 93.实施方案1-92中任一项的方法，其中使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。
[0237] 94.实施方案1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。
[0238] 95.实施方案1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。
[0239] 96.实施方案1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。
[0240] 97.实施方案1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。
[0241] 98.实施方案1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。
[0242] 99.实施方案1-93中任一项的方法，其中使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。
[0243] 100.实施方案1-99中任一项的方法，其中流体流引导该细胞通过该孔。
[0244] 101.实施方案100的方法，其中流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。
[0245] 102.实施方案100的方法，其中通过该孔的流体流是层流。
[0246] 103.实施方案100的方法，其中流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。
[0247] 104.实施方案1-103中任一项的方法，其中该细胞以一致的细胞速度穿过该孔。
[0248] 105.实施方案1-103中任一项的方法，其中该细胞以变动的细胞速度穿过该孔。
[0249] 106.实施方案1-105中任一项的方法，其中该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围内的速度穿过该孔。
[0250] 107.实施方案1-106中任一项的方法，其中该表面被包含在较大的组件内。
[0251] 108.实施方案1-107中任一项的方法，其中该表面被包含在注射器内。
[0252] 109.实施方案1-108中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含水性溶液。
[0253] 110.实施方案109的方法，其中该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。
[0254] 111.实施方案110的方法，其中影响肌动蛋白聚合的该试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。
[0255] 112.实施方案110的方法，其中该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。
[0256] 113.实施方案1-112中任一项的方法，其中该细胞悬浮液的粘度在从约8.9x 10-4Pa.s至约4.0x 10-3Pa.s的范围内。
[0257] 114.实施方案1-113中任一项的方法，其中该方法进一步包括使该细胞穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场的步骤。
[0258] 115.一种用于将化合物递送到细胞中的装置，其包含含有孔的表面，其中所述孔被配置为使得悬浮在溶液中的细胞可以穿过，其中所述孔使该细胞变形，从而引起该细胞
扰动，使得该化合物进入该细胞。
[0259] 116.实施方案115的装置，其中该表面是膜。
[0260] 117.实施方案115的装置，其中该表面是过滤器。
[0261] 118.实施方案115-117中任一项的装置，其中该表面是曲折路径表面。
[0262] 119.实施方案115-118中任一项的装置，其中该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯、石墨和陶瓷。
[0263] 120.实施方案115-119中任一项的装置，其中该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。
[0264] 121.实施方案115-120中任一项的装置，其中使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
[0265] 122.实施方案115-121中任一项的装置，其中孔尺寸是细胞直径的函数。
[0266] 123.实施方案115-122中任一项的装置，其中孔横截面宽度是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
[0267] 124.实施方案115-123中任一项的装置，其中表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。
[0268] 125.实施方案115-124中任一项的装置，其中孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。
[0269] 126.实施方案115-125中任一项的装置，其中孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。
[0270] 127.实施方案115-126中任一项的装置，其中孔横截面宽度是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
[0271] 128.实施方案115-125中任一项的装置，其中孔横截面宽度是约200μm。
[0272] 129.实施方案115-128中任一项的装置，其中该孔在尺寸上是不均匀的。
[0273] 130.实施方案115-129中任一项的装置，其中不均匀的孔横截面宽度从10％-20％变化。
[0274] 131.实施方案115-128中任一项的装置，其中该孔在尺寸上是均匀的。
[0275] 132.实施方案115-131中任一项的装置，其中该孔具有相同的入口角和出口角。
[0276] 133.实施方案115-131中任一项的装置，其中该孔具有不同的入口角和出口角。
[0277] 134.实施方案115-133中任一项的装置，其中孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
[0278] 135.实施方案115-133中任一项的装置，其中孔形状选自圆柱形或圆锥形。
[0279] 136.实施方案115-135中任一项的装置，其中孔边缘是平滑的。
[0280] 137.实施方案115-135中任一项的装置，其中孔边缘是锋利的。
[0281] 138.实施方案115-137中任一项的装置，其中孔道是直的。
[0282] 139.实施方案115-137中任一项的装置，其中孔道是弯曲的。
[0283] 140.实施方案115-139中任一项的装置，其中该孔占总表面积的约10％-80％。
[0284] 141.实施方案115-140中任一项的装置，其中该表面包含约1.0x 105至约1.0x 30
10 个总孔。
[0285] 142.实施方案115-141中任一项的装置，其中该表面的每mm2表面积包含约10至约1.0x 1015个孔。
[0286] 143.实施方案115-142中任一项的装置，其中该孔是平行分布的。
[0287] 144.实施方案115-143中任一项的装置，其中多个表面串联分布。
[0288] 145.实施方案115-144中任一项的装置，其中孔分布是有序的。
[0289] 146.实施方案115-144中任一项的装置，其中孔分布是随机的。
[0290] 147.实施方案115-146中任一项的装置，其中表面厚度是一致的。
[0291] 148.实施方案115-146中任一项的装置，其中表面厚度是可变的。
[0292] 149.实施方案115-148中任一项的装置，其中该表面是约0.01μm至约5m厚。
[0293] 150.实施方案115-149中任一项的装置，其中该表面是约10μm厚。
[0294] 151.实施方案115-150中任一项的装置，其中该表面涂覆有材料。
[0295] 152.实施方案151的装置，其中该材料是Teflon。
[0296] 153.实施方案151的装置，其中该材料包含与细胞结合的粘合涂层。
[0297] 154.实施方案151的装置，其中该材料包含表面活性剂。
[0298] 155.实施方案151的装置，其中该材料包含抗凝剂。
[0299] 156.实施方案151的装置，其中该材料包含蛋白质。
[0300] 157.实施方案151的装置，其中该材料包含粘附分子。
[0301] 158.实施方案151的装置，其中该材料包含抗体。
[0302] 159.实施方案151的装置，其中该材料包含调节细胞功能的因子。
[0303] 160.实施方案151的装置，其中该材料包含核酸。
[0304] 161.实施方案151的装置，其中该材料包含脂质。
[0305] 162.实施方案151的装置，其中该材料包含碳水化合物。
[0306] 163.实施方案151的装置，其中该材料包含复合物。
[0307] 164.实施方案163的装置，其中该复合物是脂质-碳水化合物复合物。
[0308] 165.实施方案151的装置，其中该材料包含跨膜蛋白。
[0309] 166.实施方案151-165中任一项的装置，其中该材料共价地附接到该表面。
[0310] 167.实施方案151-165中任一项的装置，其中该材料非共价地附接到该表面。
[0311] 168.实施方案115-167中任一项的装置，其中该表面是亲水的。
[0312] 169.实施方案115-167中任一项的装置，其中该表面是疏水的。
[0313] 170.实施方案115-169中任一项的装置，其中该表面是带电的。
[0314] 171.实施方案115-170中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
[0315] 172.实施方案115-171中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含混合细胞群。
[0316] 173.实施方案115-172中任一项的装置，其中该细胞悬浮液是全血。
[0317] 174.实施方案115-172中任一项的装置，其中该细胞悬浮液是淋巴液。
[0318] 175.实施方案115-172中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
[0319] 176.实施方案115-171中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含经纯化的细胞群。
[0320] 177.实施方案115-172或176中任一项的装置，其中该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。
[0321] 178.实施方案177的装置，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。
[0322] 179.实施方案115-178中任一项的装置，其中该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。
[0323] 180.实施方案115-178中任一项的装置，其中该细胞是人细胞。
[0324] 181.实施方案115-180中任一项的装置，其中该化合物包含核酸。
[0325] 182.实施方案115-181中任一项的装置，其中该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。
[0326] 183.实施方案115-182中任一项的装置，其中该化合物是质粒。
[0327] 184.实施方案115-180中任一项的装置，其中该化合物包含多肽-核酸复合物。
[0328] 185.实施方案115-180或184中任一项的装置，其中该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。
[0329] 186.实施方案115-181中任一项的装置，其中该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。
[0330] 187.实施方案115-180中任一项的装置，其中该化合物包含多肽或肽。
[0331] 188.实施方案115-180或187中任一项的装置，其中该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。
[0332] 189.实施方案115-180或187中任一项的装置，其中该化合物是抗体。
[0333] 190.实施方案115-180或187中任一项的装置，其中该化合物是转录因子。
[0334] 191.实施方案115-180中任一项的装置，其中该化合物是小分子。
[0335] 192.实施方案115-180中任一项的装置，其中该化合物是纳米粒子。
[0336] 193.实施方案115-180中任一项的装置，其中该化合物是嵌合抗原受体。
[0337] 194.实施方案115-193中任一项的装置，其中该化合物是荧光标记分子。
[0338] 195.实施方案115-180中任一项的装置，其中该化合物是脂质体。
[0339] 196.实施方案115-195中任一项的装置，其中所述细胞悬浮液在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。
[0340] 197.实施方案115-195中任一项的装置，其中待递送的该化合物被涂覆在该表面上。
[0341] 198.实施方案115-197中任一项的装置，其中该装置在0℃-45℃之间。
[0342] 199.实施方案115-198中任一项的装置，其中使该细胞靠正压或负压穿过该孔。
[0343] 200.实施方案115-199中任一项的装置，其中使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。
[0344] 201.实施方案115-200中任一项的装置，其中使用注射器施加压力。
[0345] 202.实施方案115-200中任一项的装置，其中使用泵施加压力。
[0346] 203.实施方案115-200中任一项的装置，其中使用真空施加压力。
[0347] 204.实施方案115-200中任一项的装置，其中使该细胞靠毛细管压穿过该孔。
[0348] 205.实施方案115-200中任一项的装置，其中使该细胞靠血压穿过该孔。
[0349] 206.实施方案115-200中任一项的装置，其中使该细胞靠重力穿过该孔。
[0350] 207.实施方案115-206中任一项的装置，其中使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。
[0351] 208.实施方案115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。
[0352] 209.实施方案115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。
[0353] 210.实施方案115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。
[0354] 211.实施方案115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。
[0355] 212.实施方案115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。
[0356] 213.实施方案115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。
[0357] 213.实施方案115-207中任一项的装置，其中使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。
[0358] 214.实施方案115-213中任一项的装置，其中流体流引导该细胞通过该孔。
[0359] 215.实施方案214的装置，其中流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。
[0360] 216.实施方案214的装置，其中通过该孔的流体流是层流。
[0361] 217.实施方案214的装置，其中流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。
[0362] 218.实施方案115-217中任一项的装置，其中该细胞以一致的细胞速度穿过该孔。
[0363] 219.实施方案115-217中任一项的装置，其中该细胞以变动的细胞速度穿过该孔。
[0364] 220.实施方案115-219中任一项的装置，其中该细胞以从约0.1mm/s至约20m/s范围内的速度穿过该孔。
[0365] 221.实施方案115-220中任一项的装置，其中该表面被包含在较大的组件内。
[0366] 222.实施方案115-221中任一项的装置，其中该表面被包含在注射器内。
[0367] 223.实施方案115-222中任一项的装置，其中该细胞悬浮液包含水性溶液。
[0368] 224.实施方案223的装置，其中该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。
[0369] 225.实施方案224的装置，其中影响肌动蛋白聚合的该试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。
[0370] 226.实施方案224的装置，其中该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。
[0371] 227.实施方案115-226中任一项的装置，其中该细胞悬浮液的粘度在从约8.9x 10-4Pa.s至约4.0x 10-3Pa.s的范围内。
[0372] 228.实施方案115-227中任一项的装置，其中该装置包含多个表面。
[0373] 229.实施方案115-228中任一项的装置，其中该表面是Transwell。
[0374] 230.实施方案115-229中任一项的装置，其中至少一个电极邻近于该表面以产生电场。
[0375] 231.一种包含扰动的细胞，其中该细胞通过使该细胞穿过含有孔的表面而产生，其中该孔使该细胞变形，从而引起该扰动，使得化合物能够进入该细胞。
[0376] 232.实施方案231的细胞，其中该表面是膜。
[0377] 233.实施方案231的细胞，其中该表面是过滤器。
[0378] 234.实施方案231-233中任一项的细胞，其中该表面是曲折路径表面。
[0379] 235.实施方案231-234中任一项的细胞，其中该表面包含选自以下各项之一的材料：聚碳酸酯、聚合物、硅、玻璃、金属、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚四氟乙烯、石墨和陶瓷。
[0380] 236.实施方案231-235中任一项的细胞，其中该孔的入口宽于该孔，窄于该孔或者与该孔一样宽。
[0381] 237.实施方案231-236中任一项的细胞，其中使用选自以下各项之一的方法制造该表面：蚀刻、径迹蚀刻、光刻、激光烧蚀、冲压、微孔冲孔、聚合物海绵、直接发泡、挤出和热压印。
[0382] 238.实施方案231-237中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是细胞直径的函数。
[0383] 239.实施方案231-238中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
[0384] 240.实施方案231-239中任一项的细胞，其中表面横截面宽度在从约1mm和约1m的范围内。
[0385] 241.实施方案231-240中任一项的细胞，其中孔横截面宽度在从约0.01μm-约300μm的范围内。
[0386] 242.实施方案231-241中任一项的细胞，其中孔横截面宽度在从约0.01-约35μm的范围内。
[0387] 243.实施方案231-242中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
[0388] 244.实施方案231-241中任一项的细胞，其中孔横截面宽度是约200μm。
[0389] 245.实施方案231-244中任一项的细胞，其中该孔在尺寸上是不均匀的。
[0390] 246.实施方案231-245中任一项的细胞，其中不均匀的孔横截面宽度从10％-20％变化。
[0391] 247.实施方案231-244中任一项的细胞，其中该孔在尺寸上是均匀的。
[0392] 248.实施方案231-247中任一项的细胞，其中该孔具有相同的入口角和出口角。
[0393] 249.实施方案231-247中任一项的细胞，其中该孔具有不同的入口角和出口角。
[0394] 250.实施方案231-249中任一项的细胞，其中孔横截面形状选自以下各项之一：环状、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
[0395] 251.实施方案231-249中任一项的细胞，其中孔形状选自圆柱形或圆锥形。
[0396] 252.实施方案231-251中任一项的细胞，其中孔边缘是平滑的。
[0397] 253.实施方案231-251中任一项的细胞，其中孔边缘是锋利的。
[0398] 254.实施方案231-253中任一项的细胞，其中孔道是直的。
[0399] 255.实施方案231-253中任一项的细胞，其中孔道是弯曲的。
[0400] 256.实施方案231-255中任一项的细胞，其中该孔占总表面积的约10％-80％。
[0401] 257.实施方案231-256中任一项的细胞，其中该表面包含约1.0x 105至约1.0x 1030个总孔。
[0402] 258.实施方案231-257中任一项的细胞，其中该表面的每mm2表面积包含约10至约1.0x 1015个孔。
[0403] 259.实施方案231-258中任一项的细胞，其中该孔是平行分布的。
[0404] 260.实施方案231-259中任一项的细胞，其中多个表面串联分布。
[0405] 261.实施方案231-260中任一项的细胞，其中孔分布是有序的。
[0406] 262.实施方案231-260中任一项的细胞，其中孔分布是随机的。
[0407] 263.实施方案231-262中任一项的细胞，其中表面厚度是一致的。
[0408] 264.实施方案231-262中任一项的细胞，其中表面厚度是可变的。
[0409] 265.实施方案231-264中任一项的细胞，其中该表面是约0.01μm至约5m厚。
[0410] 266.实施方案231-265中任一项的细胞，其中该表面是约10μm厚。
[0411] 267.实施方案231-266中任一项的细胞，其中该表面涂覆有材料。
[0412] 268.实施方案267的细胞，其中该材料是Teflon。
[0413] 269.实施方案267的细胞，其中该材料包含与细胞结合的粘合涂层。
[0414] 270.实施方案267的细胞，其中该材料包含表面活性剂。
[0415] 271.实施方案267的细胞，其中该材料包含抗凝剂。
[0416] 272.实施方案267的细胞，其中该材料包含多肽。
[0417] 273.实施方案267的细胞，其中该材料包含粘附分子。
[0418] 274.实施方案267的细胞，其中该材料包含抗体。
[0419] 275.实施方案267的细胞，其中该材料包含调节细胞功能的因子。
[0420] 276.实施方案267的细胞，其中该材料包含核酸。
[0421] 277.实施方案267的细胞，其中该材料包含脂质。
[0422] 278.实施方案267的细胞，其中该材料包含碳水化合物。
[0423] 279.实施方案267的细胞，其中该材料包含复合物。
[0424] 280.实施方案279的细胞，其中该复合物是脂质-碳水化合物复合物。
[0425] 281.实施方案267的细胞，其中该材料包含跨膜蛋白。
[0426] 282.实施方案267-281中任一项的细胞，其中该材料共价地附接到该表面。
[0427] 283.实施方案267-281中任一项的细胞，其中该材料非共价地附接到该表面。
[0428] 284.实施方案231-283中任一项的细胞，其中该表面是亲水的。
[0429] 285.实施方案231-283中任一项的细胞，其中该表面是疏水的。
[0430] 286.实施方案231-285中任一项的细胞，其中该表面是带电的。
[0431] 287.实施方案231-286中任一项的细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞。
[0432] 288.实施方案231-287中任一项的细胞，其中该细胞是免疫细胞、细胞系细胞、干细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经元或红细胞。
[0433] 289.实施方案288的细胞，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。
[0434] 290.实施方案231-289中任一项的细胞，其中该细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊或兔细胞。
[0435] 291.实施方案231-289中任一项的细胞，其中该细胞是人细胞。
[0436] 292.实施方案231-291中任一项的细胞，其中该化合物包含核酸。
[0437] 293.实施方案231-292中任一项的细胞，其中该化合物包含核酸，包括DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、shRNA或自扩增mRNA。
[0438] 294.实施方案231-293中任一项的细胞，其中该化合物是质粒。
[0439] 295.实施方案231-291中任一项的细胞，其中该化合物包含多肽-核酸复合物。
[0440] 296.实施方案231-291或295中任一项的细胞，其中该化合物包含Cas9蛋白和指导RNA或供体DNA。
[0441] 297.实施方案231-292中任一项的细胞，其中该化合物包含编码Cas9蛋白的核酸和指导RNA或供体DNA。
[0442] 298.实施方案231-291中任一项的细胞，其中该化合物包含蛋白质或肽。
[0443] 299.实施方案231-291或298中任一项的细胞，其中该化合物包含核酸酶、TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶、CRE重组酶、FLP重组酶、R重组酶、整合酶或转座酶。
[0444] 300.实施方案231-291或298中任一项的细胞，其中该化合物是抗体。
[0445] 301.实施方案231-291或298中任一项的细胞，其中该化合物是转录因子。
[0446] 302.实施方案231-291中任一项的细胞，其中该化合物是小分子。
[0447] 303.实施方案231-291中任一项的细胞，其中该化合物是纳米粒子。
[0448] 304.实施方案231-291中任一项的细胞，其中该化合物是嵌合抗原受体。
[0449] 305.实施方案231-304中任一项的细胞，其中该化合物是荧光标记分子。
[0450] 306.实施方案231-291中任一项的细胞，其中该化合物是脂质体。
[0451] 307.实施方案231-306中任一项的细胞，其中所述细胞在穿过该孔之前、与此同时或之后与该化合物接触。
[0452] 308.实施方案231-306中任一项的细胞，其中待递送的该化合物被涂覆在该表面上。
[0453] 309.实施方案231-308中任一项的细胞，其中使该细胞在0℃-45℃之间穿过该孔。
[0454] 310.实施方案231-309中任一项的细胞，其中使该细胞靠正压或负压穿过该孔。
[0455] 311.实施方案231-310中任一项的细胞，其中使该细胞靠恒定压力或可变压力穿过该孔。
[0456] 312.实施方案231-311中任一项的细胞，其中使用注射器施加压力。
[0457] 313.实施方案231-311中任一项的细胞，其中使用泵施加压力。
[0458] 314.实施方案231-311中任一项的细胞，其中使用真空施加压力。
[0459] 315.实施方案231-311中任一项的细胞，其中使该细胞靠毛细管压穿过该孔。
[0460] 316.实施方案231-311中任一项的细胞，其中使该细胞靠血压穿过该孔。
[0461] 317.实施方案231-311中任一项的细胞，其中使该细胞靠重力穿过该孔。
[0462] 318.实施方案231-317中任一项的细胞，其中使该细胞在从约0.05psi至约500psi范围内的压力下穿过该孔。
[0463] 319.实施方案231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约2psi的压力下穿过该孔。
[0464] 320.实施方案231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约2.5psi的压力下穿过该孔。
[0465] 321.实施方案231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约3psi的压力下穿过该孔。
[0466] 322.实施方案231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约5psi的压力下穿过该孔。
[0467] 323.实施方案231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约10psi的压力下穿过该孔。
[0468] 324.实施方案231-318中任一项的细胞，其中使该细胞在约20psi的压力下穿过该孔。
[0469] 325.实施方案231-324中任一项的细胞，其中流体流引导该细胞通过该孔。
[0470] 326.实施方案325的细胞，其中流体流在该细胞穿过该孔之前是湍流。
[0471] 327.实施方案325的细胞，其中通过该孔的流体流是层流。
[0472] 328.实施方案325的细胞，其中流体流在该细胞穿过该孔之后是湍流。
[0473] 329.实施方案231-328中任一项的细胞，其中该细胞以从约0.1mm/s至约5m/s范围内的速度穿过该孔。
[0474] 330.实施方案231-329中任一项的细胞，其中该表面被包含在较大的组件内。
[0475] 331.实施方案231-330中任一项的细胞，其中该表面被包含在注射器内。
[0476] 332.实施方案231-331中任一项的细胞，其中该细胞在包含水性溶液的细胞悬浮液中。
[0477] 333.实施方案332的细胞，其中该水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、蛋白质、螯合剂和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。
[0478] 334.实施方案333的细胞，其中影响肌动蛋白聚合的该试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。
[0479] 335.实施方案333的细胞，其中该细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM、RPMI或X-VIVO。
[0480] 336.实施方案231-335中任一项的细胞，其中使该细胞进一步穿过由邻近于该表面的至少一个电极产生的电场。
实施例
[0481] 出于说明本公开文本的各种实施方案的目的给出以下实施例，而不意味着以任何方式限制本公开文本。本领域技术人员将容易理解，本公开文本很好地适用于实现该目的
并获得所提及的目标和优点以及本文固有的那些目的、目标和优点。本领域技术人员将会
想到包含在由权利要求书的范围限定的本公开文本的精神内的其中的变化以及其他用途。
[0482] 实施例1：将葡聚糖颗粒递送至HeLa细胞
[0483] 引言
[0484] 为了评价过滤器介导的分子向细胞中的递送，使与荧光葡聚糖颗粒混合的HeLa细胞穿过含有限定尺寸的孔的过滤器，并且通过FACS分析评价细胞内颗粒递送。
[0485] 材料和方法
[0486] 聚碳酸酯膜过滤器获得自STERLITECHTM(PCT8013100)。这些聚碳酸酯过滤器是通过将碳酸酯膜暴露于核反应堆中的带电颗粒以产生孔尺寸相对均匀但具有随机分布的孔
而产生的。产生的孔的直径范围为0.010μm至35μm。过滤器孔大约为10μm厚。聚碳酸酯过滤器和过滤器孔的示例性图像示于图1A和B中。本文描述的研究中使用具有8μm、10μm、12μm、和14μm孔尺寸的过滤器。在过滤器递送实验中使用的另外的材料列于表1中。
[0487] 表1：过滤器递送材料
[0488]材料 来源
塑料过滤器夹持器(鲁尔锁) 颇尔(Pall)：P/N–4317
注射器(鲁尔锁) 固安捷(Grainger)：19G342
OptiMEM培养基 生命技术公司(Life Technologies)
PBS 生命技术公司
3kDA-PacBlue葡聚糖 生命技术公司
10kDa-Alexa 488葡聚糖 生命技术公司
镊子 NA
[0489] 将HeLa细胞以4×106个细胞/mL悬浮在optiMEM培养基中。吸取100μl细胞以用作阴性对照。使用镊子将聚碳酸酯膜过滤器悬浮在PBS中以润湿膜过滤器。将塑料过滤器夹持器取下盖子，将过滤器放在内表面上，光面朝上，并重新盖上过滤器夹持器。将200μl与葡聚糖颗粒混合的细胞添加至过滤器夹持器中。将葡聚糖以0.2mg/mL悬浮于4×106个细胞/mL
的5mL细胞中。为了恒压递送，使用了配有压力调节器的氮气递送系统。将过滤器流通物收集到24孔板或FACS管中。在FACS分析前，将所有样品离心并在4℃以400rcf洗涤三次持续4
分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS分析，采取了以下步骤。首先，制备FACS缓冲液
(PBS+终浓度：1％FBS+2nM EDTA)，并在使用前立即添加碘化丙啶(1:100稀释)。每管添加
400μL的FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录10,000次事件/样品。将与葡聚糖颗粒混合但未穿过滤器的细胞用作通过胞吞递送颗粒的对照。这些细胞已与染料接触但未穿过过滤器。所有其他步骤对
于胞吞对照都是相同的。阴性对照样品并未与染料接触，但是经受与实验样品相同的步骤。
[0490] 结果
[0491] 通过8μm、10μm、12μm和14μm尺寸的过滤器孔将葡聚糖颗粒递送到HeLa细胞的效率。
[0492] 将与3kDa PacBlue和10kDa Alexa 488葡聚糖颗粒混合的HeLa细胞在低压(5psi、10psi或20psi)下穿过8μm、10μm、12μm和14μm尺寸的过滤器孔。描绘递送后的细胞的示例性流式细胞术图示于图2A-G中。图2A-C描绘了在5psi下穿过14μm(图2A)、12μm(图2B)和10μm(图2C)尺寸的过滤器孔的细胞。图2E和G描绘了在10psi(图2E)和20psi(图2G)穿过12μm过
滤器孔的细胞。图2D和F描绘了胞吞对照(图2D)和阴性对照(图2F)图。在过滤器递送后包含
3kDa和10kDa葡聚糖颗粒二者的细胞是由PacBlue和Alexa 488(Q2象限)的双重阳性细胞染
色来指示。如由在过滤器递送后3kDa和10kDa葡聚糖颗粒呈阳性的细胞百分比所指示的递
送效率示于下表2中。葡聚糖颗粒的递送效率可预测地随孔尺寸和压力变化而变化，在5psi下8μm孔观察到最高递送(86％)。
[0493] 表2：对HeLa细胞的递送效率
[0494]递送％ 8um孔 10um孔 12um孔 14um孔
5psi 86 34 26 10
10psi 48 56 29 -
20psi 74 65 58 -
胞吞 5 2 2 2
阴性对照 0 0 0 0
[0495] 在过滤器递送后测量细胞活力。如由过滤器递送后的活细胞百分比所指示的细胞活力示于下表3中。穿过过滤器的细胞的细胞活力随着增加的所施加的压力而降低，对于每个孔尺寸而言5psi产生最高的细胞活力。与胞吞对照相比，穿过过滤器的细胞的细胞活力
降低。细胞活力可预测地随孔尺寸和压力变化而变化。
[0496] 表3：HeLa细胞在处理后的活力
[0497]活力％ 8um孔 10um孔 12um孔 14um孔
5psi 47 74 95 78
10psi 34 64 92 -
20psi 12 59 88 -
内吞作用 95 92 95 92
阴性对照 93 92 97 90
[0498] 实施例2：通过5μm尺寸的过滤器孔将葡聚糖颗粒递送至人T细胞。
[0499] 引言
[0500] 为了评价过滤器介导的分子向初级免疫细胞中的递送，使与荧光葡聚糖颗粒混合的初级人T细胞穿过5μm尺寸的过滤器孔，并通过FACS分析确定细胞内颗粒递送。比较在手动注射器压力或恒压下过滤器介导的葡聚糖颗粒向初级人T细胞的递送。
[0501] 材料和方法
[0502] 首先将外周血单核细胞(PBMC)通过聚蔗糖分离而从新鲜人血中分离。然后使用磁性柱通过负选择将T细胞与PBMC分离。将T细胞以4x 106个细胞/mL悬浮在optiMEM培养基
中。吸取100μl细胞以用作阴性对照。使用镊子将聚碳酸酯膜过滤器悬浮在PBS中以润湿膜过滤器。将塑料过滤器夹持器取下盖子，将过滤器放在内表面上，光面朝上，并重新盖上过滤器夹持器。将200μl与葡聚糖颗粒混合的细胞添加至过滤器夹持器中。将葡聚糖以0.2mg/
6
mL悬浮于4×10个细胞/mL的5mL细胞中。为了恒压递送，使用了配有压力调节器的氮气递
送系统。将过滤器流通物收集到24孔板或FACS管中。在FACS分析前，将所有样品离心并在4℃以400rcf洗涤三次持续4分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS分析，采取了以下步
骤。首先，制备FACS缓冲液(PBS+终浓度：1％FBS+2nM EDTA)，并在使用前立即添加碘化丙啶(1:100稀释)。每管添加400μL的FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录10,000次事件/样品。将与葡聚糖颗粒混合但未穿过滤器的细胞用作通过胞吞递送颗粒的对照。这些细胞已与染料接触但未穿过过
滤器。所有其他步骤对于胞吞对照都是相同的。阴性对照样品并未与染料接触，但是经受与实验样品相同的步骤。
[0503] 结果
[0504] 使与3kDa PacBlue和10kDa Alexa 488葡聚糖颗粒混合的初级人T细胞在手动注射器压力或在5psi的恒压下穿过5μm尺寸的过滤器孔。在手动注射器压力下穿过的8.60％
的细胞(图3A)和在5psi恒压下穿过的18.9％的细胞(图3B)在过滤器递送后包含3kDa和
10kDa葡聚糖颗粒二者，如由PacBlue和Alexa 488(Q2象限)的双阳性细胞染色所指示。在手动注射器压力下穿过的85.4％的细胞(图3A)和在5psi的恒压下穿过的83.1％的细胞(图
3B)在递送后是有活力的。
[0505] 实施例3：在2psi和3psi下将葡聚糖颗粒递送至HeLa细胞
[0506] 引言
[0507] 为了评价过滤器介导的分子向细胞中的递送，使与荧光葡聚糖颗粒混合的HeLa细胞穿过含有限定尺寸的孔的过滤器，并且通过FACS分析评价细胞内颗粒递送。
[0508] 材料和方法
[0509] 聚碳酸酯膜过滤器获得自STERLITECHTM。本文描述的研究中使用具有10μm孔尺寸的过滤器。将HeLa细胞以2.5×106个细胞/mL悬浮在OptiMEM培养基中，并且以0.1mg/mL的
终浓度添加3kDa葡聚糖颗粒。如实施例1所述制备膜过滤器和塑料过滤器夹持器。将200μl与葡聚糖颗粒混合的细胞添加至过滤器夹持器中。为了恒压递送，使用了配有压力调节器
的氮气递送系统。将过滤器流通物收集到24孔板或FACS管中。在FACS分析前，将所有样品离心并在4℃以400相对离心力(rcf)洗涤3次持续4分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS
分析，采取了以下步骤。首先，制备FACS缓冲液(PBS+终浓度：1％FBS+2nM EDTA)，并在使用前立即添加碘化丙啶(1:100稀释)。每管添加400μL的FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录10,000次事件/样品。将与葡聚糖颗粒混合但未穿过滤器的细胞用作通过胞吞递送颗粒的对照。这些细胞已
与染料接触但未穿过过滤器。所有其他步骤对于胞吞对照都是相同的。阴性对照样品并未
与染料接触，但是经受与实验样品相同的步骤。在每种压力(2psi和3psi)下使用三个过滤
器，每个实验都有三个样品通过每个过滤器。实验经单独的三天重复进行，每种压力下总计运行27轮。
[0510] 结果
[0511] 在2psi和3psi下通过10μm尺寸的过滤器孔将葡聚糖颗粒递送到HeLa细胞的效率。
[0512] 使与3kDa PacBlue葡聚糖颗粒混合的HeLa细胞在2psi和3psi下穿过10μm尺寸的过滤器孔。通过流式细胞术，如由针对3kDa葡聚糖颗粒呈阳性的细胞百分比所指示的递送
效率、如由过滤器递送后的活细胞百分比所指示的细胞活力、以及相对荧光强度均值
(rMFI)示于下表4(2psi)和下表5(3psi)中。递送效率、活力和rMFI值在整个实验中都是可
重复和显著的。在2psi下，细胞活力和递送效率约为80％。在3psi下，细胞活力约为60％-
70％，而递送效率约为90％，
[0513] 表4：在2psi下过滤器介导的向HeLa细胞的递送
[0514]2psi 活力％ 递送％ rMFI
平均 82.8 79.1 16.6
标准差 4.7 7.7 5.5
变异系数％ 5.7 9.7 32.9
[0515] 表5：在3psi下过滤器介导的向HeLa细胞的递送
[0516]3psi 活力％ 递送％ rMFI
平均 64.8 90.1 21.5
标准差 5.9 3.2 4.7
变异系数％ 9.0 3.6 21.7
[0517] 实施例4：由商业或定制注射器过滤器介导的葡聚糖颗粒向HeLa细胞的递送引言
[0518] 为了评价过滤器介导的分子向细胞中的递送，使与荧光葡聚糖颗粒混合的HeLa细胞穿过商业或定制注射器过滤器，并且通过FACS分析评价细胞内颗粒递送。
[0519] 材料和方法
[0520] 具有商业过滤器(COTS过滤器)和夹持器组合的10μm孔尺寸聚碳酸酯膜过滤器是获得自STERLITECHTM。还使用了具有10μm孔的定制注射器过滤器。
[0521] 将HeLa细胞以3×106个细胞/mL悬浮在OptiMEM培养基中，并且以0.1mg/mL的终浓度添加3kDa葡聚糖颗粒。如实施例1所述制备膜过滤器和塑料过滤器夹持器。将200μl与葡聚糖颗粒混合的细胞添加至过滤器夹持器中。为了恒压递送，使用了配有压力调节器的氮
气递送系统。将过滤器流通物收集到24孔板或FACS管中。在FACS分析前，将所有样品离心并在4℃以400rcf洗涤三次持续4分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS分析，采取了以下
步骤。首先，制备FACS缓冲液(PBS+终浓度：1％FBS+2nM EDTA)，并在使用前立即添加碘化丙啶(1:100稀释)。每管添加400μL的FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录10,000次事件/样品。将与葡聚糖颗粒混合但未穿过滤器的细胞用作通过胞吞递送颗粒的对照。这些细胞已与染料接触但未穿过
过滤器。所有其他步骤对于胞吞对照都是相同的。阴性对照样品并未与染料接触，但是经受与实验样品相同的步骤。在每种压力(2psi和3psi)下使用一个过滤器，每个实验都有三个
样品通过每个过滤器。实验经单独的两天重复进行，每种压力下总计运行6次。
[0522] 结果
[0523] 通过商业或定制过滤器将葡聚糖颗粒递送至HeLa细胞的效率。
[0524] 使与3kDa PacBlue葡聚糖颗粒混合的HeLa细胞在2psi和3psi下穿过10μm尺寸的过滤器孔。比较了来自COTS过滤器和定制过滤器的结果。过滤器递送后如由针对3kDa葡聚
糖颗粒呈阳性的细胞百分比所指示的递送效率以及如由活细胞百分比所指示的细胞活力
示于图4中。表示在3psi下三次运行的荧光强度均值(MFI)的代表性流式细胞术直方图示于
图5A(COTS过滤器)和图5B(定制注射器过滤器)中。在整个运行中的平均相对荧光强度均值
(rMFI)示于图5C中。在第二天进行的实验期间去除网状插入物不影响递送效率或细胞活
力。与COTS过滤器相比，在使用定制过滤器时没有观察到由于死体积减少所致的益处。总体而言，COTS过滤器和定制注射器过滤器导致可比的细胞活力和递送效率。随后的实验使用
COTS过滤器进行。
[0525] 实施例5：过滤器介导的EGFP mRNA向HeLa细胞的递送
[0526] 引言
[0527] 为了评价在过滤器介导的分子递送之后细胞的功能，使与荧光葡聚糖颗粒和EGFP mRNA混合的HeLa细胞穿过10μm孔尺寸的COTS过滤器，并且通过FACS分析评价细胞内颗粒递送和mRNA表达。
[0528] 材料和方法
[0529] 具有商用现货(COTS)过滤器和夹持器组合的10μm孔尺寸聚碳酸酯膜过滤器是获得自STERLITECHTM。将HeLa细胞以2x106个细胞/mL悬浮在OptiMEM培养基中，以0.1mg/mL的终浓度添加3kDa葡聚糖颗粒，并且以0.1mg/mL的终浓度添加编码EGFP的mRNA。如实施例1所述制备膜过滤器和塑料过滤器夹持器。将200μl与葡聚糖颗粒混合的细胞添加至过滤器夹
持器中，并使其在2psi、2.5psi或3psi下穿过过滤器。为了恒压递送，使用了配有压力调节器的氮气递送系统。将流通物收集到24孔板或FACS管中。
[0530] 在FACS分析前，将所有样品离心并在4℃以400rcf洗涤三次持续4分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS分析，采取了以下步骤。首先，制备FACS缓冲液(PBS+终浓度：1％FBS+2nM EDTA)，并在使用前立即添加碘化丙啶(1:100稀释)。每管添加400μL的FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录10,000次事件/样品。将与葡聚糖颗粒或EGFP mRNA混合但未穿过滤器的细胞用作通
过胞吞来递送的对照。这些细胞已与染料或EGFP mRNA接触但未穿过过滤器。所有其他步骤对于胞吞对照都是相同的。阴性对照样品并未与染料或EGFP mRNA接触，但是经受与实验样品相同的步骤。在每种压力(2psi、2.5psi或3psi)下使四个样品通过过滤器。
[0531] 结果
[0532] 使与3kDa PacBlue葡聚糖颗粒和EGFP mRNA混合的HeLa细胞在2psi、2.5psi、或3psi下穿过10μm尺寸的过滤器孔。通过流式细胞术，如由针对3kDa葡聚糖颗粒呈阳性的细胞百分比或表达GFP的细胞百分比所指示的递送效率、如由过滤器递送后的活细胞百分比
所指示的细胞活力、以及相对荧光强度均值(rMFI)示于下图6和下表6-8中。在2.5psi和
3psi下观察到可比的递送效率和细胞活力，与与2psi相比时观察到更高的递送。细胞在共
递送葡聚糖颗粒和EGFP mRNA24小时后保留功能，如由持续活力和GFP表达所指示的。
[0533] 表6：在2psi下过滤器介导的3kDa葡聚糖颗粒和EGFP mRNA向HeLa细胞的递送
[0534]2psi 活力％ 3kDa递送％ 3kDa rMFI GFP表达 GFP rMFI
平均 88.8 80.2 11.5 63.9 21.4
标准差 3.4 4.3 1.6 5.3 3.9
变异系数％ 3.9 5.4 14.1 8.3 18.2
[0535] 表7：在2.5psi下过滤器介导的3kDa葡聚糖颗粒和EGFP mRNA向HeLa细胞的递送
[0536]2.5psi 活力％ 3kDa递送％ 3kDa rMFI GFP表达 GFP rMFI
平均 80.6 85.3 12.8 71.4 21.0
标准差 4.8 2.1 0.5 1.9 1.5
变异系数％ 6.0 2.5 4.2 2.6 7.3
[0537] 表8：在3psi下过滤器介导的3kDa葡聚糖颗粒和EGFP mRNA向HeLa细胞的递送
[0538]
[0539]
[0540] 实施例6：收缩介导的葡聚糖和IgG抗体向人RBC的递送
[0541] 引言
[0542] 为了评价过滤器介导的分子向无核细胞中的递送，使与荧光葡聚糖颗粒或IgG抗体混合的人RBC穿过含有限定尺寸的孔的注射器过滤器，并且通过FACS分析评价细胞内颗
粒递送。
[0543] 材料和方法
[0544] 具有商业过滤器(COTS过滤器)和夹持器组合的2μm直径孔尺寸聚碳酸酯膜过滤器是获得自STERLITECHTM。将人RBC使用聚蔗糖梯度分离方法从全血或减白细胞套管中分离，并在Optimem中以所需浓度(50-500M/mL)重悬。使用镊子将聚碳酸酯膜过滤器悬浮在
Optimem中以润湿膜过滤器。将塑料过滤器夹持器取下盖子，将过滤器放在内表面上，光面朝上，并重新盖上过滤器夹持器。将葡聚糖颗粒和IgG抗体以0.1mg/mL悬浮。在室温下将1mL与葡聚糖颗粒或IgG抗体混合的细胞添加至过滤器夹持器中。使用手动手指按压注射器来
驱动细胞通过过滤器。将过滤器流通物收集到15ml Falcon管或FACS管中。在FACS分析前，将所有样品离心并在4℃以400rcf洗涤三次持续4分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS
分析，采取了以下步骤。制备FACS缓冲液(PBS+终浓度：1％FBS+2mM EDTA)，并且每管添加
400μL FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录≥10,000次事件/样品。将与葡聚糖颗粒或IgG抗体混合但未穿
过滤器的细胞用作通过胞吞来递送的对照。这些细胞已与染料接触但未穿过过滤器。所有
其他步骤对于胞吞对照都是相同的。
[0545] 结果
[0546] 使与10kDa Alexa 647葡聚糖颗粒或150kDa IgG抗体(该抗体缀合至Alexa647)混合的RBC穿过2μm尺寸的过滤器孔。描绘收缩介导的递送(SQZ)后对比胞吞对
照的荧光的示例性流式细胞术直方图示于图7A和B中。如由在过滤器递送后针对IgG抗体的
葡聚糖颗粒呈阳性的细胞百分比所指示的递送效率示于图8A中。在过滤器递送后IgG抗体
的递送效率为88.6％，并且葡聚糖颗粒的递送效率为95.6％。
[0547] 在过滤器递送后测量细胞活力。估计的细胞活力，如在过滤器递送后存在于FSC和SSC设门内的细胞百分比所指示的，示于图8B中。在过滤器递送后估计的被递送IgG抗体的
细胞的活力为68.8％，并且估计的被递送葡聚糖颗粒的细胞的活力为63.3％。
[0548] 实现了收缩介导的葡聚糖颗粒和IgG抗体向人RBC中的递送。
[0549] 实施例7：收缩介导的葡聚糖和IgG抗体向小鼠RBC的递送
[0550] 引言
[0551] 为了评价过滤器介导的分子向无核细胞中的递送，使与荧光葡聚糖颗粒或IgG抗体混合的小鼠RBC穿过含有限定尺寸的孔的注射器过滤器，并且通过FACS分析评价细胞内
颗粒递送。
[0552] 材料和方法
[0553] 具有商业过滤器(COTS过滤器)和夹持器组合的1μm和2μm直径孔尺寸聚碳酸酯膜TM
过滤器是获得自STERLITECH 。将全血离心沉淀并将细胞在Optimem中以所需浓度(100-
500M/ml)重悬。使用镊子将聚碳酸酯膜过滤器悬浮在Optimem中以润湿膜过滤器。将塑料过滤器夹持器取下盖子，将过滤器放在内表面上，光面朝上，并重新盖上过滤器夹持器。将葡聚糖颗粒和IgG抗体以0.1mg/mL悬浮。在室温下将1mL与葡聚糖颗粒或IgG抗体混合的细胞
添加至过滤器夹持器中。使用手动手指按压注射器来驱动细胞通过过滤器。可替代地，使用受控压力系统驱动与葡聚糖颗粒或IgG抗体混合的200μL细胞通过过滤器。将过滤器流通物收集到15ml Falcon管或FACS管中。在FACS分析前，将所有样品离心并在24℃以1000rfc洗
涤三次持续10分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS分析，采取了以下步骤。制备FACS缓冲液(PBS+终浓度：1％FBS+2mM EDTA)，并且每管添加400μL FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录≥10,000
次事件/样品。将与葡聚糖颗粒或IgG抗体混合但未穿过滤器的细胞用作通过胞吞来递送的
对照。这些细胞已与染料接触但未穿过过滤器。所有其他步骤对于胞吞对照都是相同的。NC(无接触)样品并未与染料接触，但是经受与实验样品相同的步骤但不穿过过滤器。
[0554] 结果
[0555] 使用手动注射器压力，使与IgG抗体(150kDa)混合的小鼠RBC穿过1μm和2μm尺寸的过滤器孔。描绘收缩介导的递送(SQZ)后对比胞吞对照(Endo)、阴性对照(NC)和无材料对照的荧光的示例性流式细胞术直方图示于图9A中。‘无材料’对照并未与IgG抗体接触，但经受与实验样品相同的步骤并穿过过滤器。
[0556] 在过滤器递送后测量细胞活力。估计的细胞活力，如在使用手动注射器压力进行IgG抗体的过滤器递送后存在于FSC和SSC设门内的细胞百分比所指示的，示于图9B中。如在使用手动注射器压力进行过滤器递送后，针对IgG抗体呈阳性的细胞百分比所指示的IgG抗
体的递送效率示于图9C中。
[0557] 使用在2psi、4psi、6psi、10psi、20psi下的受控压力系统或使用手动注射器压力使与70kDa Alexa 488葡聚糖颗粒或IgG抗体(150kDa)混合的RBC穿过2μm尺寸的过滤器孔。描绘收缩介导的递送(SQZ)后对比胞吞对照(Endo)、阴性对照(NC)和无材料对照的荧光的示例性流式细胞术直方图示于图10A-I中。在过滤器递送后测量细胞活力。估计的细胞活力，如在过滤器递送葡聚糖颗粒后存在于FSC和SSC设门内的细胞百分比所指示的，示
于图11A中。如由在过滤器递送后针对葡聚糖颗粒或IgG抗体呈阳性的细胞百分比所指示的
递送效率示于图11B中。在过滤器递送葡聚糖颗粒或IgG抗体后的荧光几何平均值示于图
11C中。
[0558] 使用在10psi、12psi、14psi、16psi或18psi下的受控压力系统使与70kDa Alexa488葡聚糖颗粒混合的RBC穿过2μm尺寸的过滤器孔。描绘收缩介导的递送(SQZ)后
对比胞吞对照(Endo)和阴性对照(NC)的荧光的示例性流式细胞术直方图示于图12A中。在
过滤器递送后测量细胞活力。估计的细胞活力，如在过滤器递送葡聚糖颗粒后存在于FSC和SSC设门内的细胞百分比所指示的，示于图12B中。如由在过滤器递送后针对葡聚糖颗粒呈
阳性的细胞百分比所指示的递送效率示于图12C中。在过滤器递送葡聚糖颗粒后的荧光几
何平均值示于图12D中。
[0559] 实现了收缩介导的葡聚糖颗粒和IgG抗体向小鼠RBC中的递送。
[0560] 实施例8.向HeLa细胞和T细胞的微筛递送
[0561] 为了评价微筛介导的分子递送，将HeLa细胞或T细胞与荧光葡聚糖颗粒混合并使其穿过微筛，并且通过FACS分析评价细胞内颗粒递送。
[0562] 材料和方法
[0563] 将来自STERLITECHTM(孔隙率8％)的10μm孔尺寸的聚碳酸酯微筛或来自AQUAMARIJN(孔隙率36.3％)的10μm孔尺寸的硅/陶瓷微筛用于HeLa细胞。将HeLa细胞以5×
106个细胞/mL悬浮在OptiMEM培养基中，并且以1mg/mL的终浓度添加3kDa葡聚糖颗粒。将
200μl与葡聚糖颗粒混合的细胞添加至微筛中，并使其在3-7psi下在室温穿过微筛。在37℃恢复。
[0564] 将初试T细胞以10×106个细胞/mL悬浮在OptiMEM培养基中，并且以1mg/mL的终浓度添加3kDa葡聚糖颗粒。使与葡聚糖颗粒混合的200μl细胞在冰上在6-8psi下超过4μm过滤器或4μm微筛。在室温下恢复。
[0565] 在FACS分析前，将所有样品离心并在4℃以400rcf洗涤三次持续4分钟以除去细胞外葡聚糖。为了准备FACS分析，采取了以下步骤。首先，制备FACS缓冲液(PBS+终浓度：1％FBS+2nM EDTA)，并在使用前立即添加碘化丙啶(1:100稀释)。每管添加400μL的FACS缓冲液并将细胞重悬。调节流式细胞仪前向散射、侧向散射和荧光通道电压以显现所有细胞事件，并记录10,000次事件/样品。将与葡聚糖颗粒混合但未穿过滤器的细胞用作通过胞吞来递
送的对照。这些细胞已与染料或EGFP mRNA接触但未穿过过滤器。所有其他步骤对于胞吞对照都是相同的。阴性对照样品并未与染料或EGFPmRNA接触，但是经受与实验样品相同的步
骤。
[0566] 结果
[0567] 微筛介导的葡聚糖向HeLa细胞的递送的结果示于图13A-13D中。针对STERLITECHTM和AQUAMARIJN微筛，细胞活力示于图13A中，并且葡聚糖的递送示于图13B中。针对
AQUAMARIJN和STERLITECHTM微筛的代表性直方图分别示于图13C和13D中。
[0568] 微筛介导的葡聚糖向T细胞的递送的结果示于图14A和14B中。针对AQUAMARIJN微筛的细胞活力和葡聚糖的递送示于图14A中。针对AQUAMARIJN微筛的代表性流式细胞术直
方图示于图14B中。结果与过滤器介导的递送是可比的。
[0569] 结果显示将微筛递送葡聚糖至HeLa细胞和T细胞后，具有良好的递送和最小的活力损失。
[0570] 本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可根据本公开文本进行制造和实施而无需过度实验。尽管已经以实施方案的方式描述了本公开文本的组合物和方法，但是对
本领域技术人员而言将清楚的是，可以对本文描述的组合物和/或方法以及在步骤或者在
方法的步骤的顺序中进行变化，而不脱离本公开文本的概念、精神和范围。更确切地，将清楚的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替在此描述的试剂，同时将实现相同或相似
的结果。对于本领域技术人员而言清楚的所有此类类似的替换和修改被认为在本公开文本
的如所附权利要求书所限定的精神、范围和概念之内。
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