专利汇可以提供一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法和应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法和用途,本发明所述鲨鱼糖蛋白是从鲨鱼鱼肉经组织捣碎、 脱脂 、酶解、再经DEAE-cellulose-52柱层析、Sephadex G-100柱层析和反相高效液相色谱纯化,浓缩、再经 冷冻干燥 步骤得到鲨鱼糖蛋白。本发明的鲨鱼糖蛋白的分子量约为26.4kDa,糖和蛋白含量分别为33.65%和66.35%,含有O-糖肽键和N-糖肽键,单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D- 葡萄糖 和D-甘露糖,相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09; 蛋白质 由17中 氨 基酸组成。本发明的鲨鱼糖蛋白在临床上可以作为一种新生血管 抑制剂 使用,可用于 肿瘤 等 疾病 的 治疗 ,具有广阔的市场前景。,下面是一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种鲨鱼糖蛋白,其特征在于该鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4kDa,其中糖和蛋白含量分别为33.65%和66.35%,该鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖,相应比例为1.00:1.53:7.27:9.07:2.09;
并且制备方法步骤为:
1)匀浆:鲨鱼肉于80(v)%~95(v)%乙醇溶液中匀浆2~4min,匀浆液用0.5~
1.5mol/LNaOH调pH值至8.5~9.5,用双蒸水调乙醇浓度至50(v)%~70(v)%,于20~
30℃水浴中保温20~40min后,于3000~5000r/min离心10~20min,收集上清液;加NaCl将上清液的NaCl浓度调至5(wt)%~10(wt)%,于20~30℃水浴中10~15小时,于
3000~5000r/min离心10~20min,收集沉淀;
2)脱脂:将1)所得沉淀物加入乙醚处理2~3小时,过滤得沉淀物,冻干得脱脂蛋白粉末;
3)酶解:将2)所得脱脂蛋白粉末按照料液比1:40~1:60溶于双蒸水中,用0.5~
1.5mol/LHCl调pH至5.5~6.5,按照脱脂蛋白粉末0.8~1.2(wt)%的量加入木瓜蛋白酶,于50~60℃酶解2~4小时;将所得的酶解产物先经灭酶处理,得酶解液,酶解液3000~
5000r/min离心20~40min,取上清液脱盐、浓缩和冷冻干燥,得糖蛋白粗品;
4)精制:将3)所得糖蛋白粗品溶于双蒸水中,经阴离子交换树脂柱层析,先用0.09~
0.11mol/LNaC1洗脱,然后用0.45~0.55mo1/LNaCl洗脱,收集0.45~0.55mo1/LNaCl洗脱组分,即得粗糖蛋白组分;将所收集的粗糖蛋白组分再上葡聚糖凝胶柱,用去离子水洗脱,收集糖蛋白组分;将凝胶色谱收集的糖蛋白组分用高效液相色谱纯化,收集洗脱峰,冷冻干燥得糖蛋白。
2.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白,其特征在于所述鲨鱼糖蛋白中有17种氨基酸,其中100g总氨基酸中含有丙氨酸10.4g,精氨酸5.9g,天冬氨酸8.3g,半胱氨酸0.1g,谷氨酸8.7g,甘氨酸15.6g,组氨酸0.2g,异亮氨酸1.2g,亮氨酸2.9g,赖氨酸2.2g,蛋氨酸
0.9g,苯丙氨酸2.6g,脯氨酸9.5g,丝氨酸16.7g,苏氨酸8.9g,酪氨酸0.3g,缬氨酸5.6g。
3.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白,其特征在于所述鲨鱼糖蛋白的组分在280nm处有蛋白质特征吸收值,同时用苯酚-硫酸法检测时,在490nm有多糖特征吸光值的组分。
4.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白,其特征在于所述鲨鱼糖蛋白的糖肽的结合方式为N-糖肽键和O-糖肽键。
5.一种根据权利要求1至4任一权利要求所述的鲨鱼糖蛋白的制备方法,其特征在于步骤为:
1)匀浆:鲨鱼肉于80(v)%~95(v)%乙醇溶液中匀浆2~4min,匀浆液用0.5~
1.5mol/LNaOH调pH值至8.5~9.5,用双蒸水调乙醇浓度至50(v)%~70(v)%,于20~
30℃水浴中保温20~40min后,于3000~5000r/min离心10~20min,收集上清液;加NaCl将上清液的NaCl浓度调至5(wt)%~10(wt)%,于20~30℃水浴中10~15小时,于
3000~5000r/min离心10~20min,收集沉淀;
2)脱脂:将1)所得沉淀物加入乙醚处理2~3小时,过滤得沉淀物,冻干得脱脂蛋白粉末;
3)酶解:将2)所得脱脂蛋白粉末按照料液比1:40~1:60溶于双蒸水中,用0.5~
1.5mol/LHCl调pH至5.5~6.5,按照脱脂蛋白粉末0.8~1.2(wt)%的量加入木瓜蛋白酶,于50~60℃酶解2~4小时;将所得的酶解产物先经灭酶处理,得酶解液,酶解液3000~
5000r/min离心20~40min,取上清液脱盐、浓缩和冷冻干燥,得糖蛋白粗品;
4)精制:将3)所得糖蛋白粗品溶于双蒸水中,经阴离子交换树脂柱层析,先用0.09~
0.11mol/LNaC1洗脱,然后用0.45~0.55mo1/LNaCl洗脱,收集0.45~0.55mo1/LNaCl洗脱组分,即得粗糖蛋白组分;将所收集的粗糖蛋白组分再上葡聚糖凝胶柱,用去离子水洗脱,收集糖蛋白组分;将凝胶色谱收集的糖蛋白组分用高效液相色谱纯化,收集洗脱峰,冷冻干燥得糖蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于所述步骤3)中的木瓜蛋白酶的酶活力
6
≥1×10U/g。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于所述步骤3)中的灭酶处理为:将所得的酶解产物升温至95~100℃,并于此温度保持10~15min,再冷却至10~20℃以终止酶反应;所述步骤3)中的脱盐过程为:将酶解液制成浓度10mg/ml~20mg/ml的溶液,进行D101大孔树脂脱盐;脱盐后的酶解液在不高于40℃的低温下进行真空浓缩,得到浓缩酶解液于低温冻干。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于所述步骤4)中的阴离子交换树脂为DEAE-cellulose-52,葡聚糖凝胶为SephadexG-100;高效液相色谱的条件为:色谱柱为InertsilODS-3C18柱,流动相为:乙腈-水,含0.1(wt)%三氟乙酸梯度洗脱,流速为0.8~
1.2ml/min。
9.一种根据权利要求1至4任一权利要求所述的鲨鱼糖蛋白用于制备抗肿瘤药物或者新生血管抑制剂的应用。
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