用于靶向给药的多孔纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）及其使用方法
阅读：594发布：2021-07-09
专利汇可以提供用于靶向给药的多孔纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 指向用于特异性靶向肝癌细胞和其他癌症细胞的原始细胞，包括一具有 支撑 脂双层的纳米多孔 二 氧 化 硅 ；至少一种促进癌细胞死亡的 试剂 （例如传统的小分子、大分子货物（如siRNA或者蛋白毒素如蓖麻毒素A链或者白喉毒素A链）和/或组蛋白 包装 的质粒DNA，该组蛋白包装的质粒DNA置于纳米多孔 二氧化硅 核心内（优选是超螺旋的，以更有效地将DNA包装进原始细胞中），该质粒DNA可选地用核 定位 序列修饰，以便帮助在癌细胞核内定位原始细胞并促进表达多种包含于癌细胞 治疗 （细胞凋亡/细胞死亡）中的肽的能 力 ，或者作为报告子、靶向肽和融合肽，该靶向肽在待治疗组织中靶向癌细胞使得原始细胞与靶标细胞的结合是特异性的并得到强化，该融合肽促进原始细胞和封装的DNA的内体逃逸。本发明原始细胞可用于治疗癌症，特别是使用新的结合肽（c-MET肽）治疗包括 肝细胞 （肝脏）癌症，该结合肽选择性结合到肝细胞组织上，或者在癌症诊断，包括 癌症治疗 和药物发现中发挥作用。，下面是用于靶向给药的多孔纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一细胞靶向性多孔原始细胞，包含：
具有支撑脂双层的纳米多孔二氧化硅或金属氧化物核心和选自由以下物质组成的组的至少一种进一步的组分：
一细胞靶向种类物质；
一融合肽，其促进原始细胞、封装的DNA和其他货物的内体逃逸，该其他货物包括至少一种货物组分，该货物组分选自双链线性DNA；
质粒DNA；
一药物；
一显像剂；
小干扰RNA、小发夹RNA、微RNA，或它们的混合物，
其中所述货物组分之一可选地进一步与一核定位序列缀合。
2.根据权利要求1所述的原始细胞，其中所述二氧化硅核心是球形的，直径为约10nm至约250nm。
3.根据权利要求2所述的原始细胞，其中所述二氧化硅核心平均直径为约150nm。
4.根据权利要求2或3所述的原始细胞，其中所述二氧化硅核心的尺寸分布是单分散或多分散的。
5.根据权利要求2或3所述的原始细胞，其中所述二氧化硅核心是单分散的。
6.根据权利要求2或3所述的原始细胞，其中所述二氧化硅核心是多分散的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的原始细胞，其中所述脂双层由选自由以下物
质组成的组的脂质组成：1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DOPC）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DPPC）、1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DSPC）、
1,2-二油酰-sn-丙三基-3-[磷酸-L-丝氨酸]（DOPS）、1,2-二油酰-3-三甲胺-丙烷（18:1DOTAP）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-二氧膦基-（1'-rac-甘油）（DOPG）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（18:1PEG-2000PE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（16:0PEG-2000PE）、1-油酰-2-[12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰]-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（18:1-12:0NBD PC）、1-棕榈酰-2-{12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰}-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（16:0-12:0NBD PC）、胆固醇及它们的混合物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的原始细胞，其中所述脂双层包括结合有DOPE的DOPC。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的原始细胞，其中所述脂双层包括DOTAP、DOPG、DOPC或它们的混合物。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的原始细胞，其中所述脂双层包括DOPG和DOPC。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的原始细胞，其中所述脂双层进一步包括胆固醇。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的原始细胞，其中所述脂双层包括结合了约
5wt%DOPE的DOPC、约30wt%胆固醇和约10wt%PEG-2000PE（18:1）。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的原始细胞，其中所述脂双层包括约5%重量的
DOPE、约5%重量的PEG、约30%重量的胆固醇、约60%重量的DOPC和/或DPPC。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述PEG缀合到所述DOPE。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的原始细胞，其中所述靶向种类物质是一靶向肽。
16.根据权利要求15所述的原始细胞，其中所述靶向肽是一SP94肽。
17.根据权利要求16所述的原始细胞，其中所述靶向肽是SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
18.根据权利要求15所述的原始细胞，其中所述靶向肽是一根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的MET结合肽。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的原始细胞，其中所述融合蛋白是H5WYG肽（SEQ ID NO:13）或一8mer多聚精氨酸（SEQ ID NO:14）。
20.根据权利要求19所述的原始细胞，其中所述融合肽为SEQ ID NO:13。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的原始细胞，包含质粒DNA，其中所述质粒DNA可选地进行修饰以表达核定位序列。
22.根据权利要求21所述的原始细胞，其中所述质粒DNA是超螺旋的，或者经包装的质粒DNA。
23.根据权利要求22所述的原始细胞，其中所述DNA是超螺旋的，并且是经包装的质粒DNA。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的原始细胞，其中所述质粒DNA经修饰以表达核定位序列。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的原始细胞，其中所述DNA是组蛋白包装的超螺旋质粒DNA，包含人组蛋白混合物。
26.根据权利要求25所述的原始细胞，其中所述组蛋白混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4组成。
27.根据权利要求25所述的原始细胞，其中所述组蛋白混合物是H1、H2A、H2B、H3和H4，其重量比为1:2:2:2:2。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的原始细胞，其中所述质粒DNA能够表达多肽毒素、小发夹RNA（shRNA）或小干扰RNA（siRNA）。
29.根据权利要求28所述的原始细胞，其中所述多肽毒素选自由以下物质组成的组：
蓖麻毒素A链或者白喉毒素A链。
30.根据权利要求1或28所述的原始细胞，其中所述shRNA或所述siRNA诱导细胞凋
亡。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的原始细胞，其中所述DNA能够表达报告蛋白。
32.根据权利要求31所述的原始细胞，其中所述报告蛋白是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的原始细胞，其中所述核定位序列是根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的肽。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的原始细胞，其中所述核定位序列是根据SEQ ID NO:9的肽。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的原始细胞，进一步包含作为药物的抗癌剂。
36.根据权利要求35所述的原始细胞，其中所述抗癌剂是依维莫司、曲贝替定、紫杉醇蛋白质结合颗粒注射悬液（abraxane）、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244（ARRY-142886）、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD1152、enzastaurin、凡德他尼（vandetanib）、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗-HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检测点-1或
2抑制剂、粘附斑激酶抑制剂、Map激酶激酶（mek）抑制剂、VEGF捕获抗体、培美曲塞、埃罗替尼、达沙替尼（dasatanib）、尼罗替尼、德卡坦尼（decatanib）、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、洛拉曲克（nolatrexed）、azd2171、巴他布林（batabulin）、奥法木单抗、扎木单抗、伊朵堤卡林（edotecarin）、粉防己碱、鲁吡替康（rubitecan）、替米利芬、奥利默森（oblimersen）、ticilimumab、易普利姆玛（Ipilimumab）、棉酚、Bio111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO140、CC8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、维特斯潘（vitespan）、Rta744、Sdx102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr311、罗咪酯肽、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他（vorinostat）、依托泊苷、吉西他滨、阿霉素、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、塞利西利（seliciclib）；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-（2-氨基-4,7-二氢-4-氧-1H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基）乙基]苯甲酰]-、二钠盐、七水合物、喜树碱、PEG标记的伊立替康、三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES（乙烯雌酚）、雌甾二醇、雌激素、雌激素缀合物、贝伐单抗、IMC-1C11、CHIR-258、3-[5-（甲基磺酰基哌啶基甲基）-吲哚-喹诺酮、瓦他拉尼（vatalanib）、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser（But）6,Azgly10]（pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser（But）-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的醋酸盐醋酸[C59H84N18Oi4-（C2H4O2）x，其中，x=1～2.4]、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特（nilutamide）、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、埃罗替尼、拉帕替尼、卡拉替尼（canertinib）、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、Ionafarnib、BMS-214662、替吡法尼；阿米福汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酸酶、卡介苗（BCG）、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素D、道诺霉素、乙烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫（gleevac）、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、
6-巯基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特（nilutamide）、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠（porfimer）、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、维甲酸、长春地辛、13-顺式视黄酸、苯丙氨酸氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷（5-deooxyuridine）、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春花碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥单抗、白介素融合毒素（denileukin diftitox）、吉非替尼、硼替佐米（bortezimib）、紫杉醇、不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇、多西他奇、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬（pipendoxifene）、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、吲哚昔酚（idoxifene）、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-O-（2-羟乙基）-雷帕霉素、西罗莫司（temsirolimus）、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀（darbepoetin）、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸、强的松、西妥昔单抗、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酸酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替伊莫单抗（ibritgumomab tiuxetan）、雄激素、地西他滨、六甲嘧胺、蓓萨罗丁、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、柔红霉素脂质体、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基强的松龙、普鲁氯嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、ss非格司亭（pegfilgrastim）、红细胞生成素、依泊汀α、达贝泊汀α、或它们的混合物。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的原始细胞，其中所述药物包括一抗病毒剂。
38.根据权利要求37所述的原始细胞，其中所述抗病毒剂是一抗HIV剂、抗HBV剂或抗HCV剂。
39.一种原始细胞，包含具有支撑脂双层纳米多孔二氧化硅核心和根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的MET结合肽。
40.根据权利要求31所述的原始细胞，其中所述MET结合肽是根据SEQ ID NO:1的肽。
41.根据权利要求39或40所述的原始细胞，其中所述MET结合肽缀合合到所述脂双
层。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的原始细胞，其中所述原始细胞进一步包含至少一种选自由以下物质组成的组的组分：一促进原始细胞和封装的DNA的内体逃逸的融合肽；一质粒DNA；双链线性DNA，一药物；一显像剂，小干扰RNA，小发夹RNA和微RNA，其中所述质粒DNA、所述药物、所述显像剂和/或所述RNA进一步与核定位序列缀合。
43.根据权利要求42所述的原始细胞，其中所述药物包括至少一种抗癌剂。
44.根据权利要求43所述的原始细胞，其中所述抗癌剂选自由由以下物质组成的
组：依维莫司、曲贝替定、紫杉醇蛋白质结合颗粒注射悬液（abraxane）、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244（ARRY-142886）、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD1152、enzastaurin、凡德他尼（vandetanib）、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗-HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检测点-1或2抑制剂、粘附斑激酶抑制剂、Map激酶激酶（mek）抑制剂、VEGF捕获抗体、培美曲塞、埃罗替尼、达沙替尼（dasatanib）、尼罗替尼、德卡坦尼（decatanib）、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、洛拉曲克（nolatrexed）、azd2171、巴他布林（batabulin）、奥法木单抗、扎木单抗、伊朵堤卡林（edotecarin）、粉防己碱、鲁吡替康（rubitecan）、替米利芬、奥利默森（oblimersen）、ticilimumab、易普利姆玛（Ipilimumab）、棉酚、Bio111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO140、CC8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、维特斯潘（vitespan）、Rta744、Sdx102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr311、罗咪酯肽、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他（vorinostat）、依托泊苷、吉西他滨、阿霉素、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、塞利西利（seliciclib）；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-（2-氨基-4,7-二氢-4-氧-1H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基）乙基]苯甲酰]-、二钠盐、七水合物、喜树碱、PEG标记的伊立替康、三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES（乙烯雌酚）、雌甾二醇、雌激素、雌激素缀合物、贝伐单抗、IMC-1C11、CHIR-258、3-[5-（甲基磺酰基哌啶基甲基）-吲哚-喹诺酮、瓦他拉尼（vatalanib）、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser（But）6,Azgly10]（pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser（But）-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 醋 酸 盐 醋 酸[C59H84N18Oi4-（C2H4O2）x，其中，x=1到2.4]、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特（nilutamide）、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、埃罗替尼、拉帕替尼、卡拉替尼（canertinib）、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、Ionafarnib、BMS-214662、替吡法尼；阿米福汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酸酶、卡介苗（BCG）、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素D、道诺霉素、乙烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫（gleevac）、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特（nilutamide）、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠（porfimer）、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、维甲酸、长春地辛、13-顺式视黄酸、苯丙氨酸氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷（5-deooxyuridine）、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春花碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥单抗、白介素融合毒素（denileukin diftitox）、吉非替尼、硼替佐米（bortezimib）、紫杉醇、不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇、多西他奇、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬（pipendoxifene）、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、吲哚昔酚（idoxifene）、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托 泊 替 康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷 帕 霉 素、
40-O-（2-羟乙基）-雷帕霉素、西罗莫司（temsirolimus）、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀（darbepoetin）、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸、强的松、西妥昔单抗、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酸酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替伊莫单抗（ibritgumomab tiuxetan）、雄激素、地西他滨、六甲嘧胺、蓓萨罗丁、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、柔红霉素脂质体、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基强的松龙、普鲁氯嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、ss非格司亭（pegfilgrastim）、红细胞生成素、依泊汀α、达贝泊汀α和它们的混合物。
45.根据权利要求39-45中任一项所述的原始细胞，其中所述药物包括至少一种抗病毒剂。
46.根据权利要求45所述的原始细胞，其中所述抗病毒剂是一抗HIV剂、抗HBV剂、抗HCV剂或它们的混合物。
47.根据权利要求39-46中任一项所述的原始细胞，其中所述DNA能够表达至少一种报告分子。
48.根据权利要求39-47中任一项所述的原始细胞，包含质粒DNA，其中所述质粒DNA可选地进行修饰以表达核定位序列。
49.根据权利要求48所述的原始细胞，其中所述DNA是超螺旋的，或者经包装的质粒DNA。
50.根据权利要求49所述的原始细胞，其中所述DNA是超螺旋的并经包装的质粒DNA。
51.根据权利要求48-51中任一项所述的原始细胞，其中所述质粒DNA经修饰以表达核定位序列。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的原始细胞，其中所述DNA是组蛋白包装的超螺旋质粒DNA，包含人组蛋白混合物。
53.根据权利要求52所述的原始细胞，其中所述组蛋白混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4组成。
54.根据权利要求53所述的原始细胞，其中所述组蛋白混合物是H1、H2A、H2B、H3和H4，其重量比为1:2:2:2:2。
55.根据权利要求48-54中任一项所述的原始细胞，其中所述质粒DNA能够表达多肽毒素、小发夹RNA（shRNA）或小干扰RNA（siRNA）。
56.根据权利要求55所述的原始细胞，其中所述多肽毒素选自由以下物质组成的组：
蓖麻毒素A链或者白喉毒素A链。
57.根据权利要求55所述的原始细胞，其中所述shRNA或所述siRNA诱导细胞凋亡。
58.根据权利要求48-57中任一项所述的原始细胞，其中所述质粒DNA能够表达报告蛋白。
59.根据权利要求58所述的原始细胞，其中所述报告蛋白是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
60.根据权利要求39-59中任一项所述的原始细胞，其中所述核定位序列是根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的肽。
61.根据权利要求60所述的原始细胞，其中所述核定位序列是根据SEQ ID NO:9的肽。
62.一种药物组合物，包含根据权利要求1-61中任一项所述的原始细胞的群，结合药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂，该原始细胞的群的量能有效用于产生治疗效果。
63.根据权利要求62所述的组合物，进一步包含一不作为货物放置在原始细胞内的药物。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述药物是一抗癌剂或抗病毒剂。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述抗病毒剂是一抗HIV剂、抗HBV剂、抗HCV剂或它们的混合物。
66.根据权利要求62-65中任一项所述的组合物，所述组合物制成胃肠外剂量形式。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述剂量形式是皮内的、肌肉的、骨内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的或鞘内的剂量形式。
68.根据权利要求62-65中任一项所述的组合物，所述组合物是局部的或经皮给药的剂量形式。
69.一根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的MET结合肽。
70.一根据权利要求69所述的根据SEQ ID NO:1的MET结合肽。
71.一包含根据权利要求69或70所述的MET结合肽的药物组合物。
72.一包含一原始细胞群的药物组合物，所述原始细胞包含靶向肽使得原始细胞与抗癌剂和抗HBV剂、抗HCV剂或它们的混合物，选择性结合到肝癌细胞。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述靶向肽选自由以下物质组成的组：S94肽、MET结合肽或它们的混合物。
74.根据权利要求72所述的组合物，其中所述的抗癌剂是多吉美（索拉非尼）、舒尼替尼、贝伐单抗、特罗凯（埃罗替尼）、泰克博（拉帕替尼）或它们的混合物。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的组合物，其中所述抗HBV剂是Hepsera（阿德福韦酯）、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、恩曲他滨、克拉夫定、valtoricitabine、氨多索韦、普拉德福韦、racivir、BAM205、硝唑尼特、UT231-B、Bay41-4109、EHT899、日达仙（zadaxin）（胸腺素α-1）或它们的混合物。
76.根据权利要求72-75中任一项所述的组合物，其中所述抗HCV剂是波西普韦
（boceprevir）、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100、NM283、VX-950（特拉普韦（telaprevir））、SCH50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191（R7227）、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS-9190、GS9256、GS9451、GS5885、GS6620、GS9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040（MVA-HCV）、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GNI-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI-201335、BI207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PSI-938、PSI-7977、PSI-7851、SCY-635、病毒唑、聚乙二醇干扰素、PHX1766、SP-30或它们的混合物。
77.一种治疗癌症的方法，包括给需要的患者施用有效量的包含根据权利要求1-61中任一项所述的原始细胞的群的组合物，所述原始细胞群经过调整以将抗癌剂运输到所述患者的癌细胞。
78.一种治疗肝细胞癌的方法，包括给所述病人施用有效量的根据权利要求72-76中任一项所述的组合物。
79.一种治疗癌症的方法，包括给需要的患者施用有效量的包含根据权利要求1-61中任一项所述的原始细胞的群，其中所述DNA质粒是超螺旋的并经过调整以表达抗癌多肽和/或RNA，可选地与有效量的另外的抗癌剂结合，所述另外的抗癌剂制备成所述原始细胞内的货物。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述抗癌多肽是蓖麻毒素A链或者白喉毒素A链。
81.根据权利要求79或80所述的方法，其中所述RNA是诱导癌细胞凋亡的shRNA或
siRNA。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的方法，其中所述siRNA选自由s565、s7824或s10234组成的组。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述shRNA是细胞周期蛋白B1特异性shRNA，其诱导细胞死亡。
84.根据权利要求79-84中任一项所述的方法，其中所述抗癌剂选自由由以下物质
组成的组：依维莫司、曲贝替定、紫杉醇蛋白质结合颗粒注射悬液（abraxane）、TLK286、AV-299、DN-101、帕 唑帕 尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244（ARRY-142886）、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD1152、enzastaurin、凡德他尼（vandetanib）、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗-HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检测点-1或2抑制剂、粘附斑激酶抑制剂、Map激酶激酶（mek）抑制剂、VEGF捕获抗体、培美曲塞、埃罗替尼、达沙替尼（dasatanib）、尼罗替尼、德卡坦尼（decatanib）、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、洛拉曲克（nolatrexed）、azd2171、巴他布林（batabulin）、奥法木单抗、扎木单抗、伊朵堤卡林（edotecarin）、粉防己碱、鲁吡替康（rubitecan）、替米利芬、奥利默森（oblimersen）、ticilimumab、易普利姆玛（Ipilimumab）、棉酚、Bio111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO140、CC8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、维特斯潘（vitespan）、Rta744、Sdx102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr311、罗咪酯肽、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他（vorinostat）、依托泊苷、吉西他滨、阿霉素、阿霉素脂质体、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、塞利西利（seliciclib）；
PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-（2-氨基-4,7-二氢-4-氧-1H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基）乙基]苯甲酰]-、二钠盐、七水合物、喜树碱、PEG标记的伊立替康、三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES（乙烯雌酚）、雌甾二醇、雌激素、雌激素缀合物、贝伐单抗、IMC-1C11、CHIR-258、3-[5-（甲基磺酰基哌啶基甲基）-吲哚-喹诺酮、瓦他拉尼（batalanib）、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser（But）
6,Azgly10]（pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser（But）-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2的醋酸盐醋酸[C59H84N18Oi4-（C2H4O2）x，其中，x=1到2.4]、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特（nilutamide）、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、埃罗替尼、拉帕替尼、卡拉替尼（canertinib）、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、Ionafarnib、BMS-214662、替吡法尼；阿米福汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酸酶、卡介苗（BCG）、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素D、道诺霉素、乙烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫（gleevac）、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特（nilutamide）、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠（porfimer）、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、维甲酸、长春地辛、13-顺式视黄酸、苯丙氨酸氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷（5-deooxyuridine）、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春花碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥单抗、白介素融合毒素（denileukin diftitox）、吉非替尼、硼替佐米（bortezimib）、紫杉醇、不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇、多西他奇、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬（pipendoxifene）、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、吲哚昔酚（idoxifene）、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托 泊 替 康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷 帕 霉 素、
40-O-（2-羟乙基）-雷帕霉素、西罗莫司（temsirolimus）、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀（darbepoetin）、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸、强的松、西妥昔单抗、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酸酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替伊莫单抗（ibritgumomab tiuxetan）、雄激素、地西他滨、六甲嘧胺、蓓萨罗丁、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、柔红霉素脂质体、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基强的松龙、普鲁氯嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、ss非格司亭（pegfilgrastim）、红细胞生成素、依泊汀α、达贝泊汀α和它们的混合物。
85.根据权利要求79-84中任一项所述的方法，其中所述原始细胞或所述原始细胞外的所述组合物进一步包括一抗病毒剂。
86.根据权利要求85所述的原始细胞，其中所述抗病毒剂是一抗HBV剂或抗HCV剂。
87.一种治疗患者体内癌症的方法，包括给需要的病人施用有效量的根据权利要求
62-76中任一项所述的组合物。
88.一种根据权利要求87所述的方法，其中，所述癌症是鳞状细胞癌、腺癌、肝细胞癌、肾细胞癌，以及膀胱、骨、肠、乳房、宫颈、直肠（结直肠）、食道、头、肾脏、肝（肝细胞）、肺、鼻咽、颈、卵巢、睾丸、胰腺、前列腺和胃癌；白血病、伯基特淋巴瘤、非霍奇（Non Hodgkin’s）金淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤；恶性黑色素瘤；骨髓增殖性疾病；尤因氏肉瘤、血管内皮瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、肌肉瘤、外周神经上皮瘤、滑膜肉瘤；神经胶质瘤、星型细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、松果体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、小细胞和非小细胞癌混合、胸膜间皮瘤、胸膜间皮瘤、睾丸癌、甲状腺癌和星形细胞瘤。
89.一种诊断具有患癌风险的患者体内癌症的方法，所述方法包括给所述患者施用一药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-61中任一项所述的原始细胞的群，所述原始细胞包含靶向肽，该靶向肽经过调整以选择性结合到癌细胞并将原始细胞运输到所述细胞，其中所述原始细胞包含一质粒DNA，该质粒DNA经过调整以表达报告分子，并可选地包含一另外的报告分子，因此，原始细胞结合到所述患者体内的癌细胞会将所述报告分子释放到癌细胞，如果存在，并且报告分子将引发一信号，其可与标准值比较，以确定患者是否患癌，以及癌症的程度和/或恶性肿瘤的大小，如果存在。
90.一种监测患者体内癌症治疗的方法，包括给所述患者施用一根据权利要求1-61中任一项所述的原始细胞的群，所述原始细胞的群包含靶向肽，该靶向肽经过调整以选择性结合到癌细胞并将原始细胞运输到所述细胞，其中所述原始细胞包含一质粒DNA，该质粒DNA经过调整以表达报告分子，并可选地包含一另外的报告分子，因此，原始细胞结合到所述患者体内的癌细胞会将所述报告分子释放到癌细胞内，并且报告分子将引发一信号，其可在治疗开始时和治疗过程中的不同时期与标准值比较，以确定患者是否对治疗有响应，以及如果有响应，对治疗的响应程度。
用于靶向给药的多孔纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）及其
使用方法
[0001] 相关申请及政府资助
[0002] 本发明要求了下列优先权：2011年4月28日提交的美国临时申请，序列号为US61/479847，名 称 为“The Selective Transfection of Hepatocellular Carcinoma Using Peptide-Targeted Silica Nanoparticle-Supported Lipid Bilayers（Protocells）（利用肽靶向二氧化硅纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）选择性转染肝癌细胞）”，该申请的整体内容通过引用并入本文中。
[0003] 本发明受到以下政府资助：资助号为PHS2PN2EY016570B国家卫生研究所资助；国家癌症研究所的1U01CA151792-01资助；资助号为FA9550-07-1-0054/9550-10-1-0054的空军科学研究办公室资助；国立环境卫生科学研究所的1U19ES019528-01资助；国家科学基金会的NSF:EF-0820117和DGE-0504276资助。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
[0004] 本发明具体是指用于患者体内的细胞特异性靶向（尤其包括肝癌细胞和其他癌症细胞）的原始细胞，包括1）一纳米多孔二氧化硅或金属氧化物核心；2）一支撑的脂双层；3）至少一种促进癌细胞死亡的试剂（例如传统的小分子、大分子货物（如siRNA、shRNA或其他微RNA，或者蛋白毒素如蓖麻毒素A链或者白喉毒素A链）和/或DNA，包括双链或线性DNA、质粒DNA，其可以是超螺旋和/或例如与组蛋白一起包装，并置于纳米多孔二氧化硅核心内（优选是超螺旋的，以更有效地将DNA包装进原始细胞中），该DNA可选地用核定位序列修饰，以便将原始细胞定位在癌细胞核内并促进表达多种肽的能力，该肽为癌细胞治疗（细胞凋亡/细胞死亡）中包括的肽，或者作为报告子、靶向肽和融合肽，靶向肽在组织中靶向待治疗癌细胞使得原始细胞与靶细胞的结合是特异性的并得到强化，，融合肽促进原始细胞和封装货物包括DNA的内体逃逸。本发明原始细胞可用于治疗癌症，特别是使用新的结合肽（（c-MET肽）治疗包括肝细胞（肝脏）癌症，该结合肽选择性结合到肝细胞组织上，或者用于进行癌症诊断，包括癌症治疗和药物发现。
背景技术
[0005] 封装在纳米载体中的药物的靶向给药可潜在地改进传统的“自由”药物表现出的许多问题，包括较差的溶解性、有限的稳定性、快速清除，以及尤其是缺乏选择性，缺乏选择性会造成对正常细胞的非特异性毒性并阻碍完全消除病态细胞必需的剂量增加。被动的靶向方案靠增强肿瘤血管的通透性并降低肿瘤淋巴管的排放效力，从而将纳米载体累积在肿瘤位点（所谓的增强通透性和滞留效应，或者称为EPR效应），该方案克服了许多问题，但是缺乏诱导纳米载体内化（internalization）所需要的细胞特异性相互作用，降低了治疗效力并可导致药物驱逐和诱导产生多种耐药性。
[0006] 纳米医药面临的一个挑战是设计纳米结构和材料，该纳米结构和材料能有效封装高浓度的货物（例如药物）穿过细胞膜，并在一指定时间段内，在目标位点可控地释放药物。最近，无机纳米颗粒已成为纳米医药领域新一代的药物或治疗运载工具。更近的，人们开发了使用香豆素、偶氮苯、轮烷、聚合物或纳米颗粒的设门法（gating method），用于将货物密封到颗粒内，并根据光学或电化学刺激触发其释放。
[0007] 虽然脂质体由于其低免疫原性和低毒性而广泛用于药物运载中，但是其在几个方面仍需改进。第一，只能在脂质体已经制备的情况下才能实现货物的装载。因此，货物的浓度和类别可能受到限制。第二，脂质体的稳定性相对较低。脂质体的脂双层往往容易老化和融合，这改变了它们的尺寸和尺寸分布。第三，在脂质体破裂时，脂质体内的货物瞬间释放，这使得释放难以控制。
[0008] 通过将脂质体和纳米多孔二氧化硅颗粒融合而形成的多孔纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）是一种新型纳米载体，其解决了与癌症治疗和诊断的靶向运输有关的多个难题。像脂质体那样，原始细胞是生物相容的、可生物降解的以及非免疫原性的，但是与相似尺寸的脂质体运输剂相比，原始细胞的纳米多孔二氧化硅核心提供了一大幅增强的货物容量和延长的双层稳定性。而且，可调节核心的多孔性和表面化学性从而促进多种治疗剂，如药物、核酸和蛋白毒素的封装。货物的释放速率可以通过核心的孔尺寸、化学成分和整体二氧化硅浓缩（condensation）程度进行控制，使得原始细胞在需要爆裂（burst）释放或可控释放特征的应用中非常有用。最后，原始细胞的支撑脂双层（SLB）能够用配体进行各种修饰，从而促进选择性运输，以及用PEG修饰从而延长循环时间。
[0009] 还一直需要改进化疗剂的活性和加强癌症治疗。使用原始细胞结合选择性的方法进行定位、结合、加强侵入癌细胞以及使化疗剂沉积在它们的活性位点附近，这些是癌症治疗的重要方面。本发明是为了推动癌症治疗领域的发展和改善治疗剂的运输（这可影响治疗结果），通过增强癌症治疗剂的给药或者在诊断中，促进诊断癌症和监测癌症治疗的方法。
发明内容
[0010] 发明目标
[0011] 本发明的目标是提供改进的原始细胞技术、原始细胞本身、包含这些原始细胞的药物组合物以及使用本发明的原始细胞和药物组合物进行治疗和诊断（包括监测治疗）的方法。
[0012] 本发明实例的另外的目标涉及新的MET结合肽、它们在本发明其他实例的药物组合物和方法中的用途。
[0014] 发明简述
[0015] 本发明的具体实施方式指向用于细胞（尤其是肝癌细胞和其他癌细胞）特异性靶向的原始细胞。
[0016] 在某些方面，本发明指向一细胞靶向性多孔原始细胞，包含具有支撑脂双层的纳米多孔二氧化硅或金属氧化物核心和选自由以下物质组成的组的至少一种进一步的组分：
[0017] 细胞靶向种类物质（cell targeting species）；
[0018] 融合肽，其促进原始细胞、封装的DNA和其他货物的内体逃逸（endosomal escape），所述其他货物包含至少一种选自双链线性DNA或质粒DNA的货物组分；
[0019] 药物；
[0020] 显像剂；
[0021] 小干扰RNA、小发夹RNA、微RNA，或它们的混合物，
[0022] 其中所述货物组分之一可选进一步与核定位序列结合。
[0023] 在某些实例中，本发明实例的原始细胞包含一具有支撑脂双层的纳米多孔二氧化硅核心；一包含至少一种治疗剂的货物，其可选促进癌细胞死亡，例如传统的小分子、大分子货物（例如siRNA，如S565、S7824和/或s10234，尤其是shRNA，或者蛋白毒素，如蓖麻毒素A链或者白喉毒素A链）和/或一包装的质粒DNA（在某些实例中是组蛋白包装的），其置于纳米多孔二氧化硅核心内（相对于本文描述的其他形式，优选是超螺旋的，以便更有效地将DNA包装进原始细胞中作为一货物元件），该质粒DNA可选用核定位序列修饰，以便将质粒定位/放置在癌细胞核内并促进表达多种肽的能力，该肽为治疗（例如，癌细胞的细胞凋亡/细胞死亡）中包括的肽或者作为报告子（除了本文另有描述的其他类蛋白，还包括荧光绿蛋白、荧光红蛋白），用于诊断应用中。本发明的原始细胞包括一靶向肽和，靶向肽靶向用于治疗的细胞（如组织中待治疗的癌细胞），使得原始细胞与靶细胞的结合是特异性的并得到强化，融合肽促进原始细胞和封装的DNA的内体逃逸。本发明的原始细胞可用于治疗或诊断，更具体地说，用于治疗癌症和其他疾病，包括病毒性感染，特别是包括肝细胞（肝脏）癌症。在本发明的其他方面，原始细胞使用新的结合肽（MET结合肽，本文另有描述），其选择性结合到癌组织（除其他组织外，还包括肝癌、卵巢癌和宫颈癌组织）以进行治疗和/或诊断癌症，包括监测癌症治疗和药物发现。
[0024] 在一个方面，本发明实例的原始细胞包括一多孔纳米颗粒原始细胞，其通常包括一具有支撑脂双层的纳米多孔二氧化硅核心。在本发明的这方面，原始细胞包括一靶向肽，其通常是一MET报告子结合肽（本文另有描述），其通常在原始细胞的表面上与融合蛋白结合。原始细胞可装载有各种治疗和/或诊断货物，包括例如小分子（用于治疗和/或诊断的小分子，尤其包括抗癌和/或抗病毒试剂（用于治疗HBV和/或HCV）），还包括大分子，其包括多肽和核酸，核酸包括RNA（shRNA和siRNA）或质粒DNA，其可以是超螺旋的和组蛋白包装的并包括一核定位序列，大分子可以是用于治疗和/或诊断的大分子（包括报告分子例如荧光多肽，包括荧光绿蛋白/FGP、荧光红蛋白/FRP，还包括其他蛋白）。
[0025] 本发明的实例的其他方面指向药物组合物。本发明的药物组合物包括一群相同或不同的原始细胞，其通过结合药学上可接受载体、添加剂或赋形剂制备而成。原始细胞可单独制备或者与另外的生物活性剂（例如另外的抗癌剂或抗病毒剂）一起制备，这取决于待治疗的疾病和给药途径（本文另有描述）。这些组合物包含原始细胞，这些原始细胞经过修饰以用于特定目的（例如治疗目的，包括癌症治疗，或诊断，包括监测癌症的治疗）。药物组合物包含一用于特定目的和给药途径的有效的原始细胞群，其结合药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂。
[0026] 本发明的一实例也涉及使用本文所述的新的原始细胞的方法。因此，在替代性实例中，本发明涉及一种治疗疾病和/或病症的方法，包括向患者或有需要的对象施与一有效量的药物组合物（本文另有描述）。本发明的药物组合物在治疗多种疾病状态，尤其包括癌症，以及癌症的继发性疾病状态或状况，或导致癌症（尤其是HBV和/或HCV感染）的疾病状态或状况中尤其有用。
[0027] 在进一步的替代方面，本发明涉及诊断癌症的方法，该方法包括施用包含原始细胞群的药物组合物，该原始细胞经过修饰，以选择性运输诊断试剂或报告子显像剂到癌细胞以确诊患者的癌症。在这种方法中，通过包含至少一种靶向肽，本发明的原始细胞可被调节以适合靶向癌细胞，该靶向肽结合到表达多肽的癌细胞上或更普遍地结合到表面受体或细胞膜组分上，这些多肽或表面受体或细胞膜组分是靶向肽的目标；通过包含靶向到癌细胞的原始细胞的报告子组分（包括显像剂），这些原始细胞也可用来通过比较来自报告子的信号和标准值，确定癌组织是否存在以及其尺寸。标准值可例如从健康患者或已确诊患一疾病的患者群体中获知。一旦确诊，可使用本发明的药物组合物进行合适的治疗或实施替代疗法。
[0028] 在本发明的其他方面，本发明的组合物可用于监测特定疾病状态和/或状况的治疗的进展，包括使用本发明的组合物的治疗。在本发明的这方面，对接受治疗的患者或对象施与包含原始细胞群的组合物，这些原始细胞可特异性结合癌细胞并包含一报告子组分，使得可监测疾病状态的治疗进展。
[0029] 本发明的其他方面涉及五（5）种新的MET结合肽（本文另有描述），在本发明某些具体实例中，其可用作原始细胞上的靶向肽，或者用在药物组合物中用于在多种癌细胞内结合MET蛋白，癌细胞包括肝癌、宫颈癌和卵巢癌细胞，以及癌症组织中的其他诸多细胞。本发明的一个实例涉及五（5）种不同的7-mer肽（7mer peptides），其显示了作为新结合肽的活性用于MET受体（又称为肝细胞生长因子受体，由c-MET基因表达）。这五（5）种7-mer肽如下所示：
[0030]
[0031] 这些肽中的每一种均可单独使用或与上述组中的其他MET结合肽或与其他一系列靶向肽（如本文描述的SP94肽）一起使用，这些靶向肽有助于将本发明实例的原始细胞结合到癌细胞上，包括肝癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞，以及其他许多癌细胞。这些结合肽也可作为MET结合肽单独用于药物化合物中，以治疗癌症或抑制肝细胞生长因子结合受体。这些肽可单独制备或与其他生物活性剂一起制备，以提供预期的效果。药物组合物包括有效量的上述五（5）种MET结合肽的至少一种，结合一药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂，可选地，结合一附加的生物活性剂，包括抗癌剂、抗病毒剂或其他生物活性剂。
附图说明
附图说明
[0034] 图2A显示了图2的a、b、c和e被CTAB、B58、P123和PS+B56模板化。A、B、C、D和E被CTAP+NaCl、3%wt P123、3%wt P123+聚（（丙二醇丙烯酸酯）、微乳液和CTAB（NH4）2S04模板化。
[0035] 图3显示了孔隙表面化学（即电荷和疏水性）、孔隙大小主要是通过有机硅烷和硅酸的共缩合（co-condensation）（根据一个实施例，通过共同自组装或后自组装衍 生） 控 制。 见 Lin,et al.,Chem.Mater.15,4247-562003；Liu,J.et al.,J.Phys.Chem.,104,8328-2339,2000；Fan,H.et al.,Nature,405,56-60,2000 和 Lu,Y.et al.,J.Am.Chem.Soc.,122,5258-5261,2000。
[0036] 图4描绘了用组蛋白包装CB1。（A）是描绘用于使CB1质粒（pCB1）超螺旋、用组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4包装超螺旋的pCB1以及用核定位序列（NLS）对获得的pCB1-组蛋白复合物进行修饰的方法的原理图，该核定位序列能够促进物质移动通过核孔。（B）和（D）是CB1质粒（B）和组蛋白包装的pCB1（D）的原子力显微镜（AFM）图像。比例尺=100nm。（C）和（E）是分别与（B）和（D）中的红线相对应的高度的轮廓图。
[0037] 图5描绘了合成装载有组蛋白包装的pCB1的MC40靶向的介孔二氧化硅纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）的合成。（A）为原理图，描绘了用于生成装载有DNA的肽靶向的原始细胞的方法。通过简单地将颗粒浸入pCB1-组蛋白复合物溶液中，将组蛋白包装的pCB1装载进介孔二氧化硅纳米颗粒内，该二氧化硅纳米颗粒形成原始细胞的核心。然后，将PEG化脂质体融合到装载有DNA的内核中，形成一支撑脂双层（SLB），其进一步用结合到HCC的靶向肽（MC40）和促进内化的原始细胞的内体逃逸（endosomal escape）的内体裂解肽（endosomolytic peptide）（H5WYG）修饰。使用巯基-氨基（sulfhydryl-to-amine）交联剂（间隔臂=9.5nm）将C末端半胱氨酸残基修饰的肽缀合到SLB的DOPE基团上。（B）是用作原始细胞核心的介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜（TEM）图像。比例尺=200nm。插入=扫描电镜（SEM）图像，其证明，15-25nm的孔是表面可进入的（surface-accesible）。插入比例尺=50nm。（C）介孔二氧化硅纳米颗粒的尺寸分布图，通过动态光散射（DLS）确定。（D，左轴）是介孔二氧化硅纳米颗粒的累积孔体积图，通过使用Barrett-Joyner-Halenda（BJH）模型，用图S-4A中显示的氮吸附等温线的吸附分支来计算。（D，右轴）是pCB1-组蛋白复合物的尺寸分布，由DLS确定。
[0038] 图6表明，根据一个实例，介孔二氧化硅纳米颗粒具有用于组蛋白包装的pCB1的高容量，并且获得的原始细胞只有在模拟内体环境的条件下才会释放封装的DNA。（A）能够被封装进未修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒（ζ=-38.5mV）或者用APTES（一种包含氨基（amine-containing）的硅烷）修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒（ζ=+11.5mV）的pCB1或者6
组蛋白包装的pCB1（“复合物”）的浓度。（B）在37℃下，浓度为1×10 个/mL的细胞用
9
1×10MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞培养24h后，对ZsGreen（一种由pCB1编码的
绿色荧光蛋白）呈阳性的Hep3B的百分比。X轴详细说明原始细胞核心是否用APTES修饰和pCB1是否用组蛋白进行预包装。在（A）和（B）中，用DOTAP和DOPE（1:1w/w）混合物包装的pCB1作为对照。（C）和（D）在暴露于模拟体液（C）或pH为5的缓冲液（D）中时，组蛋白包装的pCB1从未修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒和相应的原始细胞进行的时间依赖性释放。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000构成，在（B）中，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
组蛋白包装的pCB1（“复合物”）的浓度。（B）在37℃下，浓度为1×10 个/mL的细胞用
9
1×10MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞培养24h后，对ZsGreen（一种由pCB1编码的
绿色荧光蛋白）呈阳性的Hep3B的百分比。X轴详细说明原始细胞核心是否用APTES修饰和pCB1是否用组蛋白进行预包装。在（A）和（B）中，用DOTAP和DOPE（1:1w/w）混合物包装的pCB1作为对照。（C）和（D）在暴露于模拟体液（C）或pH为5的缓冲液（D）中时，组蛋白包装的pCB1从未修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒和相应的原始细胞进行的时间依赖性释放。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000构成，在（B）中，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0039] 图7提供了一原理图，描绘了MC40靶向的原始细胞运输组蛋白包装的pCB1到HCC的过程。[1]由于靶向肽募集（recruitment）至Met，MC40靶向的原始细胞以高亲和性结合到Hep3B细胞，该Met由各种HCC细胞系过量表达。流动的DPOC SLB促进了肽的移动，因此使原始细胞能够用低密度MC40修饰，以保留对Hep3B的高特异亲和性（见图8A）。[2]MC40靶向的原始细胞通过受体介导的内吞作用，通过Hep3B内化。（参见图8B和图15A）。[3]内体条件使SLB不稳定[插入《Nature Materials（自然材料）》文献]并导致H5WYG内体裂解肽质子化，两者都使组蛋白包装的pCB1分散在Hep3B细胞的胞质溶胶中（见图16B）。
[4]pCB1-组蛋白复合物用核定位序列（NLS）修饰时，在24小时内会聚集在Hep3B细胞核内（见图16C），这使得能够对分裂（dividing）和非分裂（non-dividing）的癌细胞进行有效转染（见图17）。
[4]pCB1-组蛋白复合物用核定位序列（NLS）修饰时，在24小时内会聚集在Hep3B细胞核内（见图16C），这使得能够对分裂（dividing）和非分裂（non-dividing）的癌细胞进行有效转染（见图17）。
[0040] 图8显示了，MC40靶向的原始细胞以高亲和性结合到HCC并通过Hep3B但不通过正常的肝细胞内化。（A）在暴露于Hep3B或肝细胞中时，MC40靶向的原始细胞的表观离解常数（Kd）；Kd值与特异亲和性成负相关，并从饱和结合曲线中确定（见图S-11）。误差条代表95%置信区间（（1.96σ）（n=5）。（B）和（C）是Hep3B（B）和肝细胞（C）的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B和肝细胞在37℃下，在超过1000倍的MC40靶向的原始细胞中暴露1小时。Met用Alexa 488标记的单克隆抗体（绿色）染色，原始细胞核心用Alexa 594
（红色）进行标记，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。比例尺=20μm。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）组成，并用0.015wt%（A-C）或0.500wt%（A）的MC40靶向肽修饰。
（红色）进行标记，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。比例尺=20μm。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）组成，并用0.015wt%（A-C）或0.500wt%（A）的MC40靶向肽修饰。
[0041] 图9显示了MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞在皮摩尔浓度下诱导HCC凋亡，但对正常肝细胞活力影响最小。Hep3B在37℃下持续暴露在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中，细胞周期蛋白（cyclin）B1mRNA的表达和细胞周期蛋白B1蛋白随剂量（A）和时间（B）依赖性下降。在（A）中，使细胞在各种pCB1浓度下暴露48小时，在（B）中，使细胞在5pM的pCB1中暴露不同时间。肝细胞中细胞周期蛋白B1蛋白的表达和Hep3B中的ZsGreen的表达作为对照。使用实时PCR和免疫荧光法分别确定细胞周期蛋白B1mRNA和蛋白质的浓度。（C）在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞（[pCB1]=5pM）中持续暴露不同时间，在G2/M期被捕获的Hep3B的百分率。将G2/M期肝细胞和S期Hep3B的百分率用作对照。在细胞周期分析之前将细胞用Hoechst33342染色。（D）在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞（[pCB1]=5pM）中持续暴露不同时间，凋亡的Hep3B的百分率。将对凋亡标记呈阳性的肝细胞的百分率作为对照。对Alexa 647标记的膜联蛋
白（annexin）V呈阳性的细胞被认为是处于凋亡早期，而膜联蛋白V和碘化丙啶都呈阳性则被认为是处于凋亡晚期。凋亡细胞的总数通过将单阳性和双阳性细胞的数目相加确定。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
白（annexin）V呈阳性的细胞被认为是处于凋亡早期，而膜联蛋白V和碘化丙啶都呈阳性则被认为是处于凋亡晚期。凋亡细胞的总数通过将单阳性和双阳性细胞的数目相加确定。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0042] 图10显示了MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞诱导HCC选择性凋亡的效率比相应的脂质体复合物高2500倍。（A）DOPC原始细胞、用10wt%PEG-2000（18:1）修饰的DOPC原始细胞、由DOTAP和DOPE（1:1w/w）的混合物和pCB1构成的脂质体复合物、用
10wt%PEG-2000修饰的DOTAP/DOPE脂质体复合物的Zeta电位值。所有Zeta电位测量在
0.5X PBS（pH7.4）中进行。（B，左轴）在37℃下，在由MC40靶向的原始细胞或脂质体复合物运输的5pM的pCB1中持续暴露48h后，凋亡的Hep3B和肝细胞的百分率。（B，右轴）在
6
37℃下，在48小时内诱导1×10 个Hep3B细胞中的90%发生凋亡所需要的MC40靶向的
装载有pCB1的原始细胞或脂质体复合物的数量。在（B）中，细胞用Alexa 647标
记的膜联蛋白V和碘化丙啶染色；单或双阳性细胞被认为是凋亡的。原始细胞SLB由含
5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（当有指出时）构成，该原始细胞SLB用
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。DOTAP/DOPE脂质体复合物用10wt%PEG2000（当有指出时）、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
10wt%PEG-2000修饰的DOTAP/DOPE脂质体复合物的Zeta电位值。所有Zeta电位测量在
0.5X PBS（pH7.4）中进行。（B，左轴）在37℃下，在由MC40靶向的原始细胞或脂质体复合物运输的5pM的pCB1中持续暴露48h后，凋亡的Hep3B和肝细胞的百分率。（B，右轴）在
6
37℃下，在48小时内诱导1×10 个Hep3B细胞中的90%发生凋亡所需要的MC40靶向的
装载有pCB1的原始细胞或脂质体复合物的数量。在（B）中，细胞用Alexa 647标
记的膜联蛋白V和碘化丙啶染色；单或双阳性细胞被认为是凋亡的。原始细胞SLB由含
5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（当有指出时）构成，该原始细胞SLB用
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。DOTAP/DOPE脂质体复合物用10wt%PEG2000（当有指出时）、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0043] 图11显示了，MC40靶向的原始细胞选择性运输高浓度的紫杉醇（taxol）、Bcl-2特异性siRNA和pCB1到HCC，而不影响肝细胞活力。（A）能够使Bcl-2表达沉默的紫杉醇、12
siRNA的浓度，以及能够封装进10 个原始细胞、脂质体或脂质体复合物中的CB1质粒的浓度。红色条表示当紫杉醇和pCB1两者都装载进原始细胞时，它们的浓度如何变化。蓝色条表示紫杉醇、siRNA和pCB1都装载进原始细胞时，或者siRNA和pCB1装载进脂质体复合物中时，它们的浓度如何变化。（B）共聚焦荧光显微镜图，显示了Oregon 488标记的紫杉醇（绿色）、Alexa 594标记的siRNA（红色），以及Cy5标记的pDNA（白色）在通过MC40靶向的原始细胞运输到Hep3B后在细胞内的分布。在固定和用Hoechst33342（蓝色）染色前，将细胞用超过其1000倍的MC40靶向的原始细胞在37℃下培养24小时。比例尺=10μm。（C）在37℃下，在10nM紫杉醇和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，在G2/M期被捕获的Hep3B、SNU-398和肝细胞的分数。用G2/M期的对数生长期细胞的百分率将分数进行归一化处理。（D）在37℃下，在10nM紫杉醇、250pM的Bcl-2特异性siRNA和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，对Alexa 647标记的膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）显阳性的Hep3B、SNU-398和肝细胞的百分率。在（C）和（D）中，“pCB1”是指用DOTAP和DOPE混合物（1:1w/w）包装和非特异性运输到细胞中的pCB1。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和
0.500wt%H5WYG修饰。脂质体由含5wt%DMPE的DSPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（16：
0）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。脂质体复合物由DOTAP和DOPE（1:1w/w）的混合物构成，并用10wt%PEG-2000、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
siRNA的浓度，以及能够封装进10 个原始细胞、脂质体或脂质体复合物中的CB1质粒的浓度。红色条表示当紫杉醇和pCB1两者都装载进原始细胞时，它们的浓度如何变化。蓝色条表示紫杉醇、siRNA和pCB1都装载进原始细胞时，或者siRNA和pCB1装载进脂质体复合物中时，它们的浓度如何变化。（B）共聚焦荧光显微镜图，显示了Oregon 488标记的紫杉醇（绿色）、Alexa 594标记的siRNA（红色），以及Cy5标记的pDNA（白色）在通过MC40靶向的原始细胞运输到Hep3B后在细胞内的分布。在固定和用Hoechst33342（蓝色）染色前，将细胞用超过其1000倍的MC40靶向的原始细胞在37℃下培养24小时。比例尺=10μm。（C）在37℃下，在10nM紫杉醇和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，在G2/M期被捕获的Hep3B、SNU-398和肝细胞的分数。用G2/M期的对数生长期细胞的百分率将分数进行归一化处理。（D）在37℃下，在10nM紫杉醇、250pM的Bcl-2特异性siRNA和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，对Alexa 647标记的膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）显阳性的Hep3B、SNU-398和肝细胞的百分率。在（C）和（D）中，“pCB1”是指用DOTAP和DOPE混合物（1:1w/w）包装和非特异性运输到细胞中的pCB1。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和
0.500wt%H5WYG修饰。脂质体由含5wt%DMPE的DSPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（16：
0）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。脂质体复合物由DOTAP和DOPE（1:1w/w）的混合物构成，并用10wt%PEG-2000、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0044] 图12提供了一CB1质粒的载体图谱。该CB1质粒（pCB1）由RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen载体（Clontech实验设备有限公司；山景城；加州）和pNEB193载体（新英格兰生物实验室有限公司；伊普斯威奇；马萨诸塞州）构建。pCB1编码细胞周期蛋白B1特异性小发夹RNA（shRNA）和一海葵属（Zoanthus sp.）绿色荧光蛋白（ZsGreen）。组成型shRNA的表达由RNA Pol III依赖的人U6启动子（PU6）驱动，而组成型ZsGreen的表R
达由巨细胞病毒的立即早期启动子（PCMV IE）驱动。ori和Amp 元件能够使质粒在大肠杆菌内增殖。编码细胞周期蛋白B1特异性shRNA的有义链和反义链的DNA序列带下划线并且侧边带有限制性酶切位点（BamHI为红色，EcoRI为蓝色），这些位点用于将dsDNA寡核苷酸引入到pSIREN载体上。
达由巨细胞病毒的立即早期启动子（PCMV IE）驱动。ori和Amp 元件能够使质粒在大肠杆菌内增殖。编码细胞周期蛋白B1特异性shRNA的有义链和反义链的DNA序列带下划线并且侧边带有限制性酶切位点（BamHI为红色，EcoRI为蓝色），这些位点用于将dsDNA寡核苷酸引入到pSIREN载体上。
[0045] 图13描绘了组蛋白包装的pCB1的特征。（A）暴露于浓度越来越高的组蛋白（H1、H2A、H2B、H3和H4的摩尔比为：1:2:2:2:2）中的pCB1的电泳迁移率变动分析。给定pCB1与组蛋白的摩尔比用于第3-6道。第1道包含DNA梯状条带，第2道包含不加组蛋白的pCB1。（B）组蛋白包装的pCB1（pCB1与组蛋白的摩尔比为1：50）的TEM图。比例尺=50nm。
[0046] 图14显示了没有装载的以及装载了pCB1的介孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸收分析。（A）装载用组蛋白包装的pCB1前后，介孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸附等温线。（B）装载用组蛋白包装的pCB1前后，介孔二氧化硅纳米颗粒的Brunauer-Emmett-Teller（BET）比表面积。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0047] 图15显示了DOPC原始细胞的小角中子散射（SANS）数据。使用用于具有恒定厚度共形外形（conformal shell）的多分散的多孔二氧化硅球体的模型获得拟合数据，该数据显示了在二氧化硅颗粒的表面存在 的双层，其跨越了孔的开口。0、20和 的双层厚度的模拟SANS数据被用于对比。测得的 的双层厚度与其他在平面支撑的脂双层进行的中子研究（33- ）一致，并且在这些比照条件下，该双层厚度主要代表了从脂双层的富含氢的碳氢化合物核心的散射。
[0048] 图16显示了原始细胞保护封装的DNA，使其不被核酸酶降解。DNase I处理的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第3道），组蛋白包装的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第5道），DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第7道），装载进具有阳离子核心的原始细胞的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第9道），和装载进具有阴离子核心的原始细胞的组蛋白包装的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第11道）。裸露的pCB1（第2道）、从组蛋白释放的pCB1（第4道），从DOTAP/DOPE脂质体复合物释放的pCB1（第6道），从具有阳离子核心的原始细胞释放的pCB1（第8道），以及从具有阴离子核心的原始细胞释放的组蛋白包装的pCB1（第10道）被用作比较。第1道包含一DNA梯状条带。样本用DNase I（1单位/50ng DNA）在室温培养30分钟，用1%SDS刺激pCB1的释放。
[0049] 图17显示了介孔二氧化硅纳米颗粒（未修饰的核心）、在室温下用20%（v/v）APTES浸泡12小时的介孔二氧化硅纳米颗粒（APTES修饰的核心）、CB1质粒（“pCB1”）、组蛋白包装的pCB1（“pCB1-组蛋白复合物”），以及用DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1（“DOTAP/DOPE脂质体复合物”）的zeta电位（ζ）值。Zeta电位测量在0.5X PBS（pH7.4）中进行。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0050] 图18显示了典型的正向散射-侧向散射（FSC-SSC）图以及FL-1柱状图，用于确定图6和图24中对ZsGreen表达呈阳性的细胞百分率。（A）-（D）对ZsGreen呈阴性的细胞的FSC-SSC图（A和C）和相应的FL-1柱状图（分别为B和D），对这些细胞进行设门（A）或者不进行设门（B）以排除细胞碎片。FL-1通道的平均荧光强度（MFI）值在（B）和（D）中给出。（E）-（H）对ZsGreen呈阳性的细胞的FSC-SSC图（E和G）和相应的FL-1柱状图（分别为F和H），对这些细胞进行设门（E）或者不进行设门（G）以排除细胞碎片。在（F）和（H）上的门对应于MFI≤282，即ZsGreen阴性细胞的MFI的100倍的细胞百分率（见版面D）。
[0051] 图19显示了MC40靶向肽的鉴别（identification）。在图中提出的原理图描述了11
用于选择MC40靶向肽的过程。1×10 pfu/mL的肽用融合到人IgG的Fc域的100nM重组人Met（rhMet）在室温下温育1小时。蛋白A或蛋白G包被的磁性颗粒用于亲和捕捉Met-噬菌体复合物，并随后用TBS（含150mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH7.4）冲洗10次以除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体克隆用低pH缓冲液（含1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸，pH2.2）洗脱，洗脱产物通过感染宿主细菌（E.coli ER2738）进行扩增。
用于选择MC40靶向肽的过程。1×10 pfu/mL的肽用融合到人IgG的Fc域的100nM重组人Met（rhMet）在室温下温育1小时。蛋白A或蛋白G包被的磁性颗粒用于亲和捕捉Met-噬菌体复合物，并随后用TBS（含150mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH7.4）冲洗10次以除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体克隆用低pH缓冲液（含1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸，pH2.2）洗脱，洗脱产物通过感染宿主细菌（E.coli ER2738）进行扩增。
[0052] 图20显示了MC40靶向肽的鉴定。（A）在第5轮选择后的肽序列比对；主要序列ASVHFPP类似于先前确定的Met特异性的12-mer，YLFSVHWPPLKA（SEQ ID NO:18，参见Zhao,et al.ClinCancerRes2007;13（206049-6055）中的加粗部分。展示靶向不相关的HAIYPRH肽（约10%）（SEQ ID NO：19，Brammer,et al.,Anal.Biochem.373（2008）88–98）的噬菌体克隆在序列比对中省略。（B）和（C）亲和选择的噬菌体克隆结合到rhMet的程度通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行确定。（B）中描述的ELISA方案在材料和方法部分进行描述。ELISA的结果显示在（C）中。（D）在移除没有结合Met的肽后的序列比对。描述在图S-9中的一致的序列由该比对确定。（E）和（F）Hep3B（E）和肝细胞（F）的流式细胞仪散点图，该Hep3B和肝细胞暴露在以下两类物质的一类中：（1）抗Met和一不相关的噬菌体克隆（TPDWLFP）（SEQ ID NO：20）的Alexa 488标记的单克隆抗体，和一抗M13噬菌体的Alexa 546标记的单克隆抗体（蓝点）或（2）抗Met和MC40克隆的Alexa488标记的单克隆抗体，和抗M13噬菌体的Alexa 546标记的单克隆抗体（橙色点）。
未经处理细胞（红点）用于设置FL-1（Alexa 488荧光）和FL-2（Alexa 546
荧光）通道的电压参数。
未经处理细胞（红点）用于设置FL-1（Alexa 488荧光）和FL-2（Alexa 546
荧光）通道的电压参数。
[0053] 图21显示了暴露于Hep3B的MC40靶向的原始细胞的样品结合曲线。为了确定图6
5A中的解离常数，用细胞松弛素D对1×10 个Hep3B或肝细胞进行预处理，以抑制内吞作用，并用各种浓度的Alexa 647标记的MC40靶向的原始细胞在37℃下培养1小时。
使用流式细胞仪确定获得的细胞群的平均荧光强度，并用其相对于原始细胞浓度作图以获得总结合曲线。在饱和浓度的未标记肝细胞生长因子存在时，通过用Alexa 647标
记的MC40靶向的原始细胞培养细胞来确定非特异性结合。通过用总结合曲线减去非特异性结合曲线获得特异性结合曲线；通过特异性结合曲线计算Kd值。在此图描述的实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用
0.015wt%MC40靶向肽（约6个肽/颗粒）修饰；相应的Kd值为1050±142pM。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=5）。
5A中的解离常数，用细胞松弛素D对1×10 个Hep3B或肝细胞进行预处理，以抑制内吞作用，并用各种浓度的Alexa 647标记的MC40靶向的原始细胞在37℃下培养1小时。
使用流式细胞仪确定获得的细胞群的平均荧光强度，并用其相对于原始细胞浓度作图以获得总结合曲线。在饱和浓度的未标记肝细胞生长因子存在时，通过用Alexa 647标
记的MC40靶向的原始细胞培养细胞来确定非特异性结合。通过用总结合曲线减去非特异性结合曲线获得特异性结合曲线；通过特异性结合曲线计算Kd值。在此图描述的实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用
0.015wt%MC40靶向肽（约6个肽/颗粒）修饰；相应的Kd值为1050±142pM。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=5）。
[0054] 图22显示了MC40靶向的原始细胞通过受体介导的内吞作用内化，并在不存在H5WYG肽时定位到溶酶体。（A）在37℃下，一小时之内，被每个Hep3B或肝细胞内化的MC40靶向的原始细胞的平均数量。在不存在（-）或存在（+）饱和浓度（100μg/mL）的人肝细胞6
生长因子（HGF）时，将1×10 个细胞用各种浓度的原始细胞进行培养，使用流式细胞仪确定TM
与每个细胞相关的颗粒的平均数量。原始细胞用NBD和pHrodo 进行标记，以分别区分表面结合的颗粒和内化到酸性细胞内隔间（compartment）的颗粒。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。（B）原始细胞和以下物质之间的皮尔逊相关系数（r值）:（1）Rab5，（2）Rab7，（3）溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1），或（4）Rab11a。在固定、透化和用Alexa
488标记的抗Rab5、Rab7、LAMP-1或Rab11a的抗体培养之前，Hep3B细胞用超过其1000倍的Alexa 594标记的原始细胞在37℃下培养1小时。用SlideBook软件确定r值，
r值表示为平均值±标准差，n=3x50个细胞。用微分干涉差（DIC）图限定Hep3B的边界，使得在计算r值时能忽略细胞边界外的像素。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
生长因子（HGF）时，将1×10 个细胞用各种浓度的原始细胞进行培养，使用流式细胞仪确定TM
与每个细胞相关的颗粒的平均数量。原始细胞用NBD和pHrodo 进行标记，以分别区分表面结合的颗粒和内化到酸性细胞内隔间（compartment）的颗粒。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。（B）原始细胞和以下物质之间的皮尔逊相关系数（r值）:（1）Rab5，（2）Rab7，（3）溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1），或（4）Rab11a。在固定、透化和用Alexa
488标记的抗Rab5、Rab7、LAMP-1或Rab11a的抗体培养之前，Hep3B细胞用超过其1000倍的Alexa 594标记的原始细胞在37℃下培养1小时。用SlideBook软件确定r值，
r值表示为平均值±标准差，n=3x50个细胞。用微分干涉差（DIC）图限定Hep3B的边界，使得在计算r值时能忽略细胞边界外的像素。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
[0055] 图23显示了用NLS修饰并通过MC40靶向的原始细胞运输时，组蛋白包装的pCB1以时间依赖方式在HCC细胞核中聚集。（A）-（C）Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B细胞在37℃下，在超过1000倍的MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中暴露15分钟（A）、12小时（B）或24小时（C）。对于（B）来说，在约2小时后，原始细胞的内体逃逸和pCB1的胞质分散是很明显的，但是直到12-16小时后，才能检测到ZsGreen表达。在24小时时，Cy5标记的pCB1仍然分布在整个细胞中；但是，（C）中胞质染色不明显，因为Cy5通道的获得被减少以避免集中在细胞核中的像素饱和。二氧化硅核心用Alexa 594（红色）标记，pCB1用Cy5（白色）标记，细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。比例尺=20μm。（D）Cy5标记的pCB1和Hoechst33342标记的Hep3B细胞核的皮尔逊相关系数（r值）对时间作图。
用SlideBook软件确定r值，r值表示为平均值±标准差，n=3x50个细胞。用微分干涉差（DIC）图限定Hep3B的边界，使得在计算r值时能忽略细胞边界外的像素。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和
0.500wt%H5WYG修饰。
用SlideBook软件确定r值，r值表示为平均值±标准差，n=3x50个细胞。用微分干涉差（DIC）图限定Hep3B的边界，使得在计算r值时能忽略细胞边界外的像素。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和
0.500wt%H5WYG修饰。
[0056] 图24显示了用NLS修饰并通过MC40靶向的原始细胞运输时，组蛋白包装的pCB1以接近100%的效力选择性转染分裂和非分裂的HCC细胞。（A）、（C）和（E）Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B细胞在37℃下，在超过1000倍的MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中暴露24小时。Hep3B细胞在（A）中的处于分裂中，在（C）和（E）中约95%汇合（confluent）；在所有图中，用组蛋白预包装pCB1，并且在（E）中，pCB1-组蛋白复合物进一步用NLS修饰。二氧化硅核心用Alexa 594（红色）标记，pCB1用Cy5（白色）标记，9
细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。比例尺=20μm。（B）、（D）和（F）在37℃下，在1×10
6
个MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞（“PC”）中持续暴露24小时后，1×10 个Hep3B和肝细胞中变得对ZsGreen表达呈阳性的细胞的百分率。细胞在（B）中是处于分裂中的，在（D）和（F）中约95%汇合；X轴表明CB1质粒（“pCB1”）和pCB1-组蛋白复合物（“复合物”）是否用NLS修饰。使用单独的pCB1，以及用DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1作为对照。细胞暴露在20mg/mL麦胚凝集素（WGA）中，以阻断NLS修饰的pCB1易位通过核孔复合物。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。（G）–（I）分别为（A）、（C）和（E）中使用的细胞的细胞周期柱状图。在G0/G1期的细胞的百分率在每个柱状图中给出。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。比例尺=20μm。（B）、（D）和（F）在37℃下，在1×10
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个MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞（“PC”）中持续暴露24小时后，1×10 个Hep3B和肝细胞中变得对ZsGreen表达呈阳性的细胞的百分率。细胞在（B）中是处于分裂中的，在（D）和（F）中约95%汇合；X轴表明CB1质粒（“pCB1”）和pCB1-组蛋白复合物（“复合物”）是否用NLS修饰。使用单独的pCB1，以及用DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1作为对照。细胞暴露在20mg/mL麦胚凝集素（WGA）中，以阻断NLS修饰的pCB1易位通过核孔复合物。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。（G）–（I）分别为（A）、（C）和（E）中使用的细胞的细胞周期柱状图。在G0/G1期的细胞的百分率在每个柱状图中给出。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
[0057] 图25显示了Hep3B（A）和肝细胞（B）的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B和肝细胞在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中暴露1小时或者72小时；在所有实验中，pCB1浓度保持在5pM。（B）中的箭头表明是有丝分裂细胞。用Alexa 594标记的单
克隆抗体（红色）标记细胞周期蛋白B1，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
克隆抗体（红色）标记细胞周期蛋白B1，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
[0058] 图26显示了Hep3B（A）和肝细胞（B）的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B和肝细胞在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中暴露1小时或者72小时；在所有实验中pCB1浓度保持在5pM。细胞用Alexa 647标记的膜联蛋白V（白色）和碘化丙啶（红
色）染色来分别分析早期和晚期细胞凋亡，细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
色）染色来分别分析早期和晚期细胞凋亡，细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
[0059] 图27显示了，具有由两性脂质构成的SLB的原始细胞引起最小化的非特异性细胞9
毒性。在37℃下，在1×10 个APTES修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒、具有APTES修饰的核心的DOPC原始细胞、装载有编码错配（scrambled）shRNA序列的质粒（“错配pCB1”）的DOPC原始细胞，或者装载有错配pCB1的DOTAP/DOPE（1:1w/w）脂质体复合物中暴露48小时，
6
1×10 个Hep3B的凋亡百分率。原始细胞和脂质体复合物用10wt%PEG-2000、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。带有正电荷或负电荷的聚苯乙烯纳米颗粒（分别为“氨基-PS”和“羧基-PS”）用作阳性对照，而暴露在10mM抗氧化剂，N-乙酰半胱氨酸（NAC）或者暴露在1pmol游离的（free）pCB1中的Hep3B用作阴性对照。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
毒性。在37℃下，在1×10 个APTES修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒、具有APTES修饰的核心的DOPC原始细胞、装载有编码错配（scrambled）shRNA序列的质粒（“错配pCB1”）的DOPC原始细胞，或者装载有错配pCB1的DOTAP/DOPE（1:1w/w）脂质体复合物中暴露48小时，
6
1×10 个Hep3B的凋亡百分率。原始细胞和脂质体复合物用10wt%PEG-2000、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。带有正电荷或负电荷的聚苯乙烯纳米颗粒（分别为“氨基-PS”和“羧基-PS”）用作阳性对照，而暴露在10mM抗氧化剂，N-乙酰半胱氨酸（NAC）或者暴露在1pmol游离的（free）pCB1中的Hep3B用作阴性对照。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
具体实施方式
[0060] 在整个说明书中使用下列术语来描述本发明。在术语没有特别定义的情况下，该术语将取其本领域普通技术人员所理解的意思。
[0061] 当给出一数值范围时，应当理解的是，除非文中明确规定，在这个范围的上限和下限之间的每个居间值（intervening value），取到下限的单位的十分位，以及在这规定的范围中的任意其他规定的值或居间值，都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，这也包括在本发明中，其受到任何在所规定的范围中明确排除的限值制约。当所规定的范围包括一个或两个限值时，排除那些已包括的限值的范围同样也包括在本发明中。当取代基是一个或多个马库什组中的可能物质的情况下，应当理解为只采用那些能形成稳定键的取代基。
[0062] 除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科技术语具有本领域技术人员所理解的一般含义。尽管任何与本文描述相似或相等的方法和材料也可以用在本发明的实施或测试中，现在还是对优选的方法和材料进行描述。
[0064] 此外，以下术语应具有下面给出的含义。
[0065] 在整个说明书中使用的术语“患者”或“对象”是指动物，通常为哺乳动物，特别地，包括家养动物，优选地指使用本发明的化合物或组合物治疗（包括预防性治疗（预防））的人类。当治疗针对某种具体动物如人类患者的那些感染、状况或疾病状态时，术语“患者”是指该特定动物。在大多数的情况下，本发明所述的患者或对象是任一性别或两种性别的人类患者。
[0066] 除另有说明，本文使用的术语“有效量”是在其使用的背景下，化合物或成分产生或引起预期的结果的量，不论该结果是关于感染和/或疾病状态的预防和/或治疗，还是另有描述。把所有其他有效量或有效浓度术语（包括术语“治疗有效量的”）纳入到这个术语中，这些术语在本发明申请中的其它地方描述或使用。
[0067] 本文使用的术语“化合物”指任何在本文中公开的具体化合物或生物活性剂，包括任何或所有的立体异构体（包括非对称异构体）、单独的旋光异构体（对映异构物）或外消旋混合物、药学上可接受的盐和前体药物形式。本文的术语化合物指的是稳定的化合物。在其使用的背景中，如本文另有说明，术语化合物可以指单个化合物或化合物的混合物。
[0068] 术语“生物活性剂”指的是在本发明实例中可以配制使用的任何生物活性化合物或药物。示例性生物活性剂包括本发明用于治疗癌症或癌症的继发性疾病状态或状况的化合物，也可包括抗病毒剂尤其是抗HIV、抗HBV和/或抗HCV剂（尤其是治疗肝癌时）和本文另有描述的其他化合物或试剂。
[0069] 术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”同义使用，指的是使处于疾病威胁或折磨的病人受益的任何措施，包括通过减轻、抑制、压制或消除至少一种症状、延迟疾病的发展、预防或延迟或抑制疾病发作的可能性等来改善身体状况。在病毒感染的情况下，这些术语也适用于病毒感染，在某些特定优选实例中，优选包括根除或消除（如诊断极限提供的）病毒，该病毒是引起感染的病原体。
[0070] 本文使用的治疗，包括预防性和治疗性治疗，主要是治疗癌症，但还治疗其他疾病状态，包括病毒性感染，尤其是包括HBV和/或HCV。例如，本发明的化合物可以在疾病发生前预防地对哺乳动物给药，以降低这种疾病的可能性。预防性的给药对降低或减少哺乳动物中疾病的后续发生可能性，或对减轻后续发生的疾病的严重性（抑制），特别包括癌转移是有效的。或者，本发明的化合物可以，例如，治疗性地对已经被疾病折磨的哺乳动物给药。在治疗性给药的一个实施例中，用本发明的化合物给药对消除疾病，和产生缓解或基本上消除癌转移的可能性是有效的。在癌症的例子中，用本发明的化合物给药对减轻疾病的严重性或延长受折磨的哺乳动物的寿命是有效的，或者在乙型肝炎病毒（HBV）和/或丙型肝炎病毒（HCV）感染的例子中，用本发明的化合物给药对抑制甚至消除疾病病原体是有效的。
[0071] 本文使用的术语“药学上可接受的”，意思是根据疾病的严重性和治疗的必要性，该化合物或组合物适于给药对象，包括病人，以获得本文描述的治疗，而没有不适当的有害的副作用。
[0072] 本文使用的术语“抑制”指的是，当抑制剂是具有抑制能力的化合物/组合物时，其能部分或全部消除潜在的影响。
[0073] 在本文背景下使用的术语“预防”应当指作为使用本发明的一种或多种化合物或组合物给药或共同给药（单独或与另一种试剂联合给药）的结果，“降低可能性”或防止疾病、状况或疾病状态的发生。人们注意到，几乎没有100%有效的预防；所以，术语预防和降低可能性用于表示这样的事实：在给定的患者或对象的群体中，用本发明的化合物进行给药将抑制或降低特定的病症或病状（特别地，病状的恶化，例如癌细胞生长或转移）或疾病发展的其他可接受的指标发生的可能性。
[0074] 术语“原始细胞”是用来描述一多孔纳米颗粒，其由包含二氧化硅、聚苯乙烯、氧化铝、二氧化钛、氧化锆或一般的金属氧化物、有机金属酸盐（organometallate）、有机硅酸盐或其混合物的材料制成。多孔球形二氧化硅纳米颗粒用于优选的原始细胞，并被一支撑脂质或聚合物双层或多层包围。本发明的各种实例提供了纳米结构和用于制造和使用纳米结构的方法，以及提供本发明原始细胞的方法。许多原始细胞的最基本的形式是本领域已知的。不同大小的多孔二氧化硅颗粒的尺寸（直径）从小于5nm至200nm或500nm或更大，这些颗粒在本领域中是现成的，或者使用本领域已知的方法容易地制备（见实例部分）或者可替代地，能够从纽约罗彻斯特的Melorium Technologies、美国德州休斯顿的SkySpring纳米材料有限公司或英属哥伦比亚的温哥华的Discovery Scientific有限公司购买到。多峰（multimodal）二氧化硅纳米颗粒可以使用Carroll,et al.,Langmuir,25,13540-13544（2009）中的步骤很容易地制备。原始细胞可使用本领域已知的方法很容易地获得。本发明实例部分提供了用于获得在本发明中有用的原始细胞的某些方法。本发明的原始细胞可以很容易地制备，包括包含脂质的原始细胞，这些脂质融合到二氧化硅纳米颗粒表面。 例 如，见Liu,et al.,Chem.Comm.,5100-5102（2009）,Liu,et al.,J.Amer.Chem.Soc.,131,1354-1355（2009）,Liu,et al.,J.Amer.Chem.Soc.,131,7567-7569（2009）Lu,et al.,Nature,398,223-226（1999），用于本发明的优选的原始细胞根据以下文献中提供的步骤制备：Ashley,et al.,Nature Materials,2011,May;10（5）:389-97,Lu,et al.,Nature,398,223-226（1999）,Caroll,et al.,Langmuir,25,13540-13544（2009），或者另外表述在随后的实验部分。
[0075] 在本发明一个实例中，纳米结构包括一核-壳结构，该结构包括一多孔颗粒核心，该核心由脂质外壳，优选是双层，但可能是单层或多层包围（见Liu,et al.,JACS,2009,Id）。例如,多孔颗粒核心可包括一多孔纳米颗粒，该纳米颗粒由无机和/或有机材料制成，如上所述，其被一脂双层包围。在本发明中，这些脂双层包围的纳米结构是指“原始细胞”或“功能性原始细胞”，因为它们具有一支撑脂双层膜结构。在本发明实例中，原始细胞的多孔颗粒核心能够装载各种所需种类物质（“货物”），包括小分子（例如本文另有描述的抗癌剂）、大分子（例如包括巨大分子如RNA，包括小干扰RNA或siRNA或小发夹RNA或shRNA，或多肽，包括多肽毒素如蓖麻毒素A链或其他毒素多肽如白喉毒素A链DTx，或其他大分子）或者一报告多肽（例如荧光绿色蛋白等）或者半导体量子点，或者金属纳米颗粒，或者金属氧化物纳米颗粒或它们的组合物。在本发明的某些优选方面，原始细胞装载有超螺旋质粒DNA，其可用于运输治疗性和/或诊断肽或小发夹RNA/shRNA或小干扰RNA/siRNA，这些物质可用于抑制蛋白表达（例如，负责或有助于细胞尤其是癌细胞生长的生长因子受体或其他受体，包上皮生长因子/EGFR、血管内皮生长因子受体/VEGFR-2或血小板衍化生长因子受体/PDGFR-α等等，还诱导癌细胞的生长停滞和凋亡）。
[0076] 在某些实例中，货物组分包括但不限于，化学小分子（尤其是抗癌剂和抗病毒剂，包括抗HIV、抗HBV和/或抗HCV试剂）、核酸（DNA和RNA，包括siRNA和shRNA和质粒，其在运输到细胞后表达一种或多种多肽或RNA分子），例如用于特殊目的，例如本文另有描述的治疗应用或诊断应用。
[0077] 在实例中，原始细胞的脂双层能提供生物相容性并能够进行修饰以拥有靶向种类物质，例如靶向肽包括抗体、核酸适配子和PEG（聚乙二醇）以使例如原始细胞具有进一步的稳定性和/或使其能靶向运输到具有生物活性细胞中。
[0078] 本发明的原始细胞颗粒尺寸分布可以是单分散的或多分散的，取决于具体的应用。二氧化硅核心可以是单分散的（即，直径差异不大于约5%的统一尺寸的群体，例如，对于200nm直径的原始细胞，差异不大于±10nm，尤其是如果它们使用溶液技术制备时）或者是多分散的（即多分散的群体，如果通过喷雾制备，可以与平均直径或中位直径差异很大，例如差异高达±200nm或更大）。见图1。多分散群可以调整大小成单分散群。所有这些都适合形成原始细胞。在本发明中，优选的原始细胞直径优选不大于约500nm，优选直径不大于约200nm，以能够运输到患者或对象中并产生预期的治疗效果。
[0079] 本发明的原始细胞一般的尺寸范围，从直径大于约8-10nm到约5μm，优选直径约20nm-3μm，约10nm-约500nm，更优选约20-200nm（包括约150nm，这可以是一平均或中位直径）。如上文所述，基于原始细胞群的平均或中位直径，原始细胞群可认为是单分散或多分散的。在本发明的治疗和诊断方面，尺寸非常重要，因为直径小于约8nm的颗粒通过肾脏排出，而那些大于约200nm的颗粒则会被肝脏和脾脏捕获。因此，本发明的一实例把重点放在小尺寸的原始细胞，用于患者或对象体内的药物运输和诊断。
[0080] 本发明的原始细胞的特征在于包含介孔，优选是存在于纳米结构材料中的孔。这些孔（至少有一个，但往往有很多个）可以贯穿纳米颗粒表面（通过孔的一个或两个末端出现在纳米颗粒的表面）或者在纳米结构内部，其至少一个或多个介孔与纳米颗粒的表面介孔相互连接。较小尺寸的相互连接的孔往往在表面介孔的内部。介孔的孔尺寸的整体范围可以是直径为0.03-50nm。优选的介孔的孔尺寸为约2-30nm；它们可以是单一尺寸的或双尺寸的或具有尺寸梯度，它们可以是有序的或无序的（基本上是随机布置的或蠕虫状的）。见附图2。
[0081] 介孔（IUPAC定义，直径为2-50nm）通过模板剂“模制”，模板剂包括表面活性剂、嵌段共聚物、分子、巨大分子、乳液、乳胶小珠，或纳米颗粒。此外，工艺也可导致形成小至约0.03nm的微孔（IUPAC定义，直径小于2nm），例如如果在喷雾工艺中不使用模板部分。它们也可以被扩大为大分子，即直径为50nm。
[0082] 纳米颗粒材料的孔表面化学可以是非常不同的——产生阳离子、阴离子、亲水、疏水、活性基团的所有有机硅烷——孔表面化学，尤其是电荷和疏水性，影响装载能力。见附图3。有吸引力的静电相互作用或疏水相互作用控制/提高装载能力和控制释放率。更大的表面面积可以通过有吸引力的相互作用装载更多的药物/货物。参见如下。
[0083] 纳米颗粒的表面积，通过N2BET方法测试，为约100m2/g至>约1200m2/g。通常，孔尺寸越大，比表面积越小。见图2A的表。如果不去除模板剂，或者如果孔在0.5nm以下从而由于动力学效应在77K下通过N2吸附检测不到，理论上表面积可减少到基本为零。然而，在这种情况下，它们可以通过CO2或水吸附测得，但也很可能被认为是没有孔的。这可应用于如果生物分子直接封装进不用模板制备的二氧化硅核心中，在这种情况下，在运输到细胞后，颗粒（内部货物）可通过二氧化硅基质的溶解而释放。
[0084] 通常本发明的原始细胞装载高达约50wt%货物的能力：定义为（货物重量/装载后的原始细胞重量）×100。最佳的装载货物重量通常为约0.01-10%，但这取决于作为货10
物进入到原始细胞内的药物或药物组合。这通常用μM/10 颗粒表示，其中数值范围为
10
2000-100μM/10 颗粒。本发明优选的原始细胞在pH为约5.5时显示释放货物，其为内体货物，但在生理pH为7或更高（7.4）时达到稳定状态。
物进入到原始细胞内的药物或药物组合。这通常用μM/10 颗粒表示，其中数值范围为
10
2000-100μM/10 颗粒。本发明优选的原始细胞在pH为约5.5时显示释放货物，其为内体货物，但在生理pH为7或更高（7.4）时达到稳定状态。
[0085] 用于装载的内部空间的表面区域是孔体积，其优选值范围为约1.1-0.5立方厘米每克（cc/g）。请注意，在本发明一个实例的原始细胞中，表面区域主要是内部的而不是纳米颗粒的外部几何表面区域。
[0086] 根据本发明的一个实例，支撑在多孔颗粒上的脂双层具有较低的熔融转变温度，即比支撑在非多孔支撑物上的脂双层或脂质体中的脂双层流动性更强。在低肽密度下实现靶向配体的高亲和力结合时，这点有时是非常重要的，因为是双层的流动性允许了通过靶细胞表面受体进行多肽的横向扩散和补充。一个实例提供了肽聚集，其有利于结合到一互补靶标。
[0087] 在本发明中，脂双层可以在组成上有很大不同。一般情况下，任何可用于脂质体的脂质或聚合物也可用于原始细胞中。优选的脂质在本文中另有描述。尤其优选的用于本发明原始细胞的脂双层包括脂质混合物（本文另有描述），其重量比为5%DOPE、5%PEG、30%胆固醇、60%DOPC或DPPC（按重量计）。
[0088] 介孔二氧化硅NP核心的电荷通过Zeta电位测量，通过用氨基硅烷（aminesilane）、2-（氨乙基）丙基三甲氧基硅烷（AEPTMS）或其他有机硅烷修饰，其可以从-50至+50mV单调变化。这种电荷修饰，反过来，使得原始细胞货物内药物的装载发生变化。一般来说，在支撑脂双层融合后，zeta电位减少至约-10mV至+5mV之间，这对于使其在血液中循环时间最大化和避免非特异性相互作用是非常重要的。
[0089] 取决于表面活性剂模板移除方式，例如在高温（500℃）下煅烧对比用酸性乙醇提取，以及取决于纳入到二氧化硅框架内的AEPTMS的量，二氧化硅溶解速率可差别很大。这种情况又反过来控制内部货物的释放速率。这种情况出现的原因是强烈吸附到孔的内部表面区域的分子缓慢地扩散出颗粒核心，因此颗粒核心的溶解在某种程度上控制释放率。
[0090] 根据本发明一个实例，原始细胞的进一步特征是它们在pH为7时稳定，即，它们不会漏出它们的货物，但在pH为5.5时，内体脂质或聚合物覆层变得不稳定，引发货物释放。这种pH触发的释放对于维持原始细胞的稳定性，直到其通过内吞作用内化到细胞内是重要的，于是一些pH触发事件导致释放到内体中并因此释放到胞质溶胶中。定量实验证据已表明，靶向原始细胞仅引起微弱的免疫反应，因为它们不支持更高亲和性IgG所需的T细胞帮助，这是一个有利的结果。
[0091] 本发明的原始细胞展示出许多特征中的至少一个或多个（取决于具体实例），这些特征使它们有别于现有的原始细胞：
[0092] 1)与现有技术相比，本发明一个实例指定了平均尺寸（直径）小于约200nm的纳米颗粒，设计这个尺寸能够通过受体介导的内吞作用进行有效的细胞摄入。
[0093] 2)本发明的一个实例指定单分散的和/或多分散尺寸，使得能够控制生物分布。
[0094] 3)本发明的一实例指向诱导受体介导的内吞作用的靶向纳米颗粒。
[0095] 4)本发明的一实例通过包含融合肽或内体裂解肽，诱导货物分散进细胞质。
[0096] 5)本发明的一实例提供了颗粒，能够通过pH触发释放货物。
[0097] 6)本发明的一实例展示了受控的时间依赖性释放货物（通过热诱导二氧化硅纳米颗粒基质交联的程度）。
[0098] 7)本发明一实例能展示具有时间依赖性的pH触发的释放。
[0099] 8)本发明的一实例能够包含和提供复合的多种货物的细胞运输。
[0100] 9)本发明一实例显示了靶标癌细胞的杀灭。
[0101] 10)本发明一实例显示了靶标癌细胞的诊断。
[0102] 11)本发明一实例显示了选择性进入靶细胞。
[0103] 12)本发明一实例显示了选择性排除非靶细胞（选择性）。
[0104] 13)本发明一实例显示了支撑脂双层的增强的流动性。
[0105] 14)本发明一实例展示了对靶细胞的亚纳摩尔级的受控的结合亲和力。
[0106] 15)本发明一实例展示了亚纳摩尔级结合亲和力，靶向配体密度低于现有技术中的浓度。
[0107] 16)本发明一实例用现有技术没有的更出色的细节水平来区分本发明和现有技术。
[0108] 术语“脂质”是用来描述用于形成纳米颗粒表面的脂双层的组分，这些纳米颗粒用于本发明。各种实例提供了由纳米颗粒构建的纳米结构，这些纳米颗粒支撑脂质双层。在本发明的实例中，纳米结构优选包括例如核-壳结构，其包括一由脂双层的外壳包围的多孔颗粒核心。纳米结构，优选是上述的多孔二氧化硅纳米结构，支撑脂双层膜结构。在本发明实例中，原始细胞的脂双层能提供生物相容性并能够进行修饰以拥有靶向种类的物质，包括例如靶向肽、融合肽、抗体、核酸适配子和PEG（聚乙二醇）以允许例如原始细胞具有进一步的稳定性和/或靶向运输到生物活性细胞，尤其是癌细胞中。当PEG包括在脂双层中时，其摩尔质量可差异很大（但可以使用含约10-约100单位乙二醇、约15-约50单位、约15-约20单位、约15-约25单位、约16-约18单位乙二醇的PEG等，PEG组分通常通过氨基缀合到磷脂上，该组分包含约1%-约20%，优选约5%-约50%、约10%重量的包括在脂双层中的脂质。
[0109] 用于脂质体运输系统的许多脂质可用于形成纳米颗粒上的脂双层，以提供本发明的原始细胞。几乎任何用于形成脂质体的脂质可用于脂双层，该脂双层包围纳米颗粒以形成本发明一实例中的原始细胞。优选的用于本发明的脂质包括，例如，1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DOPC）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DPPC）、1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DSPC）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-[磷酸-L-丝氨酸]（DOPS）、1,2-二油酰-3-三甲胺-丙烷（18:1DOTAP）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-二氧膦基-（1'-rac-甘油）（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)）（DOPG）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（18:1PEG-2000PE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（16:0PEG-2000PE）、1-油酰-2-[12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰]-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（18:1-12:0NBD PC）、1-棕榈酰-2-{12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰}-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（16:0-12:0NBD PC）、胆固醇及它们的混合物/组合物。胆固醇，在技术上不是脂质，但是鉴于胆固醇可以是本发明一实例的原始细胞的脂双层的重要组分，因此在本发明一实例中作为脂质提出。通常胆固醇被纳入到原始细胞的脂双层中是为了加强双层的结构完整性。这些脂质全部都很容易从Avanti Polar lipids有限公司（阿拉巴斯特，阿拉巴马州，美国）购买。DOPE和DPPE通过脂质上的氨基，在缀合（通过合适的交联剂）肽、多肽，包括抗体、RNA和DNA中特别有用。
[0110] 术语“报告子”用于描述一显像剂或部分（moiety），其结合到本发明一实例的原始细胞的磷脂双层或货物上并提供可测量的信号。所述部分可提供一荧光信号或是一能够进行辐射检测的放射性同位素，等等。用于原始细胞的示例性荧光标记（优选通过缀合或吸收到脂双层或二氧化硅核心，但是这些标签也可纳入到通过原始细胞运输到细胞内的货物元件中，例如DNA、RNA、多肽和小分子，包括Hoechst33342（350/461）、4',6-二脒基2-苯TM基吲哚（DAPI，356/451）、Alexa 405羧酸、琥珀酰亚胺酯（401/421）、CellTracker TM
Violet BMQC（415/516）、CellTracker GreenCMFDA（492/517）、钙黄绿素（495/515）、Alexa
488结合膜联蛋白V（495/519）、Alexa 488山羊抗鼠IgG（H+L）（495/519）、
AHA Alexa 488蛋白合成HCS分析（495/519）、LIVE/ 可固定的
TM
绿色死细胞染色试剂盒（495/519）、 绿色核酸染色（504/523）、MitoSOX 红色线TM
粒体超氧化指示剂（510/580）。Alexa 532羧酸、琥珀酰亚胺酯（532/554）、pHrodoTM
琥珀酰亚胺酯（558/576）、CellTracker 红色CMTPX（577/602）、Texas 1,2-二十六酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（Texas DHPE，583/608）、Alexa 647酰肼
（649/666）、Alexa 647羧酸、琥珀酰亚胺酯（650/668）、UlysisTM Alexa 647
核酸标记试剂盒（650/670）和Alexa 647缀合膜联蛋白V（650/665）。增强荧光信
号或放慢荧光衰弱的部分也可以被纳入，包括Slow Gold系列抗淬灭剂（含有或不含DAPI）以及 FX信号增强剂。所有这些都是本领域已知的。另外的报告子包括通
过质粒（如组蛋白包装的超螺旋DNA质粒）表达的多肽报告子，和包括例如荧光绿色蛋白和荧光红色蛋白的多肽报告子。根据本发明，报告子主要用于诊断应用中，包括诊断癌症（癌组织）的在患者体内的存在或发展和/或在患者或对象体内的治疗进展。
Violet BMQC（415/516）、CellTracker GreenCMFDA（492/517）、钙黄绿素（495/515）、Alexa
488结合膜联蛋白V（495/519）、Alexa 488山羊抗鼠IgG（H+L）（495/519）、
AHA Alexa 488蛋白合成HCS分析（495/519）、LIVE/ 可固定的
TM
绿色死细胞染色试剂盒（495/519）、 绿色核酸染色（504/523）、MitoSOX 红色线TM
粒体超氧化指示剂（510/580）。Alexa 532羧酸、琥珀酰亚胺酯（532/554）、pHrodoTM
琥珀酰亚胺酯（558/576）、CellTracker 红色CMTPX（577/602）、Texas 1,2-二十六酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（Texas DHPE，583/608）、Alexa 647酰肼
（649/666）、Alexa 647羧酸、琥珀酰亚胺酯（650/668）、UlysisTM Alexa 647
核酸标记试剂盒（650/670）和Alexa 647缀合膜联蛋白V（650/665）。增强荧光信
号或放慢荧光衰弱的部分也可以被纳入，包括Slow Gold系列抗淬灭剂（含有或不含DAPI）以及 FX信号增强剂。所有这些都是本领域已知的。另外的报告子包括通
过质粒（如组蛋白包装的超螺旋DNA质粒）表达的多肽报告子，和包括例如荧光绿色蛋白和荧光红色蛋白的多肽报告子。根据本发明，报告子主要用于诊断应用中，包括诊断癌症（癌组织）的在患者体内的存在或发展和/或在患者或对象体内的治疗进展。
[0111] 术语“组蛋白包装的超螺旋质粒DNA”用于描述本发明原始细胞的优选组分，该原始细胞利用优选的“超螺旋”的质粒DNA（即，使用导致质粒自身折叠和超螺旋的过饱和盐溶液或其他离子溶液使其自身折叠，以变得更密集，从而有效地包装进原始细胞中）。质粒可以是表达任意数量多肽或编码RNA，包括小发夹RNA/shRNA或小干扰RNA/siRNA（本文另有描述）的几乎任意质粒。一旦发生超螺旋（使用浓缩的盐或其他阴离子溶液），该超螺旋的质粒DNA随后与组蛋白复合，以产生一组蛋白包装的“复合的”超螺旋质粒DNA。
[0112] “包装的”DNA此处指装载进原始细胞的DNA（吸收进孔或自身直接限定在纳米多孔二氧化硅核心内部）。为了在空间上使DNA最小化，其通常被包装，这可通过几种不同方式实现，从调整周围介质的电荷到用例如脂质、蛋白或其他纳米颗粒（通常但不全是阳离子型）形成DNA小复合物。包装的DNA通常通过脂质体复合物（即DNA和阳离子脂质混合物复合）获得。此外，DNA也用阳离子型蛋白（包括除了组蛋白以外的蛋白），以及金纳米颗粒（例如NanoFlares-一种经设计的DNA和金属复合物，其中纳米颗粒的核心是金）进行包装。
[0113] 可以使用任何数量的组蛋白，以及将DNA包装成较小体积例如通常的阳离子型纳米颗粒、脂质或蛋白的其他方式，以包装超螺旋质粒DNA“组蛋白包装的超螺旋质粒DNA”，但在涉及治疗病人的治疗方面，优选使用人组蛋白。在本发明某些方面，人组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4组合的优选比例为1:2:2:2:2，尽管其他组蛋白可以以相似比例组合，如本领域已知的或根据本发明的教导容易实践的。DNA也可是双链线性DNA，而不是质粒DNA，也可以可选地进行超螺旋和/或用组蛋白或其他包装组分进行包装。
[0114] 用于本发明这个方面的其他组蛋白包括，例如H1F、H1F0、H1FNT、H1FOO、H1FX H1H1HIST1H1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HIST1H1T；H2AF、H2AFB1、H2AFB2、H2AFB3、H2AFJ、H2AFV、H2AFX、H2AFY、H2AFY2、H2AFZ、H2A1、HIST1H2AA、HIST1H2AB、HIST1H2AC、HIST1H2AD、HIST1H2AE、HIST1H2AG、HIST1H2AI、HIST1H2AJ、HIST1H2AK、HIST1H2AL、HIST1H2AM、H2A2、HIST2H2AA3、HIST2H2AC、H2BF、H2BFM、HSBFS、HSBFWT、H2B1、HIST1H2BA、HIST1HSBB、HIST1HSBC、HIST1HSBD、HIST1H2BE、HIST1H2BF、HIST1H2BG、HIST1H2BH、HIST1H2BI、HIST1H2BJ、HIST1H2BK、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BN、HIST1H2BO、H2B2、HIST2H2BE、H3A1、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、H3A2、HIST2H3C、H3A3、HIST3H3、H41、HIST1H4A、HIST1H4B、HIST1H4C、HIST1H4D、HIST1H4E、HIST1H4F、HIST1H4G、HIST1H4H、HIST1H4I、HIST1H4J、HIST1H4K、HIST1H4L、H44和HIST4H4。
[0115] 术语“核定位序列”是指纳入或以其他方式交联到组蛋白中的多肽序列，该组蛋白包含组蛋白包装的超螺旋的质粒DNA。在某些实例中，本发明原始细胞可进一步包括质粒（通常是组蛋白包装的超螺旋质粒DNA），其用核定位序列修饰（交联）（注意，组蛋白可与核定位序列交联，或者质粒自身可进行修饰以表达核定位序列），增强了组蛋白包装的质粒穿透细胞核并在此放置其内含物（以促进表达并最终促进细胞死亡）的能力。这些肽序列有助于将组蛋白包装的质粒DNA和相关组蛋白运输到靶细胞核内，因此，质粒将表达运输治疗和/或诊断分子（多肽和/或核苷酸）到靶细胞核内所需的肽和/或核苷酸。本领域已知的任意数量的交联剂可用于将核定位序列共价连接到组蛋白上（通常在暴露在多肽上的氨基酸侧链的赖氨酸基团或其他具有具有亲核或亲电子基团的基团处），其用于将组蛋白包装的质粒引入细胞核。或者，表达核定位序列的核苷酸序列可定位在接近表达组蛋白的序列的质粒中，使缀合到核定位序列的组蛋白得以表达，从而便于质粒转移到靶细胞核中。
[0116] 蛋白通过核膜进入细胞核。核膜由同心膜，外膜和内膜组成。这些是细胞核的门。核膜由多个孔或大型细胞核复合物组成。翻译成带有NLS的蛋白将强有力地结合到输入蛋白（aka核转运蛋白（aka karyopherin）），并且复合物一起移动通过核孔。可使用任何数量的核定位序列以将组蛋白包装的质粒DNA引入到细胞核中。优选的核定位序列包括H2N-GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOH，SEQ ID NO：9，RRMKWKK（SEQ ID NO:10）、PKKKRKV（SEQ ID NO:11）和 KR[PAATKKAGQA]KKKK（SEQ ID NO:12）、核质蛋白的NLS、包含两簇碱性氨基酸的通过约10个氨基酸的间距子分隔开的典型双组分信号。众多的其他核定位序列在本领域是是众所周知。例如，见LaCasse,et al.,Nuclear localization signals overlap NA-or RNA-binding domains in nucleic acid-bindingproteins（《核定位信号与核酸结合蛋白中的DNA或RNA结合域重叠》）.Nucl.Acids Res.,23,1647-16561995）；Weis,K.Importins and exportins:how to get in and out of the nucleus（《输入蛋白和输出蛋白：如何进出细胞核》）[勘误发表于Trends Biochem Sci1998Jul;23（7）:235].TIBS,23,185-9（1998）；以及Murat Cokol,Raj Nair&Burkhard Rost,“Finding nuclear localization signals（《寻找核定位信号》）”,见网站ubic.bioc.columbia.edu/papers/2000nls/paper.html#tab2。
[0117] 术语“癌症”用于描述具有独特的失去正常控制的特征的肿瘤细胞（赘生物）增殖，导致不受控的生长，缺失分化，局部组织侵袭和/或转移。如本文中使用的赘生物（neoplasms），包括但不限于，与相同类型组织中的正常增殖比较，对象或宿主组织中的形态不规则细胞，以及对象组织中病理性增殖的细胞。此外，赘生物包括侵袭性或非侵袭性的良性肿瘤和恶性肿瘤（如，结肠肿瘤）。恶性赘生物与良性赘生物的区别在于前者显示更大程度的发育异常，或缺乏细胞分化和定向，以及具有侵袭性和转移的特点。在本文背景下，术语癌症也包括耐药癌症，包括多重耐药性的癌症。衍生本发明的靶细胞的赘生物或瘤的实例，包括但不限于，癌（例如，鳞状细胞癌、腺癌、肝细胞癌和肾细胞癌），特别是，膀胱、骨、肠、乳房、宫颈、直肠（结直肠）、食道、头、肾脏、肝（肝细胞）、肺、鼻咽、颈、、胰腺、前列腺和胃的那些癌；白血病，如急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、急性早幼粒细胞白血病（APL）、急性T-细胞淋巴性白血病、成人T细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、粒细胞性白血病、毛细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴球性白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、中性粒细胞白血病、干细胞性白血病；良性和恶性淋巴瘤，特别是，伯基特淋巴瘤、非霍奇金（Non-Hodgkin's）淋巴瘤和B-细胞淋巴瘤；良性和恶性的黑素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤，特别是，尤因氏肉瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤（Iiposarcomas）、肌肉瘤、外周神经上皮瘤和滑膜肉瘤；中枢神经系统的肿瘤（例如，神经胶质瘤、星型细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、松果体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤和神经鞘瘤）；生殖种系肿瘤（例如，肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌（如小细胞肺癌、混合的小细胞和非小细胞癌、胸膜间皮瘤，包括转移的胸膜间皮瘤、小细胞肺癌和非小细胞肺癌）、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星型细胞瘤、食道癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和黑素瘤；混合类型的瘤，特别是，癌肉瘤和霍奇金氏病；以及混合起源（origin）的肿瘤，例如维尔姆斯瘤和畸胎癌等。注意，某些肿瘤包括肝细胞和子宫癌等展示了特别在癌细胞上的MET受体的增强水平，这些肿瘤是本发明实例的组合物和治疗方法的主要目标，这些组合物和治疗方法包括复合到原始细胞的MET结合肽。
[0118] 术语“组合给药”（coadminister）和“组合给药”（coadministration）是同义词，描述的是本发明至少一种原始细胞组合物与至少一种其他试剂，通常至少一种其他的抗癌剂（本文另有描述）组合性给药，在此公开在相同时间或大约相同时间被认为是有效量的量或者浓度。虽然优选同时进行组合物/试剂的组合给药，试剂还可分次（at times）进行给药，使得有效浓度的两种（或更多）组合物/试剂同时在患者体内出现至少一小段时间。或者，在本发明某些方面，每种组合给药的组合物/试剂可在不同时间在患者体内展示出其抑制效果，最终结果是抑制和治疗癌症，尤其包括肝细胞癌或细胞癌，以及减少或抑制其他疾病状态、病症或并发症。当然，如果不仅仅出现疾病状态、感染或其他病症，本发明化合物可根据需要结合其他试剂以治疗其他感染或疾病或病症。
[0119] 术语“抗癌剂”是用于描述一化合物，其可与一种或多种包含本发明原始细胞的组合物一起配制，且可选地，治疗任何类型癌症，尤其是肝癌或宫颈癌等。能与本发明化合物配制的抗癌化合物包括，例如用于本发明的典型的抗癌剂包括，依维莫司、曲贝替定、紫杉醇蛋白质结合颗粒注射悬液（abraxane）、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244（ARRY-142886）、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD1152、enzastaurin、凡德他尼（vandetanib）、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗-HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检测点-1或2抑制剂、粘附斑激酶抑制剂、Map激酶激酶（mek）抑制剂、VEGF捕获抗体、培美曲塞、埃罗替尼、达沙替尼（dasatanib）、尼罗替尼、德卡坦尼（decatanib）、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、洛拉曲克（nolatrexed）、azd2171、巴他布林（batabulin）、奥法木单抗、扎木单抗、伊朵堤卡林（edotecarin）、粉防己碱、鲁吡替康（rubitecan）、替米利芬、奥利默森（oblimersen）、ticilimumab、易普利姆玛（Ipilimumab）、棉酚、Bio111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO140、CC8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、维特斯潘（vitespan）、Rta744、Sdx102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr311、罗咪酯肽、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他（vorinostat）、依托泊苷、吉西他滨、阿霉素、阿霉素脂质体、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、塞利西利（seliciclib）；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-（2-氨基-4,7-二氢-4-氧-1H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基）乙基]苯甲酰]-、二钠盐、七水合
物、喜树碱、PEG标记的伊立替康、三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES（乙烯雌酚）、雌甾二醇、雌激素、雌激素缀合物、贝伐单抗、IMC-1C11、CHIR-258、
3-[5-（甲基磺酰基哌啶基甲基）-吲哚-喹诺酮、瓦他拉尼（vatalanib）、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser（But）6,Azgly10] 的 醋 酸 盐（pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser（But）-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2醋酸盐[C59H84N18Oi4-（C2H4O2）x，其中，x=1到2.4]、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特（nilutamide）、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、埃罗替尼、拉帕替尼、卡拉替尼（canertinib）、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、Ionafarnib、BMS-214662、替吡法尼；阿米福汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酸酶、卡介苗（BCG）、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素D、道诺霉素、乙烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫（gleevac）、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特（nilutamide）、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠（porfimer）、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、维甲酸、长春地辛、13-顺式视黄酸、苯丙氨酸氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷（5-deooxyuridine）、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春花碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥单抗、白介素融合毒素（denileukin diftitox）、吉非替尼、硼替佐米（bortezimib）、紫杉醇、不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬（pipendoxifene）、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、吲哚昔酚（idoxifene）、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-O-（2-羟乙基）-雷帕霉素、西罗莫司（temsirolimus）、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779、450、PEG-非格司亭、达贝泊汀（darbepoetin）、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸、强的松、西妥昔单抗、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酸酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替伊莫单抗（ibritgumomab tiuxetan）、雄激素、地西他滨、六甲嘧胺、蓓萨罗丁、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、柔红霉素脂质体、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基强的松龙、普鲁氯嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、ss非格司亭（pegfilgrastim）、红细胞生成素、依泊汀α、达贝泊汀α和它们的混合物。
物、喜树碱、PEG标记的伊立替康、三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES（乙烯雌酚）、雌甾二醇、雌激素、雌激素缀合物、贝伐单抗、IMC-1C11、CHIR-258、
3-[5-（甲基磺酰基哌啶基甲基）-吲哚-喹诺酮、瓦他拉尼（vatalanib）、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser（But）6,Azgly10] 的 醋 酸 盐（pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser（But）-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2醋酸盐[C59H84N18Oi4-（C2H4O2）x，其中，x=1到2.4]、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特（nilutamide）、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、埃罗替尼、拉帕替尼、卡拉替尼（canertinib）、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、Ionafarnib、BMS-214662、替吡法尼；阿米福汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酸酶、卡介苗（BCG）、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素D、道诺霉素、乙烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫（gleevac）、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特（nilutamide）、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠（porfimer）、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、维甲酸、长春地辛、13-顺式视黄酸、苯丙氨酸氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷（5-deooxyuridine）、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春花碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管抑素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥单抗、白介素融合毒素（denileukin diftitox）、吉非替尼、硼替佐米（bortezimib）、紫杉醇、不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬（pipendoxifene）、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、吲哚昔酚（idoxifene）、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-O-（2-羟乙基）-雷帕霉素、西罗莫司（temsirolimus）、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779、450、PEG-非格司亭、达贝泊汀（darbepoetin）、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸、强的松、西妥昔单抗、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酸酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替伊莫单抗（ibritgumomab tiuxetan）、雄激素、地西他滨、六甲嘧胺、蓓萨罗丁、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、柔红霉素脂质体、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基强的松龙、普鲁氯嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、ss非格司亭（pegfilgrastim）、红细胞生成素、依泊汀α、达贝泊汀α和它们的混合物。
[0120] 术语“抗肝细胞癌剂”在整个说明书中用来描述一种抗癌剂，其可用于抑制、治疗或减少肝细胞癌或该癌症转移的可能性。用于本发明的抗癌剂包括例如，多吉美（索拉非尼）、舒尼替尼、贝伐单抗、特罗凯（埃罗替尼）、泰克泊（拉帕替尼）或它们的混合物。另外，其它抗癌剂也可以用于本发明，这类试剂能抑制癌症转移，特别是肝细胞癌的转移。
[0121] 术语“抗病毒剂”是用于描述生物活性剂/药物，其抑制病毒生长和/或加工，病毒包括突变株如耐药性病毒菌株。优选的抗病毒剂包括抗HIV剂、抗HBV剂和抗HCV剂。在本发明某些方面，尤其是以治疗肝癌为治疗对象中，考虑到乙型肝炎B病毒（HBV）和/或乙型肝炎C病毒（HCV）经常作为与肝细胞癌相关的原发或继发感染或疾病状态被发现，包含抗乙型肝炎C剂或抗乙型肝炎B剂时可结合其他传统的抗癌剂以有效治疗。抗HBV剂可用于本发明中，作为原始细胞中的货物组分或者在包括原始细胞群的药物组合物中作为另外的生物活性剂，该抗HBV剂包括试剂例如贺维力（阿德福韦酯）、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、恩曲他滨、克拉夫定、伐托他滨、氨多索韦、帕拉德福韦、racivir、BAM205、硝唑尼特、UT231-B、Bay41-4109、EHT899、日达仙（胸腺素α-1）和它们的混合物。用于本发明的典型的抗HCV剂包括试剂，例如，波西普韦（boceprevir）、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100、NM283、VX-950（特拉普韦（telaprevir））、SCH50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191（R7227）、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS-9190、GS9256、GS9451、GS5885、GS6620、GS9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040（MVA-HCV）、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GNI-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI201335、BI207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PSI-938、PSI-7977、PSI-7851、SCY-635、病毒唑、聚乙二醇化干扰素、PHX1766、SP-30和它们的混合物。
[0122] 术语“抗HIV剂”是指一化合物，其抑制HIV病毒（I和/或II）或其突变株的生长和/或加工。可作为本发明原始细胞中的货物的用于本发明的的典型的抗HIV剂包括，例如，包括核苷酸逆转录酶抑制剂（NRTI）、其他非核苷酸逆转录酶抑制剂（即并非本发明代表性的那些）、蛋白酶抑制剂和融合抑制剂等，其示例性化合物可包括例如，3TC（拉米夫定）、AZT（齐多夫定）、（-）-FTC、ddI（地达诺新）、ddC（扎西他滨）、阿巴卡韦（ABC）、替诺福韦（PMPA）、D-D4FC（Reverset）、D4T（司他夫定）、Racivir、L-FddC、L-FD4C、NVP（奈韦拉平）、DLV（地拉夫定）、EFV（依法韦仑）、SQVM（甲磺酸沙奎那韦）、RTV（利托那韦）、IDV（茚地那韦）、SQV（沙奎那韦）、NFV（奈非那韦）、APV（安瑞那韦）、LPV（洛匹那韦），融合抑制剂如T20等等，fuseon以及它们的混合物。
[0123] 术语“靶向活性种类物质”用于描述化合物或部分，其复合或优选共价结合到本发明的原始细胞表面，其结合到待靶向细胞表面部分，使得原始细胞可选择性结合到靶细胞表面并将其内含物放置到细胞内。在本发明中使用的靶向活性种类物质优选是结合到靶细胞的靶向肽（在本文另有描述）、包括抗体或抗体片段的多肽、核酸配体或碳水化合物等。
[0124] 术语“靶向肽”是用于描述优选的靶向活性种类物质，其是结合到癌细胞的受体或其他多肽的特定序列的肽，其能使本发明原始细胞靶向到特定细胞，该特定细胞表达与靶向肽结合的肽（其是受体或其他功能性多肽）。在本发明中，示例性靶向肽包括例如SP94游离肽（H2N-SFSIILTPILPL-COOH，SEQ ID NO:6）、用于与交联剂缀合的C末端半胱氨酸修饰的SP94肽（H2N-SFSIILTPILPLGGC-COOH，SEQ ID NO:7）、修饰的SP94肽（H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH，SEQ ID NO:8）或MET结合肽，本文另有描述。其他靶向肽在本领域内是众所周知的。靶向肽可复合或优选地通过使用交联剂共价结合到脂双层，本文另有描述。
[0125] 术语“MET结合肽”或“MET受体结合肽”是五（5）种7-mer肽，其在癌细胞表面结合MET受体，具有增强的结合效率。根据本发明，确定了具有不同氨基酸序列的几种小肽，其以不同特异性水平结合MET受体（又称为肝细胞生长因子受体，由c-MET基因表达），并以不同的能力激活MET受体信号通路。用噬菌体展示生物淘选技术确定了7-mer肽，用获得的序列的实例证明了与MET受体从而与细胞如癌细胞的增强的结合性，该癌细胞（例如肝癌、卵巢癌和宫颈癌）表达高水平的MET受体，如下所示。在生物淘选过程中，几种最常观察到的序列的结合数据也呈现在本发明的实例部分。这些肽作为靶向配体用于细胞特异性治疗是特别有用的。但是，能够激活受体通路的肽本身或与其他治疗方法结合可具有另外的治疗价值。发现很多肽不仅结合肝细胞癌（其为原定靶标），也可以结合到大量其他癌症包括卵巢癌和宫颈癌。在靶向或治疗各种与MET和相关受体表达相关的癌症和其他生理问题中，这些肽被认为具有广泛的适用性。
[0126] 以下五种7mer肽序列显示了与MET受体的实质性结合，在作为靶向肽用于本发明的原始细胞时尤其有用。
[0127]
[0128] 这些肽中的每一个可单独使用或与上述组中的其他MET肽或其他靶向肽一起使用，这些靶向肽有助于将本发明实例的原始细胞结合到癌细胞上，癌细胞包括肝癌细胞、卵巢癌细胞和宫颈癌细胞，以及其他许多癌细胞。这些结合肽也可作为MET结合肽单独用于药物化合物中，以治疗癌症或抑制肝细胞生长因子结合。
[0129] 术语“融合肽”和“内体裂解肽”同义用于描述肽，该肽可选并优选交联到本发明原始细胞的脂双层表面。融合肽纳入到原始细胞上以便于或有助于从内体本体（endosomal bodies）逃逸并便于将原始细胞引入到靶向细胞中以产生预期结果（治疗和/或诊断，本文另有描述）。用于本发明原始细胞的代表性和优选的融合肽包括H5WYG肽、H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH（SEQ ID NO:13）或8mer多聚精氨酸（H2N-RRRRRRRR-COOH，SEQ ID NO:14），以及其它本领域中的已知肽。
[0130] 术语“交联剂”是用于描述包含两个不同功能基团的不同长度的双功能化合物，其可用于将本发明的各种组分相互共价连接。本发明交联剂可包括两个亲电基团（以与寡核苷酸肽上的亲核基团反应，一个亲电基团和一亲核基团或者两个亲核基团）。交联剂长度可以不同，取决于待连接的组分和所需的相对灵活性。交联剂用于将靶向肽和/或融合肽锚定到磷脂双层上，用于将核定位序列连接到组蛋白来用于包装超螺旋质粒DNA，在某些实例中，用于交联原始细胞脂双层中的脂质。有大量交联剂可用于本发明，许多可以在市场上买到或者在文献中找到。用于本发明的优选的交联剂包括，例如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐（EDC）、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸盐（SMCC）、N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼（BMPH）、NHS-（PEG）n-马来酰亚胺、琥珀酰亚胺-[N-马来酰亚胺基丙酰氨基）-二十四乙二醇]酯（SM（PEG）24），以及琥珀酰亚胺6-[3′-（2-吡啶二硫代）-丙酰胺基]己酸盐（LC-SPDP）等等。
[0131] 如上详述的，本发明的多孔纳米颗粒核心可包括至少具有一种尺寸的多孔纳米颗粒，例如宽度或直径为约3000nm或更小、约1000nm或更小、约500nm或更小、约200nm或更小。优选地，纳米颗粒核心是球形的，优选直径为约500nm或更小，更优选为约8-10nm至约200nm。在实例中，多孔颗粒核心可具有各种不同的横截面，包括圆形、矩形、正方形或任意其他形状。在某些实例中，多孔颗粒核心具有的孔的平均孔径为约2nm-约30nm，但是根据本发明教导的各种实例，平均孔径和其他属性（例如多孔颗粒核心的孔隙度）并不受限。
[0132] 一般而言，本发明的原始细胞是生物相容的。药物和其他货物组分的装载通常是通过吸附和/或毛细管灌注（capillary filling）到颗粒核心的孔中，其重量可高达最终原始细胞（包含所有组分）的约50%。在本发明的某些实例中，装载好的货物可从颗粒核心的多孔表面（介孔）释放，其中释放规律可通过例如孔尺寸、多孔颗粒核心的表面化学、系统pH值和/或多孔颗粒核心和本文通常描述的周围脂双层的相互作用来确定或调节。
[0133] 在本发明中，用于制备原始细胞的多孔纳米颗粒核心可调整为亲水的或者越来越疏水的（本文另有描述），并可进一步处理成提供一更亲水的表面。例如，介孔二氧化硅颗粒可进一步用氢氧化铵和过氧化氢处理，以提供更高的亲水性。在本发明优选方面，脂双层融合到多孔颗粒核心上以形成原始细胞。本发明的原始细胞可包括各种重量比的各种脂质，优选包括1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DOPC）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DPPC）、1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DSPC）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-[磷酸-L-丝氨酸]（DOPS）、1,2-二油酰-3-三甲胺-丙烷（18:1DOTAP）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-二氧膦基-（1'-rac-甘油）（DOPG）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（18:1PEG-2000PE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（16:0PEG-2000PE）、1-油酰-2-[12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰]-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（18:1-12:0NBD PC）、1-棕榈酰-2-{12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰}-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（16:0-12:0NBD PC）、胆固醇及它们的混合物/组合。
[0134] 用于制备本发明原始细胞的脂双层可通过使用孔径为例如约100nm的过滤器挤出水化脂质膜制备，其使用本领域已知的标准方案或本文另有描述。然后，过滤后的脂双层膜与多孔颗粒核心融合，例如，通过吸管混合。在某些实例中，可使用过量的脂双层或脂双层膜形成原始细胞，以改善原始细胞的胶体稳定性。
[0135] 在某些诊断实例中，各种染料或荧光（报告子）分子可包括在原始细胞货物中（或者通过质粒DNA表达）或附到多孔颗粒核心和/或脂双层上，用于诊断目的。例如，多孔颗粒核心可以是二氧化硅核心或脂双层，并能够用FITC（绿色荧光）共价标记，而脂双层或颗粒核心能够用FITC德克萨斯红（红色荧光）共价标记。然后，多孔颗粒核心、脂双层和形成的原始细胞能够通过例如共聚焦荧光技术观测到，用于诊断应用。另外，如本文讨论的，质粒DNA能用作本发明原始细胞中的货物，使得质粒可表达一种或多种荧光蛋白，如荧光绿蛋白或荧光红蛋白，其可用于诊断应用。
[0136] 在多种实例中，原始细胞用在协同系统中，其中装载有脂双层融合物或脂质体融合物（即在多孔颗粒核心上），并用各种具有颗粒核心孔（介孔）的货物组分密封，因而形成一装载的原始细胞，可用于货物运输跨过脂双层的细胞膜，或者如果适用，可通过溶解多孔纳米颗粒运输货物。在某些实例中，除了融合单个脂双层（例如磷脂双层），具有相反电荷的多个双层能够相继融合到多孔颗粒核心上以进一步影响货物装载和/或密封以及最终的原始细胞的释放特性。
[0137] 融合或协同装载机制可用于货物运输。例如，通过多孔颗粒上的脂质体融合，货物可协同装载、封装或密封。货物可包括例如，小分子药物（例如，尤其包括抗癌药物和/或抗病毒药物如抗HBV或抗HCV药物）、肽、蛋白、抗体、DNA（尤其是质粒DNA，包括优选的组蛋白包装的超螺旋质粒DNA）、RNA（包括shRNA和siRNA（其也可通过作为货物进入到原始细胞内的质粒DNA表达）、荧光染料，包括荧光染色肽，其可通过进入到原始细胞内的质粒DNA表达。
[0138] 根据本发明实例，货物可装载进多孔颗粒核心的孔（介孔）中，以形成装载的原始细胞。在各种实例中，任何开发用于基于脂质体药物运输的传统技术，能够转移和应用到本发明原始细胞上，例如使用PEG修饰的靶向运输。
[0139] 如上所讨论的，静电和孔径在货物装载中发挥作用。例如，多孔二氧化硅纳米颗粒可携带负电荷，而孔径能够在约2nm至约10nm之间调节。带有负电荷的纳米颗粒具有吸附带正电荷的分子的自然倾向，而带正电荷的纳米颗粒具有吸附带负电荷的分子的自然倾向。在各个实例中，其他属性例如表面可湿润性（例如疏水性）也能影响具有不同疏水性的货物的装载。
[0140] 在多个实例中，通过调整脂质的组成，货物装载可以是脂质辅助的协同装载。例如，如果货物组分是一带负电荷分子，可通过脂质辅助装载，将货物装载进带负电荷的二氧化硅中。例如，在某些实例中，当脂双层融合到二氧化硅表面上，带负电的物质能够作为货物装载进带负电二氧化硅颗粒的孔中，显示出融合和协同装载机制。用这种方式，带非负电荷（即带正电荷或不带电）的脂双层或脂质体在带负电荷的介孔颗粒上的融合能够用于将带负电荷的货物组分装载到颗粒核心。带负电荷的货物组分能够在已装载的原始细胞中浓缩，与在溶液中的带电的货物组分相比，其浓度超过约100倍。在其他实例中，通过改变介孔颗粒的电荷和脂双层，带正电荷的货物组分可较容易地装载进原始细胞中。
[0141] 一旦生成，装载后的原始细胞能进行细胞摄入，用于在给药后将货物运输进所需位点内。例如，可用装载货物的原始细胞对患者或对象进行给药，包含靶向肽的原始细胞能结合到靶细胞，并被靶细胞例如对象或患者体内的癌细胞内化或摄入。由于装载货物的原始细胞在靶细胞内的内化作用，货物组分接着能运输到靶细胞内。在某些实例中，货物是小分子，其可直接运输到靶细胞中用于治疗。在其他实例中，带负电的DNA或RNA（包括shRNA或siRNA），尤其包括DNA质粒，能够直接运输到靶细胞并被其内化，该DNA质粒优选是组蛋白包装的超螺旋质粒DNA，并优选用核定位序列修饰。因此，DNA或RNA能首先装载进原始细胞中，然后进入靶细胞，然后通过装载后的原始细胞的内化通过靶细胞。
[0142] 如前所述，装载进原始细胞，并通过其运输到靶细胞的货物包括小分子或药物（尤其是抗癌剂或抗HBV和/或抗HCV剂）、生物活性大分子（生物活性多肽例如蓖麻毒素A链或者白喉毒素A链或RNA分子如shRNA和/或siRNA，本文另有描述）或组蛋白包装的超螺旋质粒DNA，其能表达治疗性或诊断性肽，或治疗性RNA分子如shRNA或siRNA，其中组蛋白包装的超螺旋质粒DNA可选并优选用核定位序列修饰，该序列能够定位并使运输到靶细胞核内的质粒DNA浓缩。像这样，装载后的原始细胞能将其货物运输进靶细胞内用于治疗或诊断。
[0143] 在本发明多种实例中，原始细胞和/或装载后的原始细胞能提供一靶向运输方法，用于将原始细胞或货物组分选择性运输到靶细胞（如癌细胞）内。例如，一脂双层表面能通过与靶细胞相应的靶向活性种类物质修饰。靶向活性种类物质可以是一靶向肽（在本文另有描述）、一包括抗体或抗体片段的多肽、一核酸配体或碳水化合物或结合到靶细胞的其他部分。在本发明优选方面，靶向活性种类物质是一本文另有描述的靶向肽。在某些实例中，优选的肽靶向活性种类物质包括MET结合肽，在本文另有描述。
[0144] 例如，通过在装载后的原始细胞的表面上提供靶向活性种类物质（优选为靶向肽），按照本发明教导，原始细胞选择性结合到靶细胞上。在一个实例中，通过将靶向癌细胞（包括肝癌细胞）的示范性靶向肽SP94或类似物或MET结合肽（本文另有描述）与脂双层结合，由于示范性SP94或MET结合肽对癌（包括肝癌）细胞的特异性靶向，大量装载货物的原始细胞能被这种特异性癌细胞识别和内化。在大多数情况下，如果原始细胞与靶向肽结合，该原始细胞将选择性结合到癌细胞，并且没有明显的结合到非癌细胞。
[0145] 一旦被靶细胞结合和摄入，装载后的原始细胞能从多孔颗粒释放货物组分并将释放的货物组分运输到靶细胞。例如，被多孔颗粒核心上脂质体融合双层密封在原始细胞内的货物组分能够从脂双层的孔中释放，运输跨过脂双层的原始细胞膜，并运输到靶细胞内。在本发明实例中，与只是用本领域已知的脂质体相比，货物组分在原始细胞中的释放规律更加可控。货物释放可通过例如多孔核心和脂双层之间的相互作用，和/或其他参数例如系统pH值确定。例如，货物的释放可通过脂双层，可通过多孔二氧化硅的溶解实现；而货物从原始细胞的释放可以是pH依赖的。
[0146] 在某些实例中，货物pH值通常小于7，优选约4.5至约6.0，但可以是约pH14或更少。与高pH相比，较低的pH往往明显有利于货物组分的释放。较低的pH往往是有利的，这是因为大多数细胞内的内体隔间的pH较低（约5.5），但是货物在细胞内的运输速率可被货物pH影响。取决于货物和货物从原始细胞释放的pH，货物可释放较短时间（几小时到大约一天）或在从几天到约20-30天或更长的时间跨度内释放。因此，本发明可从原始细胞本身提供立即释放和/或持续释放的应用。
[0147] 在某些实例中，可包括表面活性剂以快速使脂双层破裂，将货物组分运输通过原始细胞脂双层以及靶细胞。在某些实例中，能够通过应用/释放表面活性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）等，使原始细胞的磷脂双层破裂，以促进货物从原始细胞快速释放到靶细胞内。在某些实例中，脂双层的破裂能反过来引起货物组分从原始细胞颗粒核心的孔中立即和完全释放。在这种方式中，与本领域其他运输系统相比，原始细胞平台可提供多功能的运输系统。例如，与只使用纳米颗粒的运输系统相比，本发明公开的原始细胞平台能提供一简单系统并利用了脂质体或脂双层的低毒性和免疫原性，以及它们能够进行PEG修饰或结合以延长循环时间并产生靶向作用的能力。在另一实例中，与只使用脂质体的运输系统相比，原始细胞平台能提供一更稳定系的统并能利用介孔控制装载和/或释放规律。
[0148] 另外，脂双层和其在多孔颗粒核心上的融合能够进行微调以控制装载、释放和靶向规律，并能进一步包含融合肽和相关肽以促进原始细胞的运输，用于获得更好的治疗和/或诊断效果。进一步，原始细胞的脂双层能提供一流动界面，用于配体展示和多价靶向，由于在流动脂质界面上的配体识别能力，其能够在相对较低表面配体密度下进行特异性靶向。而且，本发明公开的原始细胞可容易地进入靶细胞，而没有多孔颗粒支撑的空脂质体不能被细胞内化。
[0149] 本发明的药物组合物包含有效的原始细胞群（本文另有描述），制备该细胞群以产生预期的结果（例如，治疗结果和/或诊断分析，包括治疗监测），并结合药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂。在组合物群中的原始细胞可以是相同或不同的，这取决于想要获得的结果。本发明的药物组合物也可包含另外的生物活性剂或药物，例如抗癌剂或抗病毒剂，例如，抗HIV、抗HBV或抗HCV剂。
[0150] 一般地，复合物（compound）的给药剂量和方式是根据标准药学操作，按照对象的大小和状况来确定的。采用的剂量水平可以很广泛，并且本领域技术人员可容易地确定。通常，采用毫克到克的量。可以通过多种方式来对患者给药组合物，例如，口服、经皮、神经外膜下（perineurally）或胃肠外给药，即静脉注射、皮下注射、腹腔注射、鞘内注射或肌肉注射等，包括口腔给药、直肠给药和经皮给药。本发明的方法可治疗的设想的对象包括人类、宠物、实验动物等。本发明设想立即和/或持续性/可控释放组合物，包括同时包含立即和持续释放制剂的组合物。当不同原始细胞群用于该药物组合物时或当生物活性剂结合一种或更多原始细胞群（本文另有描述）时尤其如此。
[0151] 本发明的包含复合物的配方可以是液体、固体、半固体或冻干粉形式，例如，溶液、悬浮液、乳液、持续释放制剂、药丸、胶囊、粉末、栓剂、乳剂、软膏、洗剂、气雾剂、贴剂等等，最好是以适合精确剂量的简单给药的单位剂量形式。
[0152] 本发明药物成分通常包括一传统药物载体或赋形剂，并可另外包括其他药剂、载体、佐剂、添加剂等。最好是，组合物占本发明复合物重量的约0.1%至约85%、大约0.5%至约75%，剩下的主要是合适的药物赋形剂。
[0153] 用于肠胃外给药（例如静脉、肌肉、鞘内）的可注射组合物通常包括在合适的i.v.溶液例如无菌生理盐水中的复合物。组合物也可作为水乳浊液的悬浮液制备。
[0154] 可将原始细胞群（约0.5%至约20%重量或更多）和可选的药物佐剂溶解或分散在载体例如盐溶液、葡萄糖溶液、甘油或乙醇中从而形成溶液或悬浮液来制备液体组合物。用于口服液体制剂，组合物可制备成溶液、悬浮液、乳液或糖浆，通过液体形式或适合在水或生理盐水中水化的干物质形式提供。
[0155] 用于口服时，这类赋形剂包括药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。如果需要，组合物还可包含少量非毒性辅助物质，如湿润剂、乳化剂或缓冲液。
[0156] 当组合物使用固体制剂形成进行口服给药时，制剂可以是药片、颗粒、粉末、胶囊等。在药片制剂中，组合物通常用添加剂制备，添加剂例如赋形剂如糖类或纤维素制剂、粘合剂如淀粉糊或甲基纤维素、填充剂、崩解剂或其他通常用于医药制剂制备的添加剂。
[0157] 用于制备这些剂量形式的方法是已知的，或对于本领域技术人员是显而易见的；例如，见Remington's Pharmaceutical Sciences（《雷明登氏药学全书》）（17th Ed.,Mack Pub.Co.,1985）。待给药的组合物含药学上有效量的定量的选定复合物，用于在生物系统包括本发明的患者或对象中进行治疗。
[0158] 治疗有需要的患者或对象的特定疾病状态或感染（特别是包括癌症和/或HBV、HCV或HIV感染）的方法，包括给予一有效量的药物组合物，根据本发明，该组合物包含治疗性原始细胞和可选的至少一种另外的生物活性（如抗病毒）剂。
[0159] 本发明的诊断方法包括给予需要的患者（疑似患有癌症的患者）一有效量的诊断性原始细胞群（如包含靶向种类物质例如选择性结合到癌细胞的靶向肽和指示原始细胞结合到癌细胞（癌细胞存在时）的报告子组分的原始细胞），因此，原始细胞结合到癌细胞，如由报告子组分（部分）证实的，其能够诊断患者体内癌症的存在。
[0160] 本发明诊断方法的替代法可用于监测患者体内癌症或其他疾病状态的治疗，该方法包括在治疗前给予患者或对象一有效量的诊断性原始细胞群（例如，包含靶向种类物质例如选择性结合到癌细胞或其他靶细胞的靶向肽和指示原始细胞结合到癌细胞（癌细胞存在时）的报告子组分的原始细胞），确定诊断性原始细胞结合到所述患者体内靶细胞的水平，在治疗过程中和/或之后，确定诊断性原始细胞结合到所述患者体内靶细胞的水平，因此，在开始治疗之前和治疗过程中和/或之后的结合差异能证实在患者体内治疗的有效性，包括患者是否完全治愈或者疾病状态是否被抑制或消除（包括缓解癌症）。
[0161] 以下的非限制性实例用于阐明本发明及其优势，在任何情况下不应看做对本公开内容或权利要求的限制。在该实例中，以及本申请的其他地方，所有部分和百分率都按重量计，除非另有说明。
[0162] 实例
[0163] 如下面实例所提供的，通过将脂质体和纳米多孔二氧化硅颗粒融合而形成的多孔纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）是一种新型纳米载体，其解决了与癌症治疗和诊断的靶向运输有关的多个难题。像脂质体那样，原始细胞是生物相容的、可生物降解的以及非免疫原性的，但是与相似尺寸的脂质体运输剂相比，原始细胞的纳米多孔二氧化硅核心提供了大幅增强的货物容量和延长的脂双层稳定性。而且，核心的多孔性和表面化学能够被调节从而促进多种治疗剂，如药物、核酸和蛋白毒素的封装。货物的释放速率可以通过孔尺寸和二氧化硅浓缩（condensation）的整体程度进行控制，使得原始细胞在需要突发或可控的药物释放特征的应用中非常有用。最后，原始细胞的支撑脂双层（SLB）能够用配体进行修饰，从而促进选择性运输，以及用PEG修饰从而延长循环时间。在实例中，发明人报告了多肽靶向原始细胞的使用以实现高特异性运输质粒，该质粒编码小发夹RNA（shRNA），其通过使细胞周期蛋白B1表达沉默，从而诱导被转染细胞的生长停滞和凋亡。如在下述实例部分所陈述的，发明人已使用双表面活性剂方法制备合成的二氧化硅纳米颗粒，其具有足够大的孔来容纳组蛋白包装的质粒。非离子表面活性剂（ F-127）在与膨胀剂（1,3,5-三甲基苯）结合使用时，其作为大孔的模板，而氟碳表面活性剂（FC-4）促进了二氧化硅核心的生长。获得的颗粒直径为约100nm-300nm，并包含具有17.3nm孔入口的20nm孔的有序网络。超螺旋质粒DNA用组蛋白包装，获得的复合物（直径约15nm）在装载进二氧化硅核心之前用核定位序列（NLS）修饰。在37℃下，封装的DNA暴露在模拟体液中时，脂质体与纳米多孔核心的融合促进了封装的DNA的长期保留（>1个月）。利用噬菌体展示，发明人确定了对肝细胞生长因子受体（c-Met）具有纳摩尔亲和力的靶向肽，已知肝细胞生长因子受体被各种类型肝细胞癌（HCC）过度表达。装载有DNA-组蛋白-NLS复合物并用每种240拷贝（"240copies）的靶向肽和融合肽修饰的原始细胞能够转染分裂和非分裂的HCC；该融合肽促进原始细胞和封装的DNA的内体逃逸。此外，靶向原始细胞有效诱导HCC的GJM期生长停滞和凋亡（LC,,=25nM）而不会影响非癌细胞，包括肝细胞、内皮细胞和免疫细胞（PBMCs、B细胞和T细胞）的活力。
[0164] 方法
[0165] 使用气溶胶辅助挥发诱导自组装方法（EISA）或在油包水（water-in-oil）乳滴中使用溶剂抽提驱动自组装法1，由水溶性二氧化硅前体和两性表面活性剂的均质混合物制备出形成原始细胞核心的纳米二氧化硅颗粒，如前文所述1,2（也见Ashley,et al.,Nature Materials,2011,May;10（5）:389-97）。溶剂蒸发或抽提浓缩了表面活性剂中的气溶胶或乳滴，该气溶胶或乳滴引导了周期性的有序的结构的形成，二氧化硅在该结构周围聚集和浓缩。表面活性剂通过加热锻烧去除，获得具有明确的、统一孔径和拓扑结构的多孔纳米颗粒。通过气溶胶辅助的EISA形成的颗粒（“单峰”颗粒）具有约120nm的平均直径（在基于尺寸排除的分离之后），其Brunauer-Emmer-Teller（BET）比表面积超过1200m2/g，孔体积分率（fraction）为约50%，以及具有一直径为2.5nm的单峰孔。在乳滴中形成的颗粒（“多2
峰”颗粒）具有约150nm的平均直径（在基于尺寸排除的分离之后），>600m/g的BET比表面积，约65%的孔体积分率，和多峰孔结构，该多峰孔结构由大的（20-30nm）、表面可进入的孔（通过6-12nm孔互连）构成。与气溶胶或乳液处理（分别）相关的液体-蒸气或液-液界面张力使得球面具有最小的表面粗糙度。此外，这两种类型的颗粒，具有完全可以进入的三维孔隙网络，通过氮吸附等温线分析证明了这一点。
峰”颗粒）具有约150nm的平均直径（在基于尺寸排除的分离之后），>600m/g的BET比表面积，约65%的孔体积分率，和多峰孔结构，该多峰孔结构由大的（20-30nm）、表面可进入的孔（通过6-12nm孔互连）构成。与气溶胶或乳液处理（分别）相关的液体-蒸气或液-液界面张力使得球面具有最小的表面粗糙度。此外，这两种类型的颗粒，具有完全可以进入的三维孔隙网络，通过氮吸附等温线分析证明了这一点。
[0166] 大的孔体积、表面积和二氧化硅核心的可进入性赋予了一大的货物容量并能够快速装载多种类型的治疗和诊断剂。单峰纳米多孔核心容纳低分子量化学治疗剂的容量大；而多峰核心拥有大的表面可进入的孔，其在封装siRNA、蛋白质毒素和其它高分子量货物（例如质粒DNA）时是必需的。通过二氧化硅核心的浓缩程度可精确控制货物释放速率。将各种数量的AEPTMS、一含氨基的硅烷纳入到用于形成纳米多孔二氧化硅核心的溶胶中，降低了可实现的浓缩水平并促进了核心在中性pH、高离子强度（即细胞质基质的）条件下更快速的溶解。不包含AEPTMS的颗粒在模拟体液中超过两周之后溶解，而包含30mol%AEPTMS的颗粒在24小时之内溶解。因此，原始细胞可被调整用于需要持续性或突发性释放特征的应用中。
[0167] 将AEPTMS纳入到用于形成纳米二氧化硅颗粒的前体溶胶中，在细胞质条件下加速了颗粒溶解并促进了封装货物更快速的释放（与通过简单溶解实现的释放相比）。AEPTMS修饰的颗粒还对于弱碱性化学治疗药物（如阿霉素）容量减小。因此，为了最大程度地提高容量和细胞内释放，我们描述了zeta电位、货物（例如药物（阿霉素/DOX）/化疗）容量、硅溶解速率和货物释放率作为AEPTMS浓度的函数。如先前所表明的那样，没有修饰的单峰颗10
粒（ζ=-104.5±5.6）货物容量大（在DOX的情况下，约1.8mM/10 颗粒），但在24h内（即典型的HCC翻倍时间）只释放封装货物（药物）的20%。相反，用30wt%AEPTMS（ζ=88.9±5.5）修饰的单峰颗粒在6小时内释放所有的封装货物（药物），但具有减少的药物（DOX）容量（约
10
0.15mM/10 颗粒）。含15wt%AEPTMS（ζ=-21.3±5.1）的单峰颗粒保留了较高的药物（DOX）
10
容量（约1.1mM/10 颗粒）并在暴露于模拟体液中时在24h内几乎释放了所有的封装货物（药物）；因此，这些颗粒被选择用于涉及货物运输的所有实验中。重要的是要注意到，尽管单峰二氧化硅颗粒的zeta电位作为AEPTMS浓度的函数增加，AEPTMS修饰的颗粒的孔体积分率（包含30wt%AEPTMS的颗粒约为45%）并没有与未修饰颗粒（约50%）有实质不同。因此，我们将AEPTMS修饰的单峰颗粒的货物容量减少归因于静电排斥而不是孔体积减少。多峰颗粒用于对照，以阐明孔径对货物容量和货物释放动力学的影响。
粒（ζ=-104.5±5.6）货物容量大（在DOX的情况下，约1.8mM/10 颗粒），但在24h内（即典型的HCC翻倍时间）只释放封装货物（药物）的20%。相反，用30wt%AEPTMS（ζ=88.9±5.5）修饰的单峰颗粒在6小时内释放所有的封装货物（药物），但具有减少的药物（DOX）容量（约
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容量（约1.1mM/10 颗粒）并在暴露于模拟体液中时在24h内几乎释放了所有的封装货物（药物）；因此，这些颗粒被选择用于涉及货物运输的所有实验中。重要的是要注意到，尽管单峰二氧化硅颗粒的zeta电位作为AEPTMS浓度的函数增加，AEPTMS修饰的颗粒的孔体积分率（包含30wt%AEPTMS的颗粒约为45%）并没有与未修饰颗粒（约50%）有实质不同。因此，我们将AEPTMS修饰的单峰颗粒的货物容量减少归因于静电排斥而不是孔体积减少。多峰颗粒用于对照，以阐明孔径对货物容量和货物释放动力学的影响。
[0168] 常用试剂
[0169] 纯乙醇、盐酸（37%）、正硅酸乙酯（TEOS、98%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，≥98%）、3-[2-（2-氨基乙基氨基）乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷）]（AEPTMS，工业级）、2-氰乙基三乙氧基硅烷（CETES，≥97%）、十六烷基三甲铵溴（CTAB，≥99%）、 -56、十二烷基磺酸钠（SDS，≥98.5%）、 X-100、十六烷（≥99%）、阿霉素盐酸盐（≥98%）、5-氟尿嘧啶（≥99%）、顺糖氨铂（II）二氯化物（顺铂，≥99.9%）,来自白喉杆菌（Corynebacterium diphtheriae）的白喉毒素、来自多孔木霉（Tolypocladium inflatum）的环胞霉素A（CsA，≥95%）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，≥99%）、人表皮生长因子、L-α-磷脂酰乙醇胺、胸苷（≥99%）、次黄嘌呤（≥99%）、牛纤维连接蛋白、牛胶原蛋白I型、明胶、大豆胰蛋白酶抑制剂（≥98%）、2-巯基乙醇（≥99%）、DL-二硫苏糖醇（≥99.5%）、二甲亚砜（≥99.9%）、pH5柠檬酸缓冲液、乙二胺四乙酸（EDTA，（99.995%）、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸（HEPES，≥99.5%）、磷酸氢二铵（≥99.99%）和 CL-4B从Sigma-Aldrich购买（圣路易斯，密苏里州）。 EM90（十六基PEG/PPG-10/1二甲聚硅氧烷）购自Evonik Industries
（德国埃森）。超纯、EM级甲醛（16%，不含甲醇）从Polysciences Inc.（沃灵顿，宾夕法尼亚州）购买。 II购自Hellma（米尔海姆、德国）。
（德国埃森）。超纯、EM级甲醛（16%，不含甲醇）从Polysciences Inc.（沃灵顿，宾夕法尼亚州）购买。 II购自Hellma（米尔海姆、德国）。
[0170] 脂质
[0171] 1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DOPC）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DPPC）、1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DSPC）、1,2-二油酰-3-三甲胺-丙烷（18:1DOTAP）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-二氧膦基-（1'-rac-甘油）（DOPG）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（18:1PEG-2000PE）、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（16:0PEG-2000PE）、1-油酰-2-[12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰]-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（18:1-12:0NBD PC）、1-棕榈酰-2-{12-[（7-硝基-2-1,3-苯并噻二唑-4-yl）氨基]月桂酰}-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（16:0-12:0NBD PC）和胆固醇购自Avanti Polar Lipids,Inc.（阿拉巴斯特，阿拉巴马州）。
[0172] 细胞系和生长培养基
[0173] 人Hep3B（HB-8064）、人类肝细胞（CRL-11233）、人外周血单核细胞（CRL-9855）、人类脐带静脉内皮细胞（CRL-2873）、T淋巴细胞（CRL-8293）、B淋巴细胞（CCL-156）、伊格尔氏最低必需培养基（EMEM）、达尔贝可氏改良伊格尔氏培养基（DMEM）、伊斯考夫氏改良达尔贝可氏培养基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）（IMDM）、RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）和1x胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶与0.53mM EDTA）从美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection）购买（ATCC；马纳萨斯、弗吉尼亚州）。BEGM Bullet试剂盒购自Lonza Group Limited（Clonetics；沃克斯维尔，马里兰州）。不含酚红的DMEM购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。
[0174] 荧光染料和显微镜用试剂
[0175] Hoechst33342（350/461）、4',6-二 甲 脒 基 -2-苯 基 吲 哚（DAPI，356/451）、TMAlexa 405羧酸、琥珀酰亚胺酯（401/421）、CellTracker Violet BMQC（415/516）、TM
CellTracker GreenCMFDA（492/517）、钙黄绿素（495/515）、Alexa 488结合膜联蛋白V（495/519）、Alexa 488山羊抗小鼠IgG（H+L）（495/519）、 AHA Alexa
488蛋白合成HCS分析（495/519）、LIVE/ 可修复绿色死细胞染色试剂盒（495/519）、TM
绿色核酸染色剂（504/523）、MitoSOX 红色线粒体超氧化指示剂（510/580）、
Alexa 532羧酸、琥珀酰亚胺酯（532/554）、碘化丙啶（535/617）、pHrodoTM琥珀酰亚胺酯（558/576）、CellTrackerTM Red CMTPX（577/602）、Texas 1,2-二十六酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（Texas DHPE，583/608）、Alexa 647酰肼（649/666）、
TM
Alexa 647羧酸、琥珀酰亚胺酯（650/668）、Ulysis Alexa 647核酸标记试
剂盒（650/670）、Alexa 647结合膜联蛋白V（650/665）、Slow Gold系列抗
荧光淬灭剂（含有或不含DAPI）、 FX信号增强剂、1X达尔贝可氏磷酸盐缓冲盐水
（D-PBS）、牛白蛋白组份V（BSA，7.5%）和转铁蛋白购自Invitrogen Life Sciences（卡尔斯TM
巴德，加州）。红色荧光蛋白（RFP，557/585）、CaspGLOW 荧光活性的半胱氨酸-天冬氨酸蛋TM
白酶3染色试剂盒（485/535）和CaspGLOW 红色活性半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶8染色试剂盒（540/570）购自BioVision,Inc.（加州的山景城）。水溶性CdSe/ZnS量子点、CZWD640（640/660）购自NN-Labs（费耶特维尔，阿肯色州）。
CellTracker GreenCMFDA（492/517）、钙黄绿素（495/515）、Alexa 488结合膜联蛋白V（495/519）、Alexa 488山羊抗小鼠IgG（H+L）（495/519）、 AHA Alexa
488蛋白合成HCS分析（495/519）、LIVE/ 可修复绿色死细胞染色试剂盒（495/519）、TM
绿色核酸染色剂（504/523）、MitoSOX 红色线粒体超氧化指示剂（510/580）、
Alexa 532羧酸、琥珀酰亚胺酯（532/554）、碘化丙啶（535/617）、pHrodoTM琥珀酰亚胺酯（558/576）、CellTrackerTM Red CMTPX（577/602）、Texas 1,2-二十六酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（Texas DHPE，583/608）、Alexa 647酰肼（649/666）、
TM
Alexa 647羧酸、琥珀酰亚胺酯（650/668）、Ulysis Alexa 647核酸标记试
剂盒（650/670）、Alexa 647结合膜联蛋白V（650/665）、Slow Gold系列抗
荧光淬灭剂（含有或不含DAPI）、 FX信号增强剂、1X达尔贝可氏磷酸盐缓冲盐水
（D-PBS）、牛白蛋白组份V（BSA，7.5%）和转铁蛋白购自Invitrogen Life Sciences（卡尔斯TM
巴德，加州）。红色荧光蛋白（RFP，557/585）、CaspGLOW 荧光活性的半胱氨酸-天冬氨酸蛋TM
白酶3染色试剂盒（485/535）和CaspGLOW 红色活性半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶8染色试剂盒（540/570）购自BioVision,Inc.（加州的山景城）。水溶性CdSe/ZnS量子点、CZWD640（640/660）购自NN-Labs（费耶特维尔，阿肯色州）。
[0176] 交联剂
[0177] 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐（EDC）、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸盐（SMCC）、N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼（BMPH）、琥珀酰亚胺-[N-马来酰亚胺基丙酰氨基）-二十四乙二醇]酯（SM（PEG）24）、琥珀酰亚胺6-[3′-（2-吡啶二硫代）-丙酰胺基]己酸盐（LC-SPDP）以及巯基添加试剂盒购自Pierce Protein Research Products（Thermo Fisher Scientific LSR；罗克福德，伊利诺伊州）。
[0178] 其他硅纳米微粒
[0179] 5nm以下硅纳米颗粒从Melorium Technologies,Inc.购买（罗切斯特，纽约）。10-20nm二氧化硅纳米颗粒从SkySpring Nanomaterials,Inc.购买（得克萨斯州的休斯顿）。30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm和10μm二氧化硅颗粒从Discovery Scientific,Inc.购买（不列颠哥伦比亚省的温哥华）。
[0180] 合成的siRNA和肽
[0181] 沉 默 子（Silencer）选 择 siRNAs（EGFR、VEGFR-2 和PDGFR-α 的 siRNA 标识部分分别为s565、s7824和s10234）购自Ambion,Inc.（德克萨斯州奥斯汀）。具有5’氨基修饰剂C12的双链DNA寡核苷酸（5’-AAACATGTGGATTACCCATGTC-3’）购
自Integrated DNATechnologies（IDT；科勒尔维尔，爱荷华州）。“游离”的SP94肽（H2N-SFSIILTPILPL-COOH，SEQ ID NO:6）、C末端半胱氨酸修饰的用于缀合的SP94肽（H2N-SFSIILTPILPLGGC-COOH，SEQ ID NO:7）、图2d补 充 实 验 中 使 用 的SP94 肽（H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH，SEQ ID NO:8）由New England Peptide（加德纳，马萨诸塞州）合成。H5WYG肽（H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGGC-COOH）和核定位序列（H2N-NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOH）由Biopeptide Co.Inc.合成（圣地亚哥,加州）。肽的加粗部分是原始序列；加入另外的氨基酸残基是为了结合或标记目的。所有抗体（CHALV-1、抗Rab11a、抗LAMP-1、抗EGFR、抗VEGFR-2、抗PDGFR-α）购自Abcam,Inc.（马塞诸塞州剑桥市）。
自Integrated DNATechnologies（IDT；科勒尔维尔，爱荷华州）。“游离”的SP94肽（H2N-SFSIILTPILPL-COOH，SEQ ID NO:6）、C末端半胱氨酸修饰的用于缀合的SP94肽（H2N-SFSIILTPILPLGGC-COOH，SEQ ID NO:7）、图2d补 充 实 验 中 使 用 的SP94 肽（H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH，SEQ ID NO:8）由New England Peptide（加德纳，马萨诸塞州）合成。H5WYG肽（H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGGC-COOH）和核定位序列（H2N-NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOH）由Biopeptide Co.Inc.合成（圣地亚哥,加州）。肽的加粗部分是原始序列；加入另外的氨基酸残基是为了结合或标记目的。所有抗体（CHALV-1、抗Rab11a、抗LAMP-1、抗EGFR、抗VEGFR-2、抗PDGFR-α）购自Abcam,Inc.（马塞诸塞州剑桥市）。
[0182] 细胞培养条件
[0183] HEP3b、肝细胞、PBMCs、T淋巴细胞和B淋巴细胞都是从ATCC获得并根据制造商的指示进行培养。简而言之，Hep3B维持在含10%FBS的EMEM中。肝细胞生长在锥形瓶中，覆盖有BSA、纤连蛋白和牛胶原蛋白I型；使用的培养基是含有5ng/mL表皮生长因子、70ng/mL磷脂酰乙醇胺和10%FBS的BEGM（从BEGM Bullet试剂盒中除去庆大霉素、两性霉素和肾上腺素）。HUVEC生长在含有20%FBS的DMEM中；明胶覆盖的锥形瓶用于促进粘附性。PBMC、T淋巴细胞和B淋巴细胞都维持在悬浮锥形瓶中（Greiner Bio-One；北卡罗来纳州门罗）。PBMC生长在补充了0.02mM胸苷、1mM次黄嘌呤、0.05mM2-巯基乙醇和10%FBS的IMDM中。T和B淋巴细胞分别生长在含有20%FBS的IMDM中和含有20%FBS的RPMI中。所有细胞都维持在37℃的加湿环境中（空气补充5%CO2）。黏附细胞用0.05%胰蛋白酶以1：3的传代培养
5 6
比例进行传代培养，非粘附细胞在2×10 细胞/mL的密度下接种，并维持在1-5×10 细胞/mL。
5 6
比例进行传代培养，非粘附细胞在2×10 细胞/mL的密度下接种，并维持在1-5×10 细胞/mL。
[0184] 纳米二氧化硅颗粒的合成和鉴定
[0185] 单峰二氧化硅纳米颗粒的合成
[0186] Lu等人已经描述了使用气溶胶辅助挥发诱导自组装方法来制备具有单峰孔隙2
度的纳米多孔二氧化硅颗粒 。简而言之，一同质溶胶含有二氧化硅前体（TEOS）、结构导向的表面活性剂（CTAB，其起始浓度远小于临界胶团浓度，或CMC）以及溶解在水和乙醇溶液中的HCl，使用改良的商用气雾剂（Model9302A；TSI，Inc.；明尼苏达州圣保罗）使其气雾化。使用氮气作为载气，所有加热区保持在400℃，使溶剂蒸发掉，提高表面活性剂有效浓度。小孔压降是20psi。颗粒收集在维持于80℃的Durapore膜过滤器上（Millipore；
马塞诸塞州比勒利卡）。一典型反应混合物包含55.9mL的去离子H2O、43mL的无水乙醇（200-proof ethanol）、1.10mL的1.0N HCl、4.0g CTAB和10.32gTEOS。为了制备在细胞内条件下（中性pH、盐浓度相对较高）更快溶解的纳米多孔二氧化硅颗粒，将各种量的TEOS和AEPTMS、一含氨基硅烷纳入到前体溶胶中，用浓盐酸将系统pH值调节至2.0。例如，为制备含15wt%AEPTMS的颗粒，使用9.36g TEOS和1.33g AEPTMS。
度的纳米多孔二氧化硅颗粒 。简而言之，一同质溶胶含有二氧化硅前体（TEOS）、结构导向的表面活性剂（CTAB，其起始浓度远小于临界胶团浓度，或CMC）以及溶解在水和乙醇溶液中的HCl，使用改良的商用气雾剂（Model9302A；TSI，Inc.；明尼苏达州圣保罗）使其气雾化。使用氮气作为载气，所有加热区保持在400℃，使溶剂蒸发掉，提高表面活性剂有效浓度。小孔压降是20psi。颗粒收集在维持于80℃的Durapore膜过滤器上（Millipore；
马塞诸塞州比勒利卡）。一典型反应混合物包含55.9mL的去离子H2O、43mL的无水乙醇（200-proof ethanol）、1.10mL的1.0N HCl、4.0g CTAB和10.32gTEOS。为了制备在细胞内条件下（中性pH、盐浓度相对较高）更快溶解的纳米多孔二氧化硅颗粒，将各种量的TEOS和AEPTMS、一含氨基硅烷纳入到前体溶胶中，用浓盐酸将系统pH值调节至2.0。例如，为制备含15wt%AEPTMS的颗粒，使用9.36g TEOS和1.33g AEPTMS。
[0187] 多峰二氧化硅纳米颗粒的合成
[0188] Carroll等人已经描述了使用乳液处理来合成具有多峰孔隙度的纳米多孔二氧化1
硅颗粒 。简而言之，在20g去离子水中加入1.82g CTAB（可溶于水相），在40℃搅拌直至溶解，并待其冷却至25℃。向CTAB溶液中加入0.57g1.0N HCl、5.2g TEOS和0.22g NaCl，将获得的溶胶搅拌1小时。制备由具有3wt%Abil EM90（可溶于油相的非离子乳化剂）的十六烷组成的油相。前体溶胶在1000mL圆底锥形瓶中与油相（溶胶与油的体积比为1:3）结合，剧烈搅拌2分钟以促进形成油包水乳液，使其粘附到一旋转蒸发仪上（R-205;Buchi Laboratory Equipment；瑞士），将其放置在80℃水浴30分钟。然后将该混合物在120mbar的减压下煮沸（35rpm，3小时）以除去溶剂。颗粒在3000rpm下离心20分钟（型号Centra MP4R；国际设备公司；查特怒加市，田纳西州），回收上清液。最后，将颗粒在500℃下煅烧5小时，以除去表面活性剂和其他过量的有机物。如Carroll等人所述的，溶剂抽提富集了CTAB（>CMC）中的水相，并且获得的微胶粒在二氧化硅颗粒浓缩时模制6-12nm的孔（在水相中）。此外，两种表面活性剂（CTAB和Abil EM90）在水-油界面的吸附协同降低了界面张力，导致自发形成20-30nm的微乳液滴，其模制大的表面可进入的孔。
硅颗粒 。简而言之，在20g去离子水中加入1.82g CTAB（可溶于水相），在40℃搅拌直至溶解，并待其冷却至25℃。向CTAB溶液中加入0.57g1.0N HCl、5.2g TEOS和0.22g NaCl，将获得的溶胶搅拌1小时。制备由具有3wt%Abil EM90（可溶于油相的非离子乳化剂）的十六烷组成的油相。前体溶胶在1000mL圆底锥形瓶中与油相（溶胶与油的体积比为1:3）结合，剧烈搅拌2分钟以促进形成油包水乳液，使其粘附到一旋转蒸发仪上（R-205;Buchi Laboratory Equipment；瑞士），将其放置在80℃水浴30分钟。然后将该混合物在120mbar的减压下煮沸（35rpm，3小时）以除去溶剂。颗粒在3000rpm下离心20分钟（型号Centra MP4R；国际设备公司；查特怒加市，田纳西州），回收上清液。最后，将颗粒在500℃下煅烧5小时，以除去表面活性剂和其他过量的有机物。如Carroll等人所述的，溶剂抽提富集了CTAB（>CMC）中的水相，并且获得的微胶粒在二氧化硅颗粒浓缩时模制6-12nm的孔（在水相中）。此外，两种表面活性剂（CTAB和Abil EM90）在水-油界面的吸附协同降低了界面张力，导致自发形成20-30nm的微乳液滴，其模制大的表面可进入的孔。
[0189] 二氧化硅纳米颗粒的鉴定
[0190] 使用Zetasizer Nano（莫尔文，乌斯特郡，英国）进行纳米多孔二氧化硅颗粒的动态光散射。通过在2.4ml1X D-PBS中稀释48μL二氧化硅颗粒（25mg/mL），制备样品。将溶液转移到1mL聚苯乙烯小管中（Sarstedt；Nümbrecht，德国）用于分析。使用ASAP2020表面积和孔隙度分析仪进行氮吸附（Micromeritics仪器公司；佐治亚州）。使用Zetasizer Nano（莫尔文，乌斯特郡，英国）进行zeta电位测量。在一典型实验中，二氧化硅颗粒、脂质体、或原始细胞在模拟体液（pH7.4）或柠檬酸缓冲液（pH5.0）中按1:50稀释，这两种溶液都调整成含150mM NaCl，并转移至1ml折叠毛细血管细胞（folded capillary cell）中（莫尔文，乌斯特郡，英国）用于分析。请参阅补充的图1中的DLS和氮吸附数据以及补充的图12的二氧化硅纳米颗粒、脂质体和原始细胞的zeta电位值。
[0191] 原始细胞的合成、装载和表面功能化
[0192] 脂质体融合到纳米多孔二氧化硅颗粒上
[0193] Liu等人已经描述了用于合成原始细胞的程序25-27，因此只简单提及。脂质是从Avanti Polar Lipids订购，预先溶于氯仿中并存储在-20℃。就在原始细胞合成之前，将2.5mg脂质在氮气流下干燥并放置在真空炉（型号1450M，VWR International，美国宾夕法尼亚州西切斯特）中过夜以除去残余溶剂。脂质在0.5X D-PBS中重新水化成浓度为2.5mg/mL，并用Mini-Extruder装置（Avanti Polar Lipids,Inc.；阿拉巴斯特，阿拉巴马州）使其通过100nm过滤器至少10次。将DPPC和DSPC溶解在预热到它们各自的转化温度（41℃和55℃）的0.5XD-PBS中，并在挤出过程中保持在60℃。获得的脂质体（直径约120nm）储存在4℃，不超过一周。纳米多孔二氧化硅核心溶解在0.5X D-PBS（25mg/mL）中并在室温下，在过量的脂质体中（脂质与二氧化硅的体积比为1:2-1:4）暴露30-90分钟。在4℃下，在过量脂质存在的情况下，原始细胞可保存长达3个月。为去除多余脂质，将原始细胞在
10,000rpm离心5分钟，冲洗两次并重悬于0.5X D-PBS中。
10,000rpm离心5分钟，冲洗两次并重悬于0.5X D-PBS中。
[0194] 支撑脂双层组合物的优化
[0195] 对SLB的组合物进行优化以最大限度地减少对对照细胞的非特异性结合和毒性；见补充图4的各种使用的脂质的结构。用在所有表面结合、内化和运输实验中的原始细胞具有SLB，其由含5wt%DOPE（或DPPE）的DOPC（或DPPC）、30wt%胆固醇和5wt%18:1（或16:0）PEG-2000PE构成。如有必要，将荧光脂质（18:1-12:0NBD-PC、16:0-12:0NBD-PC或Texas DHPE）以1-5wt%结合到SLB中。各种脂质在重新水化和挤出前一起冻干；例如将75μLDOPC（25mg/mL）、5μL DOPE（25mg/mL）、10μL胆固醇（75mg/mL）、
5μL18:1PEG-2000PE（25mg/mL）和5μL18:1-12:0NBD-PC（5mg/mL）结合（combine）并冻干以形成脂质体，该脂质体由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇、5wt%PEG-2000和
1wt%NBD-PC组成。
5μL18:1PEG-2000PE（25mg/mL）和5μL18:1-12:0NBD-PC（5mg/mL）结合（combine）并冻干以形成脂质体，该脂质体由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇、5wt%PEG-2000和
1wt%NBD-PC组成。
[0196] 用各种类型靶向配体修饰支撑脂双层
[0197] 原始细胞对HCC的特异性亲和力通过将各种类型的靶向配体以各种密度缀合到SLB上进行优化。异双功能交联剂，NHS-（PEG）n-马来酰亚胺，对巯基和氨基部分具有活性并拥有一PEG间隔臂，该臂长度可改变以优化特异亲和性，通过该异双功能交联剂，SP94和H5WYG肽（合成有C末端半胱氨酸残基）被缀合到PE头基中存在的伯胺上。在大多数研究中使用SM（PEG）24（间隔臂=9.52nm）。使用Sulfhydryl Addition试剂盒（按生产商说明）将转铁蛋白、抗EGFR和CHALV-1中的氨基部分转化成自由的巯基。使用SM（PEG）24将功能化的转铁蛋白和抗体缀合到SLB中的PE上。通过反应化学计量学和培养时间控制配体密度。例如，原始细胞在室温下用超过10倍摩尔量的SP94培养2小时，以获得0.015wt%（约6个肽/原始细胞）的肽密度，而原始细胞在4℃用超过5000倍摩尔量的SP94培养过夜以获得5.00wt%（约2048个肽/原始细胞）的肽密度。平均配体密度由Tricine-SDS-PAGE28
（SP94和H5WYG肽）或Laemmli-SDS-PAGE（转铁蛋白、抗EGFR和CHALV-1）确定 。简而言之，可使用LC-SPDP（间隔臂=1.57nm）用各种密度的配体修饰原始细胞，LC-SPDP是一种与伯胺和巯基部分反应的异双功能交联剂，并可通过还原清除。原始细胞在10mM的二硫苏糖醇（DTT）中暴露30min，并在10,000rpm离心5min；获得的上清液包含游离配体，使用SDS-PAGE并通过使用Image J Image处理分析软件（NIH，美国马里兰州贝塞斯达）比较每个样品相对于标准曲线的条带强度，来确定游离配体浓度。使用20%凝胶（含6%甲叉双丙烯酰胺和6M尿素）分析SP94和H5WYG肽密度。用10%凝胶分析抗体（抗EGFR和CHALV-1）密度，而15%凝胶被用于分析转铁蛋白的密度。
（SP94和H5WYG肽）或Laemmli-SDS-PAGE（转铁蛋白、抗EGFR和CHALV-1）确定 。简而言之，可使用LC-SPDP（间隔臂=1.57nm）用各种密度的配体修饰原始细胞，LC-SPDP是一种与伯胺和巯基部分反应的异双功能交联剂，并可通过还原清除。原始细胞在10mM的二硫苏糖醇（DTT）中暴露30min，并在10,000rpm离心5min；获得的上清液包含游离配体，使用SDS-PAGE并通过使用Image J Image处理分析软件（NIH，美国马里兰州贝塞斯达）比较每个样品相对于标准曲线的条带强度，来确定游离配体浓度。使用20%凝胶（含6%甲叉双丙烯酰胺和6M尿素）分析SP94和H5WYG肽密度。用10%凝胶分析抗体（抗EGFR和CHALV-1）密度，而15%凝胶被用于分析转铁蛋白的密度。
[0198] 制备荧光标记的纳米多孔核心
[0199] 将100μL颗粒（25mg/mL）加到900μL溶于0.5X D-PBS的20%APTES中，使纳米多孔核心进行荧光标记；颗粒在APTES中常温孵化过夜，离心（10,000rpm，5min）以去除未反应的APTES，并重悬于1mL0.5X D-PBS中。添加一氨基反应荧光团（如Alexa 647羧酸、琥珀酰亚胺酯；1mg/mL，溶于DMSO中）（5μL染料/mL颗粒），这些颗粒在离心去除未反应染料之前在室温下放置2小时。荧光标记颗粒在4℃下储存在0.5X D-PBS中。
[0200] 单峰核心和脂质体装载化学治疗药物
[0201] 在脂质体融合前，修饰成含15wt%AEPTMS（25mg/mL）的单峰纳米核心在阿霉素（5mM）或阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶的混合物中（每种药物5mM）室温浸泡1小时。通过将颗粒在10,000rpm下离心5分钟去除多余的药物。120nm的脂质体用基于磷酸铵梯度的方法29
装载DOX，该方法之前已有描述 。简而言之，脂质膜用300mM（NH4）2HPO4重新水化，使脂质体溶液挤出通过100nm膜至少10次。脂质体用等渗缓冲液（140mM NaCl,10mMHEPES,pH7.4）通过渗析（Float-A-Lyzer G2渗析单位，3.5-5kDa MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.；加州Rancho Dominguez）平衡，并用阿霉素HCl（药物:脂质摩尔比为1:3）在4℃孵化过夜。
通过尺寸排阻色谱法，在0.7cm×10cm CL-4B柱上去除多余的DOX。脂质体装载
30,31
5-FU或顺铂，如前所述 。
装载DOX，该方法之前已有描述 。简而言之，脂质膜用300mM（NH4）2HPO4重新水化，使脂质体溶液挤出通过100nm膜至少10次。脂质体用等渗缓冲液（140mM NaCl,10mMHEPES,pH7.4）通过渗析（Float-A-Lyzer G2渗析单位，3.5-5kDa MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.；加州Rancho Dominguez）平衡，并用阿霉素HCl（药物:脂质摩尔比为1:3）在4℃孵化过夜。
通过尺寸排阻色谱法，在0.7cm×10cm CL-4B柱上去除多余的DOX。脂质体装载
30,31
5-FU或顺铂，如前所述 。
[0202] 多峰核心装载多组分混合物、siRNA和白喉毒素A链
[0203] 将修饰成含20wt%AEPTMS（25mg/mL）的多峰纳米多孔核心在钙黄绿素溶液（5mM）、Alexa 647标记的dsDNA寡核苷酸（100μM）、RFP（100μM）和CdSe/ZnS量子点（10μM）中浸泡4小时；改变每种货物的浓度以获得最佳的用于高光谱成像的荧光密度。通过将1mg钙黄绿素和1mgNLS溶解在850μL1X D-PBS中，钙黄绿素被NLS（合成有C末端半胱氨酸残基）修饰；加入100μL EDC（在去离子水水中浓度为10mg/mL）和50μLBMPH（在DMSO中浓度10mg/mL），将混合物在室温下孵化2小时。通过渗析（Slide-A-Lyzer迷你渗析单位，2kDa MWCO；Thermo Fisher Scientific LSR；罗克福德，伊利诺伊州）去除多余钙黄TM
绿素。dsDNA寡聚核苷酸用Ulysis Alexa 647核苷酸标记试剂盒（按制造商指示）标记并通过合并50μL dsDNA（在去离子水中浓度2mM）和50μL NLS（在DMSO中浓度1mM）以及10μL SMCC（在DMSO中浓度10mg/mL），将其用NLS修饰；混合物在室温下孵化2小时，多余的NLS通过渗析（Slide-A-Lyzer迷你渗析单位，7kDa MWCO；Thermo Fisher Scientific LSR；罗克福德，伊利诺伊州）去除。在补充图13-16描述的运输实验中，多峰纳米多孔核心用20wt%AEPTMS（25mg/mL），在4℃下在siRNA（100μM）或白喉毒素A链（100μM）中浸泡
2小时。未封装的货物通过在10000rpm离心5分钟去除，并且立即将脂质体融合到装载有货物的核心。
绿素。dsDNA寡聚核苷酸用Ulysis Alexa 647核苷酸标记试剂盒（按制造商指示）标记并通过合并50μL dsDNA（在去离子水中浓度2mM）和50μL NLS（在DMSO中浓度1mM）以及10μL SMCC（在DMSO中浓度10mg/mL），将其用NLS修饰；混合物在室温下孵化2小时，多余的NLS通过渗析（Slide-A-Lyzer迷你渗析单位，7kDa MWCO；Thermo Fisher Scientific LSR；罗克福德，伊利诺伊州）去除。在补充图13-16描述的运输实验中，多峰纳米多孔核心用20wt%AEPTMS（25mg/mL），在4℃下在siRNA（100μM）或白喉毒素A链（100μM）中浸泡
2小时。未封装的货物通过在10000rpm离心5分钟去除，并且立即将脂质体融合到装载有货物的核心。
[0204] 用组蛋白包装CB1质粒。
[0205] 用于将CB1质粒（pCB1）超螺旋的方法如图4所示。该原理图描述了使用高饱和盐溶液使CB1质粒（pCB1）超螺旋（该CB1质粒载体在下面和附图12中展示），用组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4包装超螺旋的pCB1以及用核定位序列（NLS）对获得的pCB1-组蛋白复合物进行修饰的方法，该核定位序列通过缀合到组蛋白上能够促进物质易位通过核孔。图4（B）和（D）显示了CB1质粒（B）和组蛋白包装的pCB1（D）的原子力显微镜（AFM）图像。
比例尺=100nm。（C）和（E）分别是与（B）和（D）中的红线相对应的高度的轮廓图。
比例尺=100nm。（C）和（E）分别是与（B）和（D）中的红线相对应的高度的轮廓图。
[0206] 合成装载有组蛋白包装的pCB1的MC40靶向的介孔二氧化硅纳米颗粒支撑脂双层（原始细胞）。
[0207] 如图5所示，5（A）提供了一原理图，描述了用于生成装载有DNA的肽靶向的原始细胞的方法。根据这种方法，通过简单地将颗粒浸入pCB1-组蛋白复合物溶液中，可将组蛋白包装的pCB1装载进介孔二氧化硅纳米颗粒中，该二氧化硅纳米颗粒形成原始细胞的核心。然后，将PEG化的脂质体融合到装载有DNA的核心中，形成一支撑脂双层（SLB），其进一步用结合到HCC的靶向肽（MC40）和促进内化的原始细胞的内体逃逸的内体裂解肽（endosomolytic peptide）修饰。一巯基-氨基交联剂（间隔臂=9.5nm）用于将C末端半胱氨酸残基修饰的肽结合到SLB中的DOPE部分上。图5（B）显示了用作原始细胞核心的介孔二氧化硅纳米颗粒的传输电子显微镜（TEM）图像。比例尺=200nm。插入=扫描电子显微镜（SEM）图像，其证明，15-25nm的孔是表面可进入的。插入比例尺=50nm。图5（C）显示了介孔二氧化硅纳米颗粒的尺寸分布图，通过动态光散射（DLS）确定。（5D，左轴）是介孔二氧化硅纳米颗粒的累积孔体积图，通过使用Barrett-Joyner-Halenda（BJH）模型，用图S-4A中显示的氮吸附等温线的吸附分支来计算。（5D，右轴）是pCB1-组蛋白复合物的尺寸分布，由DLS确定。
[0208] 介孔二氧化硅纳米颗粒具有很大的容量用于组蛋白包装的pCB1，并且获得的原始细胞只有在模拟内体环境的条件下才会释放封装的DNA。
[0209] 如图6（A）所示，能够被封装进未修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒（ζ=-38.5MV）或者用APTES（一种含氨基的硅烷）修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒（ζ=+11.5mV）内的pCB1或6
者组蛋白包装的pCB1（“复合物”）的浓度。图6（B）显示了在37℃下，浓度为1×10 个/
9
mL的细胞与1×10MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞培养24h后，对ZsGreen（一种由
pCB1编码的绿色荧光蛋白）呈阳性的Hep3B的百分比。X轴详细说明了原始细胞核心是否用APTES修饰和pCB1是否用组蛋白进行预包装。在（A）和（B）中，用DOTAP和DOPE（1:1w/w）混合物包装的pCB1作为对照组。图6（C）和（D）显示了在暴露于模拟体液（C）或pH为5的缓冲液（D）中时，组蛋白包装的pCB1从未修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒和相应的原始细胞进行的时间依赖性释放。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和
10wt%PEG-2000构成，在（B）中，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
者组蛋白包装的pCB1（“复合物”）的浓度。图6（B）显示了在37℃下，浓度为1×10 个/
9
mL的细胞与1×10MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞培养24h后，对ZsGreen（一种由
pCB1编码的绿色荧光蛋白）呈阳性的Hep3B的百分比。X轴详细说明了原始细胞核心是否用APTES修饰和pCB1是否用组蛋白进行预包装。在（A）和（B）中，用DOTAP和DOPE（1:1w/w）混合物包装的pCB1作为对照组。图6（C）和（D）显示了在暴露于模拟体液（C）或pH为5的缓冲液（D）中时，组蛋白包装的pCB1从未修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒和相应的原始细胞进行的时间依赖性释放。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和
10wt%PEG-2000构成，在（B）中，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0210] MC40靶向的原始细胞运输组蛋白包装的pCB1到HCC的过程
[0211] 如附图7中的原理图所示，[1]由于靶向肽募集至Met，MC40靶向的原始细胞以高亲和性结合到Hep3B细胞，该Met由各种HCC细胞系过量表达。流动的DPOC SLB促进了肽的移动性，因此使原始细胞能够用低密度MC40修饰，以保留对Hep3B的高特异性亲和力（见图8A）。[2]MC40靶向的原始细胞通过受体介导的内吞作用，被Hep3B内化（参见图8B和图15A）。[3]内体条件使SLB不稳定（插入Nature Materials（《自然材料》）文献）并导致H5WYG内体裂解肽质子化，两者都能使组蛋白包装的pCB1在Hep3B细胞的胞质溶胶中分散（见图15B）。[4]pCB1-组蛋白复合物用核定位序列（NLS）修饰时，在24小时内会在Hep3B细胞核内聚集（见图16C），这使得能够对分裂和非分裂的癌细胞进行有效转染（见图17）。
[0212] MC40靶向的原始细胞以高亲和性结合到HCC并被Hep3B但不被正常的肝细胞内化。
[0213] 图8（A）显示了在暴露于Hep3B或肝细胞中时，MC40靶向的原始细胞的表观离解常数（Kd）；Kd值与特异性亲和性成反比，并从饱和结合曲线中确定（见图S-11）。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=5）。图8（B）和（C）显示了Hep3B（B）和肝细胞（C）的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B和肝细胞在37℃下，在超过1000倍的MC40靶向的原始细胞中暴露1小时。Met用Alexa 标记的单克隆抗体（绿色）染色，原始细胞核心用Alexa
594（红色）进行标记，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。比例尺=20μm。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%（A-C）或0.500wt%（A）的MC40靶向肽修饰。
594（红色）进行标记，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。比例尺=20μm。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%（A-C）或0.500wt%（A）的MC40靶向肽修饰。
[0214] MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞在皮摩尔浓度下诱导HCC凋亡但对正常肝细胞活力影响最小。
[0215] 图9（A）和（B）显示了Hep3B在37℃下持续暴露在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中，表达细胞周期蛋白B1mRNA和细胞周期蛋白B1蛋白的剂量（A）和时间（B）依赖性下降。细胞在各种pCB1浓度下暴露48小时（A）和在5pM的pCB1中暴露不同时间（B）。肝细胞中细胞周期蛋白B1蛋白的表达和Hep3B中的ZsGreen的表达作为对照。使用实时PCR和免疫荧光法分别确定细胞周期蛋白B1mRNA和蛋白质浓度。图9（C）显示了在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞（[pCB1]=5pM）中持续暴露不同时间，在G2/M期被捕获的Hep3B的百分率。肝细胞在G2/M期的百分率和Hep3B在S期的百分率用作对比。在细胞周期分析之前将细胞用Hoechst33342染色。图9（D）显示了在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞（[pCB1]=5pM）中持续暴露不同时间，凋亡的Hep3B的百分率。将对凋亡标记呈阳性的肝细胞的百分率作为对照。对Alexa 647标记的膜联蛋白V呈阳性的细胞被认为是处于凋亡早期，而对膜联蛋白V和碘化丙啶两者都呈阳性的细胞则被认为是处于凋亡晚期。凋亡细胞的总数通过将单阳性或双阳性细胞的数目相加来确定。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0216] MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞诱导HCC选择性凋亡的效率比相应的脂质体复合物高2500倍。
[0217] 图10（A）显示了DOPC原始细胞的zeta电位，DOPC原始细胞用10wt%PEG-2000（18:1）修饰，脂质体复合物由DOTAP和DOPE（1:1w/w）的混合物和pCB1构成，DOTAP/DOPE脂质体复合物用10wt%PEG-2000修饰。所有zeta电位测量都在0.5X PBS（pH7.4）中进行。图10（B，左轴）显示了在37℃下，在由MC40靶向的原始细胞或脂质体复合物运输的5pM的pCB1中持续暴露48h后，凋亡的Hep3B和肝细胞的百分率。图10（B，右轴）显6
示了37℃下，在48小时内诱导1×10 个Hep3B中的90%发生凋亡所需要的MC40靶向的
装载有pCB1的原始细胞或脂质体复合物的数量。在（B）中，细胞用Alexa 647标
记的膜联蛋白V和碘化丙啶染色；单或双阳性细胞被认为是凋亡的。原始细胞SLB由含
5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（当有指出时）构成，该原始细胞SLB用
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。DOTAP/DOPE脂质体复合物用10wt%PEG2000（当有指出时）、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
示了37℃下，在48小时内诱导1×10 个Hep3B中的90%发生凋亡所需要的MC40靶向的
装载有pCB1的原始细胞或脂质体复合物的数量。在（B）中，细胞用Alexa 647标
记的膜联蛋白V和碘化丙啶染色；单或双阳性细胞被认为是凋亡的。原始细胞SLB由含
5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（当有指出时）构成，该原始细胞SLB用
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。DOTAP/DOPE脂质体复合物用10wt%PEG2000（当有指出时）、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0218] MC40靶向的原始细胞选择性将高浓度的紫杉醇、Bcl-2特异性siRNA和pCB1运输到HCC，而不影响肝细胞活力。
[0219] 图11（A）显示了能够使Bcl-2表达沉默的紫杉醇、siRNA的浓度，以及能够封装进1012个原始细胞、脂质体或脂质体复合物中的CB1质粒的浓度。在图11A中红色条表示当紫杉醇和pCB1都装载进原始细胞时，它们的浓度如何变化。蓝色条表示紫杉醇、siRNA和pCB1都装载进原始细胞时，或者siRNA和pCB1装载进脂质体复合物中时，它们的浓度如何变化。图11（B）提供了共聚焦荧光显微镜图，显示了Oregon 488标记的紫杉醇（绿色）、Alexa 594标记的siRNA（红色）以及Cy5标记的pDNA（白色）在通过MC40靶向原始细胞运输到Hep3B后在细胞内的分布。在固定和用Hoechst33342（蓝色）染色前，细胞用超过其1000倍的MC40靶向的原始细胞在37℃下培养24小时。比例尺=10μm。
图11（C）显示了在37℃下，在10nM紫杉醇和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，在G2/M期被捕获的Hep3B、SNU-398和肝细胞的分数。用G2/M期的对数生长期细胞的百分率对分数进行归一化处理。图11（D）显示了在37℃下，在10nM紫杉醇、250pM的Bcl-2特异性siRNA和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，对Alexa 647标记的膜联蛋白V和碘
化丙啶（PI）显阳性的Hep3B、SNU-398和肝细胞的百分率。在（C）和（D）中，“pCB1”是指用DOTAP和DOPE混合物（1:1w/w）包装和非特异性运输到细胞中的pCB1。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。脂质体由含5wt%DMPE的DSPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（16：0）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。脂质体复合物由DOTAP和DOPE（1:1w/w）的混合物构成，并用10wt%PEG-2000、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
图11（C）显示了在37℃下，在10nM紫杉醇和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，在G2/M期被捕获的Hep3B、SNU-398和肝细胞的分数。用G2/M期的对数生长期细胞的百分率对分数进行归一化处理。图11（D）显示了在37℃下，在10nM紫杉醇、250pM的Bcl-2特异性siRNA和/或5pM的pCB1中暴露48小时后，对Alexa 647标记的膜联蛋白V和碘
化丙啶（PI）显阳性的Hep3B、SNU-398和肝细胞的百分率。在（C）和（D）中，“pCB1”是指用DOTAP和DOPE混合物（1:1w/w）包装和非特异性运输到细胞中的pCB1。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。脂质体由含5wt%DMPE的DSPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（16：0）构成，并用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。脂质体复合物由DOTAP和DOPE（1:1w/w）的混合物构成，并用10wt%PEG-2000、0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1用NLS修饰。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0220] CB1质粒载体图谱
[0221] 如图12所示，该CB1质粒（pCB1）由RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体（Clontech实验设备有限公司；山景城；加州）和pNEB193载体（新英格兰生物实验室有限公司；伊普斯威奇；马萨诸塞州）构建。pCB1编码细胞周期蛋白B1特异性小发夹RNA（shRNA）[Yuan,et al.,Oncogene（2006）25,1753–1762]和海葵属绿色荧光蛋白（ZsGreen）。组成型shRNA的表达由RNA Pol III依赖的人U6启动子（PU6）驱动，而组成型ZsGreen的表达R由巨细胞病毒的立即早期启动子（PCMV IE）驱动。ori和Amp 元件能够使质粒在大肠杆菌内增殖。编码细胞周期蛋白B1特异性shRNA的有义链和反义链的DNA序列带下划线并且侧边带有限制性酶切位点（BamHI为红色，EcoRI为蓝色），这些位点用于将dsDNA寡核苷酸引入到pSIREN载体上。
[0222] 组蛋白包装的pCB1的鉴定。
[0223] 图13（A）显示了暴露于浓度越来越高的组蛋白（H1、H2A、H2B、H3和H4组的摩尔比为：1:2:2:2:2）中的pCB1的电泳迁移率变动分析。给定pCB1:组蛋白的摩尔比用于第3-6道。第1道包含DNA梯状条带，第2道包含不加组蛋白的pCB1。图13（B）显示了组蛋白包装的pCB1（pCB1:组蛋白摩尔比为1：50）的TEM图。比例尺=50nm。
[0224] 没有装载以及装载有pCB1的介孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸附分析。
[0225] 图14（A）装载用组蛋白包装的pCB1前后，介孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸附等温线。图14（B）显示了装载用组蛋白包装的pCB1前后，介孔二氧化硅纳米颗粒的Brunauer-Emmett-Teller（BET）比表面积。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0226] DOPC原始细胞的小角中子散射（SANS）数据。
[0227] 图15显示了DOPC原始细胞的SANS数据。使用用于具有恒定厚度共形外形的多分散的多孔二氧化硅球体的模型获得拟合数据，该数据拟合显示了在二氧化硅颗粒的表面存在 的双层，其跨越了孔的开口。0、20和 的双层厚度的模拟SANS数据用作对比。测得的 的双层厚度与其他在平面支撑的脂双层上进行的中子研究（33- ）[见，Ferrari,M.Cancer nanotechnology:Opportunities and challenges（《癌症纳米技术：机遇和挑战》）.Nature Reviews Cancer5,161-171（2005）]一致，并且在这些比照条件下，该双层厚度主要代表了从脂双层的富含氢的碳氢化合物核心的散射。实验数据也表明了存在 孔，通过将 （即实验数据峰值的q值，由孔散射导致）分（dividing）
成2π确定。通过使用在100%D2O PBS缓冲液中的5%（v/v）原始细胞悬液，在LANSCE（洛斯阿拉莫斯国家实验室）的LQD光束线上获得SAN数据。使用NCNR SANS数据分析软件包（NIST）进行数据拟合。
成2π确定。通过使用在100%D2O PBS缓冲液中的5%（v/v）原始细胞悬液，在LANSCE（洛斯阿拉莫斯国家实验室）的LQD光束线上获得SAN数据。使用NCNR SANS数据分析软件包（NIST）进行数据拟合。
[0228] 原始细胞保护封装的DNA，使其不被核酸酶降解。
[0229] 图16显示了DNase I处理的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第3道）、组蛋白包装的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第5道）、DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第7道），装载进具有阳离子核心的原始细胞的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第9道），和装载进具有阴离子核心的原始细胞的组蛋白包装的pCB1的琼脂糖凝胶电泳（第11道）的结果。裸露的pCB1（第2道）、从组蛋白释放的pCB1（第4道）、从DOTAP/DOPE脂质体复合物释放的pCB1（第6道）、从具有阳离子核心的原始细胞释放的pCB1（第8道），以及从具有阴离子核心的原始细胞释放的组蛋白包装的pCB1（第10道）用于比较。第1道包含一DNA梯状条带。样本用Dnase I（1单位/50ng DNA）在室温培养30分钟，用1%SDS刺激pCB1的释放。
[0230] 图17显示了介孔二氧化硅纳米颗粒（“未修饰的核心”）、在室温下在20%（v/v）APTES中浸泡12小时的介孔二氧化硅纳米颗粒（“APTES修饰的核心”）、CB1质粒（“pCB1”）、组蛋白包装的pCB1（“pCB1-组蛋白复合物”），以及用DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1（“DOTAP/DOPE脂质体复合物”）的Zeta电位（ζ）值。Zeta电位测量在0.5X PBS（pH7.4）中进行。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0231] 典型的正向散射-侧向散射（FSC-SSC）图以及FL-1柱状图，用于确定图6和S-16（A）-（D）中对ZsGreen表达呈阳性的细胞百分率。
[0232] 图18显示了对ZsGreen呈阴性的细胞的FSC-SSC图（A和C）和相应的FL-1柱状图（分别为B和D），对这些细胞进行设门（A）或者不进行设门（B）以排除细胞碎片。FL-1通道的平均荧光强度（MFI）值在（B）和（D）中给出。（E）-（H）对ZsGreen呈阳性的细胞的FSC-SSC图（E和G）和相应的FL-1柱状图（分别为F和H），对这些细胞进行设门（E）或者不进行设门（G）以排除细胞碎片。在（F）和（H）上的门对应于MFI≤282（即ZsGreen阴性细胞的MFI的100倍）的细胞百分率（见版面D）。
[0233] MC40靶向肽的鉴别。
[0234] 图19提供了一原理图，描述了用于从Ph.D.TM-7噬菌体展示库（新英格兰生物实验11
室有限公司；伊普斯威奇；马萨诸塞州）中选择MC40靶向肽的方法。1×10 pfu/mL用融合到人IgG的Fc域的100nM重组人Met（rhMet）在室温下孵化1小时。使用蛋白A或蛋白G包被的磁性颗粒亲和捕捉Met-噬菌体复合物，并随后用TBS（含150mM NaCl的50mMTris-HCl，pH7.4）冲洗10次。结合的噬菌体克隆体用低pH缓冲液（含1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸，pH2.2）洗脱，洗脱产物通过感染宿主细菌（E.coli ER2738）进行扩增。根据原理图，使用越来越严格的条件进行五轮亲和性选择，条件为：Met浓度从100nM降至50nM、10nM，孵化时间从1小时减少至30min、15min，加入到冲洗缓冲液中的吐温20的浓度从0%（v/v）增加至
0.1%、0.5%。通过改变在蛋白A包被的磁性颗粒和蛋白G包被的磁性颗粒之间的选择轮数，避免了对蛋白A和蛋白G特异的多肽。在五轮选择之后，从40个独立的克隆中回收DNA，并TM
使用Ph.D. -7试剂盒提供的-96gIII引物进行测序。具有最大结合MET受体活性的序列如下所示:
室有限公司；伊普斯威奇；马萨诸塞州）中选择MC40靶向肽的方法。1×10 pfu/mL用融合到人IgG的Fc域的100nM重组人Met（rhMet）在室温下孵化1小时。使用蛋白A或蛋白G包被的磁性颗粒亲和捕捉Met-噬菌体复合物，并随后用TBS（含150mM NaCl的50mMTris-HCl，pH7.4）冲洗10次。结合的噬菌体克隆体用低pH缓冲液（含1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸，pH2.2）洗脱，洗脱产物通过感染宿主细菌（E.coli ER2738）进行扩增。根据原理图，使用越来越严格的条件进行五轮亲和性选择，条件为：Met浓度从100nM降至50nM、10nM，孵化时间从1小时减少至30min、15min，加入到冲洗缓冲液中的吐温20的浓度从0%（v/v）增加至
0.1%、0.5%。通过改变在蛋白A包被的磁性颗粒和蛋白G包被的磁性颗粒之间的选择轮数，避免了对蛋白A和蛋白G特异的多肽。在五轮选择之后，从40个独立的克隆中回收DNA，并TM
使用Ph.D. -7试剂盒提供的-96gIII引物进行测序。具有最大结合MET受体活性的序列如下所示:
[0235]
[0236] MC40靶向肽的鉴定。
[0237] 图20（A）显示了在第5轮选择后的多肽序列比对；主要序列ASVHFPP类似于先前确定的Met特异性的12-mer，YLFSVHWPPLKA（SEQ ID NO:18）中的加粗部分。展示了靶向不相关的HAIYPRH肽（约10%）（SEQ ID NO：19）的噬菌体克隆在序列对比中被省略。图20（B）和（C）显示了亲和选择的噬菌体克隆结合到rhMet的程度通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行确定。在（B）中描述的ELISA方案在材料和方法部分进行了描述。ELISA的结果显示在（C）中。图20（D）显示了在移除没有结合到Met的肽后的序列比对。描绘在图20中的一致的序列由该序列比对确定。图20（E）和（F）显示了Hep3B（E）和肝细胞（F）的流式细胞仪散点图，该Hep3B和肝细胞暴露在以下两类物质的一类中：（1）抗Met和不相关噬菌体克隆（TPDWLFP）的Alexa 488标记的单克隆抗体，和一抗M13噬菌体
的Alexa 546标记的单克隆抗体（蓝点）或（2）抗Met和MC40克隆的Alexa
488标记的单克隆抗体，和抗M13噬菌体的Alexa 546标记的单克隆抗体（橙色点）。
未经处理细胞（红点）用于设置FL-1（Alexa 488荧光）和FL-2（Alexa 546
荧光）通道的电压参数。
的Alexa 546标记的单克隆抗体（蓝点）或（2）抗Met和MC40克隆的Alexa
488标记的单克隆抗体，和抗M13噬菌体的Alexa 546标记的单克隆抗体（橙色点）。
未经处理细胞（红点）用于设置FL-1（Alexa 488荧光）和FL-2（Alexa 546
荧光）通道的电压参数。
[0238] 暴露于Hep3B的MC40靶向的原始细胞的样品结合曲线。
[0239] 为了确定图8A中的解离常数，用细胞松弛素D对1×106个Hep3B或肝细胞进行预处理，以抑制内吞作用，并用各种浓度的Alexa 647标记的MC40靶向的原始细胞在37℃下培养1小时。使用流式细胞仪确定获得的细胞群的平均荧光强度，并用其相对于原始细胞浓度作图以获得总结合曲线。在饱和浓度的未标记的肝细胞生长因子存在时，通过用Alexa 647标记的MC40靶向的原始细胞培养细胞来确定非特异性结合。通过用总
结合曲线减去非特异性结合曲线获得特异性结合曲线；通过特异性结合曲线计算Kd值。在图21描述的实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40靶向肽（约6个肽/颗粒）修饰；相应Kd值为1050±142pM。
所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=5）。
结合曲线减去非特异性结合曲线获得特异性结合曲线；通过特异性结合曲线计算Kd值。在图21描述的实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，并用0.015wt%MC40靶向肽（约6个肽/颗粒）修饰；相应Kd值为1050±142pM。
所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=5）。
[0240] MC40靶向的原始细胞通过受体介导的内吞作用内化，并在不存在H5WYG肽时定位到溶酶体。
[0241] 图22（A）显示了在37℃下，一小时之内，被每个Hep3B或肝细胞进行内化的MC40靶向的原始细胞的平均数量。在不存在（-）或存在（+）饱和浓度（100μg/mL）的人肝细胞6
生长因子（HGF）时，将1×10 个细胞与各种浓度的原始细胞进行培养，使用流式细胞仪确定与每个细胞相关的颗粒的平均数量，如Ashley et al.Nature Materials,2011,May;10TM
（5）:389-97所描述的。原始细胞用NBD和pHrodo 进行标记，以（分别）区分表面结合的颗粒和内化到酸性细胞内隔间的颗粒。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。（B）原始细胞和以下物质之间的皮尔逊相关系数（r值）:（1）Rab5，（2）Rab7，（3）溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1），或（4）Rab11a。在固定、透化和用Alexa 488标记的抗Rab5、Rab7、LAMP-1或Rab11a的抗体培养之前，Hep3B细胞用超过其1000倍的Alexa 594标记
的原始细胞在37℃下培养1小时。用SlideBook软件确定r值，它们表示为数值的平均值±标准差，n=3x50个细胞。用微分干涉差（DIC）图限定Hep3B细胞的边界，使得在计算r值时能忽略细胞边界外的像素点。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和
10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
生长因子（HGF）时，将1×10 个细胞与各种浓度的原始细胞进行培养，使用流式细胞仪确定与每个细胞相关的颗粒的平均数量，如Ashley et al.Nature Materials,2011,May;10TM
（5）:389-97所描述的。原始细胞用NBD和pHrodo 进行标记，以（分别）区分表面结合的颗粒和内化到酸性细胞内隔间的颗粒。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。（B）原始细胞和以下物质之间的皮尔逊相关系数（r值）:（1）Rab5，（2）Rab7，（3）溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1），或（4）Rab11a。在固定、透化和用Alexa 488标记的抗Rab5、Rab7、LAMP-1或Rab11a的抗体培养之前，Hep3B细胞用超过其1000倍的Alexa 594标记
的原始细胞在37℃下培养1小时。用SlideBook软件确定r值，它们表示为数值的平均值±标准差，n=3x50个细胞。用微分干涉差（DIC）图限定Hep3B细胞的边界，使得在计算r值时能忽略细胞边界外的像素点。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和
10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
[0242] 用NLS修饰并通过MC40靶向的原始细胞运输时，组蛋白包装的pCB1以时间依赖方式在HCC细胞核中聚集。
[0243] 图23（A）-（C）描述了Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B细胞在37℃下，在超过1000倍的MC40靶向的装载pCB1的原始细胞中暴露15分钟（A）、12小时（B）或24小时（C）。对于（B）来说，在约2小时后，原始细胞的内体逃逸和pCB1的胞质分散是很明显的；但是直到12-16小时，才能检测到ZsGreen表达。在第24小时，Cy5标记的pCB1仍然分布在整个细胞中；但是，由于Cy5通道的获得减少以避免位于细胞核中的像素饱和，胞质染色在（C）中不明显。二氧化硅核心用Alexa 594（红色）标记，pCB1用Cy5（白色），细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。比例尺=20μm。图23（D）显示了Cy5标记的pCB1和Hoechst33342标记的Hep3B细胞核的皮尔逊相关系数（r值）对时间的图。用SlideBook软件确定r值，它们表示为平均值±标准差，n=3x50个细胞。微分干涉差（DIC）图用于限定Hep3B的边界，使得在计算r值时能忽略细胞边界外的像素点。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
[0244] 用NLS修饰并通过MC40靶向的原始细胞运输时，组蛋白包装的pCB1以接近100%的效力选择性转染分裂和非分裂的HCC细胞。
[0245] 图24（A）、（C）和（E）显示了Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B细胞在37℃下，在超过1000倍的MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中暴露24小时。Hep3B细胞在（A）中是分裂的，在（C）和（E）中约95%是汇合的（confluent）；在所有图中，pCB1用组蛋白预包装，并且在（E）中，pCB1-组蛋白复合物进一步用NLS修饰。二氧化硅核心用Alexa 594（红色）标记，pCB1用Cy5标记（白色），细胞核用Hoechst33342（蓝色）
9
复染。比例尺=20μm。图24（B）、（D）和（F）显示了在37℃下，在1×10 个MC40靶向的
6
装载有pCB1的原始细胞（“PC”）中持续暴露24小时后，1×10 个Hep3B和肝细胞中变得对ZsGreen表达呈阳性的细胞的百分率。细胞在（B）中是分裂的，在（D）和（F）中约95%是汇合的；X轴表明CB1质粒（“pCB1”）和pCB1-组蛋白复合物（“复合物”）是否用NLS修饰。使用单独的pCB1，以及用DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1作为对照。细胞暴露在20mg/mL麦胚凝集素（WGA）中，以阻断NLS修饰的pCB1易位通过核孔复合物。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。图24（G）–（I）分别为图（A）、（C）和（E）中使用的细胞的细胞周期柱状图。在G0/G1期的细胞的百分率在每个柱状图中给出。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
9
复染。比例尺=20μm。图24（B）、（D）和（F）显示了在37℃下，在1×10 个MC40靶向的
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装载有pCB1的原始细胞（“PC”）中持续暴露24小时后，1×10 个Hep3B和肝细胞中变得对ZsGreen表达呈阳性的细胞的百分率。细胞在（B）中是分裂的，在（D）和（F）中约95%是汇合的；X轴表明CB1质粒（“pCB1”）和pCB1-组蛋白复合物（“复合物”）是否用NLS修饰。使用单独的pCB1，以及用DOTAP和DOPE混合物（1:1（w/w））包装的pCB1作为对照。细胞暴露在20mg/mL麦胚凝集素（WGA）中，以阻断NLS修饰的pCB1易位通过核孔复合物。误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。图24（G）–（I）分别为图（A）、（C）和（E）中使用的细胞的细胞周期柱状图。在G0/G1期的细胞的百分率在每个柱状图中给出。在所有实验中，原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。
[0246] 图25显示了Hep3B（A）和肝细胞（B）的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B和肝细胞在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中暴露1小时或者72小时；在所有实验中，pCB1浓度保持在5pM。（B）中的箭头指示有丝分裂细胞。用Alexa 594标记的单克
隆抗体（红色）标记细胞周期蛋白B1，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
隆抗体（红色）标记细胞周期蛋白B1，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
[0247] 图26显示了Hep3B（A）和肝细胞（B）的共聚焦荧光显微镜图，Hep3B和肝细胞在37℃下，在MC40靶向的装载有pCB1的原始细胞中暴露1小时或者72小时；在所有实验中pCB1浓度保持在5pM。细胞用Alexa 647标记的膜联蛋白V（白色）和碘化丙啶（红
色）染色来分别分析早期和晚期细胞凋亡，细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
色）染色来分别分析早期和晚期细胞凋亡，细胞核用Hoechst33342（蓝色）复染。原始细胞SLB由含5wt%DOPE的DOPC、30wt%胆固醇和10wt%PEG-2000（18:1）构成，该原始细胞SLB用0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。所有比例尺=20μm。
[0248] 具有由两性脂质构成的SLB的原始细胞引起最小化的非特异性细胞毒性。
[0249] 如附图27所描绘的，在37℃下，在1×109个APTES修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒、具有APTES修饰的核心的DOPC原始细胞、装载有编码错配的shRNA序列的质粒（“错配pCB1”）的DOPC原始细胞，或者装载有错配pCB1的DOTAP/DOPE（1:1w/w）脂质体复合物中6
暴露48小时，1×10 个Hep3B的凋亡百分率。原始细胞和脂质体复合物用10wt%PEG-2000、
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。带有正电荷和带负电荷的聚苯乙烯纳米颗粒（分别为“氨基-PS”和“羧基-PS”）用作阳性对照，而暴露在10mM抗氧化剂、N-乙酰半胱氨酸（NAC）或者暴露在1pmol游离的pCB1中的Hep3B用作阴性对照。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
暴露48小时，1×10 个Hep3B的凋亡百分率。原始细胞和脂质体复合物用10wt%PEG-2000、
0.015wt%MC40和0.500wt%H5WYG修饰。带有正电荷和带负电荷的聚苯乙烯纳米颗粒（分别为“氨基-PS”和“羧基-PS”）用作阳性对照，而暴露在10mM抗氧化剂、N-乙酰半胱氨酸（NAC）或者暴露在1pmol游离的pCB1中的Hep3B用作阴性对照。所有误差条代表95%置信区间（1.96σ）（n=3）。
[0250] 在此公开的所有参考文献都通过相关引用并入本文中。
[0251] 参考文献
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