微生物定量和检测的方法及试剂盒

本发明涉及微生物的定量和检测。本发明更具体地涉及带有DNA或RNA基因组的微生物的定量和/或检测。

本发明适用于所有的已知微生物，如感染人、动物或植物的、带有DNA或RNA基因组的病毒、细菌、芽孢杆菌、原生动物、血内寄生原虫，以及那些存在于病理状态或正常状态人、动物及植物中的微生物；本发明还适用于动物(包括人)和植物产品中的、以及能在水中生存的这些微生物的定量和检测。

本发明方法更进一步用于对人免疫缺陷RNA病毒(HIV)感染和人乙型肝炎DNA病毒(HBV)感染的定量。

对流行病学的研究及人类、动物和植物疾病的预防和治疗是现今医学、兽医学及农业或植物卫生工业中优选考虑的目标。很好地完成这些目标必不可少的步骤是对诸如生物组织、液体及体外制剂等介质中微生物的鉴定和定量。考虑到大多数微生物(尤其是病毒)的大小和它们在生物介质中的浓度(一般在101-1012个微生物体/毫升)，现今仅有的能同时进行病原分子鉴定和定量评价技术工具是扩增基因组片段，。现在最有效的基因组扩增方法称为聚合酶链反应或PCR。该方法借助于一种酶，即聚合酶，可以扩增DNA基因组的一个片段。同样，借助于逆转录酶+聚合酶或一种能实现此两种功能的酶可进行RNA至DNA的逆转录及扩增。扩增后按不同的方法(放射性或有色探针，扩增片段的长度)特异性地鉴定基因组的该片段或扩增物。

在下列文献中描述了应用PCR的HIV定量方法：Holodniy M.等，J.Infect.Dis.163，862-866(1991)；Aoki-Sci S.等，J.AIDS Res.Hum.Retrovirus8，1263-1270(1992)；Bagnarelli P.等，J.Virol.66，7328-7335(1992)；PiatakJr.M.等，Science 259，1749-1755(1993)；Bruisten S.M.等，AIDS 7(suppl.2)，s25-s20(1993)。

丙型肝炎RNA病毒的定量方法已在下列文献中作了介绍：如Kumar U.等，J.Virol.Methods 47(1-2)，95-102(1994)；Manzin A.等，J.Clin.Micrbiol.32(8)，1939-44(1994)；Ravaggi A.等，J.Clin.Microbiol，33(2)，265-9(1995)；Yong，K.K.等J.Clin.Microbiol.33(3)，654-7(1995).

乙型肝炎DNA病毒的定量方法已在如下列文献中描述过：Lehtovaara P.等，PCR Methods Appl.3(3)，169-75(1993)；Wu J.等，J.Virol.Methods 49(3)，331-41(1994)；Zaaijer H.L.等，J，Clin.Microbiol.32(9)，2088-91(1994)；Kaneko S.等，J.Clin.Microbiol.27(9)，1930-33(1989)。

但扩增产物与原始DNA或RNA之间的关系在不同实验组间并不真正恒定，此处需要考虑平行测定标准品的问题，标准品的浓度可通过别的方法已知。

迄今为止一般通过在包含恒定拷贝的待定量基因组的细胞或者借助各自含单一基因片段的质粒来评价PCR扩增的能力。以这种方式首先证实借助PCR可特异性地鉴定基因的单一片段，还证实了在用于扩增的质粒DNA浓度与扩增后测定的DNA浓度之间存在一比例关系。但该比例关系在不同实验间显示变化，因为PCR扩增是一生物过程，即聚合酶作用的结果，不能完全按组纯物理技术的方式来控制它。

这导致生物技术公司的研究人员和技术员在每次病毒定量实验中引入标准品。迄今为止，标准品是由一系列浓度(一般为3-5)的质粒标准品构成，其中要扩增的DNA片段具有与病毒相同的引物互补序列并且按照该技术扩增片段在标准品与病毒之间可具有部分不同的序列或相同的序列。具有相同引物互补序列但不同长度或相同长度不同序列的两个质粒DNA扩增的比：1)等浓度的不同的情形下可不同，2)在相同实验中，不一定与来自同一浓度野生毒的DNA的扩增比相同。

如果要定量或鉴定RNA病毒，例如，AIDS病毒(HIV)，问题就更复杂了。实际上，对RNA病毒的PCR扩增步骤应与一逆转录步骤(简写为RT)相结合，该步骤常借助于另一种酶即逆转录酶，或借助于具有两种作用(逆转录及DNA扩增)的一种酶来实现。在此两种情形下，现今市场上可得到的酶使得逆转录比率在不同的实验中在10∶1(即10拷贝的RNA产生1拷贝的DNA)到100∶1(即100拷贝的RNA产生1拷贝的DNA)之间变化。由此产生的问题，即连续实验结果的不可比性，现已通过下述方法得到解决：同时引入一系列已知浓度的使用相同引物的RNA片段标准品(转录物标准品)，其扩增部分在用作外标时可相同，但用于共扩增(内标)时其序列或长度可不同，该转录物(内标法)然后可与待定量靶微生物的RNA在同一试管中反应。不幸的是相同浓度的两种转录物产生的扩增物浓度可能不同，特别是与相应病毒浓度的RNA所产生的扩增物浓度也不同。

总之，-逆转录和/或扩增的技术本身对同一样本在不同实验中不能给出相同结果；-有必要使用即可以是内标又可以是外标的外标准品；-外标物一般由用于DNA微生物的质粒、或用于RNA微生物的RNA转录物组成，只能进行相对定量，因为其扩增比率不一定与微生物的野生型完整DNA或RNA的扩增比率相同；-共扩增的内标物质粒或转录物还涉及共扩增片段的长度或序列与野生型病原不同，同时还具有与使用质粒或转录物的外标物相同的缺点。

依据上述现有的技术状况，质粒DNA的扩增并不真正与病毒DNA的扩增成比例。现用于RNA病毒的标准品是转录物，它具有与质粒相同的缺点，而且游离RNA易降解，很难稳定保存。

因此，需要获得能对靶微生物进行绝对值定量和检测的方法。

现发现在下述条件下可以绝对值的方式定量或检测任何DNA或RNA微生物：(1)已知或通过别的方法可以测定微生物的标准浓度或该微生物所携带DNA或RNA的浓度，称为微生物标准品，及(2)将来自未知浓度微生物的RNA或DNA的逆转录和/或扩增产物的量与来自多个已知浓度所述微生物的RNA或DNA的扩增物的量进行比较。

这种方法构成本发明的第一个目的。

根据另一个实施方案，步骤(2)可以主要由比较揭示或任何其它不需扩增微生物标准品或靶微生物的DNA或RNA的揭示方法组成，其中比较揭示是基于将微生物标准品浓度与靶微生物浓度进行比较，其优选通过所谓的分支DNA方法测得的。

为制备已知浓度的微生物，按本领域人员掌握的各项技术进行，优选离心并纯化(从待检测的人、动物或植物样品开始，或从细胞培养物开始)任何量的待定量微生物，然后按标准方法从这些离心纯化的制备物中提取DNA或RNA。在本方法后续步骤中使用的量可是任何量，只要它足以最终获得按直接微生物学方法可测定量的微生物标准品的DNA或RNA，所述微生物学方法不使用PCR类的扩增并在本领域技术人员的知识范围内。实际上，考虑到在实验室中进行这些测定中现今可得到的设备的精确性。几百纳克或几微克水平的量较好。

本发明的方法最好包括下列步骤：1)从人、动物或植物样品或从细胞培养物提取并纯化一定量的待定量微生物，微生物的量最好足以确保能直接方法测量靶DNA或RNA浓度；2)提取DNA或RNA并测定所收获的量(用ng或μg表示)；3)另一方面利用该微生物的核苷酸碱基数目，该数目例如可从数据库得到，或可通过常规方法测定；4)考虑核苷酸的平均分子量已知(约330道尔顿)，从核苷酸碱基数目计算所述微生物DNA或RNA的总分子量；5)利用阿佛加德罗常数(即6.02×1023)再计算每个微生物所携带DNA或RNA的量；6)制备和/或利用一系列浓度的微生物标准品，这是根据这些DNA或RNA浓度，通过将预先校准的微生物进行连续稀释而获得的，以形成外标准品，因此每个稀释液的(a)DNA或RNA浓度及(b)微生物的浓度是已知的；7)提取这些微生物标准品和靶样品的DNA或RNA，将这些提取物平行地进行根据所谓的分支DNA方法的揭示或任何其它不需扩增微生物标准品或靶微生物的DNA或RNA的揭示方法，和/或进行逆转录和/或扩增，并记录所得值；及8)比较微生物标准品和靶微生物的DNA或RNA的浓度，或将靶微生物的扩增产物和外标的产物进行比较，以便推出每个靶微生物样品中的DNA或RNA或微生物体的浓度值。

从中可以找到有关微生物核苷酸碱基数目数据库方面的说明或参考的文献，可举出：Virus Res.23，39-53(1992)；Gene 8l，275-284(1989)；Virology 177，305-311(1990)及J.Gen.Virol.69，2575-2583(1988)。

根据一种有利的变异实施方案，如果微生物足够大能够直接检测并计数，特别是通过光学和/或电子手段进行，则本发明方法的上述第2)-5)步用微生物数目的直接简单测定来取代。

根据最优选的实施方案，本发明的方法可以任选地包括加入一内部对照，其优选是杂合质粒DNA或转录RNA，该内部对照的序列和引物与靶DNA或RNA无关。所述的内部对照优选加入到待测的每一样品中作为内部对照(以下称“IC”)，即用于控制扩增或RT-扩增的效率。

作为变异方案，本发明的方法中已知浓度微生物的制备可由已知浓度的下列物质的制备来代替：-失活的相同微生物，其DNA或RNA仍适于用揭示方法如所谓的分支DNA揭示方法检测或定量，和/或按野生型病毒DNA或RNA相同的方式进行逆转录和/或扩增，-从相同微生物提取的完全核苷酸序列，或-合成制备的完全核苷酸序列。

根据本发明方法的一种特别有利的变异方案，制备并储存待定量或检测的DNA或RNA型完全微生物的已知校准浓度的制备物，或所述微生物基因组DNA或RNA相当于该微生物已知浓度之浓度的制备物，直到使用者支配。

为简化说明，以下仅示意性举例说明由扩增完成的检测，更精确地说是通过PCR或RT-PCR完成，然而，其他扩增方法也可以使用，例如NASBA(即基于核糖序列的扩增)方法。

本发明的分子定量和检测对小微生物以及较大的微生物都显示显著的益处，这些微生物浓度低，或其传统的经验测定技术在发达国家中不再适用于系统常规。

本发明还涉及用于DNA或RNA微生物定量和检测的试剂盒或仪器整合，在适当的容器中和/或以适当的装置形式，其主要包括：-待定量或检测的DNA或RNA型完全微生物的一系列已知浓度标准品，或相当于所述微生物已知浓度的一系列浓度的DNA或RNA，-靶微生物和标准品的DNA或RNA的提取，揭示和/或及逆转录和/或扩增(特别是PCR，RT-PCR或NASBA扩增)的系列仪器设备。

-分析靶微生物或标准品微生物的DNA或RNA或者揭示或扩增产物的工具。

所述的试剂盒或仪器整合还可任选地包括一内部对照，例如约103拷贝/μl的杂合质粒DNA或转录RNA，以作为扩增或RT-扩增的效率的对照。

应注意的是PCR或RT-PCT产物的分析工具可由该试剂盒以外的工具组成，并与该试剂盒结合使用。这些工具例如可包括通过电泳、比色法、放射性测量法或任何其他适当的分析方法测定的装置和/或产品。

上述方法和相关系列设备以新颖的方式提供了DNA或RNA微生物的绝对定量，因为靶微生物或其待定量的基因组与微生物标准品或其平行提取的基因组是相同的。而且，已证明本方法加上系列设备为微生物体的定量和鉴定提供了一种国际通用技术，因为它能对所有微生物进行定量。

除定量的功能以外，采用RNA或DNA微生物逆转录和/或扩增的现有方法，本发明的方法和工具可测到的最小量的微生物。具体而言，可测到的最小量的DNA微生物为1-5个微生物的水平，而最小量的RNA微生物为10-100个微生物。

以下参考附图更具体地描述本发明。附图不以任何方式限制本发明，其中：-图1表示用多种不同浓度的相同病毒DNA标准品进行的各种PCR实验的检测敏感性差异和扩增效率差异的图示；-图2表示用多种不同浓度的相同病毒RNA标准品进行的各种RT-PCR实验的检测敏感性差异和扩增效率差异的图示；

-图3表示在同一实验中用来自不同病人之病毒制备物的多种浓度DNA进行的PCR实验中，扩增效率差异的图示；-图4表示分别用来自同一病毒多种制备物的多种浓度DNA以及来自两种不同质粒的多种浓度DNA进行的PCR实验中，扩增效率差异的图示；-图5表示用来自不同病人之病毒制备物的多种浓度RNA进行的RT-PCR实验中，扩增效率差异的图示；-图6表示分别用来自同一病毒多种制备物的多种浓度RNA和两种不同转录物的RNA进行的RT-PCR实验中，扩增效率差异的图示。

例如(用于说明)，从一种培养物中浓缩、纯化并提取HIV的RNA以便获得300ng；已知HIV核苷酸总数是19000，且核苷酸的分子量为330道尔顿，从而推算出HIV RNA的总分子量为6,300,000道尔顿。然后通过利用阿佛加德罗常数计算获得病毒基因组的及产生300ng RNA的病毒的准确数目，即约3×1010病毒。已知一份纯化病毒制备物的病毒浓度，然后就可以制备一系列该病毒的标准品，并用于本发明的方法中。

本发明的方法能进行可靠的鉴定和/或绝对定量，因为(待测)靶微生物与微生物标准品相同。而且实施本发明的方法是通用的，因为该方法可对所有可平行测定其量的微生物进行定量。

本发明方法用于其实施的试剂盒不但可用于所有介质和样品中微生物的定量，而且还可用于检测用RNA或DNA微生物逆转录和/或扩增的现有方法可测得的最小量的微生物。

对DNA微生物而言，可测到的最小量是1-5个微生物的水平，对RNA微生物而言，其为10-100个微生物。

本发明给微生物的体外定量测定带来一决定性的进步，获得了一种用于定量标准化的简便有效的方法和技术。

在下列实例中更详细地描述本发明，这些实施例不限制本发明，其中的比例和百分比在无相反说明的情况下均为重量/重量比。

实施例1  证明用PCR检测及定量靶DNA的通用标准品的必要性我们研究了对来自相同HBV不同浓度的DNA的检测敏感性和PCR扩增效率的差异。用血浆采取法从具有高HBsAg滴度的HBV长期携带者获得血浆。通过离心(在Spinco 25离心机中4℃25,000转/分钟过夜)穿过一处于TEBM介质(Tris-HCL 0.01M，pH7.6，Na-EDTA 0.001M，1％牛血清白蛋白和0.3％ 2-巯基乙醇)中30％(重量/体积)蔗糖组成的床，纯化了HBV的DNA病毒颗粒。分级的HBV病毒颗粒的纯度随后通过电子显微镜测定。借助于有商品供应的DNA纯化试剂盒提取了病毒颗粒的DNA。所得病毒DNA用分光光度计定量。病毒DNA的拷贝数用HBV DNA的病毒基因组的分子量计算。或者也可以通过电子显微镜确定病毒颗粒的数目与纯度。HBV的DNA系列稀释液(10，100，1000，10000个拷贝)进行连续的相同PCR循环(94℃60秒，56℃60秒及72℃90秒)，使用100pmol对HBV C基因特异的引物对：(GCTTTGGGGCATGGACATTGCC/GACTACTAGATCCCTGGATGCTGG)。通过与一末端γ-32P标记的探针(TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC)进行斑点印迹杂交，分析特异PCR产物，每个PCR信号的每分钟计数(cpm)借助于β放射计数器进行记录。

记录这些结果并以图示形式报告在图1中。图1清楚地显示标准品给出不同的结果，因此应在每次实验中与靶样品平行使用。

因此，对于每个恒定的模板DNA输入(拷贝数)，按照图1的曲线，不同实验间PCR产物的浓度存在大的差别。

实施例2 证明用于RT-PCR检测及定量靶RNA的通用标准品的必要性我们研究了对来自相同HIV-1不同浓度的RNA的检测敏感性和PCR逆转录/扩增效率的差异。将原代分离病毒感染血单核母细胞，其培养物的上清液通过一琼脂糖凝胶柱，纯化HIV-1的RNA病毒颗粒。分级的HIV-1病毒颗粒的纯化随后用电子显微镜测定。借助于有商品供应的RNA分离试剂盒提取了病毒颗粒的RNA。所得病毒RNA通过分光光度测定法定量。通过HIV-1 RNA病毒基因组的分子量计算了病毒RNA的拷贝数。加入1μgtRNA后，将此RNA样品的系列稀释液(1,000,000、100,000、10,000、1,000拷贝)沉淀并重悬于10μl。将10μl RNA和1μg对照tRNA(无HIV)立即加入到每个RT-PCR反应混合物(qoul)，反应混合物中含有10单位重组的Moloney鼠白血病毒逆转录酶和3单位ampli Taq DNA聚合酶，以扩增HIV的gag基因。RT-PCT按如下进行：42℃25分钟，再于94℃5分钟，然后使用PCR循环(94℃60秒，56℃60秒和72℃90秒)，PCR使用100pmol对HIV gag基因特异的引物对(GGAACATCAAGCAGCCATGC/TCCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC).通过一末端γ-32P标记的探针(ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC)进行斑点印迹杂交分析特异PCR产物，每个PCR信号的每分钟计数(cpm)通过β放射计数器记录。

记录结果并以图示形式报告在图2中。图2显示每个实验间的结果差异很大。而且还清楚地显示标准品给出不同的结果，因此应在每次实验中与靶样品平行进行。

因此，对于每个恒定的RNA输入(拷贝数)，按照图2的曲线，不同实验间的PCR产物的浓度存在大的差别。实施例3  病毒颗粒DNA标准品的有效性本实施例说明来自不同HBV感染病人血清的野生HBV病毒颗粒DNA经相同PCR循环后扩增效率的一致性。如实施例1中所示制备的HBV病毒颗粒不同的DNA的系列稀释样品在相同实验中进行相同数目的PCR循环。PCR产物(输出)通过斑点印迹定量并以cpm计数。

结果以图表形式报告于图3中。结果显示无论何种来源的HIV颗粒(此处为4种不同来源)，PCR扩增的效率是一致的。实施例4 病毒颗粒DNA标准品的有效性如同实施例3中所述进行操作，但每次对野生病毒颗粒DNA以及来自两个HBV质粒的DNA(输入)进行相同PCR循环，可以建立PCR扩增的比较效率(见图4)。

HBV的C基因序列的DNA片段从HBVsAg+血清通过PCR产生，并连接在质粒pGEM-3Z(Promega)和pCTR(Invitrogen)中(分别为HBV的DNA1和DNA2的质粒)。所有构建物通过用适当的商购试剂盒进行DNA测序而证实。

以图表形式报告在图4中的结果表明，已知数量的拷贝可与来自多个样本的野生型病毒DNA相同数量拷贝有或无可比的扩增效率。

从实施例3和4可得出：不同来源HBV病毒颗粒的已知浓度DNA构成理想的通用标准品，而整合在不同质粒中的病毒DNA片段它们之间及与野生型DNA的表现不同。实施例5 病毒颗粒RNA标准品的有效性本实施例说明来自不同HIV感染病人血清的野生HIV病毒颗粒RNA经相同RT-PCR循环后扩增效率的一致性。如实施例2中所示制备的HIV病毒颗粒不同的RNA的系列稀释样品在相同实验中进行相同数目的RT-PCR循环。PCR产物(输出)通过斑点印迹定量并以cpm计数。

以图表形式报告在图5中的结果表明无论何种来源的HIV病毒颗粒，其RT-PCR扩增的效率是一致的。实施例6 病毒颗粒RNA标准品的有效性如同实施例5中所述进行操作，但每次对野生病毒颗粒RNA以及具有已知拷贝数的转录物RNA(输入)进行相同的RT-PCT循环，可以建立RT-PCR扩增的比较效率(见图6)。

HIV-1的gag序列的RNA片段通过用T7 RNA聚合酶对HIV-1的DNA模板(分别为质粒HIV-Z6 DNA pBR322和质粒HIVmBDNA pBH20-R3)进行转录而产生(分别为HIV的转录物RNA1和RNA2)。

以图表形式报告在图6中的结果表明，具有已知拷贝数的转录物RNA经RT-PCT扩增的效率与样品RNA的效率不同。

从实施例5和6可得出：各种来源的HIV病毒颗粒的已知浓度RNA构成理想的通用标准品，而整合在不同质粒中的病毒RNA片段它们之间及与野生型RNA的表现均不同。

因此：

-为了使定量PCR试验中扩增效率一致，按照本发明利用病毒颗粒DNA作为外标远比质粒DNA作为外标或内标精确且简便；-为了使定量RT-PCR试验中扩增效率一致，按照本发明利用病毒颗粒RNA作为外标远比转录物RNA作为外标或内标精确且简便。实施例7 通过显色法检测的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒7.1简介本发明的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒设计用来检测和定量在任何无细胞生理液体(如血浆、血清、精液、支气管肺泡液等)以及培养物上清中的HIV基因组RNA(包括所有的HIV-0、HIV-1和HIV-2基因型)。试剂盒中包括使用快速方法分离病毒RNA所需的试剂-用克隆的Moloney鼠白血病病毒逆转录酶将HIV病毒RNA逆转录成cDNA-用Taq DNA聚合酶扩增-最后用简单的琼脂糖凝胶显色程序进行定量检测，这使得在8小时内在一单个测试中可检测1000个病毒RNA拷贝，定量范围大于4个数量级。提供了足够最终体积为50μl程序的100个反应(每个反应40μl)的试剂。

如上所述该试剂盒含有一系列HIV病毒标准品(以下称“病毒标准”)(104、103、102、10拷贝/μl，供4批测试)，这使得能精确测定血浆/血清中的HIV病毒RNA浓度。该试剂盒还含有作为阳性扩增信号对照的质粒HIV DNA(102拷贝/反应，供4批测试)，以及任选地加入到每一待测样品中的用作内部对照(以下称为“IC”)的杂合转录物RNA(103拷贝/反应，供100个反应)。7.2试剂盒组分清单HIV基因组定量试剂盒应优选在一恒温冰箱中于-20℃储存，或用合适的酶储存液于4℃储存。如果在合适的条件下储存，该产物可在标签上指定的控制日期内保持稳定。编号     试剂              体积   数量     功能1       HIV病毒标准品1a  病毒标准品1(104拷贝/μl)  0.4ml    1    校准样品RNA1b  病毒标准品2(103拷贝/μl)  0.4ml    1    校准样品RNA1c  病毒标准品3(102拷贝/μl)  0.4ml    1    校准样品RNA1d  病毒标准品4(10拷贝/μl)    0.4ml    1    校准样品RNA1e  病毒标准品5(HIV阴性血清)   0.4ml    1    特异性(阴性)对照2   tRNA(0.1mg/ml)             1ml      1    作为样品RNA的载体RNA3   RNA储存缓冲液              250μl   4    溶解RNA样品4   HIV扩增混合物，带有HIV引   1ml      4    与HIV RNA和cDNA物和IC引物(如果有)                       基因组杂交5   酶混合物                   28μl    4    逆转录靶RNA并扩增cDNA6   质粒HIV DNA                40μl    1    HIV cDNA(阳性)(102DNA拷贝/μl)                        信号对照7   任选的IC(103DNA拷贝/μl)  1ml      1    RT扩增效率的内部对照8   灭菌水                     40μl    1    本底(阴性)信号对照7.3试剂和设备7.3.1试剂-氯仿(ACS级)-异丙醇(ACS级)-75％乙醇(ACS级)-琼脂糖(无DNase)-溴化乙锭-RNA分离溶液7.3.2设备-微型离心机(4℃)-真空设备-盖加热热循环仪-发电机和电泳水浴7.4  通过逆转录相连的基因组扩增进行HIV定量的程序7.4.1 RNA提取将100μl HIV病毒标准品和血浆或血清样品与400μl RNA分离溶液一起在匀浆机中进行若干击打以匀浆，加入60μl氯仿并剧烈振荡15秒，置于冰上10分钟，悬液在4℃于12,000g离心15分钟。

加入氯仿和离心后，匀浆物形成两相：下层苯酚-氯仿相(约240μl)和上层水相(约320μl)，RNA仅存在于水相中，而DNA和蛋白质则位于界面和有机相中。

将水相(300μl)转移到新试管中，加入等体积的异丙醇，在-20℃储存样品1小时。样品于12,000g(4℃)离心10分钟并短时干燥沉淀。移去上清，用75％乙醇(500μl)振荡洗RNA沉淀一次，最后真空干燥RNA沉淀。将RNA沉淀溶于11μl RNA储存缓冲液中。

RNA沉淀在试管底部形成白-黄色沉淀(仅在大量时可见)。重要的是不要使RNA沉淀完全干燥，因为干燥会极大地降低其溶解性。7.4.2 RNA逆转录和cDNA扩增将10μl RNA样品和阳性/阴性对照加到新的(200μl)试管中。向每一管中加入40μl HIV逆转录/扩增混合物(RTAM)(38.9μl HIV扩增混合物+1.1μl酶混合物)，将试管转移到一盖加热热循环仪中。

-42℃25分钟；-94℃5分钟；-35个循环(94℃35秒，55℃45秒，72℃60秒)；-然后55℃5分钟，再72℃5分钟。7.5显色和定量将10μl反应后混合物加到含0.5μg/ml溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中，在150V电泳10分钟。

通过大小的不同，特异性扩增的HIV序列可以很容易地辨别出，通过比较其扩增条带和HIV病毒标准品的扩增条带可以估计出在100μl血浆/血清样品中的HIV病毒RNA的拷贝数范围(半定量)。实施例8 通过光密度阅读器检测的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒8.1简介本发明的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒设计用来检测和定量在任何无细胞生理液体(如血浆、血清、精液、支气管肺泡液等)以及培养物上清中的HIV基因组RNA(包括所有的HIV-0、HIV-1和HIV-2基因型)。试剂盒中包括使用快速方法分离病毒RNA所需的试剂-用克隆的Moloney鼠白血病病毒逆转录酶将HIV病毒RNA逆转录成cDNA-用Taq DNA聚合酶扩增-最后用DIG相连的液体杂交程序进行定量检测，这使得在8小时内在一单个测试中可检测100个病毒RNA拷贝，定量范围约2个数量级。提供了足够最终体积为50μl程序的100个反应(每个反应40μl)的试剂。

该试剂盒含有一系列HIV病毒标准品(103、102、10、1拷贝/μl，供4批测试)，这使得能精确测定血浆/血清中的HIV病毒RNA浓度。该试剂盒还含有作为阳性扩增信号对照的质粒HIV DNA(102拷贝/反应，供4批测试)，以及任选地加入到每一待测样品中的用作IC的杂合转录物RNA(103拷贝/反应，供100个反应)。8.2试剂盒组分清单HIV基因组定量试剂盒应优选在一恒温冰箱中于-20℃储存，或用合适的酶储存液于4℃储存。如果在合适的条件下储存，该产物可在标签上指定的控制日期内保持稳定。编号  试剂                      体积    数量     功能I   逆转录(RT)相连的HIV基因组扩增和DIG标记1   HIV病毒标准品1a  病毒标准品1(103拷贝/μl)   0.4ml    1    校准样品RNA1b  病毒标准品2(102拷贝/μl)   0.4ml    1    校准样品RNA1c  病毒标准品3(10拷贝/μl)     0.4ml    1    校准样品RNA1d  病毒标准品4(1拷贝/μl)      0.4ml    1    校准样品RNA1e  病毒标准品5(HIV阴性血清)    0.4ml    1    特异性(阴性)对照2   tRNA(0.1mg/ml)              1ml      1     作为样品RNA的载体RNA3   RNA储存缓冲液               250μl   4     溶解RNA样品4   HIV扩增混合物，带有HIV引    1ml      4     与HIV RNA和cDNA物和IC引物(5％DIG-dUTP)                    基因组杂交5   酶混合物                    28μl    4     逆转录靶RNA并扩增cDNA6   质粒HIV DNA                 40μl    1     HIV cDNA(阳性)(102DNA拷贝/μl)                          信号对照7   杂合转录物RNA               1ml      1     RT扩增效率的内(103拷贝/μl)                             部对照8   灭菌水                      40μl    1     本底(阴性)信号对照II液体杂交和DIG检测9   生物素化的HIV探针           200μl   1     在液体杂交中捕获HIV cDNA10  生物素化内部对照            100μl   1     在液体杂交中捕获DNA特异性探针                              IC cDNA11  变性缓冲液                  4ml      1     使扩增的dsDNA变性12  杂交缓冲液                  40ml     1     使探针与靶DNA杂交13  清洗缓冲液(10×)            50ml     1     除去非特异性DNA14  链亲和素包被的珠            200(8孔) 1(24) 在液体杂交中捕获(或微孔板)                                 已杂交的HIV cDNA15  抗-DIG-POD工作液            40ml     1     与特异性扩增产物的DIG分子结合16  ABTS底物溶液                40ml     1     使得在POD系统中显色8.3  试剂和设备8.3.1  试剂-氯仿(ACS级)-异丙醇(ACS级)-75％乙醇(ACS级)-RNA分离溶液-链亲和素包被的微孔板8.3.2设备-微型离心机(4℃)-真空设备-盖加热热循环仪-用于液体杂交的水浴或温浴器-自动光密度阅读器8.4通过逆转录相连的基因组扩增进行HIV定量的程序8.4.1 RNA提取将100μl HIV病毒标准品和血浆或血清样品与400μl RNA分离溶液一起在匀浆机中进行若干击打以匀浆，加入60μl氯仿并剧烈振荡15秒，置于冰上10分钟，悬液在4℃于12,000g离心15分钟。

加入氯仿和离心后，匀浆物形成两相：下层苯酚-氯仿相(约240μl)和上层水相(约320μl)，RNA仅存在于水相中，而DNA和蛋白质则位于界面和有机相中。

将水相(300μl)转移到新试管中，加入等体积的异丙醇，在-20℃储存样品1小时。样品于12,000g(4℃)离心10分钟并短时干燥沉淀。移去上清，用75％乙醇(500μl)振荡洗RNA沉淀一次，最后真空干燥RNA沉淀。将RNA沉淀溶于11μl RNA储存缓冲液中。

RNA沉淀在试管底部形成白-黄色沉淀(仅在大量时可见)。重要的是不要使RNA沉淀完全干燥，因为干燥会极大地降低其溶解性。8.4.2 RNA逆转录和cDNA扩增将10μl RNA样品和阳性/阴性对照加到新的(200μl)试管中。向每一管中加入40μl HIV逆转录/扩增混合物(RTAM)(38.7μl HIV扩增混合物+1.1μl酶混合物+0.2μl DIG-dUTP)，将试管转移到一盖加热热循环仪中。

-42℃25分钟；-94℃5分钟；-36个循环(94℃35秒，55℃45秒，72℃60秒)；-然后55℃5分钟，再72℃5分钟。8.5检测和定量将2μl扩增产物(×2)和10倍稀释液(×2)加入到新管中并于室温与18μl变性溶液混合10分钟。加入含HIV探针和IC探针的180μl杂交溶液(×4)后，振荡，随后吸入到链亲和素包被的微孔板的孔中，在振荡器上于37℃培养2小时，弃去溶液并用200μl清洗缓冲液洗每孔3次。加入200μl抗-DIG-POD工作液后在振荡器上于37℃培养30分钟，在培养期间保持板处于暗处。在405nm读吸收值，通过使用由HIV病毒标准品产生的标准曲线用自动计算机系统可给出每毫升每种血浆/血清样品中的HIV颗粒数(绝对定量)。实施例9 通过荧光检测的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒9.1简介本发明的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒的设计和使用相同于实施例8所述，只是在一个单一测试中在7小时内的定量范围约4个数量级。9.2试剂盒组分清单HIV基因组定量试剂盒应优选在一恒温冰箱中于-20℃储存，或用合适的酶储存液于4℃储存。如果在合适的条件下储存，该产物可在标签上指定的控制日期内保持稳定。编号    试剂                          体积       数量      功能I   逆转录(RT)相连的HIV基因组扩增1   HIV病毒标准品1a  病毒标准品1(103拷贝/μl)        0.4ml        1    校准样品RNA1b  病毒标准品2(102拷贝/μl)        0.4ml        1    校准样品RNA1c  病毒标准品3(10拷贝/μl)          0.4ml        1    校准样品RNA1d  病毒标准品4(1拷贝/μl)           0.4ml        1    校准样品RNA1e  病毒标准品5(HIV阴性血清)         0.4ml        1    特异性(阴性)对照2   tRNA(0.1mg/ml)                   1ml          1    作为样品RNA的载体RNA3   RNA储存缓冲液                    250μl       4    溶解RNA样品4    HIV扩增混合物，带有HIV引       1ml        4    与HIV RNA和cDNA物和IC引物                                     基因组杂交5    酶混合物                       28μl      4    逆转录靶RNA并扩增cDNA6    质粒HIV DNA                    40μl      1    HIV cDNA(阳性)(102DNA拷贝/μl)                              信号对照7    杂合转录物RNA                  1ml        1    RT扩增效率的内(103拷贝/μl)                                 部对照8    灭菌水                         40μl      1    本底(阴性)信号对照II液体杂交和荧光计数9   HIV探针(+&-菌株)-               8孔        12   在液体杂交中捕获包被的微孔板                                    HIV cDNA10  IC-探针包被的微孔板             8孔        12   在液体杂交中捕获IC cDNA11  变性缓冲液                      2ml        1    使扩增的dsDNA变性12  杂交缓冲液                      20ml       1    使探针与靶DNA杂交13  清洗缓冲液                      100ml      1    使特异性扩增的DNA保持在微孔板中14  荧光染料                        10ml       1    检测扩增后的dsDNA9.3 试剂和设备9.3.1 试剂-氯仿(ACS级)-异丙醇(ACS级)-75％乙醇(ACS级)-RNA分离溶液9.3.2设备-微型离心机(4℃)-真空设备或离心泵-盖加热热循环仪-用于液体杂交的水浴或温浴器-灵敏的荧光计9.4 通过逆转录相连的基因组扩增进行HIV定量的程序9.4.1 RNA提取将100μl HIV病毒标准品和血浆或血清样品与400μl RNA分离溶液一起在匀浆机中进行若干击打以匀浆，加入60μl氯仿并剧烈振荡15秒，置于冰上10分钟，悬液在4℃于12,000g离心15分钟。

加入氯仿和离心后，匀浆物形成两相：下层苯酚-氯仿相(约240μl)和上层水相(约320μl)，RNA仅存在于水相中，而DNA和蛋白质则位于界面和有机相中。

将水相(300μl)转移到新试管中，加入等体积的异丙醇，在-20℃储存样品1小时。样品于12,000g(4℃)离心10分钟并短时干燥沉淀。移去上清，用75％乙醇(500μl)振荡洗RNA沉淀一次，最后真空干燥RNA沉淀。将RNA沉淀溶于11μl RNA储存缓冲液中。

RNA沉淀在试管底部形成白-黄色沉淀(仅在大量时可见)。重要的是不要使RNA沉淀完全干燥，因为干燥会极大地降低其溶解性。9.4.2RNA逆转录和cDNA扩增将10μl RNA样品和阳性/阴性对照加到新的(200μl)试管中。向每一管中加入40μl HIV逆转录/扩增混合物(RTAM)(38.9μl HIV扩增混合物+1.1μl酶混合物)，将试管转移到一盖加热热循环仪中。

-42℃25分钟；-94℃5分钟；-35个循环(94℃35秒，55℃45秒，72℃60秒)；-然后55℃5分钟，再72℃5分钟。9.5检测和定量将5μl(×2)反应后混合物加入到新管中并于室温与15μl变性溶液混合10分钟。加入180μl(×2)杂交溶液后，振荡，随后吸入到HIV探针包被的微孔板的孔中，在振荡器上于37℃培养2小时，弃去溶液并用200μl清洗缓冲液洗每孔3次。加入100μl荧光染料溶液后将微孔板移至一自动荧光计中进行荧光计数并打印结果。实施例10 通过化学发光检测的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒10.1简介本发明的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组定量试剂盒的设计和使用相同于实施例8所述，只是在一个单一测试中在7小时内的定量范围大于4个数量级。10.2试剂盒组分清单HIV基因组定量试剂盒应优选在一恒温冰箱中于-20℃储存，或用合适的酶储存液于4℃储存。如果在合适的条件下储存，该产物可在标签上指定的控制日期内保持稳定。编号      试剂                  体积    数量    功能I   逆转录(RT)相连的HIV基因组扩增1   HIV病毒标准品1a  病毒标准品1(103拷贝/μl)   0.4ml    1    校准样品RNA1b  病毒标准品2(102拷贝/μl)   0.4ml    1    校准样品RNA1c  病毒标准品3(10拷贝/μl)     0.4ml    1    校准样品RNA1d  病毒标准品4(1拷贝/μl)      0.4ml    1    校准样品RNA1e  病毒标准品5(HIV阴性血清)    0.4ml    1    特异性(阴性)对照2   tRNA(0.1mg/ml)              1ml      1    作为样品RNA的载体RNA3   RNA储存缓冲液               250μl   4    溶解RNA样品4   HIV扩增混合物，带有生物素   1ml      4    与HIV RNA和cDNA化的HIV和IC引物                           基因组杂交5   酶混合物                    28μl    4    逆转录靶RNA并扩增cDNA6   质粒HIV DNA                 40μl    1    HIV cDNA(阳性)(102DNA拷贝/μl)                         信号对照7   杂合转录物RNA               1ml      1    RT扩增效率的内(103拷贝/μl)                            部对照8   灭菌水                      40μl    1    本底(阴性)信号对照II液体杂交和化学发光标记9   HIV特异性探针       100μl    1        与HIV cDNA特异性杂交10  IC DNA特异性探针    100μl    1        与IC cDNA特异性杂交11  变性缓冲液          5ml       1        使扩增的dsDNA变性12  杂交缓冲液          50ml      1        使探针与靶DNA杂交13  清洗缓冲液(10×)    50ml      1        除去微孔板中的非特异性的DNA14  链亲和素包被的珠    200(8孔)  1(24)    在液体杂交中捕获(或微孔板)                             已杂交的HIV cDNA15  抗-dsDNA-APL工作液  10ml      1        标记已杂交的靶DNA16  化学发光底物溶液    10ml      1        化学发光检测和定量10.3 试剂和设备10.3.1 试剂-氯仿(ACS级)-异丙醇(ACS级)-75％乙醇(ACS级)-RNA分离溶液10.3.2 设备-微型离心机(4℃)-真空设备或离心泵-盖加热热循环仪-用于液体杂交的水浴或温浴器-发光计10.4 通过逆转录相连的基因组扩增进行HIV定量的程序10.4.1 RNA提取将100μl HIV病毒标准品和血浆或血清样品与400μl RNA分离溶液一起在匀浆机中进行若干击打以匀浆，加入60μl氯仿并剧烈振荡15秒，置于冰上10分钟，悬液在4℃于12,000g离心15分钟。

加入氯仿和离心后，匀浆物形成两相：下层苯酚-氯仿相(约240μl)和上层水相(约320μl)，RNA仅存在于水相中，而DNA和蛋白质则位于界面和有机相中。

将水相(300μl)转移到新试管中，加入等体积的异丙醇，在-20℃储存样品1小时。样品于12,000g(4℃)离心10分钟并短时干燥沉淀。移去上清，用75％乙醇(500μl)振荡洗RNA沉淀一次，最后真空干燥RNA沉淀。将RNA沉淀溶于11μl RNA储存缓冲液中。

RNA沉淀在试管底部形成白-黄色沉淀(仅在大量时可见)。重要的是不要使RNA沉淀完全干燥，因为干燥会极大地降低其溶解性。10.4.2RNA逆转录和cDNA扩增将10μl RNA样品和阳性/阴性对照加到新的(200μl)试管中。向每一管中加入40μl HIV逆转录/扩增混合物(RTAM)(38.9μl HIV扩增混合物+1.1μl酶混合物)，将试管转移到一盖加热热循环仪中。

-42℃25分钟；-94℃5分钟；-35个循环(94℃35秒，55℃45秒，72℃60秒)；-然后55℃5分钟，再72℃5分钟。10.5检测和定量将5μl(×2)反应后混合物加入到2个新管中并于室温与15μl变性溶液混合10分钟。加入180μl(×2)含HIV特异性探针或内部对照(IC)DNA特异性探针的杂交溶液后，振荡，随后吸入到装有链亲和素包被的珠的试管中或链亲和素包被的微孔板的孔中，在振荡器上于37℃培养2小时，弃去溶液并用200μl清洗缓冲液洗每孔3次。加入200μl用碱性磷酸酶(APL)缀合的抗dsDNA抗体，随后在振荡器上于37℃培养30分钟，用200μl清洗缓冲液洗3次后加入100μl化学发光底物溶液。然后，立即将将微孔板移至一发光计中进行化学发光计数并打印结果。通过使用由HIV病毒标准品产生的标准曲线用自动计算机系统可给出每毫升每种血浆/血清样品中的HIV颗粒数(绝对定量)。实施例11 通过化学发光检测的人乙肝病毒(HBV)基因组定量试剂盒11.1简介本发明的人乙肝病毒(HBV)基因组定量试剂盒设计用来检测和定量在任何无细胞生理液体(如血浆、血清、精液、支气管肺泡液等)中的HBV基因组DNA。试剂盒中包括使用快速方法分离病毒DNA，用Taq DNA聚合酶扩增HBV病毒DNA-最后用化学发光相连的液体杂交程序进行定量检测所需的试剂，这使得在5小时内在一单个测试中可检测50个病毒DNA拷贝，定量范围超过4个数量级。提供了足够最终体积为50μl程序的100个反应(每个反应40μl)的试剂。

该试剂盒含有一系列HBV病毒标准品(104、103、102、10拷贝/μl，供4批测试)，这使得能精确测定血浆/血清中的HBV病毒DNA浓度。该试剂盒还含有作为阳性扩增信号对照的质粒HBV DNA(103拷贝/反应，供4批测试)，以及任选地加入到每一待测样品中的用作IC的杂合质粒DNA(103拷贝/反应，供100个反应)。11.2试剂盒组分清单HBV基因组定量试剂盒应优选在一恒温冰箱中于-20℃储存，或用合适的酶储存液于4℃储存。如果在合适的条件下储存，该产物可在标签上指定的控制日期内保持稳定。编号   试剂                      体积   数量     功能I   HBV基因组扩增1   HBV病毒标准品1a  病毒标准品1(104拷贝/μl)    0.2ml    1    校准样品DNA1b  病毒标准品2(103拷贝/μl)    0.2ml    1    校准样品DNA1c  病毒标准品3(102拷贝/μl)    0.2ml    1    校准样品DNA1d  病毒标准品4(10拷贝/μl)      0.2ml    1    校准样品DNA1e  病毒标准品5(HBV阴性血清)     0.2ml    1    特异性(阴性)对照2   HBV扩增混合物，带有生物素    1.1ml    4    与HBV DNA基因组化的HBV和IC引物                            杂交3   Taq DNA聚合酶                25μl    4    扩增靶DNA4   质粒HBV DNA                  50μl    1    HBV cDNA(阳性)(102DNA拷贝/μl)                          信号对照5    杂合质粒DNA            1ml       1      扩增效率的内(102DNA拷贝/μl)                       部对照6    灭菌水                 100μl    1      本底(阴性)信号对照7    DNA溶解缓冲液II液体杂交和化学发光标记8    HBV特异性探针          100μl    1      与HBV cDNA特异性杂交9    IC DNA特异性探针       100μl    1      与IC DNA特异性杂交10   变性缓冲液             5ml       1      使扩增的dsDNA变性11   杂交缓冲液             50ml      1      使探针与靶DNA杂交12   清洗缓冲液(10×)       50ml      1      除去非特异性的DNA13   链亲和素包被的珠       200(8孔)  1(24)  在液体杂交中捕获(或微孔板)                              已杂交的HBV cDNA14   抗-dsDNA-APL工作液     10ml      1      标记已杂交的靶DNA15   化学发光底物溶液       10ml      1      化学发光检测和定量11.3所需设备-微型离心机-盖加热热循环仪-用于液体杂交的水浴-发光计11.4样品制备和扩增程序11.4.1样品制备将50μl HBV病毒标准品和血浆或血清样品与50μl DNA溶解缓冲液一起匀浆，然后置于98℃15分钟，在7,500g离心10分钟。

离心后DNA仅存在于液相(10-15μl)中，而蛋白质则位于沉淀中。11.4.2cDNA扩增将10μl所述的液相转移到一新的(200μl)试管中。向每一管中加入40μl HBV扩增混合物(40μl HBV扩增混合物+5μl TaqDNA聚合酶)，将试管转移到一盖加热热循环仪中。

-42℃25分钟；-94℃5分钟；-35个循环(94℃35秒，55℃45秒，72℃60秒)；-然后72℃5分钟。11.5显色和定量将5μl(×2)反应后混合物平行加入到2个新管中并于室温与15μl变性溶液混合10分钟。加入180μl(×2)含HBV特异性探针或IC-DNA特异性探针的杂交溶液后，振荡，随后吸入到装有链亲和素包被的珠的试管中或链亲和素包被的微孔板的孔中，在振荡器上于37℃培养2小时，弃去溶液并用200μl清洗缓冲液洗每孔3次。加入200μl用碱性磷酸酶(APL)缀合的抗dsDNA抗体，随后在振荡器上于37℃培养30分钟，用200μl清洗缓冲液洗3次后加入100μl化学发光底物溶液。然后，立即将将微孔板移至一发光计中进行化学发光计数并打印结果。通过使用由HBV病毒标准品产生的标准曲线用自动计算机系统可给出每毫升每种血浆/血清样品中的HBV颗粒数(绝对定量)。