一种长期保藏微生物菌种的方法
专利汇可以提供一种长期保藏微生物菌种的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 菌种保藏方法，主要涉及 酵母 菌、芽胞杆菌、曲霉菌种的长期保藏方法。培养基的重量配比：玉米面40～70%，麸皮5～30%， 豆粕 粉15～35%，料 水 配比1∶0.8～1.2；培养基分装灭菌：按上述配量培养基物料与水混合，分装入试管，高压 蒸汽 灭菌1.2atm，30～45min，冷却备用；接种培养：于无菌条件下接入1～2环菌种(0.1～0.2ml)，于 培养箱 中26～30℃培养2～3天；干燥保藏：在40～45℃条件下干燥2～3天，使水份控制在≤6%， 包装 置于 冰 箱 中于1～4℃或-16℃～-20℃保藏期达到3～5年。此方法设备投入少，在普通的冰箱就能实现菌种长期保藏，实用性强，具有操作简单、稳定可靠、成本低廉、保藏期长的特点。，下面是一种长期保藏微生物菌种的方法专利的具体信息内容。
1、一种长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于该保藏方法如下：
a)培养基的重量配比：玉米面40～70％，麸皮5～30％，豆粕粉15～35％， 料水配比1∶0.8～1.2；
b)培养基分装灭菌：按上述配量培养基物料与水混合，分装入试管，高压 蒸汽灭菌1.2atm，30～45min，冷却备用；
c)接种培养：于无菌条件下接入1～2环菌种，于培养箱中26～30℃培养2～ 3天；
d)干燥保藏：在40～45℃条件下干燥2～3天，使水份控制在≤6％，包装 置于冰箱中于1～4℃或-16℃～-20℃保藏期达到3～5年。
2、按照权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征是用该方法 保藏的菌种有酵母菌、芽胞杆菌、曲霉菌种。
3、按照树种要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征是培养基的 重量配比选择为玉米面50～60％，麸皮15～20％，豆粕粉25～30％，料水配比1∶ 0.8～1.0。
技术领域
本发明涉及微生物菌种保藏方法，主要涉及酵母菌、芽胞杆菌、曲霉菌种 的长期保藏方法。
背景技术
斜面定期移植保藏法：通常是采用在带棉塞的玻璃试管内，用少于1/3管的 无菌的固体培养基摆成斜面，中央划线的接种方法，在28-30℃培养2-3天后， 置于冰箱内4℃保藏，这种方法是用于微生物菌种的主要保藏方法，优点是操作 简单，缺点是斜面培养基与空气接触面大，脱水较快，一般在半年内就会干缩； 棉塞容易吸水变潮，容易导致菌种染菌；保藏温度较高，酵母菌种仍有一定的 代谢活动，可进行繁殖，为了防止菌种死亡，通常3-4个月就应该传代转管；加 大了菌种保藏的工作量；由于菌种传代频繁，菌种变异频率较高，需要对菌种 定期的分离复壮，给菌种的保藏带来较高的技术要求和较大的工作量。
液体石蜡保藏法：是定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下，菌 种的生物代谢受到抑制，细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入，使好气菌 不能继续生长，也可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌 种保藏时间的目的。该方法优点是菌种保藏时间长，一般2-10年不等。缺点是 只适应于不能分解液体石蜡的微生物菌种的保藏；菌种保藏时必须用试管架竖 直摆放，保藏占用的空间较大，保藏场所应保持干燥，防止棉塞污染；整个操 作比较繁琐。
冷冻干燥法是将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的 生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
氮超低温保藏是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的长 期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地 保藏微生物。
-80℃低温冷冻保藏是将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进 行冷冻的一种保藏方法。
上述三种方法都能较好地保藏微生物菌种，保藏周期长，变异频率低，缺 点是操作复杂，技术含量高，设备投入高，运行成本高，只适合专业保藏机构 使用，不适合生产企业使用。
发明内容
本发明所述微生物菌种保藏方法如下：
1、培养基的制备
培养基的重量配比：玉米面40-70％，麸皮5-30％，豆粕粉15-35％， 料水配比为：1∶0.8-1.2。
2、培养基分装与灭菌
按上述配量将培养基物料与水混合，分装于试管中，通常试管中装量为 1/3～2/3，塞好棉塞，高压灭菌，1.0-1.2atm，30-45min，取出趁热摇散，冷 却备用；
3、接种与培养
在无菌条件下接入1-2环菌种(0.1-0.2ml)，用接种针搅匀，松散水平放 入培养箱中26-30℃培养2-3天。
4、干燥与保藏
在40-45℃条件下干燥2-3天，使物料水份控制在≤6％，用牛皮纸包好，放 至冰箱中1～4℃冷藏或-16～-20℃冷冻保存，保藏期达到3～5年。
5、菌种复苏方法
将所保藏试管中的物料颗粒，在无菌条件下转入到新鲜斜面培养基上数粒， 放到培养箱中进行适温培养即可。
本发明优选的培养基重量配比为玉米面50～60％，麸皮15～20％，豆粕粉25～ 30％，料水配比1∶0.～1.0。
本发明首先选择适当的培养基及培养条件让微生物在培养物中生长，然后 在较温和的条件下将菌种脱水干燥，由于菌种细胞中含水量很低，可放入冰箱 中冷藏或冷冻保藏。此方法是将斜面试管保藏、冷冻干燥保藏、和低温保藏结 合起来的一种保藏方法。本法保藏微生物菌种，4℃冷藏可保藏3-4年，-18℃ 冷冻可保藏4-5年。此方法设备投入少，在普通的冰箱就能实现菌种长期保藏， 实用性强，具有操作简单、稳定可靠、成本低廉、保藏期长的特点。
具体实施方式
培养基的配制：玉米面60％，麸皮15％，豆粕粉25％，料水比1∶0.85。
将原料按上述比例混合，加入定量的水，分装于试管中，通常试管中装量为 1/3，塞好棉塞，高压灭菌，1.2atm，30～45min，取出趁热摇散，冷却备用。
在无菌条件下接入1-2环菌种(0.1-0.2ml)，所保藏的菌种如下：
编号 学名 中文名称 用途 E3-1 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 白酒酿造 E5-2 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 果酒酿造 E4-1 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 啤酒酿造 20238 Saccharomyces rouxii Boutr 鲁氏酵母 酱油酿造 20124 Handenula anomala 异常汉逊酵母 白酒生香 R15 Candida utilis 产朊假丝酵母 饲料酵母 S-02 Endomyces decipiens 近似内孢霉 饲料酵母 E2-3 Geotrichum candidum 白地霉 饲料酵母 Ys-01 Bacillus licheniformis 地衣芽胞杆菌 饲料 Ys-02 Bacillus cereus 腊样芽胞杆菌 饲料 As3.951 Aspergillus oryzae 米曲酶 酱油酿造 As3.350 Aspergillus awamori 泡盛曲酶 酱油酿造
用接种针搅匀，松散水平放入培养箱中28-30℃培养2-3天。
在40-45℃条件下干燥2-3天，检测试管中菌种的细胞数。用牛皮纸包好， 放至冰箱中4℃冷藏保存和-18℃冷冻保存。
菌种保藏初始细胞数测定结果
编号 学名 中文名称 细胞数(亿/ 克) E3-1 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 240 E5-2 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 45 E4-1 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 22 20238 Saccharomyces rouxii Boutr 鲁氏酵母 36 20124 Handenula anomala 异常汉逊酵母 47 R15 Candida utilis 产朊假丝酵母 68 S-02 Endomyces decipiens 近似内孢霉 88 E2-3 Geotrichum candidum 白地霉 18 Ys-01 Bacillus licheniformis 地衣芽胞杆 45 Ys-02 Bacillus cereus 腊样芽胞杆菌 42 As3.951 Aspergillus oryzae 米曲酶 130 As3.350 Aspergillus awamori 泡盛曲酶 110
4℃冷藏保存结果
4℃条件下不同年限菌种保藏存活率(％)单位：年
编号 中文名称 1年 2年 3年 4年 E3-1 酿酒酵母 87 80 15 0 E5-2 酿酒酵母 85 83 18 0 E4-1 酿酒酵母 92 88 21 0 20238 鲁氏酵母 85 79 20 0 20124 异常汉逊酵母 89 85 24 0 R15 产朊假丝酵母 88 84 31 0 S-02 近似内孢霉 87 79 22 0 E2-3 白地霉 82 68 0 Ys-01 地衣芽胞杆菌 95 88 72 54 Ys-02 腊样芽胞杆菌 95 90 81 62 As3.951 米曲酶 88 80 51 32 As3.350 泡盛曲酶 87 76 43 26
-18℃冷冻保藏结果
-18℃条件下不同年限菌种保藏存活率(％)单位：年
编号 中文名称 1年 2年 3年 4年 5年 E3-1 酿酒酵母 92 88 79 67 53 E5-2 酿酒酵母 95 84 72 63 49 E4-1 酿酒酵母 95 85 75 64 55 20238 鲁氏酵母 94 83 72 61 48 20124 异常汉逊酵母 92 81 68 57 46 R15 产朊假丝酵母 95 87 73 61 42 S-02 近似内孢霉 91 78 66 48 39 E2-3 白地霉 91 75 52 36 0 Ys-01 地衣芽胞杆菌 95 95 87 76 66 Ys-02 腊样芽胞杆菌 95 95 88 79 69 As3.951 米曲酶 92 82 76 65 56 As3.350 泡盛曲酶 94 86 74 63 52
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