食品微生物检测板及其制备与应用
专利汇可以提供食品微生物检测板及其制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种食品细菌总数及大肠菌群检测板，该板可一次同时完成细菌总数及大肠菌群的检测。本发明还涉及该检测板的制备及应用。，下面是食品微生物检测板及其制备与应用专利的具体信息内容。
1.能同时检测食品细菌总数和大肠菌群的食品简易检测板，其特征在于该板为长方形板，由板的中心纵向分为两部分，分别装入检测细菌总数的培养基和检测大肠菌群的培养基。
2.根据权利要求1所述的检测板，其中所述检测细菌总数的培养基由下列成分组成：成分 含量牛脑浸液 150～250毫升牛心浸液 150～250毫升蛋白胨 10克葡萄糖 2克氯化钠 5克磷酸氢二钾 2.5克琼脂 15克蒸馏水 加至1000毫升PH7.0-7.4在每100毫升上述培养基中还含有5毫升氯化三苯四唑的5%水溶液。
3.根据权利要求1所述的检测板，其中所述检测大肠菌群的培养基由下列成分组成：成分 含量牛肉膏 3克蛋白胨 20克乳糖 10克去氧脱酸钠 1.0克硫化硫酸钠 2.3克柠檬酸钠 1.0克柠檬酸铁铵 1.0克中性红 0.03克琼脂 15克蒸馏水 加至1000毫升PH6.8-7.0
4.根据权利要求1所述的检测板，其中检测板为5.0×3.6×0.2cm大小的长方形板。
5.根据权利要求1所述的检测板，在其一侧还带有一手持的把手。
6.用权利要求1所述的检测板同时检测食品细菌总数及大肠菌群的应用。
本发明涉及一种食品细菌总数及大肠菌群检测板，其制备方法及应用。
食品在加工、运输、保存和销售等过程中，经常受到外界环境中微生物的污染。食品细菌污染能引起腐败变质，甚至引起食物中毒，是食品卫生中最常见的有害因素之一。我国颁布的《食品卫生标准》规定，食品卫生的常规监测，要求检验细菌总数和大肠菌群，国家标准方法虽然准确，但操作比较复杂，检出需要的时间长。近年来，国内研究出的一些快速简易检测方法，不同程度上可以加快检出时间，简化操作程序，但是在这些方法中，有的只能检测细菌总数，有的只能检测大肠菌群，均不能同时完成上述两个指标的检验，而且有些方法仅仅是针对某类食品的。
另外，大肠菌群系指一群能在36℃24小时内发酵乳糖产酸产气、需氧兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，实际上包括肠杆菌科中四种常见细菌：大肠埃希氏菌（E.coli）、费劳地氏柠檬酸杆菌（C.freundii）、肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）、阴沟肠杆菌（E.cloacae）。所以大肠菌群并不是单一的细菌，而是作为卫生指标而选择的一类细菌。现有的一些检测培养基仅仅用于检测某一种细菌，如专门检测大肠埃希氏菌（E.coli）。
为满足食品卫生检测的需要，我们研制出一种能同时检测食品细菌总数及大肠菌群的食品简易检测板。该检测板所使用的培养基对大肠菌群检测的范围比现有技术的培养基检测范围广。并且，本发明的检测板所使用的培养基采用特定成分的配比及含量，从而达到检测中对不同类群细菌的选择性或全面性。
以往的技术（包括国家标准方法）对于检测总菌数和大肠菌群数分别采用不同的方法，根本不可能将两种检测方法进行组合，而本发明在分别对两种检测方法进行简化的同时，为这两种组合提供了可能。
本发明的检测板可以使操作简便、结果快速、费用经济而且准确性达到了国家标准。
本发明的目的在于提供一种能同时检测食品细菌总数及大肠菌群的食品简易检测板。
本发明另一个目的在于提供制备上述检测板的方法。
本发明还有一个目的是提供用该检测板同时检测食品细菌总数及大肠菌群的应用。
本发明的检测板为长方形板，其尺寸大小可以是5.0×3.6×0.2cm，由板的中心纵向分为两部分，分别装入培养基1和培养基2（图1），该板一侧可带有一手持的把手（图2）。作为本领域的专业人员应该理解，该检测板尺寸大小形状的变化是一般知识，因此对于其尺寸大小及形状的任何修改及改变均包括在本发明范围内。
培养基1是用于细菌总数检测的培养基，培养基2用于测定大肠菌群，其组成与制备方法如下。
培养基1成分 含量牛脑浸液＊150～250毫升牛心浸液＊150～250毫升蛋白胨 10克葡萄糖 2克氯化钠 5克磷酸氢二钾 2.5克琼脂 15克蒸馏水 加至1000毫升PH7.0-7.4＊心脑浸液：将新鲜去脂及筋膜绞碎的牛心和牛脑各500克，分别置于2000毫升三角烧瓶中，各加蒸馏水1000毫升混匀，放在冰箱中过夜。次日，分别用瓷勺撇去浮油，再放在45℃水浴中1小时，然后加热煮沸30分钟，纱布过滤，然后用蒸馏水分别补至1000毫升，15磅20分钟灭菌。
将按上述配方制备的培养基15磅加热灭菌15分钟，灭菌后冷却至50℃左右。按每100ml培养基加入5mlTTC（氯化三苯四唑，5%水溶液）的比例加入TTC，混匀。
在培养基1中，优选含有200ml牛脑浸液和250ml牛心浸液。
培养基2成分 含量牛肉膏＊3克蛋白胨 20克乳糖 10克去氧胆酸钠 1.0克硫代硫酸钠 2.3克柠檬酸钠 1.0克柠檬酸铁铵 1.0克中性红 0.03克琼脂 15克蒸馏水 加至1000毫升PH6.8～7.0＊牛肉膏：用新鲜牛肉去其脂肪、肌膜及肌腱，绞碎后加两倍（重量）水浸泡一液，煮沸后过滤，将凝固蛋白除去，成肉浸汁，经70℃真空蒸发而制成。
将15磅按上述配方制备的培养基加热灭菌15分钟。
用本发明检测板检测食品细菌总数及大肠菌群的实验及结果如下。
材料1.菌株铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）、气味黄杆菌（Flavobacterium odoratum）、君子兰链球菌（Streptococcusmimiatus）、自养黄色杆菌（Xanthobacter autotrophicus）、植生克雷伯氏菌（Klebsiellaplanticola）、乳杆菌（Lactobacillus sp.）、嗜麦芽假单孢菌（Pseudomoenasmaltophilia）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus brevis）、（以上由中国科学院微生物研究所提供）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）（由黑龙江省卫生防疫站提供）。
2.培养基（1）细菌总数培养基（上述培养基1）;
（2）大肠菌群培养基（上述培养基2）;
（3）肉汁胨;
（4）PYG培养基。
方法1.培养基选择性、特异性及稳定性实验将培养基制成平板，表面干燥后，以24小时液体培养物一白金环接种，30℃培养24小时和48小时后观察，同时以肉汁胨和PYG培养基做对照。
将制备的经无菌试验合格的10块检测板置4℃冰箱贮存，1个月、3个月及半年后取出，用大肠埃希氏菌悬液稀释液接种后，37℃培养24小时，以国标法对照观察结果，计算两法的符合率。
2.预备实验（1）取大肠埃希氏菌24小时营养琼脂斜面培养物，用灭菌生理盐水配成每毫升中含800、400、200、100、50、20个细菌的菌悬液。
（2）将检测板在上述各浓度的菌悬液中浸蘸，然后用灭菌滤纸吸干多余菌液，37℃培养18～24小时，记录板上长出的菌落数。同时，将每个标准菌悬液作为一个待检样品，分别用国际法检测细菌总数及大肠菌群的MPN值。
（3）计算检测板法和国标法的相关系数，分析相关关系。
（参见《卫生统计学》，第2版，杨树勤，人民卫生出版社，1985，第103-109页。）3.正式实验按国标法将检样做前处理，检测细菌总数及大肠菌群的MPN值。同时，将各检测板在不同稀释度的检样中浸蘸，用灭菌滤纸吸干多余液体，37℃培养18～24小时，记录其菌落数。
4.实验结果的统计学处理将国标法测得的细菌总数及大肠菌群的MPN值。和对应10倍稀释的检测板上长出的菌落数输入计算机，按95%可信限删去不可信数据，分别作相关关系分析，得出直线回归方程（参见《卫生统计学》，如上所述）。
5.标准板的制备根据得出的直线回归方程，并计算出下述代表不同污染程度标准板上的菌落数。
未被污染 国家标准值以下可食用的污染 国家标准值5倍以下轻度污染 国家标准值25倍以内中度污染 国家标准值125倍以内重度污染 国家标准值125倍以上6.考核应用在石家庄、呼和浩特、沈阳、哈尔滨、齐齐哈尔、海拉尔等地的卫生防疫站，对1058份检样同时用国标法和检测板法进行检测。
结果讨论1.各种细菌在两种培养基上的生长情况。
将已知菌株接种四种培养基，30℃24～48小时后的生长情况见表1。
表1各种细菌在培养基上生长情况的比较
注：+～生长;-～不生长;+-～生长不良。
不能在肉汁胨和PYG培养基上生长的细菌，能在检测板法用于检测细菌总数的培养基上生长。同时，生长不良的菌群能很好生长。细菌的脱氢酶使TTC还原形成红色菌落，质地淡黄色，易于辨认和计数。
用于检测大肠菌群的检测板培养基，由于含抑制剂和指示剂，只生长大肠菌群的细菌，并形成特征的粉色及红黑色菌落，质地红褐色，变形菌不弥漫生长。
2.预实验的结果表明，检测板法和国标法检测细菌总数和大肠菌群的相关系数分别为0.96和0.98，相关程度很高，从而为实验应用提供了科学依据。
3.用检测板检测样品340份，经统计学处理，其95%可信限内的数据，细菌总数为314份，大肠菌群为322份。将所得数据做散点图，结果呈线性，说明检测板法和国标法呈直线相关关系。其相关系数和直线回归方程如表2。
表2检测板法和国标法检测细菌总数及大肠菌群值的相关回归关系检测项目 细菌总数 大肠菌群值相关系数 0.9926 0.9999直线回归方程 Y=-5008+208X Y=-51+45X＊Y-国标法测得和细菌总数及MPN值。
X-检测板法测得的细菌总数及大肠菌群个数。
上述结果说明，两法的相关程度很高，检测板法的结果可信，可以代替国标法评价食品的污染情况。另外，从上述两种回归方程中看出，检测板的培养基比较敏感，就测定细菌总数而言，用国标法测得的结果＜1（即0＝-5008+208X，X＝24～25），在我们研制的小板上却能生长24～25个菌落，有些在普通营养琼脂培养基上不生长的细菌，在检测板法用的培养基上也能生长，和生长实验结果相一致。
大肠菌群的检测结果也是如此。若用国标法测得的MPN值为30，即每毫升检样中的大肠菌群数＜1，而检测板的接种量仅为0.2ml左右，如此推断小板上不应有细菌生长，但实际上长出1～2个菌落，这是由于培养基的营养条件较好的缘故。虽然检测板的培养基敏感，能检测出国标法检测不出的细菌，但是我们是用国标法为对照得出的回归方程，它综合了检测板的面积，接种量等诸多因素的影响，故检测结果是可信的。
4.根据我国的食品卫生标准及实验所得的回归方程，确定标准板的表示范围如表3。
表3食品细菌总数及大肠菌群检测标准计数板的表示范围
尽管各种食品的卫生标准不同，但我们制出的标准板是统一的，因为已经从检样的稀释数上加以平衡;标准中细菌总数和大肠菌群MPN值低的样品，稀释倍数要相对地小，反之要相对增大。各种食品的具体稀释倍数见附表。在检测工作中，只要对检样做适当稀释，直接接种检测板，经18～24小时培养后，将生长的菌落和标准板相对照，即可推定细菌总数和大肠菌群MPN值的大致范围，直观判定被检食品的污染程度。
5.以国标法对照，用我们研制的食品细菌总数及大肠菌群检测板，共检测1058份各类食品，二法所得结果的符合率达97%以上（表4）。制出的10块检测板，经1个月、3个月及半年后从4℃冰箱中取出，再接种大肠埃希氏菌稀释液，除一块小板因污染真菌外，其他小板测得的结果均相符，说明检测板使用的培养基质量稳定，敏感性无改变。
以上结果说明检测板法测出的结果准确可靠，勿需另配制培养基及洗刷灭菌器材，并具有操作简单，使用方便，省时省力，易于判定等优点，适用于广大基层单位。
表41058份食品检样两法检测结果的复合率
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