用于治疗癌症的方法和组合物
阅读：1001发布：2020-06-04
专利汇可以提供用于治疗癌症的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了用于 治疗 癌症的 过继细胞转移 的方法，所述方法包括向受试者施用 治疗有效量 的具有抗 肿瘤 活性的免疫细胞，其中所述免疫细胞在向所述受试者施用之前与蛋白转导结构域PTD-MYC融合多肽 接触 。在一些 实施例 中，所述PTD-MYC融合多肽包括：(i)HIV TAT蛋白转导结构域；和(ii)MYC多肽序列。，下面是用于治疗癌症的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种组合物，其包括：
(a)MYC融合肽，所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列；以及(b)一或多个原代免疫细胞，所述一或多个原代免疫细胞是从患有实体瘤的供体受试者中分离，其中所述一或多个原代免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述实体瘤为癌、腺瘤、腺癌、母细胞瘤、肉瘤或淋巴瘤。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述实体瘤为转移性肿瘤。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述实体瘤为基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、CNS癌、结肠癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、胃癌(gastric cancer)、神经胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞瘤、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾脏癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、鳞状细胞癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌或外阴癌。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的组合物，其中所述MYC融合肽包括SEQID NO:1。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多个免疫细胞对实体瘤细胞具有抗肿瘤活性。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多个免疫细胞包括一或多个淋巴细胞。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述一或多个淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或其任何组合。
9.根据权利要求7到8中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多个淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体修饰的淋巴细胞或嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述肿瘤浸润性淋巴细胞具有CD8+CD25+特征或CD4+CD25+特征。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多个免疫细胞包括可检测的部分。
12.一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括向有需要的所述受试者施用一或多个修饰的免疫细胞，其中所述一或多个修饰的免疫细胞包括MYC融合肽，所述MYC融合肽包括：
(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列，并且所述一或多个修饰的免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞源自于从所述受试者分离的原代免疫细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞源自于从患有相同类型的癌症的单独供体受试者分离的原代免疫细胞。
15.根据权利要求12到14中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症为癌或肉瘤。
16.根据权利要求12到14中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
17.根据权利要求12到14中任一权利要求所述的组合物，其中所述癌症为基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、CNS癌、结肠癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、胃癌(gastric cancer)、神经胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞瘤、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾脏癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、鳞状细胞癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌或外阴癌。
18.根据权利要求13到17中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞是分离后通过使所述原代免疫细胞与所述MYC融合肽在体外接触来制备。
19.根据权利要求13到17中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在与所述MYC融合肽接触之前或之后在体外扩增所述原代免疫细胞。
20.根据权利要求12到19中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽包括SEQID NO:1。
21.根据权利要求12到20中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞对所述受试者的癌细胞具有抗肿瘤活性。
22.根据权利要求12到21中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞包括一或多个无反应性免疫细胞。
23.根据权利要求12到22中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个免疫细胞包括一或多个淋巴细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一或多个淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK或其任何组合。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述一或多个淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体修饰的淋巴细胞或嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-特征、CD8+CD25+特征或CD4+CD25+特征。
27.根据权利要求13到26中任一权利要求所述的方法，其中方法进一步包括从所述供体受试者分离所述原代免疫细胞。
28.根据权利要求12到27中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞是静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内或肿瘤内施用的。
29.根据权利要求12到28中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在施用所述一或多个修饰的免疫细胞之前对所述受试者进行淋巴耗竭。
30.根据权利要求12到29中任一权利要求所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用细胞因子。
31.根据权利要求12到30中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者是人或动物。
32.根据权利要求12到31中任一权利要求所述的方法，其进一步包括施用另外的癌症疗法。
33.一种用于制备用于癌症疗法的修饰的免疫细胞的方法，其包括使一或多个免疫细胞在体外与MYC融合多肽接触，其中所述免疫细胞来自已经暴露于一或多个肿瘤抗原的供体，并且其中所述MYC融合肽包括：(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列，并且所述免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞源自于从患有癌症的受试者分离的原代免疫细胞。
35.根据权利要求33到34中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在与所述MYC融合肽接触之前或之后在体外扩增所述原代免疫细胞。
36.根据权利要求33到35中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽包括SEQID NO:1。
37.根据权利要求33到34中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个修饰的免疫细胞具有抗肿瘤活性。
38.根据权利要求33到37中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK或其任何组合。
39.根据权利要求33到37中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个免疫细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体修饰的淋巴细胞或嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。
40.一种用于提高受试者的过继细胞疗法或T细胞疗法的功效的方法，其包括施用根据权利要求1到11中任一权利要求所述的组合物。
41.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗癌症。
42.一种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的组合物的用途，其用于制造用于治疗癌症的药物。
用于治疗癌症的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此以全文引用的方式并入。创建于2018年7月24日的所述ASCII副本名称为106417-0333_SL.txt并且大小为22,015字节。
背景技术
[0005] 过继细胞转移(ACT)是一种免疫疗法形式，其涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到患者中。ACT通常涉及从患者分离具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，从而在体外培养淋巴细胞以扩增群体并且然后将淋巴细胞输注到荷瘤宿主中。用于过继转移的淋巴细胞可以源自于切除的肿瘤(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞)的基质、源自于淋巴管或淋巴结或源自于血液。在一些情况下，分离的淋巴细胞被基因工程化以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。用于输注的淋巴细胞可以从供体(同种异体ACT)或荷癌宿主(自体ACT)中分离出来。发明内容
[0006] 在某些实施例中，本文提供了用于治疗癌症的过继细胞转移的方法。在一些实施例中，提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的具有抗肿瘤活性的免疫细胞，其中所述免疫细胞在向所述受试者施用之前与蛋白转导结构域(PTD)-MYC融合多肽接触。在一些实施例中，所述免疫细胞包括一或多个淋巴细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞包括T细胞和/或B细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞包括肿瘤浸润性淋巴细胞。在一些实施例中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施例中，所述癌症为癌、腺瘤、腺癌、母细胞瘤、肉瘤或淋巴瘤。在一些实施例中，所述癌症为基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、CNS癌、结肠癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、胃癌(gastric cancer)、神经胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞瘤、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾脏癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、鳞状细胞癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌或外阴癌。在一些实施例中，所述免疫细胞从患有实体瘤的供体受试者中获得。在一些实施例中，所述实体瘤是转移性肿瘤。在一些实施例中，所述免疫细胞从患有黑色素瘤或结肠癌的供体受试者中获得。在一些实施例中，供体受试者和接受所述免疫细胞的受试者是相同的(即，自体ACT)。在一些实施例中，供体受试者和所述接受所述免疫细胞的受试者是不同的(即，同种异体ACT)。
[0007] 在一些实施例中，所述PTD-MYC融合多肽包括：(i)HIV TAT蛋白转导结构域；和(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，所述PTD-MYC融合多肽易位到所述免疫细胞的细胞核。在一些实施例中，所述PTD-MYC融合多肽表现出MYC的生物活性，如MYC靶基因的活化。在一些实施例中，融合肽包括SEQ ID NO:1。
[0008] 在某些实施例中，本文描述了组合物，其包括：(a)MYC融合肽，所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列；以及(b)一或多个原代免疫细胞，所述一或多个原代免疫细胞从患有肿瘤的供体受试者中分离出来，其中所述一或多个原代免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。在一些实施例中，所述MYC融合肽易位到所述一或多个原代免疫细胞的细胞核。在一些实施例中，所述MYC融合肽表现出MYC的生物活性。在一些实施例中，所述MYC融合肽进一步包括一或多个分子，所述一或多个分子连接所述蛋白转导结构域和所述MYC多肽。在一些实施例中，所述MYC融合肽包括具有以下一般结构的MYC融合肽：
[0009] 蛋白转导结构域-X-MYC序列，
[0010] 其中-X-是连接所述蛋白转导结构域和所述MYC序列的分子。在一些实施例中，蛋白转导结构域序列是TAT蛋白转导结构域序列。在一些实施例中，所述TAT蛋白转导结构域序列选自由以下组成的组：TAT[48-57]和TAT[57-48]。在一些实施例中，所述MYC融合肽包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述MYC融合肽是乙酰化的。在一些实施例中，所述一或多个免疫细胞对肿瘤细胞具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，所述一或多个免疫细胞包括一或多个淋巴细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或其任何组合。在一些实施例中，所述T细胞选自由以下组成的组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、无反应性T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞以及抗原特异性T细胞。在一些实施例中，所述B细胞选自由以下组成的组：原初B细胞、血浆B细胞、活化的B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受B细胞、嵌合B细胞以及抗原特异性B细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体修饰的淋巴细胞或嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，所述肿瘤浸润性淋巴细胞具有CD8+CD25+特征。在一些实施例中，所述淋巴细胞具有CD4+CD25+特征。在一些实施例中，所述一或多个免疫细胞包括可检测的部分。
[0011] 在某些实施例中，本文描述了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一或多个修饰的免疫细胞，其中所述一或多个修饰的免疫细胞包括MYC融合肽，所述MYC融合肽包括：(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列，并且所述一或多个修饰的免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞源自于从所述受试者分离的原代免疫细胞。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞源自于从患有相同类型的肿瘤的单独供体受试者分离的原代免疫细胞。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞是分离后通过使所述原代免疫细胞与所述MYC融合肽在体外接触而制备的。在一些实施例中，所述方法进一步包括在与所述MYC融合肽接触之前在体外扩增所述原代免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括在与所述MYC融合肽接触之后扩增所述原代免疫细胞。在一些实施例中，所述细胞使用抗CD3抗体进行扩增。在一些实施例中，所述细胞使用辐射的同种异体饲养细胞进行扩增。在一些实施例中，所述细胞在存在外源细胞因子的情况下进行扩增。在一些实施例中，所述细胞因子是白细胞介素-2。在一些实施例中，所述MYC融合肽易位到所述免疫细胞的细胞核。在一些实施例中，所述MYC融合肽表现出MYC的生物活性。在一些实施例中，所述MYC融合肽进一步包括一或多个分子，所述一或多个分子连接所述蛋白转导结构域和所述MYC多肽。在一些实施例中，所述MYC融合肽包括具有以下一般结构的MYC融合肽：
[0012] 蛋白转导结构域-X-MYC序列，
[0013] 其中-X-是连接所述蛋白转导结构域和所述MYC序列的分子。在一些实施例中，蛋白转导结构域序列是TAT蛋白转导结构域序列。在一些实施例中，所述TAT蛋白转导结构域序列选自由以下组成的组：TAT[48-57]和TAT[57-48]。在一些实施例中，所述MYC融合肽包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述MYC融合肽是乙酰化的。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞对所述受试者的肿瘤细胞具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞对所述受试者的肿瘤细胞具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，癌症细胞是实体瘤细胞。在一些实施例中，所述实体瘤是转移性肿瘤。在一些实施例中，所述癌症细胞是黑色素瘤或结肠肿瘤细胞。在一些实施例中，所述癌症细胞来自基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、CNS癌、结肠癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、胃癌(gastric cancer)、神经胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞瘤、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾脏癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、鳞状细胞癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌或外阴癌。在一些实施例中，所述免疫细胞从患有实体瘤的供体受试者中获得。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞包括一或多个无反应性免疫细胞。在一些实施例中，所述一或多个免疫细胞包括一或多个淋巴细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK或其任何组合。在一些实施例中，所述T细胞选自由以下组成的组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、无反应性T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞以及抗原特异性T细胞。在一些实施例中，所述B细胞选自由以下组成的组：原初B细胞、血浆B细胞、活化的B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受B细胞、嵌合B细胞以及抗原特异性B细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体修饰的淋巴细胞或嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，所述淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-特征。在一些实施例中，所述淋巴细胞具有CD8+CD25+特征。在一些实施例中，所述淋巴细胞具有CD4+CD25+特征。在一些实施例中，所述方法进一步包括从所述供体受试者分离所述原代免疫细胞。在一些实施例中，所述供体受试者患有癌症。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞是静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内或肿瘤内施用的。在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用所述一或多个修饰的免疫细胞之前对所述受试者进行淋巴耗竭。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子在施用所述一或多个修饰的免疫细胞之前、期间或之后施用。在一些实施例中，所述细胞因子选自由以下组成的组：干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、IL-2、TNFα、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7和XCL2。在一些实施例中，所述肿瘤是转移性的。在一些实施例中，所述受试者是人或动物。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用另外的癌症疗法。在一些实施例中，所述另外的癌症疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、单克隆抗体、抗癌核酸或蛋白、抗癌病毒或微生物以及其任何组合。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞包括可检测的部分。
[0014] 在某些实施例中，本文还描述了用于制备用于癌症疗法的修饰的免疫细胞的方法，其包括使一或多个免疫细胞在体外与MYC融合多肽接触，其中所述免疫细胞来自已经暴露于一或多个肿瘤抗原的供体，并且其中所述MYC融合肽包括：(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列，并且所述免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞源自于从患有肿瘤的受试者分离的原代免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括在与所述MYC融合肽接触之前在体外扩增所述原代免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括在与所述MYC融合肽接触之后扩增所述原代免疫细胞。在一些实施例中，所述细胞使用抗CD3抗体进行扩增。在一些实施例中，所述细胞使用辐射的同种异体饲养细胞进行扩增。在一些实施例中，所述细胞在存在外源细胞因子的情况下进行扩增。在一些实施例中，所述细胞因子是白细胞介素-2。在一些实施例中，所述MYC融合肽易位到所述免疫细胞的细胞核。在一些实施例中，所述MYC融合肽表现出MYC的生物活性。在一些实施例中，所述MYC融合肽进一步包括一或多个分子，所述一或多个分子连接所述蛋白转导结构域和所述MYC多肽。在一些实施例中，所述MYC融合肽包括具有以下一般结构的MYC融合肽：
[0015] 蛋白转导结构域-X-MYC序列，
[0016] 其中-X-是连接所述蛋白转导结构域和所述MYC序列的分子。在一些实施例中，蛋白转导结构域序列是TAT蛋白转导结构域序列。在一些实施例中，所述TAT蛋白转导结构域序列选自由以下组成的组：TAT[48-57]和TAT[57-48]。在一些实施例中，所述MYC融合肽包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述MYC融合肽是乙酰化的。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞对所述受试者的肿瘤细胞具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，所述一或多个修饰的免疫细胞包括一或多个无反应性免疫细胞。在一些实施例中，所述一或多个免疫细胞包括一或多个淋巴细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK或其任何组合。在一些实施例中，所述T细胞选自由以下组成的组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、无反应性T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞以及抗原特异性T细胞。在一些实施例中，所述B细胞选自由以下组成的组：原初B细胞、血浆B细胞、活化的B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受B细胞、嵌合B细胞以及抗原特异性B细胞。在一些实施例中，所述一或多个淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体修饰的淋巴细胞或嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，所述淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-特征。在一些实施例中，所述淋巴细胞具有CD8+CD25+特征。在一些实施例中，所述淋巴细胞具有CD4+CD25+特征。
[0017] 在某些实施例中，本文还描述了组合物，其包括：(a)一或多个分离的原代免疫细胞，所述一或多个分离的原代免疫细胞已经暴露于肿瘤细胞系；以及(b)MYC融合肽，所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列；其中所述一或多个原代免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。
[0018] 在某些实施例中，本文还描述了用于治疗癌症的上述组合物中的任一种组合物。在某些实施例中，本文还描述了用于制造治疗癌症的药物的上述组合物中的任一种组合物。
[0019] 在某些实施例中，本文还描述了用于提高受试者的过继细胞疗法或T细胞疗法的疗效的方法，所述方法包括施用上述组合物中的任一种组合物。
[0020] 在某些实施例中，本文还描述了肿瘤浸润性淋巴细胞，其包括MYC融合肽，所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，所述肿瘤浸润性淋巴细胞源自于从患有癌症的受试者分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞。
[0021] 在某些实施例中，本文还描述了淋巴细胞，其包括嵌合抗原受体和MYC融合肽，所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，所述淋巴细胞源自于从患有癌症的受试者分离的原代淋巴细胞。
[0022] 在某些实施例中，本文还描述了用于制备用于过继细胞疗法的方法，所述方法包括使一或多个原代免疫细胞与MYC融合肽接触，所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列，其中一或多个原代免疫细胞从患有肿瘤的患者中分离出来，并且其中一或多个原代免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。
[0023] 还提供了试剂盒，其包括本文所提供的用于治疗癌症的MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞。在一些实施例中，所述试剂盒包括用于检测所施用的MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞的一或多种试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包括用本文所提供的MYC融合多肽治疗的细胞，例如造血干细胞、供体白细胞、T细胞或NK细胞。在一些实施例中，所述试剂盒包括用于使用所述MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞的相关说明。附图说明
[0024] 图1展示了在输注来自用TAT-MYC治疗的荷瘤供体小鼠的淋巴细胞持续1小时之后荷黑色素瘤肿瘤小鼠存活的结果。用TAT-MYC淋巴细胞治疗小鼠，用对照蛋白治疗淋巴细胞或不予治疗。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0025] 图2展示了在输注来自用TAT-MYC治疗的荷瘤供体小鼠的淋巴细胞之后荷黑色素瘤肿瘤小鼠存活的结果(重复图1中所示的实验)。用TAT-MYC淋巴细胞治疗小鼠，用对照蛋白治疗淋巴细胞或不予治疗。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0026] 图3展示了在输注来自用TAT-MYC治疗的荷瘤供体小鼠的不同量的淋巴细胞之后荷黑色素瘤肿瘤小鼠存活的结果。用TAT-MYC淋巴细胞治疗小鼠，用对照蛋白治疗淋巴细胞或不予治疗。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0027] 图4展示了在输注来自用TAT-MYC治疗的荷瘤供体小鼠的不同量的淋巴细胞之后荷黑色素瘤肿瘤小鼠存活的结果。用TAT-MYC淋巴细胞治疗小鼠，用对照蛋白治疗淋巴细胞或不予治疗。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0028] 图5展示了在输注用TAT-MYC治疗的荷瘤供体小鼠的淋巴细胞之后荷结肠瘤小鼠存活的结果。用TAT-MYC淋巴细胞治疗小鼠，用对照蛋白治疗淋巴细胞或不予治疗。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0029] 图6展示了在输注来自用TAT-MYC治疗的荷瘤供体小鼠的不同量的淋巴细胞之后荷结肠瘤小鼠存活的结果。用TAT-MYC淋巴细胞治疗小鼠或不予治疗。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
具体实施方式
[0030] 本公开不限于本申请中描述的特定实施例，所述实施例旨在作为本公开的单独方面的单一说明。本文将不描述本公开的所有各个实施例。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本公开进行许多修改和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。除了本公开列举的那些之外，根据前述描述，本公开的范围内的功能等效方法和设备对于本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改和变化旨在属于所附权利要求的范围之内。本公开仅受所附权利要求的条款以及所述权利要求所授权的等同物的全部范围的限制。
[0031] 应理解，本公开不限于当然可以变化的特定用途、方法、试剂、化合物、组合物或生物系统。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且并不旨在是限制性的。
[0033] 如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面说明方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含所引用的数字并且是指可以被随后分解为上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组等等。
[0034] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
[0035] I.定义
[0036] 本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的并且不旨在限制本公开。如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”旨在也包含复数形式。
[0037] 如本文所使用的，术语“约”意味着值可以变化+/-20％、+/-15％、+/-10％或+/-5％并且仍处于本公开的范围内。例如，“约200IU/mL的浓度”涵盖介于160IU/mL与240IU/mL之间的浓度。
[0038] 如本文所使用的，术语向受试者“施用”药剂包含将药剂引入或递送到受试者以发挥其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，包含静脉内、肌肉内、腹腔内或皮下施用。施用包含自我施用和由另一个人施用。
[0039] 术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的药剂，即与氢、羧基、氨基和R基结合的α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基(如正亮氨酸)或经过修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。在一些实施例中，形成多肽的氨基酸为D型。在一些实施例中，形成多肽的氨基酸为L型。在一些实施例中，形成多肽的第一多个氨基酸为D型，并且第二多个氨基酸为L型。
[0040] 氨基酸在本文通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸通过其普遍接受的单字母代码来表示。
[0041] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，例如，氨基酸类似物。所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包含全长蛋白，其中通过共价肽键连接氨基酸残基。
[0042] 如本文所使用的，“对照物”是出于比较目的在实验中使用的替代样品。对照物可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，当实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗疗效的相关性时，通常采用阳性对照物(表现出期望的治疗效果的已知组合物)和阴性对照物(未接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
[0043] 如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现期望的治疗效果的药剂量。在治疗应用的上下文中，施用于受试者的治疗性肽的量可以取决于感染的类型和严重程度以及如总体健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性等个体的特性。它还可以取决于疾病的程度、严重程度和类型。熟练的技术人员将能够依据这些和其它因素确定适当的剂量。
[0044] 如本文所使用的，术语“表达”是指将多核苷酸转录成mRNA的过程和/或将转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包含在真核细胞中剪接mRNA。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定基因的表达水平。一方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与来自对照样品或参照样品的那个基因的表达水平直接进行比较。另一方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与来自施用本文公开的组合物后的相同样品的那个基因的表达水平直接进行比较。术语“表达”还指以下事件中的一或多个事件：(1)从细胞内的DNA序列(例如，通过转录)产生RNA模板；(2)在细胞内处理RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)在细胞内将RNA序列翻译成多肽或蛋白质；(4)在细胞内对多肽或蛋白质进行翻译后的修饰；(5)在细胞表面上呈递多肽或蛋白质；以及(6)从细胞中分泌或呈递或释放多肽或蛋白质。
[0045] 术语“接头”是指连接(connect或link)两个序列(例如，连接两个多肽结构域)的合成序列(例如，氨基酸序列)。在一些实施例中，接头含有氨基酸序列中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸序列。
[0046] 如本文所使用的，术语“经过冻干的”、“冻干”等是指首先冷冻待干燥的材料(例如，纳米颗粒)并且然后在真空环境中通过升华去除冰或冷冻溶剂的过程。赋形剂可以包含在预冻干的调配物中，以增强经过冻干的产物在储存时的稳定性。经过冻干的样品可以进一步含有另外的赋形剂。
[0047] 如本文所使用的，术语免疫细胞是指在免疫应答中发挥作用的任何细胞。免疫细胞属于造血来源，并且包含淋巴细胞，如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
[0048] 术语“淋巴细胞”是指所有未成熟、成熟、未分化和已分化的白色淋巴细胞群体，其包含组织特异性种类和专门种类。通过非限制性实例的方式，所述淋巴细胞涵盖B细胞、T细胞、NKT细胞和NK细胞。在一些实施例中，淋巴细胞包含所有B细胞谱系，所述B细胞谱系包含前B细胞、祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞和无反应性AN1/T3细胞群体。
[0049] 如本文所使用的，术语T细胞包含原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、无反应性T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞和抗原特异性T细胞。
[0050] 通过非限制性实例的方式，术语“一个B细胞”或“多个B细胞”是指前B细胞、祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、原初B细胞、血浆B细胞、活化的B细胞、无反应性B细胞、耐受B细胞、嵌合B细胞、抗原特异性B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞和无反应性AN1/T3细胞群体。在一些实施例中，术语B细胞包含在其细胞表面表达免疫球蛋白重链和/或轻链的B细胞。在一些实施例中，术语B细胞包含表达并分泌免疫球蛋白重链和/或轻链的B细胞。在一些实施例中，术语B细胞包含在其细胞表面结合抗原的细胞。在本文公开的一些实施例中，B细胞或AN1/T3细胞用于上述过程中。在某些实施例中，此类细胞任选地被任何动物细胞取代，所述动物细胞适于表达、能够表达(例如，诱导表达)或能够被分化成适于表达抗体的细胞，所述细胞包含例如造血干细胞、原初B细胞、B细胞、前B细胞、祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞、无反应性B细胞或无反应性AN1/T3细胞。
[0051] 如本文所使用的，“过继细胞治疗组合物”是指包括适于过继细胞转移的细胞的任何组合物。在示范性实施例中，过继细胞治疗组合物包括选自由以下组成的组的细胞类型：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、经TCR(即异源性T细胞受体)修饰的淋巴细胞和经CAR(即嵌合抗原受体)修饰的淋巴细胞。在另一个实施例中，过继细胞治疗组合物包括选自由以下组成的组的细胞类型：T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、δ-γT细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞。在另一个实施例中，TIL、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、δ-γT细胞、调节性T细胞或外周血单核细胞形成过继细胞治疗组合物。在一个实施例中，过继细胞治疗组合物包括T细胞。
[0052] 如本文所使用的，“肿瘤浸润性淋巴细胞”或TIL是指离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。
[0053] 术语“MYC”和“MYC基因”是同义词。它们是指编码MYC多肽的核酸序列。MYC基因包括至少120个核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列与NCBI登录号NM—002467的序列至少60％到100％相同或同源，例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、
90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或约70％到约100％的任何其它百分比。在一些实施例中，MYC基因是原癌基因。在某些情况下，在8号染色体上的8q24.21处发现MYC基因。在某些情况下，MYC基因始于短臂末端的128,816,862bp，并且止于短臂末端的128,822,
856bp。在某些情况下，MYC基因为约6kb。在某些情况下，MYC基因对至少八个分离的mRNA序列—5个可替代地剪接的变体和3个非剪接的变体进行编码。
90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或约70％到约100％的任何其它百分比。在一些实施例中，MYC基因是原癌基因。在某些情况下，在8号染色体上的8q24.21处发现MYC基因。在某些情况下，MYC基因始于短臂末端的128,816,862bp，并且止于短臂末端的128,822,
856bp。在某些情况下，MYC基因为约6kb。在某些情况下，MYC基因对至少八个分离的mRNA序列—5个可替代地剪接的变体和3个非剪接的变体进行编码。
[0054] 术语“MYC蛋白”、“MYC多肽”和“MYC序列”是同义词，并且是指NCBI登录号UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1(MYC同种型1)或NP_002458.2(UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.2；MYC同种型2)中公开的氨基酸残基的聚合物以及其功能性同系物、类似物或片段。UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1的序列为：
[0055] MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:2)。
[0056] NP_002458.2(UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.2)的序列为：
[0057] MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:11)。
[0058] 在一些实施例中，MYC多肽是完整MYC多肽序列。在一些实施例中，MYC多肽是部分MYC多肽序列。在一些实施例中，MYC多肽包括SEQ ID NO:2或11的至少400个连续的氨基酸。在一些实施例中，MYC多肽包括SEQ ID NO:2或11的至少400个连续的氨基酸并且保留至少一种MYC活性。在一些实施例中，MYC多肽包括SEQ ID NO:2或11的至少400个、至少410个、至少420个、至少430个或至少450个连续的氨基酸。在一些实施例中，MYC多肽包括SEQ ID NO:
2或11的至少400个、至少410个、至少420个、至少430个或至少450个连续的氨基酸并且保留至少一种MYC活性。在一些实施例中，MYC多肽是c-MYC。在一些实施例中，MYC多肽序列包含以下示出的序列：
2或11的至少400个、至少410个、至少420个、至少430个或至少450个连续的氨基酸并且保留至少一种MYC活性。在一些实施例中，MYC多肽是c-MYC。在一些实施例中，MYC多肽序列包含以下示出的序列：
[0059] MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:3)。
[0060] 在一些实施例中，MYC多肽序列包含以下示出的序列：
[0061] PLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:4)。
[0062] 在一些实施例中，MYC多肽包括与NCBI登录号NP002458.2或UniProtKB/Swiss-Prot登录号P01106.1的序列至少40％到100％相同的氨基酸序列，例如与其至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约40％到约100％的任何其它百分比相同。在一些实施例中，MYC多肽是指439个氨基酸的聚合物，一种未经受任何翻译后修饰的MYC多肽。在一些实施例中，MYC多肽是指已经受翻译后修饰的439个氨基酸的聚合物。在一些实施例中，MYC多肽为48,804kDa。在一些实施例中，MYC多肽含有基本螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH/LZ)结构域。在一些实施例中，bHLH/LZ结构域包括以下序列：ELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，MYC多肽是转录因子(例如，转录因子64)。在一些实施例中，MYC多肽含有E-盒DNA结合结构域。在一些实施例中，MYC多肽与包括CACGTG的序列结合。在一些实施例中，MYC多肽促进细胞存活和/或细胞增殖中的一或多种。在一些实施例中，MYC多肽包含上述中的一或多个，并且包含一或多个翻译后修饰(例如，乙酰化)。在一些实施例中，MYC多肽包括在多肽的N端或C端处的一或多个另外的氨基酸残基。在一些实施例中，MYC多肽是融合蛋白。在一些实施例中，MYC多肽在多肽的N端或C端处连接到一或多个另外的肽。
88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约40％到约100％的任何其它百分比相同。在一些实施例中，MYC多肽是指439个氨基酸的聚合物，一种未经受任何翻译后修饰的MYC多肽。在一些实施例中，MYC多肽是指已经受翻译后修饰的439个氨基酸的聚合物。在一些实施例中，MYC多肽为48,804kDa。在一些实施例中，MYC多肽含有基本螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH/LZ)结构域。在一些实施例中，bHLH/LZ结构域包括以下序列：ELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，MYC多肽是转录因子(例如，转录因子64)。在一些实施例中，MYC多肽含有E-盒DNA结合结构域。在一些实施例中，MYC多肽与包括CACGTG的序列结合。在一些实施例中，MYC多肽促进细胞存活和/或细胞增殖中的一或多种。在一些实施例中，MYC多肽包含上述中的一或多个，并且包含一或多个翻译后修饰(例如，乙酰化)。在一些实施例中，MYC多肽包括在多肽的N端或C端处的一或多个另外的氨基酸残基。在一些实施例中，MYC多肽是融合蛋白。在一些实施例中，MYC多肽在多肽的N端或C端处连接到一或多个另外的肽。
[0063] 适于在本文所描述的方法中使用的蛋白质还包含功能变体，包含与本文所述的任何蛋白质的氨基酸序列相比具有介于1到15个之间的氨基酸变化(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸取代、缺失或添加)的蛋白质。在其它实施例中，改变的氨基酸序列与本文所述的任何蛋白质抑制剂的氨基酸序列至少75％相同，例如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
只要改变的氨基酸序列保留足够的生物活性以在本文所述的组合物和方法中发挥功能，此类序列变体蛋白就适于本文所述的方法。在进行氨基酸取代时，取代可以是保守氨基酸取代。在常见的天然存在的氨基酸中，例如，通过以下组中的每一组内的氨基酸中的取代来说明“保守氨基酸取代”：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷氨酰胺和天冬酰胺；以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是源自蛋白序列区段的约2,000个局部多重比对的氨基酸取代矩阵，表示多于500组的相关蛋白质的高度保守的区域(赫尼科夫(Henikoff)等人,(1992),美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA),89:10915-10919)。因此，BLOSUM62取代频率用于定义在一些实施例中引入本文所述或公开的氨基酸序列中的保守氨基酸取代。尽管有可能仅基于化学特性设计氨基酸取代(如上文所讨论的)，但语言“保守氨基酸取代”优选地是指由大于-1的BLOSUM62值表示的取代。例如，如果取代的特征在于BLOSUM62值为0、1、2或3，则氨基酸取代是保守的。根据此系统，优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值为至少1(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值为至少2(例如，2或3)。
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
只要改变的氨基酸序列保留足够的生物活性以在本文所述的组合物和方法中发挥功能，此类序列变体蛋白就适于本文所述的方法。在进行氨基酸取代时，取代可以是保守氨基酸取代。在常见的天然存在的氨基酸中，例如，通过以下组中的每一组内的氨基酸中的取代来说明“保守氨基酸取代”：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷氨酰胺和天冬酰胺；以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是源自蛋白序列区段的约2,000个局部多重比对的氨基酸取代矩阵，表示多于500组的相关蛋白质的高度保守的区域(赫尼科夫(Henikoff)等人,(1992),美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA),89:10915-10919)。因此，BLOSUM62取代频率用于定义在一些实施例中引入本文所述或公开的氨基酸序列中的保守氨基酸取代。尽管有可能仅基于化学特性设计氨基酸取代(如上文所讨论的)，但语言“保守氨基酸取代”优选地是指由大于-1的BLOSUM62值表示的取代。例如，如果取代的特征在于BLOSUM62值为0、1、2或3，则氨基酸取代是保守的。根据此系统，优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值为至少1(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值为至少2(例如，2或3)。
[0064] 短语“E盒序列”和“增强子盒序列”在本文中可互换使用并且意指核苷酸序列CANNTG，其中N是任何核苷酸。在某些情况下，所述E盒序列包括CACGTG。在某些情况下，通过MYC编码的转录因子的基本螺旋-环-螺旋结构域与所述E盒序列结合。在某些情况下，所述E盒序列位于基因(例如，p21、Bc1-2或鸟氨酸脱羧酶)的上游。在某些情况下，MYC多肽含有E盒DNA结合结构域。在某些情况下，E盒DNA结合结构域包括KRRTHNVLERQRRN(SEQ ID NO:6)的序列。在某些情况下，通过MYC编码的转录因子与E盒序列的结合使RNA聚合酶转录E盒序列下游的基因。
[0065] 术语“MYC活性”或“MYC生物活性”或“生物活性MYC”包含增强或诱导细胞存活、细胞增殖和/或抗体产生中的一或多种。通过举例的方式而非以限制方式，MYC活性包含增强抗CD3和抗CD28活化的T细胞的扩增和/或增加长期自我更新造血干细胞的增殖。MYC活性还包含进入细胞的细胞核中、与核酸序列结合(例如，结合E盒序列)和/或诱导MYC靶基因的表达。
[0066] 术语“患者”、“受试者”，“个体”等在本文中可互换使用，并且是指动物，通常是哺乳动物。在一个实施例中，患者、受试者或个体是哺乳动物。在一个实施例中，患者、受试者或个体是人。在一些实施例中，患者、受试者或个体是动物，如但不限于如马、牛、鼠类、羊、狗和猫等家养动物。
[0067] 术语“蛋白转导结构域(PTD)”或“肽转运蛋白序列(也称为细胞渗透蛋白(CPP)或膜易位序列(MTS))”在本文中可互换使用以指能够独立于经典胞吞作用而将大得多的分子转移到细胞中的小肽。在一些实施例中，可以在蛋白转导结构域内发现核定位信号，所述核定位信号介导分子进一步易位到细胞核中。
[0068] 如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖对如人等受试者的疾病的治疗，并且包含：(i)抑制疾病，即阻止其发展；(ii)缓解疾病，即引起疾病消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病的一或多种症状的进展。关于癌症，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”还涵盖使肿瘤消退、减缓肿瘤生长、抑制肿瘤转移、抑制癌症复发或再发和/或维持缓解。
[0069] 还应了解，所描述的各种治疗或预防医学疾病和病状的方式旨在表示“基本的”，其包含完全的治疗或预防但也包含次于其的治疗或预防，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。治疗可以是对慢性疾病的连续长期治疗或用于治疗急性病状的单次或较少次施用。
[0070] 如本文所使用的，术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
[0071] II.概述
[0072] 本公开部分地涉及通过施用组合物治疗受试者的癌症，所述组合物包括一或多个具有抗肿瘤活性的免疫细胞(例如，调节抗肿瘤应答的免疫细胞，如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL))，其中在向受试者施用之前，使所述一或多个免疫细胞与PTD-MYC融合多肽在体外接触。在一些实施例中，免疫细胞从患有肿瘤的供体受试者中获得。在一些实施例中，细胞与接受治疗的受试者是自体的。在一些实施例中，肿瘤是黑色素瘤肿瘤。
[0073] 本公开至少部分地基于以下发现：用含有MYC多肽和如HIV TAT蛋白转导结构域等蛋白转导结构域(PTD)的MYC融合多肽治疗从患有黑色素瘤肿瘤的供体受试者分离的淋巴细胞，并且向荷黑色素瘤肿瘤的受试者施用治疗的淋巴细胞显著地提高了荷瘤受试者的存活率。本文提供的实例证明，当在向第二只荷黑色素瘤小鼠施用之前，在体外用TAT-MYC融合蛋白治疗细胞时，从荷黑色素瘤小鼠的淋巴结提取的免疫细胞显著提高了治疗疗效。这些数据支持，使用用PTD-MYC融合多肽处理的抗肿瘤免疫细胞的过继细胞转移可以用于治疗癌症，如黑色素瘤。
[0074] 在一些实施例中，用于治疗受试者的癌症的方法包括施用已经在体外与PTD-MYC融合多肽接触的免疫细胞。在一些实施例中，用于本方法的免疫细胞在体内用肿瘤抗原灌注。在一些实施例中，免疫细胞来自患有癌症的供体。在一些实施例中，免疫细胞来自患有如黑色素瘤、癌、腺瘤、腺癌、母细胞瘤、肉瘤或淋巴瘤等实体瘤的供体。在一些实施例中，使免疫细胞在体内与肿瘤抗原接触。在一些实施例中，免疫细胞来自已经暴露于一或多个肿瘤抗原的供体。在一些实施例中，免疫细胞来自已经暴露于抗肿瘤疫苗的供体。在一些实施例中，免疫细胞是B细胞、T细胞、NK细胞或其任何组合。在一些实施例中，免疫细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在一些实施例中，免疫细胞是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。
[0075] 在一些实施例中，用于治疗受试者的癌症的方法包括向有需要的受试者施用一或多个修饰的免疫细胞，其中所述一或多个修饰的免疫细胞包括MYC融合肽，所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列，并且所述一或多个修饰的免疫细胞对肿瘤特异性抗原具有反应性。
[0076] 在一些实施例中，用于治疗受试者的癌症的方法包括以下步骤：
[0077] a)使免疫细胞与MYC融合多肽在体外接触，其中所述免疫细胞来自已经暴露于一或多个肿瘤抗原的供体，并且所述MYC融合肽包括(i)蛋白转导结构域；(ii)MYC多肽序列；以及
[0078] b)向荷癌受试者施用接触的免疫细胞，由此治疗癌症。
[0079] 在一些实施例中，使免疫细胞与PTD-MYC融合多肽在体外接触是通过在存在MYC融合多肽的情况下培养免疫细胞来进行的。在一些实施例中，免疫细胞是在存在一或多个细胞因子和/或生长因子(例如，白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)的情况下培养的。在一些实施例中，免疫细胞在施用之前未扩增。在一些实施例中，免疫细胞在施用之前扩增。在一些实施例中，治疗的供体和受试者是相同的。
[0080] 在一些实施例中，免疫细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞。在一些实施例中，肿瘤浸润性淋巴细胞是自体肿瘤浸润性淋巴细胞。因此，在一些实施例中，用于治疗受试者的癌症的方法包括施用已经在体外与PTD-MYC融合多肽接触的淋巴细胞，其中免疫细胞来自淋巴细胞，所述淋巴细胞是来自受试者的自体肿瘤浸润性淋巴细胞。
[0081] 在一些实施例中，用于治疗受试者的癌症的方法包括以下步骤：
[0082] a)使淋巴细胞与PTD-MYC融合多肽在体外接触，其中所述淋巴细胞是来自受试者的自体肿瘤浸润性淋巴细胞；以及
[0083] b)向受试者施用接触的自体肿瘤浸润性淋巴细胞，由此治疗癌症。
[0084] 获得和制备用于转移的免疫细胞的方法
[0085] 用于本文所提供的方法的免疫细胞可以使用本领域已知的任何合适的方法获得。在一些实施例中，免疫细胞是原代免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是如T细胞和B细胞等淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，免疫细胞是淋巴细胞和NK细胞的混合物。在一些实施例中，免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，免疫细胞是已经浸润肿瘤的T细胞(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞)。在一些实施例中，T细胞在肿瘤手术期间去除。例如，在一些实施例中，T细胞在通过活检去除肿瘤组织后分离。在一些实施例中，免疫细胞在从供体中分离后进行修饰。在一些实施例中，免疫细胞是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。
[0086] 在一些实施例中，T细胞从含有细胞群体的样品(如血液、淋巴或组织活检样品)中分离。T细胞可以通过本领域已知的任何方式从细胞群体中分离。在一个实施例中，所述方法包括通过本领域已知的任何合适的方法从肿瘤样品中获得大量的T细胞群体。例如，大量的T细胞群体可以通过将肿瘤样品解离成细胞悬浮液而从肿瘤样品中获得，特定的细胞群体可以选自所述细胞悬浮液。获得大量的T细胞群体的合适的方法可以包含但不限于机械解离(例如，切碎)肿瘤、酶解离(例如，消化)肿瘤和抽吸(例如，正如用针一样)中的任一或多种。
[0087] 从肿瘤样品中获得的大量的T细胞群体可以包括任何合适类型的T细胞。优选地，从肿瘤样品中获得的大量的T细胞群体包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
[0088] 肿瘤样品可以从任何哺乳动物中获得。除非另外说明，否则如本文所使用的，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包含但不限于兔形目(Logomorpha)哺乳动物，如兔子；食肉目(Carnivora)哺乳动物，包含猫科动物(猫)和犬科动物(狗)；偶蹄目(Artiodactyla)哺乳动物，包含牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目(Perssodactyla)哺乳动物，包含马科动物(马)。哺乳动物可以是非人灵长类动物，例如灵长目(Primates)、猿目(Ceboids)或猴目(Simoids)(猴子)动物或猿猴亚目(Anthropoids)(人和猿)动物。在一些实施例中，哺乳动物可以是啮齿目(Rodentia)哺乳动物，如小鼠和仓鼠。优选地，哺乳动物是非人灵长类或人。示范性哺乳动物是人。在一些实施例中，接受免疫细胞的受试者也是肿瘤样品的供体(即自体ACT)。
[0089] T细胞可以从多个来源获得，包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可以使用技术人员已知的任何数量的技术(如Ficoll分离)从采集自受试者的单位血液中获得T细胞。在一个实施例中，通过单采血液成分术或白细胞去除术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产品通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞置于适合的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在本发明的一个实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代性实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果并非全部)二价阳离子。在没有钙的情况下，初始的活化步骤会导致活化放大。如本领域普通技术人员应容易理解的，可以通过本领域技术人员已知的方法(如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器))完成洗涤步骤。洗涤之后，可以将细胞重新悬浮于各种生物相容性缓冲液中，如例如无钙、无镁的PBS。可替代地，可以去除单采血液成分术样品的不期望组分并且将细胞直接重新悬浮于培养基中。
[0090] 在另一个实施例中，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞(例如，通过PERCOLLTM梯度离心)从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过阳性选择技术或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD28+、CD4+、CDC、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)缀合珠( M-450CD3/CD28 T或XCYTE DYNABEADSTM)温育足以对期望的T细胞进行阳性选择的时间段来分离T细胞。在一个实施例中，时间段为约30分钟。在另外的实施例中，时间段在30分钟到36小时的范围或更长以及其间的所有整数值。在另外的实施例中，时间段为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在又另一个实施例中，时间段为10小时到24小时。在一个实施例中，温育时间段为24小时。对于从患有白血病的患者中分离出T细胞，使用更长的温育时间(如24小时)可以增加细胞产率。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，可以使用更长的温育时间分离T细胞，如从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。另外，使用更长的温育时间可以提高CD8+T细胞的捕获效率。
[0091] 通过阴性选择富集T细胞群体可以用针对经过阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来实现。在一个实施例中，所述方法是通过使用单克隆抗体的混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或细胞选择，所述单克隆抗体针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
[0092] 另外，通过各种方法从血液制剂中耗竭单核细胞群体(即CD14+细胞)，所述方法包含抗CD14包被珠或柱或利用这些细胞的吞噬活性促进去除。因此，在一个实施例中，本发明使用大小足以被吞噬单核细胞吞噬的顺磁颗粒。在某些实施例中，顺磁颗粒是可商购获得的珠，例如那些由生命科技公司(Life Technologies)生产的商品名为DynabeadsTM的珠。在一个实施例中，通过用“无关”蛋白质(例如，血清蛋白或抗体)包被顺磁颗粒来去除其它非特异性细胞。无关蛋白质和抗体包含那些未特异性地靶向待分离的T细胞的蛋白质和抗体或其片段。在某些实施例中，无关珠包含用绵羊抗小鼠抗体、山羊抗小鼠抗体和人血清白蛋白包被的珠。
[0093] 简单来说，可以通过用一或多种无关或非抗体偶联的顺磁颗粒以允许去除单核细胞(大约20:1的珠：细胞比)的任何量在22℃到37℃下预温育从全血、单采外周血或肿瘤中分离的T细胞持续约30分钟到2小时，随后磁性去除附接到或吞噬顺磁颗粒的细胞来进行单核细胞的这种耗竭。可以使用本领域可获得的标准方法进行这种分离。例如，可以使用任何磁性分离方法，包含各种可商购获得的方法(例如， 磁性颗粒集中器(DYNAL))。保证必要的耗竭可以通过那些本领域普通技术人员已知的各种方法来监测，包含耗竭之前和耗竭之后对CD14阳性细胞的流式细胞分析。
[0094] 为了通过阳性选择或阴性选择分离期望的细胞群体，细胞和表面(例如，如珠等颗粒)的浓度可以变化。在某些实施例中，可能期望显著减少珠与细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞与珠的最大接触。例如，在一个实施例中，使用20亿个细胞/毫升的浓度。在一个实施例中，使用10亿个细胞/毫升的浓度。在另外的实施例中，使用大于1亿个细胞/毫升的浓度。在另外的实施例中，使用1千万个细胞/毫升、1.5千万个细胞/毫升、2千万个细胞/毫升、2.5千万个细胞/毫升、3千万个细胞/毫升、3.5千万个细胞/毫升、4千万个细胞/毫升、4.5千万个细胞/毫升或5千万个细胞/毫升的细胞浓度。在又另一个实施例中，使用7.5千万个细胞/毫升、8千万个细胞/毫升、8.5千万个细胞/毫升、9千万个细胞/毫升、9.5千万个细胞/毫升或1亿个细胞/毫升的细胞浓度。在另外的实施例中，可以使用1.25亿个细胞/毫升或1.5亿个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可能导致细胞产率增加、细胞活化和细胞扩增。另外，使用高细胞浓度使得更有效地捕获能够弱表达所关注的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织)的细胞。
此类细胞群体可以具有治疗价值，并且将是期望获得的。例如，使用高细胞浓度使得更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
此类细胞群体可以具有治疗价值，并且将是期望获得的。例如，使用高细胞浓度使得更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
[0095] 在相关实施例中，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞与表面(例如，如珠等颗粒)的混合物，最小化颗粒与细胞之间的相互作用。这选择了表达较高量的待结合到颗粒的期望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个实施例中，所使用的细胞浓度为5×106/ml。在其它实5 6
施例中，所使用的浓度可以为约1×10/ml到1×10/ml以及其间的任何整数值。
施例中，所使用的浓度可以为约1×10/ml到1×10/ml以及其间的任何整数值。
[0096] 还可以冷冻T细胞。冷冻和后续解冻步骤可以通过去除细胞群体中的粒细胞和一定程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且将可用于此上下文中，但是一种方法涉及使用含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS或其它合适的细胞冷冻培养基，然后以每分钟1°的速率将细胞冷冻到-80℃并且将细胞储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其它控制冷冻的方法以及在-20℃下或液氮中不受控制地立即冷冻的方法。
[0097] 用于本发明中的T细胞也可以是抗原特异性T细胞。例如，可以使用抗原特异性T细胞。在某些实施例中，可以从所关注的患者(如患有癌症的患者，如患有肿瘤的患者)分离抗原特异性T细胞。在一些实施例中，患者患有黑色素瘤。
[0098] 在一个实施例中，确定受试者的新表位，并且分离对这些抗原具有特异性的T细胞。也可以使用本领域已知的例如如题为“抗原特异性T细胞的产生和分离(Generation And Isolation of Antigen-Specific T Cells)”的美国专利公开号US 20040224402或美国专利第6,040,177号中所述的任何数量的方法在体外产生用于扩增的抗原特异性细胞。也可以使用本领域已知的例如如免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)或细胞生物学实验指南(Current Protocols in Cell Biology)(二者均由马萨诸塞州波士顿约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.,Boston,Mass)出版)中所述的任何数量的方法在体外产生用于本发明的抗原特异性细胞。
[0099] 在相关实施例中，可能期望在一轮或两轮扩增之前或之后分选或以其它方式阳性选择(例如，通过磁性选择)抗原特异性细胞。可以使用肽-MHC四聚体分选或阳性选择抗原特异性细胞(阿特曼(Altman)等人,1996科学(Science).10月4日；274(5284):94-6)。在另一个实施例中，使用适应性四聚体技术方法(安德森(Andersen)等人,2012自然实验手册(Nat Protoc).7:891-902)。四聚体受限于需要基于先前假设利用预测的结合肽以及对特异性HLA的限制。可以使用本领域已知的技术产生肽-MHC四聚体，并且可以用本文所述的所关注的任何MHC分子和所关注的任何抗原制备所述肽-MHC四聚体。可以使用本领域已知的125
大量测定鉴定在此上下文中使用的特异性表位。例如，可以通过监测促使 I标记的β2-微球蛋白(β2m)并入MHC I类/β2m/肽异源三聚体复合物中的能力来间接地评估多肽与MHC I类结合的能力(参见帕克(Parker)等人,1994,免疫学杂志(J.Immunol.)152:163,)。
大量测定鉴定在此上下文中使用的特异性表位。例如，可以通过监测促使 I标记的β2-微球蛋白(β2m)并入MHC I类/β2m/肽异源三聚体复合物中的能力来间接地评估多肽与MHC I类结合的能力(参见帕克(Parker)等人,1994,免疫学杂志(J.Immunol.)152:163,)。
[0100] 在一些实施例中，对T细胞进行重组修饰以表达经过修饰的受体或嵌合受体(例如，经嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞)。
[0101] 在一个实施例中，直接用表位特异性试剂标记细胞，以通过流式细胞术分离，随后表征表型和TCR。在一个实施例中，通过接触T细胞特异性抗原分离T细胞。可以使用各种可商购获得的细胞分选仪(包含但不限于MoFlo分选仪(科罗拉多州柯林斯堡达寇塞托美逊股份有限公司(DakoCytomation)、FACSAriaTM、FACSArrayTM、FACSVantageTM、BDTMLSR II和FACSCaliburTM(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences))中的任一种分选仪分选抗原特异性T细胞或具体地本发明的任何细胞。
[0102] 在一个实施例中，所述方法包括选择也表达CD3的细胞。所述方法可以包括以任何合适的方式特异性地选择细胞。优选地，使用流式细胞术执行所述选择。可以使用本领域已知的任何合适的方法执行流式细胞术。流式细胞术可以采用任何合适的抗体和染色剂。优选地，选择抗体使得其特异性地识别并结合到所选的特定生物标志物。例如，可以分别使用抗CD3、抗CD8、抗TIM-3、抗LAG-3、抗4-lBB或抗PD-1抗体特异性地选择CD3、CD8、TIM-3、LAG-3、4-1BB或PD-1。可以将一个抗体或多个抗体缀合到珠(例如，磁珠)或荧光染料。优选地，流式细胞术是荧光活化细胞分选术(FACS)。可以基于对自体肿瘤的反应性来选择在T细胞上表达的TCR。此外，可以使用专利公开第WO 2014133567号和WO 2014133568中描述的方法基于标志物选择对肿瘤具有反应性的T细胞，所述专利公开以全文引用的方式并入本文中。此外，可以基于CD107a的表面表达选择活化的T细胞。
[0103] 在一个实施例中，所述方法进一步包括扩增富集细胞群体中的T细胞的数量。此类方法在美国专利第8,637,307号中描述并且以全文引用的方式并入本文中。可以在用PTD-MYC多肽治疗细胞之前或之后扩增T细胞。T细胞的数量可以增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选地至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，更优选地至少约100倍，更优选地至少约1,000倍，或者最优选地至少约100,000倍。可以使用本领域已知的任何合适的方法扩增T细胞的数量。扩增细胞的数量的示范性方法在专利申请第WO 2003057171号、美国专利第8,034,334号和美国专利申请公开第2012/0244133号中进行描述，各自通过引用并入本文中。
[0104] 在一个实施例中，可以通过分离T细胞和随后的刺激或活化，接着进行另外的扩增来进行离体T细胞扩增。在本发明的一个实施例中，T细胞可以被单种药剂刺激或活化。在另一个实施例中，使用两种药剂刺激或活化T细胞，一种药剂诱导初级信号，而第二种药剂是共刺激信号。可以以可溶形式使用可用于刺激单个信号或刺激初级信号的配体和刺激第二信号的辅助分子。可以将配体附接到细胞表面、工程化的多价信号传导平台(EMSP)或将所述配体固定在表面上。在一个实施例中，初级药剂和次级药剂两者被共同固定在表面上，例如珠或细胞。在一个实施例中，提供初级活化信号的分子可以是CD3配体，并且共刺激分子可以是CD28配体或4-1BB配体。在一些实施例中，通过用一或多个抗原(如一或多个源自患者肿瘤的黑色素瘤肿瘤抗原)刺激来扩增细胞。
[0105] 在一些实施例中，分离后立即用PTD-MYC融合多肽处理分离的免疫细胞。在其它的实施例中，在用PTD-MYC融合多肽处理之前，将分离的免疫细胞储存在合适的缓冲液中并冷冻。在一些实施例中，分离后立即用PTD-MYC融合多肽处理分离的免疫细胞，并且将经过处理的细胞储存在合适的缓冲液中并冷冻，直至需要向患者施用为止。
[0106] 在某些实施例中，使分离的免疫细胞(例如，混合群体免疫细胞或分离类型，如肿瘤浸润性淋巴细胞)与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触足以被细胞摄取的时间段。在一些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触小于约24小时、小于约23小时、小于约22小时、小于约21小时、小于约20小时、小于约19小时、小于约18小时、小于约17小时、小于约16小时、小于约15小时、小于约14小时、小于约13小时、小于约12小时、小于约11小时、小于约10小时、小于约9小时、小于约8小时、小于约7小时、小于约6小时、小于约5小时、小于约4小时、小于约3小时、小于约2小时或小于约1小时。
[0107] 在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触小于约55分钟、小于约50分钟、小于约45分钟、小于约40分钟、小于约35分钟、小于约30分钟、小于约29分钟、小于约28分钟、小于约27分钟、小于约26分钟、小于约25分钟、小于约24分钟、小于约23分钟、小于约22分钟、小于约21分钟、小于约20分钟、小于约19分钟、小于约18分钟、小于约17分钟、小于约16分钟、小于约15分钟、小于约14分钟、小于约13分钟、小于约12分钟、小于约11分钟或小于约10分钟。在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触约1小时。
[0108] 在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触约24小时或更久。在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触小于约12天、小于约11天、小于约10天、小于约9天、小于约8天、小于约7天、小于约6天、小于约5天、小于约4天、小于约2天或小于约1天。
[0109] 在某些可以与先前实施例中的任一实施例组合的实施例中，以0.5μg/ml到500μg/ml、0.5μg/ml、至少0.6μg/ml、至少0.7μg/ml、至少0.8μg/ml、至少0.9μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少3μg/ml、至少4μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少7μg/ml、至少8μg/ml、至少9μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少30μg/ml、至少35μg/ml、至少40μg/ml、至少45μg/ml、至少50μg/ml、至少55μg/ml、至少60μg/ml、至少65μg/ml、至少70μg/ml、至少75μg/ml、至少80μg/ml、至少85μg/ml、至少90μg/ml、至少95μg/ml或至少100μg/ml的浓度使细胞与MYC融合多肽接触。
[0110] MYC融合蛋白
[0111] 在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽包括蛋白转导结构域(PTD)、促使细胞存活或细胞增殖中的一或多个的MYC多肽以及任选地蛋白标签结构域，例如一或多个促进融合蛋白纯化的氨基酸序列。在一些实施例中，与MYC多肽接触的细胞表现出增加的存活时间(例如，与未与MYC接触的相同类型的相同或类似细胞相比)和/或增加的增殖(例如，与未与MYC接触的相同类型的相同或类似细胞相比)。
[0112] 在一些实施例中，融合蛋白包括(a)蛋白转导结构域；和(b)MYC多肽序列。在一些实施例中，融合肽是式(I)的肽：
[0113] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列。
[0114] 在一些实施例中，本文公开的融合肽包括：(a)蛋白转导结构域；(b)MYC多肽序列；以及(c)一或多个连接蛋白转导结构域和MYC多肽序列的分子。在一些实施例中，融合肽是式(II)的肽：
[0115] 蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列，
[0116] 其中-X-是连接蛋白转导结构域和MYC多肽序列的分子。在一些实施例中，-X-是至少一个氨基酸。
[0117] 在一些实施例中，本文公开的融合肽包括：(a)蛋白转导结构域；(b)MYC多肽序列；(c)至少两个蛋白标签；以及(d)任选地一或多个接头。在一些实施例中，融合肽是式(III-VI)的肽：
[0118] 蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列-X-蛋白标签1-X-蛋白标签2(式(III))，或[0119] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-X-蛋白标签1-X-蛋白标签2(式(IV))，或
[0120] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-蛋白标签1-X-蛋白标签2(式(V))，或
[0121] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-蛋白标签1-蛋白标签2(式(VI))，
[0122] 其中-X-是接头。在一些实施例中，-X-是一或多个氨基酸。
[0123] 在一些实施例中，本文公开的融合肽包括：(a)蛋白转导结构域；(b)MYC多肽序列；(c)6-组氨酸标签；(d)V5表位标签：以及(e)任选地一或多个接头。在一些实施例中，融合肽是式(VII-XIV)的肽：
[0124] 蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列-X-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(VII))，或[0125] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-X-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(VIII))，或[0126] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(IX))，或[0127] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-6-组氨酸标签-V5表位标签(式(X))，
[0128] 蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列-X-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XI))，或[0129] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-X-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XII))，或[0130] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-组氨酸标签-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XIII))，或
[0131] 蛋白转导结构域-MYC多肽序列-V5表位标签-6-组氨酸标签(式(XIV))，
[0132] 其中-X-是接头。在一些实施例中，-X-是一或多个氨基酸。
[0133] 如上所述，在一些实施例中，MYC融合蛋白包括一或多个接头序列。可以采用接头序列来连接融合蛋白的蛋白转导结构域、MYC多肽序列、V5表位标签和/或6-组氨酸标签。在一些实施例中，接头包括一或多个氨基酸。在一些实施例中，接头的氨基酸序列包括KGELNSKLE。在一些实施例中，接头包括RTG的氨基酸序列。
[0134] 蛋白转导结构域(PTD)
[0135] 在一些实施例中，MYC融合蛋白包含蛋白转导结构域。转运肽为跨细胞膜将小分子、蛋白质或核酸递送到细胞的细胞内区室提供了替代方案。一种非限制性实例且经过良好表征的蛋白转导结构域(PTD)是TAT衍生肽。弗兰克尔(Frankel)等人(参见例如美国专利第5,804,604号、美国专利第5,747,641号、美国专利第5,674,980号、美国专利第5,670,617号和美国专利第5,652,122号)证明，通过将含有TAT的氨基酸48-57的肽缀合到货物蛋白以将货物蛋白(β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)转运到细胞中。在一些实施例中，TAT包括氨基酸序列MRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7)。
[0136] PTD的另一个非限制性实例是穿膜肽。穿膜肽可以跨细胞膜转运亲水性高分子(德罗西(Derossi)等人,细胞生物学趋势(Trends Cell Biol.),8:84-87(1998)，其以全文引用的方式并入本文中)。穿膜肽是一种对应于触角足同源域的氨基酸43-58的16氨基酸肽，所述触角足同源域是在培养物中被细胞内化的果蝇转录因子。
[0137] PTD的又另一个非限制性实例是VP22。VP22(一种来自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的被膜蛋白)具有跨细胞膜转运蛋白质和核酸的能力(埃略特(Elliot)等人,细胞(Cell)88:223-233,1997，其以全文引用的方式并入本文中)。VP22的残基267-300是必需的，但是不足以进行转运。因为负责转运功能的区域尚未确定，所以整个VP22蛋白通常用于跨细胞膜转运货物蛋白和核酸(赛威兹(Schwarze)等人,药理科学趋势(Trends Pharmacol Sci),21:
45-48,2000)。
45-48,2000)。
[0138] 在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽包含蛋白转导结构域。通过举例的方式而非以限制方式，在一些实施例中，蛋白转导结构域包括TAT、穿膜肽、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16和触角足中的一或多个的蛋白转导结构域。在一些实施例中，蛋白转导结构域包括TAT、穿膜肽、VP22、vpr和EPTD中的一或多个的蛋白转导结构域。在一些实施例中，蛋白转导结构域包括TAT、穿膜肽、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16和触角足中的至少一个的蛋白转导结构域。在一些实施例中，蛋白转导结构域包括合成蛋白转导结构域(例如，聚精氨酸或PTD-5)。在特定实施例中，蛋白转导结构域包括TAT蛋白转导结构域。在一些实施例中，蛋白转导结构域与MYC多肽共价连接。在一些实施例中，蛋白转导结构域通过肽键与MYC多肽连接。在一些实施例中，通过接头序列将蛋白转导结构域连接到MYC多肽。在一些实施例中，接头包括短氨基酸序列。通过举例的方式而非以限制方式，在一些实施例中，接头序列的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
[0139] 可以按任何期望的顺序布置本技术的MYC融合蛋白。例如，在一些实施例中，可以按以下顺序布置MYC融合蛋白：a)与MYC多肽使用相同读框连接的蛋白转导结构域；b)与V5结构域使用相同读框连接的MYC多肽；以及c)与6-组氨酸表位标签使用相同读框连接的V5结构域。在一些实施例中，MYC融合蛋白具有以下组分顺序：a)与蛋白转导结构域使用相同读框连接的MYC多肽；b)与V5结构域使用相同读框连接的蛋白转导结构域；以及c)与6-组氨酸表位标签使用相同读框连接的V5结构域。在一些实施例中，另外的氨基酸序列可以包含在序列中的每一个序列之间。在一些实施例中，可以在多肽序列的开始和/或结束包含另外的氨基酸。
[0140] 在一些实施例中，蛋白转导结构域是TAT蛋白转导结构域。在一些实施例中，蛋白转导结构域是TAT[48-57]。在一些实施例中，蛋白转导结构域是TAT[57-48]。
[0141] 蛋白标签结构域
[0142] 在一些实施例中，MYC融合蛋白包括蛋白标签结构域，所述蛋白标签结构域包括一或多个促进所述融合蛋白纯化的氨基酸序列。在一些实施例中，蛋白标签结构域包括多组氨酸标签和表位标签中的一或多个。通过举例的方式而非以限制方式，示范性标签包含以下中的一或多个：V5、组氨酸标签(例如，6-组氨酸标签)、血凝素(HA)标签、FLAG标签、钙调蛋白结合肽(CBP)、共价但可解离NorpD肽(CYD)、Strepll或C蛋白的重链(HPC)。在一些实施例中，蛋白标签结构域的长度为约10个到20个氨基酸。在一些实施例中，蛋白标签结构域的长度为2到40个氨基酸，例如6-20个氨基酸。在一些实施例中，上文列出的标签中的两个(例如，V5和HIS-标签)一起使用以形成蛋白标签结构域。
[0143] 在一些实施例中，组氨酸标签是6-组氨酸标签。在一些实施例中，组氨酸标签包括序列HHHHHH(SEQ ID NO:8)。在一些实施例中，本文公开的融合肽包括V5表位标签。在一些实施例中，V5标签包括以下氨基酸序列：GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:9)。在一些实施例中，V5标签包括氨基酸序列IPNPLLGLD(SEQ ID NO:10)。
[0144] 可以通过任何合适的方法将蛋白标签添加到本文公开的融合蛋白。通过举例的方式而非以限制方式，在一些实施例中，将TAT-MYC多肽序列克隆到编码一或多个蛋白标签(例如，多组氨酸标签和/或V5标签)的表达载体中。在一些实施例中，通过PCR添加多组氨酸标签和/或V5标签(即PCR引物包括多组氨酸序列和/或V5序列)。
[0145] PTD-MYC融合多肽的构建
[0146] 可以通过本领域众所周知的方法构建本文公开的PTD-MYC融合多肽(例如，TAT-MYC融合多肽)。通过举例的方式而非以限制方式，可以通过PCR产生编码TAT-MYC融合多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，人类MYC序列的正向引物包括TAT蛋白转导结构域的同框N端9-氨基酸序列(例如，RKKRRQRRR)。在一些实施例中，人类MYC序列的反向引物被设计用于去除终止密码子。在一些实施例中，将PCR产物克隆到任何合适的表达载体中。在一些实施例中，表达载体包括多组氨酸标签和V5标签。
[0147] 在一些实施例中，本文公开的融合肽包括(a)TAT和(b)c-MYC。在一些实施例中，本文公开的融合肽包括(a)TAT[48-57]和(b)c-MYC。在一些实施例中，本文公开的融合肽包括(a)TAT[57-48]和(b)c-MYC。
[0148] 在一些实施例中，本文公开的融合肽包括：(a)TAT；(b)c-MYC；(c)一或多个接头；(d)V5标签；以及(e)6-组氨酸标签。在一些实施例中，本文公开的融合肽包括：(a)TAT[48-57]；(b)c-MYC；(c)一或多个接头；(d)V5标签；以及(e)6-组氨酸标签。在一些实施例中，本文公开的融合肽包括：(a)TAT[57-48]；(b)c-MYC；(c)一或多个接头；(d)V5标签；以及(e)6-组氨酸标签。
[0149] 在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽包括SEQ ID NO:1；在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽是SEQ ID NO:1。
[0150] MRKKRRQRRRPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRKGELNSKLEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH(SEQ ID NO:1)。
[0151] 可以在合成期间或合成之后修饰融合蛋白以包含一或多个官能团。通过举例的方式而非以限制方式，可以修饰蛋白质以包含乙酰基、磷酸基、乙酸基、酰胺基、烷基和/或甲基中的一或多个。此列表不旨在是穷举性的，而仅仅是示范性的。在一些实施例中，蛋白质至少包含一个乙酰基。
[0152] 可以通过本领域已知的任何合适的方法(例如通过在如细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等细胞中进行重组蛋白表达)产生PTD-MYC融合多肽。在一些实施例中，通过微生物发酵重组产生PTD-MYC融合多肽。在一些实施例中，微生物发酵以约1升到约10,000升的发酵体积进行，例如约10升到约1000升的发酵体积。发酵可以利用任何合适的微生物宿主细胞和培养基。在示范性实施例中，大肠杆菌被用作微生物宿主细胞。在替代性实施例中，可以使用其它微生物，例如酿酒酵母、毕赤酵母、乳杆菌、杆菌和曲霉。在示范性实施例中，微生物宿主细胞是BL-21StarTM大肠杆菌菌株(英杰公司(Invitrogen))。在示范性实施例中，微生物宿主细胞是BLR DE3大肠杆菌菌株。
[0153] 在一些实施例中，对宿主细胞进行修饰以为稀有密码子提供tRNA，所述tRNA用于克服宿主微生物细胞密码子偏倚度以改善表达的蛋白质的翻译。在示范性实施例中，用如pRARE(CamR)等质粒转换宿主细胞(例如，大肠杆菌)，所述质粒表达AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA密码子的tRNA。此外，用于为特定密码子提供tRNA的合适质粒或构建体在本领域中是已知的，并且可以用于所提供的方法中。
[0154] 整合载体或自复制载体可以用于将PTD-MYC融合多肽表达盒引入选择的宿主细胞中的目的。在表达盒中，PTD-MYC融合多肽的编码序列可操作地连接到启动子，如诱导型启动子。诱导型启动子是在其控制下响应于培养条件的一些变化(例如，存在或不存在营养物或温度变化)而启动来自DNA的提高的转录水平的启动子。在一些实施例中，针对细菌表达对编码PTD-MYC融合多肽的核酸进行密码子优化。
[0155] 通过各种潜在宿主细胞识别的示范性启动子是众所周知的。可以通过从源DNA(如果存在，通过限制酶消化并将分离的启动子序列插入到载体中)中去除启动子来将这些启动子可操作地连接到PTD-MYC融合多肽编码性DNA。适于与微生物宿主一起使用的启动子包含但不限于β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(张(Chang)等人,(1978)自然(Nature),275:617-624；戈德尔(Goeddel)等人,(1979)自然,281:544)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(戈德尔(1980)核酸研究(Nucleic Acids Res.)8:4057；EP 36,776)和如tac启动子等杂合启动子(德波儿(deBoer)等人,(1983)美国国家科学院院刊80:21-25)。可以使用适于通过选择的宿主细胞进行表达的任何启动子。公布了合适的核苷酸序列，从而使熟练的工作人员使用接头或衔接子将其可操作地连接到编码PTD-MYC融合多肽的DNA(参见例如斯本利斯特(Siebenlist)等人,(1980)细胞(Cell)20:269)，以供应任何所需的限制性位点。在示范性实施例中，用于细菌系统中的启动子可以含有操作性连接到编码序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno，S.D.)序列。在一些实施例中，诱导型启动子是lacZ启动子，其由如在本领域中众所周知的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。也可以使用众所周知的用于合成所关注的DNA序列的技术重新合成启动子和表达盒。在示范性实施例中，用于表达PTD-MYC融合多肽的表达载体是pET101/D-Topo(英杰公司)。
[0156] 为了表达PTD-MYC融合多肽，含有编码所述PTD-MYC融合多肽的表达载体的微生物宿主通常在发酵反应器中生长到高密度。在一些实施例中，反应器具有受控的葡萄糖进料。在一些实施例中，首先在补充有抗生素的培养基中培养发酵罐接种物(例如，过夜培养)。然后，发酵罐接种物用于接种发酵罐培养物以表达蛋白质。在发酵罐培养的OD600为至少约
15，通常为至少约20、至少25、至少约30或更高时，诱导重组蛋白的表达。在示范性实施例中，在诱导型启动子是lacZ启动子的情况下，将IPTG添加到发酵培养基以诱导PTD-MYC融合多肽的表达。通常，在OD600表示对数生长期时，将IPTG添加到发酵罐培养物。
15，通常为至少约20、至少25、至少约30或更高时，诱导重组蛋白的表达。在示范性实施例中，在诱导型启动子是lacZ启动子的情况下，将IPTG添加到发酵培养基以诱导PTD-MYC融合多肽的表达。通常，在OD600表示对数生长期时，将IPTG添加到发酵罐培养物。
[0157] 在所提供的方法的某些实施例中，诱导的蛋白质表达在诱导后维持约2小时左右到约5小时左右，并且可以是诱导后约2小时左右到约3小时左右。由于重组蛋白的降解，较长的诱导时间段可能是不期望的。诱导期间反应混合物的温度优选地为约28℃到约37℃，通常为约30℃到约37℃。在特定实施例中，在约37℃下进行诱导。
[0158] PTD-MYC融合多肽通常在微生物细胞中表达为胞质包涵体。为了采集包涵体，诱导后通过离心发酵培养物收集细胞沉淀物，在-70℃或更低温度下冷冻、解冻并重新悬浮于破裂缓冲液中。通过常规方法(例如，超声处理、均质化等)裂解细胞。裂解物然后重新悬浮于溶解缓冲液中，通常在存在浓度有效溶解蛋白质的尿素的存在下，例如约5M、6M、7M、8M、9M左右或更大。重新悬浮可能需要机械破碎沉淀物并搅拌以达到均质性。在一些实施例中，将细胞沉淀物直接重新悬浮于尿素缓冲液中并混合直至均质。在一些实施例中，重新悬浮/溶解缓冲液是8M尿素，50mM磷酸盐pH 7.5，并且悬浮液通过均质器。
[0159] 在一些实施例中，均质的悬浮液被磺酰化。例如，在一些实施例中，将均质化的悬浮液调节成包含200mM亚硫酸钠和10mM四硫酸钠。然后在室温下混合溶液直至均质。然后，将混合的裂解物再混合另外一段时间以完成磺酰化(例如，在2-8℃下≥12小时)。然后，将磺酰化的裂解物离心一小时。然后，通过离心收集含有磺酰化PTD-MYC融合多肽的上清液，并且丢弃细胞沉淀物。上清液然后通过过滤器，例如0.22μm膜过滤器，以净化裂解物。
[0160] 然后纯化溶解的蛋白质。纯化方法可以包含亲和色谱法、反相色谱法、凝胶排阻色谱法等。在一些实施例中，使用亲和色谱法。例如，蛋白质带有表位标签或组氨酸6标签以便于纯化。在本发明中，示范性PTD-MYC融合多肽包括组氨酸6标签，以使用采用Ni树脂的Ni亲和色谱法进行纯化。
[0161] 在示范性实施例中，Ni树脂柱在含有尿素的缓冲液中平衡。在一些实施例中，平衡缓冲液是6M尿素、50mM磷酸盐、500mM NaCl和10％甘油溶液。然后，将包括PTD-MYC融合多肽的磺酰化和净化的上清液装载到Ni树脂柱上。然后用洗涤缓冲液(例如，6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油、500mM NaCl，pH 7.5)洗涤柱。然后用盐浓度降低的顺序洗涤缓冲液洗涤柱。例如，示范性后续洗涤可以包含6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油和2M NaCl，pH 7.5，然后另一次洗涤6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油、50mM NaCl和30mM咪唑，pH 7.5。
[0162] 在顺序应用洗涤缓冲液之后，通过添加洗脱缓冲液(例如，6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油和50mM氯化钠，pH 7.5，梯度为100mM到300mM咪唑)并收集级分来从柱中洗脱PTD-MYC融合多肽。然后通过0.22μm膜过滤含有待合并的级分的蛋白质。可以使用任何合适的方法(例如，UV波长280的分光光度法)测量蛋白质产率的评估。
[0163] 在一些实施例中，可以采用一或多种另外的纯化方法来进一步纯化分离的PTD-MYC融合多肽。在示范性实施例中，通过阴离子交换色谱法使用Q-琼脂糖凝胶树脂进一步纯化来自Ni-琼脂糖凝胶色谱法步骤的合并级分。在一些实施例中，通过用来自Ni琼脂糖凝胶色谱法步骤的第二洗涤缓冲液(例如，6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油、2M NaCl，pH 7.5)将样品稀释到Q琼脂糖凝胶缓冲液的电导率(17.52+/-1mS/cm)来制备装载到Q-琼脂糖凝胶柱上的池。然后将稀释的池装载到Q-琼脂糖凝胶柱上，随后使用追踪缓冲液(例如，6M尿素、50mM磷酸盐、300mM氯化钠和10％甘油)执行两个追踪步骤，进一步连续应用追踪缓冲液，直到UV跟踪达到基线，这表明蛋白质已经从柱上洗脱。
[0164] 治疗方法
[0165] 施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞以治疗患者的癌症。在一些实施例中，患者患有实体瘤。在一些实施例中，患者患有癌、腺瘤、腺癌、母细胞瘤、肉瘤或淋巴瘤。在一些实施例中，患者患有转移性肿瘤。在一些实施例中，患者在施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞之前接受了一或多种治疗癌症的药剂。在一些实施例中，癌症是复发性或难治性癌症。在一些实施例中，癌症对治疗癌症的一或多种药剂具有抗性。
[0166] 针对本文所提供的治疗方法，人类的示范性肿瘤包含但不限于黑色素瘤、膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、癌、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、CNS癌、胶质肿瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(gastric cancer)、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾脏癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌以及泌尿系统癌症。在一些实施例中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施例中，癌症是复发性或难治性癌症。
[0167] 在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞的施用抑制了肿瘤的生长或减小肿瘤的体积。在一些实施例中，向患有癌症的受试者施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞减轻了癌症的一或多个症状。在一些实施例中，向患有癌症的受试者施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞提高了受试者的总体存活率。在一些实施例中，向患有癌症的受试者施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞增加了癌症的消退。
[0168] 根据本文所提供的方法的PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞(例如，PTD-MYC融合多肽治疗的肿瘤浸润性淋巴细胞)的施用可以以任何适当的方式向受试者施用细胞来执行，包含但不限于注射、输血、植入或移植。在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞通过静脉内注射或淋巴管内注射或腹腔内向患者皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、鞘内施用。在一些实施例中，将PTD-MYC融合多肽免疫细胞施用到通过肿瘤组织切除(即，腔内递送)形成的腔中或在切除之前直接施用到肿瘤中(即，瘤内递送)。在一个实施例中，MYC融合多肽免疫细胞通过静脉内注射施用。
[0169] 除了PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞之外，施用的组合物可以包括任何其它药剂，如药学上可接受的载剂、缓冲液、赋形剂、佐剂、添加剂、防腐剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂和/或通常在对应的产物中发现的任何组分。选择用于调配用于特定施用途径的组合物的合适的成分和适当的制造方法是本领域公知的。
[0170] 包括PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞的过继细胞治疗组合物可以呈任何形式，如适于施用的固体、半固体或液体形式。调配物可以选自由以下组成、但不限于以下的组：溶液、乳剂、悬浮液、片剂、团粒和胶囊。组合物不限于某一种调配物，相反，所述组合物可以配制成任何已知的药学上可接受的调配物。可以通过本领域已知的任何常规方法产生药物组合物。
[0171] 在一些实施例中，MYC融合多肽修饰的免疫细胞的施用包括每千克体重施用104-1010个细胞，包含105到106个细胞/千克体重，包含这些范围内细胞数的所有整数值。在一些实施例中，在具有或没有淋巴耗竭的情况下施用细胞，例如，使用环磷酰胺。
[0172] MYC融合多肽修饰的免疫细胞可以施用一或多个剂量。在一个实施例中，PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞的治疗有效量作为单一剂量施用。在一些实施例中，施用单剂量的PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞具有治疗效果。在另一个实施例中，有效量的MYC融合多肽修饰的免疫细胞在一段时间内被作为多于一个剂量施用。施用时间在管理医师的判断范围内并且取决于各种因素，包含但不限于患者的年龄、性别或临床病状以及癌症的特性，包含癌症的类型、程度或位置。虽然个体需求各不相同，但用于治疗特定疾病或病状的有效量的MYC融合多肽修饰的免疫细胞的最佳范围的确定在本领域技术人员的知识范围内。
[0173] PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞可以例如在头2周、3周、4周、每月或在治疗期间施用1到10次。在一些实施例中，施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。在一些实施例中，每周、每2周、每3周或每月施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞。
[0174] 治疗有效量意味着提供治疗或预防益处的数量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、同期治疗(如果有的话)的种类、治疗频率、和希望的作用性质。
[0175] 在一些实施例中，首先用一或多种细胞因子和/或其它免疫调节剂对接受PTD-MYC修饰的免疫细胞的患者进行预处理。在一些实施例中，接受PTD-MYC修饰的免疫细胞的患者在施用PTD-MYC修饰的免疫细胞之前是淋巴耗竭的。淋巴耗竭的目的是为输注的淋巴细胞腾出空间，具体地通过消除调节性T细胞和其它竞争稳态细胞因子的非特异性T细胞。
[0176] 在一些实施例中，用另外的治疗剂施用PTD-MYC修饰的免疫细胞。在一些实施例中，另外的治疗剂是在用PTD-MYC修饰的免疫细胞治疗之前、同时、间歇或随后施用的。在一些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂，如白细胞介素(例如，IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子、趋化因子或免疫调节药物。在一些实施例中，细胞因子选自由以下组成的组：干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、IL-2、TNFα、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5(＝RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7和XCL2。在一些实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，如化学疗法或放射疗法。
[0177] 在一些实施例中，用于治疗癌症的修饰的免疫细胞是具有基因修饰的抗原受体的T细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。例如，可以采用各种策略以通过改变T细胞受体(TCR)的特异性对T细胞进行基因修饰，例如通过引入具有选定肽特异性的新型TCRα和β链(参见例如美国专利第8,697,854号；PCT专利出版物：WO 2003020763、WO 2004033685、WO 2004044004、WO 2005114215、WO 2006000830、WO 2008038002、WO 2008039818、WO
2004074322、WO 2005113595、WO 2006125962、WO 2013166321、WO 2013039889、WO
2014018863、WO 2014083173；美国专利第8,088,379号)。嵌合抗原受体(CAR)可以用于产生免疫应答细胞，如对选定靶标具有特异性的T细胞，如恶性细胞，其中已经描述了多种受体嵌合构建体(参见例如美国专利第5,843,728号；第5,851,828号；第5,912,170号；第6,004,
811号；第6,284,240号；第6,392,013号；第6,410,014号；第6,753,162号；第8,211,422号；
以及PCT出版物WO9215322)。用于制备CAR T细胞的方法在本领域中是已知的，并且可以与本文所提供的方法组合使用，以产生本文所描述的包括MYC融合多肽(例如，PTD)的修饰的CAR T细胞。
2004074322、WO 2005113595、WO 2006125962、WO 2013166321、WO 2013039889、WO
2014018863、WO 2014083173；美国专利第8,088,379号)。嵌合抗原受体(CAR)可以用于产生免疫应答细胞，如对选定靶标具有特异性的T细胞，如恶性细胞，其中已经描述了多种受体嵌合构建体(参见例如美国专利第5,843,728号；第5,851,828号；第5,912,170号；第6,004,
811号；第6,284,240号；第6,392,013号；第6,410,014号；第6,753,162号；第8,211,422号；
以及PCT出版物WO9215322)。用于制备CAR T细胞的方法在本领域中是已知的，并且可以与本文所提供的方法组合使用，以产生本文所描述的包括MYC融合多肽(例如，PTD)的修饰的CAR T细胞。
[0178] 通常，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外结构域包括对预定靶标具有特异性的抗原结合结构域。虽然CAR的抗原结合结构域通常是抗体或抗体片段(例如，单链可变片段scFv)，但只要其导致对靶标的特异性识别，结合结构域就不会特别限制。例如，在一些实施例中，抗原结合结构域可以包括受体，使得CAR能够与受体的配体结合。可替代地，抗原结合结构域可以包括配体，使得CAR能够与配体的内源性受体结合。
[0179] 在一些实施例中，表达期望的CAR的T细胞是通过与γ-辐射活化和传播细胞(AaPC)共培养来选择的，所述AaPC共表达癌症抗原和共刺激分子。在一些实施例中，扩增工程化的CAR T细胞，例如在存在可溶性因子(如IL-2和IL-21)的情况下通过在AaPC上进行共培养来扩增。此扩增可以例如被执行以提供记忆CAR+T细胞。以这种方式，可以提供具有针对抗原荷瘤的特异性细胞毒性活性的CAR T细胞(任选地，与如干扰素-γ等所期望的趋化因子的产生相结合)。
[0180] 在一些实施例中，使CAR T细胞与本文所提供的PTD-MYC融合多肽在体外接触，以产生用于治疗癌症的修饰CAR T细胞。修饰的CAR T细胞可以根据任何合适的方法施用，包含用于施用如上所述的PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞的方法。
[0181] 试剂盒
[0182] 包括本文所提供的MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞的药物组合物可以组装到用于治疗癌症的试剂盒或药物系统中。根据此实施例的试剂盒可以包括载剂装置，如一或多个容器(如小瓶、管、安瓶、瓶子、注射器或袋子)封闭在其中的盒子、纸箱、管。试剂盒还可以包括用于使用MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞的相关说明。
[0183] 在一些实施例中，试剂盒包括有效量的过继细胞疗法，如MYC融合多肽修饰的免疫细胞。在一些实施例中，所述试剂盒包括用于检测所施用的MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞的一或多种试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包括用本文所提供的MYC融合多肽治疗的细胞，例如造血干细胞、供体白细胞、T细胞或NK细胞。在一些实施例中，试剂盒进一步包括与本文所提供的MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞组合施用的有效量的治疗剂。在一些实施例中，治疗剂是抗癌剂。
[0184] 本文所提供的试剂盒还可以包含一种用于向受试者施用本文所提供的MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞的装置。本领域已知的用于向受试者施用多肽和细胞的各种装置中的任一种装置可以包含在本文所提供的试剂盒中。示范性装置包含皮下注射针、静脉内注射针、导管、无针注射器，但不限于皮下注射针、静脉内注射针、导管、无针注射装置、吸入器和如滴眼器等液体分配器。通常用于施用试剂盒的MYC融合多肽和/或MYC融合多肽修饰的免疫细胞的装置将与所期望的组合物的施用方法兼容。例如，静脉内递送的组合物可以包含在具有皮下注射针和注射器的试剂盒中。
[0185] 实例
[0186] 实例1.用TAT-MYC处理免疫细胞以产生用于黑色素瘤肿瘤的免疫疗法的TAT-MYC处理的淋巴细胞
[0187] 在此实例中，检查了包括HIV-1反式激活蛋白(TAT)和MYC的蛋白转导结构域的PTD-MYC融合多肽调节对体内黑色素瘤细胞的免疫应答的能力。具体来说，研究了源自于荷黑色素瘤的小鼠并用TAT-MYC处理的淋巴样细胞治疗携带黑色素瘤的小鼠的能力。这些研究的目的是确定免疫细胞是否源自于荷黑色素瘤的小鼠并用TAT-MYC治疗以产生TAT-MYC淋巴细胞，所述TAT-MYC淋巴细胞在移植到荷黑色素瘤的小鼠中时将有效治疗黑色素瘤肿瘤。
[0188] 材料与方法
[0189] C57BL/6J是应用最广泛的近交系，并且首先对其基因组进行测序。虽然此菌株对许多肿瘤具有难治性，但其是大多数突变最大化表达的允许背景。C57BL/6J小鼠对听源性惊厥具有抗性，骨密度相对低，并发展年龄相关的听力损伤。其也容易受到饮食诱导的肥胖、2型糖尿病和动脉粥样硬化的影响。来自此菌株的巨噬细胞对炭疽致死毒素的效果具有抗性。
[0190] 治疗组
[0191] 产生重约25g并携带黑色素瘤肿瘤的十五只C57BL/6小鼠(杰克逊实验室库存编号000664)并将其划分为5只动物的3个队列，一只小鼠的一个队列作为无治疗对照组，一个队列用源自于荷瘤小鼠的淋巴细胞治疗并用对照TAT-融合蛋白治疗，并且一个队列用TAT-MYC淋巴细胞治疗。
[0192] 荷瘤供体小鼠的产生和供体细胞的制备
[0193] 将植入的B16-F10黑色素瘤细胞(ATCC CRL 6475，小鼠皮肤黑色素瘤)在D10培养基(DMEM，10％FBS，Pen/Strep(10,000个单位/毫升)(Gibco目录号15140)；L-谷氨酸(200mM)(Gibco目录号25030)；MEM非必需氨基酸(Gibco目录号11140))中培养。
[0194] 通过尾静脉注射使C57BL/6j小鼠(杰克逊实验室#003548)植入有含1×104B16-F10黑色素瘤细胞的250μL PBS。在注射之前，将每只测试小鼠放置在250W的热灯下持续1到2分钟，并且然后静脉内注射黑色素瘤细胞。在移植后14天，从注射的小鼠采集淋巴结并用
10mL的注射器的柱塞研磨。
10mL的注射器的柱塞研磨。
[0195] 对于第一次研究，从5只小鼠中采集淋巴结。对于第二次研究，从10只小鼠中采集淋巴结。用C10洗涤细胞，采集细胞并以260×g旋转5分钟。在丢弃上清液之后，将细胞重新悬浮于10mL无菌TAC中，以260×g旋转5分钟。在丢弃上清液之后，用5％的BSA将细胞重新悬浮于2mL无菌过滤的PBS中。
[0196] 用TAT-MYC处理淋巴结细胞以产生TAT-MYC淋巴细胞或用对照TAT融合蛋白处理。将细胞分成2个15mL锥形管(每只各1mL)，用1mL的25μg/mL对照蛋白(实验1的TAT-CRE和实验2的TAT-GFP)或1mL的25μg/mL TAT-MYC批次C18进行处理。在室温温育一小时之后，用无菌PBS洗涤每只管三次，将其转移到5mL无菌管中，并放置在冰上。
[0197] 通过将含1×104B16-F10黑色素瘤细胞的250μL PBS注射到每队列5C57BL/6j小鼠的尾静脉中来制备测试小鼠。在注射之后，每日观察一次小鼠。监测体重、食物消耗、活动和死亡率的变化。在移植后7天，然后将TAT-MYC淋巴细胞或对照淋巴样细胞移植到黑色素瘤细胞注射的小鼠中。
[0198] 每日监测症状。当出现严重症状时，对小鼠进行安乐死并记录死亡。发现小鼠死亡，或者如果发现有严重的症状，如呼吸沉重、驼背和不动性，则对小鼠进行安乐死。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0199] 来自实验1和2的结果分别示出在图1和2中。如图所示，与用对照TAT融合蛋白处理的移植淋巴样细胞相比，用通过使源自于荷黑色素瘤小鼠的小鼠淋巴样细胞与TAT-MYC接触产生的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)治疗荷黑色素瘤小鼠显著提高了小鼠的总体存活率。这些结果表明，TAT-MYC治疗免疫细胞可用于使用过继细胞转移治疗黑色素瘤。
[0200] 实例2.TAT-MYC处理的淋巴细胞对黑色素瘤肿瘤免疫疗法的剂量应答效果
[0201] 在此实例中，检查了不同量施用的TAT-MYC处理的淋巴细胞对黑色素瘤肿瘤的免疫疗法的治疗效果。此实验如上述实例1进行，除了注射和比较若干种不同剂量的TAT-MYC处理的淋巴细胞之外。进行了两次实验。在第一个实验中，实验3，根据以下剂量组通过尾静脉注射向荷黑色素瘤的小鼠施用TAT-MYC淋巴细胞：3.0×106个细胞/千克、6.0×106个细胞/千克、14.0×106个细胞/千克和70.0×106个细胞/千克。对于对照组，向小鼠施用70.0×106TAT-Cre进行治疗或不施用细胞(NT)。在第二个实验中，实验4，根据以下剂量组通过尾静脉注射向荷黑色素瘤的小鼠施用TAT-MYC淋巴细胞：4.0×103个细胞/千克、4.0×104个细胞/千克、4.0×105个细胞/千克、4.0×106个细胞/千克和4.0×107个细胞/千克。对于对照组，向小鼠施用4.0×106TAT-Cre进行治疗或不施用细胞(NT)。来自实验3和4的结果分别示出在图3和4中。如图所示，用更多量的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)治疗荷黑色素瘤的小鼠使两个实验的总体存活率显著提高。这些实验证明了用于治疗荷黑色素瘤的受试者的TAT-MYC淋巴细胞的可重现性和疗效。
[0202] 实例3.用TAT-MYC处理免疫细胞以产生用于结肠癌的免疫疗法的TAT-MYC处理的淋巴细胞
[0203] 在此实例中，检查了包括HIV-1反式激活蛋白(TAT)和MYC的蛋白转导结构域的PTD-MYC融合多肽调节对体内结肠癌细胞的免疫应答的能力。具体来说，研究了源自于荷结肠肿瘤的小鼠并用TAT-MYC处理的淋巴样细胞治疗携带源自结肠癌细胞的肿瘤的小鼠的能力。这些研究的目的是确定免疫细胞是否源自于荷结肠肿瘤的小鼠并用TAT-MYC治疗以产生TAT-MYC淋巴细胞，所述TAT-MYC淋巴细胞在移植到荷结肠肿瘤的小鼠中时将有效治疗结肠癌。
[0204] 材料与方法
[0205] 将植入的MC-38鼠类结肠腺癌细胞(Kerafast#ENH204)在D10培养基(DMEM，10％FBS，Pen/Strep(10,000个单位/毫升)(Gibco目录号15140)；L-谷氨酸(200mM)(Gibco目录号25030)；MEM非必需氨基酸(Gibco目录号11140))中培养。
[0206] 通过尾静脉注射使重约25g的九只供体C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室库存编号000664)植入有含1×106MC-38小鼠结肠腺癌细胞的250μL PBS。在一周之后，使18只受体C57BL/6J小鼠植入有1×106MC-38小鼠结肠腺癌细胞。
[0207] 在供体小鼠移植后14天，从注射的九只供体小鼠采集淋巴结并用10mL的注射器的柱塞研磨。用C10洗涤细胞，采集细胞并以260×g旋转5分钟。在丢弃上清液之后，将细胞重新悬浮于10mL无菌TAC中，以260×g旋转5分钟。在丢弃上清液之后，用5％的BSA将细胞重新悬浮于2mL无菌过滤的PBS中。用TAT-MYC处理淋巴结细胞以产生TAT-MYC淋巴细胞或用对照TAT融合蛋白处理。将细胞分成2个15mL锥形管(每只各1mL)，用1mL的25μg/mL对照TAT融合蛋白(TAT-CRE)或1mL的25μg/mL TAT-MYC批次C18进行处理。在室温温育一小时之后，用无菌PBS洗涤每只管三次，将其转移到5mL无菌管中，并放置在冰上。然后以250μL PBS将125,000个淋巴细胞注射到每只受体小鼠的尾静脉中(相当于5×106个细胞/千克)，以产生各自
6只小鼠的3个队列：一个队列无治疗对照，一个队列用源自于荷瘤小鼠的淋巴样细胞治疗并用对照TAT融合蛋白治疗，并且一个队列用源自于荷瘤小鼠的淋巴样细胞治疗并用TAT-MYC融合蛋白(TAT-MYC淋巴细胞)治疗。
6只小鼠的3个队列：一个队列无治疗对照，一个队列用源自于荷瘤小鼠的淋巴样细胞治疗并用对照TAT融合蛋白治疗，并且一个队列用源自于荷瘤小鼠的淋巴样细胞治疗并用TAT-MYC融合蛋白(TAT-MYC淋巴细胞)治疗。
[0208] 在注射之后，每日观察一次小鼠。监测体重、食物消耗、活动和死亡率的变化。每日监测症状。当出现严重症状时，对小鼠进行安乐死并记录死亡。发现小鼠死亡，或者如果发现有严重的症状，如呼吸沉重、驼背和不动性，则对小鼠进行安乐死。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0209] 结果
[0210] 来自此实验的结果示出在图5中。在治疗后第27天，第一次无处理，并且TAT-CRE对照小鼠被发现死亡。到治疗后第34天，所有都没有处理，并且TAT-CRE对照小鼠要么被发现死亡，要么需要进行安乐死。相比之下，第一个TAT-MYC淋巴细胞治疗的小鼠死亡发生在治疗后第32天。到第52天，只有3只经TAT-MYC淋巴细胞治疗的小鼠死亡。
[0211] 因此，如图所示，与用对照TAT-MYC融合蛋白处理的移植淋巴样细胞相比，用通过使源自于荷结肠肿瘤的小鼠的小鼠淋巴样细胞与TAT-MYC接触产生的TAT-MYC淋巴细胞治疗荷结肠肿瘤的小鼠显著地(p<0.0019)提高了小鼠的总体存活率。这些结果表明，TAT-MYC治疗免疫细胞可用于使用过继细胞转移治疗结肠癌。
[0212] 实例4.TAT-MYC处理的淋巴细胞对黑色素瘤肿瘤免疫疗法的剂量应答效果
[0213] 在此实例中，检查了不同量施用的TAT-MYC处理的淋巴细胞对黑色素瘤肿瘤的免疫疗法的治疗效果。此实验如上述实例3进行，除了注射和比较若干种不同剂量的TAT-MYC处理的淋巴细胞之外。在此实验中，根据以下剂量组通过尾静脉注射向荷黑色素瘤的小鼠施用TAT-MYC淋巴细胞(每组5只荷瘤小鼠)：5.0×103个细胞/千克、5.0×104个细胞/千克、5.0×105个细胞/千克、5.0×106个细胞/千克、5.0×107个细胞/千克和5.0×108个细胞/千克。对于对照组，不向小鼠施用细胞(NT)(8只小鼠)或向非荷瘤小鼠(5只小鼠)施用5.0×
107个细胞/千克。来自此实验的结果示出在图6中。如图所示，用更多量的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)治疗荷黑色素瘤的小鼠使总体存活率显著提高。在未经治疗的队列中，75％的动物在第19天死亡，并且剩余未经治疗的小鼠在肿瘤移植后第41天死亡。所有接受5×103个细胞/千克的小鼠在第19天死亡。相比之下，在整个研究过程中，60％的动物接受5×105个细胞/千克，并且100％的动物接受5×106或5×107个细胞/千克。此外，在整个研究过程中，接受5×107个细胞/千克的100％的非荷瘤小鼠存活。所有接受5×108个细胞/千克的小鼠都表现出其皮毛变薄。接受5×108个细胞/千克的40％的小鼠在第41天死亡。接受5×108个细胞/千克的剩余60％的小鼠在整个研究过程中存活。
107个细胞/千克。来自此实验的结果示出在图6中。如图所示，用更多量的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)治疗荷黑色素瘤的小鼠使总体存活率显著提高。在未经治疗的队列中，75％的动物在第19天死亡，并且剩余未经治疗的小鼠在肿瘤移植后第41天死亡。所有接受5×103个细胞/千克的小鼠在第19天死亡。相比之下，在整个研究过程中，60％的动物接受5×105个细胞/千克，并且100％的动物接受5×106或5×107个细胞/千克。此外，在整个研究过程中，接受5×107个细胞/千克的100％的非荷瘤小鼠存活。所有接受5×108个细胞/千克的小鼠都表现出其皮毛变薄。接受5×108个细胞/千克的40％的小鼠在第41天死亡。接受5×108个细胞/千克的剩余60％的小鼠在整个研究过程中存活。
[0214] 这些实验证明了TAT-MYC淋巴细胞治疗在其它方面致命的MC-38结肠直肠癌肿瘤模型中的荷结肠肿瘤的受试者的可重现性和疗效两者。
[0215] 实例5.用TAT-MYC治疗免疫细胞以产生用于实体瘤的免疫疗法的TAT-MYC处理的淋巴细胞
[0216] 在此实例中，检查了包括HIV-1反式激活蛋白(TAT)和MYC的蛋白转导结构域的PTD-MYC融合多肽调节对体内另外的肿瘤细胞类型的免疫应答的能力。具体来说，研究了源自于荷瘤小鼠并用TAT-MYC处理的淋巴样细胞治疗携带实体瘤的小鼠的能力。这些研究的目的是确定免疫细胞是否源自于荷瘤小鼠并用TAT-MYC治疗以产生TAT-MYC淋巴细胞，所述TAT-MYC淋巴细胞在移植到荷瘤小鼠上时有效治疗实体瘤。
[0217] 许多使用癌细胞系移植的小鼠异种移植模型在本领域是可用的，并且可以在本实例中使用来评估实体瘤的治疗。下表列出了用于产生异种移植肿瘤的癌症和可用细胞系的非限制性实例。
[0218]
[0219] 材料与方法
[0220] 产生重约25g并携带实体瘤的十五只C57BL/6小鼠(杰克逊实验室库存编号000664)并将其划分为5只动物的3个队列，一只小鼠的一个队列作为无治疗对照组，一个队列用源自于荷瘤小鼠的淋巴细胞治疗并用对照TAT-融合蛋白治疗，并且一个队列用TAT-MYC淋巴细胞治疗。
[0221] 荷瘤供体小鼠的产生和供体细胞的制备
[0222] 将植入的实体瘤在D10培养基(DMEM，10％FBS，Pen/Strep(10,000个单位/毫升)(Gibco目录号15140)；L-谷氨酸(200mM)(Gibco目录号25030)；MEM非必需氨基酸(Gibco目录号11140))中培养。
[0223] 通过尾静脉注射使C57BL/6j小鼠(杰克逊实验室#003548)植入有含1×104个肿瘤细胞的250μL PBS中。在注射之前，将每只测试小鼠放置在250W的热灯下持续1到2分钟，并且然后静脉内注射肿瘤细胞。在移植后14天，从注射的小鼠采集淋巴结并用10mL的注射器的柱塞研磨。
[0224] 对于第一次研究，从5只小鼠中采集淋巴结。对于第二次研究，从10只小鼠中采集淋巴结。用C10洗涤细胞，采集细胞并以260×g旋转5分钟。在丢弃上清液之后，将细胞重新悬浮于10mL无菌TAC中，以260×g旋转5分钟。在丢弃上清液之后，用5％的BSA将细胞重新悬浮于2mL无菌过滤的PBS中。
[0225] 用TAT-MYC处理淋巴结细胞以产生TAT-MYC淋巴细胞或用对照TAT融合蛋白处理。将细胞分成2个15mL锥形管(每只各1mL)，用1mL的25μg/mL对照蛋白(实验1的TAT-CRE和实验2的TAT-GFP)或1mL的25μg/mL的TAT-MYC批次C18进行处理。在室温温育一小时之后，用无菌PBS洗涤每只管三次，将其转移到5mL无菌管中，并放置在冰上。
[0226] 通过将含1×104个肿瘤细胞的250μL PBS注射到每队列5C57BL/6j小鼠的尾静脉中来制备测试小鼠。在注射之后，每日观察一次小鼠。监测体重、食物消耗、活动和死亡率的变化。在移植后7天，然后将TAT-MYC淋巴细胞或对照淋巴样细胞移植到肿瘤细胞注射的小鼠中。
[0227] 每日监测症状。当出现严重症状时，对小鼠进行安乐死并记录死亡。发现小鼠死亡，或者如果发现有严重的症状，如呼吸沉重、驼背和不动性，则对小鼠进行安乐死。用治疗天数将死亡天数记录为第0天。
[0228] 可能期望，与用对照TAT融合蛋白处理的移植淋巴样细胞相比，用通过使源自于荷瘤小鼠的小鼠淋巴样细胞与TAT-MYC接触产生的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)治疗荷瘤小鼠显著提高了小鼠的总体存活率。这些结果将示出，TAT-MYC治疗免疫细胞可用于使用过继细胞转移治疗实体瘤。
[0229] 实例6.TAT-MYC处理的淋巴细胞对实体瘤免疫疗法的剂量应答效果
[0230] 在此实例中，检查了不同量施用的TAT-MYC处理的淋巴细胞对实体瘤的免疫疗法的治疗效果。此实验如以上所描述的进行，除了注射和比较若干种不同剂量的TAT-MYC处理的淋巴细胞之外。进行了两次实验。在第一个实验中，根据以下剂量组通过尾静脉注射向荷瘤小鼠施用TAT-MYC淋巴细胞：3.0×106个细胞/千克、6.0×106个细胞/千克、14.0×106个细胞/千克和70.0×106个细胞/千克。对于对照组，向小鼠施用70.0×106TAT-Cre进行治疗或不施用细胞(NT)。在第二个实验中，实验4，根据以下剂量组通过尾静脉注射向荷瘤小鼠施用TAT-MYC淋巴细胞：4.0×103个细胞/千克、4.0×104个细胞/千克、4.0×105个细胞/千克、4.0×106个细胞/千克和4.0×107个细胞/千克。对于对照组，向小鼠施用4.0×106TAT-Cre进行治疗或不施用细胞(NT)。可能期望，用更多量的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)治疗荷瘤小鼠将使两个实验的总体存活率显著提高。这些实验也将证明用于治疗荷瘤受试者的TAT-MYC淋巴细胞的可重现性和疗效。
[0231] 虽然已经在本文示出并描述了本公开的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应当显而易见的是此类实施例仅以举例方式提供。在不背离本公开的情况下，本领域的普通技术人员现在将会想到众多变体、变化以及取代。应当理解，本文所述的本公开的实施例的多种替代方案可以用于实践本公开。预期的是以下权利要求限定了本公开的范围以及由此覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
[0233] 在以下权利要求中阐述了其它实施例。
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