作为调节细胞疗法的分子开关的抗体化学诱导二聚体(AbCID)
阅读：997发布：2020-08-22
专利汇可以提供作为调节细胞疗法的分子开关的抗体化学诱导二聚体(AbCID)专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且化学诱导二聚体(AbCID)已经成为人工调节细胞中 信号 传导通路的最强有 力 的工具之一；然而，目前还没有简单的方法来鉴定或设计这些系统。本 发明 提供了一种方法，其通过选择识别由结合的小分子产生的化学表位的合成 抗体 ，从已知的小分子- 蛋白质 复合物中快速产生基于抗体的化学诱导二聚体(AbCID)。这一策略的成功通过产生十种抗BCL-xL/ABT-737复合物的化学诱导抗体来证明。所述抗体中的三种对BCL-xL/ABT-737复合物的选择性高于单独的BCL-xL。AbCID的两个典型的重要细胞应用是通过在细胞内应用它们来诱导CRISPRa介导的基因表达和在细胞外应用它们来调节用小分子ABT-737对CAR T细胞激活的调节。ABT-737在细胞中用于激活AbCID的浓度下是无毒的。由本发明提供的AbCID是新的 正交 AbCID，扩展了可用CID的有限工具箱。，下面是作为调节细胞疗法的分子开关的抗体化学诱导二聚体(AbCID)专利的具体信息内容。
1.一种系统，其包含：
(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核酸，所述第一化学诱导二聚体(CID)组分包含(i)能够与小分子相互作用以在所述第一CID组分与所述小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到所述第一结合部分的第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)和所述小分子与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到所述第二结合部分的第二衔接子部分，其中所述第二结合部分特异性地结合包含所述小分子的至少一部分和所述第一结合部分的一部分的复合物的位点。
2.根据权利要求1所述的系统，其进一步包含所述小分子，其中所述第二CID组分在包含所述小分子的至少一部分和所述第一结合部分的一部分的复合物的位点处结合至所述小分子与所述第一CID组分之间的复合物。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其中包含所述小分子的至少一部分和所述第一结合部分的一部分的所述复合物的位点是所述小分子与针对所述小分子的所述第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包含所述小分子的至少一个原子和所述第一结合部分的一个原子。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述第一结合部分是与所述小分子特异性地结合的第一抗体部分。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述小分子是甲氨蝶呤。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，其中所述第一结合部分源自所述小分子的天然存在的结合配偶体，或其小分子结合变体。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述天然存在的结合配偶体是Bcl-2、Bcl-xL、FK506结合蛋白(FKBP)或细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述天然存在的结合配偶体是Bcl-2，并且所述小分子是ABT-199、ABT-263或其类似物。
9.根据权利要求7所述的系统，其中所述天然存在的结合配偶体是Bcl-xL，并且所述小分子是ABT-737或其类似物。
10.根据权利要求7所述的系统，其中所述天然存在的结合配偶体是FKBP，并且所述小分子是具有式(I)的结构的雷帕霉素(SLF)的合成配体或其类似物。
11.根据权利要求7所述的系统，其中所述天然存在的结合配偶体是cIAP1，并且所述小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427、比利那潘或其类似物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的系统，其中所述第二结合部分是与化学表位特异性地结合的抗体部分，所述化学表位包含所述小分子的至少一部分和所述第一结合部分的一部分。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中所述第二CID组分结合至所述第一CID组分和所述小分子的复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离第一CID组分和游离小分子中的每一个的Kd的约1/500。
14.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)Bcl-xL的ABT-737结合结构域和(ii)第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-737与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表1的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述ABT-737结合结构域包含SEQ IDNO:314的氨基酸序列。
16.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)Bcl-2的ABT-199结合结构域和(ii)第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-199与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表2的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述ABT-199结合结构域包含SEQ IDNO:315的氨基酸序列。
18.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)Bcl-2的ABT-263结合结构域和(ii)第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-263与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表3的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述ABT-263结合结构域包含SEQ IDNO:315的氨基酸序列。
20.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)FKBP的雷帕霉素(SLF)结合结构域的合成配体和(ii)第一衔接子部分，其中所述SLF具有式(I)的结构；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和所述SLF与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表4的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列。
22.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的GDC-0152结合结构域和(ii)第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和GDC-0152与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表5的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述GDC-0152结合结构域包含SEQID NO:317的氨基酸序列。
24.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的LCL161结合结构域和(ii)第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和LCL161与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表6的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
25.根据权利要求24所述的系统，其中所述LCL161结合结构域包含SEQ IDNO:317的氨基酸序列。
26.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的AT406结合结构域和(ii)第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和AT406与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表7的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
27.根据权利要求26所述的系统，其中所述AT406结合结构域包含SEQ IDNO:317的氨基酸序列。
28.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的CUDC-427结合结构域和(ii)第一衔接子部分；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和CUDC-427与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表8的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
29.根据权利要求28所述的系统，其中所述CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
30.一种系统，其包含：
(a)第一CID组分或编码所述第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)甲氨蝶呤结合型Fab和(ii)第一衔接子部分，其中所述甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、
321、322和323的氨基酸序列；和
(b)第二CID组分或编码所述第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和甲氨蝶呤与所述第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，
其中所述第二CID组分的抗体部分包含根据表9的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的系统，其中
(a)所述第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且所述第二衔接子部分包含转录调节结构域；或者
(b)所述第二衔接子部分包含DNA结合结构域，并且所述第一衔接子部分包含转录调节结构域，
其中所述第一CID组分和所述第二CID组分被配置成使得当在所述小分子的存在下二聚化形成所述CID时，所述CID能够调节靶基因的转录。
32.根据权利要求31所述的系统，其中
(a)所述转录调节结构域是转录激活结构域，并且所述CID能够上调所述靶基因的转录；或者
(b)所述转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且所述CID能够下调所述靶基因的转录。
33.根据权利要求31或32所述的系统，其中所述DNA结合结构域源自天然存在的转录调节因子。
34.根据权利要求31或32所述的系统，其中所述DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡的。
36.根据权利要求35所述的系统，其中所述DNA结合结构域源自催化性死亡的Cas9(dCas9)。
37.根据权利要求1-30中任一项所述的系统，其中所述第一CID组分和所述第二CID组分被配置成使得当在所述小分子的存在下二聚化形成与靶细胞相关联的CID时，所述CID能够诱导靶细胞死亡。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述第一衔接子部分和所述第二衔接子部分一起能够诱导所述靶细胞凋亡。
39.根据权利要求38所述的系统，其中所述第一衔接子部分和/或所述第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。
40.根据权利要求39所述的系统，其中所述第一衔接子部分和所述第二衔接子部分源自半胱天冬酶-9。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的系统，其中所述靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。
42.根据权利要求41所述的系统，其中所述靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
43.根据权利要求1-30中任一项所述的系统，其中所述第一CID组分和所述第二CID组分被配置成使得当在所述小分子的存在下二聚化形成与T细胞相关联的CID时，所述CID是能够在结合靶抗原后激活所述T细胞的异二聚体CAR。
44.根据权利要求43所述的系统，其中
(a)所述第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且所述第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；或者(b)所述第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且所述第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；
其中所述细胞外抗原结合部分特异性地结合所述靶抗原。
45.根据权利要求44所述的系统，其中包含所述细胞外抗原结合部分的所述CID组分进一步包含分泌信号肽。
46.根据权利要求43所述的系统，其中
(a)所述第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞外抗原结合部分；并且所述第二衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；或者
(b)所述第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞外抗原结合部分；并且所述第一衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；
其中所述细胞外抗原结合部分特异性地结合所述靶抗原。
47.根据权利要求43所述的系统，其中所述第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；并且所述第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；其中所述第一或第二CID组分进一步包含与其结合部分相连的细胞外抗原结合部分；并且其中所述细胞外抗原结合部分特异性地结合所述靶抗原。
48.根据权利要求46或47所述的系统，其中所述第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
49.根据权利要求1-30中任一项所述的系统，其中所述第一CID组分和所述第二CID组分被配置成使得当在所述小分子的存在下二聚化形成CID时，所述CID是能够将T细胞重引导至靶细胞的异二聚体双特异性T细胞接合器。
50.根据权利要求49所述的系统，其中
(a)所述第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且所述第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者
(b)所述第二衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且所述第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分。
51.根据权利要求50所述的系统，其中所述T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。
52.根据权利要求50或51所述的系统，其中所述靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。
53.根据权利要求52所述的系统，其中所述患病细胞是癌细胞。
54.根据权利要求52或53所述的系统，其中所述靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。
55.根据权利要求1-30中任一项所述的系统，其中所述第一CID组分和所述第二CID组分被配置成使得当在所述小分子的存在下二聚化形成与免疫细胞相关联的CID时，所述CID是能够调节所述免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子。
56.根据权利要求55所述的系统，其中所述第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且所述第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域。
57.根据权利要求56所述的系统，其中所述第一衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域和/或所述第二衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的系统，其中所述免疫细胞是T细胞。
59.根据权利要求58所述的系统，其中所述T细胞是CAR T细胞。
60.一种从结合分子文库中选择结合部分的方法，其中所述结合部分特异性地结合小分子与同源结合部分之间的复合物，所述方法包括：
(a)对结合部分输入组筛选出在所述小分子不存在时不与所述同源结合部分结合的结合部分，从而产生反选择的结合部分组；和
(b)对结合部分输入组筛选出和所述小分子与所述同源结合部分的复合物结合的结合部分，从而产生阳性选择的结合部分组；和
(c)进行一轮或多轮筛选，其中每轮筛选包括步骤(a)的筛选和步骤(b)的筛选，使得产生和所述小分子与所述同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述方法包括两轮或更多轮筛选，并且其中(1)对于第一轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是所述结合分子文库，(2)对于每轮筛选，步骤(b)的所述结合部分输入组是来自给定轮筛选的步骤(a)的所述反选择的结合部分组，
(3)对于第一轮筛选后的每轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是来自前一轮筛选的步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组，以及
(4)对于最后一轮筛选，和所述小分子与所述同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组是步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组。
62.根据权利要求61所述的方法，其包括至少2轮选择。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中和所述小分子与所述同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的至少一个结合部分结合至所述复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/
500。
64.根据权利要求63所述的方法，其中和所述小分子与所述同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的每个结合部分结合至所述复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/500。
65.根据权利要求60-64中任一项所述的方法，其中所述结合分子文库是抗体文库、DARPin文库、纳米抗体文库或适体文库。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述结合分子文库是抗体文库。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述抗体文库是噬菌体展示的Fab文库。
68.一种构建体，其包含和小分子与结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，所述构建体通过包括以下步骤的方法制备：
(A)根据权利要求60-67中任一项所述的方法从抗体文库中选择抗体部分；和(B)提供包含(A)的抗体部分中的一种的构建体。
69.根据权利要求1-59中任一项所述的系统，其中所述第二结合部分是通过包括以下步骤的方法选择的抗体部分：
(A)根据权利要求60-67中任一项所述的方法从抗体文库中选择抗体部分；和(B)选择所述第二结合部分作为(A)的抗体部分中的一种。
70.一种调节细胞中靶基因表达的方法，其包括在所述细胞中表达根据权利要求31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分，并修改所述细胞中所述小分子的量以调节所述靶基因表达。
71.一种治疗个体的疾病的方法，其包括：
(A)在个体的靶细胞中表达根据权利要求31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分，其中所述靶基因在所述靶细胞中的表达水平与所述疾病相关联；和(B)以有效治疗所述疾病的方案向所述个体给予所述小分子。
72.一种核酸，其编码根据权利要求31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
73.一种细胞，其包含根据权利要求31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
74.一种控制个体中靶细胞存活的方法，其包括：
(A)在所述靶细胞中表达根据权利要求37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和
(B)以有效(I)杀死预定量的所述靶细胞；或(II)保持预定量的所述靶细胞的方案向所述个体给予所述小分子。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述靶细胞是所述个体中过继细胞疗法的一部分。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述靶细胞是CAR T细胞。
77.一种治疗个体的疾病的方法，其包括：
(A)向所述个体给予针对所述疾病的过继细胞疗法，所述过继细胞疗法包括修饰的细胞，其中所述修饰的细胞表达根据权利要求37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和
(B)以有效(I)杀死预定量的所述过继转移细胞；或(II)保持预定量的所述过继转移细胞的方案向所述个体给予所述小分子。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述过继细胞疗法是CAR T细胞疗法。
79.一种核酸，其编码根据权利要求37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
80.一种细胞，其包含根据权利要求37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
81.根据权利要求80所述的细胞，其中所述细胞是过继细胞疗法的一部分。
82.根据权利要求81所述的细胞，其中所述细胞是CAR T细胞。
83.一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：
(A)向所述个体给予表达根据权利要求43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分的经修饰的T细胞，其中所述靶抗原在所述靶细胞表面上表达；和
(B)以有效调节对所述靶细胞免疫应答的方案向所述个体给予所述小分子。
84.一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：
(A)向所述个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达根据权利要求44所述的系统的CID组分，所述CID组分包含所述细胞质信号传导结构域；
(B)向所述个体给予根据权利要求44所述的系统的CID组分，所述CID组分包含所述细胞外抗原结合部分，其中所述靶抗原在所述靶细胞表面上表达；和
(C)以有效调节对所述靶细胞免疫应答的方案向所述个体给予所述小分子。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中与包括将表达了包含所述CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对所述靶细胞的免疫应答，同时对所述个体的副作用更少。
86.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：
(A)向所述个体给予表达根据权利要求43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分的经修饰的T细胞，其中所述靶抗原在所述靶细胞表面上表达；和
(B)以有效治疗所述疾病的方案向所述个体给予所述小分子。
87.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：
(A)向所述个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达根据权利要求44所述的系统的CID组分，所述CID组分包含所述细胞质信号传导结构域；
(B)向所述个体给予根据权利要求44所述的系统的CID组分，所述CID组分包含所述细胞外抗原结合部分，其中所述靶抗原在所述靶细胞表面上表达；和
(C)以有效治疗所述疾病的方案向所述个体给予所述小分子。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中与包括将表达了含有所述CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对所述个体的副作用更少。
89.一种核酸，其编码根据权利要求43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
90.一种T细胞，其包含根据权利要求43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
91.一种T细胞，其包含根据权利要求44所述的系统的CID组分，所述CID组分包含所述细胞质信号传导结构域。
92.一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：
(A)向所述个体给予根据权利要求49-54中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；
和
(B)以有效调节对所述靶细胞免疫应答的方案向所述个体给予所述小分子。
93.根据权利要求92所述的方法，其中与包括将包含所述CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对所述靶细胞的免疫应答，同时对所述个体的副作用更少。
94.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：
(A)向所述个体给予根据权利要求49-54中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；
和
(B)以有效治疗所述疾病的方案向所述个体给予所述小分子。
95.根据权利要求94所述的方法，其中与包括将包含所述CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对所述个体的副作用更少。
96.一种核酸，其编码根据权利要求49-54中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
97.一种调节个体中由T细胞介导的免疫应答的方法，其包括：
(A)在所述T细胞中表达根据权利要求55-59中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和
(B)以有效调节由所述T细胞介导的免疫应答的方案向所述个体给予所述小分子。
98.根据权利要求97所述的方法，其中与包括在所述T细胞中表达包含所述CID的对应信号传导结构域的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地维持由所述T细胞介导的免疫应答，同时对所述个体的副作用更少。
99.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：
(A)在所述个体中在能够识别并杀死所述靶细胞的T细胞中表达根据权利要求55-59中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和
(B)以有效治疗所述疾病的方案向所述个体给予所述小分子。
100.根据权利要求99所述的方法，其中与包括在所述T细胞中表达包含所述CID的对应信号传导结构域的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对所述个体的副作用更少。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述T细胞是CAR T细胞。
102.一种核酸，其编码根据权利要求55-59中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
103.一种T细胞，其包含根据权利要求55-59中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
104.根据权利要求103所述的T细胞，其中所述T细胞是CAR T细胞。
作为调节细胞疗法的分子开关的抗体化学诱导二聚体
(AbCID)
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
[0003] 本公开文本涉及用于调节细胞疗法的组合物和方法。具体地，所述组合物包括用于产生生理功能性合成抗体化学诱导二聚体(antibody chemically induced dimerizer，
AbCID)复合物的一般结构，所述复合物用作分子开关。还提供了使用此类组合物的方法，如用于治疗各种疾病和病症。
AbCID)复合物的一般结构，所述复合物用作分子开关。还提供了使用此类组合物的方法，如用于治疗各种疾病和病症。
[0005] 本发明是根据由美国国立卫生研究院授予的批准号R01 CA191018和R01 GM097316，在政府支持下完成的。政府享有本发明的一定权利。
背景技术
[0006] 化学诱导二聚体(CID)是蛋白质-蛋白质相互作用中剂量和时间控制的有力工具(Spencer等人,Science,262:1019-1024(1993)；Clackson,T.,Chemical Biology,第227-
249页(2008)；Fegan等人,Chem.Rev.,110:33153336(2010)；Putyrski等人,FEBS Lett.,
586:2097-2105(2012))。CID已经被应用于人工细胞回路的开发(Lienert等人,
Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,15:95107(2014))、激活分裂酶(split-enzyme)活性(Shekhawat
等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,15:789-797(2011)；Nguyen等人,Nat.Commun.,7:12009
(2016)；Zetsche等人,Nat.Biotechnol.,33:139-142(2015)；Pelletier等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:12141-12146(1998))，并且最近在临床上被用作下一代T细
胞疗法的安全开关(Straathof等人,Blood,105:4247-4254(2005)；Di Stasi等人,
N.Engl.J.Med.,365:1673-1683(2011))。已经开发了许多同型和异型CID，但绝大多数局限于已知能结合小分子诱导剂的天然蛋白质片段，如原型雷帕霉素-FKBP12-FRB系统
(Spencer等人,Science,262:1019-1024(1993)；Ho等人,Nature,382:822-826(1996)；
Belshaw等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:4604-4607(1996)；Rivera等人,Nat.Med.,2:
1028-1032(1996)；Farrar等人,Nature,383:178-181(1996)；Miyamoto等人,
Nat.Chem.Biol.,8:465-470(2012)；Erhart等人,Chem.Biol.,20:549-557(2013)；Kopytek等人,Chem.Biol.,7:313-321(2000)；Liang等人,Sci.Signal.,4,rs2(2011)；Czlapinski
等人,J.Am.Chem.Soc.,130:13186-13187(2008))。目前，还不存在设计或鉴定这些工具的
通用方法。然而，CID在细胞和动物生物事件多重控制中的广泛应用和兴趣，需要发明更多的小分子诱导系统。此外，CID在人类疗法中具有希望，但没有用于产生基于人类来源部分的CID的系统性手段来降低或消除免疫原性的风险。
249页(2008)；Fegan等人,Chem.Rev.,110:33153336(2010)；Putyrski等人,FEBS Lett.,
586:2097-2105(2012))。CID已经被应用于人工细胞回路的开发(Lienert等人,
Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,15:95107(2014))、激活分裂酶(split-enzyme)活性(Shekhawat
等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,15:789-797(2011)；Nguyen等人,Nat.Commun.,7:12009
(2016)；Zetsche等人,Nat.Biotechnol.,33:139-142(2015)；Pelletier等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:12141-12146(1998))，并且最近在临床上被用作下一代T细
胞疗法的安全开关(Straathof等人,Blood,105:4247-4254(2005)；Di Stasi等人,
N.Engl.J.Med.,365:1673-1683(2011))。已经开发了许多同型和异型CID，但绝大多数局限于已知能结合小分子诱导剂的天然蛋白质片段，如原型雷帕霉素-FKBP12-FRB系统
(Spencer等人,Science,262:1019-1024(1993)；Ho等人,Nature,382:822-826(1996)；
Belshaw等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:4604-4607(1996)；Rivera等人,Nat.Med.,2:
1028-1032(1996)；Farrar等人,Nature,383:178-181(1996)；Miyamoto等人,
Nat.Chem.Biol.,8:465-470(2012)；Erhart等人,Chem.Biol.,20:549-557(2013)；Kopytek等人,Chem.Biol.,7:313-321(2000)；Liang等人,Sci.Signal.,4,rs2(2011)；Czlapinski
等人,J.Am.Chem.Soc.,130:13186-13187(2008))。目前，还不存在设计或鉴定这些工具的
通用方法。然而，CID在细胞和动物生物事件多重控制中的广泛应用和兴趣，需要发明更多的小分子诱导系统。此外，CID在人类疗法中具有希望，但没有用于产生基于人类来源部分的CID的系统性手段来降低或消除免疫原性的风险。
[0007] 先前的工作人员已经证明，有可能使用噬菌体展示来产生抗体，所述抗体可以特异性地结合通过小分子结合而“捕获”的蛋白质构象(Gao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
106:3071-3076(2009)；Rizk等人,Nat.Struct.Mol.Biol.,18:437-442(2011)；Staus等人,Nature,535:448-452(2016)；Thomsen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,110:8477-8482
(2013))。在这些情况下，类似于CID，抗体对小分子结合形式的蛋白质显示出增加的亲和
力。然而，抗体通常能够结合处于捕获构象的蛋白质，而不依赖于小分子。因此，结合形式的构象选择性抗体相对于载脂蛋白形式的选择性是有限的，从而降低了它们作为选择性CID
的效用。因此，本领域存在改善CID的需求。此外，将CID技术用于人类疗法以调节工程化蛋白质或细胞高度依赖于使用人类来源的蛋白质支架来降低免疫原性。迄今为止，唯一含有
完全人类部分的CID系统是FKBP-FRB CID，并且用于激活它的小分子本身是有毒的或缺乏
类药性。因此，需要用人类来源的蛋白质或抗体来扩大CID的开发。
106:3071-3076(2009)；Rizk等人,Nat.Struct.Mol.Biol.,18:437-442(2011)；Staus等人,Nature,535:448-452(2016)；Thomsen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,110:8477-8482
(2013))。在这些情况下，类似于CID，抗体对小分子结合形式的蛋白质显示出增加的亲和
力。然而，抗体通常能够结合处于捕获构象的蛋白质，而不依赖于小分子。因此，结合形式的构象选择性抗体相对于载脂蛋白形式的选择性是有限的，从而降低了它们作为选择性CID
的效用。因此，本领域存在改善CID的需求。此外，将CID技术用于人类疗法以调节工程化蛋白质或细胞高度依赖于使用人类来源的蛋白质支架来降低免疫原性。迄今为止，唯一含有
完全人类部分的CID系统是FKBP-FRB CID，并且用于激活它的小分子本身是有毒的或缺乏
类药性。因此，需要用人类来源的蛋白质或抗体来扩大CID的开发。
发明内容
[0008] 本文所述的几个方面涉及包括抗体化学诱导二聚体(AbCID)的组合物和方法。
[0009] 在一个方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核酸，所述第一化学诱导二聚体(CID)组分包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)
连接到第一结合部分的第一衔接子(adapter)部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分
的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物
特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二
结合部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点。在一些实施方案中，所述系统进一步包含小分子，其中第二CID组分在包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点处结合至小分子与第一CID组分之间的
复合物。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物
的位点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包含小分
子的至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
连接到第一结合部分的第一衔接子(adapter)部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分
的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物
特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二
结合部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点。在一些实施方案中，所述系统进一步包含小分子，其中第二CID组分在包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点处结合至小分子与第一CID组分之间的
复合物。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物
的位点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包含小分
子的至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
[0010] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第一结合部分是与小分子特异性地结合的第一抗体部分。在一些实施方案中，所述小分子是甲氨蝶呤。
[0011] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第一结合部分源自小分子的天然存在的结合配偶体，或其小分子结合变体。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是
Bcl-2、Bcl-xL、FK506结合蛋白(FKBP)或细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-2，并且小分子是ABT-199、ABT-263或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-xL，并且小分子是ABT-737或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是FKBP，并且小分子是具有式(I)的结构的雷帕霉素(SLF)
的合成配体或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是cIAP1，并且小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427、比利那潘(Birinapant)或其类似物。
Bcl-2、Bcl-xL、FK506结合蛋白(FKBP)或细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-2，并且小分子是ABT-199、ABT-263或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-xL，并且小分子是ABT-737或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是FKBP，并且小分子是具有式(I)的结构的雷帕霉素(SLF)
的合成配体或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是cIAP1，并且小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427、比利那潘(Birinapant)或其类似物。
[0012] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第二结合部分是特异性地结合化学表位的抗体部分，所述化学表位包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分。
[0013] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第二CID组分结合至第一CID组分和小分子的复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离第一CID组分和游离小分
子中的每一个的Kd的约1/500。
子中的每一个的Kd的约1/500。
[0014] 在另一方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含Bcl-xL的ABT-737结合结构域；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-737
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表1的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列。
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表1的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列。
[0015] 在另一方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含Bcl-2的ABT-199结合结构域；和(b)第二
CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-199
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表2的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列。
CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-199
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表2的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列。
[0016] 在另一方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含Bcl-2的ABT-263结合结构域；和(b)第二
CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-263
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表3的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列。
CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-263
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表3的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列。
[0017] 在另一方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含FKBP的雷帕霉素(SLF)结合结构域的合成
配体，其中SLF具有式(I)的结构；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和SLF与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表4的重链互补决定区和轻链互补决定区
(CDR)。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列。
配体，其中SLF具有式(I)的结构；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和SLF与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表4的重链互补决定区和轻链互补决定区
(CDR)。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列。
[0018] 在另一方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含cIAP1的GDC-0152结合结构域；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和GDC-
0152与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分
包含根据表5的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，GDC-0152结
合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
0152与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分
包含根据表5的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，GDC-0152结
合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0019] 在另一方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含cIAP1的LCL161结合结构域；和(b)第二
CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和LCL161
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表6的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，LCL161结合结构
域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和LCL161
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
根据表6的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，LCL161结合结构
域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0020] 在另一个实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含cIAP1的AT406结合结构域；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和AT406与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部
分包含根据表7的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
分包含根据表7的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0021] 在另一个实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含cIAP1的CUDC-427结合结构域；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和CUDC-427与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体
部分包含根据表8的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，CUDC-
427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
部分包含根据表8的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，CUDC-
427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0022] 在另一方面，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含甲氨蝶呤结合型Fab，其中甲氨蝶呤结合
型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、
319、320、321、322和323的氨基酸序列；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和甲氨蝶呤与第一CID组分之间的复合物特异性地
结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表9的重链互补决定区和轻链互补
决定区(CDR)。
型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、
319、320、321、322和323的氨基酸序列；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和甲氨蝶呤与第一CID组分之间的复合物特异性地
结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表9的重链互补决定区和轻链互补
决定区(CDR)。
[0023] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，(a)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二衔接子部分包含转录调节结构域；或者(b)第二衔接子部分包含DNA结合
结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分被配
置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录。在一些实施
方案中，(a)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(b)转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能够下调靶基因的转录。在一些实施方案
中，DNA结合结构域源自天然存在的转录调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自催化性
死亡的Cas9(dCas9)。
结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分被配
置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录。在一些实施
方案中，(a)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(b)转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能够下调靶基因的转录。在一些实施方案
中，DNA结合结构域源自天然存在的转录调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自催化性
死亡的Cas9(dCas9)。
[0024] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与靶细胞相关联的CID时，CID能够诱导靶细胞死
亡。在一些实施方案中，第一衔接子部分和第二衔接子部分一起能够诱导靶细胞凋亡。在一些实施方案中，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，第一衔接子部分和第二衔接子部分源自半胱天冬酶-9。在一些实施方案中，靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。在一些实施方案中，靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T
细胞。
亡。在一些实施方案中，第一衔接子部分和第二衔接子部分一起能够诱导靶细胞凋亡。在一些实施方案中，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，第一衔接子部分和第二衔接子部分源自半胱天冬酶-9。在一些实施方案中，靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。在一些实施方案中，靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T
细胞。
[0025] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与T细胞相关联的CID时，CID是能够在结合靶抗
原后激活T细胞的异二聚体CAR。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构
域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；或者(b)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结
构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部
分的CID组分进一步包含分泌信号肽。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞外抗原结合部
分；并且第二衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；或者(b)第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和
(iii)细胞外抗原结合部分；并且第一衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号
传导结构域；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；并且第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；
其中第一或第二CID组分进一步包含与其结合部分相连的细胞外抗原结合部分；并且其中
细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
原后激活T细胞的异二聚体CAR。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构
域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；或者(b)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结
构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部
分的CID组分进一步包含分泌信号肽。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞外抗原结合部
分；并且第二衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；或者(b)第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和
(iii)细胞外抗原结合部分；并且第一衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号
传导结构域；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；并且第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；
其中第一或第二CID组分进一步包含与其结合部分相连的细胞外抗原结合部分；并且其中
细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
[0026] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID是能够将T细胞重引导至靶细胞的异
二聚体双特异性T细胞接合器(T cell engager)。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分
包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者(b)第二衔
接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一
些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。
二聚体双特异性T细胞接合器(T cell engager)。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分
包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者(b)第二衔
接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一
些实施方案中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。
[0027] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与免疫细胞相关联的CID时，CID是能够调节免疫
细胞激活的异二聚体信号传导分子。在一些实施方案中，第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域。在一些实施方案中，第一衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域和/或第二衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。
细胞激活的异二聚体信号传导分子。在一些实施方案中，第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域。在一些实施方案中，第一衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域和/或第二衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。
[0028] 在另一方面，本文提供了一种从结合分子文库中选择结合部分的方法，其中结合部分特异性地结合小分子与同源结合部分之间的复合物，所述方法包括：(a)对结合部分输入组筛选出在小分子不存在时不与同源结合部分结合的结合部分，从而产生反选择的结合
部分组；和(b)对结合部分输入组筛选出和小分子与同源结合部分的复合物结合的结合部
分，从而产生阳性选择的结合部分组；和(c)进行一轮或多轮筛选，其中每轮筛选包括步骤(a)的筛选和步骤(b)的筛选，使得产生和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结
合的结合部分组。在一些实施方案中，所述方法包括两轮或更多轮筛选，并且其中(1)对于第一轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是结合分子文库，(2)对于每轮筛选，步骤(b)的所述结合部分输入组是来自给定轮筛选的步骤(a)的所述反选择的结合部分组，(3)对于
第一轮筛选后的每轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是来自前一轮筛选的步骤(b)的
所述阳性选择的结合部分组，以及(4)对于最后一轮筛选，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组是步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组。在一些实施
方案中，所述方法包括至少2轮选择。
部分组；和(b)对结合部分输入组筛选出和小分子与同源结合部分的复合物结合的结合部
分，从而产生阳性选择的结合部分组；和(c)进行一轮或多轮筛选，其中每轮筛选包括步骤(a)的筛选和步骤(b)的筛选，使得产生和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结
合的结合部分组。在一些实施方案中，所述方法包括两轮或更多轮筛选，并且其中(1)对于第一轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是结合分子文库，(2)对于每轮筛选，步骤(b)的所述结合部分输入组是来自给定轮筛选的步骤(a)的所述反选择的结合部分组，(3)对于
第一轮筛选后的每轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是来自前一轮筛选的步骤(b)的
所述阳性选择的结合部分组，以及(4)对于最后一轮筛选，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组是步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组。在一些实施
方案中，所述方法包括至少2轮选择。
[0029] 在一些实施方案中，根据上述选择结合部分的方法中的任一种，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的至少一个结合部分结合至复合物，
其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的
约1/500。在一些实施方案中，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的每个结合部分结合至复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分
子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/500。
其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的
约1/500。在一些实施方案中，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的每个结合部分结合至复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分
子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/500。
[0030] 在一些实施方案中，根据上述选择结合部分的方法中的任一种，结合分子文库是抗体文库、DARPin文库、纳米抗体文库或适体文库。在一些实施方案中，结合分子文库是抗体文库。在一些实施方案中，抗体文库是噬菌体展示的Fab文库。
[0031] 在另一方面，本文提供了一种构建体，其包含和小分子与结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，所述构建体通过包括以下步骤的方法制备：(A)根据上述选择结合部分的方法中的任一种从抗体文库中选择抗体部分；和(B)提供包含(A)的抗体部分中的
一种的构建体。
一种的构建体。
[0032] 在一些实施方案中，根据上述系统中的任一种，第二结合部分是通过包括以下步骤的方法选择的抗体部分：(A)根据上述选择结合部分的方法中的任一种从抗体文库中选
择抗体部分；和(B)选择第二结合部分作为(A)的抗体部分中的一种。
择抗体部分；和(B)选择第二结合部分作为(A)的抗体部分中的一种。
[0033] 在另一方面，本文提供了一种调节细胞中靶基因表达的方法，其包括表达上述任一系统(所述系统包含能够调节细胞中靶基因转录的CID组分)中的第一和第二CID组分，并
修改细胞中小分子的量以调节靶基因表达。
修改细胞中小分子的量以调节靶基因表达。
[0034] 在另一方面，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括：(A)表达上述任一系统中的第一和第二CID组分，所述系统包含能够调节个体靶细胞中靶基因转录的CID组
分，其中靶基因在靶细胞中的表达水平与疾病相关联；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
分，其中靶基因在靶细胞中的表达水平与疾病相关联；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0035] 在另一方面，本文提供了一种编码上述任一系统中的第一和第二CID组分的核酸，所述系统包含能够调节靶基因转录的CID组分。
[0036] 在另一方面，本文提供了一种包含上述任一系统中的第一和第二CID组分的细胞，所述系统包含能够调节靶基因转录的CID组分。
[0037] 在另一方面，本文提供了一种控制个体中靶细胞存活的方法，其包括：(A)表达上述任一系统中的第一和第二CID组分，所述系统包含能够诱导靶细胞中靶细胞死亡的CID组
分；和(B)以有效(I)杀死预定量的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予
小分子。在一些实施方案中，靶细胞是个体中过继细胞疗法的一部分。在一些实施方案中，靶细胞是CAR T细胞。
分；和(B)以有效(I)杀死预定量的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予
小分子。在一些实施方案中，靶细胞是个体中过继细胞疗法的一部分。在一些实施方案中，靶细胞是CAR T细胞。
[0038] 在另一方面，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予针对疾病的过继细胞疗法，所述疗法包括修饰的细胞，其中所述修饰的细胞表达上述任一系
统中的第一和第二CID组分，所述系统包含能够诱导靶细胞死亡的CID组分；和(B)以有效
(I)杀死预定量的过继转移细胞；或(II)保持预定量的过继转移细胞的方案向个体给予小
分子。在一些实施方案中，过继细胞疗法是CAR T细胞疗法。
统中的第一和第二CID组分，所述系统包含能够诱导靶细胞死亡的CID组分；和(B)以有效
(I)杀死预定量的过继转移细胞；或(II)保持预定量的过继转移细胞的方案向个体给予小
分子。在一些实施方案中，过继细胞疗法是CAR T细胞疗法。
[0039] 在另一方面，本文提供了一种编码上述任一系统中的第一和第二CID组分的核酸，所述系统包含能够诱导靶细胞死亡的CID组分。
[0040] 在另一方面，本文提供了一种包含上述任一系统中的第一和第二CID组分的细胞，所述系统包含能够诱导靶细胞死亡的CID组分。在一些实施方案中，所述细胞是过继细胞疗法的一部分。在一些实施方案中，所述细胞是CAR T细胞。
[0041] 在另一方面，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予表达上述任一系统中的第一和第二CID组分的经修饰的T细胞，所述系统包含形
成异二聚体CAR的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
成异二聚体CAR的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
[0042] 在另一方面，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予表达上述任一系统中的CID组分的经修饰的T细胞，所述系统包含形成含有细胞
质信号传导结构域的异二聚体CAR的CID组分；(B)向个体给予CID的包含细胞外抗原结合部
分的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效调节对靶细胞免疫应答的方
案向个体给予小分子。
质信号传导结构域的异二聚体CAR的CID组分；(B)向个体给予CID的包含细胞外抗原结合部
分的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效调节对靶细胞免疫应答的方
案向个体给予小分子。
[0043] 在一些实施方案中，根据上述的调节对靶细胞的免疫应答的方法中的任一种，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述
方案有效地维持对靶细胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
方案有效地维持对靶细胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
[0044] 在另一方面，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予表达上述任一系统中的第一和第二CID组分的经修饰的T细胞，所述系统包
含形成异二聚体CAR的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
含形成异二聚体CAR的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0045] 在另一方面，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予表达上述任一系统中的CID组分的经修饰的T细胞，所述系统包含形成含有
细胞质信号传导结构域的异二聚体CAR的CID组分；(B)向个体给予CID的包含细胞外抗原结
合部分的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效治疗疾病的方案向个体
给予小分子。
细胞质信号传导结构域的异二聚体CAR的CID组分；(B)向个体给予CID的包含细胞外抗原结
合部分的CID组分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效治疗疾病的方案向个体
给予小分子。
[0046] 在一些实施方案中，根据上述治疗以靶细胞为特征的疾病的方法中的任一种，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述
方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0047] 在另一方面，本文提供了一种编码上述任一系统中的第一和第二CID组分的核酸，所述系统包含形成异二聚体CAR的CID组分。
[0048] 在另一方面，本文提供了一种包含上述任一系统中的第一和第二CID组分的T细胞，所述系统包含形成异二聚体CAR的CID组分。
[0049] 在另一方面，本文提供了一种包含上述任一系统中的CID组分的T细胞，所述系统包含形成含有细胞质信号传导结构域的异二聚体CAR的CID组分。
[0050] 在另一方面，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予上述任一系统中的第一和第二CID组分，所述系统包含形成异二聚体双特异性T
细胞接合器的CID组分；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。在
一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T
细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫应答，同时对个体
的副作用更少。
细胞接合器的CID组分；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。在
一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T
细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫应答，同时对个体
的副作用更少。
[0051] 在另一方面，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予上述任一系统中的第一和第二CID组分，所述系统包含形成异二聚体双特异
性T细胞接合器的CID组分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T细胞接合器
给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
性T细胞接合器的CID组分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T细胞接合器
给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0052] 在另一方面，本文提供了一种编码上述任一系统中的第一和第二CID组分的核酸，所述系统包含形成异二聚体双特异性T细胞接合器的CID组分。
[0053] 在另一方面，本文提供了一种调节个体中由T细胞介导的免疫应答的方法，其包括：(A)表达上述任一系统中的第一和第二CID组分，所述系统包含在T细胞中形成异二聚体信号传导分子的CID组分；和(B)以有效调节由T细胞介导的免疫应答的方案向个体给予小
分子。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域的单体信
号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地维持由T细胞介导的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
分子。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域的单体信
号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地维持由T细胞介导的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
[0054] 在另一方面，这里提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)表达上述任一系统中的第一和第二CID组分，所述系统包含在个体的T细胞中形成能够
识别和杀死靶细胞的异二聚体信号传导分子的CID组分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个
体给予小分子。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域
的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作
用更少。
识别和杀死靶细胞的异二聚体信号传导分子的CID组分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个
体给予小分子。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域
的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作
用更少。
[0055] 在一些实施方案中，根据采用形成上述异二聚体信号传导分子的CID的方法中的任一种，所述T细胞是CAR T细胞。
[0056] 在另一方面，本文提供了一种编码上述任一系统中的第一和第二CID组分的核酸，所述系统包含形成异二聚体信号传导分子的CID组分。
[0058] 图1A示出了示例性基于抗体的化学诱导二聚体(AbCID)的设计、生产和表征的图形概述。
[0059] 图1B示出了用于选择BCL-xL的ABT-737诱导型Fab结合物的噬菌体选择策略图。
[0060] 图1C示出了生物层干涉测量法，其示出了在ABT-737的存在下Fab AZ2与BCL-xL的有效和可逆结合(左)，但在ABT-737不存在时没有显著结合(右)。蓝色曲线代表测量的数据点，并且红色虚线代表用于分析的全局拟合线。
[0061] 图2A-2C示出了Fab AZ1、AZ2和AZ3的化学表位选择性的证明。
[0062] 图2A示出了结合配体：ABT-737、ABT-263和Bak肽的化学结构和氨基酸序列。
[0064] 图2C示出了生物层干涉测量法，其示出了在ABT-737的存在下Fab AZ1-AZ3与BCL-xL有效结合，同时在ABT-263的存在下效力大大降低，并且在Bak肽的存在下效力微弱或不
可检测。数据表明，Fab可以容易地区分小分子中细微的结构差异，并支持Fab AZ1、AZ2和AZ3是化学表位选择性的。同种型对照是针对CD55选择的Fab，具有与AZ1、AZ2和AZ3相同的支架，但CDR序列不同。
可检测。数据表明，Fab可以容易地区分小分子中细微的结构差异，并支持Fab AZ1、AZ2和AZ3是化学表位选择性的。同种型对照是针对CD55选择的Fab，具有与AZ1、AZ2和AZ3相同的支架，但CDR序列不同。
[0065] 图3A-3C示出了AZ1的单链Fab形式，用作细胞内AbCID以调节CRISPRa介导的基因激活。
[0066] 图3A示出了AbCID调节的基因激活系统的示意图。VPR转录激活结构域对dCas9的诱导性募集导致萤光素酶报告物的表达。
[0067] 图3B示出了与向常规CID中添加雷帕霉素(100nM)相比，在向AbCID门控系统中添加ABT-737(20nM)后48小时萤光素酶活性的定量。将值针对阳性对照进行归一化，所述阳性对照是遗传上与VPR融合的dCas9，并且用阴性对照进行背景消减，所述阴性对照是具有阴
性sgRNA的dCas9-VPR。每个数据点表示4个独立实验的平均值±s.d.。
性sgRNA的dCas9-VPR。每个数据点表示4个独立实验的平均值±s.d.。
[0068] 图3C示出了通过将ABT-737添加至AbCID门控系统中诱导48小时后的剂量反应。每个数据点表示3个独立实验的平均值±s.d.。
[0069] 图4示出了细胞外AbCID，用于调节CAR T细胞激活。
[0070] 图4A示出了一种方案，其中通常用作CAR构建体外部的scFv被诱导型二聚体的单体1替代。二聚体的单体2现在融合到scFv以产生一种双功能蛋白质，它能识别癌细胞，并在配体的存在下二聚化。当添加配体时，CAR T细胞就被募集到癌细胞并激活。
[0071] 图4B示出了一种方案，其中通常在CAR构建体内部部分上发现的刺激和共刺激结构域被分裂并融合到诱导型二聚体的单体1或单体2。当添加配体时，CAR构建体的内部部分聚集在一起，并且CAR T细胞被激活。
[0072] 图4C示出了一种方案，其中通常在CAR构建体内部部分上发现的刺激和共刺激结构域被分裂并通过跨膜结构域融合到诱导型二聚体的单体1或单体2，使得二聚化结构域保
持在细胞外。当添加配体时，CAR构建体的内部部分聚集在一起，并且CAR T细胞被激活。
持在细胞外。当添加配体时，CAR构建体的内部部分聚集在一起，并且CAR T细胞被激活。
[0073] 图4D示出了一种方案，其中识别T细胞受体复合物的CD3部分的抗体与诱导型二聚体的单体1融合，并且然后抗原识别抗体与单体2融合。当添加配体时，CAR T细胞就被募集到癌细胞并激活。本质上，所述系统充当诱导型双特异性T细胞接合抗体。
[0074] 图4E示出了一种方案，其中分裂人转录因子的转录激活结构域与诱导型二聚体的单体1融合，并且然后分裂人转录因子的DNA结合结构域与单体2融合。当添加配体时，转录激活结构域被募集到DNA结合结构域的位点，并且目的基因的转录被激活。本质上，所述系统充当诱导型基因表达回路。这可以用于在CAR T细胞中诱导表达CAR，或可替代地用于诱
导生物治疗剂的表达和生产。
导生物治疗剂的表达和生产。
[0075] 图4F示出了AbCID调节的CAR T细胞激活的示意图，其中CAR含有细胞外BCL-xL结+
构域来代替典型的scFv。AZ1-αCD19双特异性抗体和不同浓度的ABT-737的添加导致CD19
癌细胞的募集和CAR T细胞的可调激活。
构域来代替典型的scFv。AZ1-αCD19双特异性抗体和不同浓度的ABT-737的添加导致CD19
癌细胞的募集和CAR T细胞的可调激活。
[0076] 图4G示出了用于生产CAR的基因构建体的线性图和用于本研究的对应抗体的示意图。
[0077] 图4H示出了在开始与CD19+或CD19-K562靶细胞共培养并添加抗体(5nM)和不同浓度的小分子后20小时，NFAT依赖性GFP报告物表达的量化。在CD19+K562细胞和双特异性抗
体的存在下添加ABT-737导致NFAT途径的剂量依赖性激活，但在ABT-737不存在时或与
CD19-K562细胞共培养时没有观察到激活。缺乏抗体的CD19结合scFv部分的缺陷型AbCID
CAR，并非在所有条件下都被激活。每个数据点表示3个独立实验的平均值±s.d.。
体的存在下添加ABT-737导致NFAT途径的剂量依赖性激活，但在ABT-737不存在时或与
CD19-K562细胞共培养时没有观察到激活。缺乏抗体的CD19结合scFv部分的缺陷型AbCID
CAR，并非在所有条件下都被激活。每个数据点表示3个独立实验的平均值±s.d.。
[0078] 图5示出了AbCID激活所必需的ABT-737浓度范围低于细胞杀伤所必需的浓度范围。在ABT-737处理24小时后，使用CellTiter-Glo测定来测量相对于单独DMSO处理(右轴)
的Jurkat和K562细胞的活力。数据与来自图4H(左轴)的CAR T细胞激活数据并置。测得的
AbCID激活浓度范围较低，并且不包括毒性浓度范围。每个数据点表示3个独立实验的平均
值±s.d.。
的Jurkat和K562细胞的活力。数据与来自图4H(左轴)的CAR T细胞激活数据并置。测得的
AbCID激活浓度范围较低，并且不包括毒性浓度范围。每个数据点表示3个独立实验的平均
值±s.d.。
[0079] 图6示出了来自蛋白质数据库的866个小分子-蛋白质复合晶体结构中小分子的溶剂可及性分析。我们假设当ABT-737与BCL-xL复合时，ABT-737的大量溶剂暴露表面积
将为抗体的直接识别提供化学表位。FKBP12/雷帕霉素复合物 是天然
存在的CID的一部分，在这一分析中是一个明显的异常值，这支持了我们的假设。
将为抗体的直接识别提供化学表位。FKBP12/雷帕霉素复合物 是天然
存在的CID的一部分，在这一分析中是一个明显的异常值，这支持了我们的假设。
[0080] 图7示出了来自针对与ABT-737结合的BCL-xL的第2轮至第4轮Fab噬菌体选择的噬菌体文库的代表性滴度。与DMSO相比，在1μM ABT-737的存在下针对BCL-xL结合观察到的噬菌体富集大于10倍，如通过量化回收的菌落形成单位所确定。
[0081] 图8示出了源自ABT-737结合的BCL-xL选择的经纯化的序列独特性Fab的ELISA。在ABT-737的存在下，所有Fab都显示出增强的结合力。在测试的十个Fab中，有四个(AZ 1-4)在ABT-737的存在下表现出与BCL-xL的高效力和剂量依赖性结合，而在ABT-737不存在时几
乎没有明显的结合。每个数据点表示单个测量值。
乎没有明显的结合。每个数据点表示单个测量值。
[0082] 图9A-9C示出了Fab AZ1、AZ3和AZ4的生物层干涉测量法。实曲线代表测量的数据点，并且虚线代表用于分析的全局拟合线。
[0083] 图9A示出了Fab AZ1，其示出了在ABT-737的存在下与BCL-xL的有效和可逆结合(左)，并在ABT-737不存在时没有显著结合(右)。
[0084] 图9B示出了Fab AZ3，其示出了在ABT-737的存在下与BCL-xL的有效结合(左)，和在ABT-737不存在时可忽略的结合(右)。
[0085] 图9C示出了在ABT-737的存在下，与Fab AZ1和AZ3相比，Fab AZ4与BCL-xL的结合不太有效(左)，并且还示出了ABT-737结合形式相对于仅DMSO的选择性更低(右)。AZ4的动
力学数据无法准确拟合，并且因此没有报告全局拟合数据。
力学数据无法准确拟合，并且因此没有报告全局拟合数据。
[0086] 图10示出了HEK293细胞裂解物的抗Avi标签免疫印迹，所述细胞裂解物来自用C-末端带AVi标签的scAZ1转染的细胞。
[0087] 图11示出了在将ABT-737(20nM)添加至scAZ1 AbCID基因回路中或将雷帕霉素(100nM)添加至常规FKBP-FRB CID基因回路中后48小时萤光素酶活性的定量。此原始数据
用于图3B的归一化和产生。每个数据点表示4个独立实验的平均值±s.d.。
用于图3B的归一化和产生。每个数据点表示4个独立实验的平均值±s.d.。
[0088] 图12A和12B示出了剂量依赖性AbCID激活后，对CAR T细胞激活(通过经典标记物CD69)和IL-2分泌的独立确认。
[0089] 图12A示出了在开始与CD19+或CD19-K562靶细胞共培养并添加抗体(5nM)和不同浓度的小分子后20小时，如通过免疫荧光流式细胞术测量的对CD69表达的量化。在CD19+K562细胞和双特异性抗体的存在下添加ABT-737导致CD69的剂量依赖性表达，但在ABT-737不存
在时或与CD19-K562细胞共培养时没有观察到表达。缺乏抗体的CD19结合scFv部分的缺陷
型AbCID CAR，在所有条件下都未显示CD69的表达。每个数据点表示3个独立实验的平均值
±s.d.。
在时或与CD19-K562细胞共培养时没有观察到表达。缺乏抗体的CD19结合scFv部分的缺陷
型AbCID CAR，在所有条件下都未显示CD69的表达。每个数据点表示3个独立实验的平均值
±s.d.。
[0090] 图12B示出了在开始与CD19+或CD19-K562靶细胞共培养并添加抗体(5nM)和不同浓度的小分子后20小时，如通过ELISA测量的对IL-2分泌的量化。在CD19+K562细胞和双特异
性抗体的存在下添加ABT-737导致IL-2的剂量依赖性分泌，但在ABT-737不存在时或与
CD19-K562细胞共培养时没有观察到分泌。缺乏抗体的CD19结合scFv部分的缺陷型AbCID
CAR，在所有条件下都未显示IL-2的分泌。每个数据点表示3个独立实验的平均值±s.d.。
性抗体的存在下添加ABT-737导致IL-2的剂量依赖性分泌，但在ABT-737不存在时或与
CD19-K562细胞共培养时没有观察到分泌。缺乏抗体的CD19结合scFv部分的缺陷型AbCID
CAR，在所有条件下都未显示IL-2的分泌。每个数据点表示3个独立实验的平均值±s.d.。
[0091] 图13示出了AbCID激活所必需的ABT-737浓度范围低于细胞杀伤所必需的浓度范围。在ABT-737处理24小时后，使用CellTiter-Glo测定来测量相对于单独DMSO处理(右轴)
的HEK293T细胞的活力。数据与来自图3C(左轴)的萤光素酶活性数据并置。测得的AbCID激
活浓度范围较低，并且不包括毒性浓度范围。每个数据点表示3个独立实验的平均值±
s.d.。
的HEK293T细胞的活力。数据与来自图3C(左轴)的萤光素酶活性数据并置。测得的AbCID激
活浓度范围较低，并且不包括毒性浓度范围。每个数据点表示3个独立实验的平均值±
s.d.。
[0093] 图15示出了针对BCL-2/ABT-199选择的Fab噬菌体的竞争ELISA。对顶部命中物(浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。
[0094] 图16示出了针对甲氨蝶呤结合型Fab/甲氨蝶呤选择的Fab噬菌体的竞争ELISA。对顶部命中物(浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。
[0095] 图17示出了针对FKBP/SLF选择的Fab噬菌体的竞争ELISA。对顶部命中物(浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。
[0096] 图18示出了针对cIAP1/GDC-0152、cIAP1/LCL161、cIAP1/AT406和cIAP1/CUDC-427选择的Fab噬菌体的竞争ELISA。对顶部命中物(浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。
[0097] 图19A示出了AbCID调节的诱导型双特异性T细胞接合器的示意图，其中AbCID组分与识别CD3的抗体和特异性地结合肿瘤特异性抗原的抗体相连。给予小分子二聚体允许产
生CID复合物，从而导致将T细胞募集到表达肿瘤特异性抗原的癌细胞。
生CID复合物，从而导致将T细胞募集到表达肿瘤特异性抗原的癌细胞。
[0098] 图19B示出了由双特异性T细胞接合器介导的T细胞激活的流式细胞术分析，所述双特异性T细胞接合器具有与抗CD3抗体缀合的Bcl-2和与抗CD19抗体缀合的抗体AZ21、
AZ34或AZ35。当与CD19+K562细胞共培养时，添加ABT-199导致了对于3种双特异性T细胞接
合器中每一种而言的T细胞激活，如通过NFAT激活和CD69表达所评价。
AZ34或AZ35。当与CD19+K562细胞共培养时，添加ABT-199导致了对于3种双特异性T细胞接
合器中每一种而言的T细胞激活，如通过NFAT激活和CD69表达所评价。
[0099] 图19C示出了对于具有与抗CD3抗体缀合的Bcl-2和与抗CD19抗体缀合的抗体AZ21的双特异性T细胞接合器，T细胞激活对ABT-199的剂量依赖性。通过GFP阳性T细胞的百分比来评价T细胞激活，所述GFP阳性T细胞指示NFAT激活。
具体实施方式
[0100] 蛋白质-蛋白质相互作用的时间控制对生物信号传导非常重要。在各种实施方案中，本发明提供了一种化学诱导的二聚体，所述二聚体通过小分子(SM)化学诱导的二聚体
促进异聚蛋白质a-蛋白质b相互作用。在本文所述的示例性系统中，两部分蛋白质a-蛋白质b二聚体中的蛋白质a包含抗体或抗体片段(Ab)，并且蛋白质b是基于其与小分子(SM)配体有
效结合的能力来选择的。如本领域技术人员所理解的，抗体可以在本发明的组合物和方法
中被特异性地结合SM的任何蛋白质替代。
促进异聚蛋白质a-蛋白质b相互作用。在本文所述的示例性系统中，两部分蛋白质a-蛋白质b二聚体中的蛋白质a包含抗体或抗体片段(Ab)，并且蛋白质b是基于其与小分子(SM)配体有
效结合的能力来选择的。如本领域技术人员所理解的，抗体可以在本发明的组合物和方法
中被特异性地结合SM的任何蛋白质替代。
[0101] Ab是通过任何实际方法产生的，然而，在示例性实施方案中，Ab是从针对蛋白质b的SM结合形式选择并且针对蛋白质b的未结合形式反选择的Ab噬菌体文库中产生的。通过
b
这种方式，可以确保所选Ab更强地结合或仅结合SM-蛋白质复合物。在另一个实施方案中，Ab被广泛表征，并被选择用于利用SM配体作为其结合界面的一部分的那些Ab。
b
这种方式，可以确保所选Ab更强地结合或仅结合SM-蛋白质复合物。在另一个实施方案中，Ab被广泛表征，并被选择用于利用SM配体作为其结合界面的一部分的那些Ab。
[0102] 因此，在示例性实施方案中，本发明进一步提供了一种特异性地结合蛋白质b-SM复合物的抗体。这些抗体的示例性种类是其中特异性结合涵盖SM和蛋白质b二者的至少一
b b
部分的抗体。在另一个示例性实施方案中，SM的部分和蛋白质的部分是参与蛋白质与SM特
异性结合的那些部分。还提供了具有这些特性的蛋白质b-SM-蛋白质a二聚体。
b b
部分的抗体。在另一个示例性实施方案中，SM的部分和蛋白质的部分是参与蛋白质与SM特
异性结合的那些部分。还提供了具有这些特性的蛋白质b-SM-蛋白质a二聚体。
[0103] 示例性Ab通过与BCL-XL和ABT-737二者接触，选择性地结合至蛋白BCL-XL(蛋白质b)的ABT-737(SM)结合形式。
[0104] 在示例性实施方案中，激活目的生物系统所必需的AbCID或其组分之一的量低于这种系统中AbCID的毒性阈值。因此，当本发明的AbCID用作治疗剂时，它们具有可接受的治疗指数。类似地，当AbCID用于诊断或实验系统时，AbCID在使用它们的系统中没有显著的毒性。
[0105] 本发明在本文中通过参考使用已知的小分子-蛋白质复合物和合成抗体文库而快速产生化学诱导二聚体的新颖方法来举例说明。这种方法的例子是从BCL-xL/ABT-737复合
物产生AbCID。这些AbCID可以用于调节活细胞中多种多样的生物过程，包括CRISPRa介导的基因表达和CAR T细胞激活。最后，我们发现用于激活AbCID的ABT-737的浓度范围远低于在细胞中观察到有毒性的浓度。
物产生AbCID。这些AbCID可以用于调节活细胞中多种多样的生物过程，包括CRISPRa介导的基因表达和CAR T细胞激活。最后，我们发现用于激活AbCID的ABT-737的浓度范围远低于在细胞中观察到有毒性的浓度。
[0106] 本发明提供了能够从不同的小分子-蛋白质对快速产生新CID(例如AbCID)的方法，其中大部分小分子是溶剂可及的。本发明各种实施方案的基本策略和由此产生的AbCID代表了一种开发用于细胞生物学、合成生物学和治疗应用的下一代CID工具的新颖和有希
望的方法。
望的方法。
[0107] 定义
[0108] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，否则本文中引用的所有专利、申
请、公开的申请以及其他公开均以通过引用以其整体明确地并入。在本文中的术语存在多
种定义的情况下，除非另有说明，否则以此部分中的那些定义为准。
请、公开的申请以及其他公开均以通过引用以其整体明确地并入。在本文中的术语存在多
种定义的情况下，除非另有说明，否则以此部分中的那些定义为准。
[0109] 如本文所用，“一个(种)”可以意指一个(种)或多于一个(种)。
[0110] 当根据说明书阅读时，“约”具有其简单和普通的含义，并且可以例如在提及可测量值时使用，并可以意指涵盖与特定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且仍更优选±0.1％的变化。
[0111] “抗体化学诱导二聚体”或“AbCID”是指在小有机或有机金属化合物(“SM”)与第二SM结合基序之间形成的复合物，所述小有机或有机金属化合物(“SM”)至少具有由第一蛋白质(蛋白质b)上的互补结合基序识别的第一SM结合基序，并且所述第二SM结合基序识别作为抗体的第二蛋白质(蛋白质a)上的互补结合基序。当第一和第二蛋白质在AbCID中结合在
一起时，所述第一和第二蛋白质通过各自的结合结构域与SM结合而二聚化。在示例性实施
方案中，第一蛋白质、第二蛋白质或两种蛋白质分别通过第一SM结合基序和第二SM结合基
序特异性地结合至SM。SM可以通过不同的结合基序结合相同蛋白质的两个分子(即第一和
第二蛋白质是相同的蛋白质)，或者它可以通过其不同的结合基序结合不同的蛋白质(即第
一和第二蛋白质是不同的蛋白质)。在其中第一蛋白质和/或第二蛋白质是抗体的那些实施
方案中，SM在本文中可替换地称为“抗原”或“表位”，并且与SM结合的抗体序列或区域称为“互补位”。
一起时，所述第一和第二蛋白质通过各自的结合结构域与SM结合而二聚化。在示例性实施
方案中，第一蛋白质、第二蛋白质或两种蛋白质分别通过第一SM结合基序和第二SM结合基
序特异性地结合至SM。SM可以通过不同的结合基序结合相同蛋白质的两个分子(即第一和
第二蛋白质是相同的蛋白质)，或者它可以通过其不同的结合基序结合不同的蛋白质(即第
一和第二蛋白质是不同的蛋白质)。在其中第一蛋白质和/或第二蛋白质是抗体的那些实施
方案中，SM在本文中可替换地称为“抗原”或“表位”，并且与SM结合的抗体序列或区域称为“互补位”。
[0112] 本发明利用大量小分子作为化学诱导二聚体的组分。示例性SM包括ABT-263、ABT-199和ABT-737。参见例如，Spencer,D.M.,Wandless,T.J.,Schreiber,S.L.和Crabtree,
G.R.Controlling signal transduction with synthetic ligands.Science 262,1019-
1024(1993)；Ho,S.N.,Biggar,S.R.,Spencer,D.M.,Schreiber,S.L.和Crabtree,
G.R.Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in
reinitiation.Nature 382,822-826(1996)；Belshaw,P.J.,Ho,S.N.,Crabtree,G.R.和
Schreiber,S.L.Controlling protein association and subcellular localization
with a synthetic ligandc that induces heterodimerization of
proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,4604-4607(1996)；Rivera,V.M.等人A humanized system for pharmacologic control of gene expression.Nat.Med.2,1028-1032
(1996)；Farrar,M.A.,Alberol-Ila,J.和Perlmutter,R.M.Activation of the Raf-1
kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.Nature 383,178-181(1996)；
Miyamoto,T.等人Rapid and orthogonal logic gating with a gibberellin-induced
dimerization system.Nat.Chem.Biol.8,465-470(2012)；Erhart,D.等人Chemical
development of intracellular protein heterodimerizers.Chem.Biol.20,549-557
(2013)；Kopytek,S.J.,Standaert,R.F.,Dyer,J.C.和Hu,J.C.Chemically induced
dimerization of dihydrofolate reductase by a homobifunctional dimer of
methotrexate.Chem.Biol.7,313-321(2000)；Liang,F.S.,Ho,W.Q.和Crabtree,
G.R.Engineering the ABA plant stress pathway for regulation of induced
proximity.Sci.Signal.4,rs2(2011)；以及Czlapinski,J.L.等人Conditional
glycosylation in eukaryotic cells using a biocompatible chemical inducer of
dimerization.J.Am.Chem.Soc.130,13186-13187(2008)。
G.R.Controlling signal transduction with synthetic ligands.Science 262,1019-
1024(1993)；Ho,S.N.,Biggar,S.R.,Spencer,D.M.,Schreiber,S.L.和Crabtree,
G.R.Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in
reinitiation.Nature 382,822-826(1996)；Belshaw,P.J.,Ho,S.N.,Crabtree,G.R.和
Schreiber,S.L.Controlling protein association and subcellular localization
with a synthetic ligandc that induces heterodimerization of
proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,4604-4607(1996)；Rivera,V.M.等人A humanized system for pharmacologic control of gene expression.Nat.Med.2,1028-1032
(1996)；Farrar,M.A.,Alberol-Ila,J.和Perlmutter,R.M.Activation of the Raf-1
kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.Nature 383,178-181(1996)；
Miyamoto,T.等人Rapid and orthogonal logic gating with a gibberellin-induced
dimerization system.Nat.Chem.Biol.8,465-470(2012)；Erhart,D.等人Chemical
development of intracellular protein heterodimerizers.Chem.Biol.20,549-557
(2013)；Kopytek,S.J.,Standaert,R.F.,Dyer,J.C.和Hu,J.C.Chemically induced
dimerization of dihydrofolate reductase by a homobifunctional dimer of
methotrexate.Chem.Biol.7,313-321(2000)；Liang,F.S.,Ho,W.Q.和Crabtree,
G.R.Engineering the ABA plant stress pathway for regulation of induced
proximity.Sci.Signal.4,rs2(2011)；以及Czlapinski,J.L.等人Conditional
glycosylation in eukaryotic cells using a biocompatible chemical inducer of
dimerization.J.Am.Chem.Soc.130,13186-13187(2008)。
[0113] “小分子”是指分子量小于约2kDa的有机化合物，包括有机金属化合物。在示例性实施方案中，小分子不是由以下项组成的组中的成员：天然存在的多核苷酸、多肽、多糖、以及由多个重复单元构成的合成聚合物。示例性小分子包括一个或多个取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的杂环烷基部分，它们通过取代或未取代的烷
基或取代或未取代的杂烷基接头直接连接在一起、融合或连接。AbCID的示例性SM组分是
ABT家族的成员和甲氨蝶呤以及衍生物和类似物。在各种实施方案中，小分子和与疾病状态和/或疾病进展相关联的细胞表面蛋白(例如，细胞表面受体)具有显著结合。示例性疾病是增殖性障碍，例如癌症。示例性靶细胞蛋白结合化合物包括但不限于与EGFR、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和MCL1具有显著结合的化合物。示例性的小分子AbCID组分如图2A所示。其他示例性小分子包括BH3模拟物。Billard,Mol.Cancer Ther.,2013:12(9)；1691-7163。
基或取代或未取代的杂烷基接头直接连接在一起、融合或连接。AbCID的示例性SM组分是
ABT家族的成员和甲氨蝶呤以及衍生物和类似物。在各种实施方案中，小分子和与疾病状态和/或疾病进展相关联的细胞表面蛋白(例如，细胞表面受体)具有显著结合。示例性疾病是增殖性障碍，例如癌症。示例性靶细胞蛋白结合化合物包括但不限于与EGFR、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和MCL1具有显著结合的化合物。示例性的小分子AbCID组分如图2A所示。其他示例性小分子包括BH3模拟物。Billard,Mol.Cancer Ther.,2013:12(9)；1691-7163。
[0114] 如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指可能存在于特定的定义位置处的20种天然存在的氨基酸中的一种或任何非天然类似物。本文中的“蛋白质”意指至少两个共价附接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可以由天然存在的氨基酸和肽键组成；或者由合成的肽模拟物结构(即“类似物”，如类肽)组成，(参见Simon等人，PNAS USA 89(20):9367(1992))，特别是当要将肽向患者给予时如此。因此，本文所用的“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在的和合成的氨基酸二者。例如，出于本发明的目的，高苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸是(S)或L-构型。如果使用非天然存在的侧链，则可以使用非氨基酸取代基，以例如防止或延缓体内降解。
[0115] 如本文所用，“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或者以化学方式连接至蛋白质的部分的改变。例如，修饰可以是附着到蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为了清楚起见，除非另有注释，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和
RNA中具有密码子的20个氨基酸。本文优选的氨基酸修饰是取代。
RNA中具有密码子的20个氨基酸。本文优选的氨基酸修饰是取代。
[0116] 如本文所用，“氨基酸取代”或“取代”意指亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸被不同氨基酸替代。具体地，在一些实施方案中，取代是指不是天然存在于特定位置处的氨基酸，也不是天然存在于生物体或任何生物体中的氨基酸。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这种情况下是Fc变体，其中位置272处的谷氨酸被酪氨酸替代，其中编号根据Kabat的EU系统。为了清楚起见，已被工程化以改变核酸编码序列但不改变初始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取
代”；也就是说，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但如果蛋白质在它开始的特定位置处具有相同的氨基酸，这就不是氨基酸取代。
代”；也就是说，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但如果蛋白质在它开始的特定位置处具有相同的氨基酸，这就不是氨基酸取代。
[0117] 如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示谷氨酸在位置233之后和位置234之前的插入。另外，-233ADE或A233ADE表示AlaAspGlu在位置233之后和位置234之前的插入。
[0118] 如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中特定位置处去除氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del表示位置233处的谷氨酸缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233处开始的序列GluAspAla缺失。
[0119] 如本文所用，“多肽”是指至少两个共价附接的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基可以包含天然存在的氨基酸和肽键，或者合成的肽模拟物结构，即“类似物”，如类肽(参见Simon等人，PNAS USA 89(20):9367(1992)，通过引用全部并入)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如，不是由DNA编码的氨基酸)；如本领域技术人员将理解的。例如，出于本发明的目的，均苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被认为是合成氨基酸，并且可以利用D-和L-(R或S)两种构型的氨基酸。本发明的变体可以包含修饰，所述修饰包括使用例如使用以下来掺入的合成氨基酸：由Schultz及其同事开发的技术，包括但不限于由Cropp
和Shultz,2004,Trends Genet.20(12):625-30、Anderson等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71、Zhang等人,2003,303(5656):371-3以及Chin等人,2003,Science
301(5635):964-7描述的方法，它们都通过引用全部并入。此外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、环状置换、环化、与其他分子的连接、与蛋白质或蛋白质结构域的融合、以及肽标签或标记的添加。
和Shultz,2004,Trends Genet.20(12):625-30、Anderson等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71、Zhang等人,2003,303(5656):371-3以及Chin等人,2003,Science
301(5635):964-7描述的方法，它们都通过引用全部并入。此外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、环状置换、环化、与其他分子的连接、与蛋白质或蛋白质结构域的融合、以及肽标签或标记的添加。
[0120] 如本文所概述，本发明的示例性多肽特异性地结合靶细胞表面上展示的蛋白质。本文中“特异性地结合”意指多肽的结合常数在至少10-4-10-6M-1的范围内，优选的范围是
10-7-10-9M-1。
10-7-10-9M-1。
[0121] “多肽”的定义中特别包括无糖基化多肽。如本文所用，“无糖基化多肽(aglycosylated polypeptide)”意指在Fc区的位置297处缺乏附着碳水化合物的多肽，其
中编号根据Kabat的EU系统。无糖基化多肽可以是去糖基化多肽(deglycosylated
polypeptide)，即Fc碳水化合物已经从中例如被化学或酶促地去除的抗体或抗体片段。可
替代地，无糖基化多肽可以是不含Fc碳水化合物的表达的非糖基化或未糖基化抗体或其片
段，例如通过编码糖基化模式的一个或多个残基的突变或者通过在不将碳水化合物附着到
蛋白质的生物体(例如细菌)中的表达得到。
中编号根据Kabat的EU系统。无糖基化多肽可以是去糖基化多肽(deglycosylated
polypeptide)，即Fc碳水化合物已经从中例如被化学或酶促地去除的抗体或抗体片段。可
替代地，无糖基化多肽可以是不含Fc碳水化合物的表达的非糖基化或未糖基化抗体或其片
段，例如通过编码糖基化模式的一个或多个残基的突变或者通过在不将碳水化合物附着到
蛋白质的生物体(例如细菌)中的表达得到。
[0122] 如本文所用，“亲本多肽”或“前体多肽”(包括Fc亲本或前体)意指随后被修饰以产生变体的多肽。所述亲本多肽可以是天然存在的多肽，或者天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码其的氨基酸序列。因此，如本文所用，“亲本Fc多肽”意指被修饰以产生变体的未修饰Fc多肽，并且如本文所用的“亲本抗体”意指被修饰以产生变异抗体的未修饰抗体。
[0123] 如本文所用，“位置”意指蛋白质序列中的一个位置。位置可以按顺序编号，或根据既定格式编号，例如根据用于抗体编号的EU索引。
[0124] 如本文所用，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞介导的反应，其中表达FγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，并随后导致靶细胞裂解。ADCC与FcγRIIIa的结合相关；与FcγRIIIa结合的增加导致ADCC活性的增加。
[0125] 如本文所用，“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达FγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，并随后导致靶细胞的吞噬。
[0126] 由本发明AbCID展示的另一种细胞毒性模式是T细胞介导的细胞毒性，例如CAR T细胞介导的细胞毒性。
[0127] 在各种实施方案中，这些机制中的一种或两种是CID(例如本发明的AbCID)治疗功效的基础。
[0128] 如本文所用的“靶抗原”意指被给定抗体的可变区特异性地结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其他化合物。本文描述了一系列合适的示例性靶抗原。
[0129] 如本文所用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
[0130] “Ab”是指抗体。如本文所用，“抗体”在本文中意指由一种或多种多肽组成的蛋白质，所述多肽基本上由识别的免疫球蛋白基因的全部或部分编码。例如在人类中，识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ和重链基因座，它们一起包含无数可变区基因；以及恒定区基因μ、δ、γ、和α，它们分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同种型。本文中的抗体意指包括全长抗体和抗体片段，并且可以指来自任何生物体的天然抗体、工程化抗体或为实验、治疗或其他目的以重组方式产生的抗体，如下文进一步定义。因此，“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体(mAb)二者。单克隆抗体和多克隆抗体的制备和纯化方法是本领域已知的，并且例如描述于Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)中。如本文所概述，“抗体”具体包括本文所述的Fc变体，“全长”抗体(其包括本文所述的Fc变体片段)，以及如本文所述的Fc变体与其他蛋白质的融合物。
[0131] 术语“抗体”包括本领域已知的抗体片段，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fcs或抗体的其他抗原结合亚序列，如通过修饰整个抗体产生的单链抗体(例如scFab和scFv)、嵌合抗体等，或者使用重组DNA技术从头合成的那些。术语“抗体”进一步包括多克隆抗体和mAb，它们可以是激动剂或拮抗剂抗体。
[0132] “抗体”的定义中特别包括含有Fc变体部分的全长抗体。本文中的“全长抗体”意指构成抗体的天然生物形式的结构，其包括可变区和恒定区。例如，在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，IgG类的全长抗体是四聚体，并且由两对相同的两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包括免疫球蛋白结构域VL和CL，并且每条重链包括免疫球蛋白结构域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。在一些哺乳动物中，例如骆驼和美洲驼中，IgG抗体可能仅由两条重链组成，每条重链包含一个附接到Fc区的可变结构域。如本文所用的“IgG”意指属于基本上由识别的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人类中，此类别包
括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，此类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。
括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，此类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。
[0133] 在优选的实施方案中，本发明的抗体是人源化的。使用当前的单克隆抗体技术，可以产生可以被鉴定的几乎任何靶抗原的人源化抗体[Stein,Trends Biotechnol.15:88-90(1997)]。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、
Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)的嵌合分子，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体的互补决定区
(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的具有所希望特异性、
亲和力和能力的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基
替代。人源化抗体还可以包含既未发现于受体抗体中也未发现于输入CDR或框架序列中的
残基。通常，人源化抗体将基本上包含至少一个(并且通常是两个)可变结构域的全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR区是人
免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分[Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,
Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)]。人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。
Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)的嵌合分子，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体的互补决定区
(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的具有所希望特异性、
亲和力和能力的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基
替代。人源化抗体还可以包含既未发现于受体抗体中也未发现于输入CDR或框架序列中的
残基。通常，人源化抗体将基本上包含至少一个(并且通常是两个)可变结构域的全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR区是人
免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分[Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,
Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)]。人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。
[0134] 总体上，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化可以本质上按照
Winter和合作者的方法[Jones等人,同上；Riechmann等人,同上；和Verhoeyen等人,
Science,239:1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来
进行。人源化鼠单克隆抗体的其他例子在本领域中也是已知的，例如结合人蛋白C的抗体
[O'Connor等人,Protein Eng.11:321-8(1998)]、结合白细胞介素2受体的抗体[Queen等
人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.86:10029-33(1989])和结合人类表皮生长因子受体2的
抗体[Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285-9(1992)]。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物
种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似部位的残基取代。
Winter和合作者的方法[Jones等人,同上；Riechmann等人,同上；和Verhoeyen等人,
Science,239:1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来
进行。人源化鼠单克隆抗体的其他例子在本领域中也是已知的，例如结合人蛋白C的抗体
[O'Connor等人,Protein Eng.11:321-8(1998)]、结合白细胞介素2受体的抗体[Queen等
人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.86:10029-33(1989])和结合人类表皮生长因子受体2的
抗体[Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285-9(1992)]。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物
种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似部位的残基取代。
[0135] 在优选的实施方案中，本发明的抗体是基于人序列，并且因此人序列被用作“基础”序列，与其他序列如大鼠、小鼠和猴序列进行比较。为了建立与一级序列或结构的同源性，将前体或亲本抗体或scFv的氨基酸序列直接与对应的人序列进行比较。在比对序列后，使用本文所述的一个或多个同源性比对程序(例如在物种间使用保守残基)，允许必要的插
入和缺失以便保持比对(即避免通过任意缺失和插入而消除保守残基)，定义了等同于人多
肽一级序列中特定氨基酸的残基。保守残基的比对优选地应保存100％的此类残基。然而，大于75％或少至50％的保守残基的比对也足以定义等同残基(在本文中有时称为“对应残
基”)。
入和缺失以便保持比对(即避免通过任意缺失和插入而消除保守残基)，定义了等同于人多
肽一级序列中特定氨基酸的残基。保守残基的比对优选地应保存100％的此类残基。然而，大于75％或少至50％的保守残基的比对也足以定义等同残基(在本文中有时称为“对应残
基”)。
[0136] 如本文所用的“残基”意指蛋白质中的一个位置及其相关联的氨基酸身份，其中编号根据Kabat的EU系统。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
[0137] 等同残基也可以通过测定scFv片段三级结构水平上的同源性来定义，所述scFv片段的三级结构已通过x射线结晶学测定。等同残基定义为亲本或前体的特定氨基酸残基的
两个或更多个主链原子的原子坐标(N在N上，CA在CA上，C在C上并且O在O上)在比对后在
0.13nm且优选0.1nm内的残基。在最佳模型已经被定向和定位以给出scFv变体片段的非氢
蛋白质原子的原子坐标的最大重叠之后，实现比对。
两个或更多个主链原子的原子坐标(N在N上，CA在CA上，C在C上并且O在O上)在比对后在
0.13nm且优选0.1nm内的残基。在最佳模型已经被定向和定位以给出scFv变体片段的非氢
蛋白质原子的原子坐标的最大重叠之后，实现比对。
[0138] 如本文所用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。如本领域技术人员将理解的，这些通常由两条链组成，或者可以组合(通常用本文讨论的接头)以形成scFv。
[0139] 本文中的“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv接头，可变重链(VH)结构域共价附接到可变轻链(VL)结构域以形成scFv或scFv结构域。scFv结构域可以处于从N-末端到C-末端的任一个取向上(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
[0140] 如本文所用的“单链Fab”或“scFab”意指共价附接到恒定重链(CH)结构域的可变重链(VH)结构域，其通常使用如本文所讨论的scFab接头进而附接到与可变轻链(VL)结构域附接的恒定轻链(CL)结构域以形成scFab或scFab结构域。
[0141] 如本文所用，“可变区”意指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个Ig结构域，所述一个或多个Ig结构域基本上由分别构成κ、λ以及重链和轻链免疫球蛋白基因座的任何Vic、Vλ、VL和/或VH基因编码。
[0142] “CD-x”是指一组分化(CD)蛋白。在示例性实施方案中，CD-x选自对给予了本发明多肽构建体的受试者中的T细胞的募集或激活具有作用的那些CD蛋白。在示例性实施方案中，CD-x选自CD-19和CD-3。在示例性实施方案中，CD-x是CAR T细胞的靶标。
[0143] 本文中“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区(CDR)，当作为多肽序列的一部分存在时，其特异性地结合如本文所讨论的靶抗原。因此，“检查点抗原结合结构域”结合如本文所概述的靶检查点抗原。如本领域所知，这些CDR通常作为第一组可变重链CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻链CDR(vlCDR或VLCDR)存在，每组包括三个CDR：重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3和轻链的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于可变重链结构域和可变轻链结构域中，并且一起形成Fv区。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个CDR由可变重链和可变轻链贡献。在“Fab”形式中，一组6个CDR由两种不同的多肽序列贡献，可变重链结构域(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻链结构域(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，其中vh结构域的C-末端附接到重链CH1结构域的N-末端，并且vl结构域的C-末端附接到恒定轻链结构域的N-末端(并且由此形成轻链)。在scFv或scFab形
式中，vh和vl结构域通常通过使用如本文所概述的接头共价附接到单个多肽序列中，所述
多肽序列可以是vh-接头-vl或vl-接头-vh(从N-末端开始)，其中前者通常是优选的(根据
所使用的形式，在每侧上包括任选的结构域接头)。示例性抗原结合结构域识别并特异性地b b
结合蛋白质-SM复合物。在表1-9中提供了本发明的示例性蛋白质分子的示例性CDR，并且
在SEQ ID NO:312和313中分别提供了示例性重链和轻链可变结构域支架。
式中，vh和vl结构域通常通过使用如本文所概述的接头共价附接到单个多肽序列中，所述
多肽序列可以是vh-接头-vl或vl-接头-vh(从N-末端开始)，其中前者通常是优选的(根据
所使用的形式，在每侧上包括任选的结构域接头)。示例性抗原结合结构域识别并特异性地b b
结合蛋白质-SM复合物。在表1-9中提供了本发明的示例性蛋白质分子的示例性CDR，并且
在SEQ ID NO:312和313中分别提供了示例性重链和轻链可变结构域支架。
[0144] 如本文所用的“Fc”、“Fc区”、“FC多肽”等意指如本文所定义的抗体，其包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白域，并且是IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白域，以及这些结构域N-末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1与Cγ2之间的铰链。虽然Fc区的边界可能变化，但通常所界定的
人IgG重链Fc区包含其羧基末端的残基C226或P230，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。
Fc可以指分离的此区域，或抗体、抗体片段或Fc融合物情况下的此区域。Fc可以是抗体、Fc融合物、或包含Fc的蛋白质或蛋白质结构域。特别优选的是Fc变体，其是非天然存在的Fc变体。
人IgG重链Fc区包含其羧基末端的残基C226或P230，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。
Fc可以指分离的此区域，或抗体、抗体片段或Fc融合物情况下的此区域。Fc可以是抗体、Fc融合物、或包含Fc的蛋白质或蛋白质结构域。特别优选的是Fc变体，其是非天然存在的Fc变体。
[0145] 如本文所用的“IgG”意指属于基本上由识别的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人类中，此类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，此类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。本文中“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指由一种或多种多肽组成的蛋白质，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因编码。免疫球蛋白包括但不限于抗体。免疫球蛋白可以具有
多种结构形式，包括但不限于全长抗体、抗体片段和单独的免疫球蛋白结构域。本文中“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指免疫球蛋白的一个区域，其作为蛋白质结构领域的技术人员所
确定的独特结构实体而存在。Ig结构域通常具有特征夹层折叠拓扑结构。抗体IgG类中已知的Ig结构域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
多种结构形式，包括但不限于全长抗体、抗体片段和单独的免疫球蛋白结构域。本文中“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指免疫球蛋白的一个区域，其作为蛋白质结构领域的技术人员所
确定的独特结构实体而存在。Ig结构域通常具有特征夹层折叠拓扑结构。抗体IgG类中已知的Ig结构域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
[0146] 本文的“野生型或WT”意指自然界中所见的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白质具有未被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
[0147] 如本文所用的“变体多肽”意指与亲本多肽序列的序列因至少一个氨基酸修饰而不同的多肽序列。修饰可以包括取代、缺失和添加。变体多肽可以指多肽本身、包含所述多肽的组合物、或编码其的氨基酸序列。优选地，变体多肽与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有约1至约10个氨基酸修饰，并且优选约1至约5个氨基酸修饰。
本文的变体多肽序列优选地将与亲本多肽序列具有至少约80％的同源性，并且最优选至少
约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性。因此，如本文所用的“Fc变体”意指与亲本Fc序列的序列因至少一个氨基酸修饰而不同的Fc序列。类似地，示例性“非活性VL结构域”或“非活性VH结构域”是亲本VL或VH多肽的变体。
本文的变体多肽序列优选地将与亲本多肽序列具有至少约80％的同源性，并且最优选至少
约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性。因此，如本文所用的“Fc变体”意指与亲本Fc序列的序列因至少一个氨基酸修饰而不同的Fc序列。类似地，示例性“非活性VL结构域”或“非活性VH结构域”是亲本VL或VH多肽的变体。
[0148] 在一些实施方案中，本发明的AbCID和/或多肽组分是“分离的”或“基本上纯的”多肽。“分离的”或“基本上纯的”在用于描述本文公开的多肽时意指已被鉴定且与它的产生环境的组分分离和/或自所述产生环境的组分回收的多肽。优选地，多肽不与或基本上不与来自其产生环境的所有其他组分缔合。其产生环境的污染组分，如由重组转染细胞产生的污染组分，是典型地干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。生产培养基中所希望的多肽可以按重量计占培养基中总多肽的至少约5％、至少约25％或至少约50％。
[0149] 包括本发明多肽的示例性分离多肽和AbCID基本上或本质上不含用于生产材料的组分。对于本发明的肽，术语“分离的”是指基本上或本质上不含组分的材料，所述组分通常伴随用于制备肽的混合物中的材料。“分离的”和“纯的”可互换地使用。通常，本发明的分离多肽具有优选地表达为范围的纯度水平。多肽构建体纯度范围的下限为约60％、约70％或
约80％，并且纯度范围的上限为约70％、约80％、约90％或大于约90％。
约80％，并且纯度范围的上限为约70％、约80％、约90％或大于约90％。
[0150] 当多肽纯度超过约90％时，它们的纯度也优选地表达为一个范围。纯度范围的下限为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％纯度。
[0152] 在各种实施方案中，蛋白质b通过一个或多个结合结构域与SM结合。根据本发明，结合结构域是一种或多种多肽的组分。此类多肽可以包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例
如化学接头或化学交联剂，诸如戊二醛)。多肽(包括其片段、优选生物活性片段和肽，通常具有多于30个氨基酸的肽)包含经由共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基
酸链)。
如化学接头或化学交联剂，诸如戊二醛)。多肽(包括其片段、优选生物活性片段和肽，通常具有多于30个氨基酸的肽)包含经由共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基
酸链)。
[0153] “特异性结合”或“特异性地结合”或“对特定抗原或表位特异”意指明显不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过测定与对照分子结合相比的分子结合来测量，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来测定特异性结合。
[0154] 对特定抗原或表位的特异性结合可以例如由对抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约
10-11M、至少约10-12M或更高的抗体展现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
通常，相对于抗原或表位而言，与所述抗原特异性地结合的抗体的KD是对照分子的KD的20、
50、100、500、1000、5,000、10,000或更高倍数。
10-11M、至少约10-12M或更高的抗体展现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
通常，相对于抗原或表位而言，与所述抗原特异性地结合的抗体的KD是对照分子的KD的20、
50、100、500、1000、5,000、10,000或更高倍数。
[0155] 另外，对特定抗原或表位的特异性结合可例如由以下展现：抗体对于抗原或表位的缔合常数或Ka为对照对于所述表位的缔合常数或Ka的至少20、50、100、500、1000、5,000、
10,000或更高倍数，其中缔合常数或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。通常使用测定来测量结合亲和力。
10,000或更高倍数，其中缔合常数或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。通常使用测定来测量结合亲和力。
[0156] 术语“本质上不特异性地结合”、“基本上不特异性地结合”或“不能特异性地结合”可互换地使用，并且意指本发明的结合结构域不结合靶抗原之外的蛋白质或抗原，即，与靶抗原之外的蛋白质或抗原的反应性不超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％。此术语与本发明的抗体相关，因为当它们不结合在蛋白质b-SM复合物中时，它们缺乏与蛋白质b和SM的相互作用。
[0157] 如本文所用的术语“双特异性”是指“至少双特异性”的抗体，即它至少包含第一结合结构域(例如靶抗原，例如Bcl-xL、EGFR)和第二结合结构域(例如CD-x，例如CD-19或CD-3)，其中第一结合结构域结合一种抗原或靶标，并且第二结合结构域结合另一种抗原或靶
标。因此，根据本发明的多肽构建体包含针对至少两种不同抗原或靶标的特异性。本发明的术语“双特异性多肽构建体”还涵盖多特异性多肽构建体，如三特异性多肽构建体，后者包括三个结合结构域，或具有超过三种(例如四种、五种......)特异性的构建体。
标。因此，根据本发明的多肽构建体包含针对至少两种不同抗原或靶标的特异性。本发明的术语“双特异性多肽构建体”还涵盖多特异性多肽构建体，如三特异性多肽构建体，后者包括三个结合结构域，或具有超过三种(例如四种、五种......)特异性的构建体。
[0158] 本发明的示例性实施方案利用双特异性抗体，它们不是天然存在的，并且它们明显不同于天然存在的产物。因此，“双特异性”抗体是具有至少两个有不同特异性的结合位点的人工杂合多肽。可以通过多种方法产生双特异性多肽构建体。参见例如，Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)。
[0159] 当本发明的抗体是scFv或scFab抗体时，这些抗体可以包含或不包含肽接头(间隔肽)。根据本发明，术语“肽接头”包含这样的氨基酸序列：通过所述氨基酸序列，本发明的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一个(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列
彼此连接。这种肽接头的基本技术特征在于它不包含任何聚合活性。合适的肽接头是在美
国专利号4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽接头也可用于将其他结
构域或模块或区(诸如半衰期延长结构域)附接到本发明的抗体构建体。
彼此连接。这种肽接头的基本技术特征在于它不包含任何聚合活性。合适的肽接头是在美
国专利号4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽接头也可用于将其他结
构域或模块或区(诸如半衰期延长结构域)附接到本发明的抗体构建体。
[0160] 在使用接头的那些实施方案中，此接头的长度和序列优选地足以确保每个靶抗原和CD-3结合结构域能够彼此独立地保持它们不同的结合特异性。对于连接本发明的抗体构
建体中的至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，仅包含优化数量的氨基酸残
基的那些肽接头是优选的。对于scFv抗体构建体，示例性接头为例如12个氨基酸残基或更
少。因此，使用12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头。对于本发明的scFab抗体构建体，示例性接头包括高达约80个氨基酸，例如高达约70、60、50、40、30、20个氨基酸。
建体中的至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，仅包含优化数量的氨基酸残
基的那些肽接头是优选的。对于scFv抗体构建体，示例性接头为例如12个氨基酸残基或更
少。因此，使用12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头。对于本发明的scFab抗体构建体，示例性接头包括高达约80个氨基酸，例如高达约70、60、50、40、30、20个氨基酸。
[0161] 设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或1个氨基酸，其中富含Gly的接头是优选的。在所述“肽接头”背景下特别优选的“单一”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可以由单一氨基酸Gly组成。肽接头的另一个优选实施方案的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser(SEQ ID NO:325)，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为1或更大的整数(例如2或3)。所述肽接头的特征(包括不存在二级结构的促进)是本领域中已知的并且
描述于例如Dall'Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol
(1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。此外还使用不促进任
何二级结构的肽接头。所述结构域彼此的连接可以例如通过基因工程提供，如实施例中所
述。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表
达它们的方法是本领域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人,Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,
N.Y.,2001)。
描述于例如Dall'Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol
(1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。此外还使用不促进任
何二级结构的肽接头。所述结构域彼此的连接可以例如通过基因工程提供，如实施例中所
述。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表
达它们的方法是本领域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人,Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,
N.Y.,2001)。
[0162] 本发明的示例性实施方案包括至少一个scFv结构域，虽然不是天然存在的，但通常包括通过scFv接头连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文所概述的，
虽然scFv结构域通常从N-到C-末端取向为VH-scFv接头-VL，但对于任何scFv结构域(或使
用来自Fab的VH和VL序列构建的那些结构域)可以颠倒成VL-scFv接头-VH，根据形式在一端
或两端处具有任选的接头。还包括其中scFab是组分的实施方案。
虽然scFv结构域通常从N-到C-末端取向为VH-scFv接头-VL，但对于任何scFv结构域(或使
用来自Fab的VH和VL序列构建的那些结构域)可以颠倒成VL-scFv接头-VH，根据形式在一端
或两端处具有任选的接头。还包括其中scFab是组分的实施方案。
[0163] 如本文所示，存在许多合适的、可以使用的、通过重组技术产生的scFab和scFv接头，包括传统肽键。接头肽可以主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽的长度应足以连接两个分子，这样使它们相对于彼此采取正确的构象，从而保持所希望的活性。
在一个实施方案中，接头长度为约1至80个氨基酸，优选长度为约1至50个氨基酸。在一个实施方案中，可以使用长度为1至20个氨基酸的接头，在一些实施方案中发现使用了约5至约
10个氨基酸。可用接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为1(并且通常为3至4)的整数、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。可替代地，多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可以用作接头，即可以用作接头。
在一个实施方案中，接头长度为约1至80个氨基酸，优选长度为约1至50个氨基酸。在一个实施方案中，可以使用长度为1至20个氨基酸的接头，在一些实施方案中发现使用了约5至约
10个氨基酸。可用接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为1(并且通常为3至4)的整数、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。可替代地，多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可以用作接头，即可以用作接头。
[0164] 其他接头序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可以源自免疫球蛋白轻
链，例如CK或CA。接头可以源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Ca1、Ca2、Cδ、Cc和Cji。接头序列也可以源自其他蛋白质，如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、KIR)；铰链区来源的序列；和来自其他蛋白质的其他天然序列。
链，例如CK或CA。接头可以源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Ca1、Ca2、Cδ、Cc和Cji。接头序列也可以源自其他蛋白质，如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、KIR)；铰链区来源的序列；和来自其他蛋白质的其他天然序列。
[0165] 在一些实施方案中，接头是“结构域接头”，用于将如本文所概述的任何两个结构域连接在一起。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为1(并且通常为3至4至5)的整数，以及允许以足够的长度和灵活性连接两个结构域以允许每个结构域保持其生物功
能的任何肽序列。
能的任何肽序列。
[0166] 本文中的“计算筛选方法”意指设计本发明的一种或多种多肽构建体的任何方法，所述多肽构建体包括构建体的组分(例如，VH、VL)中的突变，其中所述方法利用计算机评价潜在氨基酸侧链取代彼此和/或与蛋白质其余部分的相互作用的能量。如本领域技术人员将理解的，能量评价，称为能量计算，是指对一个或多个氨基酸修饰进行评分的一些方法。
所述方法可以涉及物理或化学能量项，或者可以涉及基于知识、统计、序列的能量项等。构成计算筛选方法的计算在本文中称为“计算筛选计算”。
所述方法可以涉及物理或化学能量项，或者可以涉及基于知识、统计、序列的能量项等。构成计算筛选方法的计算在本文中称为“计算筛选计算”。
[0167] 如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性或良性)以及所有癌性和癌前细胞和组织。
[0168] “侵入性血管生成”是指支持病理状态(包括恶性和非恶性肿瘤)的血管形成以及黄斑变性中新血管的异常形成。
[0169] 术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤和白血病。
[0170] 如本文所使用，术语“治疗”(“treat”或“treatment”)是指治疗性治疗和预防性或防止性措施二者，其中目的是为了防止或减缓(减轻)不希望的生理学变化或障碍，如多发性硬化、关节炎或癌症的进展。有益或希望的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病的程度减小、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、和无论是可检测的还是不可检测的缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还可以意指与如果没有接受治疗的预期的存活期相比，延长存活期。需要治疗的患者包括已经患有病症或障碍的患者，以及易于患有病症或障碍的患者，或者病症或障碍有待预防的患者。
[0171] “受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指任何需要诊断、预后或治疗的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物、以及动物园、体育竞技动物或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛等。
[0172] “AZx”(例如AZ1、AZ2、AZ3是指本发明的抗体，其特异性地结合与BCL-xL、BCL-2或BCL-W复合的ABT-737及其缀合物。)
[0173] 如本文所用，术语“靶向部分”和“靶向剂”是指将选择性地定位于身体特定组织或区域中的种类。定位是通过对分子决定簇、靶向剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水相互作用等的特定识别来介导的。将药剂靶向特定组织或区域的其他机制是本领域技术人员已知的。
[0174] 如本文所用，“治疗部分”意指可用于治疗的任何药剂，包括但不限于抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药物、细胞毒素和放射性药剂。“治疗部分”包括生物活性剂的前药，其中多于一个的治疗部分连接到载体的构建体，例如多价药剂。治疗部分还包括肽和包含肽的构建体。因此“治疗部分”意指可用于治疗的任何药剂，包括但不限于抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药物、细胞毒素和放射性药剂。“治疗部分”包括生物活性剂的前药，其中多于一个的治疗部分连接到载体的构建体，例如多价药剂。
[0175] 如本文所用，“抗肿瘤药物”意指可用于抗癌的任何药剂，包括但不限于细胞毒素和药剂，如抗代谢物、烷化剂、蒽环霉素、抗生素、抗有丝分裂剂、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、干扰素和放射性药剂。术语“抗肿瘤药物”的范围还涵盖具有抗肿瘤活性的肽(例如TNF-α)的缀合物。缀合物包括但不限于在本发明的治疗蛋白与糖蛋白之间形成的那些缀合物。代表性的缀合物是PSGL-1与TNF-α之间形成的缀合物。
[0176] 如本文所用，“细胞毒素或细胞毒性剂”意指对细胞有害的任何药剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、道诺霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。其他毒素包括，例如，蓖麻毒素，CC-1065和类似物，倍癌霉素(duocarmycin)。还有其他毒素包括白喉毒素和蛇毒(例如眼镜蛇毒)。
[0177] 如本文所用，“放射性药剂”包括有效诊断或破坏肿瘤的任何放射性同位素。例子包括但不限于铟-111、钴-60和锝。另外，天然存在的放射性元素，如铀、镭和钍，通常代表放射性同位素的混合物，是放射性药剂的合适例子。金属离子通常与有机螯合部分螯合。
[0178] 如本文所用，“药学上可接受的载体”包括当与缀合物组合时保持缀合物活性并且不与受试者免疫系统反应的任何材料。例子包括但不限于以下标准药学载体中的任一种：如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(如油/水乳液)，以及各种类型的润湿剂。其他载体还可以包括无菌溶液、片剂(包括包衣片剂和胶囊)。通常，此类载体含有赋形剂，如淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其他已知赋形剂。此类载体还可以包括风味和颜色添加剂或其他成分。通过熟知的常
规方法来配制包含此类载体的组合物。
规方法来配制包含此类载体的组合物。
[0179] 术语“半衰期”或“t1/2”，如本文在向患者给予SM或SM-蛋白复合物的上下文中所用，被定义为向患者给予的物质的血浆浓度降低一半所需的时间。取决于多种清除机制、再分布和本领域熟知的其他机制，与给予种类相关联的半衰期可能多于一个。通常，α和β半衰期被定义为使得α相与再分布相关联，并且β相与清除相关联。然而，对于大多数限于血流的蛋白质药物，可能存在至少两个清除半衰期。对于一些糖基化肽，快速β相清除可以经由巨噬细胞或内皮细胞上的识别末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖或岩藻糖的受体介导。对于有效半径<2nm(大约68kD)和/或在组织中具有特异性或非特异性摄取和代谢的分子，可以经由肾小球过滤产生较慢的β相清除。聚乙二醇化可以封闭末端糖(例如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)，并且从而阻断经由识别这些糖的受体进行的快速α相清除。它还可以赋予更大的有效半径，并且从而减少分布体积和组织摄取，从而延长β相晚期。因此，聚乙二醇化对α相和β相半衰期的精确影响将根据大小、糖基化状态和其他参数而变化，这在本领域是熟知的。对“半衰期”的进一步解释见Pharmaceutical Biotechnology(1997,
DFA Crommelin and RD Sindelar编,Harwood Publishers,Amsterdam,第101–120页)。
DFA Crommelin and RD Sindelar编,Harwood Publishers,Amsterdam,第101–120页)。
[0180] 术语“烷基”本身或作为另一个取代基的部分，除非另有说明，否则意指直链或支链或环状烃基，或其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的并且可以包括单价、二价和多价基团、具有指定的碳原子数(即，C1-C10意指一至十个碳)。饱和烷基的例子包括但不限于如以下的基团：甲基、亚甲基、乙基、亚乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、其同系物和异构体(例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等)。不饱和烷基为具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的例子包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另有注释，否则术语“烷基”包括“亚烷基”，以及任选地，下面更详细定义的烷基衍生物，如“杂烷基”。
[0181] 除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合，意指稳定的直链或支链，或环状烃基，或其组合，由所述数量的碳原子和至少一个选自O、N、Si、P和S的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、S、P和Si可以置于杂烷基的任何内部位置或烷基附接至分子的其余部分所处的位置处。例子包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如像-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“亚杂烷基”本身或作为另一个取代基的部分意指衍生自杂烷基的二价基团，如通过-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-
CH2-所例示但不限于此。对于亚杂烷基，杂原子也可以占据任一个或两个链末端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的取向并非由书写所述连接基团的化学式的方向所暗示。例如，式-C(O)
2R'-表示-C(O)2R'-和-R'C(O)2-二者。
CH2-所例示但不限于此。对于亚杂烷基，杂原子也可以占据任一个或两个链末端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的取向并非由书写所述连接基团的化学式的方向所暗示。例如，式-C(O)
2R'-表示-C(O)2R'-和-R'C(O)2-二者。
[0182] 除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合，分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。还包括二价和多价种类，如“环亚烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环附接至分子的其余部分所处的位置处。环烷基的例子包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括但不限于：1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
[0183] 术语“卤代基”或“卤素”本身或作为另一个取代基的部分，除非另有说明，否则意指氟、氯、溴或碘原子。另外，如“卤代烷基”的术语意指包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于如三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等的种类。
[0184] 除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱和的、芳族的烃取代基，其可以是单环或多环(优选1-3个环)，它们稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”是指芳基(或环)，其含有1至4个选自N、O和S的杂原子，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的其余部分附接。芳基和杂芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基，2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。还包括二价和多价接头种类，如“亚芳基”。以上所提到的芳基和杂芳基环体系中每个的取代基选自下文所述的可接受取代基的组。
[0185] 为简洁起见，当与其他术语(例如，芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)组合使用时术语“芳基”包括如上定义的芳基环和杂芳基环二者。因此，术语“芳烷基”意指包括其中芳基附接至烷基的那些基团(例如苄基、苯乙基、吡啶甲基等)，所述烷基包括其中碳原子(例如亚甲基)被例如氧原子替代的那些烷基(例如苯氧甲基、2-吡啶基氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
[0186] 以上术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中的每一个包括所示基团的取代和未取代形式二者。下面提供了每种类型基团的示例性取代基。
[0187] 烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于以下的多种基团中的一种或多种：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、SO3R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”')＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”'、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，数目从0至(2m'+1)变化，其中m’是所述基团中碳原子的总数。R'、R”、R”'和R””各自优选独立地是指氢，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基(例如被1-
3个卤素取代的芳基)，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，每个R基团被独立地选择为每个R'、R”、R”'和R””基团。当R'和R”与相同的氮原子附接时，它们可以与所述氮原子组合形成5、6或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。因此，由取代基的以上讨论，本领域技术人员将理解，术语“取代烷基”和“杂烷基”意在包括具有结合至除了氢原子之外的基团的碳原子的基团，如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例
如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
3个卤素取代的芳基)，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，每个R基团被独立地选择为每个R'、R”、R”'和R””基团。当R'和R”与相同的氮原子附接时，它们可以与所述氮原子组合形成5、6或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。因此，由取代基的以上讨论，本领域技术人员将理解，术语“取代烷基”和“杂烷基”意在包括具有结合至除了氢原子之外的基团的碳原子的基团，如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例
如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
[0188] 上文段落中所阐述的取代基在本文中称为“烷基取代基”。
[0189] 类似于对于烷基所述的取代基，芳基和杂芳基的取代基是不同的并且选自例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、SO3R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基以及氟代(C1-C4)烷基，数目从0至芳环体系上开放价键的总数
变化；并且其中R'、R”、R”'和R””优选地独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代芳基和杂芳基、(未取代芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代芳基)氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化
合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，每个R基团被独立地选择为每个R'、R”、R”'和R””基团。
变化；并且其中R'、R”、R”'和R””优选地独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代芳基和杂芳基、(未取代芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代芳基)氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化
合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，每个R基团被独立地选择为每个R'、R”、R”'和R””基团。
[0190] 芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基替代，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，并且q是0至3的整数。可替代地，所述芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-A-
(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的单键中的一个可任选地被双键替代。可替代地，所述芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-
(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-的取代基替代，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的单键中的一个可任选地被双键替代。可替代地，所述芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-
(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-的取代基替代，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
[0191] 上文两个段落中所阐述的取代基在本文中称为“芳基取代基”。
[0192] 在形成本发明的蛋白质a和/或蛋白质b的缀合物时，本发明这些缀合物的蛋白质前体组分包括一个或多个“反应性官能团”。示例性种类包括直接附着到蛋白质或附着到蛋白质的接头的反应性官能团。示例性的反应性官能团附接到蛋白质上的烷基或杂烷基接头。
当反应性基团附接到取代或未取代的烷基或取代或未取代的杂烷基接头部分时，反应性基
团优选地位于烷基或杂烷基链的末端位置处。可用于实施本发明的反应性基团和反应类别
通常是生物共轭化学领域中熟知的那些。本发明蛋白质缀合物可用的目前优选的反应类别
是在相对温和的条件下进行的那些反应。这些包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如迈克
尔反应(Michael reaction)、狄尔斯-阿尔德加成(Diels-Alder addition))。所述条件足
够温和，使得蛋白质前体和所希望的蛋白质缀合物在用于在缀合反应中展开反应性官能团
的反应条件下不会发生显著降解。可用的反应在例如March,Advance Organic Chemistry,
第3版John Wiley&Sons,New York,1985；Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego,1996；和Feeney等人,Modification of Proteins；Advances in
Chemistry Series,第198卷,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982中讨
论。
当反应性基团附接到取代或未取代的烷基或取代或未取代的杂烷基接头部分时，反应性基
团优选地位于烷基或杂烷基链的末端位置处。可用于实施本发明的反应性基团和反应类别
通常是生物共轭化学领域中熟知的那些。本发明蛋白质缀合物可用的目前优选的反应类别
是在相对温和的条件下进行的那些反应。这些包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如迈克
尔反应(Michael reaction)、狄尔斯-阿尔德加成(Diels-Alder addition))。所述条件足
够温和，使得蛋白质前体和所希望的蛋白质缀合物在用于在缀合反应中展开反应性官能团
的反应条件下不会发生显著降解。可用的反应在例如March,Advance Organic Chemistry,
第3版John Wiley&Sons,New York,1985；Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego,1996；和Feeney等人,Modification of Proteins；Advances in
Chemistry Series,第198卷,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982中讨
论。
[0193] 可用的反应性官能团包括，例如：(a)羧基及其衍生物，包括但不限于活化酯，例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基苯并三唑酯、对硝基苯基酯；酸性卤化物；酰基咪唑；硫酯；烷基、烯基、炔基和芳族酯；和用于肽合成的活化基团；(b)羟基和羟胺，其可以转化为酯、磺酸酯、氨基磷酸酯、醚、醛等。(c)卤代烷基，其中卤化物可以被亲核基团例如像胺、羧酸根阴离子、硫醇根阴离子、碳负离子或醇盐离子替换，从而导致新基团共价附接在卤原子位置处；(d)亲二烯体基团，其能够参与狄尔斯-阿尔德反应，例如像马来酰亚胺基团；(e)醛基或酮基，允许经由形成羰基衍生物，例如亚胺、腙、氨基脲或肟，或经由如格氏加成或烷基锂加成的机制衍生化；(f)磺酰卤基团，用于与胺反应，例如以形成磺酰胺；(g)硫醇基，其可以转化成二硫化物或与例如酰卤反应；(h)胺、肼或巯基，其可以是例如经酰化、烷基化或氧化的；(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、迈克尔加成等；(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；和(k)亚磷酰胺和其他可用于核酸合成的标准官能团。
[0194] 在各种实施方案中，反应性官能团是选自以下的成员：
[0195]
[0196] 其中每个r独立地选自1至10的整数；G是卤素；并且R30和R31是独立地选自H和卤素的成员，并且R30和R31中的至少一个是卤素。
[0197] 可以选择反应性官能团，使得它们不参与或干扰组装或利用多肽缀合物所必需的反应。可替代地，可以通过保护基团的存在来保护反应性官能团不参与反应。本领域技术人员理解如何保护特定的官能团，使得它不干扰所选的一组反应条件。可用的保护基团的例
子，参见例如，Greene等人,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,John Wiley&
Sons,New York,1991。
子，参见例如，Greene等人,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,John Wiley&
Sons,New York,1991。
[0198] 如本文所用的“分析物”、“靶标”、“待测定物质”和“靶种类”是指测定混合物中的目的种类。所述术语是指使用本发明的材料、方法或装置定性或定量检测的物质。此类物质的例子包括细胞及其部分、酶，如本文所用的“分析物”、“靶标”、“待测定物质”和“靶种类”是指测定混合物中的目的种类。所述术语是指使用本发明的材料、方法或装置定性或定量检测的物质。此类物质的例子包括细胞及其部分，酶，
[0199] “CRISPR”是指规律间隔成簇短回文重复序列，是Ishino首次在大肠杆菌中发现的原核免疫系统(Ishino等人,Journal of Bacteriology 169(12):5429-5433(1987))。这些系统通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸，在细菌和古生菌中提供针对病毒和质
粒的免疫。
粒的免疫。
[0200] 这些免疫系统涉及两个主要阶段；第一个是获得，并且第二个是干扰。第一阶段包括切割入侵病毒和质粒的基因组，并将其中的片段整合到细菌和古生菌的CRISPR位点中。待整合到基因组中的片段称为原型间隔子，并且有助于保护生物体免受相同病毒或质粒的
后续攻击。第二阶段包括攻击入侵的病毒或质粒。此阶段依赖于称为间隔子的整合序列，被转录成RNA，并且经过一些加工后，此RNA然后与入侵多核苷酸(例如病毒或质粒)的DNA或
RNA中的互补序列杂交，同时还与有效结合和/或切割DNA或RNA的蛋白质或蛋白质复合物缔
合。
后续攻击。第二阶段包括攻击入侵的病毒或质粒。此阶段依赖于称为间隔子的整合序列，被转录成RNA，并且经过一些加工后，此RNA然后与入侵多核苷酸(例如病毒或质粒)的DNA或
RNA中的互补序列杂交，同时还与有效结合和/或切割DNA或RNA的蛋白质或蛋白质复合物缔
合。
[0201] 存在几种不同的CRISPR-Cas系统，并且随着系统的进一步表征，这些系统的命名和分类也发生了变化。在2类II型系统中，存在两条RNA链是CRISPR-Cas系统的一部分：
CRISPR RNA(crRNA)和反式激活型CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA与前crRNA互补区杂
交，通过RNase III酶促进前crRNA成熟为crRNA。由tracrRNA和crRNA形成的双链体被蛋白
Cas9识别并缔合，所述蛋白通过与靶核酸中的序列互补并杂交的crRNA序列引导到靶核酸。
已经证明，基于RNA的免疫系统的这些最小组分可以通过使用单个蛋白质和两个RNA指导序
列或单个RNA分子，以位点特异性方式被重新编程为靶向DNA。
CRISPR RNA(crRNA)和反式激活型CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA与前crRNA互补区杂
交，通过RNase III酶促进前crRNA成熟为crRNA。由tracrRNA和crRNA形成的双链体被蛋白
Cas9识别并缔合，所述蛋白通过与靶核酸中的序列互补并杂交的crRNA序列引导到靶核酸。
已经证明，基于RNA的免疫系统的这些最小组分可以通过使用单个蛋白质和两个RNA指导序
列或单个RNA分子，以位点特异性方式被重新编程为靶向DNA。
[0202] AbCID
[0203] 在各种实施方案中，本发明提供了获得化合物和方法的途径，以实现对蛋白质a-蛋白质b二聚体形成的时间性SM控制。在示例性实施方案中，这些AbCID诱导的相互作用充
当分子开关，其导致细胞信号的传输。根据治疗需要和应用，这些信号可以被编程为促存活或促死亡。一个示例性信号激活了T细胞。
当分子开关，其导致细胞信号的传输。根据治疗需要和应用，这些信号可以被编程为促存活或促死亡。一个示例性信号激活了T细胞。
[0204] 本发明可以应用于许多应用，例如工程化的T细胞疗法和基因表达控制(例如使用CRISPR)。
[0205] 嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在治疗许多癌症方面显示出巨大的前景。遗憾的是，过度激活的T细胞经常具有负面的副作用，限制了这种疗法的使用。本发明以两种方式应用于CAR T细胞为例：例如，CAR T细胞的一个关键问题是它们在体内具有长的半衰期。因此，一旦它们具有治疗效果，就有兴趣将其移除。本发明可用于构建SM诱导的死亡开关，从而当希望时，可以从接受相同治疗的受试者体内消除CAR T细胞。例如，本发明可以用于将化学诱导型死亡开关并入到CAR T系统中，使得如果T细胞对患者有毒，则可以给予选择性
地触发所述开关并杀死工程化T细胞的SM。
地触发所述开关并杀死工程化T细胞的SM。
[0206] 本发明还提供了一种CAR T细胞激活因子和抗原募集因子。在示例性实施方案中，CAR的scFv部分被BCL-XL(蛋白质b)替代，并且蛋白质a(Ab)是双特异性抗体的一部分，所述双特异性抗体也靶向肿瘤表面上的癌症特异性抗原ABT-737的添加使蛋白质a和蛋白质b二
聚化，这导致了T细胞的激活，同时将T细胞募集到它们的癌症靶标(图2)。由于小分子是可滴定的和可逆的，这允许调节T细胞的激活及其作用的持续时间，从而极大地提高了治疗指数，并且因此提高了这种治疗方法的安全性。
聚化，这导致了T细胞的激活，同时将T细胞募集到它们的癌症靶标(图2)。由于小分子是可滴定的和可逆的，这允许调节T细胞的激活及其作用的持续时间，从而极大地提高了治疗指数，并且因此提高了这种治疗方法的安全性。
[0207] 本公开文本的一个方面提供了一种通过AbCID形成的二聚体，所述AbCID并入了包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶，所述至少一个核定位信号允许核酸内切
酶进入真核细胞和胚胎(例如像非人单细胞胚胎)的细胞核。RNA指导的核酸内切酶还包含
至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用的结构域。RNA指导的核酸内切酶被
指导RNA引导到特定的核酸序列(或靶位点)。指导RNA与RNA指导的核酸内切酶以及靶位点
相互作用，使得一旦引导到靶位点，则RNA指导的核酸内切酶能够在靶位点核酸序列中引入双链断裂。由于指导RNA为靶向切割提供特异性，所以RNA指导的核酸内切酶的核酸内切酶
是通用的，并且可以与不同的指导RNA一起用于切割不同的靶核酸序列。本文提供了分离的RNA指导的核酸内切酶、编码RNA指导的核酸内切酶的分离核酸(即RNA或DNA)、包含编码RNA指导的核酸内切酶的核酸的载体、以及包含RNA指导的核酸内切酶加指导RNA的蛋白质-RNA
复合物。Cas-9的无催化活性变体也可用于本发明的方法。
酶进入真核细胞和胚胎(例如像非人单细胞胚胎)的细胞核。RNA指导的核酸内切酶还包含
至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用的结构域。RNA指导的核酸内切酶被
指导RNA引导到特定的核酸序列(或靶位点)。指导RNA与RNA指导的核酸内切酶以及靶位点
相互作用，使得一旦引导到靶位点，则RNA指导的核酸内切酶能够在靶位点核酸序列中引入双链断裂。由于指导RNA为靶向切割提供特异性，所以RNA指导的核酸内切酶的核酸内切酶
是通用的，并且可以与不同的指导RNA一起用于切割不同的靶核酸序列。本文提供了分离的RNA指导的核酸内切酶、编码RNA指导的核酸内切酶的分离核酸(即RNA或DNA)、包含编码RNA指导的核酸内切酶的核酸的载体、以及包含RNA指导的核酸内切酶加指导RNA的蛋白质-RNA
复合物。Cas-9的无催化活性变体也可用于本发明的方法。
[0208] RNA指导的核酸内切酶可以源自规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统。CRISPR/Cas系统可以是I型、II型或III型系统。合适的CRISPR/Cas蛋白的非限制性例子包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14charged、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。
[0209] 在一个实施方案中，RNA指导的核酸内切酶源自II型CRISPR/Cas系统。在具体实施方案中，RNA指导的核酸内切酶源自Cas9蛋白。Cas9蛋白可以来自化脓链球菌、嗜热链球菌、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis
dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌
(Streptomyces viridochromogenes)、绿产色链霉菌、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、粉红链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌
(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属物种(Polaromonas
sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属物种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium
arabaticum)、Ammonifex degensii、贝氏热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌、艰难梭菌、大芬戈尔德菌(Finegoldia
magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、Pelotomaculum the
rmopropionicum、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌
(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属
物种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球
菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium
evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属物种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻
(Arthrospira platensis)、节旋藻属物种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbya
sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属物种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)或深海单细胞蓝藻
(Acaryochloris marina)。
dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌
(Streptomyces viridochromogenes)、绿产色链霉菌、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、粉红链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌
(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属物种(Polaromonas
sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属物种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium
arabaticum)、Ammonifex degensii、贝氏热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌、艰难梭菌、大芬戈尔德菌(Finegoldia
magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、Pelotomaculum the
rmopropionicum、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌
(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属
物种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球
菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium
evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属物种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻
(Arthrospira platensis)、节旋藻属物种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbya
sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属物种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)或深海单细胞蓝藻
(Acaryochloris marina)。
[0210] 通常，CRISPR/Cas蛋白包含至少一个RNA识别和/或RNA结合结构域。RNA识别和/或RNA结合结构域与指导RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白质还可以包括核酸酶结构域(即DNase
或RNase结构域)、DNA结合结构域、螺旋酶结构域、RNAse结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其他结构域。
或RNase结构域)、DNA结合结构域、螺旋酶结构域、RNAse结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其他结构域。
[0211] CRISPR/Cas样蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、修饰的CRISPR/Cas蛋白、或者野生型或修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。CRISPR/Cas样蛋白质可以被修饰以增加核酸结合
亲和力和/或特异性、改变酶活性和/或改变蛋白质的另一特性。例如，CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即DNase、RNase)结构域可以被修饰、缺失或失活。可替代地，CRISPR/Cas样蛋白可以被截短以去除对融合蛋白功能不重要的结构域。CRISPR/Cas样蛋白也可以被截短或修
饰，以优化融合蛋白效应结构域的活性。如本领域技术人员将理解的，蛋白质a或蛋白质b可以与除Cas9之外的其他结合DNA的蛋白质(例如锌指蛋白质)融合。
亲和力和/或特异性、改变酶活性和/或改变蛋白质的另一特性。例如，CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即DNase、RNase)结构域可以被修饰、缺失或失活。可替代地，CRISPR/Cas样蛋白可以被截短以去除对融合蛋白功能不重要的结构域。CRISPR/Cas样蛋白也可以被截短或修
饰，以优化融合蛋白效应结构域的活性。如本领域技术人员将理解的，蛋白质a或蛋白质b可以与除Cas9之外的其他结合DNA的蛋白质(例如锌指蛋白质)融合。
[0212] 在一些实施方案中，CRISPR/Cas样蛋白可以源自野生型Cas9蛋白或其片段。在其他实施方案中，CRISPR/Cas样蛋白可以源自修饰的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列可以被修饰以改变蛋白质的一种或多种特性(例如核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。可替代地，可以从蛋白质中消除Cas9蛋白的不参与RNA指导切割的结构域，使得修饰的Cas9蛋白小于野生型Cas9蛋白。
[0213] 通常，Cas9蛋白包含至少两个核酸酶(即DNase)结构域。例如，Cas9蛋白可以包含RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域一起工作来切割单链，从而
在DNA中形成双链断裂。(Jinek等人,Science,2012,337:816-821)。在一些实施方案中，
Cas9衍生的蛋白质可以被修饰以含有仅一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶
结构域)。例如，Cas9衍生的蛋白质可以被修饰，使得其中一个核酸酶结构域被缺失或突变，使得它不再具有功能(即，核酸酶活性不存在)。在其中一个核酸酶结构域是非活性的一些
实施方案中，Cas9衍生的蛋白质能够在双链核酸中引入切口(这种蛋白质称为“切口酶”)，但不能切割双链DNA。例如，在RuvC样结构域中天冬氨酸到丙氨酸(D10A)的转化将Cas9衍生的蛋白质转化为切口酶。同样，在HNH结构域中组氨酸到丙氨酸(H840A或H839A)的转化将
Cas9衍生的蛋白质转化为切口酶。可以使用熟知的方法，如定点诱变、PCR介导的诱变和全基因合成、以及本领域已知的其他方法修饰每个核酸酶结构域。本发明的化合物和方法还
可以应用于使用除了CRISPR衍生蛋白质之外的蛋白质(例如TALEN、锌指蛋白质等)调节遗
传回路。
在DNA中形成双链断裂。(Jinek等人,Science,2012,337:816-821)。在一些实施方案中，
Cas9衍生的蛋白质可以被修饰以含有仅一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶
结构域)。例如，Cas9衍生的蛋白质可以被修饰，使得其中一个核酸酶结构域被缺失或突变，使得它不再具有功能(即，核酸酶活性不存在)。在其中一个核酸酶结构域是非活性的一些
实施方案中，Cas9衍生的蛋白质能够在双链核酸中引入切口(这种蛋白质称为“切口酶”)，但不能切割双链DNA。例如，在RuvC样结构域中天冬氨酸到丙氨酸(D10A)的转化将Cas9衍生的蛋白质转化为切口酶。同样，在HNH结构域中组氨酸到丙氨酸(H840A或H839A)的转化将
Cas9衍生的蛋白质转化为切口酶。可以使用熟知的方法，如定点诱变、PCR介导的诱变和全基因合成、以及本领域已知的其他方法修饰每个核酸酶结构域。本发明的化合物和方法还
可以应用于使用除了CRISPR衍生蛋白质之外的蛋白质(例如TALEN、锌指蛋白质等)调节遗
传回路。
[0214] 在示例性实施方案中，AbCID形成具有体内半衰期的二聚体，当向受试者给予时，所述体内半衰期比其组分的任何子集都长。
[0215] 在各种实施方案中，AbCID在第一蛋白质缀合物与第二蛋白质缀合物之间形成二聚体，所述第一蛋白质缀合物包含选自第一治疗部分、第一靶向部分、第一可检测部分及其第一组合的成员，所述第二蛋白质缀合物包含第二治疗部分、第二靶向部分、第二可检测部分及其第二组合。在示例性实施方案中，在将SM或蛋白质b-SM复合物向需要通过这种给予
进行治疗干预的患者给予后，在体内形成这种二聚体。
进行治疗干预的患者给予后，在体内形成这种二聚体。
[0216] 本发明的示例性实施方案利用抗体作为蛋白质a和蛋白质b中的一种或两种。如本文所讨论，术语“抗体”以其最一般的意义使用。在本发明中使用的抗体可以是如本文所述的多种形式，包括如本文所述，在附图中描绘并且在本领域中一般性描述的传统完整抗体
以及抗体衍生物、片段和模拟物。
以及抗体衍生物、片段和模拟物。
[0217] 因此，在示例性实施方案中，本发明提供了一种抗体，其能够和蛋白质b与其同源SM结合配偶体之间形成的复合物特异性地结合。在各种实施方案中，所述抗体特异性地结
合至复合SM的至少一部分。在各种实施方案中，所述抗体结合至与SM复合的蛋白质b的至少一部分。在示例性实施方案中，所述抗体同时地结合至复合SM的至少一部分和结合SM的蛋
白质b的至少一部分二者。在各种实施方案中，这些结合模式中的一种或两种是抗体与蛋白质b-SM复合物特异性地结合的组分。在示例性实施方案中，蛋白质a在具有大量溶剂进入的b b
位置或表面处与蛋白质-SM复合物结合。存在几种方法可用于定义蛋白质-SM复合物中SM
的表面可及性。例如，蛋白质b-SM复合物的晶体结构可以用于计算复合物中SM的溶剂可及
性。图6提供了一个范例，其示出了基于复合物的已知结构，当结合蛋白质b时，各种SM的表面可及性的计算。推断结合的SM的溶剂可及性的其他方法包括NMR方法，以确定它们的结
b
构，或溶剂与SM的相互作用。表面可及性的另一个量度是蛋白质-SM复合物暴露于溶剂的
表面积的量。溶剂暴露表面积的示例性范围小于约 例如小于约 小于约
小于约 在示例性实施方案中，溶剂可及表面为约1至约 例如约1至
约 或约
合至复合SM的至少一部分。在各种实施方案中，所述抗体结合至与SM复合的蛋白质b的至少一部分。在示例性实施方案中，所述抗体同时地结合至复合SM的至少一部分和结合SM的蛋
白质b的至少一部分二者。在各种实施方案中，这些结合模式中的一种或两种是抗体与蛋白质b-SM复合物特异性地结合的组分。在示例性实施方案中，蛋白质a在具有大量溶剂进入的b b
位置或表面处与蛋白质-SM复合物结合。存在几种方法可用于定义蛋白质-SM复合物中SM
的表面可及性。例如，蛋白质b-SM复合物的晶体结构可以用于计算复合物中SM的溶剂可及
性。图6提供了一个范例，其示出了基于复合物的已知结构，当结合蛋白质b时，各种SM的表面可及性的计算。推断结合的SM的溶剂可及性的其他方法包括NMR方法，以确定它们的结
b
构，或溶剂与SM的相互作用。表面可及性的另一个量度是蛋白质-SM复合物暴露于溶剂的
表面积的量。溶剂暴露表面积的示例性范围小于约 例如小于约 小于约
小于约 在示例性实施方案中，溶剂可及表面为约1至约 例如约1至
约 或约
[0218] 传统的完整抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每一对具有一个“轻”链(通常具有的分子量为约25kDa)和一个“重”链(通常具有的分子量为约50-70kDa)。人轻链分类为κ和λ轻链。本发明提供了二聚体，其并入了通常基于具有数个亚类的IgG类别的双特异性抗体，所述亚类包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。
通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3使用得更频繁。应注意的是，IgG1具有不同的同种异型体，在
356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。在示例性实施方案中，蛋白质a和/或蛋白质b是产生的人源化Ab，当制成双特异性抗体的一部分时，将允许SM诱导Ab介导的细胞-细胞相互作用的形成，所述细胞如被工程化以在其表面上表达BCL-XL的T细胞和具有肿瘤特异性抗原的
癌细胞。
通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3使用得更频繁。应注意的是，IgG1具有不同的同种异型体，在
356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。在示例性实施方案中，蛋白质a和/或蛋白质b是产生的人源化Ab，当制成双特异性抗体的一部分时，将允许SM诱导Ab介导的细胞-细胞相互作用的形成，所述细胞如被工程化以在其表面上表达BCL-XL的T细胞和具有肿瘤特异性抗原的
癌细胞。
[0219] 如本文所用的“同种型”意指通过其恒定区的化学特征和抗原特征来定义的任何免疫球蛋白的亚类。应了解，治疗抗体也可以包含同种型和/或亚类的杂合体。例如，如通过引用并入的美国公开案2009/0163699所示，本发明涵盖IgG1/G2杂合体的pI工程化。
[0220] 条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区，在本领域和本文中所述可变区通常称为“Fv结构域”或“Fv区”。在所述可变区中，对于具有重链和轻链的V结构域中的每一个，三个环聚集以形成抗原结合位点。环中的每一个称为互补决定区(以下称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变异最为显著。“可变”是指可变区的某些区段的序列在抗体之间广泛不同。可变区内的变异性并非均匀分布。实际上，V区由具有15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变伸长区组成，所述伸长区由各自为9-15个
氨基酸长或更长的称为“高变区”的极具变异性的较短区隔开。
氨基酸长或更长的称为“高变区”的极具变异性的较短区隔开。
[0221] 每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR组成，其以下列次序从氨基末端排列至羧基末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
[0222] 高变区通常涵盖约24-34个氨基酸残基的氨基酸残基(LCDR1；“L”表示轻链)，在轻链可变区中为50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)并且在约31-35B左右(HCDR1；“H”表示重链)，在重链可变区中为50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版Public Health Service,National Institutes of
Health,Bethesda,Md.(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如轻链可变区中的残基26-
32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的残基26-32(HCDR1)、53-55
(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。以下描述本发明的特定CDR。
Health,Bethesda,Md.(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如轻链可变区中的残基26-
32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的残基26-32(HCDR1)、53-55
(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。以下描述本发明的特定CDR。
[0223] 如本领域技术人员将理解的，不同编号系统中CDR的确切编号和位置可以不同。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开内容包括相关联(固有)CDR的公开内容。因此，每个可变重链区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个可变轻链区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。
[0224] 贯穿本说明书，当提及可变结构域中的残基(近似地，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统，对于Fc区使用EU编号系统(例如
Kabat等人,同上(1991))。
Kabat等人,同上(1991))。
[0225] 本发明提供了大量不同的CDR组。在这种情况下，“全CDR组”包括三个可变轻链CDR和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以是更大的可变轻或可变重链结构域的一部分。此外，如本文更全面概述的，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重和可变轻链结构域可以在单独的多肽链上，或者在scFv序列的情况下，在单个多肽链上。
[0226] CDR促成抗体的抗原结合位点、或更特别是表位结合位点的形成。“表位”是指与抗体分子可变区中的称为抗体互补位(paratope)的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是成组的如氨基酸或糖侧链的分子，并且通常具有特定结构特征，以及特定电荷特征。
单一抗原可以具有多于一个表位。示例性表位是由SM与蛋白质b结合形成的复合物形成的
表位。在采用ABT-737作为表位的一部分的示例性实施方案中，已经证明相关类似物ABT-
263不会导致二聚体的形成，从而证明SM的至少一部分是蛋白质a结合位点的组分。
单一抗原可以具有多于一个表位。示例性表位是由SM与蛋白质b结合形成的复合物形成的
表位。在采用ABT-737作为表位的一部分的示例性实施方案中，已经证明相关类似物ABT-
263不会导致二聚体的形成，从而证明SM的至少一部分是蛋白质a结合位点的组分。
[0227] 表位可包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和并不直接涉及结合的其他氨基酸残基，如通过特异抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基是在特异抗原结合肽的占位区域(footprint)内。在本发明的化合物和方法中
使用的示例性表位包括由蛋白质b结合SM形成的那些结构。
使用的示例性表位包括由蛋白质b结合SM形成的那些结构。
[0228] 表位可以是构象的或线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象表位和非构象
表位的差别可能在于：在变性溶剂的存在下，对构象表位(而不是非构象表位)的结合丧失。
表位的差别可能在于：在变性溶剂的存在下，对构象表位(而不是非构象表位)的结合丧失。
[0229] 表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫测定中进行验证，所述免疫测定示出一种抗体阻断
另一种抗体结合至靶抗原的能力，所述免疫测定例如“分箱(binning)”。如下所概述，本发明不仅包括列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争结合由列举的抗原结合结构域结合
的表位的那些结构域和抗体。
另一种抗体结合至靶抗原的能力，所述免疫测定例如“分箱(binning)”。如下所概述，本发明不仅包括列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争结合由列举的抗原结合结构域结合
的表位的那些结构域和抗体。
[0230] 每条链的羧基末端部分限定恒定区，主要负责效应子功能。Kabat等人收集了重链和轻链的可变区的许多一级序列。基于序列保守度，Kabat等人将单独的一级序列分为CDR
和框架并将其制成列表(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版,NIH
publication,第91-3242号,E.A.Kabat等人，通过引用全部并入)。
和框架并将其制成列表(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版,NIH
publication,第91-3242号,E.A.Kabat等人，通过引用全部并入)。
[0231] 示例性AbCID
[0232] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含Bcl-xL的ABT-737结合结构域和(b)第二CID组分，其包含能够和ABT-737与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重
链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示
的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示
的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
[0233] 表1.Bcl-xL+ABT-737
[0234]
[0235]
[0236] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0237] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含Bcl-2的ABT-199结合结构域和(b)第二CID组分，其包含能够和ABT-199与
第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重
链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示
的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重
链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示
的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
[0238] 表2.Bcl-2+ABT-199
[0239]
[0240]
[0241] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0242] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含Bcl-2的ABT-263结合结构域和(b)第二CID组分，其包含能够和ABT-263与
第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重
链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示
的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重
链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示
的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
[0243] 表3.Bcl-2+ABT-263
[0244]
[0245] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0246] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含cIAP1的LCL161结合结构域和(b)第二CID组分，其包含能够和LCL161与第
一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重链
可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的
HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源
性的变体。
一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重链
可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的
HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源
性的变体。
[0247] 表4.cIAP1+LCL161
[0248]
[0249] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0250] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含cIAP1的GDC-0152结合结构域和(b)第二CID组分，其包含能够和GDC-0152
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所
示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所
示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
[0251] 表5.cIAP1+GDC-0152
[0252]
[0253]
[0254] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0255] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含cIAP1的AT406结合结构域和(b)第二CID组分，其包含能够和AT406与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重链可
变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的
变体。
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重链可
变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的
变体。
[0256] 表6.cIAP1+AT406
[0257]
[0258] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0259] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含cIAP1的CUDC-427结合结构域和(b)第二CID组分，其包含能够和CUDC-427
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所
示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含
重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所
示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
[0260] 表7.cIAP1+CUDC-427
[0261]
[0262] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0263] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述AbCID包含(a)第一CID组分，其包含FKBP的雷帕霉素(SLF)结合结构域的合成配体，其中SLF具有式(I)的结构：
[0264]
[0265] 和(b)第二CID组分，其包含能够和SLF与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同
源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列或其与
SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列或其与
SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0266] 表8.FKBP+SLF
[0267]
[0268] 对于所有克隆：LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0269] 在一些实施方案中，根据本文所述的AbCID中的任一种，所述ABCID包含(a)第一CID组分，其包含甲氨蝶呤结合型Fab，其中甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-
CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，和(b)第二CID组分，其包含能够和甲氨蝶呤与第
一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重链
可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的
HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型
Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，和(b)第二CID组分，其包含能够和甲氨蝶呤与第
一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含重链
可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的
HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型
Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
[0270] 表9.Fab+甲氨蝶呤
[0271]
[0272] LC-CDR1-SEQ ID NO:310，LC-CDR2–SEQ ID NO:311
[0273] 系统
[0274] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核酸，所述第一化学诱导二聚体(CID)组分包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分(这
样的第一结合部分在本文中也称为蛋白质b)；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部
分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含
(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分(这样的第二结合
部分在本文中也称为蛋白质a)；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二
结合部分特异地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点。
在一些实施方案中，所述系统进一步包含小分子，其中第二CID组分在包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点处结合至小分子与第一CID组分之间的复合
物。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包含小分子的
至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
样的第一结合部分在本文中也称为蛋白质b)；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部
分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含
(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分(这样的第二结合
部分在本文中也称为蛋白质a)；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二
结合部分特异地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点。
在一些实施方案中，所述系统进一步包含小分子，其中第二CID组分在包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点处结合至小分子与第一CID组分之间的复合
物。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包含小分子的
至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
[0275] 在一些实施方案中，根据本文所述的系统中的任一种，其中第二结合部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点，第一结合部分
是特异性地结合小分子的第一抗体部分。在一些实施方案中，所述小分子是甲氨蝶呤。在一些实施方案中，特异性地结合甲氨蝶呤的第一抗体部分是甲氨蝶呤结合型Fab。例如，在一些实施方案中，第一抗体部分是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所
述的甲氨蝶呤结合型Fab。在一些实施方案中，第一抗体部分是甲氨蝶呤结合型Fab，其包含一个或多个来自Gayda等人描述的甲氨蝶呤结合型Fab的CDR。在一些实施方案中，第一抗体部分是甲氨蝶呤结合型Fab，其包含每个来自Gayda等人描述的甲氨蝶呤结合型Fab的CDR。
在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab包含分别含有SEQ ID NO:318、319、320、321、322和
323的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，或其具有至少85％同源性的变体。
是特异性地结合小分子的第一抗体部分。在一些实施方案中，所述小分子是甲氨蝶呤。在一些实施方案中，特异性地结合甲氨蝶呤的第一抗体部分是甲氨蝶呤结合型Fab。例如，在一些实施方案中，第一抗体部分是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所
述的甲氨蝶呤结合型Fab。在一些实施方案中，第一抗体部分是甲氨蝶呤结合型Fab，其包含一个或多个来自Gayda等人描述的甲氨蝶呤结合型Fab的CDR。在一些实施方案中，第一抗体部分是甲氨蝶呤结合型Fab，其包含每个来自Gayda等人描述的甲氨蝶呤结合型Fab的CDR。
在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab包含分别含有SEQ ID NO:318、319、320、321、322和
323的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，或其具有至少85％同源性的变体。
[0276] 在一些实施方案中，根据本文所述的系统中的任一种，其中第二结合部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点，第一结合部分
源自小分子的天然存在的结合配偶体或其小分子结合变体。在一些实施方案中，天然存在
的结合配偶体是Bcl-2、Bcl-xL、FK506结合蛋白(FKBP)或细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-2，并且小分子是ABT-199、ABT-263或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-xL，并且小分子是ABT-737或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是FKBP，并且小分子是具有式(I)的结构的雷帕霉素(SLF)的合成配体或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是
cIAP1，并且小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427、比利那潘(Birinapant)或其类似物。
源自小分子的天然存在的结合配偶体或其小分子结合变体。在一些实施方案中，天然存在
的结合配偶体是Bcl-2、Bcl-xL、FK506结合蛋白(FKBP)或细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-2，并且小分子是ABT-199、ABT-263或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是Bcl-xL，并且小分子是ABT-737或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是FKBP，并且小分子是具有式(I)的结构的雷帕霉素(SLF)的合成配体或其类似物。在一些实施方案中，天然存在的结合配偶体是
cIAP1，并且小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427、比利那潘(Birinapant)或其类似物。
[0277] 在一些实施方案中，根据本文所述的系统中的任一种，其中第二结合部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点，第二结合部分
是特异性地结合化学表位的抗体部分，所述化学表位包含小分子的至少一部分和第一结合
部分的一部分。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的
复合物的位点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包
含小分子的至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
是特异性地结合化学表位的抗体部分，所述化学表位包含小分子的至少一部分和第一结合
部分的一部分。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的
复合物的位点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包
含小分子的至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
[0278] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，第二CID组分结合至第一CID组分和小分子的复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离第一CID组分和游离
小分子中的每一个的Kd的约1/250(如不超过约1/300、1/350、1/400、1/450、1/500、1/600、
1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400或1/1500或更少中的任一个)。
小分子中的每一个的Kd的约1/250(如不超过约1/300、1/350、1/400、1/450、1/500、1/600、
1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400或1/1500或更少中的任一个)。
[0279] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)Bcl-xL的ABT-737结合结构域
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-737与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表1的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-737与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表1的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
[0280] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)Bcl-2的ABT-199结合结构域
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-199与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表2的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-199与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表2的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
[0281] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)Bcl-2的ABT-263结合结构域
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-263与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表3的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和ABT-263与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表3的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少
85％同源性的变体。
[0282] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)FKBP的雷帕霉素(SLF)结合结
构域的合成配体和(ii)第一衔接子部分，其中SLF具有式(I)的结构；和(b)第二CID组分或
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和SLF与第一CID
组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的
抗体部分包含根据表4的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源
性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
构域的合成配体和(ii)第一衔接子部分，其中SLF具有式(I)的结构；和(b)第二CID组分或
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和SLF与第一CID
组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的
抗体部分包含根据表4的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源
性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0283] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的GDC-0152结合结构域
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和GDC-0152与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表5的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至
少85％同源性的变体。
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和GDC-0152与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表5的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至
少85％同源性的变体。
[0284] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的LCL161结合结构域和
(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和LCL161与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分
和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表6的重链互补决定区和轻
链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和LCL161与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分
和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表6的重链互补决定区和轻
链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％
同源性的变体。
[0285] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的AT406结合结构域和
(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和AT406与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分
和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表7的重链互补决定区和轻
链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同
源性的变体。
(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和AT406与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分
和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表7的重链互补决定区和轻
链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同
源性的变体。
[0286] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)cIAP1的CUDC-427结合结构域
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和CUDC-427与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表8的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至
少85％同源性的变体。
和(ii)第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)能够和CUDC-427与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体
部分和(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表8的重链互补决定区
和轻链互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至
少85％同源性的变体。
[0287] 在一些实施方案中，本文提供了一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含(i)甲氨蝶呤结合型Fab和(ii)第
一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二
CID组分包含(i)能够和甲氨蝶呤与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和
(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表9的重链互补决定区和轻链
互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、
319、320、321、322和323的氨基酸序列。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二
CID组分包含(i)能够和甲氨蝶呤与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分和
(ii)第二衔接子部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表9的重链互补决定区和轻链
互补决定区(CDR)，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、
319、320、321、322和323的氨基酸序列。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
[0288] 转录调节因子
[0289] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，(a)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二衔接子部分包含转录调节结构域；或者(b)第二衔接子部分包含DNA
结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分
被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录。在一些
实施方案中，第一CID组分进一步包含核定位信号，并且第二CID组分进一步包含核定位信
号，在一些实施方案中，(i)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(ii)转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能够下调靶基因的转录。在一些实施方案中，转录调节结构域是VPR转录激活结构域(参见例如，Chavez等人,
Nat.Methods,12:326-328(2015))。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自天然存在的转
录调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死
亡的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自催化性死亡的Cas9(dCas9)。可以用于能够调节基因转录的CID的衔接子部分的例子，如dCas9，可以在例如美国专利号8,993,233中找
到。
结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分
被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录。在一些
实施方案中，第一CID组分进一步包含核定位信号，并且第二CID组分进一步包含核定位信
号，在一些实施方案中，(i)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(ii)转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能够下调靶基因的转录。在一些实施方案中，转录调节结构域是VPR转录激活结构域(参见例如，Chavez等人,
Nat.Methods,12:326-328(2015))。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自天然存在的转
录调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死
亡的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自催化性死亡的Cas9(dCas9)。可以用于能够调节基因转录的CID的衔接子部分的例子，如dCas9，可以在例如美国专利号8,993,233中找
到。
[0290] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，(a)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二衔接子部分包含转录调节结构域；或者(b)第二衔接子部分包含DNA
结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分
被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录，其中转
录调节结构域是VPR转录激活结构域，并且DNA结合结构域源自dCas9。
结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分
被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录，其中转
录调节结构域是VPR转录激活结构域，并且DNA结合结构域源自dCas9。
[0291] 杀死开关
[0292] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与靶细胞相关联的CID时，CID能够诱导靶细
胞死亡。在一些实施方案中，第一衔接子部分和第二衔接子部分一起能够诱导靶细胞凋亡。
在一些实施方案中，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。在一些实施方案中，靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。可以用于能够诱导细胞死亡的CID的衔接子部分的例子可以在例
如美国专利公开号US 20160175359和US 20160166613中找到。
胞死亡。在一些实施方案中，第一衔接子部分和第二衔接子部分一起能够诱导靶细胞凋亡。
在一些实施方案中，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。在一些实施方案中，靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。可以用于能够诱导细胞死亡的CID的衔接子部分的例子可以在例
如美国专利公开号US 20160175359和US 20160166613中找到。
[0293] 通过用可广泛获得的小分子对促凋亡蛋白进行二聚化来控制细胞凋亡，应允许实验者或临床医生紧密且快速地控制展示不希望效果的基于细胞的植入物的活力。这些效果
的例子包括但不限于，针对脱靶组织或植入物过度、不受控制的生长或转移的移植物抗宿
主(GvH)免疫应答，或CAR T细胞介导的细胞因子释放综合征。细胞凋亡的快速诱导将严重
削弱不需要的细胞的功能，并允许吞噬细胞如巨噬细胞自然清除死亡细胞，而没有过度炎
症。细胞凋亡受到严格的调控，并且自然地使用支架，如Apaf-1、CRADD/RAIDD或FADD/
Mort1，以使半胱天冬酶寡聚和激活，所述半胱天冬酶可以最终杀死细胞。Apaf-1可以将凋亡蛋白酶半胱天冬酶-9组装成潜在复合物，然后在支架上募集细胞色素C时形成活性寡聚
凋亡体。关键事件是支架单元的寡聚化导致半胱天冬酶的二聚化和激活。类似的衔接子，如CRADD，可以使半胱天冬酶-2寡聚，从而导致细胞凋亡。本文提供的组合物和方法使用例如AbCID，其允许在用小分子募集时作为衔接子部分存在的半胱天冬酶单元自发二聚化和激
活。
的例子包括但不限于，针对脱靶组织或植入物过度、不受控制的生长或转移的移植物抗宿
主(GvH)免疫应答，或CAR T细胞介导的细胞因子释放综合征。细胞凋亡的快速诱导将严重
削弱不需要的细胞的功能，并允许吞噬细胞如巨噬细胞自然清除死亡细胞，而没有过度炎
症。细胞凋亡受到严格的调控，并且自然地使用支架，如Apaf-1、CRADD/RAIDD或FADD/
Mort1，以使半胱天冬酶寡聚和激活，所述半胱天冬酶可以最终杀死细胞。Apaf-1可以将凋亡蛋白酶半胱天冬酶-9组装成潜在复合物，然后在支架上募集细胞色素C时形成活性寡聚
凋亡体。关键事件是支架单元的寡聚化导致半胱天冬酶的二聚化和激活。类似的衔接子，如CRADD，可以使半胱天冬酶-2寡聚，从而导致细胞凋亡。本文提供的组合物和方法使用例如AbCID，其允许在用小分子募集时作为衔接子部分存在的半胱天冬酶单元自发二聚化和激
活。
[0294] 使用本文提供的某些组合物和方法，只有当存在小分子以允许AbCID的半胱天冬酶融合的CID组分二聚化时，才发生半胱天冬酶激活。在这些方法中，这两种AbCID组分必须作为二聚体单元而不是单体存在，以驱动半胱天冬酶二聚化(例如半胱天冬酶-9)。CID组分可以作为可溶性实体定位在胞质溶胶中，或者通过靶向信号存在于特定的亚细胞区域，如
质膜中。用于激活细胞凋亡的组分和降解细胞的下游组分由所有细胞和跨物种共享。关于
半胱天冬酶-9的激活，这些方法可以广泛用于细胞系、正常原代细胞，例如像但不限于，T细胞或细胞移植物。半胱天冬酶-9多肽可以是全长的或截短的。
质膜中。用于激活细胞凋亡的组分和降解细胞的下游组分由所有细胞和跨物种共享。关于
半胱天冬酶-9的激活，这些方法可以广泛用于细胞系、正常原代细胞，例如像但不限于，T细胞或细胞移植物。半胱天冬酶-9多肽可以是全长的或截短的。
[0295] 除了半胱天冬酶-9之外，可以用作本文所述AbCID的衔接子部分的半胱天冬酶多肽包括例如半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-8。对这些半胱天冬酶多肽的讨论
可以在例如MacCorkle,R.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)95:3655-3660；和
Fan,L.等人(1999)Human Gene Therapy 10:2273-2285)中找到。
可以在例如MacCorkle,R.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)95:3655-3660；和
Fan,L.等人(1999)Human Gene Therapy 10:2273-2285)中找到。
[0296] 嵌合抗原受体(CAR)
[0297] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与T细胞相关联的CID时，CID是能够在结合
靶抗原后激活T细胞的异二聚体CAR。
靶抗原后激活T细胞的异二聚体CAR。
[0298] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，(a)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；或者(b)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质
共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。参见例如图4A。在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部分的CID组分进一步包含分泌信号肽。
共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。参见例如图4A。在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部分的CID组分进一步包含分泌信号肽。
[0299] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，(a)第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞外抗原结合部分；并且第二衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；或者(b)第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞外抗原结合部分；并且第一衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号
传导结构域；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。参见例如图4B。在一些实施方案中，第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
传导结构域；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。参见例如图4B。在一些实施方案中，第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
[0300] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；并且第二衔接子部分包含
(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；其中第一或第二
CID组分进一步包含与其结合部分相连的细胞外抗原结合部分；并且其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原。参见例如图4C。在一些实施方案中，第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；其中第一或第二
CID组分进一步包含与其结合部分相连的细胞外抗原结合部分；并且其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原。参见例如图4C。在一些实施方案中，第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
[0301] 可以用于CID以形成异二聚体CAR的衔接子部分的例子可以在例如美国专利号US 9587020中找到。
[0302] 在一些实施方案中，本文所述的AbCID可以存在于真核细胞(例如哺乳动物细胞)的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括但不限于细胞毒性细胞、T淋巴细胞、干细胞、干细胞的后代、祖细胞、祖细胞的后代和NK细胞。当存在于真核细胞的质膜中时，AbCID在以下物质的存在下是活性的：1)允许第一和第二CID组分二聚化的小分子；和2)结合细胞外抗原结合部分的因子。结合细胞外抗原结合结构域的因子可以是可溶性(例如，不结合细胞)因子；
存在于细胞如靶细胞表面上的因子；呈现在固体表面上的因子；存在于脂双层中的因子；
等。
存在于细胞如靶细胞表面上的因子；呈现在固体表面上的因子；存在于脂双层中的因子；
等。
[0303] 在一些实施方案中，当本公开文本的AbCID存在于真核细胞的质膜中并且被小分子激活时，导致细胞对靶细胞具有细胞毒性活性，所述靶细胞在其细胞表面上表达细胞外
抗原结合结构域结合的抗原。例如，当真核细胞是细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)时，本公开文本的AbCID在存在于所述细胞的质膜中并且被小分子激活时增加所
述细胞对靶细胞的细胞毒性活性，所述靶细胞在其细胞表面上表达细胞外抗原结合结构域
结合的抗原。例如，当真核细胞是NK细胞或T淋巴细胞时，与不存在小分子时细胞的细胞毒性活性相比，本公开文本的AbCID在存在于所述细胞的质膜中时并且被小分子激活时，将细胞的细胞毒性活性增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍或超过10倍。
抗原结合结构域结合的抗原。例如，当真核细胞是细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)时，本公开文本的AbCID在存在于所述细胞的质膜中并且被小分子激活时增加所
述细胞对靶细胞的细胞毒性活性，所述靶细胞在其细胞表面上表达细胞外抗原结合结构域
结合的抗原。例如，当真核细胞是NK细胞或T淋巴细胞时，与不存在小分子时细胞的细胞毒性活性相比，本公开文本的AbCID在存在于所述细胞的质膜中时并且被小分子激活时，将细胞的细胞毒性活性增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍或超过10倍。
[0304] 在一些实施方案中，本公开文本的AbCID在存在于真核细胞的质膜中时并且被结合细胞外抗原结合结构域和小分子的抗原激活时，可以导致其他CAR激活相关事件，如增
殖、扩增、细胞内信号传导调节、细胞分化或细胞死亡。
殖、扩增、细胞内信号传导调节、细胞分化或细胞死亡。
[0305] 适用于本公开文本的AbCID的细胞外抗原结合结构域可以是任何抗原结合多肽，其众多种类是本领域已知的。在一些情况下，细胞外抗原结合结构域是单链Fv(scFv)。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼抗体可变结构域)和人源化形式、IgNAR VH(鲨鱼抗
体可变结构域)和人源化形式、sdAb VH(单链结构域抗体可变结构域)和“骆驼化”抗体可变结构域适合使用。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双结构域TCR)也适合使用。
体可变结构域)和人源化形式、sdAb VH(单链结构域抗体可变结构域)和“骆驼化”抗体可变结构域适合使用。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双结构域TCR)也适合使用。
[0306] 适用于本公开文本AbCID的细胞外抗原结合结构域可以具有多种抗原结合特异性。在一些情况下，细胞外抗原结合结构域对于由癌细胞表达(合成)的抗原(即癌细胞相关抗原)中存在的表位是特异性的。癌细胞相关抗原可以是与例如乳腺癌细胞、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞(例如小细胞肺癌细胞)、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如小细胞肺癌细胞)、黑素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、结直肠癌细胞等相关联的抗原。
癌细胞相关抗原也可以由非癌细胞表达。
癌细胞相关抗原也可以由非癌细胞表达。
[0307] 双特异性T细胞接合器
[0308] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID是能够将T细胞重引导至靶细胞
的异二聚体双特异性T细胞接合器。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者(b)第二衔接子部分包含T
细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案
中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。可以用于CID以形成异二聚体双特异性T细胞接合器的衔接子部分的例子可以在
例如美国专利公开号US20140050660中找到。
的异二聚体双特异性T细胞接合器。在一些实施方案中，(a)第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者(b)第二衔接子部分包含T
细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案
中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。可以用于CID以形成异二聚体双特异性T细胞接合器的衔接子部分的例子可以在
例如美国专利公开号US20140050660中找到。
[0309] T细胞调节
[0310] 在一些实施方案中，根据本文所述系统中的任一种，第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与免疫细胞相关联的CID时，CID是能够调节
免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子。在一些实施方案中，第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。可以用于CID以形成能够调节免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子的衔接子部分
的例子可以在例如美国专利公开号20140286987中找到。
免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子。在一些实施方案中，第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。可以用于CID以形成能够调节免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子的衔接子部分
的例子可以在例如美国专利公开号20140286987中找到。
[0311] 在一些实施方案中，本文所述AbCID的衔接子部分包含一种或多种共刺激多肽，例如像CD28和4-1BB，具有或不具有CD3ζ链，以实现AbCID依赖性增殖和共刺激。AbCID可以单独用于提供共刺激，并增加T细胞免疫应答。使用此类AbCID，可以用编码AbCID的DNA转染或转化T细胞群体，例如具有非特异性靶标的群体，然后向受试者给予以增强一般免疫应答。
这些AbCID也可以和CAR一起在细胞中表达。在此类方法中，诱导型AbCID与CAR结合使用，从而将CAR信号传导分成两个独立的功能。这第二个功能是由CAR提供的，为工程化T细胞提供抗原特异性细胞毒性。
这些AbCID也可以和CAR一起在细胞中表达。在此类方法中，诱导型AbCID与CAR结合使用，从而将CAR信号传导分成两个独立的功能。这第二个功能是由CAR提供的，为工程化T细胞提供抗原特异性细胞毒性。
[0312] 共刺激多肽分子能够通过激活参与细胞存活和增殖的信号传导通路来扩增细胞介导的免疫应答。预期的共刺激蛋白包括例如肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员(即CD40、RANK/TRANCE-R、OX40和4-1BB)和CD28家族成员(CD28、ICOS)。共刺激蛋白可以包括例如
CD28、4-1BB和OX40。刺激蛋白可以包括例如CD3ζ链。多于一种的共刺激多肽或共刺激多肽细胞质区可以用于本文所述的诱导型AbCID。例如，AbCID可以包含CD28细胞质多肽和4-1BB细胞质多肽。或者，例如，AbCID可以包含CD28细胞质多肽和OX40细胞质多肽。或者，例如，AbCID可以进一步包含CD3ζ结构域多肽。
CD28、4-1BB和OX40。刺激蛋白可以包括例如CD3ζ链。多于一种的共刺激多肽或共刺激多肽细胞质区可以用于本文所述的诱导型AbCID。例如，AbCID可以包含CD28细胞质多肽和4-1BB细胞质多肽。或者，例如，AbCID可以包含CD28细胞质多肽和OX40细胞质多肽。或者，例如，AbCID可以进一步包含CD3ζ结构域多肽。
[0313] 产生AbCID的方法
[0314] 在一些实施方案中，本文提供了一种从结合分子文库中选择结合部分的方法，其中结合部分特异性地结合小分子与同源结合部分之间的复合物，所述方法包括：(a)对结合部分输入组筛选出在小分子不存在时不与同源结合部分结合的结合部分，从而产生反选择
的结合部分组；和(b)对结合部分输入组筛选出和小分子与同源结合部分的复合物结合的
结合部分，从而产生阳性选择的结合部分组；和(c)进行一轮或多轮筛选，其中每轮筛选包括步骤(a)的筛选和步骤(b)的筛选，使得产生和小分子与同源结合部分之间的复合物特异
性地结合的结合部分组。在一些实施方案中，所述方法包括两轮或更多轮筛选，其中(1)对于第一轮筛选，步骤(a)的结合部分输入组是结合分子文库，(2)对于每轮筛选，步骤(b)的所述结合部分输入组是来自给定轮筛选的步骤(a)的所述反选择的结合部分组，(3)对于第
一轮筛选后的每轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是来自前一轮筛选的步骤(b)的所
述阳性选择的结合部分组，以及(4)对于最后一轮筛选，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组是步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组。在一些实施方
案中，所述方法包含至少2(如至少2、3、4、5、6或更多中的任一个)轮选择。在一些实施方案中，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的至少一个结合
部分结合至复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部
分中的每一个的Kd的约1/250(如不超过约1/300、1/350、1/400、1/450、1/500、1/600、1/
700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400或1/1500或更少中的任一个)。
在一些实施方案中，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中
的每个结合部分结合至复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离
同源结合部分中的每一个的Kd的约1/250(如不超过约1/300、1/350、1/400、1/450、1/500、
1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400或1/1500或更少中的任一个)。在一些实施方案中，结合分子文库是抗体文库、DARPin文库、纳米抗体文库或适体文库。在一些实施方案中，结合分子文库是抗体文库。在一些实施方案中，抗体文库是噬菌体展示的Fab文库。
的结合部分组；和(b)对结合部分输入组筛选出和小分子与同源结合部分的复合物结合的
结合部分，从而产生阳性选择的结合部分组；和(c)进行一轮或多轮筛选，其中每轮筛选包括步骤(a)的筛选和步骤(b)的筛选，使得产生和小分子与同源结合部分之间的复合物特异
性地结合的结合部分组。在一些实施方案中，所述方法包括两轮或更多轮筛选，其中(1)对于第一轮筛选，步骤(a)的结合部分输入组是结合分子文库，(2)对于每轮筛选，步骤(b)的所述结合部分输入组是来自给定轮筛选的步骤(a)的所述反选择的结合部分组，(3)对于第
一轮筛选后的每轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是来自前一轮筛选的步骤(b)的所
述阳性选择的结合部分组，以及(4)对于最后一轮筛选，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组是步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组。在一些实施方
案中，所述方法包含至少2(如至少2、3、4、5、6或更多中的任一个)轮选择。在一些实施方案中，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的至少一个结合
部分结合至复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部
分中的每一个的Kd的约1/250(如不超过约1/300、1/350、1/400、1/450、1/500、1/600、1/
700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400或1/1500或更少中的任一个)。
在一些实施方案中，和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中
的每个结合部分结合至复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离
同源结合部分中的每一个的Kd的约1/250(如不超过约1/300、1/350、1/400、1/450、1/500、
1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400或1/1500或更少中的任一个)。在一些实施方案中，结合分子文库是抗体文库、DARPin文库、纳米抗体文库或适体文库。在一些实施方案中，结合分子文库是抗体文库。在一些实施方案中，抗体文库是噬菌体展示的Fab文库。
[0315] 在一些实施方案中，本文提供了一种构建体，其包含和小分子与结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，所述构建体通过包括以下步骤的方法制备：(A)根据本文所述的方法中的任一种，从抗体文库中选择和小分子与结合部分之间的复合物特异性地结
合的抗体部分；和(B)提供包含(A)的抗体部分中的一种的构建体。在一些实施方案中，所述构建体是根据本文所述的实施方案中的任一种的AbCID的第二CID组分，并且AbCID的第一
CID组分包含所述结合部分。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和结合部分的一部分的复合物的位点。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部
分和结合部分的一部分的复合物的位点是小分子与小分子的结合部分的结合位点之间的
界面，所述界面包含小分子的至少一个原子和结合部分的一个原子。
合的抗体部分；和(B)提供包含(A)的抗体部分中的一种的构建体。在一些实施方案中，所述构建体是根据本文所述的实施方案中的任一种的AbCID的第二CID组分，并且AbCID的第一
CID组分包含所述结合部分。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和结合部分的一部分的复合物的位点。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部
分和结合部分的一部分的复合物的位点是小分子与小分子的结合部分的结合位点之间的
界面，所述界面包含小分子的至少一个原子和结合部分的一个原子。
[0316] 在一些实施方案中，本文提供了一种根据本文所述实施方案中任一种所述的系统，其中第二结合部分是通过包括以下步骤的方法选择的抗体部分：(A)根据本文所述的方法中的任一种，从抗体文库中选择和小分子与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的
抗体部分；和(B)选择待成为(A)的抗体部分中的一种的第二结合部分。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包含小分子的
至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
抗体部分；和(B)选择待成为(A)的抗体部分中的一种的第二结合部分。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点。在一些实施方案中，包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位
点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之间的界面，所述界面包含小分子的
至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
[0317] 使用AbCID的方法
[0318] 转录调节
[0319] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节细胞中靶基因表达的方法，其包括在细胞中表达根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组分(其中CID能够
调节靶基因转录)，并修改细胞中小分子的量以调节靶基因表达。
调节靶基因转录)，并修改细胞中小分子的量以调节靶基因表达。
[0320] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节细胞中靶基因表达的方法，其包括：(A)在细胞中表达(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在
第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第
一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异
性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二衔接子部分包含转录调节结构域；或者(2)第二衔
接子部分包含DNA结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组
分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基
因的转录；和(B)修改细胞中小分子的量以调节靶基因表达。在一些实施方案中，第一CID组分进一步包含核定位信号，并且第二CID组分进一步包含核定位信号。在一些实施方案中，(i)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(ii)转录调
节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能够下调靶基因的转录。在一些实施方案中，转录调节结构域是VPR转录激活结构域在一些实施方案中，DNA结合结构域源自天然存在的转录
调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡
的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自催化性死亡的Cas9(dCas9)。
第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第
一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异
性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二衔接子部分包含转录调节结构域；或者(2)第二衔
接子部分包含DNA结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组
分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基
因的转录；和(B)修改细胞中小分子的量以调节靶基因表达。在一些实施方案中，第一CID组分进一步包含核定位信号，并且第二CID组分进一步包含核定位信号。在一些实施方案中，(i)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(ii)转录调
节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能够下调靶基因的转录。在一些实施方案中，转录调节结构域是VPR转录激活结构域在一些实施方案中，DNA结合结构域源自天然存在的转录
调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡
的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自催化性死亡的Cas9(dCas9)。
[0321] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-xL的ABT-737结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-
737与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变
结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性
的变体。
737与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变
结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性
的变体。
[0322] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-199结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-199与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0323] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-263结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-263与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0324] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的LCL161结合结构域，并且第二结合部分包含能够和LCL161与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0325] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的GDC-0152结合结构域，并且第二结合部分包含能够和GDC-
0152与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变
结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源
性的变体。
0152与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变
结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源
性的变体。
[0326] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的AT406结合结构域，并且第二结合部分包含能够和AT406与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0327] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的CUDC-427结合结构域，并且第二结合部分包含能够和CUDC-
427与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变
结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源
性的变体。
427与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变
结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-
CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源
性的变体。
[0328] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含FKBP的SLF结合结构域，并且第二结合部分包含能够和SLF与第一结
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的
氨基酸序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的
氨基酸序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0329] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节靶基因在细胞中表达的方法中的任一种，第一结合部分包含甲氨蝶呤结合型Fab，其中所述甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-
CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和
323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，并且第二结合部分包含能够和甲氨蝶
呤与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结
构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR
和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和
323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，并且第二结合部分包含能够和甲氨蝶
呤与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结
构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR
和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
[0330] 细胞存活
[0331] 在一些实施方案中，本文提供了一种控制个体中靶细胞存活的方法，其包括：(A)在靶细胞中表达根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组分，其中
CID能够诱导靶细胞死亡；和(B)以有效(I)杀死预定量的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予小分子。
CID能够诱导靶细胞死亡；和(B)以有效(I)杀死预定量的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予小分子。
[0332] 在一些实施方案中，本文提供了一种控制个体中靶细胞存活的方法，其包括：(A)在靶细胞中表达(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以
在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的
第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特
异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第一衔
接子部分和第二衔接子部分一起能够诱导靶细胞中的细胞凋亡；和(B)以有效(I)杀死预定
量的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。在一些实施方案中，靶细胞是个体中过继细胞疗法的一部分。
在一些实施方案中，靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的
第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特
异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第一衔
接子部分和第二衔接子部分一起能够诱导靶细胞中的细胞凋亡；和(B)以有效(I)杀死预定
量的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。在一些实施方案中，靶细胞是个体中过继细胞疗法的一部分。
在一些实施方案中，靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
[0333] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-xL的ABT-737结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-737与
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0334] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-199结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-199与
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0335] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-263结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-263与
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0336] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的LCL161结合结构域，并且第二结合部分包含能够和LCL161与第
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0337] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的GDC-0152结合结构域，并且第二结合部分包含能够和GDC-0152
与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含
SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的
变体。
与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含
SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的
变体。
[0338] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的AT406结合结构域，并且第二结合部分包含能够和AT406与第一
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:
317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:
317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0339] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的CUDC-427结合结构域，并且第二结合部分包含能够和CUDC-427
与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含
SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的
变体。
与第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构
域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-CDR和
LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含
SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的
变体。
[0340] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含FKBP的SLF结合结构域，并且第二结合部分包含能够和SLF与第一结合部
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变
结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基
酸序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变
结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基
酸序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0341] 在一些实施方案中，根据本文所述的控制个体中靶细胞存活的方法中的任一种，第一结合部分包含甲氨蝶呤结合型Fab，其中所述甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，并且第二结合部分包含能够和甲氨蝶呤与第
一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
[0342] 免疫调节
[0343] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予表达根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组分
的经修饰的T细胞，其中CID是对靶抗原具有特异性的异二聚体CAR，并且其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
的经修饰的T细胞，其中CID是对靶抗原具有特异性的异二聚体CAR，并且其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
[0344] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达(a)第一化学诱导二聚体(CID)组
分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结
合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结
合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺
激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部
分；或者(2)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域，并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部分的CID组分进一步包含分泌信号肽。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方
法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结
合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结
合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺
激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部
分；或者(2)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域，并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部分的CID组分进一步包含分泌信号肽。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方
法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
[0345] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部
分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和
(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部
分，并且其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原；和(C)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构
域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫应
答，同时对个体的副作用更少。
分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和
(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部
分，并且其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原；和(C)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构
域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫应
答，同时对个体的副作用更少。
[0346] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第
一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分，并且其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原；(B)向个体给予表达第二CID组分的经修饰的T细胞，所述第二
CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和
(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；
(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；和(C)以有效调节对靶细胞免
疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR
结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫
应答，同时对个体的副作用更少。
一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分，并且其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原；(B)向个体给予表达第二CID组分的经修饰的T细胞，所述第二
CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和
(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；
(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；和(C)以有效调节对靶细胞免
疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR
结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细胞的免疫
应答，同时对个体的副作用更少。
[0347] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组分，其
中CID是能够将T细胞重引导至靶细胞的异二聚体双特异性T细胞接合器；和(B)以有效调节
对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
中CID是能够将T细胞重引导至靶细胞的异二聚体双特异性T细胞接合器；和(B)以有效调节
对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
[0348] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用
以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分
的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物
特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者(2)第二衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合
部分；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案
中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常
规双特异性T细胞接合器(例如 )给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细
胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分
的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物
特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者(2)第二衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合
部分；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案
中，患病细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常
规双特异性T细胞接合器(例如 )给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细
胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
[0349] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中由T细胞介导的免疫应答的方法，其包括：(A)在T细胞中表达根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID
组分，其中CID是能够调节免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子；和(B)以有效调节由T细胞介导的免疫应答的方案向个体给予小分子。
组分，其中CID是能够调节免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子；和(B)以有效调节由T细胞介导的免疫应答的方案向个体给予小分子。
[0350] 在一些实施方案中，本文提供了一种调节个体中由T细胞介导的免疫应答的方法，其包括：(A)在T细胞中表达(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结
合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的
复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其
中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；和(B)以有效调节由T细胞介导的免疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信
号传导结构域的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地维持由T细胞介导的
免疫应答，同时对个体的副作用更少。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。
合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的
复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其
中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；和(B)以有效调节由T细胞介导的免疫应答的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信
号传导结构域的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地维持由T细胞介导的
免疫应答，同时对个体的副作用更少。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。
[0351] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-xL的ABT-737结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-737与第
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0352] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-199结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-199与第
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0353] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-263结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-263与第
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和
轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0354] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的LCL161结合结构域，并且第二结合部分包含能够和LCL161与第一
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:
317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:
317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0355] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的GDC-0152结合结构域，并且第二结合部分包含能够和GDC-0152与
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0356] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的AT406结合结构域，并且第二结合部分包含能够和AT406与第一结
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317
的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317
的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0357] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的CUDC-427结合结构域，并且第二结合部分包含能够和CUDC-427与
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
第一结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域
和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-CDR和LC-
CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0358] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含FKBP的SLF结合结构域，并且第二结合部分包含能够和SLF与第一结合部分
之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变结
构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸
序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变结
构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸
序列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0359] 在一些实施方案中，根据本文所述的调节个体中免疫应答的方法中的任一种，第一结合部分包含甲氨蝶呤结合型Fab，其中所述甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，并且第二结合部分包含能够和甲氨蝶呤与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人
Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人
Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
[0360] 细胞
[0361] 在一些方面，本文提供了工程化细胞，如工程化哺乳动物细胞(例如，T细胞)，其包含如本文所阐述和描述的AbCID的一种或多种组分。在一些实施方案中，AbCID包含第一CID组分和第二CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞包含第一CID组分和/或编码第一CID组分的核酸。在一些实施方案中，工程化细胞包含第二CID组分和/或编码二CID组分的核
酸。在一些实施方案中，工程化细胞包含i)第一CID组分和/或编码第一CID组分的核酸，和ii)第二CID组分和/或编码第二CID组分的核酸。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化T细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞是人的。
酸。在一些实施方案中，工程化细胞包含i)第一CID组分和/或编码第一CID组分的核酸，和ii)第二CID组分和/或编码第二CID组分的核酸。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化T细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞是人的。
[0362] 在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞包含AbCID的第一CID组分。在一些实施方案中，第一CID组分包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形
成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分。在一些实施方
案中，工程化细胞进一步包含AbCID的第二CID组分。在一些实施方案中，第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第
二结合部分的第二衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含AbCID的第二CID组
分。
成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分。在一些实施方
案中，工程化细胞进一步包含AbCID的第二CID组分。在一些实施方案中，第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第
二结合部分的第二衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含AbCID的第二CID组
分。
[0363] 在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞包含AbCID的第二CID组分。在一些实施方案中，第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第
二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含AbCID的第一CID组分。在一些实施方案中，第一CID组分包含(i)能够与小分
子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第
一结合部分的第一衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含AbCID的第一CID组
分。
二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含AbCID的第一CID组分。在一些实施方案中，第一CID组分包含(i)能够与小分
子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第
一结合部分的第一衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含AbCID的第一CID组
分。
[0364] 在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞包含编码AbCID的第一CID组分的核酸。在一些实施方案中，第一CID组分包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分。在
一些实施方案中，工程化细胞进一步包含第一CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含编码AbCID的第二CID组分的核酸。在一些实施方案中，第二CID组分包含(i)和小
分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合
部分的第二衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含第二CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码AbCID的第二CID组分的核酸。
一些实施方案中，工程化细胞进一步包含第一CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含编码AbCID的第二CID组分的核酸。在一些实施方案中，第二CID组分包含(i)和小
分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合
部分的第二衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含第二CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码AbCID的第二CID组分的核酸。
[0365] 在一些实施方案中，本文所述的工程化细胞包含编码AbCID的第二CID组分的核酸。在一些实施方案中，第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分。在一些实施方案
中，工程化细胞进一步包含第二CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含编码AbCID的第一CID组分的核酸。在一些实施方案中，第一CID组分包含(i)能够与小分子相互
作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合
部分的第一衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含第一CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码AbCID的第一CID组分的核酸。
中，工程化细胞进一步包含第二CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含编码AbCID的第一CID组分的核酸。在一些实施方案中，第一CID组分包含(i)能够与小分子相互
作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合
部分的第一衔接子部分。在一些实施方案中，工程化细胞进一步包含第一CID组分。在一些实施方案中，工程化细胞不包含编码AbCID的第一CID组分的核酸。
[0366] 在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，或能够分化成T细胞的前体细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是CD3+、CD8+和/或CD4+T淋巴细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其可以包括幼稚CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或大量(bulk)CD8+T细胞。
[0367] 可以根据已知技术收集淋巴细胞(T淋巴细胞)，并通过已知技术(如与抗体的亲和力结合，如流式细胞术和/或免疫磁性选择)富集或耗尽。在富集和/或耗尽步骤之后，可以根据对本领域技术人员来说清楚的已知技术或其变体进行所需T淋巴细胞的体外扩增。在
一些实施方案中，T细胞是从患者获得的自体T细胞。
一些实施方案中，T细胞是从患者获得的自体T细胞。
[0368] 例如，可以通过以下来扩增所需的T细胞群体或亚群：在体外向培养基中添加初始T淋巴细胞群体，并且然后向所述培养基中添加饲养细胞，如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得针对待扩增的初始群体中每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少5、10、20或40个或更多的PBMC饲养细胞)；并且孵育所述培养物(例如持续足以扩增T细胞数量的时间)。
非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用3000至3600拉德
范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些实施方案中，用3000、3100、3200、3300、
3400、3500或3600rad或任何所列值的任何两个端点之间的任何rad值的伽马射线辐照
PBMC，以防止细胞分裂。如果希望，可以颠倒向培养基中添加T细胞和饲养细胞的顺序。培养物通常可以在适用于T淋巴细胞生长的温度等条件下孵育。例如，对于人T淋巴细胞的生长，温度通常为至少25℃，优选至少30℃，更优选37℃。在一些实施方案中，人T淋巴细胞生长的温度是22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、37℃，或者任何所列值的任何两个端点之间的任何其他温度。
非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用3000至3600拉德
范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些实施方案中，用3000、3100、3200、3300、
3400、3500或3600rad或任何所列值的任何两个端点之间的任何rad值的伽马射线辐照
PBMC，以防止细胞分裂。如果希望，可以颠倒向培养基中添加T细胞和饲养细胞的顺序。培养物通常可以在适用于T淋巴细胞生长的温度等条件下孵育。例如，对于人T淋巴细胞的生长，温度通常为至少25℃，优选至少30℃，更优选37℃。在一些实施方案中，人T淋巴细胞生长的温度是22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、37℃，或者任何所列值的任何两个端点之间的任何其他温度。
[0369] 在分离出T淋巴细胞后，细胞毒性和辅助性T淋巴细胞二者可以在扩增前或扩增后分选为幼稚、记忆和效应T细胞亚群。
[0370] 可以通过使用标准方法获得CD8+细胞。在一些实施方案中，通过鉴定与每种类型CD8+细胞相关联的细胞表面抗原，CD8+细胞被进一步分选为幼稚、中央记忆和效应记忆细
胞。在一些实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚组中。
在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实
施方案中，中央记忆TCM的表型标记物的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或
CD127，并且对颗粒酶B为阴性或低。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应子TE对CD62L、CCR7、CD28和/或CD127为阴性，并且对颗粒酶B和/或穿孔素为阳性。在一些实施方案中，幼稚CD8+T淋巴细胞的特征在于幼稚T细胞的表型标记物(包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和/或CD45RA)的表达。
胞。在一些实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚组中。
在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实
施方案中，中央记忆TCM的表型标记物的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或
CD127，并且对颗粒酶B为阴性或低。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应子TE对CD62L、CCR7、CD28和/或CD127为阴性，并且对颗粒酶B和/或穿孔素为阳性。在一些实施方案中，幼稚CD8+T淋巴细胞的特征在于幼稚T细胞的表型标记物(包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和/或CD45RA)的表达。
[0371] 嵌合和人源化抗体
[0372] 在一些实施方案中，本发明的抗体源自来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”二者是指组合来自多于一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在一些情况下为大鼠)的一个或多个可变区和来自人类的一个或多个恒定区。“人源化抗体”通常是指将可变结构域框架区交换为人抗体中存在的序列的非人抗体。通常，在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同，除在其CDR内有所不同。CDR(其一些或全部由起源于非人生物体的核酸编码)接枝到人抗体可变区的β-折叠框架中，以产生抗体，所述抗体的特异性由接枝的CDR决定。此类抗体的产生描述于例如WO 92/11018,Jones,1986,Nature 321:
522-525,Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中，它们都通过引用全部并入。所
选受体框架残基至对应供体残基的“回复突变(Backmutation)”经常要求重新获得初始移
植的构建体中所丧失的亲和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US
6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213，它们都通过引用全部并入)。
人源化抗体最佳地也将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少
一部分，并且因此通常将包含人Fc区。人源化抗体也可以使用具有基因工程化免疫系统的
小鼠产生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654，其通过引用全部并入。用于人源化和重整非人抗体的各种技术与方法在本领域中是熟知的(参见Tsurushita和Vasquez,
2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-
545,Elsevier Science(USA)，和其中引证的参考文献，它们都通过引用全部并入)。人源化方法包括但不限于描述于以下文献中的方法：Jones等人,1986,Nature 321:522-525；
Riechmann等人,1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-
1536；Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等人,1998,
J.Immunol.160:1029-1035；Carter等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9；
Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等人,1991,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O’Connor等人,1998,Protein Eng 11:321-8，它们都通过引用全部并入。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化方法或其他方法可以包
括表面重修(resurfacing)方法，例如，Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:
969-973中所述，其通过引用全部并入。
522-525,Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中，它们都通过引用全部并入。所
选受体框架残基至对应供体残基的“回复突变(Backmutation)”经常要求重新获得初始移
植的构建体中所丧失的亲和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US
6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213，它们都通过引用全部并入)。
人源化抗体最佳地也将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少
一部分，并且因此通常将包含人Fc区。人源化抗体也可以使用具有基因工程化免疫系统的
小鼠产生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654，其通过引用全部并入。用于人源化和重整非人抗体的各种技术与方法在本领域中是熟知的(参见Tsurushita和Vasquez,
2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-
545,Elsevier Science(USA)，和其中引证的参考文献，它们都通过引用全部并入)。人源化方法包括但不限于描述于以下文献中的方法：Jones等人,1986,Nature 321:522-525；
Riechmann等人,1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-
1536；Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等人,1998,
J.Immunol.160:1029-1035；Carter等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9；
Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等人,1991,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O’Connor等人,1998,Protein Eng 11:321-8，它们都通过引用全部并入。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化方法或其他方法可以包
括表面重修(resurfacing)方法，例如，Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:
969-973中所述，其通过引用全部并入。
[0373] 在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包含含有重链或轻链可变区的人抗体或由含有重链或轻链可变区的人抗体组成，所述重链或轻链
可变区是特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列。通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择序列最接近(即，最大％同一性)人抗体序
列的人种系免疫球蛋白序列，可以鉴定“人种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体。作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可能含有氨基酸差异，这是由于例如自然发生的体
细胞突变或故意引入定点突变。然而，人源化抗体通常在氨基酸序列方面与由人种系免疫
球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，并且含有如下氨基酸残基，当与其他物种的
种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比时，所述氨基酸残基将抗体鉴定为源
自人序列。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的
氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。
通常，源自特定人种系序列的人源化抗体将展示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸
序列的差异不超过10-20个氨基酸(在本文引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常很少)。在某些情况下，人源化抗体可能展示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的差异不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸(同样，在本文引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常很少)。
可变区是特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列。通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择序列最接近(即，最大％同一性)人抗体序
列的人种系免疫球蛋白序列，可以鉴定“人种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体。作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可能含有氨基酸差异，这是由于例如自然发生的体
细胞突变或故意引入定点突变。然而，人源化抗体通常在氨基酸序列方面与由人种系免疫
球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，并且含有如下氨基酸残基，当与其他物种的
种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比时，所述氨基酸残基将抗体鉴定为源
自人序列。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的
氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。
通常，源自特定人种系序列的人源化抗体将展示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸
序列的差异不超过10-20个氨基酸(在本文引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常很少)。在某些情况下，人源化抗体可能展示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的差异不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸(同样，在本文引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常很少)。
[0374] 在一个实施方案中，亲本抗体已如本领域中所知进行了亲和力成熟。可以采用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如，在USSN 11/004,590中所述。可以采用基于选择的方法进行抗体可变区的人源化和/或亲和力成熟，所述方法包括但不限于描述于以
下文献中的方法：Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人,1997,
J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-
22618；Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等人,2003,
Protein Engineering 16(10):753-759，它们都通过引用全部并入。其他人源化方法可以
涉及仅移植CDR的部分，包括但不限于描述于USSN 09/810,510；Tan等人,2002,
J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084中的方法，它们都通过引用全部并入。
下文献中的方法：Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人,1997,
J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-
22618；Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等人,2003,
Protein Engineering 16(10):753-759，它们都通过引用全部并入。其他人源化方法可以
涉及仅移植CDR的部分，包括但不限于描述于USSN 09/810,510；Tan等人,2002,
J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084中的方法，它们都通过引用全部并入。
[0375] 治疗方法
[0376] 本发明的示例性方法涉及AbCID用于治疗患有可由治疗剂治疗的疾病的患者的用途，所述治疗剂包含通过如本文所讨论的AbCID形成的蛋白质a与蛋白质b之间的二聚体。示例性疾病包括但不限于癌症、侵袭性血管生成和自身免疫疾病。
[0377] 以下讨论涉及用本发明的AbCID治疗各种疾病和障碍，本文所述的方法也适用于缀合物。对于本领域技术人员显而易见的是，这种讨论适用于通过这些AbCID形成的二聚体的蛋白质组分的蛋白质a、蛋白质b、抗体、抗原结合片段、变体和衍生物。
[0378] 在一个实施方案中，有需要的受试者的治疗包括将本发明的AbCID应用或给予到来自患者的分离组织、细胞或细胞系，其中所述患者患有疾病、疾病症状或有疾病倾向，例如T细胞或CAR T细胞。在另一个实施方案中，治疗还旨在包括将包含本发明AbCID的药物组合物应用或给予到来自患有疾病、疾病症状或疾病倾向的患者的分离组织、细胞或细胞系。
示例性药物组合物包括与药学上可接受的载体、赋形剂等混合的AbCID或其蛋白质复合物。
示例性药物组合物包括与药学上可接受的载体、赋形剂等混合的AbCID或其蛋白质复合物。
[0379] 本发明的示例性AbCID可用于治疗各种恶性和非恶性肿瘤。“抗肿瘤活性”意思是降低恶性细胞增殖或积聚的速率，并且从而降低现有肿瘤或治疗期间出现的肿瘤的生长速
率，和/或破坏现有赘生性(肿瘤)细胞或新形成的赘生性细胞，并且从而降低治疗期间肿瘤的总大小。例如，用至少一种AbCID进行治疗引起生理反应，例如血管生成减少，这对于治疗人的疾病状态是有益的。
率，和/或破坏现有赘生性(肿瘤)细胞或新形成的赘生性细胞，并且从而降低治疗期间肿瘤的总大小。例如，用至少一种AbCID进行治疗引起生理反应，例如血管生成减少，这对于治疗人的疾病状态是有益的。
[0380] 在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明用作药物、特别是用于治疗或预防癌症或用于癌症前期状况或病变的AbCID分子，例如抗体或其结合片段及其缀合物。在某些实施方案中，本发明的AbCID用于淋巴瘤或白血病的治疗。
[0381] 本发明的其他AbCID也可以用于抑制血管生成，以治疗依赖于新血管形成的病理状况，包括肿瘤发展和黄斑变性。血管生成是一个复杂的多步骤形态发生事件，在此过程
中，内皮细胞在血管重塑的主要决定因素的刺激下，动态地改变其细胞至细胞和细胞至基
质的接触，并定向地移动以重组为成熟的血管树(Bussolino等人,Trends Biochem
Sci.22:251-256(1997)；Risau,Nature 386:671-674(1997)；Jain,Nat.Med.9:685-693
(2003))。新血管的形成是胚胎发育过程中的一个关键步骤，但它也发生在生理和病理状况下的成人中，如视网膜病变、类风湿性关节炎、局部缺血，并且尤其是肿瘤生长和转移
(Carmeliet,Nat.Med.9:653-660(2003))。这种新血管的病理形成在本文中称为“侵入性血管生成”Basile等人,PNAS 103(24):9017-9022(2006))。血管生成是一种常用的策略，通过这种策略，多种癌症可以促进血管生成。
中，内皮细胞在血管重塑的主要决定因素的刺激下，动态地改变其细胞至细胞和细胞至基
质的接触，并定向地移动以重组为成熟的血管树(Bussolino等人,Trends Biochem
Sci.22:251-256(1997)；Risau,Nature 386:671-674(1997)；Jain,Nat.Med.9:685-693
(2003))。新血管的形成是胚胎发育过程中的一个关键步骤，但它也发生在生理和病理状况下的成人中，如视网膜病变、类风湿性关节炎、局部缺血，并且尤其是肿瘤生长和转移
(Carmeliet,Nat.Med.9:653-660(2003))。这种新血管的病理形成在本文中称为“侵入性血管生成”Basile等人,PNAS 103(24):9017-9022(2006))。血管生成是一种常用的策略，通过这种策略，多种癌症可以促进血管生成。
[0382] 根据本发明的方法，至少一种如本文别处所定义的AbCID用于促进对恶性人细胞的积极治疗反应。关于癌症治疗的“积极治疗反应”意思是改善与这些结合分子(例如抗体或其片段)的抗肿瘤活性相关联的疾病，和/或改善与疾病相关联的症状。也就是说，可以观察到抗增殖作用、防止进一步的肿瘤生长、减小肿瘤大小、减小肿瘤脉管系统、减少癌细胞数量和/或减少与疾病相关联的一种或多种症状。因此，例如，疾病的改善可以表征为完全反应。“完全反应”意思是不存在临床上可检测的疾病，并且任何先前异常射线研究、骨髓以及脑脊液(CSF)正常化。这种反应在根据本发明的方法治疗后必须持续至少一个月。可替代地，疾病的改善可以归类为部分反应。“部分反应”意思是在没有新损伤并持续至少一个月的情况下，所有可测量的肿瘤负荷(即受试者中存在的肿瘤细胞的数量)减少至少约50％。
这种反应仅适用于可测量的肿瘤。
这种反应仅适用于可测量的肿瘤。
[0383] 可以使用筛选技术如生物发光成像，例如萤光素酶成像，骨扫描成像以及包括骨髓抽吸(BMA)的肿瘤活检采样来评估肿瘤反应的肿瘤形态变化(即，总体肿瘤负荷、肿瘤细
胞计数等)。除了这些积极的治疗反应之外，接受使用抗CD100结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)的疗法的受试者可以体验改善与疾病相关联的症状的有益作用。例如，受试者可以体验所谓的B症状，例如盗汗、发热、重量减轻和/或荨麻疹的减少。
胞计数等)。除了这些积极的治疗反应之外，接受使用抗CD100结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)的疗法的受试者可以体验改善与疾病相关联的症状的有益作用。例如，受试者可以体验所谓的B症状，例如盗汗、发热、重量减轻和/或荨麻疹的减少。
[0384] 本文所述的AbCID也可以用于治疗炎性疾病和免疫系统的缺陷或障碍。炎性疾病的特征在于炎症和组织破坏，或其组合。“抗炎活性”意思是减少或预防炎症。“炎性疾病”包括任何炎性免疫介导的过程，其中免疫应答的起始事件或靶标涉及一种或多种非自身抗
原，包括例如同种抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或过敏原。在一个实施方案中，炎性疾病是外周或中枢神经系统的炎性障碍。在另一个实施方案中，炎性疾病是关节的炎性障碍。
原，包括例如同种抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或过敏原。在一个实施方案中，炎性疾病是外周或中枢神经系统的炎性障碍。在另一个实施方案中，炎性疾病是关节的炎性障碍。
[0385] 此外，出于本发明的目的，术语“一种或多种炎性疾病”包括“一种或多种自身免疫疾病”。如本文所用，术语“自身免疫”通常被理解为涵盖涉及“自身”抗原的炎性免疫介导的过程。在自身免疫疾病中，一种或多种自身抗原触发宿主免疫应答。自身免疫疾病可能是由针对自身抗原(自体抗原)的不适当免疫应答引起的，这种免疫应答偏离了正常的自身耐受状态。通常，抗体(特别是但不限于IgG抗体)作为细胞毒性分子或免疫复合物，是各种自身免疫疾病的主要介质，其中许多疾病可能会使人虚弱或危及生命。
[0386] 可以使用筛选技术如磁共振成像(MRI)扫描、x射线照相成像、计算机断层(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活细胞分选仪(FACS)分析、组织学、大体病理学和血液化学(包括但不限于通过ELISA、RIA、色谱法等可检测的变化)来评估临床反应。除了这些积极的治疗反应之外，接受使用AbCID的疗法的受试者可以体验改善与疾病相关联的症状的有益作用。
[0387] AbCID可以与至少一种其他癌症疗法组合使用，包括但不限于手术或外科手术(例如脾切除术、肝切除术、淋巴结切除术、白细胞电泳、骨髓移植等)；放射疗法；化学疗法，任选地与自体骨髓移植或其他癌症疗法组合；其中在AbCID分子(例如抗体或其抗原结合片
段)疗法之前、期间或之后给予额外的癌症疗法。因此，当组合疗法包括给予本发明的AbCID连同给予另一种治疗剂，如化学疗法、放射疗法、其他抗癌抗体疗法、基于小分子的癌症疗法或基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法时，本发明的方法涵盖共给予(使用单独的配制品或单
一的药物配制品)，或和以任一顺序连续给予。
段)疗法之前、期间或之后给予额外的癌症疗法。因此，当组合疗法包括给予本发明的AbCID连同给予另一种治疗剂，如化学疗法、放射疗法、其他抗癌抗体疗法、基于小分子的癌症疗法或基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法时，本发明的方法涵盖共给予(使用单独的配制品或单
一的药物配制品)，或和以任一顺序连续给予。
[0388] 本发明的AbCID分子可以与以下组合使用：用于癌症、自身免疫和炎性疾病的任何已知疗法，包括已知可用于或已经用于或当前正在用于治疗自身免疫和炎性疾病的任何药
剂或药剂组合。因此，当组合疗法包括AbCID分子的给予和另一种治疗剂的给予时，本发明的方法涵盖共给予(使用单独的配制品或单一的药物配制品)，以及以任一顺序连续给予。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的AbCID结合免疫抑制药物或抗炎药物给予，其中抗体和一种或多种治疗剂可以顺序、以任何顺序或同时(即，同时或在同一时间框架内)给予。
剂或药剂组合。因此，当组合疗法包括AbCID分子的给予和另一种治疗剂的给予时，本发明的方法涵盖共给予(使用单独的配制品或单一的药物配制品)，以及以任一顺序连续给予。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的AbCID结合免疫抑制药物或抗炎药物给予，其中抗体和一种或多种治疗剂可以顺序、以任何顺序或同时(即，同时或在同一时间框架内)给予。
[0389] 本发明的另一个实施方案是使用AbCID作为临床测试程序的一部分用于组织中蛋白质水平的诊断监测，例如，以确定给定治疗方案的功效。例如，可以通过将AbCID与可检测物质偶联来促进检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；
合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素
125 131 35 3
酶、荧光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性物质的例子包括 I、 I、S或H。
合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素
125 131 35 3
酶、荧光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性物质的例子包括 I、 I、S或H。
[0390] 转录调节
[0391] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括在个体的靶细胞中表达根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组分，其中CID能
够调节靶基因转录，其中靶基因在靶细胞中的表达水平与疾病相关联，并且以有效治疗疾
病的方案向个体给予小分子。
够调节靶基因转录，其中靶基因在靶细胞中的表达水平与疾病相关联，并且以有效治疗疾
病的方案向个体给予小分子。
[0392] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，其中靶细胞中靶基因的表达水平与疾病相关联，其包括：(A)在个体的靶细胞中表达(a)第一化学诱导二聚体
(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物
的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到
第二结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二
衔接子部分包含转录调节结构域；或者(2)第二衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第一
衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分
子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，第一CID组分进一步包含核定位信号，并且第二CID组分进一步包含核定位信号。在一些实施方案中，(i)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(ii)转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能
够下调靶基因的转录。在一些实施方案中，转录调节结构域是VPR转录激活结构域在一些实施方案中，DNA结合结构域源自天然存在的转录调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自
催化性死亡的Cas9(dCas9)。
(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物
的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到
第二结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二
衔接子部分包含转录调节结构域；或者(2)第二衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第一
衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分
子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，第一CID组分进一步包含核定位信号，并且第二CID组分进一步包含核定位信号。在一些实施方案中，(i)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(ii)转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能
够下调靶基因的转录。在一些实施方案中，转录调节结构域是VPR转录激活结构域在一些实施方案中，DNA结合结构域源自天然存在的转录调节因子。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡的。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自
催化性死亡的Cas9(dCas9)。
[0393] 细胞存活
[0394] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予针对疾病的过继细胞疗法，所述疗法包括修饰的细胞，其中所述修饰的细胞表达根据
本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组分，其中CID能够诱导靶细胞死
亡；和(B)以有效(I)杀死预定量的过继转移细胞；或(II)保持预定量的过继转移细胞的方
案向个体给予小分子。
本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组分，其中CID能够诱导靶细胞死
亡；和(B)以有效(I)杀死预定量的过继转移细胞；或(II)保持预定量的过继转移细胞的方
案向个体给予小分子。
[0395] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予针对疾病的过继细胞疗法，所述疗法包括修饰的细胞，其中所述修饰的细胞表达(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分
子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合
部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第一衔接子部分和第二衔接子
部分一起能够诱导靶细胞中的细胞凋亡；和(B)以有效(I)杀死预定量的过继转移的细胞；
或(II)保持预定量的过继转移的细胞的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，第一
衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，过继细胞疗法是CAR T细胞疗法。
子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合
部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第一衔接子部分和第二衔接子
部分一起能够诱导靶细胞中的细胞凋亡；和(B)以有效(I)杀死预定量的过继转移的细胞；
或(II)保持预定量的过继转移的细胞的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，第一
衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。在一些实施方案中，过继细胞疗法是CAR T细胞疗法。
[0396] 免疫调节
[0397] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予表达根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID
组分的经修饰的T细胞，其中CID是对靶抗原具有特异性的异二聚体CAR，并且其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
组分的经修饰的T细胞，其中CID是对靶抗原具有特异性的异二聚体CAR，并且其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0398] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一
结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二
结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共
刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；或者(2)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域，并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部分的CID组分进一步包含分泌信号肽。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述
方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二
结合部分的第二衔接子部分，其中(1)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共
刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；或者(2)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域，并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；其中细胞外抗原结合
部分特异性地结合靶抗原；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，包含细胞外抗原结合部分的CID组分进一步包含分泌信号肽。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述
方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0399] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达第一化学诱导二聚体(CID)组
分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结
合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予第二
CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；
和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含细胞外抗原结合
部分，并且其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原；和(C)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结
合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予第二
CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；
和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含细胞外抗原结合
部分，并且其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原；和(C)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0400] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分
的第一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分，并且其中细胞外抗原
结合部分特异性地结合靶抗原；(B)向个体给予表达第二CID组分的经修饰的T细胞，所述第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；
和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；
(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；和(C)以有效治疗疾病的方案
向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规
CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作
用更少。
的第一衔接子部分，其中第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部分，并且其中细胞外抗原
结合部分特异性地结合靶抗原；(B)向个体给予表达第二CID组分的经修饰的T细胞，所述第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；
和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；
(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；和(C)以有效治疗疾病的方案
向个体给予小分子。在一些实施方案中，与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规
CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作
用更少。
[0401] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予根据本文所述实施方案中任一种所述的系统的第一和第二CID组
分，其中CID是能够将T细胞重引导至靶细胞的异二聚体双特异性T细胞接合器；和(B)以有
效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
分，其中CID是能够将T细胞重引导至靶细胞的异二聚体双特异性T细胞接合器；和(B)以有
效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0402] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互
作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合
部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复
合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中
(1)第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部
分；或者(2)第二衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗
原结合部分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，患病
细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部
分。在一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特
异性T细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合
部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复
合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中
(1)第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部
分；或者(2)第二衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗
原结合部分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。在一些实施方案中，患病
细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部
分。在一些实施方案中，与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特
异性T细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0403] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)在个体中在能够识别并杀死靶细胞的T细胞中表达根据本文所述实施方案中任
一种所述的系统的第一和第二CID组分，其中CID是能够调节T细胞激活的异二聚体信号传
导分子；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
一种所述的系统的第一和第二CID组分，其中CID是能够调节T细胞激活的异二聚体信号传
导分子；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0404] 在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)在个体中在能够识别并杀死靶细胞的T细胞中表达(a)第一化学诱导二聚体
(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物
的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到
第二结合部分的第二衔接子部分，其中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域的单体信号传导分
子的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
(CID)组分，其包含(i)能够与小分子相互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物
的第一结合部分；和(ii)连接到第一结合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分，其包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合部分；和(ii)连接到
第二结合部分的第二衔接子部分，其中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。在一些实施方案中，T细胞是CAR T细胞。在一些实施方案中，与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域的单体信号传导分
子的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0405] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-xL的ABT-737结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-737与第一结
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:
314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表1所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:
314的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:314的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0406] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-199结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-199与第一结
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:
315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表2所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:
315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0407] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含Bcl-2的ABT-263结合结构域，并且第二结合部分包含能够和ABT-263与第一结
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:
315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链
可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表3所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:
315的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:315的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0408] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的LCL161结合结构域，并且第二结合部分包含能够和LCL161与第一结合
部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可
变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可
变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表4所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0409] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的GDC-0152结合结构域，并且第二结合部分包含能够和GDC-0152与第一
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID
NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表5所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，GDC-0152结合结构域包含SEQ ID
NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0410] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的AT406结合结构域，并且第二结合部分包含能够和AT406与第一结合部
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变
结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨
基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变
结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表6所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨
基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0411] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含cIAP1的CUDC-427结合结构域，并且第二结合部分包含能够和CUDC-427与第一
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID
NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表7所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，CUDC-427结合结构域包含SEQ ID
NO:317的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:317的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0412] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含FKBP的SLF结合结构域，并且第二结合部分包含能够和SLF与第一结合部分之间
的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变结构
域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序
列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻链可变结构
域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表8所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序
列或其与SEQ ID NO:316的氨基酸序列具有至少85％同源性的变体。
[0413] 在一些实施方案中，根据本文所述的治疗个体的疾病的方法中的任一种，第一结合部分包含甲氨蝶呤结合型Fab，其中所述甲氨蝶呤结合型Fab HC-CDR1、HC-CDR2、HC-
CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，并且第二结合部分包含能够和甲氨蝶呤与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人
Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、321、322和323的氨基酸序列或其具有至少85％同源性的变体，并且第二结合部分包含能够和甲氨蝶呤与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中抗体部分包含重链可变结构域和轻
链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域包含如表9所示的HC-CDR和LC-CDR，或其具有至少85％同源性的变体。在一些实施方案中，甲氨蝶呤结合型Fab是如Gayda等人
Biochemistry 2014 53(23),3719-3726中所述的甲氨蝶呤结合型Fab。
[0414] 药物组合物和给予方法
[0415] 制备并向有需要的受试者给予本发明的AbCID的方法是本领域技术人员熟知的或容易确定的。AbCID的给予途径可以是例如口服、肠胃外、吸入或局部。如本文所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给予。虽然清楚地认为所有这些给予形式在本发明的范围内，但用于给予的形式的例子将是用于注射的溶液，具体
是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可以包含缓冲液
(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂
(例如人白蛋白)等。然而，在与本文的传授内容相容的其他方法中，可以将本发明的AbCID直接递送至不良细胞群的位点，由此增加患病组织对治疗剂的暴露。
是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可以包含缓冲液
(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂
(例如人白蛋白)等。然而，在与本文的传授内容相容的其他方法中，可以将本发明的AbCID直接递送至不良细胞群的位点，由此增加患病组织对治疗剂的暴露。
[0416] 如本文所讨论，可以以药物有效量给予本发明的AbCID，用于在体内治疗各种细胞介导的疾病，如某些类型的癌症、自身免疫疾病、炎性疾病(包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎性疾病)以及侵入性血管生成。在这一方面，应当理解，将配制本发明所公开的结合分子，以便促进给予且促进活性剂的稳定性。优选地，根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的、无毒的、无菌载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本申请的目的，缀合或未缀合的AbCID的药学有效量应保持意指足以实现与靶标的有效结合且足以
获得益处(例如，足以改善疾病或障碍的症状或检测物质或细胞)的量。
获得益处(例如，足以改善疾病或障碍的症状或检测物质或细胞)的量。
[0417] 用于本发明中的药物组合物包含药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物)、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮)、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇以及脂肪。
[0418] 用于肠胃外给予的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括例如水、醇溶液/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M和优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常
见的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。
也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
见的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。
也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
[0419] 更具体地，适用于注射使用的药物组合物包括无菌的水性溶液(水溶性的)或分散体、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在此类情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应当稳定，并且将优选
地抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂
或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。用于本文所公开的治疗方法的适合的配制品描
述于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)第16版(1980)中。
地抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂
或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。用于本文所公开的治疗方法的适合的配制品描
述于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)第16版(1980)中。
[0420] 防止微生物的作用可以通过各种抗细菌以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
[0421] 在任何情况下，可以通过将活性化合物(例如，AbCID自身或与其他活性剂组合)以所需的量掺入适当的溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液，所述溶剂根据需要具
有本文列举的一种成分或多种成分的组合。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中制
备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在
用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这
些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。将用于注射的制
剂加工，填充至容器如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制剂可以以试剂盒的形式包装和销售，如美国专利申请序列号09/259,
337中描述的那些。此类制品优选具有标签或包装说明书，其指示相关组合物可用于治疗患有或易患疾病或障碍的受试者。
有本文列举的一种成分或多种成分的组合。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中制
备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在
用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这
些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。将用于注射的制
剂加工，填充至容器如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制剂可以以试剂盒的形式包装和销售，如美国专利申请序列号09/259,
337中描述的那些。此类制品优选具有标签或包装说明书，其指示相关组合物可用于治疗患有或易患疾病或障碍的受试者。
[0422] 肠胃外配制品可以是单次推注剂量、输注或加载推注剂量，然后是维持剂量。可以按具体的固定或可变的间隔，例如每天一次，或“按需”给予这些组合物。
[0423] 可以按可接受的剂型(包括例如，胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液)口服给予用于本发明中的某些药物组合物。还可以通过鼻气溶胶或吸入来给予某些药物组合物。采用苄醇或其他合适的防腐剂、吸附促进剂以增强生物利用度、和/或其他常规稳定剂或分散剂，可以将此类组合物制备成盐水溶液。
[0424] 可以与载体材料组合以产生单一剂型的AbCID的量将取决于所治疗的宿主和特定给予方式而变化。可以按单一剂量、多剂量或以输注的形式经确立的时间段给予所述组合
物。还可以调整给药方案以提供最优的希望的反应(例如，治疗反应或预防反应)。
物。还可以调整给药方案以提供最优的希望的反应(例如，治疗反应或预防反应)。
[0425] 为了与本公开文本的范围保持一致，可以将本发明的AbCID按照前述治疗方法以足以产生治疗效果的量给予至人或其他动物。可以将本发明的AbCID通过根据已知技术将
本发明的抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂组合制备的常规剂型给予至此类人或
其他动物。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于
与其组合的活性成分的量，给予的途径和其他熟知的变量。本领域技术人员将进一步理解，包含本发明的AbCID的一种或多种种类的混合物可以证明是特别有效的。
本发明的抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂组合制备的常规剂型给予至此类人或
其他动物。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于
与其组合的活性成分的量，给予的途径和其他熟知的变量。本领域技术人员将进一步理解，包含本发明的AbCID的一种或多种种类的混合物可以证明是特别有效的。
[0426] “治疗有效剂量或量”或“有效量”意思是在给予时对治疗患者的待治疗疾病产生积极治疗反应的AbCID的量。
[0427] 本发明组合物用于治疗以下疾病的治疗有效剂量根据许多不同的因素而改变：细胞介导的疾病，如某些类型的癌症，例如白血病、淋巴瘤；自身免疫疾病，例如关节炎、多发性硬化、炎性疾病，包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎性疾病；以及侵入性血管生成，所述不同的因素包括给予方式、目标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、给予的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法逐步增加，以优化安全性和功效。
[0428] 鉴于本发明的公开文本，待给予的至少一种AbCID的量由本领域普通技术人员容易地确定，而无需过多的实验。影响给予方式和至少一种AbCID各自量的因素包括但不限于疾病的严重程度、疾病史以及接受治疗的个体的年龄、身高、体重、健康和身体状况。类似地，待给予的AbCID的量将取决于给予方式，以及受试者将接受单剂量还是多剂量的这种药剂。
[0429] 在另一个示例性实施方案中，用编码蛋白质a、蛋白质b、其融合物或衍生物、或两种或更多种这些要素的组合的核酸转染受试者的细胞，使得细胞产生一种或多种蛋白质。在各种实施方案中，通过向受试者给予一种或多种SM而形成二聚体。以这种方式，SM使蛋白
质a和蛋白质b，或这些蛋白质中的一种或两种的融合物或衍生物二聚化。
质a和蛋白质b，或这些蛋白质中的一种或两种的融合物或衍生物二聚化。
[0430] 诊断
[0431] 本发明进一步提供了一种在诊断细胞介导的疾病如某些类型的癌症、自身免疫疾病、炎性疾病(包括例如关节炎、多发性硬化、中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎性疾病)以及侵袭性血管生成期间可用的诊断方法，所述方法包括测量来自个体的组织或
其他细胞或体液中疾病相关蛋白或转录物的表达水平，并将测量的表达水平与正常组织或
体液中的标准表达水平进行比较，由此与标准表达水平相比表达水平的增加指示障碍。
其他细胞或体液中疾病相关蛋白或转录物的表达水平，并将测量的表达水平与正常组织或
体液中的标准表达水平进行比较，由此与标准表达水平相比表达水平的增加指示障碍。
[0432] 本发明的AbCID可以用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样品中的蛋白质水平(参见例如，Jalkanen等人,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；
Jalkanen等人,J.Cell Biol.105:3087-3096(1987))。可用于检测蛋白质表达的其他基于
抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀反应以及蛋白质印
迹。适合的测定在本文其他地方更详细地描述。
Jalkanen等人,J.Cell Biol.105:3087-3096(1987))。可用于检测蛋白质表达的其他基于
抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀反应以及蛋白质印
迹。适合的测定在本文其他地方更详细地描述。
[0433] “测定蛋白质的表达水平”意思是直接(例如，通过确定或估计绝对蛋白质水平)或相对(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关多肽水平进行比较)定性或定量地测量或估计第一生物样品中的疾病相关蛋白水平。优选地，测量或估计第一生物样品中的蛋白质表
达水平，并将其与标准蛋白质水平进行比较，所述标准取自从没有所述障碍的个体获得的
第二生物样品，或者通过平均来自没有所述障碍的个体群体的水平来确定。如本领域将理
解的，一旦“标准”蛋白质水平已知，则它可以重复地用作比较的标准。
达水平，并将其与标准蛋白质水平进行比较，所述标准取自从没有所述障碍的个体获得的
第二生物样品，或者通过平均来自没有所述障碍的个体群体的水平来确定。如本领域将理
解的，一旦“标准”蛋白质水平已知，则它可以重复地用作比较的标准。
[0434] “生物样品”意思是从个体、细胞系、组织培养物或潜在地表达疾病相关蛋白的其他细胞来源获得的任何生物样品。用于从哺乳动物获得组织活检物和体液的方法在本领域是熟知的。
[0435] 免疫测定
[0436] 本发明的AbCID可以用于免疫测定，例如，可以通过本领域已知的任何方法测定它们的免疫特异性结合。可以使用的免疫测定包括但不限于使用如蛋白质印迹等技术的竞争
性和非竞争性测定系统、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定等。此类测定在本领域中是常规且熟知的(参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&
Sons,Inc.,NY)第1卷，其通过引用以其整体并入本文)。下面简要描述示例性免疫测定(但
目的不在于加以限制)。
性和非竞争性测定系统、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定等。此类测定在本领域中是常规且熟知的(参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&
Sons,Inc.,NY)第1卷，其通过引用以其整体并入本文)。下面简要描述示例性免疫测定(但
目的不在于加以限制)。
[0437] 免疫沉淀方案通常包括在裂解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，pH 7.2的0.01M磷酸钠，1％Trasylol)中裂解细胞群，所述缓冲液补充有蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)，将目的抗体添加至细胞裂解物中，在4℃下孵育一段时间(例如1-4小时)，将蛋白A和/或蛋
白G琼脂糖珠粒添加至细胞裂解物中，在4℃下孵育约1小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤珠粒并将珠粒重新悬浮在SDS/样品缓冲液中。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通
过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员会知道可以经修饰以增加抗体与抗原的结
合并降低背景的参数(例如，用琼脂糖珠粒预先清除细胞裂解物)。对于关于免疫沉淀方案
的进一步讨论，参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular
Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷10.16.1。
白G琼脂糖珠粒添加至细胞裂解物中，在4℃下孵育约1小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤珠粒并将珠粒重新悬浮在SDS/样品缓冲液中。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通
过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员会知道可以经修饰以增加抗体与抗原的结
合并降低背景的参数(例如，用琼脂糖珠粒预先清除细胞裂解物)。对于关于免疫沉淀方案
的进一步讨论，参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular
Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷10.16.1。
[0438] 蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，8％–20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)中使蛋白质样品电泳，将蛋白质样品自聚丙烯酰胺凝胶转移至如硝酸纤维素、PVDF或尼龙的膜中，在封闭溶液(例如，具有3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如，PBS-吐温20)中洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的一抗(目的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的缀合到酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32P或sup.125I)的二抗(其识别一抗，例如抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，以及检测抗原的存在。本领域技术人员会知道可以经修饰以增加检测的信号并降低背景噪声的参数。对于关于蛋白质印迹方案的进一步
讨论，参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷10.8.1。
讨论，参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷10.8.1。
[0439] ELISA包括制备抗原、用所述抗原包被96孔微量滴定板的孔、向孔中添加与可检测化合物如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的目的抗体并孵育一段时间，
和检测所述抗原的存在。在ELISA中，目的抗体并非必须缀合到可检测化合物；而是，可以向孔中添加与可检测化合物缀合的第二抗体(其识别目的抗体)。此外，可以将抗体包被到孔
中，而非用抗原包被孔。在这种情况下，可以在向被包被的孔中添加目的抗原之后添加与可检测化合物缀合的第二抗体。本领域技术人员会知道可以经修饰以增加检测信号的参数以
及本领域中已知的其他ELISA变体。对于关于ELISA的进一步讨论，参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷
11.2.1。
和检测所述抗原的存在。在ELISA中，目的抗体并非必须缀合到可检测化合物；而是，可以向孔中添加与可检测化合物缀合的第二抗体(其识别目的抗体)。此外，可以将抗体包被到孔
中，而非用抗原包被孔。在这种情况下，可以在向被包被的孔中添加目的抗原之后添加与可检测化合物缀合的第二抗体。本领域技术人员会知道可以经修饰以增加检测信号的参数以
及本领域中已知的其他ELISA变体。对于关于ELISA的进一步讨论，参见例如，Ausubel等人编,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷
11.2.1。
[0440] 蛋白质a及其同源结合配偶体(例如抗原的抗体)的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离速率可以通过竞争性结合测定来确定。竞争性结合测定的一个例子是放射免疫
测定，其包括在增加量的未经标记的抗原的存在下，用目的抗体孵育经标记的抗原(例如3H
125
或 I)，并且检测与经标记的抗原结合的抗体。目的抗体对特定抗原的亲和力和结合解离
速率可以通过Scatchard绘图分析的数据来测定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫
测定来确定。在这种情况下，在增加量的未经标记的第二抗体的存在下，抗原与目的抗体一起孵育，所述目的抗体与经标记的化合物(例如，3H或125I)缀合。
测定，其包括在增加量的未经标记的抗原的存在下，用目的抗体孵育经标记的抗原(例如3H
125
或 I)，并且检测与经标记的抗原结合的抗体。目的抗体对特定抗原的亲和力和结合解离
速率可以通过Scatchard绘图分析的数据来测定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫
测定来确定。在这种情况下，在增加量的未经标记的第二抗体的存在下，抗原与目的抗体一起孵育，所述目的抗体与经标记的化合物(例如，3H或125I)缀合。
[0441] 另外，AbCID可以用于组织学，如免疫荧光、免疫电镜或非免疫学测定，用于所选蛋白质的原位检测。原位检测可以通过从患者体内取出组织样本，并在其上施加经标记的AbCID来完成，优选地通过将经标记的AbCID覆盖在生物样品上来施加。通过使用这种程序，不仅可以确定所选蛋白质或保守变体或肽片段的存在，还可以确定其在被检查组织中的分
布。使用本发明，普通技术人员将容易地理解，可以修改多种组织学方法(如染色程序)中的任一种，以便实现这种原位检测。
布。使用本发明，普通技术人员将容易地理解，可以修改多种组织学方法(如染色程序)中的任一种，以便实现这种原位检测。
[0442] 使用AbCID的免疫测定和非免疫测定通常将包括在可检测经标记的AbCID的存在下孵育样品，如生物液体、组织提取物、新收获的细胞或已经在细胞培养中孵育的细胞裂解物，并通过本领域熟知的多种技术中的任一种来检测结合的抗体。
[0443] 生物样品可以与固相支持物或载体(如硝化纤维素或者能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的其他固体支持物)接触并固定在其上。然后可以用合适的缓冲液洗涤支
持物，随后用可检测经标记的AbCID进行处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持物，以除去未结合的抗体。任选地，所述抗体随后被标记。然后可以通过常规方法检测固体支持物上结合标记的量。
持物，随后用可检测经标记的AbCID进行处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持物，以除去未结合的抗体。任选地，所述抗体随后被标记。然后可以通过常规方法检测固体支持物上结合标记的量。
[0444] “固相支持物或载体”意思是能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。出于本发明的目的，载体的性质可以是在一定程度上可溶性的或不溶性的。支持材料实际上可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持构型可以是球形的，如珠粒，或圆柱形的，如试管的内表面，或杆的外表面。
可替代地，所述表面可以是平的，如片材、测试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠粒。本领域的技术人员将知道许多其他适合结合抗体或抗原的载体，或者将能够通过使用常规实验
来确定它们。
可替代地，所述表面可以是平的，如片材、测试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠粒。本领域的技术人员将知道许多其他适合结合抗体或抗原的载体，或者将能够通过使用常规实验
来确定它们。
[0445] 可以根据熟知的方法来确定给定批次AbCID的结合活性。本领域技术人员将能够通过采用常规实验确定每一测定的操作和最佳测定条件。
[0446] 存在多种方法可用于测量抗体-抗原相互作用的亲和力，但用于确定速率常数的方法相对较少。大多数方法依赖于标记抗体或抗原，这不可避免地使常规测量复杂化，并在测量量中引入不确定性。
[0447] 在 上进行的表面等离子体共振(SPR)提供了许多优于测量抗体-抗原相互作用亲和力的常规方法的优点：(i)不需要标记抗体或抗原；(ii)抗体不需要预先纯化，细胞培养上清液可以直接使用；(iii)实时测量，允许不同单克隆抗体相互作用的快速半定量比较，能够并足以用于许多评价目的；(iv)生物特异性表面可以再生，使得在相同条件下可以容易地比较一系列不同的单克隆抗体；(v)分析程序完全自动化，并且无需用户干预即可以进行一系列广泛的测量。BIAapplications手册，AB版(1998年重印)，
代码编号BR-1001-86；BIAtechnology手册，AB版(1998年重印)，
代码编号BR-1001-84。基于SPR的结合研究要求结合对中的一个成员固定在
传感器表面上。固定的结合配偶体称为配体。溶液中的结合配偶体称为分析物。在一些情况下，配体通过与另一种称为捕获分子的固定化分子结合而间接附着于表面。SPR反应反映了当分析物结合或解离时检测器表面处质量浓度的变化。
代码编号BR-1001-86；BIAtechnology手册，AB版(1998年重印)，
代码编号BR-1001-84。基于SPR的结合研究要求结合对中的一个成员固定在
传感器表面上。固定的结合配偶体称为配体。溶液中的结合配偶体称为分析物。在一些情况下，配体通过与另一种称为捕获分子的固定化分子结合而间接附着于表面。SPR反应反映了当分析物结合或解离时检测器表面处质量浓度的变化。
[0448] 基于SPR，实时 测量在相互作用发生时直接监测相互作用。所述技术非常适合于动力学参数的测定。比较亲和力排序易于执行，并且动力学和亲和力常数二者
都可以从传感图数据中导出。
都可以从传感图数据中导出。
[0449] 当分析物以离散脉冲穿过配体表面注射时，所得传感图可以分为三个基本阶段：(i)样品注射过程中分析物与配体的关联；(ii)样品注射过程中的平衡或稳态，其中分析物结合速率通过从复合物中解离来平衡；(iii)缓冲液流动过程中分析物从表面解离。
[0450] 缔合和解离阶段提供了关于分析物-配体相互作用动力学的信息(ka和kd，复合物形成和解离的速率，kd/ka＝KD)。平衡阶段提供了关于分析物-配体相互作用(KD)亲和力的信息。
[0451] BIAevaluation软件提供了使用数值积分和全局拟合算法二者进行曲线拟合的综合工具。通过对数据的合适分析，可以从简单的 研究中获得相互作用的分离
速率和亲和常数。这种技术可以测量的亲和力范围很广，范围从mM到pM。
速率和亲和常数。这种技术可以测量的亲和力范围很广，范围从mM到pM。
[0452] 表位特异性是单克隆抗体的一个重要特征。与使用放射免疫测定法、ELISA或其他表面吸附方法的常规技术形成对比，用 进行表位定位不需要标记或纯化抗
体，并且允许使用几个单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。另外，可以自动处理大量分析。
体，并且允许使用几个单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。另外，可以自动处理大量分析。
[0453] 成对结合实验测试两个Ab同时结合同一抗原的能力。针对不同表位的Ab将独立地结合，而针对相同或密切相关表位的MAb将干扰彼此的结合。用 进行这些结合
实验非常简单。
实验非常简单。
[0454] 在各种实施方案中，生物层干涉测量法(BLI)被用于评估结合，例如octet BLI。
[0455] 肽抑制是用于表位定位的另一种技术。这种方法可以补充成对抗体结合研究，并且当抗原的一级序列已知时，可以将功能表位与结构特征相关联。测试肽或抗原片段对不
同Ab与固定抗原结合的抑制作用。干扰给定Ab结合的肽被认为在结构上与由所述Ab定义的
表位相关。
同Ab与固定抗原结合的抑制作用。干扰给定Ab结合的肽被认为在结构上与由所述Ab定义的
表位相关。
[0456] 除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分说明。参见例如，Sambrook等人编(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编
(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Springs Harbor Laboratory,
NY)；D.N.Glover编,(1985)DNA Cloning,第I和II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide
Synthesis；Mullis等人美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid
Hybridization；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation；Freshney
(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells和Enzymes
(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)APractical Guide To Molecular Cloning；the
treatise.Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,纽约)；Miller和Calos编
(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Cold Spring Harbor
Laboratory)；Wu等人编,Methods In Enzymology,Vols.154 and 155；Mayer和Walker编
(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,伦
敦)；Weir和Blackwell编,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；
Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor.纽约,(1986)；和Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology
(John Wiley and Sons.马里兰州巴尔的摩)。
(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Springs Harbor Laboratory,
NY)；D.N.Glover编,(1985)DNA Cloning,第I和II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide
Synthesis；Mullis等人美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid
Hybridization；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation；Freshney
(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells和Enzymes
(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)APractical Guide To Molecular Cloning；the
treatise.Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,纽约)；Miller和Calos编
(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Cold Spring Harbor
Laboratory)；Wu等人编,Methods In Enzymology,Vols.154 and 155；Mayer和Walker编
(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,伦
敦)；Weir和Blackwell编,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；
Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor.纽约,(1986)；和Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology
(John Wiley and Sons.马里兰州巴尔的摩)。
[0457] 抗体工程的一般原理阐述在Borrebaeck编(1995)Antibody Engineering(第2版；Oxford Univ.Press)中。蛋白质工程的一般原理阐述在Rickwood等人编(1995)Protein
Engineering,APractical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)
中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理阐述在以下中：Nisonoff(1984)Molecular
Immunology(第2版；Sinauer Associates,Sunderland,Mass.)；和Steward(1984)
Antibodies,Their Structure and Function(Chapman and Hall,New York,N.Y.)。另外，本领域已知并且没有确切描述的免疫学方面的标准方法通常根据如下参考文献中：
Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York；Stites等人编(1994)
Basic and Clinical Immunology(第8版；Appleton&Lange,Norwalk,Conn.)以及Mishell
和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and
Co.,NY)。
Engineering,APractical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)
中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理阐述在以下中：Nisonoff(1984)Molecular
Immunology(第2版；Sinauer Associates,Sunderland,Mass.)；和Steward(1984)
Antibodies,Their Structure and Function(Chapman and Hall,New York,N.Y.)。另外，本领域已知并且没有确切描述的免疫学方面的标准方法通常根据如下参考文献中：
Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York；Stites等人编(1994)
Basic and Clinical Immunology(第8版；Appleton&Lange,Norwalk,Conn.)以及Mishell
和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and
Co.,NY)。
[0458] 阐述免疫学的一般原理的标准参考工作包括Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York；Klein(1982)J.,Immunology:The Science of
Self-Nonself Discrimination(John Wiley&Sons,NY)；Kennett等人编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press,NY)；
Campbell(1984)“Monoclonal Antibody Technology”in Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology,ed.Burden等人,(Elsevere,Amsterdam)；Goldsby
等人编(2000)Kuby Immunnology(第4版；H.Freemand&Co.)；Roitt等人(2001)Immunology
(第6版；London:Mosby)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版；
Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann和Dubel(2001)Antibody
Engineering(Springer Verlan)；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A
Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(Prentice
Hall 2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)。
Self-Nonself Discrimination(John Wiley&Sons,NY)；Kennett等人编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press,NY)；
Campbell(1984)“Monoclonal Antibody Technology”in Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology,ed.Burden等人,(Elsevere,Amsterdam)；Goldsby
等人编(2000)Kuby Immunnology(第4版；H.Freemand&Co.)；Roitt等人(2001)Immunology
(第6版；London:Mosby)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版；
Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann和Dubel(2001)Antibody
Engineering(Springer Verlan)；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A
Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(Prentice
Hall 2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)。
[0459] 核酸递送
[0460] 在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的任何核酸分子，例如编码AbCID的核酸，被包装到递送媒介物的表面中或表面上，用于递送至细胞。预期的递送媒介物包括但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。如本领域所述，多种靶向部分可以用于增强此类媒介物与所希望细胞类型或位置的优先相互作用。
[0461] 将本公开文本的复合物、多肽和核酸引入细胞可以通过以下进行：病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
[0462] 示例性递送方法和试剂描述于WO 2018002719中。
[0463] 示例性实施方案
[0464] 实施方案1.一种系统，其包含：(a)第一化学诱导二聚体(CID)组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核酸，所述第一化学诱导二聚体(CID)组分包含(i)能够与小分子相
互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结
合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合
部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二结合部分特异性地结合包
含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点。
互作用以在第一CID组分与小分子之间形成复合物的第一结合部分；和(ii)连接到第一结
合部分的第一衔接子部分；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含(i)和小分子与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的第二结合
部分；和(ii)连接到第二结合部分的第二衔接子部分，其中第二结合部分特异性地结合包
含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点。
[0465] 实施方案2.根据实施方案1所述的系统，其进一步包含小分子，其中第二CID组分在包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点处结合至小分子与
第一CID组分之间的复合物。
第一CID组分之间的复合物。
[0466] 实施方案3.根据实施方案1或2所述的系统，其中包含小分子的至少一部分和第一结合部分的一部分的复合物的位点是小分子与针对小分子的第一结合部分的结合位点之
间的界面，所述界面包含小分子的至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
间的界面，所述界面包含小分子的至少一个原子和第一结合部分的一个原子。
[0467] 实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的系统，其中第一结合部分是与小分子特异性地结合的第一抗体部分。
[0468] 实施方案5.根据实施方案4所述的系统，其中小分子是甲氨蝶呤。
[0469] 实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的系统，其中第一结合部分源自小分子的天然存在的结合配偶体，或其小分子结合变体。
[0470] 实施方案7.根据实施方案6所述的系统，其中天然存在的结合配偶体是Bcl-2、Bcl-xL、FK506结合蛋白(FKBP)或细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)。
[0471] 实施方案8.根据实施方案7所述的系统，其中天然存在的结合配偶体是Bcl-2，并且小分子是ABT-199、ABT-263或其类似物。
[0472] 实施方案9.根据实施方案7所述的系统，其中天然存在的结合配偶体是Bcl-xL，并且小分子是ABT-737或其类似物。
[0473] 实施方案10.根据实施方案7所述的系统，其中天然存在的结合配偶体是FKBP，并且小分子是具有式(I)的结构的雷帕霉素(SLF)的合成配体或其类似物。
[0474] 实施方案11.根据实施方案7所述的系统，其中天然存在的结合配偶体是cIAP1，并且小分子是GDC-0152、LCL161、AT406、CUDC-427、比利那潘或其类似物。
[0475] 实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的系统，其中第二结合部分是与化学表位特异性地结合的抗体部分，所述化学表位包含小分子的至少一部分和第一结合部分
的一部分。
的一部分。
[0476] 实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的系统，其中第二CID组分结合至第一CID组分和小分子的复合物，其中解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离第一CID组分和
游离小分子中的每一个的Kd的约1/500。
游离小分子中的每一个的Kd的约1/500。
[0477] 实施方案14.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含Bcl-xL的ABT-737结合结构域；和(b)第二CID组分或
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-737与第一CID
组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表1的
重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-737与第一CID
组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表1的
重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0478] 实施方案15.根据实施方案14所述的系统，其中ABT-737结合结构域包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列。
[0479] 实施方案16.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第二CID组分包含Bcl-2的ABT-199结合结构域；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-199与第一CID组
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表2的重
链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表2的重
链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0480] 实施方案17.根据实施方案16所述的系统，其中ABT-199结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列。
[0481] 实施方案18.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含Bcl-2的ABT-263结合结构域；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和ABT-263与第一CID组
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表3的重
链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表3的重
链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0482] 实施方案19.根据实施方案18所述的系统，其中ABT-263结合结构域包含SEQ ID NO:315的氨基酸序列。
[0483] 实施方案20.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含FKBP的雷帕霉素(SLF)结合结构域的合成配体，其中
SLF具有式(I)的结构；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和SLF与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中
第二CID组分的抗体部分包含根据表4的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
SLF具有式(I)的结构；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和SLF与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中
第二CID组分的抗体部分包含根据表4的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0484] 实施方案21.根据实施方案20所述的系统，其中SLF结合结构域包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列。
[0485] 实施方案22.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含cIAP1的GDC-0152结合结构域；和(b)第二CID组分或
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和GDC-0152与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表
5的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和GDC-0152与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表
5的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0486] 实施方案23.根据实施方案22所述的系统，其中GDC-0152结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0487] 实施方案24.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组包含cIAP1的LCL161结合结构域；和(b)第二CID组分或编码
第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和LCL161与第一CID组分
之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表6的重链
互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和LCL161与第一CID组分
之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表6的重链
互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0488] 实施方案25.根据实施方案24所述的系统，其中LCL161结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0489] 实施方案26.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含cIAP1的AT406结合结构域；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和AT406与第一CID组分之
间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表7的重链互
补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表7的重链互
补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0490] 实施方案27.根据实施方案26所述的系统，其中AT406结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0491] 实施方案28.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含cIAP1的CUDC-427结合结构域；和(b)第二CID组分或
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和CUDC-427与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表
8的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
编码第二CID组分的多肽组分的第二核酸，所述第二CID组分包含能够和CUDC-427与第一
CID组分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表
8的重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)。
[0492] 实施方案29.根据实施方案28所述的系统，其中CUDC-427结合结构域包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列。
[0493] 实施方案30.一种系统，其包含：(a)第一CID组分或编码第一CID组分的多肽组分的第一核苷酸，所述第一CID组分包含甲氨蝶呤结合型Fab，其中甲氨蝶呤结合型Fab HC-
CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、
321、322和323的氨基酸序列；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核
酸，所述第二CID组分包含能够和甲氨蝶呤与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗
体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表9的重链互补决定区和轻链互补决定区
(CDR)。
CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3分别包含SEQ ID NO:318、319、320、
321、322和323的氨基酸序列；和(b)第二CID组分或编码第二CID组分的多肽组分的第二核
酸，所述第二CID组分包含能够和甲氨蝶呤与第一CID组分之间的复合物特异性地结合的抗
体部分，其中第二CID组分的抗体部分包含根据表9的重链互补决定区和轻链互补决定区
(CDR)。
[0494] 实施方案31.根据实施方案1-30中任一项所述的系统，其中(a)第一衔接子部分包含DNA结合结构域，并且第二衔接子部分包含转录调节结构域；或者(b)第二衔接子部分包
含DNA结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录。
含DNA结合结构域，并且第一衔接子部分包含转录调节结构域，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID能够调节靶基因的转录。
[0495] 实施方案32.根据实施方案31所述的系统，其中(a)转录调节结构域是转录激活结构域，并且CID能够上调靶基因的转录；或者(b)转录调节结构域是转录阻遏物结构域，并且CID能够下调靶基因的转录。
[0496] 实施方案33.根据实施方案31或32所述的系统，其中DNA结合结构域源自天然存在的转录调节因子。
[0497] 实施方案34.根据实施方案31或32所述的系统，其中DNA结合结构域源自RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。
[0498] 实施方案35.根据实施方案34所述的系统，其中RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶是催化性死亡的。
[0499] 实施方案36.根据实施方案35所述的系统，其中DNA结合结构域源自催化性死亡的Cas9(dCas9)。
[0500] 实施方案37.根据实施方案1-30中任一项所述的系统，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与靶细胞相关联的CID时，CID能够
诱导靶细胞死亡。
诱导靶细胞死亡。
[0501] 实施方案38.根据实施方案37所述的系统，其中第一衔接子部分和第二衔接子部分一起能够诱导靶细胞凋亡。
[0502] 实施方案39.根据实施方案38所述的系统，其中第一衔接子部分和/或第二衔接子部分源自半胱天冬酶蛋白。
[0503] 实施方案40.根据实施方案39所述的系统，其中第一衔接子部分和第二衔接子部分源自半胱天冬酶-9。
[0504] 实施方案41.根据实施方案37-40中任一项所述的系统，其中靶细胞是过继转移至个体的工程化细胞。
[0505] 实施方案42.根据实施方案41所述的系统，其中靶细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
[0506] 实施方案43.根据实施方案1-30中任一项所述的系统，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与T细胞相关联的CID时，CID是能够
在结合靶抗原后激活T细胞的异二聚体CAR。
在结合靶抗原后激活T细胞的异二聚体CAR。
[0507] 实施方案44.根据实施方案43所述的系统，其中(a)第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第二衔接子部分包含细胞外抗原结合部分；或者(b)第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；(ii)细胞质共刺
激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部
分；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。
激结构域；和(iii)细胞质信号传导结构域；并且第一衔接子部分包含细胞外抗原结合部
分；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。
[0508] 实施方案45.根据实施方案44所述的系统，其中包含细胞外抗原结合部分的CID组分进一步包含分泌信号肽。
[0509] 实施方案46.根据实施方案43所述的系统，其中(a)第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞外抗原结合部
分；并且第二衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；或者(b)第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和
(iii)细胞外抗原结合部分；并且第一衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号
传导结构域；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。
分；并且第二衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；或者(b)第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；(ii)跨膜结构域；和
(iii)细胞外抗原结合部分；并且第一衔接子部分包含细胞质共刺激结构域或细胞质信号
传导结构域；其中细胞外抗原结合部分特异性地结合靶抗原。
[0510] 实施方案47.根据实施方案43所述的系统，其中第一衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；并且第二衔接子部分包含(i)细胞质共刺激结构域或细胞质信号传导结构域；和(ii)跨膜结构域；其中第一或第二CID组分进一步包含与其结合部分相连的细胞外抗原结合部分；并且其中细胞外抗原结合部分特异
性地结合靶抗原。
性地结合靶抗原。
[0511] 实施方案48.根据实施方案46或47所述的系统，其中第一和第二CID组分一起包含细胞质共刺激结构域和细胞质信号传导结构域。
[0512] 实施方案49.根据实施方案1-30中任一项所述的系统，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成CID时，CID是能够将T细胞重引导至
靶细胞的异二聚体双特异性T细胞接合器。
靶细胞的异二聚体双特异性T细胞接合器。
[0513] 实施方案50.根据实施方案49所述的系统，其中(a)第一衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第二衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分；或者(b)第二衔接子部分包含T细胞抗原结合部分，并且第一衔接子部分包含靶细胞抗原结合部分。
[0514] 实施方案51.根据实施方案50所述的系统，其中T细胞抗原结合部分是与CD3特异性地结合的抗体部分。
[0515] 实施方案52.根据实施方案50或51所述的系统，其中靶细胞抗原结合部分是和与患病细胞相关联的细胞表面抗原特异性地结合的抗体部分。
[0516] 实施方案53.根据实施方案52所述的系统，其中患病细胞是癌细胞。
[0517] 实施方案54.根据实施方案52或53所述的系统，其中靶细胞抗原结合部分是与CD19特异性地结合的抗体部分。
[0518] 实施方案55.根据实施方案1-30中任一项所述的系统，其中第一CID组分和第二CID组分被配置成使得当在小分子的存在下二聚化形成与免疫细胞相关联的CID时，CID是
能够调节免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子。
能够调节免疫细胞激活的异二聚体信号传导分子。
[0519] 实施方案56.根据实施方案55所述的系统，其中第一衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域；并且第二衔接子部分包含(i)跨膜结构域；和(ii)细胞质共刺激结构域。
[0520] 实施方案57.根据实施方案56所述的系统，其中第一衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域和/或第二衔接子部分进一步包含细胞质信号传导结构域。
[0521] 实施方案58.根据实施方案55-57中任一项所述的系统，其中免疫细胞是T细胞。
[0522] 实施方案59.根据实施方案58所述的系统，其中T细胞是CAR T细胞。
[0523] 实施方案60.一种从结合分子文库中选择结合部分的方法，其中结合部分特异性地结合小分子与同源结合部分之间的复合物，所述方法包括：(a)对结合部分输入组筛选出在小分子不存在时不与同源结合部分结合的结合部分，从而产生反选择的结合部分组；和
(b)对结合部分输入组筛选出和小分子与同源结合部分的复合物结合的结合部分，从而产
生阳性选择的结合部分组；和(c)进行一轮或多轮筛选，其中每轮筛选包括步骤(a)的筛选
和步骤(b)的筛选，使得产生和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合
部分组。
(b)对结合部分输入组筛选出和小分子与同源结合部分的复合物结合的结合部分，从而产
生阳性选择的结合部分组；和(c)进行一轮或多轮筛选，其中每轮筛选包括步骤(a)的筛选
和步骤(b)的筛选，使得产生和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合
部分组。
[0524] 实施方案61.根据实施方案60所述的方法，其中所述方法包括两轮或更多轮筛选，并且其中(1)对于第一轮筛选，步骤(a)的结合部分输入组是结合分子文库，(2)对于每轮筛选，步骤(b)的所述结合部分输入组是来自给定轮筛选的步骤(a)的所述反选择的结合部分
组，(3)对于第一轮筛选后的每轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是来自前一轮筛选
的步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组，以及(4)对于最后一轮筛选，和小分子与同源结
合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组是步骤(b)的所述阳性选择的结合部分
组。
组，(3)对于第一轮筛选后的每轮筛选，步骤(a)的所述结合部分输入组是来自前一轮筛选
的步骤(b)的所述阳性选择的结合部分组，以及(4)对于最后一轮筛选，和小分子与同源结
合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组是步骤(b)的所述阳性选择的结合部分
组。
[0525] 实施方案62.根据实施方案61所述的方法，其包括至少2轮选择。
[0526] 实施方案63.根据实施方案60-62中任一项所述的方法，其中和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的至少一个结合部分结合至复合物，其中
解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/
500。
解离常数(Kd)不超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/
500。
[0527] 实施方案64.根据实施方案63所述的方法，其中和小分子与同源结合部分之间的复合物特异性地结合的结合部分组中的每个结合部分结合至复合物，其中解离常数(Kd)不
超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/500。
超过其用于结合至游离小分子和游离同源结合部分中的每一个的Kd的约1/500。
[0528] 实施方案65.根据实施方案60-64中任一项所述的方法，其中结合分子文库是抗体文库、DARPin文库、纳米抗体文库或适体文库。
[0529] 实施方案66.根据实施方案65所述的方法，其中结合分子文库是抗体文库。
[0530] 实施方案67.根据实施方案66所述的方法，其中抗体文库是噬菌体展示的Fab文库。
[0531] 实施方案68.一种构建体，其包含和小分子与结合部分之间的复合物特异性地结合的抗体部分，所述构建体通过包括以下步骤的方法制备：(A)根据实施方案60-67中任一
项所述的方法从抗体文库中选择抗体部分；和(B)提供包含(A)的抗体部分中的一种的构建
体。
项所述的方法从抗体文库中选择抗体部分；和(B)提供包含(A)的抗体部分中的一种的构建
体。
[0532] 实施方案69.根据实施方案1-59中任一项所述的系统，其中第二结合部分是通过包括以下步骤的方法选择的抗体部分：(A)根据实施方案60-67中任一项所述的方法从抗体
文库中选择抗体部分；和(B)选择第二结合部分作为(A)的抗体部分中的一种。
文库中选择抗体部分；和(B)选择第二结合部分作为(A)的抗体部分中的一种。
[0533] 实施方案70.一种调节细胞中靶基因表达的方法，其包括在细胞中表达根据实施方案31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分，并修改细胞中小分子的量以调节靶
基因表达。
基因表达。
[0534] 实施方案71.一种治疗个体的疾病的方法，其包括：(A)在个体的靶细胞中表达根据实施方案31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分，其中靶基因在靶细胞中的表
达水平与疾病相关联；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
达水平与疾病相关联；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0535] 实施方案72.一种核酸，其编码根据实施方案31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0536] 实施方案73.一种细胞，其包含根据实施方案31-36中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0537] 实施方案74.一种控制个体中靶细胞存活的方法，其包括：(A)在靶细胞中表达根据实施方案37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和(B)以有效(I)杀死预定量
的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予小分子。
的靶细胞；或(II)保持预定量的靶细胞的方案向个体给予小分子。
[0538] 实施方案75.根据实施方案74所述的方法，其中靶细胞是个体中过继细胞疗法的一部分。
[0539] 实施方案76.根据实施方案75所述的方法，其中靶细胞是CAR T细胞。
[0540] 实施方案77.一种治疗个体的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予针对疾病的过继细胞疗法，所述疗法包括修饰的细胞，其中所述修饰的细胞表达根据实施方案37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和(B)以有效(I)杀死预定量的过继转移细胞；或
(II)保持预定量的过继转移细胞的方案向个体给予小分子。
(II)保持预定量的过继转移细胞的方案向个体给予小分子。
[0541] 实施方案78.根据实施方案77所述的方法，其中过继细胞疗法是CAR T细胞疗法。
[0542] 实施方案79.一种核酸，其编码根据实施方案37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0543] 实施方案80.一种细胞，其包含根据实施方案37-42中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0544] 实施方案81.根据实施方案80所述的细胞，其中所述细胞是过继细胞疗法的一部分。
[0545] 实施方案82.根据实施方案81所述的细胞，其中所述细胞是CAR T细胞。
[0546] 实施方案83.一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予表达根据实施方案43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分的经修饰的T细胞，其
中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小
分子。
中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效调节对靶细胞免疫应答的方案向个体给予小
分子。
[0547] 实施方案84.一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达根据实施方案44所述的系统的CID组分，所述CID组分
包含细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予根据实施方案44所述的系统的CID组分，所述
CID组分包含细胞外抗原结合部分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效调节对
靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
包含细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予根据实施方案44所述的系统的CID组分，所述
CID组分包含细胞外抗原结合部分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效调节对
靶细胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
[0548] 实施方案85.根据实施方案83或84所述的方法，其中与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地维持对靶细胞
的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
[0549] 实施方案86.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予表达根据实施方案43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分的经修饰的T细
胞，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
胞，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0550] 实施方案87.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予修饰的T细胞，所述修饰的T细胞表达根据实施方案44所述的系统的CID组分，所述CID
组分包含细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予根据实施方案44所述的系统的CID组分，
所述CID组分包含细胞外抗原结合部分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效治
疗疾病的方案向个体给予小分子。
组分包含细胞质信号传导结构域；(B)向个体给予根据实施方案44所述的系统的CID组分，
所述CID组分包含细胞外抗原结合部分，其中靶抗原在靶细胞表面上表达；和(C)以有效治
疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0551] 实施方案88.根据实施方案86或87所述的方法，其中与包括将表达了含有CID的对应CAR结构域的常规CAR的CAR T细胞给予的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0552] 实施方案89.一种核酸，其编码根据实施方案43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0553] 实施方案90.一种T细胞，其包含根据实施方案43-48中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0554] 实施方案91.一种T细胞，其包含根据实施方案44所述的系统的CID组分，所述CID组分包含所述细胞质信号传导结构域。
[0555] 实施方案92.一种调节个体中对靶细胞免疫应答的方法，其包括：(A)向个体给予根据实施方案49-54中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和(B)以有效调节对靶细
胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
胞免疫应答的方案向个体给予小分子。
[0556] 实施方案93.根据实施方案92所述的方法，其中与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地维
持对靶细胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
持对靶细胞的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
[0557] 实施方案94.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)向个体给予根据实施方案49-54中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和(B)以有效治疗疾
病的方案向个体给予小分子。
病的方案向个体给予小分子。
[0558] 实施方案95.根据实施方案94所述的方法，其中与包括将包含CID的对应双特异性T细胞接合器结构域的常规双特异性T细胞接合器给予的对应方法相比，所述方案有效地治
疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
疗所述疾病，同时对个体的副作用更少。
[0559] 实施方案96.一种核酸，其编码根据实施方案49-54中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0560] 实施方案97.一种调节个体中由T细胞介导的免疫应答的方法，其包括：(A)在T细胞中表达根据实施方案55-59中任一项所述的系统的第一和第二CID组分；和(B)以有效调
节由T细胞介导的免疫应答的方案向个体给予小分子。
节由T细胞介导的免疫应答的方案向个体给予小分子。
[0561] 实施方案98.根据实施方案97所述的方法，其中与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地维持由T细胞
介导的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
介导的免疫应答，同时对个体的副作用更少。
[0562] 实施方案99.一种治疗个体中以靶细胞为特征的疾病的方法，其包括：(A)在个体中在能够识别并杀死靶细胞的T细胞中表达根据实施方案55-59中任一项所述的系统的第
一和第二CID组分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
一和第二CID组分；和(B)以有效治疗疾病的方案向个体给予小分子。
[0563] 实施方案100.根据实施方案99所述的方法，其中与包括在T细胞中表达包含CID的对应信号传导结构域的单体信号传导分子的对应方法相比，所述方案有效地治疗所述疾
病，同时对个体的副作用更少。
病，同时对个体的副作用更少。
[0564] 实施方案101.根据实施方案97-100中任一项的方法，其中T细胞是CAR T细胞。
[0565] 实施方案102.一种核酸，其编码根据实施方案55-59中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0566] 实施方案103.一种T细胞，其包含根据实施方案55-59中任一项所述的系统的第一和第二CID组分。
[0567] 实施方案104.根据实施方案103所述的T细胞，其中T细胞是CAR T细胞。
[0568] 本公开文本已在上文参照特定替代方案加以描述。然而，在本公开文本的范围内，除了上述之外的其他替代方案同样是可能的。在本公开文本的范围内，可以提供与上述不同的方法步骤。本文所述的不同特征和步骤可以按除了描述的那些之外的其他组合来组
合。
合。
[0569] 相对于本文中复数和/或单数术语的使用，本领域的技术人员可以根据环境和/或应用酌情从复数转化为单数和/或从单数转化为复数。为清楚起见，本文可能明确阐述各种单数/复数排列。
[0570] 本领域技术人员将理解，通常，本文并且尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在为“开放”术语(例如术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。
[0571] 另外，当本公开文本的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本公开文本还由此以马库什组的任何单独的成员或成员子组描述。
[0572] 第一至第十一方面的替代方案的任何特征都适用于本文确定的所有方面和替代方案。此外，第一至第十一方面的替代方案的任何特征可独立地、部分地或全部地与本文以任何方式描述的其他替代方案组合，例如，一个、两个或三个或更多个替代方案可以全部或部分地组合。此外，第一至第十一方面的替代方案的任何特征可以对其他方面或替代方案
是任选的。尽管上文根据不同举例替代方案和实现方式进行了描述，但应理解，在一个或多个单独的替代方案中描述的各种特征、方面和功能不限于其对所描述的具体替代方案的适
用性，相反可以单独或者以不同组合应用于本申请的一个或多个其他替代方案中，不论是
否描述此类替代方案并且不论是否将此类特征作为所描述的替代方案的一部分呈现。因
此，本申请的宽度和范围不应由任何上述举例替代方案所限制。
是任选的。尽管上文根据不同举例替代方案和实现方式进行了描述，但应理解，在一个或多个单独的替代方案中描述的各种特征、方面和功能不限于其对所描述的具体替代方案的适
用性，相反可以单独或者以不同组合应用于本申请的一个或多个其他替代方案中，不论是
否描述此类替代方案并且不论是否将此类特征作为所描述的替代方案的一部分呈现。因
此，本申请的宽度和范围不应由任何上述举例替代方案所限制。
[0573] 本文中引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开文本相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或
优先于任何这种矛盾的材料。就通过引用并入本文的出版物和专利或专利申请与说明书中
包含的公开文本相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
优先于任何这种矛盾的材料。就通过引用并入本文的出版物和专利或专利申请与说明书中
包含的公开文本相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
[0574] 本公开文本的一个或多个实施方案的详情在下文的随附描述中进行阐述。与本文所述的类似或等同的任何材料和方法都可以用于实践或测试本公开文本。本公开文本的其
他特征、目标和优势将根据所述描述显而易知。在描述中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开
文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。在冲突的情况下，以本发明的描述
为准。
他特征、目标和优势将根据所述描述显而易知。在描述中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开
文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。在冲突的情况下，以本发明的描述
为准。
[0575] 应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据它们进行的各种修改或改变将为本领域技术人员知晓，并且应包括在本申请的精神和范围内以及所附
权利要求的范围内。本文引用的所有公开、专利和专利申请出于所有目的据此通过引用以
其整体并入本文。
权利要求的范围内。本文引用的所有公开、专利和专利申请出于所有目的据此通过引用以
其整体并入本文。
[0576] 通过以下非限制性实施例进一步说明了本文提供的本公开文本的一些实施方案。
[0577] 实施例
[0578] 材料和方法
[0579] 小分子和肽试剂
[0580] 无需进一步纯化即可使用ABT-737(ChemieTek CT-A737)、ABT-263(Selleckchem S1001)、ABT-199(LC-Laboratories V-3579)、甲氨蝶呤(Sigma-Aldrich A6770)和Bak肽
(Anaspec AS-61616)。使用时，将ABT-737、ABT-263、ABT-199和甲氨蝶呤和Bak肽(SEQ ID NO:324)分别溶解在DMSO中作为10mM储备液。将储备液保存在-80℃下直到使用。
(Anaspec AS-61616)。使用时，将ABT-737、ABT-263、ABT-199和甲氨蝶呤和Bak肽(SEQ ID NO:324)分别溶解在DMSO中作为10mM储备液。将储备液保存在-80℃下直到使用。
[0581] 配体溶剂暴露分析
[0582] 在蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中使用其内部高级搜索功能鉴定了小分子-蛋白质复合物。使用的搜索参数是：分子量搜索：最小分子量＝
100.0最大分子量＝50000.0和结合亲和力：结合亲和力最小为0.001，和结合亲和力最大为
1000，和亲和性类型为Ki，并且分类(TAXONOMY)只是智人(人)，并且分类(TAXONOMY)仅只是智人(人)。然后用手整理产生的列表，以便除去配体不是有机小分子的复合物，从而得到
866个结构的最终列表。结合配体的溶剂可及表面积使用Naccess V2.1.1用默认参数计算，在所述计算中考虑了氢以及杂原子。使用ggplot2软件包在R-studio中产生溶剂暴露表面
积的图。
100.0最大分子量＝50000.0和结合亲和力：结合亲和力最小为0.001，和结合亲和力最大为
1000，和亲和性类型为Ki，并且分类(TAXONOMY)只是智人(人)，并且分类(TAXONOMY)仅只是智人(人)。然后用手整理产生的列表，以便除去配体不是有机小分子的复合物，从而得到
866个结构的最终列表。结合配体的溶剂可及表面积使用Naccess V2.1.1用默认参数计算，在所述计算中考虑了氢以及杂原子。使用ggplot2软件包在R-studio中产生溶剂暴露表面
积的图。
[0583] BCL-xL的表达和生物素化
[0584] 编码带有N-末端Avi标签的C-末端截短的BCL-xL(残基2-215)的基因是作为gBlockTM(IDT)购买的。使用Gibson克隆将所述基因克隆到pMCSG7载体中(Kong等人,
Biomol.Ther.,21:423434(2013))。然后使用视觉定向诱变将烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点
引入Avi标签与BCL-xL结构域之间。通过整个基因的测序证实最终构建体的序列。将质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞中，并使用单个菌落接种1.5L含有羧苄青霉素(100μg/mL)的
2xYT培养基。使培养物在37℃下生长至OD600为1-1.2，冷却至18℃保持1h，并且然后用
0.5mM IPTG在18℃下诱导过夜。通过离心收获细胞，并将沉淀储存在-80℃下。
Biomol.Ther.,21:423434(2013))。然后使用视觉定向诱变将烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点
引入Avi标签与BCL-xL结构域之间。通过整个基因的测序证实最终构建体的序列。将质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞中，并使用单个菌落接种1.5L含有羧苄青霉素(100μg/mL)的
2xYT培养基。使培养物在37℃下生长至OD600为1-1.2，冷却至18℃保持1h，并且然后用
0.5mM IPTG在18℃下诱导过夜。通过离心收获细胞，并将沉淀储存在-80℃下。
[0585] 为了蛋白质纯化，将沉淀在0℃下解冻，并且然后重新悬浮在10mL补充有PMSF(100μg/mL)的裂解缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，20mM咪唑)中。使用微流体化器
(micro-fludizer)裂解细胞，并通过在4℃下离心来清除裂解物。将清除的裂解物添加至
400μL Ni-NTA超流动树脂(Qiagen)中，并在4℃下旋转1h。用裂解缓冲液洗涤树脂(3x)，并且然后转移至旋转柱。用洗脱缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，600mM咪唑)洗脱纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE分析级分并将纯度>95％的那些级分合并，交换到储存缓冲液
(25mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，1mM DTT)中并浓缩。
(micro-fludizer)裂解细胞，并通过在4℃下离心来清除裂解物。将清除的裂解物添加至
400μL Ni-NTA超流动树脂(Qiagen)中，并在4℃下旋转1h。用裂解缓冲液洗涤树脂(3x)，并且然后转移至旋转柱。用洗脱缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，600mM咪唑)洗脱纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE分析级分并将纯度>95％的那些级分合并，交换到储存缓冲液
(25mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，1mM DTT)中并浓缩。
[0586] 使用由Avidity提供的标准方案，将纯化的BCL-xL蛋白在其Avi标签上生物素化。通过Xevo G2-XS质谱仪(Waters)上完整的蛋白质质谱监测生物素化，并发现是定量的。然
后如上所述在Ni-NTA上纯化生物素化的BCL-xL，分离成等分试样，速冻并在-80℃下储存以备后用。
后如上所述在Ni-NTA上纯化生物素化的BCL-xL，分离成等分试样，速冻并在-80℃下储存以备后用。
[0587] 噬菌体展示选择和噬菌体滴度测定
[0588] 所有噬菌体选择都是根据先前建立的方案进行的(Seiler等人,Nucleic Acids Res.,42:D12531260(2014)。简而言之，使用用链霉亲和素包被的磁珠(Promega)捕获的生
物素化BCL-xL进行抗体噬菌体文库F的选择。在每次选择之前，将噬菌体库在不存在ABT-
737的情况下与固定在链霉亲和素珠上的1μM BCL-xL孵育，以便耗尽与BCL-xL apo形式的
任何结合者的文库。随后，除去珠粒，并将浓度为1μM的ABT-737添加至噬菌体库中。用渐减的BCL-xL抗原的量(100nM、50nM、10nM和10nM)总共进行了四轮筛选。为了减少非特异性结合噬菌体的有害影响，我们采用了一种“捕获和释放”策略，其中通过添加2μg/mL TEV蛋白酶从磁珠中选择性洗脱特异性的BCL-xL结合型Fab噬菌体。分析来自第四轮选择的单独噬
菌体克隆以便测序。
物素化BCL-xL进行抗体噬菌体文库F的选择。在每次选择之前，将噬菌体库在不存在ABT-
737的情况下与固定在链霉亲和素珠上的1μM BCL-xL孵育，以便耗尽与BCL-xL apo形式的
任何结合者的文库。随后，除去珠粒，并将浓度为1μM的ABT-737添加至噬菌体库中。用渐减的BCL-xL抗原的量(100nM、50nM、10nM和10nM)总共进行了四轮筛选。为了减少非特异性结合噬菌体的有害影响，我们采用了一种“捕获和释放”策略，其中通过添加2μg/mL TEV蛋白酶从磁珠中选择性洗脱特异性的BCL-xL结合型Fab噬菌体。分析来自第四轮选择的单独噬
菌体克隆以便测序。
[0589] 噬菌体滴度是根据标准方案进行的。简而言之，将TEV洗脱噬菌体用于感染对数生长期XL1-Blue大肠杆菌细胞(Stratagene)。将感染的细胞在室温下在定轨振荡器上孵育20
分钟。然后将细胞连续稀释，并连同羧苄青霉素(50μg/mL)点在LB琼脂板上，并在37℃下孵育过夜。针对BCL-xL/ABT-737复合物和apo BCL-xL二者的每一轮选择测量噬菌体滴度。
分钟。然后将细胞连续稀释，并连同羧苄青霉素(50μg/mL)点在LB琼脂板上，并在37℃下孵育过夜。针对BCL-xL/ABT-737复合物和apo BCL-xL二者的每一轮选择测量噬菌体滴度。
[0590] Fab的表达
[0591] 根据先前描述的方案表达Fab(Seiler等人,Nucleic Acids Res.,42:D1253-1260(2014))。简而言之，使含有表达质粒的C43(DE3)Pro+大肠杆菌在37℃下在2xYT中生长至
OD600为0.6-0.8，并且然后通过添加1mM IPTG诱导Fab表达。将孵育温度随后降低至30℃，并将培养物摇动16-18h。通过离心收获细胞，并通过蛋白A亲和色谱纯化Fab。使用Xevo G2-XS质谱仪(Waters)通过SDS-PAGE和完整蛋白质质谱来评估Fab纯度和完整性。
OD600为0.6-0.8，并且然后通过添加1mM IPTG诱导Fab表达。将孵育温度随后降低至30℃，并将培养物摇动16-18h。通过离心收获细胞，并通过蛋白A亲和色谱纯化Fab。使用Xevo G2-XS质谱仪(Waters)通过SDS-PAGE和完整蛋白质质谱来评估Fab纯度和完整性。
[0592] Fab ELISA
[0593] ELISA是根据标准方案进行的。简而言之，将96孔Maxisorp板在4℃下用中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)(10μg/ml)包被过夜，并且随后在20℃下用BSA(2％w/v)封闭1h。将
20nM生物素化的BCL-xL在包被有中性抗生物素蛋白的孔中捕获30分钟，随后添加不同浓度
的Fab连同1μM ABT-737或0.05％DMSO，保持30分钟。然后使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗Fab单克隆抗体(Jackson ImmunoResearch 109-036-097)检测结合的Fab。
20nM生物素化的BCL-xL在包被有中性抗生物素蛋白的孔中捕获30分钟，随后添加不同浓度
的Fab连同1μM ABT-737或0.05％DMSO，保持30分钟。然后使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗Fab单克隆抗体(Jackson ImmunoResearch 109-036-097)检测结合的Fab。
[0594] 结合动力学分析
[0595] 使用Octet RED384仪器(ForteBio)测量生物层干涉测量数据。使用200nM溶液将生物素化的BCL-xL固定在链霉亲和素(SA)生物传感器上。将在具有小分子(1μM)、肽(5μM)或媒介物(0.05％DMSO)的动力学缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％吐温-20，0.2％BSA，10μM生物素)中连续稀释的Fab用作分析物。使用Octet RED384软件根据数据的全局拟合(1:1)计算
亲和力(KD)和动力学参数(kon和koff)。
亲和力(KD)和动力学参数(kon和koff)。
[0596] 产生用于细胞测定的载体
[0597] 使用Gibson克隆将Fab AZ1转换为先前描述的单链Fab构建体(Hornsby等人,Mol.Cell.Proteomics,14:2833-2847(2015))。
[0598] 编码常规CAR构建体(CD8信号序列-Myc标签-αCD19scFv-CD8铰链结构域-CD8跨膜结构域-4IBB共刺激区-CD3ζ结构域)的基因是作为gBlockTM(IDT)购买的。将所述基因通过PCR扩增，并使用Gibson克隆将其克隆到pLX302载体(Addgene质粒#25896)中。通过整个基
因的测序证实最终构建体的序列。通过以下产生AbCID CAR构建体：通过Gibson克隆用BCL-xL基因(残基2-215)替代常规CAR载体的αCD19scFv部分，随后通过定点诱变将BCL-xL转化
为BCL-xL(M159P)。M159P突变先前已被证实可以防止BCL-xL形成结构域交换的二聚体
(Koerber等人,J.Mol.Biol.,427:576-586(2015))。我们担心AbCID CAR在细胞膜上的二维
限制会促进BCL-xL(WT)中二聚体的形成，并导致CAR T细胞的抗原非依赖性激活。M159P突
变不影响ABT-737或AZ1结合(数据未示出)。通过整个基因的测序证实最终构建体的序列。
因的测序证实最终构建体的序列。通过以下产生AbCID CAR构建体：通过Gibson克隆用BCL-xL基因(残基2-215)替代常规CAR载体的αCD19scFv部分，随后通过定点诱变将BCL-xL转化
为BCL-xL(M159P)。M159P突变先前已被证实可以防止BCL-xL形成结构域交换的二聚体
(Koerber等人,J.Mol.Biol.,427:576-586(2015))。我们担心AbCID CAR在细胞膜上的二维
限制会促进BCL-xL(WT)中二聚体的形成，并导致CAR T细胞的抗原非依赖性激活。M159P突
变不影响ABT-737或AZ1结合(数据未示出)。通过整个基因的测序证实最终构建体的序列。
[0599] CD19的基因获自ORFeome(Rajan等人,Sci.Rep.,5:10609(2015))，并通过重叠延伸PCR与P2A-mCherry基因融合。使用Gibson克隆将基因克隆到pLX302载体中。通过整个基
因的测序证实最终构建体的序列。
因的测序证实最终构建体的序列。
[0600] 细胞系的培养
[0601] 使用的NFAT报告物Jurkat细胞是来自Arthur Weiss的慷慨礼物。使用的K562和HEK293T细胞来自由Wells实验室保存的冷冻储备物。细胞系在使用前未经验证。未进行支
原体属污染测试。除非另有说明，否则所有的Jurkat和K562细胞系都在补充有10％FBS和1X青霉素/链霉素的RPMI中培养。将所有Jurkat NFAT报告细胞都保存在G418(2mg/mL)中。除
G418之外，将所有含有CAR的Jurkat细胞系都维持在嘌呤霉素(2μg/mL)中。将CD19+K562细胞维持在嘌呤霉素(2μg/mL)中。将含有Gal4-UAS-Fluc操纵子的HEK293T细胞维持在补充有
10％FBS、1X青霉素/链霉素和嘌呤霉素(2μg/mL)的高葡萄糖DMEM中。将所有细胞系在37℃和5％CO2下培养。
原体属污染测试。除非另有说明，否则所有的Jurkat和K562细胞系都在补充有10％FBS和1X青霉素/链霉素的RPMI中培养。将所有Jurkat NFAT报告细胞都保存在G418(2mg/mL)中。除
G418之外，将所有含有CAR的Jurkat细胞系都维持在嘌呤霉素(2μg/mL)中。将CD19+K562细胞维持在嘌呤霉素(2μg/mL)中。将含有Gal4-UAS-Fluc操纵子的HEK293T细胞维持在补充有
10％FBS、1X青霉素/链霉素和嘌呤霉素(2μg/mL)的高葡萄糖DMEM中。将所有细胞系在37℃和5％CO2下培养。
[0602] 免疫印迹
[0603] 以大约0.5×106个细胞/孔将HEK293T细胞铺板在6孔板中，并且在转染前在37℃和5％CO2下培养过夜。按照制造商的程序，使用TransIT-293(Mirus Bio)用编码scAZ1-avi标签的质粒转染细胞。将细胞在37℃下进一步孵育48h。将细胞用PBS洗涤，并用补充有
CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂(Thermo
Scientific)在4℃下裂解10分钟。使用抗Avi标签抗体(GenScript小鼠mAb，A01738)进行免疫印迹。
CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂(Thermo
Scientific)在4℃下裂解10分钟。使用抗Avi标签抗体(GenScript小鼠mAb，A01738)进行免疫印迹。
[0604] CRISPRa介导的萤光素酶测定
[0605] 对于CRISPRa介导的转录激活，以约0.5×106个细胞/孔将含有Gal4-UAS-Fluc操纵子的报告物HEK293T细胞系(Collaboration,O.R,Nat.Methods,13:191-192(2016))接种
在6孔板中，并在5％CO2下于37℃下培养过夜。用编码scAZ1-VPR的质粒和另一种编码
dCas9-BCL-xL和Gal4 sgRNA的质粒以1:1的比率转染细胞。在转染后24小时，将转染的细胞胰蛋白酶化并重新悬浮在补充有10％FBS的新鲜DMEM中。然后将细胞等分到96孔聚-D-赖氨
酸包被的板(Corning)中，并使其贴壁24h，之后添加20nM ABT-737以诱导CRISPRa活性。然后，在评价萤光素酶基因表达之前，将细胞进一步孵育48h。为了测定萤光素酶活性，用
Bright-Glo萤光素酶分析底物(Promega)裂解细胞，并使用Infinite M200 PRO板读取器
(Tecan)分析。将萤光素酶活性用阴性对照(表达全长dCas9-VPR和PHOX2B阴性-sgRNA的细
胞)进行背景消减，并针对阳性对照(表达全长dCas9-VPR和Gal4 sgRNA的细胞)进行归一
化。为了研究细胞剂量反应，在细胞被转染并等分到96孔板后，向细胞中添加不同浓度的
ABT-737(0.014nM、0.041nM、0.12nM、0.37nM、1.1nM、3.3nM、10nM、30nM、90nM、270nM)。
在6孔板中，并在5％CO2下于37℃下培养过夜。用编码scAZ1-VPR的质粒和另一种编码
dCas9-BCL-xL和Gal4 sgRNA的质粒以1:1的比率转染细胞。在转染后24小时，将转染的细胞胰蛋白酶化并重新悬浮在补充有10％FBS的新鲜DMEM中。然后将细胞等分到96孔聚-D-赖氨
酸包被的板(Corning)中，并使其贴壁24h，之后添加20nM ABT-737以诱导CRISPRa活性。然后，在评价萤光素酶基因表达之前，将细胞进一步孵育48h。为了测定萤光素酶活性，用
Bright-Glo萤光素酶分析底物(Promega)裂解细胞，并使用Infinite M200 PRO板读取器
(Tecan)分析。将萤光素酶活性用阴性对照(表达全长dCas9-VPR和PHOX2B阴性-sgRNA的细
胞)进行背景消减，并针对阳性对照(表达全长dCas9-VPR和Gal4 sgRNA的细胞)进行归一
化。为了研究细胞剂量反应，在细胞被转染并等分到96孔板后，向细胞中添加不同浓度的
ABT-737(0.014nM、0.041nM、0.12nM、0.37nM、1.1nM、3.3nM、10nM、30nM、90nM、270nM)。
[0606] 双特异性抗体的表达
[0607] 将Expi293(Life Technologies)细胞与两个pFUSE(InvivoGen)载体瞬时共转染，这些载体带有以1:1比率遗传融合到αCD19 scFv的AZ1重链和AZ1轻链。根据制造商的说明，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Life Technologies)进行转染。将细胞在5％CO2环境
中于37℃下孵育7天，然后通过离心收获上清液。通过蛋白A亲和色谱纯化蛋白质，并通过
SDS-PAGE评估质量和完整性。
中于37℃下孵育7天，然后通过离心收获上清液。通过蛋白A亲和色谱纯化蛋白质，并通过
SDS-PAGE评估质量和完整性。
[0608] 细胞系的产生
[0609] 通过慢病毒转导产生为T细胞激活实验所产生的所有含有CAR的Jurkat细胞和+
CD19K562细胞。为了产生病毒，在-80％汇合度下，用第二代慢病毒包装质粒的混合物转染HEK293T细胞。将FuGene HD(Promega)用于在六孔板中每孔使用3jig DNA(1.35jig pCMV
delta8.91、0.15jig pMD2-G，1.5jig pLX302)和7.5jiL的FuGene HD进行质粒的转染。在用转染混合物孵育6小时后，更换培养基以完成DMEM。转染后72小时，收获上清液并通过经过
0.2jim过滤器进行清除。用8jig/mL聚凝胺将清除的上清液添加至目标Jurkat NFAT报告细
胞和K562细胞(-100万个细胞/mL)中，并将细胞以1000g在33℃下离心2h。然后将细胞与病
毒上清液混合物孵育过夜，然后将培养基换成新鲜的完整RPMI。在药物选择培养基中生长
之前将细胞最少扩增48h。通过添加2jig/mL嘌呤霉素开始进行稳定细胞系的药物选择。在
含有嘌呤霉素的培养基中孵育至少72小时后，通过流式细胞术分析细胞中CAR或CD19的表
达。通过流式细胞术，针对经由P2A序列与CD19遗传连接的细胞内mCherry标记物的表达进
行门控，来富集CD19+K562细胞的高表达群体。通过流式细胞术，使用Myc标签小鼠mAb
Alexa Fluor647缀合物(Cell Signaling 2233S)针对Myc标签抗体染色进行门控，来富集
展示高水平CAR的Jurkat细胞。所有流式细胞术细胞分选都是使用AriaII(BD
Biosciences)进行的。
CD19K562细胞。为了产生病毒，在-80％汇合度下，用第二代慢病毒包装质粒的混合物转染HEK293T细胞。将FuGene HD(Promega)用于在六孔板中每孔使用3jig DNA(1.35jig pCMV
delta8.91、0.15jig pMD2-G，1.5jig pLX302)和7.5jiL的FuGene HD进行质粒的转染。在用转染混合物孵育6小时后，更换培养基以完成DMEM。转染后72小时，收获上清液并通过经过
0.2jim过滤器进行清除。用8jig/mL聚凝胺将清除的上清液添加至目标Jurkat NFAT报告细
胞和K562细胞(-100万个细胞/mL)中，并将细胞以1000g在33℃下离心2h。然后将细胞与病
毒上清液混合物孵育过夜，然后将培养基换成新鲜的完整RPMI。在药物选择培养基中生长
之前将细胞最少扩增48h。通过添加2jig/mL嘌呤霉素开始进行稳定细胞系的药物选择。在
含有嘌呤霉素的培养基中孵育至少72小时后，通过流式细胞术分析细胞中CAR或CD19的表
达。通过流式细胞术，针对经由P2A序列与CD19遗传连接的细胞内mCherry标记物的表达进
行门控，来富集CD19+K562细胞的高表达群体。通过流式细胞术，使用Myc标签小鼠mAb
Alexa Fluor647缀合物(Cell Signaling 2233S)针对Myc标签抗体染色进行门控，来富集
展示高水平CAR的Jurkat细胞。所有流式细胞术细胞分选都是使用AriaII(BD
Biosciences)进行的。
[0610] CAR-T细胞激活的量化
[0611] 将表达CAR的Jurkat细胞与抗原阳性(CD19+)或抗原阴性(CD19-)K562靶细胞以1:2的比率混合。将双特异性抗体(AZ1-αCD19)或Fab(AZ1)和ABT-737或DMSO在培养基中稀释并添加至细胞混合物中。在37℃下孵育过夜后，通过离心沉淀细胞。使用FACSCanto II(BD
Biosciences)通过流式细胞术定量NFAT依赖的GFP报告物表达。使用APC抗人CD69抗体
(Biolegend 310910)，使用FACSCanto II(BD Biosciences)通过免疫荧光流式细胞术定量
CD69表达。通过收集上清液定量IL-2分泌，并使用按照制造商方案设置的BD人IL-2ELISA通过ELISA进行分析。所有流式细胞术数据分析均使用FlowJo软件进行，并且所有图均使用
Prism软件(GraphPad)产生。
Biosciences)通过流式细胞术定量NFAT依赖的GFP报告物表达。使用APC抗人CD69抗体
(Biolegend 310910)，使用FACSCanto II(BD Biosciences)通过免疫荧光流式细胞术定量
CD69表达。通过收集上清液定量IL-2分泌，并使用按照制造商方案设置的BD人IL-2ELISA通过ELISA进行分析。所有流式细胞术数据分析均使用FlowJo软件进行，并且所有图均使用
Prism软件(GraphPad)产生。
[0612] ABT-737细胞毒性的测定
[0613] 以每孔约5000个细胞将WT Jurkat、AbCID CAR Jurkat、常规CAR Jurkat、WT K562、CD19+K562和HEK293T细胞铺板在96孔板中。将每种细胞系都与不同浓度的ABT-737
(10μM初始，3倍系列稀释，8倍)或单独的DMSO(0.1％)孵育。在24h后，使用
荧光细胞活力测定(Promega)和制造商的标准方案测量细胞活力。使用Prism软件
(GraphPad)绘制并分析每种细胞系相对于DMSO处理而言的活力百分比。
(10μM初始，3倍系列稀释，8倍)或单独的DMSO(0.1％)孵育。在24h后，使用
荧光细胞活力测定(Promega)和制造商的标准方案测量细胞活力。使用Prism软件
(GraphPad)绘制并分析每种细胞系相对于DMSO处理而言的活力百分比。
[0614] 实施例1：用于产生AbCID的BCL-xL/ABT-737复合物的鉴定
[0615] 我们认为用以产生选择性抗体的理想复合物(所述选择性抗体是针对所述理想复合物)是在结合时大部分小分子保持溶剂暴露的那些复合物。自然界在雷帕霉素-FKBP12-
FRB AbCID系统中采用了类似的原理，其中雷帕霉素首先结合FKBP12，产生一个新的结合表面，其然后被FRB识别。几种其他天然产物使用类似方法进行人工蛋白质募集(Fegan等人,
Chem.Rev.,110:3315-3336(2010))。其他设计原则包括：目标蛋白是小单体结构域；并且小分子诱导剂可商购获得，具有希望的药代动力学特性和低毒性，这使得其潜在地可用于动
物模型应用。
FRB AbCID系统中采用了类似的原理，其中雷帕霉素首先结合FKBP12，产生一个新的结合表面，其然后被FRB识别。几种其他天然产物使用类似方法进行人工蛋白质募集(Fegan等人,
Chem.Rev.,110:3315-3336(2010))。其他设计原则包括：目标蛋白是小单体结构域；并且小分子诱导剂可商购获得，具有希望的药代动力学特性和低毒性，这使得其潜在地可用于动
物模型应用。
[0616] 在对蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中的小分子结合结构进行调查后，我们将注意力转向人BCL-xL/ABT-737复合物(PDB:2YXJ)(Lee等人,Cell
Death Differ.,14:1711-1713(2007))。BCL-xL是抗凋亡BCL-2蛋白家族的成员(Czabotar
等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,15:49-63(2014))。这种小的单体蛋白(约26kDa)位于线粒
体的外膜上，在那里它隔离BCL-2家族的促凋亡成员。由于其抗凋亡作用，已经开发了许多针对BCL-xL的动物和临床活性小分子抑制剂，用于治疗癌症(Besbes等人,Oncotarget 6:
12862-12871(2015))。我们的候选配体ABT-737(Oltersdorf等人,Nature,435:677-681
(2005))与BCL-xL结合的晶体结构表明，ABT-737的大部分暴露于溶剂 为抗体结
合提供了潜在的化学表位。相比之下，对PDB中866个小分子结合结构的分析(图6)揭示了平均溶剂暴露表面积为 其中与FKBP12结合的雷帕霉素在 (PDB:1FKB)处为异
常值(Van Duyne等人,J.Mol.Biol.,229:105-124(1993))。因此，我们认为BCL-xL/ABT-737复合物将是开发AbCID的理想的首位靶标。
Death Differ.,14:1711-1713(2007))。BCL-xL是抗凋亡BCL-2蛋白家族的成员(Czabotar
等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,15:49-63(2014))。这种小的单体蛋白(约26kDa)位于线粒
体的外膜上，在那里它隔离BCL-2家族的促凋亡成员。由于其抗凋亡作用，已经开发了许多针对BCL-xL的动物和临床活性小分子抑制剂，用于治疗癌症(Besbes等人,Oncotarget 6:
12862-12871(2015))。我们的候选配体ABT-737(Oltersdorf等人,Nature,435:677-681
(2005))与BCL-xL结合的晶体结构表明，ABT-737的大部分暴露于溶剂 为抗体结
合提供了潜在的化学表位。相比之下，对PDB中866个小分子结合结构的分析(图6)揭示了平均溶剂暴露表面积为 其中与FKBP12结合的雷帕霉素在 (PDB:1FKB)处为异
常值(Van Duyne等人,J.Mol.Biol.,229:105-124(1993))。因此，我们认为BCL-xL/ABT-737复合物将是开发AbCID的理想的首位靶标。
[0617] 实施例2：化学表位选择性抗体的选择
[0618] 为了鉴定独特的化学表位选择性抗体，我们使用了BCL-xL的缺乏线粒体跨膜结构域的C-末端截短形式(残基2-215)。将生物素化的BCL-xL固定在链霉亲和素树脂上，并使用先前开发的合成抗体-片段文库和选择策略用于噬菌体选择(Hornsby等人,
Mol.Cell.Proteomics,14:2833-2847(2015))。在每一轮选择中，首先在没有小分子的情况下对噬菌体文库进行针对BCL-xL的严格的反选择，从而除去对ABT-737结合形式没有选择
性的任何Fab噬菌体。然后在饱和量的ABT-737(1μM)的存在下进行阳性选择，从而确保大部分BCL-xL与ABT-737结合(图1B)。总共进行了四轮选择。令人鼓舞的是，我们观察到在ABT-
737的存在下对于针对BCL-xL的选择，噬菌体滴度显著富集(图7)。在第四轮后，分离单独
Fab噬菌体克隆并测序。总共鉴定了十个在Fab互补决定区(CDR)中具有独特序列的Fab噬菌
体(表1)。
Mol.Cell.Proteomics,14:2833-2847(2015))。在每一轮选择中，首先在没有小分子的情况下对噬菌体文库进行针对BCL-xL的严格的反选择，从而除去对ABT-737结合形式没有选择
性的任何Fab噬菌体。然后在饱和量的ABT-737(1μM)的存在下进行阳性选择，从而确保大部分BCL-xL与ABT-737结合(图1B)。总共进行了四轮选择。令人鼓舞的是，我们观察到在ABT-
737的存在下对于针对BCL-xL的选择，噬菌体滴度显著富集(图7)。在第四轮后，分离单独
Fab噬菌体克隆并测序。总共鉴定了十个在Fab互补决定区(CDR)中具有独特序列的Fab噬菌
体(表1)。
[0619] 实施例3：工程化抗体对BCL-xL的ABT-737结合形式具有高度特异性
[0620] 将独特的Fab亚克隆到细菌表达载体中，表达并纯化(Hornsby等人,Mol.Cell.Proteomics,14:2833-2847(2015))。令人欣慰的是，在ABT-737存在或不存在的
情况下，用BCL-xL进行的酶联免疫吸附测定(ELISA)显示，所有十个Fab在药物的存在下都
增强了结合。在ABT-737的存在下，四个Fab显示出优异的效力和极强的结合选择性(图8)。
为了进一步描述这四个Fab，我们通过生物层干涉测量法(图1C和图9)表征了在ABT-737存
在或不存在的情况下BCL-xL结合的动力学(Shah等人,J.Vis.Exp.,e51383(2014))。四个
Fab中的三个(AZ1、AZ2和AZ3)在ABT-737(KD<10nM)的存在下是BCL-xL的非常有效的结合
剂，并且在浓度高达5000nM Fab的情况下，在不存在ABT-737的情况下，未显示出可检测的结合(表10)。我们的最佳Fab(AZ2)显示，BCL-xL的ABT-737结合形式的选择性是apo形式的>
2000倍。
情况下，用BCL-xL进行的酶联免疫吸附测定(ELISA)显示，所有十个Fab在药物的存在下都
增强了结合。在ABT-737的存在下，四个Fab显示出优异的效力和极强的结合选择性(图8)。
为了进一步描述这四个Fab，我们通过生物层干涉测量法(图1C和图9)表征了在ABT-737存
在或不存在的情况下BCL-xL结合的动力学(Shah等人,J.Vis.Exp.,e51383(2014))。四个
Fab中的三个(AZ1、AZ2和AZ3)在ABT-737(KD<10nM)的存在下是BCL-xL的非常有效的结合
剂，并且在浓度高达5000nM Fab的情况下，在不存在ABT-737的情况下，未显示出可检测的结合(表10)。我们的最佳Fab(AZ2)显示，BCL-xL的ABT-737结合形式的选择性是apo形式的>
2000倍。
[0621] 表10.在ABT-737存在或不存在的情况下测量的Fab AZ1、AZ2和AZ3与BCL-xL结合的结合常数和动力学常数。
[0622]
[0623] N.D.表示由于缺乏可检测的结合，无法确定值
[0624] 实施例4：化学表位选择性表明抗体与ABT-737直接接触
[0625] 我们假设我们的Fab的精细选择性是Fab CDR与ABT-737的部分直接相互作用的结果。我们推断，如果是这种情况，则Fab与其他BCL-xL-配体复合物的结合会不太有效。ABT-
263是一种类似物，其以与ABT-737(RMSD＝0.8)类似的效力结合BCL-xL的相同构象(图2A和
图2B)(Tse等人,Cancer Res.,68,3421-3428(2008))。为了检验我们的假设，我们测量了
AZ1、AZ2和AZ3区分ABT-737、ABT-263和天然配体衍生的Bak肽(Sattler等人,Science,275:
983986(1997))结合的BCL-xL的能力(图2C)。正如预测的那样，我们观察到Fab与BCL-xL/
ABT-263复合物的结合显著减弱，并且没有检测到Fab与Bak-肽复合物的结合。虽然我们没
有AbCID复合物的晶体结构，但这些数据强烈表明这三种抗体结合在小分子结合位点附近，如果不是越过小分子结合位点的话。
263是一种类似物，其以与ABT-737(RMSD＝0.8)类似的效力结合BCL-xL的相同构象(图2A和
图2B)(Tse等人,Cancer Res.,68,3421-3428(2008))。为了检验我们的假设，我们测量了
AZ1、AZ2和AZ3区分ABT-737、ABT-263和天然配体衍生的Bak肽(Sattler等人,Science,275:
983986(1997))结合的BCL-xL的能力(图2C)。正如预测的那样，我们观察到Fab与BCL-xL/
ABT-263复合物的结合显著减弱，并且没有检测到Fab与Bak-肽复合物的结合。虽然我们没
有AbCID复合物的晶体结构，但这些数据强烈表明这三种抗体结合在小分子结合位点附近，如果不是越过小分子结合位点的话。
[0626] 实施例5：AZ1 AbCID在活细胞中诱导CRISPRa介导的基因表达
[0627] 当前的AbCID技术经常用于控制细胞内信号传导通路(Clackson,T.,Chemical Biology,第227-249页(2008)；Fegan等人,Chem.Rev.,110:3315-3336(2010)；Putyrski等
人,FEBS Lett.,586:2097-2105(2012))。由于二硫键连接Fab的重链和轻链以及细胞内的
还原环境，通常认为Fab在哺乳动物细胞中的细胞内表达会导致非活性种类。最近，我们报道了一种单链Fab(scFab)构建体，其中轻链和重链在遗传上融合为单一多肽(Koerber等
人,J.Mol.Biol.,427:576-586(2015))。scFab支架具有非常高的熔化温度(Tm＝约81℃)，
因此一旦形成，它就非常稳定(Koerber等人,J.Mol.Biol.,427:576-586(2015))。我们假设我们的ABT-737诱导型Fab转化为scFab形式可允许它们在活细胞中使用。事实上，如通过免疫印迹法(图10)测定，将AZ1基因以scFab形式(scAZ1)转染入HEK293T细胞导致了稳固表
达。为了测试scAZ1在活细胞中是否有活性，我们构建了一个基因回路，其中scAZ1与VPR转录激活结构域融合(Chavez等人,Nat.Methods,12:326-328(2015))并且BCL-xL与dCas9融
合(Qi等人,Cell,152:1173-1183(2013))(图3A)。两种构建体都含有一个核定位序列，这降低了与内源性BCL-xL相互作用的可能性，同时启动系统在核中的激活。dCas9-BCL-xL融合
物可以通过向驱动萤光素酶报告物的启动子添加特定的sgRNA来靶向。如果AbCID在细胞中
起作用，则ABT-737的添加将导致AZ1-VPR定位于萤光素酶报告物，从而促进可以容易地检
测的萤光素酶表达。为了进行比较，我们产生了一个相同的回路，但使用了基于雷帕霉素-FKBP12-FRB系统的常规AbCID(Rivera等人,Nat.Med.,2:1028-1032(1996))，正如Qi和同事
最近报道的(Gao等人,Nat.Methods,13:1043-1049(2016))。事实上，在我们的工程化细胞
中添加ABT-737导致萤光素酶的稳固表达，从而支持AZ1和BCL-xL在活细胞中作为ABT-737
诱导型AbCID发挥作用(图3B)。使用AbCID观察到的激活水平与通过常规AbCID观察到的激
活水平相当。萤光素酶表达的诱导是剂量依赖性的，其中EC50为8.9±1.0nM(图3C)。重要的是，将ABT-737添加到具有阴性sgRNA的AbCID门控系统中不会导致萤光素酶表达的增加(图
11)。总之，这些结果支持我们的AbCID可以用于活细胞中生物系统的可调控制。
人,FEBS Lett.,586:2097-2105(2012))。由于二硫键连接Fab的重链和轻链以及细胞内的
还原环境，通常认为Fab在哺乳动物细胞中的细胞内表达会导致非活性种类。最近，我们报道了一种单链Fab(scFab)构建体，其中轻链和重链在遗传上融合为单一多肽(Koerber等
人,J.Mol.Biol.,427:576-586(2015))。scFab支架具有非常高的熔化温度(Tm＝约81℃)，
因此一旦形成，它就非常稳定(Koerber等人,J.Mol.Biol.,427:576-586(2015))。我们假设我们的ABT-737诱导型Fab转化为scFab形式可允许它们在活细胞中使用。事实上，如通过免疫印迹法(图10)测定，将AZ1基因以scFab形式(scAZ1)转染入HEK293T细胞导致了稳固表
达。为了测试scAZ1在活细胞中是否有活性，我们构建了一个基因回路，其中scAZ1与VPR转录激活结构域融合(Chavez等人,Nat.Methods,12:326-328(2015))并且BCL-xL与dCas9融
合(Qi等人,Cell,152:1173-1183(2013))(图3A)。两种构建体都含有一个核定位序列，这降低了与内源性BCL-xL相互作用的可能性，同时启动系统在核中的激活。dCas9-BCL-xL融合
物可以通过向驱动萤光素酶报告物的启动子添加特定的sgRNA来靶向。如果AbCID在细胞中
起作用，则ABT-737的添加将导致AZ1-VPR定位于萤光素酶报告物，从而促进可以容易地检
测的萤光素酶表达。为了进行比较，我们产生了一个相同的回路，但使用了基于雷帕霉素-FKBP12-FRB系统的常规AbCID(Rivera等人,Nat.Med.,2:1028-1032(1996))，正如Qi和同事
最近报道的(Gao等人,Nat.Methods,13:1043-1049(2016))。事实上，在我们的工程化细胞
中添加ABT-737导致萤光素酶的稳固表达，从而支持AZ1和BCL-xL在活细胞中作为ABT-737
诱导型AbCID发挥作用(图3B)。使用AbCID观察到的激活水平与通过常规AbCID观察到的激
活水平相当。萤光素酶表达的诱导是剂量依赖性的，其中EC50为8.9±1.0nM(图3C)。重要的是，将ABT-737添加到具有阴性sgRNA的AbCID门控系统中不会导致萤光素酶表达的增加(图
11)。总之，这些结果支持我们的AbCID可以用于活细胞中生物系统的可调控制。
[0628] 实施例6：AZ1 AbCID诱导CAR T细胞的剂量依赖性激活
[0629] 使用工程化的T细胞治疗恶性肿瘤最近已经成为癌症治疗学的一个重要范例(Fesnak等人,Nat.Rev.Cancer,16:566-581(2016))。一种称为嵌合抗原受体T细胞(CAR T
细胞)的方法涉及T细胞的基因工程，使得其表达与细胞内T细胞激活结构域相连的表面暴
露的scFv抗体片段。scFv对肿瘤抗原具有特异性，并且导致T细胞募集至肿瘤以及T细胞的
抗原依赖性激活。这种技术在通过靶向CD19抗原治疗白血病方面显示出很好的反应。然而，CAR T细胞的超激活导致了脱靶细胞毒性效应，并且在一些情况下导致死亡，从而限制了这种有希望的方式的效用(Fesnak等人,Nat.Rev.Cancer,16:566-581(2016)；Brudno等人,
Blood,127:3321-3330(2016))。因此，人们对开发对这些细胞活性的远程控制非常感兴趣，以便调整激活水平或在出现不良毒性时终止激活(Wu等人,Science,350,aab4077(2015)；
Cao等人,Angew.Chem.Int.Ed.,55:7520-7524(2016)；Rodgers等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,113:E459-468(2016)；Ma等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,113:
E450-458(2016))。
细胞)的方法涉及T细胞的基因工程，使得其表达与细胞内T细胞激活结构域相连的表面暴
露的scFv抗体片段。scFv对肿瘤抗原具有特异性，并且导致T细胞募集至肿瘤以及T细胞的
抗原依赖性激活。这种技术在通过靶向CD19抗原治疗白血病方面显示出很好的反应。然而，CAR T细胞的超激活导致了脱靶细胞毒性效应，并且在一些情况下导致死亡，从而限制了这种有希望的方式的效用(Fesnak等人,Nat.Rev.Cancer,16:566-581(2016)；Brudno等人,
Blood,127:3321-3330(2016))。因此，人们对开发对这些细胞活性的远程控制非常感兴趣，以便调整激活水平或在出现不良毒性时终止激活(Wu等人,Science,350,aab4077(2015)；
Cao等人,Angew.Chem.Int.Ed.,55:7520-7524(2016)；Rodgers等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,113:E459-468(2016)；Ma等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,113:
E450-458(2016))。
[0630] 我们假设，我们的AbCID技术可以用作使用小分子调节CAR T细胞活性的独特方式。为了测试这一点，我们工程化了Jurkat T细胞来表达一种CAR，其中CAR的scFv部分被
BCL-xL替代(图4A和图4B)。这产生了一种含有激活所需机制的T细胞，但不再与抗原呈递细胞结合。同时，我们通过将临床使用的αCD19scFv(June等人,Use of chimeric antigen
receptor-modified T cells to treat cancer.(2012))连接至Fab AZ1产生了双特异性
抗体。在添加ABT-737后，双特异性抗体将被募集到CAR T细胞，同时接合CD19+细胞。这种设计允许诱导型和抗原依赖型CAR T细胞激活。为了促进对T细胞激活的快速定量，我们使用
了一种已被工程化以在激活NFAT途径时表达GFP的Jurkat T细胞系(Wei等人,Nature,488:
384-388(2012))。在CD19+K562细胞和我们的双特异性抗体(AZ1-αCD19)的存在下，ABT-737的添加导致如通过GFP的表达测量的CAR T细胞的剂量依赖性激活(图4C)。通过规范的T细
胞激活标记物CD69的表达和分泌的白细胞介素-2(图12)，进一步证实了T细胞的激活
(Ziegler等人,Stem Cells,12:456-465(1994)；Smith-Garvin等人,Annu.Rev.Immunol.,
27:591-619(2009))。重要的是，对于缺乏CD19的K562细胞或使用不含αCD19 scFv的AbCID时，未观察到T细胞的激活(图4C)。此外，ABT-737本身不能诱导T细胞激活。虽然我们的T细胞系统显示出常规CAR对照的激活水平的-65％，但由于常规CAR情况下观察到的超激活和
毒性，活性降低实际上可能是有益的。这些数据表明AbCID可以用于细胞信号传导通路的细胞外调节，并代表了小分子控制CAR T细胞激活的新颖范例。
BCL-xL替代(图4A和图4B)。这产生了一种含有激活所需机制的T细胞，但不再与抗原呈递细胞结合。同时，我们通过将临床使用的αCD19scFv(June等人,Use of chimeric antigen
receptor-modified T cells to treat cancer.(2012))连接至Fab AZ1产生了双特异性
抗体。在添加ABT-737后，双特异性抗体将被募集到CAR T细胞，同时接合CD19+细胞。这种设计允许诱导型和抗原依赖型CAR T细胞激活。为了促进对T细胞激活的快速定量，我们使用
了一种已被工程化以在激活NFAT途径时表达GFP的Jurkat T细胞系(Wei等人,Nature,488:
384-388(2012))。在CD19+K562细胞和我们的双特异性抗体(AZ1-αCD19)的存在下，ABT-737的添加导致如通过GFP的表达测量的CAR T细胞的剂量依赖性激活(图4C)。通过规范的T细
胞激活标记物CD69的表达和分泌的白细胞介素-2(图12)，进一步证实了T细胞的激活
(Ziegler等人,Stem Cells,12:456-465(1994)；Smith-Garvin等人,Annu.Rev.Immunol.,
27:591-619(2009))。重要的是，对于缺乏CD19的K562细胞或使用不含αCD19 scFv的AbCID时，未观察到T细胞的激活(图4C)。此外，ABT-737本身不能诱导T细胞激活。虽然我们的T细胞系统显示出常规CAR对照的激活水平的-65％，但由于常规CAR情况下观察到的超激活和
毒性，活性降低实际上可能是有益的。这些数据表明AbCID可以用于细胞信号传导通路的细胞外调节，并代表了小分子控制CAR T细胞激活的新颖范例。
[0631] ABT-737在无毒浓度范围内使AbCID二聚化
[0632] ABT-737是一种可溶性的、细胞可渗透的、生物可利用的、有效的和可商购的化合物，使其成为一种极好的分子以在细胞中和潜在地在动物中用于AbCID中。然而，已知ABT-
737在一些细胞类型中诱导细胞凋亡，特别是在具有高表达水平的BCL-2家族成员的造血细
胞中(Oltersdorf等人,Nature,435:677-681(2005))。因此，我们测试了诱导Jurkat、K562和HEK293T细胞凋亡所必需的ABT-737浓度。重要的是，用于诱导AbCID CAR(<100nM)和
CRISPRa(<270nM)活性的浓度范围低于观察到细胞死亡时的浓度(Jurkat IC50-2μM，
K562IC50>10μM和HEK293TIC50-10μM)(图5和图13)。ABT-737已广泛用于小鼠癌症模型，并且除了血小板毒性之外，小鼠通常耐受性良好(Oltersdorf等人,Nature,435:677-681(2005))。
然而，在我们的细胞分析中，用于激活AbCID的浓度(<100nM)远低于观察到的对血小板有毒的浓度(低μM)(Zhang等人,Cell Death Differ.,14:943-951(2007))。另外，其他人也表
明，ABT-737可以在活细胞实验中应用于激活工程化蛋白，同时几乎没有观察到细胞毒性
(Goreshnik等人,J.Am.Chem.Soc.,132:938-940(2010))。这些数据共同支持在细胞和动物
应用中使用ABT-737激活的AbCID的可行性，同时对这些模型生物的活力影响最小。此外，虽然ABT-737缺乏生物正交性可能是研究应用的一个警告，但如果将这里描述的AbCID CAR方
法应用于ABT-737敏感型B细胞恶性肿瘤的治疗，它实际上可能从治疗角度是有益的。
737在一些细胞类型中诱导细胞凋亡，特别是在具有高表达水平的BCL-2家族成员的造血细
胞中(Oltersdorf等人,Nature,435:677-681(2005))。因此，我们测试了诱导Jurkat、K562和HEK293T细胞凋亡所必需的ABT-737浓度。重要的是，用于诱导AbCID CAR(<100nM)和
CRISPRa(<270nM)活性的浓度范围低于观察到细胞死亡时的浓度(Jurkat IC50-2μM，
K562IC50>10μM和HEK293TIC50-10μM)(图5和图13)。ABT-737已广泛用于小鼠癌症模型，并且除了血小板毒性之外，小鼠通常耐受性良好(Oltersdorf等人,Nature,435:677-681(2005))。
然而，在我们的细胞分析中，用于激活AbCID的浓度(<100nM)远低于观察到的对血小板有毒的浓度(低μM)(Zhang等人,Cell Death Differ.,14:943-951(2007))。另外，其他人也表
明，ABT-737可以在活细胞实验中应用于激活工程化蛋白，同时几乎没有观察到细胞毒性
(Goreshnik等人,J.Am.Chem.Soc.,132:938-940(2010))。这些数据共同支持在细胞和动物
应用中使用ABT-737激活的AbCID的可行性，同时对这些模型生物的活力影响最小。此外，虽然ABT-737缺乏生物正交性可能是研究应用的一个警告，但如果将这里描述的AbCID CAR方
法应用于ABT-737敏感型B细胞恶性肿瘤的治疗，它实际上可能从治疗角度是有益的。
[0633] 实施例7：甲氨蝶呤结合型Fab/甲氨蝶呤Fab二聚体
[0634] 除了BCL-2家族成员Fab二聚体，我们还利用甲氨蝶呤结合型Fab(Gayda等人Biochemistry 2014 53(23),3719-3726)和甲氨蝶呤产生了二聚体。在选择后，我们在存在或不存在甲氨蝶呤的情况下，使用来自我们选择的分离的Fab-噬菌体进行噬菌体竞争
ELISA(图16)，以鉴定在甲氨蝶呤的存在下选择性地结合甲氨蝶呤结合型Fab的Fab。对最佳命中物(浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。
ELISA(图16)，以鉴定在甲氨蝶呤的存在下选择性地结合甲氨蝶呤结合型Fab的Fab。对最佳命中物(浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。
[0635] 实施例8：Bcl-2/ABT-199Fab二聚体
[0636] 我们已经使用上述相同的方法产生了二聚体，但用的是蛋白Bcl-2和小分子ABT-199。在选择后，我们在存在或不存在ABT-199的情况下，使用来自我们选择的分离的Fab-噬菌体进行噬菌体竞争ELISA(图15)，以鉴定在ABT-199的存在下选择性地结合BCL-2的Fab。
对最佳命中物(为浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。所有克隆的Kd均<20nM。
对最佳命中物(为浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。所有克隆的Kd均<20nM。
[0637] 实施例9：FKBP/SLF Fab二聚体
[0638] 我们已经使用上述相同的方法产生了二聚体，但用的是蛋白FKBP和小分子SLF。在选择后，我们在存在或不存在SLF的情况下，使用来自我们选择的分离的Fab-噬菌体进行噬菌体竞争ELISA(图17)，以鉴定在SLF的存在下选择性地结合FKBP的Fab。对最佳命中物(为
浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。所有克隆的Kd均<20nM。
浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。所有克隆的Kd均<20nM。
[0639] 实施例10：cIAP1/小分子Fab二聚体
[0640] 我们已经使用上述相同的方法产生了二聚体，但用的是蛋白cIAP1和各个小分子GDC-0152、LCL-161、AT-406和CUDC-427。在选择后，我们在存在或不存在每个小分子的情况下，使用来自我们选择的分离的Fab-噬菌体进行噬菌体竞争ELISA(图18)，以鉴定在GDC-
0152、LCL-161、AT-406和CUDC-427的存在下选择性地结合cIAP1的Fab。对最佳命中物(为浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。所有克隆的Kd均<20nM。
0152、LCL-161、AT-406和CUDC-427的存在下选择性地结合cIAP1的Fab。对最佳命中物(为浅灰色)测序以鉴定具有独特序列的克隆。所有克隆的Kd均<20nM。
[0641] 实施例11：双特异性T细胞接合器
[0642] AbCID调节的诱导型双特异性T细胞接合器的代表性实施方案如图19A所示，其具有与抗CD3抗体缀合的第一AbCID组分和与识别肿瘤特异性抗原的抗体缀合的第二AbCID组
分。给予小分子二聚体允许产生CID复合物，从而导致将T细胞募集到表达肿瘤特异性抗原
的癌细胞。当与CD19+K562细胞共培养时，如通过激活NFAT信号传导(导致GFP表达)和CD69
表达增加测量的，在添加ABT-199后，具有与抗CD3抗体缀合的Bcl-2和与抗CD19抗体缀合的抗体AZ21、AZ34或AZ35的双特异性T细胞接合器的二聚化导致T细胞激活(图19B)。如图19C
所示，由双特异性T细胞接合器介导的T细胞激活水平(如通过NFAT激活测量)通过滴定ABT-
199浓度是可调的，所述双特异性T细胞接合器具有与抗CD19抗体缀合的AZ21和与抗CD3抗
体缀合的Bcl-2。
分。给予小分子二聚体允许产生CID复合物，从而导致将T细胞募集到表达肿瘤特异性抗原
的癌细胞。当与CD19+K562细胞共培养时，如通过激活NFAT信号传导(导致GFP表达)和CD69
表达增加测量的，在添加ABT-199后，具有与抗CD3抗体缀合的Bcl-2和与抗CD19抗体缀合的抗体AZ21、AZ34或AZ35的双特异性T细胞接合器的二聚化导致T细胞激活(图19B)。如图19C
所示，由双特异性T细胞接合器介导的T细胞激活水平(如通过NFAT激活测量)通过滴定ABT-
199浓度是可调的，所述双特异性T细胞接合器具有与抗CD19抗体缀合的AZ21和与抗CD3抗
体缀合的Bcl-2。
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