嵌合蛋白
阅读：454发布：2020-05-20
专利汇可以提供嵌合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供嵌合蛋白，其包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白与细胞外配体结合，引起FAS胞内域的活化。所述嵌合蛋白用作自杀基因。本发明还提供包含此类嵌合蛋白的细胞，例如T细胞，其在过继T细胞免疫 治疗 方法中有用。，下面是嵌合蛋白专利的具体信息内容。
1.嵌合蛋白，其包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白(multi-spanning transmembrane protein)，其中所述多跨跨膜蛋白与细胞外配体结合，引起所述FAS胞内域的活化。
2.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白是CD20，或其缺乏氨基末端胞内域或羧基末端胞内域的截短形式。
3.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中所述细胞外配体是利妥昔单抗(Rituxumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)或维妥珠单抗(Veltuzumab)。
4.根据权利要求2的嵌合蛋白，其包含与缺乏氨基末端胞内域的CD20的截短形式的羧基末端融合的FAS胞内域。
5.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中参考如SEQ ID No.3所示的全长序列，所述CD20包含突变P172W。
6.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中所述CD20包含如SEQ ID No.3、4、5或6所示的序列。
7.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白包含异源配体结合域，其结合所述细胞外配体。
8.根据前述权利要求中任一项的嵌合蛋白，其中所述FAS胞内域包含如SEQ ID No.20所示的序列。
9.核酸序列，其编码根据前述权利要求任一项中的嵌合蛋白。
10.核酸构建体，其包含一个或多个根据权利要求9的核酸序列和编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
11.载体，其包含根据权利要求9的核酸序列或根据权利要求10的核酸构建体。
12.载体，其包含根据权利要求9的核酸序列，所述载体还包含感兴趣的核苷酸。
13.根据权利要求12的载体，其中所述感兴趣的核酸编码嵌合抗原受体或T细胞受体，使得当所述载体用于转导靶细胞时，所述靶细胞共表达根据权利要求1至8中任一项的嵌合蛋白和嵌合抗原受体或T细胞受体。
14.细胞，其表达根据权利要求1至8中任一项的嵌合蛋白。
15.根据权利要求14的细胞，其是T细胞、自然杀伤(NK)细胞或干细胞。
16.制备根据权利要求14或15的细胞的方法，其包括使用根据权利要求11至13中任一项的载体转导或转染细胞的步骤。
17.用于删除根据权利要求14或15的细胞的方法，其包括将所述细胞暴露于结合所述多跨跨膜蛋白的细胞外配体的步骤。
18.根据权利要求17的方法，其中所述细胞外配体的结合导致所述FAS胞内域的活化和所述细胞的凋亡。
19.根据权利要求17的方法，其中所述细胞外配体的结合导致多个嵌合蛋白的多跨跨膜蛋白的交联，引起补体依赖的细胞毒性(CDC)。
20.根据权利要求17的方法，其中所述细胞外配体是抗体，并且所述细胞外配体的结合导致抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
21.根据权利要求17至20中任一项的方法，其中所述细胞外配体是利妥昔单抗、奥法木单抗或维妥珠单抗。
22.用于预防或治疗受试者中的疾病的方法，其包括将根据权利要求14或15的细胞施用至所述受试者的步骤。
23.根据权利要求22的方法，其包括以下步骤：
(i)用根据权利要求11至13中任一项的载体转导或转染从受试者分离的细胞样品；和(ii)将经转导的/转染的细胞施用至患者。
24.根据权利要求23的方法，其用于治疗癌症。
25.用于预防和/或治疗受试者中的由向所述受试者施用根据权利要求14或15的细胞引起的病理性免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用能够结合所述多跨跨膜蛋白的细胞外配体的步骤。
26.根据权利要求25的方法，其中所述病理性免疫反应选自以下组：移植物抗宿主病；
中靶脱肿瘤毒性；免疫活化综合征；和淋巴增殖性病症。
27.根据权利要求22的用于治疗受试者中的疾病的方法，其包括以下步骤：
(i)将根据权利要求14或15的细胞施用至所述受试者；
(ii)监测所述受试者的病理性免疫反应的形成；和
(iii)如果所述受试者显示正在形成或已经形成病理性免疫反应的体征，则向所述受试者施用能够结合所述多跨跨膜蛋白的细胞外配体。
28.根据权利要求14或15的细胞，其用于造血干细胞移植、淋巴细胞输注或过继细胞转移。
29.抗CD20抗体，其用于预防或治疗由向受试者施用根据权利要求14或15的细胞引起的病理性免疫反应。
嵌合蛋白
发明领域
[0001] 本发明涉及在过继细胞疗法(ACT)中有用的嵌合蛋白。所述嵌合蛋白可以起自杀基因作用，使得表达所述嵌合蛋白的细胞能够被删除。本发明还提供编码此类嵌合蛋白的核酸、包含此类核酸的细胞及其治疗用途。
[0002] 发明背景
[0003] 过继免疫疗法是一种已经建立的且不断进化的治疗方法。在同种异体(allogeneic)造血干细胞移植(HSCT)的背景中，频繁地给与供体淋巴细胞输注以治疗造血恶性肿瘤的复发。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)有效治疗转移性黑色素瘤。T细胞的遗传工程大大增加了T细胞疗法的范围和效力：T细胞受体转移允许靶向细胞内癌抗原，而嵌合抗原受体(CAR)允许靶向表面癌症或谱系特异性抗原。已经使用两种方法观察到临床反应，并且正在进行许多进一步的试验。
[0004] 过继性免疫治疗后可能发生急性不良事件。移植物抗宿主病(GVHD)是DLI的常见且严重的并发症。工程化T细胞的施用也导致毒性。例如，在针对黑素瘤抗原的天然T细胞受体转移研究中已经报道了中靶脱肿瘤毒性；重定向至肾细胞癌抗原碳酸酐酶IX(CAIX)的T细胞产生出乎意料的肝毒性。CD19CAR治疗后报告了免疫活化综合征。最后，载体诱导的插入诱变导致淋巴增殖性病症的理论风险。这些毒性的发生率和严重程度是不可预测的。此外，与其中的不良事件通常随着治疗剂的半衰期而减少的治疗性蛋白或小分子形成对比，T细胞植入并且复制，潜在地导致升高和爆发性毒性。
[0005] 自杀基因
[0006] 自杀基因是遗传编码的机制，其允许在面对不可接受的毒性的情况下选择性破坏过继转移的T细胞。已经在临床研究中测试了两种自杀基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。
[0007] 在T细胞中HSV-TK的表达赋予对更昔洛韦(ganciclovir)的易感性。HSV-TK是一种高度有效的自杀基因，但是免疫原性限制了对诸如单倍体相同的(haploidentical)HSCT的深度免疫抑制的临床背景的应用。此外，它妨碍了使用更昔洛韦治疗巨细胞病毒(CMV)感染。
[0008] iCasp9由实验性小分子化学诱导剂或二聚化剂(CID)激活。该CID是一种实验性药物，并认为是生物学惰性的，因为它不与野生型FKBP12相互作用。然而，使用该试剂的临床经验仅限于非常少数的患者(Di Stasi,A.et al.(2011)N.Engl.J.Med.365,1673–1683；和Iuliucci,J.D.et al.(2001)J.Clin.Pharmacol.41,870–879)。它是一种相对大且极性的分子，不太可能穿过血脑屏障。已经描述了基于FAS的CID活化的自杀基因(Amara et al(1999)Hum.Gene Ther.10,2651–2655)。这也依赖于该CID用于激活，并且由于它不直接活化细胞凋亡级联，因此逃避(通过FAS抗性)是可能的。
[0009] 突变型人胸苷酸激酶(mTMPK)使细胞对AZT易感。最近，将HSV-TK，iCasp9与mTMPK进行了比较(Marin et al(2012)Hum.Gene Ther.Methods 23,376–386)。mTMPK活性不足而不是有用的。
[0010] 已经提出了其他自杀基因，例如全长CD20，其当在T细胞上表达时，能够使得T细胞对通过治疗性抗CD20抗体利妥昔单抗的溶解易感(Introna,M.et al.(2000)Hum.Gene Ther.11,611–620)。抗体识别这一主题也描述了其他自杀基因：RQR8使T细胞对CD20敏感，但比全长CD20分子更紧凑(Philip,B.et al.(2014)Blood doi:10.1182/blood-2014-01-545020)；EGFR的截短形式(huEGFRt)使细胞对通过抗EGFR mAb的溶解易感(Wang,X.et al.(2011)Blood 118,1255–1263)；而在细胞表面上表达的myc表位标签使得细胞对使用抗myc抗体的溶解易感(Kieback et al(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,623–628)。这些抗体依赖性方法的主要限制是它们对高局部浓度下起作用的治疗性抗体的生物利用度的依赖性。已知例如溶解性抗体对于大体积疾病(bulky disease)不是特别有效，而基于抗体的自杀基因的限制在于驻留于不能达到高抗体浓度处的细胞将会逃脱。
[0011] 因此，需要与上述缺点不相关的替代性自杀基因。
[0013] 图1：利妥昔单抗(Rituxumab)和奥法木单抗(Ofatumumab)对CD20截短的识别[0014] 制备了CD20的氨基和羧基末端截短，其中截短了氨基或羧基末端胞内域(endodomain)。将这些与eGFP一起表达并转染到293T细胞中。
[0015] 图2：显示a)RQR8和RQR8-FAS，和b)dCD20-FAS的图
[0016] 图3：比较RQR8和RQR8-FAS和dCD20-FAS的功能
[0017] 显示了在不同测试构建体中当表达并通过奥法木单抗活化时的凋亡(作为表达细胞的百分比)。
[0019] 使用与eGFP共表达的dCD20-FAS转导Jurkat T细胞。随时间和以不同浓度的利妥昔单抗时显示了利妥昔单抗诱导的直接杀伤。
[0020] 图5：dCD20-FAS对利妥昔单抗的延伸的剂量-响应曲线
[0021] 在48小时内使用增加稀释的利妥昔单抗培养使用dCD20-FAS转导并共表达eGFP的Jurkat T细胞。相对于不同浓度的利妥昔单抗显示了直接杀伤。
[0022] 图6：dCD20-FAS对奥法木单抗的敏感性和时间进程
[0023] 使用与eGFP共表达的dCD20-FAS转导Jurkat T细胞。随时间和以不同浓度的奥法木单抗显示了奥法木单抗诱导的直接杀伤。
[0024] 图7：dCD20-FAS对奥法木单抗的延伸的剂量-响应曲线
[0025] 在48小时内使用增加稀释的奥法木单抗培养使用dCD20-FAS转导并共表达eGFP的Jurkat T细胞。相对于不同浓度的奥法木单抗显示了直接杀伤。
[0026] 图8：CD20中的P172W突变导致利妥昔单抗抗性。
[0027] 图9：dCD20-FAS和dCD20P172W-FAS对原代人T细胞的直接的和CDC介导的杀伤。
[0028] 图10：通过奥法木单抗的由dCD20-FAS对原代T细胞的直接杀伤的实例。
[0029] 发明概述
[0030] 本发明人已经开发了新的自杀基因，其可以使用细胞外配体例如抗体诱导，并且具有低的基础毒性和高的诱导毒性。该自杀基因是“三重功能”，因为它可以通过FAS活化，补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)引起自杀。
[0031] 因此，在第一个方面，提供了嵌合蛋白，其包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白，其中所述多跨跨膜蛋白结合细胞外配体，引起FAS胞内域的活化。
[0032] 多跨跨膜蛋白可以是或包含CD20，或其缺少氨基末端胞内域或羧基末端胞内域的截短形式。
[0033] 细胞外配体可以是抗CD20单克隆抗体，例如利妥昔单抗(Rituxumab)，奥法木单抗(Ofatumumab)或维妥珠单抗(Veltuzumab)。细胞外配体可以包含来自抗CD20单克隆抗体的抗原结合部分(例如VH/VL或互补决定区(CDR)序列)。
[0034] 嵌合蛋白可以包含与缺少氨基末端胞内域的CD20截短形式的羧基末端融合的FAS胞内域。
[0035] 多跨跨膜蛋白可以包含一个或多个突变以增加其结合亲和力或特异性。在多跨跨膜蛋白是或包含CD20或其一部分的情况下，其可以包含一个或多个突变，使得其结合奥法木单抗而不结合利妥昔单抗。例如，参考SEQ ID No.3所示的全长序列，CD20可以包含突变P172W。
[0036] 当多跨跨膜蛋白是或包含CD20或其一部分时，其可以包含SEQ ID No.3，4，5或6所示的序列。
[0037] 多跨跨膜蛋白可以包含内源性配体结合域，例如CD20，或者其可以包含结合细胞外配体的异源配体结合域。
[0038] FAS胞内域可以包含如SEQ ID No.20所示的序列。
[0039] 在第个二方面，本发明提供了编码根据本发明第一个方面的嵌合蛋白的核酸序列。
[0040] 还提供了核酸构建体，其包含一个或多个根据本发明第二个方面的核酸序列，和编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
[0041] 在第三个方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明第二个方面的核酸序列或如上定义的核酸构建体。
[0042] 载体还可以包含感兴趣的核苷酸。感兴趣的核苷酸可以编码嵌合抗原受体或T细胞受体，使得当该载体用于转导靶细胞时，靶细胞共表达根据本发明第一个方面的嵌合蛋白，和嵌合抗原受体或T细胞受体
[0043] 在第四个方面，本发明提供了细胞，其表达根据本发明第一个方面的嵌合蛋白。
[0044] 细胞可以是例如T细胞，自然杀伤(NK)细胞或干细胞。
[0045] 在第五个方面，提供了用于制备根据本发明第四个方面的细胞的方法，其包括使用根据本发明第三个方面的载体转导或转染细胞的步骤。
[0046] 在第六个方面，提供了用于删除根据本发明第四个方面的细胞的方法，其包括将细胞暴露于结合多跨跨膜蛋白的细胞外配体的步骤。
[0047] 在本发明第六个方面的方法中，细胞外配体的结合可以导致以下一项，两项或全部三项：
[0048] ·FAS胞内域的活化，引起细胞的凋亡；
[0049] ·多个嵌合蛋白的多跨跨膜蛋白的交联，引起补体依赖性细胞毒性(CDC)；和[0050] ·抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)-在细胞外配体是抗体的情况下。
[0051] 细胞外配体可以是抗CD20单克隆抗体，例如利妥昔单抗，奥法木单抗或维妥珠单抗。
[0052] 在第七个方面，提供了用于预防或治疗受试者中的疾病的方法，其包括将根据本发明第四个方面的细胞给施用至受试者的步骤。
[0053] 该方法可以包括以下步骤：
[0054] (i)使用根据本发明第三个方面的载体转导或转染从受试者分离的细胞样品，并[0055] (ii)将经转导/转染的细胞施用至患者。
[0056] 该方法可以用于治疗癌症。
[0057] 在第八个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗受试者中由向所述受试者施用本发明第四个方面的细胞引起的病理性免疫反应的方法，其包括向受试者施用能够结合多跨跨膜蛋白的细胞外配体的步骤。
[0058] 病理性免疫反应可以是例如：移植物抗宿主病；中靶脱肿瘤毒性；免疫活化综合征；和淋巴增殖性病症。
[0059] 根据本发明第七个方面的用于治疗受试者中的疾病的方法可以包括以下步骤：
[0060] (i)将根据本发明的第四个方面的细胞施用至受试者；
[0061] (ii)监测受试者的病理性免疫反应的形成；和
[0062] (iii)如果受试者显示正在形成或已经形成病理性免疫反应的体征，则向所述受试者施用能够结合多跨跨膜蛋白的细胞外配体。
[0063] 还提供了根据本发明的第四个方面的细胞，其用于造血干细胞移植，淋巴细胞输注或过继细胞转移。
[0064] 还提供了抗CD20抗体，其用于预防或治疗由向受试者施用根据本发明第四个方面的细胞引起的病理性免疫反应。
[0065] 发明详述
[0066] 嵌合蛋白
[0067] 本发明涉及嵌合蛋白，其起自杀基因作用。可以通过施用细胞外配体体内或体外删除表达该嵌合蛋白的细胞。
[0068] 嵌合蛋白包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白。
[0069] 嵌合蛋白可以包含如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列或其变体。
[0070] SEQ ID No.1
[0071]
[0072] SEQ ID No.2
[0073]
[0074] 变体序列可以与SEQ ID No.1或2具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％序列同一性，只要该序列提供有效的自杀基因。也就是说，只要该序列保留结合细胞外配体，引起FAS胞内域活化的能力。
[0075] 多跨跨膜蛋白
[0076] 跨膜蛋白是跨越其永久附着的整个生物膜的蛋白。也就是说，跨膜蛋白从膜的一侧跨越到膜的另一侧。
[0077] 跨膜蛋白通常参考N和C末端结构域的位置通过拓扑学分类。I型，II型和III型是单通分子，而IV型涉及多通分子。本发明的嵌合蛋白质包含IV型跨膜蛋白，其包含多个通过一系列细胞外和/或细胞内环连接的跨膜α-螺旋。
[0078] IV型跨膜蛋白细分为IV-A，其中N端结构域靶向至胞质溶胶；和IV-B，其中在合成期间N末端结构域靶向至内质网的内腔。一旦跨膜蛋白在细胞表面表达，IV-A型跨膜蛋白具有细胞内N末端结构域，而IV-B型跨膜蛋白具有胞外N末端结构域。
[0079] 嵌合蛋白可以包含IV-A型或IV-B型多跨跨膜蛋白。FAS胞内域可以融合到跨膜蛋白的N末端结构域或C末端结构域，以胞内定位者为准。
[0080] 多跨跨膜蛋白可以包含跨越膜的两个或更多个不同的序列区域，例如α螺旋。多跨膜蛋白可以包括例如2至8个，3至6个或约4个跨膜部分。
[0081] 多跨跨膜蛋白可以包含4个跨膜部分和两个胞外环。
[0082] 多跨跨膜蛋白包含与细胞外配体结合的配体结合域。配体结合域位于质膜的细胞外侧。配体结合域可以是多跨跨膜蛋白的整体部分，例如CD20的利妥昔单抗结合表位，或者它可以通过蛋白质工程引入。
[0083] 配体结合域可以是或插入多跨跨膜蛋白的细胞外环，即在两个疏水α螺旋跨膜部分之间的亲水环。或者，配体结合域可以是或插入或连接到多跨跨膜蛋白的氨基末端或羧基末端细胞外部分，即多跨跨膜蛋白的亲水端部分之一，条件是它位于质膜的细胞外侧，而不是胞质侧。
[0084] 配体结合域可以通过重组蛋白质工程融合至或引入多跨跨膜蛋白。
[0085] 细胞外配体可以是非天然存在的配体，例如针对多跨跨膜蛋白的配体结合域产生的抗体。
[0086] 多跨跨膜蛋白的配体结合域能够结合细胞外配体，所述结合导致FAS胞内域的活化。
[0087] 为了避免表达自杀基因的细胞的不受控制的删除，多跨蛋白可以不具有内源性配体，或者可以经修饰使得其不再具有结合任何天然配体的能力。
[0088] CD20
[0089] CD20是一种多跨膜蛋白。CD20在B细胞发育的除了第一和最后阶段外的所有阶段表达：其从晚期pro-B细胞到记忆细胞存在，但不存在于早期的pro-B细胞或浆母细胞和浆细胞上。其表达于几乎所有的B细胞淋巴瘤，毛细胞白血病和B细胞慢性淋巴细胞白血病上。CD20具有由二硫键约束的两个细胞外环：小环和大环。其具有氨基末端和羧基末端胞内域。
当使用某些抗CD20单克隆抗体暴露时，CD20聚集在脂筏中。该聚集依赖于羧基末端胞内域。
当使用某些抗CD20单克隆抗体暴露时，CD20聚集在脂筏中。该聚集依赖于羧基末端胞内域。
[0090] 全长人CD20的序列显示为SEQ ID No.3。
[0091] SEQ ID No.3
[0092]MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEP N SEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP[0093] 位置A170和P172以粗体和下划线显示。
[0094] 本发明人已经表明可以在氨基或羧基末端截短CD20，并保留在细胞表面表达的能力，以及被抗CD20抗体如利妥昔单抗或奥法木单抗识别的能力。
[0095] 多跨跨膜蛋白可以包含缺少氨基末端胞内域的CD20的截短形式。截短的CD20可以从氨基末端缺少直至并包括41个氨基酸。例如，截短的CD20可以从氨基末端缺少1至41，5至35或10-20个氨基酸。
[0096] 截短的CD20可以包含如SEQ ID No.4所示的序列，或其变体。
[0097] SEQ ID No.4(dCD20)
[0098] QSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP
[0099] 多跨跨膜蛋白可以包含缺少羧基末端胞内域的CD20的截短形式。截短的CD20可以从羧基末端缺少直至并包括61个氨基酸。例如，截短的CD20可以从羧基末端缺少1至61，5至55或10-20个氨基酸
[0100] 截短的CD20可以包含如SEQ ID No.5所示的序列，或其变体。
[0101] SEQ ID No.5(CD20d)
[0102] MGTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKK
[0103] CD20可以经工程化以增加结合亲和力或增加结合细胞外配体的选择性。例如，参考上文SEQ ID No.3所示的全长CD20序列的编号，CD20可以包含位置A170和/或P172处的突变(在SEQ ID No.3中粗体和加下划线显示)。突变可以是例如添加，缺失或取代。
[0104] 特别地，CD20序列可以包含突变P172W，使得变体CD20结合奥法木单抗而不结合利妥昔单抗。
[0105] 嵌合蛋白可以包含缺少氨基末端胞内域的CD20的截短形式，其包括参考全长CD20(如SED ID No.3所示)的位置编号的突变P172W。该序列显示为以下SEQ ID No.6。
[0106] SEQ ID No.6(dCD20P172W)
[0107]QSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPAN
SEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP
SEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP
[0108] 配体结合域可以结合抗CD20单克隆抗体，如利妥昔单抗。
[0109] 配体结合域可以包含来自CD20的利妥昔单抗结合表位序列，其具有SEQ ID No.7所示的序列。
[0110] CEPANPSEKNSPSTQYC(SEQ ID No.7)
[0111] Perosa等人(2007,J.Immunol 179:7967-7974)描述了一系列半胱氨酸约束的7聚体环肽，其具有被抗CD20mAb利妥昔单抗识别的抗原基序，但具有不同的基序周围氨基酸。总共描述了11种肽，如下表所示：
[0112]肽 插入序列
R15-C acPYANPSLc(SEQ ID No.8)
R3-C acPYSNPSLc(SEQ ID No.9)
R7-C acPFANPSTc(SEQ ID No.10)
R8-,R12-,R18-C acNFSNPSLc(SEQ ID No.11)
R14-C acPFSNPSMc(SEQ ID No.12)
R16-C acSWANPSQc(SEQ ID No.13)
R17-C acMFSNPSLc(SEQ ID No.14)
R19-C acPFANPSMc(SEQ ID No.15)
R2-C acWASNPSLc(SEQ ID No.16)
R10-C acEHSNPSLc(SEQ ID No.17)
R13-C acWAANPSMc(SEQ ID No.18)
R15-C acPYANPSLc(SEQ ID No.8)
R3-C acPYSNPSLc(SEQ ID No.9)
R7-C acPFANPSTc(SEQ ID No.10)
R8-,R12-,R18-C acNFSNPSLc(SEQ ID No.11)
R14-C acPFSNPSMc(SEQ ID No.12)
R16-C acSWANPSQc(SEQ ID No.13)
R17-C acMFSNPSLc(SEQ ID No.14)
R19-C acPFANPSMc(SEQ ID No.15)
R2-C acWASNPSLc(SEQ ID No.16)
R10-C acEHSNPSLc(SEQ ID No.17)
R13-C acWAANPSMc(SEQ ID No.18)
[0113] Li等人(2006Cell Immunol 239:136-43)也描述了利妥昔单抗的模拟表位(minetopes)，包括以下序列：
[0114] QDKLTQWPKWLE(SEQ ID No.19)
[0115] 本发明的嵌合蛋白可以包含利妥昔单抗结合表位，其具有如SEQ ID No.7至19中任一项所示的氨基酸序列或其保留了利妥昔单抗结合活性的变体。
[0116] 变体利妥昔单抗结合表位是基于如SEQ ID No.7至19中任一项所示的序列氨基酸序列，但包含一个或多个氨基酸突变，例如氨基酸插入，取代或缺失，条件是表位保留了利妥昔单抗结合活性。该序列可以包含3个或更少，2个或更少，或1个氨基酸突变。
[0117] 可以通过本领域已知的方法，例如使用重组技术将利妥昔单抗结合表位例如具有SEQ ID No.7至19中任一项所示的氨基酸序列的利妥昔单抗结合表位或其变体引入多跨跨膜蛋白的细胞外环或细胞外氨基或羧基末端序列。
[0118] FAS胞内域
[0119] FAS受体(FasR)也称为凋亡抗原1(APO-1或APT)，分化簇95(CD95)或肿瘤坏死因子受体超家族成员6(TNFRSF6)是导致程序性细胞死亡(凋亡)的细胞表面上的死亡受体。
[0120] 成熟的FAS蛋白具有319个氨基酸，具有预测分子量48kD，并分为3个结构域：细胞外结构域，跨膜结构域和胞质结构域。细胞外结构域具有157个氨基酸且富含半胱氨酸残基。跨膜和胞质结构域分别具有17个和145个氨基酸。
[0121] FAS的胞质或胞内域包含“死亡结构域”。
[0122] FAS的生理配体是FASL，其是TNF细胞因子家族成员。FASL在活化的T细胞，自然杀伤(NK)细胞和免疫系统的其他细胞上表达。当FAS与其配体结合时，在细胞内启动胱天蛋白酶级联，最终导致其死亡。
[0123] FAS在配体结合后形成死亡诱导信号传导复合物(DISC)。相邻细胞表面的膜锚定FAS配体三聚体引起FAS的寡聚。在接踵而至的死亡结构域(DD)聚集后，受体复合体通过细胞内体机器内化。这允许接头分子FADD通过其自身的死亡结构域结合FAS的死亡结构域。
[0124] FAS在免疫系统中起关键作用，包括杀伤病原体感染的细胞以及已废弃的和自身反应性的淋巴细胞的死亡。以这种方式，在免疫系统中，FAS防止自身免疫和淋巴样肿瘤形成。FAS通过FADD介导的胱天蛋白酶-8的募集和活化触发细胞凋亡。而在非淋巴样组织中，例如肝细胞中，FAS诱导的凋亡需要通过促凋亡BCL-2家族成员BID的蛋白水解活化进行放大。然而，淋巴样细胞对FAS活化极为敏感。
[0125] 细胞外配体与多跨跨膜蛋白的结合以类似于FASL结合FAS的方式引起FAS胞内域的活化。细胞外配体与多跨跨膜蛋白的结合导致FAS胞内域的聚集，FADD的结合和胱天蛋白酶-8的活化。
[0126] FAS是删除自身反应性淋巴细胞的途径的关键组分。本发明的嵌合蛋白利用该途径作为自杀基因，其关键应用之一是停止自身反应性(例如中靶脱肿瘤毒性)的工程化T细胞应答。
[0127] 本发明的嵌合蛋白可以包含FAS的胞质结构域，其对应于FAS的残基174-317，并且具有如SEQ ID No.20所示的序列或其变体。
[0128] SEQ ID NO.20
[0129] EVQKTCRKHRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLSKYITTIAGVMTLSQVKGFVRKNGVNEAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKKANLCTLAEKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV[0130] 本发明的嵌合蛋白可以包含FAS的“死亡结构域”，其对应于FAS胞内域的残基230-314，并且具有如SEQ ID No.29所示的序列或其变体。
[0131] SEQ ID No.29
[0132] SKYITTIAGVMTLSQVKGFVRKNGVNEAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKKANLCTLAEKIQTII
[0133] 变体序列可以与SEQ ID No.20或29具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％序列同一性，条件是FAS变体保留了触发细胞凋亡的能力。也就是说，只要FAS变体保留了当配体结合时引起DISC装配，导致随后的胱天蛋白酶-8活化的能力。
[0134] 细胞外配体
[0135] 细胞外配体可以是能够结合嵌合蛋白的多跨跨膜部分的配体结合域，从而导致FAS胞内域的活化的任何蛋白质或其他实体。
[0136] 术语“细胞外”表示配体存在于细胞外，所述细胞包含在其细胞膜中的本发明的嵌合蛋白。
[0137] 细胞外配体可以引起本发明第一个方面的嵌合蛋白在细胞膜中的聚簇。细胞外配体本身可以是溶解性的(如利妥昔单抗)，提供使得表达嵌合蛋白的细胞被破坏的另一种机制。
[0138] 细胞外配体可以是可溶性配体(即不是膜结合的)。
[0139] 为了避免表达自杀基因的细胞的不受控制的删除，细胞外配体不应当是内源性配体或不应具有也能够结合嵌合蛋白的多跨膜部分的任何内源对应物。
[0140] 细胞外配体可以是合成的配体或对受试者不是内源性的天然配体(例如衍生自植物或另一动物物种)。
[0141] 特别地，细胞外配体可以是抗体，该术语包括抗体片段和模拟物。
[0142] 如本文所用，“抗体”是指具有抗原结合位点的多肽，其包含至少一个互补决定区CDR。抗体可以包含3个CDR并且具有与域抗体(dAb)相当的抗原结合位点。抗体可以包含6个CDR并且具有与经典抗体分子相当的抗原结合位点。多肽的其余部分可以是为抗原结合位点提供合适的支架并以合适的方式展示它用于结合抗原的任何序列。抗体可以是整个免疫球蛋白分子或其一部分，例如Fab，F(ab)’2，Fv，单链Fv(ScFv)片段或纳米抗体(Nanobody)。抗体可以是双功能抗体。抗体可以是非人的，嵌合的，人源化的或完全人的。
[0143] 因此，抗体可以是保留了完全抗体的抗原特异性的任何功能性片段。
[0144] 另一方面，细胞外配体结合域可以包含不衍生自或基于免疫球蛋白的结合部分。已经开发了许多“抗体模拟物”设计重复蛋白(DRP)以利用非抗体多肽的结合能力。
[0145] 重复蛋白如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白是普遍存在的结合分子，其与抗体不同，在细胞内和细胞外发生。其独特的模块架构的特征在于重复的结构单元(重复)，它们堆叠在一起以形成展示可变且模块的靶标结合表面的延长重复结构域。基于此种模块性，可以产生具有高度多样化结合特异性的多肽的组合文库。DARPins(设计锚蛋白重复蛋白，Designed Ankyrin Repeat Proteins)是基于该技术的抗体模拟物的一个实例。
[0146] 对于Anticalins，结合特异性来源于脂质运载蛋白(lipocalin)，其是执行与化学敏感或不溶性化合物的生理转运和储存相关的一系列体内功能相关的蛋白家族。脂质运载蛋白具有强健的内在结构，其包含支持在蛋白的一个末端的四个环的高度保守的β-桶。用于结合口袋的入口的这些环和分子的该部分中的构象差异解释了不同脂质运载蛋白之间结合特异性的变化。
[0147] 通过体外外显子改组(shuffling)和噬菌体展示，产生具有结合和抑制性质的多结构域蛋白从人细胞外受体结构域的大家族演化出Avimers。
[0148] Versabody是3-5kDa的小蛋白，具有>15％的半胱氨酸，其形成高二硫化物密度的支架，代替大多数蛋白质中存在的疏水核心。使用少量二硫化物代替包含疏水核心的大量疏水性氨基酸导致蛋白更小，更亲水，更能抵抗蛋白酶和热，并具有较低密度的T细胞表位。所有这四种性质都导致蛋白具有降低得相当大的免疫原性。它们也可以在大肠杆菌(E.coli)中制造，并且是高度可溶和稳定的。
[0149] CD20单克隆抗体
[0150] CD20是单克隆抗体(mAb)例如利妥昔单抗，奥法木单抗，维妥珠单抗，obinutuzumab，ibritumomab，tiuxetan，和tositumomab的靶标。
[0151] 细胞外配体可以是或包含一种或这些CD20mAb或其结合域。
[0152] 几种抗CD20抗体已经被批准用于治疗用途或目前正在进行临床试验，例如：
[0153] ·利妥昔单抗用于治疗非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)[0154] ·奥法木单抗由FDA于2009年10月批准用于CLL；
[0155] ·obinutuzumab由FDA于2013年11月批准用于CLL；
[0156] 嵌合mAb利妥昔单抗(Rituxan)是第一个FDA批准的CD20单克隆抗体。目前批准它用于治疗CD20阳性B细胞恶性肿瘤；例如非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。此外，它也被批准用于一些自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎。利妥昔单抗正在越来越多地用于其他几种自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)或多发性硬化症。在肿瘤学适应症中，利妥昔单抗通常与化学疗法组合使用，例如CHOP与利妥昔单抗的方案(R-CHOP)是弥漫性大B细胞淋巴瘤的护理标准。利妥昔单抗正在越来越多地用于无痛淋巴增殖性疾病中，作为长时间的维持阶段的单一疗法。利妥昔单抗是目前最常用的治疗性抗体。因此，已经浮现了其药理学性质的非常清楚的图片：利妥昔单抗是一种高效的淋巴耗竭性抗体。它通常是非常好地耐受的。虽然利妥昔单抗单一治疗导致B细胞耗竭，但增加的感染风险，特别是用短期方案是轻微的。
[0157] 利妥昔单抗是所谓的I型CD20mAb。利妥昔单抗诱导CD20分子重组织为脂筏，从而有效活化补体系统的经典途径。相比之下，II型CD20mAb没有这种效果并且较差活化补体。这两种类型都能够在效应细胞存在下诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0158] 利妥昔单抗是遗传工程化的嵌合鼠/人单克隆抗体。该抗体是含有鼠轻链和重链可变区序列和人恒定区序列的IgG1kappa免疫球蛋白。
[0159] 利妥昔单抗的重链和轻链可变区如SEQ ID No.21和22所示。
[0160] 奥法木单抗的重链和轻链可变区如SEQ ID No.23和24所示，其中CDR序列用下划线表示。
[0161] 利妥昔单抗重链可变链序列(SEQ ID No.21)
[0162] QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS
[0163] 利妥昔单抗轻链可变链序列(SEQ ID No.22)
[0164] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKR
[0165] 结合本发明的嵌合蛋白的细胞外配体可以是或包含利妥昔单抗或其结合部分。例如，细胞外配体可以包含如SEQ ID No.21所示的利妥昔单抗的重链可变区和/或如SEQ ID No.22所示的利妥昔单抗的轻链可变区。细胞外配体可以包含来自如SEQ ID No.21所示的利妥昔单抗重链可变区的CDR3和/或来自如SEQ ID No.22所示的利妥昔单抗的轻链可变区的CDR3。细胞外配体可以包含来自如SEQ ID No.21所示的利妥昔单抗重链可变区的CDR1，CDR2和CDR3和/或来自如SEQ ID No.22所示的利妥昔单抗的轻链可变区的CDR1，CDR2和CDR3。
[0166] 虽然利妥昔单抗是临床上使用的第一种和标准的抗CD20mAb，但已经开发和使用了其它的抗CD20 mAb。FDA在2009年批准了完全人CD20 mAb奥法木单抗用于治疗对阿仑单抗(alemtuzumab)和氟达拉滨都具有抗性的CLL患者。奥法木单抗对CD20的识别与利妥昔单抗对CD20的识别的不同之处在于其识别CD20的细胞外小和大环上的重叠表位。奥法木单抗是I型抗体，并且认为导致比利妥昔单抗甚至更好的补体活化，这可能是由于更好的脂筏形成。维妥珠单抗是人源化的CD20 mAb，其携带与利妥昔单抗相似的CDR序列(因此结合相同的表位)。Obinutuzumab(也称为GA101)是一种不常见的抗CD20治疗性mAb，因为它是II型CD20 mAb。obinutuzumab正在临床开发中。
[0167] 奥法木单抗重链可变链序列(SEQ ID No.23)
[0168] EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
[0169] 奥法木单抗轻链可变链序列(SEQ ID No.24)
[0170] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
[0171] 在上述序列中，CDR序列用下划线表示。
[0172] 结合本发明的嵌合蛋白的细胞外配体可以是或包含奥达木单抗或其结合部分。例如，细胞外配体可以包含如SEQ ID No.23所示的奥法木单抗的重链可变区和/或如SEQ ID No.24所示的奥法木单抗的轻链可变区。细胞外配体可以包含来自如SEQ ID No.23所示的奥法木单抗的重链可变区的CDR3和/或来自如SEQ ID No.24所示的奥法木单抗的轻链可变区的CDR3。细胞外配体可以包含来自如SEQ ID No.23所示的奥法木单抗的重链可变区的CDR1，CDR2，和CDR3和/或来自如SEQ ID No.24所示的奥法木单抗的轻链可变区的CDR1，CDR2，和CDR3。
[0173] 利妥昔单抗和奥法木单抗(以及可能的维尔珠单抗)对于本发明的自杀基因的FAS触发是理想的，因为它们引起CD20的聚簇并且内在地高溶解性，特别是利妥昔单抗具有非常良好建立的安全性概貌。有时，利妥单抗触发的自杀基因可能是不现实的-在定期接受利妥昔单抗的患者，特别是定期接受维持利妥昔单抗的患者中将是这样。由于利妥昔单抗具有此类长的半衰期，并且我们正在开发的自杀基因方法可能具有此类敏感性，在利妥昔单抗剂量后可能花费几个月才能给出工程化的T细胞。在这些患者中，具有对利妥昔单抗不敏感但对奥法木单抗敏感的CD20变体将是有用的。
[0174] 核酸序列
[0175] 本发明的第二方面提供了编码根据本发明的嵌合蛋白的核酸序列。
[0176] 如本文所用，术语“多核苷酸”，“核苷酸”和“核酸”意在彼此同义。
[0177] 技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本文所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映多肽在其中表达的任何特定宿主生物的密码子选择。
[0178] 根据本发明第二方面的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是在其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'端加入吖啶或聚赖氨酸链。为了本文所述的用途的目的，应当理解可以通过本领域可获得的任何方法修饰多核苷酸。可以进行这些修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
[0179] 关于核苷酸序列的术语“变体”，“同系物”或“衍生物”包括一个(或多个)核酸从序列或对序列的任何取代，变异，修饰，替换，缺失或添加。
[0180] 核酸序列可以编码如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示的嵌合蛋白序列或其变体。
[0181] 例如，核苷酸序列可以包含如SEQ ID No.25或26所示的序列。
[0182] SEQ ID No.25dCD20-FAS
[0183] ATGGGCCAGAGCTTCTTCATGCGGGAGAGCAAGACCCTGGGAGCCGTGCAGATCATGAACGGCCTGTTCCACATCGCCCTGGGAGGCCTGCTGATGATCCCTGCCGGCATCTACGCCCCAATCTGCGTGACCGTGTGGTACCCACTGTGGGGAGGCATCATGTACATCATCAGCGGCAGCCTGCTGGCCGCCACCGAGAAGAACAGCCGGAAGTGCCTGGTGAAGGGCAAGATGATCATGAACAGCCTGAGCCTGTTCGCCGCCATCAGCGGCATGATCCTGAGCATCATGGACATCCTGAACATCAAGATCAGCCACTTCCTGAAGATGGAGAGCCTGAACTTCATCCGGGCCCACACCCCATACATCAACATCTACAACTGCGAGCCTGCCAACCCCAGCGAGAAGAACAGCCCCAGCACCCAGTACTGCTACAGCATCCAGAGCCTGTTCCTGGGCATCCTGAGCGTGATGCTGATCTTCGCCTTCTTCCAGGAGCTGGTGATCGCCGGCATCGTGGAGAACGAGTGGAAGCGGACCTGCAGCCGGCCCAAGAGCAACATCGTGCTGCTGAGCGCCGAAGAGAAGAAAGAGCAGACCATCGAGATCAAGGAGGAAGTGGTGGGCCTGACCGAGACCAGCAGCCAGCCCAAGAACGAGGAGGACATCGAGATCATCCCCATCCAGGAAGAAGAGGAAGAGGAGACCGAGACCAACTTCCCCGAGCCACCCCAGGACCAGGAGAGCAGCCCTATCGAGAACGACAGCAGCCCCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGAGGTACAGAAAACATGCAGAAAGCACAGAAAGGAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACCTTAAATCCTGAAACAGTGGCAATAAATTTATCTGATGTTGACTTGAGTAAATATATCACCACTATTGCTGGAGTCATGACACTAAGTCAAGTTAAAGGCTTTGTTCGAAAGAATGGTGTCAATGAAGCCAAAATAGATGAGATCAAGAATGACAATGTCCAAGACACAGCAGAACAGAAAGTTCAACTGCTTCGTAATTGGCATCAACTTCATGGAAAGAAAGAAGCGTATGACACATTGATTAAAGATCTCAAAAAAGCCAATCTTTGTACTCTTGCAGAGAAAATTCAGACTATCATCCTCAAGGACATTACTAGTGACTCAGAAAATTCAAACTTCAGAAATGAAATCCAAAGCTTGGTCTGA[0184] SEQ ID No.26 dCD20P172W-FAS
[0185] ATGGGCCAGAGCTTCTTCATGCGGGAGAGCAAGACCCTGGGAGCCGTGCAGATCATGAACGGCCTGTTCCACATCGCCCTGGGAGGCCTGCTGATGATCCCTGCCGGCATCTACGCCCCAATCTGCGTGACCGTGTGGTACCCACTGTGGGGAGGCATCATGTACATCATCAGCGGCAGCCTGCTGGCCGCCACCGAGAAGAACAGCCGGAAGTGCCTGGTGAAGGGCAAGATGATCATGAACAGCCTGAGCCTGTTCGCCGCCATCAGCGGCATGATCCTGAGCATCATGGACATCCTGAACATCAAGATCAGCCACTTCCTGAAGATGGAGAGCCTGAACTTCATCCGGGCCCACACCCCATACATCAACATCTACAACTGCGAGCCTGCCAACTGGAGCGAGAAGAACAGCCCCAGCACCCAGTACTGCTACAGCATCCAGAGCCTGTTCCTGGGCATCCTGAGCGTGATGCTGATCTTCGCCTTCTTCCAGGAGCTGGTGATCGCCGGCATCGTGGAGAACGAGTGGAAGCGGACCTGCAGCCGGCCCAAGAGCAACATCGTGCTGCTGAGCGCCGAAGAGAAGAAAGAGCAGACCATCGAGATCAAGGAGGAAGTGGTGGGCCTGACCGAGACCAGCAGCCAGCCCAAGAACGAGGAGGACATCGAGATCATCCCCATCCAGGAAGAAGAGGAAGAGGAGACCGAGACCAACTTCCCCGAGCCACCCCAGGACCAGGAGAGCAGCCCTATCGAGAACGACAGCAGCCCCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGAGGTACAGAAAACATGCAGAAAGCACAGAAAGGAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACCTTAAATCCTGAAACAGTGGCAATAAATTTATCTGATGTTGACTTGAGTAAATATATCACCACTATTGCTGGAGTCATGACACTAAGTCAAGTTAAAGGCTTTGTTCGAAAGAATGGTGTCAATGAAGCCAAAATAGATGAGATCAAGAATGACAATGTCCAAGACACAGCAGAACAGAAAGTTCAACTGCTTCGTAATTGGCATCAACTTCATGGAAAGAAAGAAGCGTATGACACATTGATTAAAGATCTCAAAAAAGCCAATCTTTGTACTCTTGCAGAGAAAATTCAGACTATCATCCTCAAGGACATTACTAGTGACTCAGAAAATTCAAACTTCAGAAATGAAATCCAAAGCTTGGTCTGA[0186] 核酸构建体
[0187] 本发明还提供了核酸构建体，其包含：
[0188] i)编码嵌合蛋白的第一核酸序列，所述嵌合蛋白包含与FAS胞内域融合的多跨跨膜蛋白；和
[0189] ii)编码感兴趣的核苷酸(NOI)的第二核酸序列。
[0190] NOI可以例如编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
[0191] 可以通过允许两个或多个核酸序列共表达的序列连接核酸序列。例如，构建体可以包含内部启动子，内部核糖体进入序列(IRES)序列或编码切割位点的序列。切割位点可以是自切割的，使得当多肽产生时，其立即被切割成离散的蛋白，而不需要任何外部切割活性。
[0193] SEQ ID No.27
[0194] RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
[0195] 或者
[0196] SEQ ID No.28
[0197] QCTNYALLKLAGDVESNPGP
[0198] 共表达序列可以是内部核糖体进入序列(IRES)。共表达序列可以是内部启动子。
[0199] T细胞受体(TCR)
[0200] T细胞受体或TCR是T细胞表面上发现的分子，其负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。TCR和抗原之间的结合是相对低亲和力的并且是简并的：许多TCR识别相同的抗原且许多抗原被相同的TCR识别。
[0201] TCR由两条不同的蛋白链组成，即其是异二聚体。在95％的T细胞中，这由alpha(α)和beta(β)组成，而在5％的T细胞中，这由gamma和delta(γ/δ)链组成。该比率在个体发育期间和疾病状态中改变。
[0202] 当TCR与抗原性肽和MHC(肽/MHC)接合时，T淋巴细胞通过由相关酶、共受体、特化的衔接头分子，以及活化或释放的转录因子介导的一系列生物化学事件活化。
[0203] 本发明的核酸构建体或载体可以包含编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的核酸序列。其可以例如包含编码TCRα链的核酸序列和编码TCRβ链的核酸序列；或编码TCRγ链的核酸序列或编码TCRδ链的核酸序列。两个核酸序列可以通过使得能够共表达两条TCR链的序列，例如内部启动子、IRES序列或切割位点例如自切割位点连接。
[0204] 嵌合抗原受体(CAR)
[0205] 感兴趣的核酸序列(NOI)可以编码嵌合抗原受体(CAR)。
[0206] 经典的CAR是嵌合I型跨膜蛋白，其将细胞外抗原识别结构域(结合剂)与细胞内信号传导结构域(胞内域)连接。结合剂通常是衍生于单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗原识别位点的其它形式例如配体。为了将结合剂与膜分开并允许其适当定向，间隔区结构域可以是必要的。使用的常见间隔区结构域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧密的间隔区可以足够，例如来自CD8α的茎部和甚至仅单独的IgG1铰链。跨膜结构域将蛋白锚定在细胞膜中并将间隔区连接至胞内域，所述胞内域可以包含细胞内信号传导结构域或与细胞内信号传导结构域结合。
[0207] 早期的CAR设计具有来源于FcεR1或CD3ζ的γ链的细胞内部分的胞内信号传导域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足够触发T细胞杀伤关联靶细胞，但不能完全活化T细胞以增殖或存活。为了克服这一限制，构建了复合信号传导域：将T细胞共刺激分子的细胞内部分融合至CD3ζ的细胞内部分，产生了第二代受体，其在抗原识别后能够同时传输活化和共刺激信号。最通常使用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发T细胞增殖。也已经描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如紧密相关的OX40和41BB，其传输存活信号。现在已经描述了甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输活化，增殖和存活信号的胞内信号传导域。
[0208] 可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸转移至T细胞。以这种方式，可以生成大量抗原特异性T细胞用于用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输至上面表达有它的T细胞。因此，CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引导至表达靶定抗原的细胞。
[0209] 载体
[0210] 在第三个方面，本发明提供载体，其包含本发明的核酸序列或核酸构建体。
[0211] 本发明还提供载体，或载体的试剂盒，其包含一种或多种本发明的核酸序列或核酸构建体和任选地一种或多种另外的感兴趣的核酸序列(NOI)。此类载体可以用于将核酸序列或核酸构建体引入宿主细胞，使得其表达一种或多种根据本发明的第一个方面的嵌合蛋白，和任选地一种或多种其它的感兴趣的蛋白(POI)。该试剂盒还可以包含细胞外配体。
[0212] 载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。
[0213] 载体可以能够转染或转导T细胞。
[0214] NOI可以例如编码嵌合抗原受体或T细胞受体，使得当载体用于转导靶细胞时，靶细胞共表达嵌合蛋白和嵌合抗原受体或T细胞受体。
[0215] 细胞
[0216] 本发明还涉及包含根据本发明的第一个方面的嵌合蛋白的细胞。
[0217] 细胞可以是例如免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
[0218] 细胞可以是干细胞例如造血干细胞。
[0219] T细胞或T淋巴细胞是淋巴细胞的类型，其在细胞介导的免疫中发挥中心作用。通过细胞表面上的T细胞受体(TCR)的存在，它们可以与其它淋巴细胞例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分。存在多种类型的T细胞，如下文总结的。
[0220] 辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，所述免疫学过程包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面上表达CD4。TH细胞当通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子给它们呈递肽抗原时被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1，TH2，TH3，TH17，Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
[0221] 细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植物排斥。CTL在其表面表达CD8。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类缔合的抗原而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10，腺苷和其他分子，可以将CD8+细胞失活至无变应性状态，这防止自身免疫疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
[0222] 记忆T细胞是抗原特异性T细胞的子集，该细胞在感染已经消退之后长期持续。它们在再次暴露于其关联抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供了针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
[0223] 以前称为抑制物T细胞的调节性T细胞(Treg细胞)对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫朝向免疫反应的结束，以及抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞。
[0224] 已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞-天然发生的Treg细胞和适应性Treg细胞。
[0225] 天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并且已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞二者之间的相互作用联系起来。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在而与其它T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。
[0226] 适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间起源。
[0227] 自然杀伤细胞(或NK细胞)是形成先天免疫系统的一部分的一类细胞溶解性细胞。NK细胞以不依赖于MHC的方式对来自病毒感染的细胞的先天信号提供快速应答。
[0228] NK细胞(属于先天性淋巴样细胞群)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从产生B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓，淋巴结，脾，扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那里它们进入循环。
[0229] 干细胞是未分化的细胞，其可以分化为特化的细胞。在哺乳动物中，存在两大类干细胞：胚胎干细胞，其是从胚泡的内细胞团分离，和成体干细胞，其在各种组织中存在。在成年生物体中，干细胞和祖细胞充当机体的修复系统，补充成体组织。在发育中的胚胎中，干细胞可以分化成所有的特化细胞-外胚层，内胚层和中胚层(见诱导的多能干细胞)-但还维持再生器官如血液，皮肤或肠组织的正常周转。
[0230] 在人类中存在三种已知的可及的自体成体干细胞来源：
[0231] 1.骨髓，其需要通过收获来提取，即钻入骨中。
[0232] 2.脂肪组织，其需要通过抽脂术提取。
[0233] 3.血液，这需要通过单采血液成分(apheresis)提取，其中血液从供体采集并通过机器，该机器提取干细胞并将血液的其它部分返回供体。
[0234] 成体干细胞经常在药物疗法中使用，例如在骨髓移植中。现在干细胞可以人工生长并转化(分化)为具有与多种组织例如肌肉或神经的细胞一致的特征的特化细胞类型。通过体细胞核移植或去分化生成的自体胚胎干细胞和胚胎细胞系也可以用于生成特化的细胞类型用于细胞疗法。
[0235] 造血干细胞(HSC)是血细胞，其产生所有其它的血细胞，并来源于中胚层。它们定位于在大多数骨骼的核心中含有的红骨髓。
[0236] 它们产生髓样细胞(单核细胞和巨噬细胞，嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)，和淋巴样谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。造血组织含有具有长期和短期再生能力的细胞，和定型(committed)多能、寡能和单能祖细胞。
[0237] HSC是异质性群体。存在三类干细胞，通过血液中它们的淋巴样对髓样后代的比率(L/M)区分。髓样偏好的(My-bi)HSC具有低的L/M比率(0和3之间)，而淋巴样偏好的(Ly-bi)的HSC显示大的比率(＞10)。第三类由平衡的(Bala)HSC组成，其L/M比率在3和10之间。仅髓样偏好的和平衡的HSC具有持久的自我更新特性。
[0238] 本发明的表达嵌合蛋白的细胞可以是上述任何细胞类型。
[0239] 表达一种或多种根据本发明的第一个方面的嵌合蛋白的T或NK细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体产生，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的设置中产生，或自不相关供体的外周血(第三方)产生。
[0240] 或者，表达一种或多种根据本发明的第一个方面的嵌合蛋白的T或NK细胞可以通过诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为T细胞衍生。或者，可以使用保留其溶解功能并且可以起治疗剂作用的永生化T细胞系。
[0241] 在所有这些实施方案中，通过诸如使用病毒载体转导或使用DNA或RNA转染等手段，引入编码嵌合蛋白或每种嵌合蛋白和任选的NOI的DNA或RNA来生成表达嵌合蛋白的细胞。
[0242] 本发明的细胞可以是来自受试者的离体T或NK细胞。T或NK细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品。T或NK细胞可以在用编码一种或多种根据本发明的第一个方面的嵌合蛋白的核酸转导之前进行活化和/或扩增，例如通过使用抗CD3单克隆抗体处理。
[0243] 本发明的T或NK细胞可以如下制备：
[0244] (i)从受试者或上文列出的其它来源分离含T或NK细胞的样品；并
[0245] (ii)使用编码一种或多种根据本发明的第二个方面的核酸序列转导或转染T或NK细胞。
[0246] 本发明还提供试剂盒，其包含T或NK细胞和CID，所述T或NK细胞包含一种或多种根据本发明的第一个发明的嵌合蛋白。
[0247] 药物组合物
[0248] 本发明还涉及药物组合物，其含有多种根据本发明的第四个方面的细胞。药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如为适合用于静脉输注的形式。
[0249] 方法
[0250] 本发明还提供用于制备根据本发明的第四个方面的细胞的方法，其包括使用根据本发明的第三个方面的载体转导或转染细胞的步骤。
[0251] 载体可以是例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
[0252] 本发明还提供用于删除根据本发明的第四个方面的细胞的方法，其包括将细胞暴露于结合多跨跨膜蛋白的细胞外配体的步骤。
[0253] 细胞外配体的结合引起FAS胞内域的活化和细胞的凋亡。
[0254] 细胞外配体的结合可以引起多个嵌合蛋白的多跨跨膜蛋白的交联，引起补体依赖性细胞毒性(CDC)。
[0255] 在细胞外配体是抗体的情况下，细胞外配体的结合可以引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0256] 细胞可以在体内或体外暴露于细胞外配体。
[0257] 细胞外配体可以是例如抗CD20mAb，例如利妥昔单抗，奥法木单抗或维妥珠单抗。
[0258] 可以以药物组合物的形式施用细胞外配体。药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以为例如适合用于静脉输注的形式。
[0259] 本发明还提供用于预防和/或治疗受试者中由对受试者施用根据本发明的第四个方面的细胞引起的病理性免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用能够结合多跨跨膜蛋白的细胞外配体的步骤。
[0260] 病理性免疫反应可以选自下组：移植物抗宿主病；中靶脱肿瘤毒性(on-target,off-tumour toxicity)；免疫活化综合征；和淋巴增殖性病症。
[0261] 本发明还提供用于治疗或预防受试者中的疾病的方法，其包括向所述受试者施用根据本发明的第四个方面的细胞的步骤。该细胞可以以如上文定义的药物组合物的形式。
[0262] 所述方法可以包括以下步骤：
[0263] (i)使用根据本发明的第三个方面的载体转导或转染从受试者分离的细胞样品，并
[0264] (ii)将经转导的/转染的细胞施用至患者。
[0265] 用于治疗疾病的方法涉及本发明的细胞的治疗性用途。本文中，可以将细胞施用至具有现存的疾病或状况的受试者，以减轻，降低或改善至少一种与该疾病相关的症状和/或减慢、降低或阻断疾病的进展。
[0266] 用于预防疾病的方法涉及本发明的免疫细胞的预防性用途。本文中，可以将此类细胞施用至尚未感染疾病和/或没有显示疾病的任何症状的受试者，以预防或削弱疾病的原因或降低或防止与疾病相关的至少一种症状的形成。该受试者可以具有形成疾病的素因或认为具有形成疾病的风险。
[0267] 本发明提供的用于治疗疾病的方法可以涉及监测疾病的进展和监测任何毒性活性并调整施用至受试者的细胞外配体的剂量，以提供可接受水平的疾病进展和毒性活性。
[0268] 监测疾病的进展意味着随时间评估与疾病相关的症状以确定其是否在降低/改善或增加/恶化。
[0269] 毒性活性指在将本发明的细胞施用至受试者后由其引起的副作用。毒性活性可以包括例如免疫毒性、胆汁毒性和呼吸窘迫综合征。
[0270] 特别地，本发明提供用于治疗受试者中的疾病的方法，其包括以下步骤：
[0271] (i)将根据本发明的第四个方面的细胞施用至受试者；
[0272] (ii)监测所述受试者的病理性免疫反应的形成；并
[0273] (iii)如果所述受试者显示正在形成或已经形成病理性免疫反应的体征，则向所述受试者施用雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
[0274] 本发明提供本发明的细胞，其用于治疗和/或预防疾病。
[0275] 该细胞可以例如用于造血干细胞移植、淋巴细胞输注或过继细胞转移。
[0276] 本发明还涉及本发明的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
[0277] 本发明还提供用于治疗和/或预防毒性活性的细胞外配体，其能够活化根据本发明的第一个方面的嵌合蛋白。
[0278] 通过本发明的细胞和方法治疗和/或预防的疾病可以是感染，例如病毒感染。
[0279] 本发明的方法还可以用于控制病理性免疫应答，例如在自身免疫性疾病、变态反应和移植物抗宿主排斥中。
[0280] 在本发明的细胞表达TCR或CAR的情况下，它们可以用于治疗癌性疾病，例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
[0281] 本发明的表达TCR/CAR的细胞可以能够杀伤靶细胞，例如癌细胞。
[0282] 本发明的细胞可以用于任何细胞疗法，其中将经修饰或未修饰的细胞施用至患者。细胞治疗的一个例子是在CD34+干细胞移植后的过继性T细胞转移。干细胞转移后施用T细胞有助于加速患者受体免疫系统的重建。当匹配的相关或不相关的供体不可用时，或者该疾病对于广泛的供体搜索来说太具攻击性时，使用HLA单倍体相同的(haploidentical)家族供体可以是有效的。此类供体可以是父母，兄弟姐妹或二级亲属。此类输注可以增强免疫恢复，并且从而降低病毒感染和消除复发性白血病细胞。然而，供体干细胞移植物中同种异体反应性(alloreactive)T细胞的共存可以导致移植物抗宿主病(GvHD)，其中供体细胞针对接受体起反应，这可以逐渐损伤接受体的皮肤、肠、肝和其它器官。
[0283] 细胞疗法的其它实例包括使用天然(native)细胞或遗传工程改造以表达异源基因的细胞。这些治疗用于许多病症，包括血液病症，但这些治疗方法可以具有负面的副作用。在另一种方法中，可以分化成许多类型的成熟细胞的未成熟祖细胞(例如间充质基质细胞)可用于通过置换患病细胞的功能来治疗病症。本发明提供了快速且有效的机制，以去除细胞疗法中使用的供体细胞可能的负面影响。
[0284] 本发明提供在供体T细胞移植后，降低人类患者中移植物抗宿主病的作用的方法，其包括用根据本发明的载体转导或转染供体细胞培养物中的人类供体T细胞；向患者施用经转导或转染的T细胞；随后检测患者中存在或不存在移植物抗宿主病；以及向检测到移植物抗宿主病存在的患者施用细胞外配体。T细胞可以是非同种异体耗竭的(non-allodepleted)。
[0285] 本发明提供了干细胞移植的方法，包括向人类患者施用单倍体相同的干细胞移植物；以及向所述患者施用单倍体相同的供体T细胞，其中使用根据本发明的载体转染或转导单倍体相同的供体细胞培养物中的T细胞。
[0286] 细胞可以是供体细胞培养物中的非同种异体耗竭的人类供体T细胞。
[0287] 本发明还提供了干细胞移植的方法，包括向人类患者施用单倍体相同的干细胞移植物；以及向所述患者施用非同种异体耗竭的供体T细胞，其中使用根据本发明的载体转染或转导单倍体相同的供体细胞培养物中的T细胞。
[0288] 单倍体相同的干细胞移植物可以是CD34+单倍体相同的干细胞移植物。人类供体T细胞可以与患者的T细胞单倍体相同的。患者可以患有可以通过干细胞移植减轻的任何疾病或病症。患者可以患有癌症，例如实体瘤或血液或骨髓的癌症。患者可以患有血液或骨髓疾病。患者可以患有镰状细胞性贫血或异染性脑白质营养不良。
[0289] 可以从骨髓样品或外周血制备供体细胞培养物。可以从供体外周血单核细胞制备供体细胞培养物。在一些实施方案中，在转染或转导之前从供体细胞培养物同种异体耗竭供体T细胞。在施用至患者之前，转导或转染的T细胞可以在IL-2的存在下培养。
[0290] 将通过实施例的方式进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，且不意图以任何方式限制本发明的范围。实施例
[0291] 实施例1-测试CD20的截短形式
[0292] CD20是在B细胞和几乎所有B细胞淋巴瘤，毛细胞白血病和B细胞慢性淋巴细胞白血病上表达的多跨膜蛋白。CD20具有通过二硫键约束的两个胞外环：小环和大环。其具有氨基末端和羧基末端胞内域。
[0293] CD20被许多治疗性单克隆抗体识别，包括利妥昔单抗和奥法木单抗。本发明人寻求确定具有氨基或羧基胞内域末端缺失的CD20是否仍然能够被此类抗体识别。
[0294] 为了该目的：全长CD20；CD20的氨基末端(胞内域)截短体；和CD20的羧基末端(胞内域)截短体，各自与eGFP融合。用这些质粒转染293T细胞并用利妥昔单抗或奥法木单抗染色。流式细胞分析显示，这些截短对CD20的表面表达/识别没有产生差异(图1)。
[0295] 实施例2-具有低基础毒性的FAS嵌合体的产生
[0296] 简单的FAS嵌合体(例如RQR8和FAS之间的融合)或具有FAS胞内域的嵌合抗原受体(Tone et al(2013)Hum.Gene Ther.Methods 24,141–150)的表达导致显著的基础毒性。由于FAS是凋亡的敏感触发因子，简单的过表达可以导致自发活化。
[0297] 为了测试这一点，生成了FAS嵌合体，其是多跨膜蛋白和FAS之间的融合。这应当导致“填补(padding out)”FAS胞内域，降低自发活化的可能性，并从而降低或消除基础毒性。选择CD20作为多跨蛋白，并将CD20的氨基末端截短形式的羧基末端与FAS的胞内域融合，以产生dCD20-FAS(图2b)。
[0298] 构建体还共表达eGFP，使得能够研究其表达和功能。还包括RQR8和RQR8-FAS，即一种RQR8变体，其中FAS附接至RQR8的羧基末端。在293T细胞中测试功能，比较其基础毒性和通过暴露于奥法木单抗诱导的毒性。结果如图3所示。与具有高水平的基础毒性的RQR8-FAS不同，dCD20-FAS导致非常低的基础毒性和非常高的诱导毒性。
[0299] 实施例3-研究利妥昔单抗的敏感性
[0300] 使用dCD20-FAS转导Jurkat T细胞并暴露于不同浓度的利妥昔单抗(没有补体)并进行时间进程(time-course)。预期FAS介导的凋亡相对缓慢地活化。通过用膜联蛋白-V/7AAD染色T细胞来测定凋亡。值得注意的是，如图4所示，在24和48小时的时间进程中，杀伤
50％细胞的利妥昔单抗的浓度低于3.125ug/ml。进行进一步的实验，其中杀伤dCD20-FAS表达性T细胞是暴露于利妥昔单抗的进一步稀释达48小时的(图5)。该实验表明，dCD20-FAS提供非常敏感的活化，其中杀伤50％细胞的百分比约为0.6ug/ml。这远低于约200ug/ml的治疗水平(Berinstein et al.(1998)Ann.Oncol.Off.J.Eur.Soc.Med.Oncol.ESMO 9,995–
1001)。
50％细胞的利妥昔单抗的浓度低于3.125ug/ml。进行进一步的实验，其中杀伤dCD20-FAS表达性T细胞是暴露于利妥昔单抗的进一步稀释达48小时的(图5)。该实验表明，dCD20-FAS提供非常敏感的活化，其中杀伤50％细胞的百分比约为0.6ug/ml。这远低于约200ug/ml的治疗水平(Berinstein et al.(1998)Ann.Oncol.Off.J.Eur.Soc.Med.Oncol.ESMO 9,995–
1001)。
[0301] 实施例4-研究奥法木单抗的敏感性
[0302] 使用dCD20-FAS转导Jurkat T细胞并暴露于不同浓度的奥法木单抗并进行时间进程(图6)。T细胞对奥法木单抗非常敏感。比利妥昔单抗更快且以更低的浓度发生杀伤。为了确定dCD20-FAS表达性T细胞的敏感性，进行了进一步的实验，其中测定暴露于增加稀释度的奥法木单抗48小时后对dCD20-FAS T细胞的杀伤(图7)。值得注意的是，未达到50％T细胞被杀伤的奥法木单抗浓度，其中该浓度低于0.195ug/ml。这远低于奥法木单抗的治疗浓度，其报道为63ug/ml和1482ug/ml之间(分别为奥法木单抗的第一次输注和第12次之后)(Gravanis et al.(2010)The Oncologist；15:1335-1343)。
[0303] 实施例5-工程化改造CD20以破坏利妥昔单抗结合而不破坏奥法木单抗结合[0304] 可能有些情况下，利妥昔单抗不是理想的活化药物，例如定期接受利妥昔单抗的患者群体中。在这些患者中，对利妥昔单抗不敏感而对奥法木单抗敏感将是有用的方法，因为奥法木单抗不常用，但似乎与利妥昔单抗同等有效或更有效。
[0305] 为了产生CD20变体，在残基A170和P172处将许多突变引入到CD20中，预测它们替换了利妥昔单抗结合但不影响奥法木单抗结合。从这些突变，发现P172W突变的CD20结合奥法木单抗，而不结合利妥昔单抗。这通过图8所示的结果证实，其中wt CD20和CD20-P172W与eGFP共表达并转染到293T细胞中。随后用利妥昔单抗或奥妥珠单抗染色这些细胞。尽管wt CD20结合这两者，但CD20-P172W仅结合奥法木单抗。
[0306] 实施例6-研究ADCC
[0307] 由于ADCC发生在直接杀伤的时间范围内，生成了dCD20-FAS的突变体，其中使用点突变(E272K)使FAS胞内域失活(Wang et al.,(2010),Nature Structural and Molecular Biology,17,11,1324-1330)。使用该构建体转导T细胞。使用通过逆转录病毒载体转导和单细胞克隆建立的K562刺激细胞系生成自然杀伤(NK)细胞效应物，所述K562刺激细胞系表达膜结合性白细胞介素-15和41BBL(K562.41BBL.mIL150)。将从健康供体新鲜分离的外周血单核细胞与经照射的K562.41BBL.mIL150在24孔组织培养处理的多孔板中以1：1共培养，所述经照射的K562.41BBL.mIL150在120Gy下照射并使用40iu IL2补充。根据需要进行部分培养基改变。在培养中7天后，在单轮Miltenyi CD56阳性选择后分离出NK细胞的纯群体(约95％纯度)，并用CellTRACE violet(invitrogen)标记。使用全长CD20，RQR8或dCD20-FASE272K转导的T细胞作为靶标，并以16：1，8：1，4：1和2：1的效应物：靶标比例与NK细胞效应物共培养48小时。在膜联蛋白V(BD Biosciences)和碘化丙啶(PI)(SigmaAldrich)染色后，通过流式细胞术评估细胞删除。
[0308] 实施例7-在人原代T细胞中研究dCD20-FAS和dCD20P172W-FAS的功能
[0309] 在原代人T细胞中研究了构建体dCD20-FAS和dCD20P172W-FAS在暴露于利妥昔单抗和奥法木单抗时直接激活细胞凋亡的能力。由于FAS活化花费一些时间来形成，而CDC几乎是瞬时的，通过在补体存在下测试即时凋亡，可以确定这些构建体是否也允许CDC介导的杀伤。如图9所示，dCD20-FAS T细胞被利妥昔单抗和奥法木单抗有效地直接杀伤，且通过CDC杀伤。另一方面，dCD20P172W-FAS原代T细胞仅被奥法木单抗而不被利妥昔单抗有效地直接杀伤或通过CDC杀伤。通过奥法木单抗在原发性T细胞中使用dCD20-FAS直接杀伤的实例在图10中显示。
[0310] 因此，本发明人产生了由治疗性单克隆抗体活化的三重功能自杀基因。
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