增强抗PSCA嵌合抗原受体活性的人源化抗体及其应用
阅读：1005发布：2020-07-17
专利汇可以提供增强抗PSCA嵌合抗原受体活性的人源化抗体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程领域，具体涉及一种增强抗PSCA嵌合 抗原 受体活性的人源化 抗体 及其应用。本发明所述的人源化抗体识别PSCA并且能够增强抗PSCA嵌合抗原受体的抗 肿瘤 活性。进一步该人源化抗体组合的嵌合抗原受体，可以稳定表达于病人来源的T淋巴细胞，未经PSCA阳性靶细胞刺激不会发生自激活现象并且具有更好的清除肿瘤细胞的能 力 ，用于针对实体瘤的 过继细胞 治疗 。，下面是增强抗PSCA嵌合抗原受体活性的人源化抗体及其应用专利的具体信息内容。
1.识别PSCA的人源化抗体，其特征在于，所述人源化单链抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述人源化单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
2.权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
3.权利要求1-2任一项所述的人源化单链抗体在用于制备治疗实体瘤的药物中的应用，所述实体瘤细胞表达PSCA。
4.权利要求1-2任一项所述的人源化单链抗体组合的嵌合抗原受体。
5.权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含识别PSCA的单链抗体，铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别PSCA的单链抗体的氨基酸如SEQ ID NO:13所示。
6.权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；所述胞内信号域为CD3ζ链和/或FcRγ和/或CD28和/或CD137和/或CD278。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24所示。
8.含有权利要求1-7任一项所述序列对应的核苷酸序列的载体，所述载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体或质粒。
9.权利要求8所述的载体感染的细胞，所述细胞可选自：干细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞或巨噬细胞。
10.权利要求9所述的细胞在用于制备治疗实体瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的实体瘤的细胞能够表达PSCA。
增强抗PSCA嵌合抗原受体活性的人源化抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种增强抗PSCA嵌合抗原受体活性的人源化抗体及其应用，还涉及包含所述抗体的识别PSCA的嵌合抗原受体。
背景技术
[0002] 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区、跨膜区及胞内信号域依次连接组成。胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB (CD137)，CD28，ICOS(CD278)。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。
[0003] 近年来，T淋巴细胞嵌合抗原受体（CAR-T）在肿瘤治疗中展现了显著的治疗效果尤其是治疗CD19阳性的恶相肿瘤或者白血病方面；利用CAR-T进行实体瘤的研究也不断得到重视，但是大多数CAR-T治疗实体瘤的效果却并不令人满意。在CAR-T的治疗中相对于杀伤肿瘤的能力，安全性和CAR-T能否有效的识别肿瘤细胞是更重要的因素，发明人团队通过前期研究发现了2个较为适合作为靶向PSCA CAR抗原识别区的鼠源抗体，在高效靶比时均对PSCA阳性肿瘤细胞有较高杀伤，但在低效靶比时杀伤较弱；发明人团队还发现大多数鼠源抗体组合的CAR-T细胞在体外正常培养时存在自激活的可能，而CAR-T细胞自激活问题也是威胁CAR-T安全性的关键问题之一，目前关于CAR-T自激活还没有很好地解决方案，是否铰链区还是scFv的选择或人源化程度会对CAR-T细胞自激活有影响也未见报道，是否自激活是影响CAR-T细胞杀伤活性的一大因素也还未确认。
[0004] 综上所述，通过改造scFv获得更强有效性的CAR及CAR-T，寻求降低CAR-T自激活的解决方案，对于CAR-T实体瘤治疗很有必要。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种识别PSCA的人源化单链抗体，本发明所述的人源化单链抗体能够增强靶抗PSCA CAR-T活性，降低CAR-T细胞自激活作用，只有在PSCA阳性靶细胞刺激下才会激活对靶细胞进行清除。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：识别PSCA的人源化单链抗体，由鼠抗人PSCA的单克隆抗体轻、重链的6段FR区氨基酸序列经过IMGT/BLAST数据库经序列分析及比对，选择同源性最高人抗体序列作为改造模板；
对人源化改造的序列进行PCR定点突变。
对人源化改造的序列进行PCR定点突变。
[0007] 人源化抗体是指抗体的可变区部分（即VH和VL区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应，人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为人源化抗体。但是常规的CDR移植的人源化改造方法通常会导致改造的抗体失去原有抗原结合活性，因此需要对影响抗原抗体结合的关键残基进行反复修改，而后通过大量抗原抗体结合特异性、亲和力检测，从而筛选得到具有活性的抗体序列。
[0008] 因此，本发明的目的之一，在于提供一种识别PSCA的人源化单链抗体。
[0009] 所述识别PSCA的人源化单链抗体（scFv）的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述人源化单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
[0010] 进一步，所述的人源化抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0011] 进一步，所述人源化抗体核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 本发明的目的之二，在于提供所述的人源化单链抗体在用于制备治疗实体瘤的药物中的应用。
[0013] 进一步，所述实体瘤细胞表达PSCA。
[0014] 进一步，提供由所述的人源化单链抗体组合的嵌合抗原受体。
[0015] 发明人团队经过大量的CAR-T表达研究发现scFv以及铰链区（hinge区）的选择都是影响CAR-T自激活的关键因素，如何设计scFv使之能够较好地保留其对抗原的亲和活性，如何选择hinge序列使之与scFv组合为最佳的识别PSCA嵌合抗原受体，是一个难题。发明人团队在未有更有效的技术提示的情况下通过排除法将目前已报道的鼠源抗PSCA的单克隆抗体设计的scFv和人源化scFv，通过与不同的hinge序列组合构建CAR（嵌合抗原受体）进行筛选；而仅仅由本发明所保护的识别PSCA的嵌合抗原受体，具有预料不到的技术效果。本发明保护的CAR的组合方式，经过测试之后，可以稳定表达于病人来源的T淋巴细胞，未经PSCA阳性靶细胞刺激不会发生自激活现象并且具有更好的清除肿瘤细胞的能力，用于针对实体瘤的过继细胞治疗。
[0016] 进一步，所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含识别PSCA的单链抗体，铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别PSCA的单链抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0017] 进一步，所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；所述胞内信号域为CD3ζ链和/或FcRγ和/或CD28和/或CD137和/或CD278。
[0018] 作为一种优选，所述胞内信号域依次为CD28、CD137和CD3ζ。
[0019] 优选的，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24所示。
[0020] 本发明的目的之三在于提供一种含有上述所述序列的载体，所述载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体或质粒。
[0021] 本发明的目的还在于提供一种所述的载体感染的细胞，所述细胞可选自：干细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞或巨噬细胞。
[0023] 另外，回到发明的起源端，本发明的目的还在于提供SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列在制备CAR-T骨架中的应用。
[0024] 总的来说，本发明提供的人源化单链抗体能够增强CAR-T细胞杀伤肿瘤的有效性，表达所述的scFv组合的CAR的CAR-T细胞，不仅可以维持靶向PSCA的CAR在病人细胞培养过程中的阳性率并且能够避免由于CAR-T细胞回输人体后的自激活引发的安全隐患，同时能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。
[0025] 本发明的有益效果在于：1）本发明提供的人源化单链抗体，能够特异性识别PSCA，并且增强抗PSCA嵌合抗原受体活性。
[0026] 2）本发明提供的包含本发明所述人源化单链抗体的识别PSCA嵌合抗原受体，能够更稳定的表达于T淋巴细胞，具有更好的清除肿瘤细胞的能力，可以用于制备治疗实体瘤的药物中针对实体瘤的过继细胞治疗。
[0027] 3）本发明提供的包含本发明所述人源化单链抗体的识别PSCA嵌合抗原受体获得的CAR-T细胞，未经靶细胞刺激活化不能自行激活增殖，可以维持靶向PSCA的嵌合抗原受体在病人细胞培养过程中的阳性率，安全性好有效性高。附图说明
[0028] 图1靶向人PSCA人源化scFv的序列图2不同CAR结构示意图。
[0029] 图3不同肿瘤细胞PSCA表达。
[0030] 图4 PSCA-CAR转染T淋巴细胞能力检测。
[0031] 图5不同scFv组合的CAR-T细胞对表达不同程度PSCA肿瘤细胞杀伤。
[0032] 图6 不同scFv组合的CAR-T细胞杀伤细胞后细胞因子释放检测。
具体实施方式
[0033] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0034] 本部分实验通过对“现有技术”中的两种不同的单克隆抗体（表位肽不同）的单链抗体进行获得，虽然理论上“单链抗体”可以用于制备嵌合抗原受体，但实际并不是每一单链抗体都可以用于制备嵌合抗原受体，组成嵌合抗原受体铰链区的不同也对嵌合抗原受体功能有着重大影响。这需要发明人付出创造性的劳动，才能在众多的CAR的组合方式中找到具有预料不到的效果的产品。
[0035] 实施例1设计抗人PSCA抗原的人源化单链抗体将鼠抗人PSCA抗原的单克隆抗体轻、重链的6段FR区氨基酸序列经过IMGT/BLAST数据库经序列分析及比对，选择同源性最高人抗体序列作为改造模板。对人源化改造的序列进行PCR定点突变，进行定点突变后获得4个新的改造scFV，选择P-3h1进行CAR结构改造，P-
3h1氨基酸序列如图1所示。
3h1氨基酸序列如图1所示。
[0036] 实施例2含有识别PSCA的scFv的嵌合抗原受体病毒的构建为了构建更有效的针对PSCA的嵌合抗原受体我们利用已有的两株鼠源抗体构建其scFv设计了PSCA1-G4h，PSCA1-8h，PSCA2-G4h，PSCA2-8h四组CAR结构，利用人源化改造的scFv构建P-3h1-G4h和P-3h1-8h CAR组合。CAR结构如图2所示。
[0037] 合成不同组合的靶向PSCA的嵌合抗原受体的基因序列合成依次含前导肽(又称信号肽)(简称LP)、抗人PSCA抗原的不同的单链抗体scFv，IgG4铰链区(简称G4h)或CD8铰链区(简称8h)、CD28跨膜区 (简称为TM)，以及CD28、CD137和CD3胞内信号域，其中，编码前导肽的核酸序列如SEQ ID NO:9所示；抗人PSCA抗原的单链抗体核酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20所示的；铰链区核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；CD28跨膜区核酸序列如SEQ ID NO:5所示；胞内信号分子核酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。CAR结构如图1所示。
[0038] 构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体设计引物核酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，并将其由南京金斯瑞生物科技公司合成。
[0039] 然后以上述所示序列为引物，上述合成的各嵌合抗原受体序列为模板进行PCR扩增，反应体系按KOD FX NEO DNA聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书加样，将扩增产物鉴定后用回收试剂盒(Promega公司)进行DNA片段回收，具体方法见说明书，回收获得嵌合抗原受体，将DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司测序。
[0040] 将克隆获得的编码嵌合抗原受体的基因序列双酶切，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将的目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。将慢病毒载体转化大肠杆菌TOP10，挑取单克隆培养12h后用质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
[0042] 4慢病毒的纯化收集病毒3000r/min离心10min后过滤，滤液3000r/min离心10min至新的50ml离心管；
根据病毒上清量，用终浓度为8.5％的PEG6000，0.3M NaCl沉降病毒；然后于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用200μl DMEM培养基重悬病毒，1.5mlEP管分装，每管40μl，-
80℃保存备用。制得病毒分别命名为：
PSCA1-G4h，PSCA1-8h，PSCA2-G4h，PSCA2-8h，P-3h1-G4h和P-3h1-8h。
根据病毒上清量，用终浓度为8.5％的PEG6000，0.3M NaCl沉降病毒；然后于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用200μl DMEM培养基重悬病毒，1.5mlEP管分装，每管40μl，-
80℃保存备用。制得病毒分别命名为：
PSCA1-G4h，PSCA1-8h，PSCA2-G4h，PSCA2-8h，P-3h1-G4h和P-3h1-8h。
[0043] 慢病毒滴度测定293T细胞加入1μl聚凝胺(Polybrene)溶液，然后将1μl和9μl稀释后的病毒液分别加到
293T细胞中，24h后用含10％FBS(wt)的DMEM培养基换液，感染72h后通过流式方法检测Protein-L表达推算病毒感染滴度；Protein-L为可与抗体轻链结合蛋白，通过检测被感染细胞表面Protein-L分子的表达可以反映被感染细胞表面包含单链抗体的CAR的表达；计算结果显示，病毒滴度大于1× 108TU/ml。
293T细胞中，24h后用含10％FBS(wt)的DMEM培养基换液，感染72h后通过流式方法检测Protein-L表达推算病毒感染滴度；Protein-L为可与抗体轻链结合蛋白，通过检测被感染细胞表面Protein-L分子的表达可以反映被感染细胞表面包含单链抗体的CAR的表达；计算结果显示，病毒滴度大于1× 108TU/ml。
[0044] 实施例3、不同肿瘤细胞表达PSCA阳性比例检测培养至10天的肿瘤细胞Hela，PC3，T24，RT4分别收集到10ml离心管，300g/min，离心
5min，弃尽上清以收集细胞； 用含有体积分数1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1× 106个/ml；将收集的细胞分装后标记抗PSCA流式检测抗体，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测。
5min，弃尽上清以收集细胞； 用含有体积分数1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1× 106个/ml；将收集的细胞分装后标记抗PSCA流式检测抗体，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测。
[0045] 结果如图3所示，PC3、RT4、Hela为PSCA阳性细胞，表达阳性率依次升高，T24为PSCA阴性细胞。
[0046] 实施例4 PSCA-CAR转染T淋巴细胞能力检测1人外周血单核细胞的分离
用加有抗凝剂的采血管采集外周血分装于50ml离心管，加入7.5ml 羟乙基淀粉稀释后室温(18～25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于 1400rpm/min条件下离心15min；然后利用梯度离心法分离淋巴细胞层，取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次后重悬细胞，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，得人外周血单核细胞。
用加有抗凝剂的采血管采集外周血分装于50ml离心管，加入7.5ml 羟乙基淀粉稀释后室温(18～25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于 1400rpm/min条件下离心15min；然后利用梯度离心法分离淋巴细胞层，取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次后重悬细胞，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，得人外周血单核细胞。
[0047] 慢病毒载体感染T淋巴细胞分离的人外周血单核细胞利用抗CD3和抗CD28抗体活化后进行病毒感染，未感染的 T淋巴细胞作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养7-14天。PSCA1-G4h，PSCA1-8h，PSCA2-G4h，PSCA2-8h，P-3h1-G4h和P-3h1-
8h病毒感染的T细胞分别命名为PSCA-CAR-1，PSCA-CAR-2，PSCA-CAR-3、PSCA-CAR-4、(P-
3h1)-CAR-1以及(P-3h1)-CAR-2。
8h病毒感染的T细胞分别命名为PSCA-CAR-1，PSCA-CAR-2，PSCA-CAR-3、PSCA-CAR-4、(P-
3h1)-CAR-1以及(P-3h1)-CAR-2。
[0048] 1）在培养过程中对培养的已感染病毒的T细胞利用流式细胞术检测Protein-L阳性率，检测结果即表示培养第10天不同PSCA-CAR组合在T淋巴细胞表达阳性率。
[0049] 结果如图4所示，除PSCA-CAR-4转染T淋巴细胞阳性率低，其他PSCA-CAR在 T细胞均有较高表达，其中以PSCA-CAR-2、(P-3h1)-CAR-1以及(P-3h1)-CAR-2 CAR阳性率较高。
[0050] 实施例5、病毒感染CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤能力的影响不同scFv的嵌合抗原受体对靶细胞的杀伤能力通过ACEA xCELLigence RTCA MP仪器完成，实验步骤依据仪器说明书进行；第一天将靶细胞（表达CEA的肿瘤细胞）以2-5*104每孔铺板于仪器配备的96孔板中，附着于孔底的肿瘤细胞以电阻指数为数据每15分钟记录一次，24小时后依据预先设计的效靶比每孔铺入相应的CAR-T细胞， CAR-T细胞铺入后每隔15分钟记录一次电阻指数，通过电阻指数判断贴壁的靶细胞的增殖或者死亡情况。利用电阻指数分析结果公式为：CAR-T细胞杀伤率=基线电阻指数-实时电阻指数。
[0051] 实验结果如图5：在低效靶比1：1和1:2 24小时CAR-T杀伤结果显示 (P-3h1)-CAR-1和(P-3h1)-CAR-2有较好的杀伤效果，尤其是在1:2效靶比时杀伤24小时仅有(P-3h1)-CAR-1和(P-3h1)-CAR-2对PSCA表达细胞有杀伤效果，(P-3h1)-CAR-1和(P-3h1)-CAR-2氨基酸序列分别如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24所示。效靶比1:2和1:1 CAR-T细胞24小时杀伤百分比统计如表1和表2所示：
表1 效靶比1:2 不同PSCA-CAR-T杀伤肿瘤细胞百分比
表2 效靶比1:1 不同PSCA-CAR-T杀伤肿瘤细胞百分比
实施例6 不同scFv组合的CAR-T细胞杀伤细胞后细胞因子释放检测
细胞因子IFN-γ检测采用Elisa的方法，使用BD公司试剂盒进行。检测试剂盒货号：
555142生产批号6266958，具体步骤见试剂盒说明书。
表1 效靶比1:2 不同PSCA-CAR-T杀伤肿瘤细胞百分比
表2 效靶比1:1 不同PSCA-CAR-T杀伤肿瘤细胞百分比
实施例6 不同scFv组合的CAR-T细胞杀伤细胞后细胞因子释放检测
细胞因子IFN-γ检测采用Elisa的方法，使用BD公司试剂盒进行。检测试剂盒货号：
555142生产批号6266958，具体步骤见试剂盒说明书。
[0053] 结果如图6所示，显示效靶比为1:1CAR-T细胞杀伤靶细胞24小时后，以CD8为hinge序列如：组成的嵌合抗原受体如PSCA1-8h或者PSCA2-8h杀伤PSCA阳性肿瘤细胞时释放更高的IFN-γ(IFN-γ也可以写作IFN-g)，IFN-γ表达水平体现了CAR-T细胞的活化程度以及杀伤能力。统计结果如表3所示表3 不同PSCA-CAR-T细胞杀伤肿瘤靶细胞24小时后IFN-g分泌（单位为pg/ml）最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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