用于过继细胞治疗的方法和组合物
阅读：357发布：2020-05-12
专利汇可以提供用于过继细胞治疗的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了多重给予用于 过继细胞 治疗 的细胞的方法，和用于向已接受前施(先前)给予的对象给予细胞的方法，以及用于所述方法中的组合物和制品。所述细胞一般表达重组分子，例如重组受体，例如，嵌合 抗原 受体(CAR)和/或其它转基因受体。所述方法可涉及给予：表达第一或前施受体的一种或多种细胞，和表达第二或后施受体的一种或多种细胞，所述第二或后施受体不同于第一受体，并且表达第二或后施受体的一种或多种细胞一般不表达第一受体，和/或给予表达第二受体的细胞至已接受第一给予的对象。所述方法能提供多种不同的益处，例如在第一或前施给予之后，所述对象中针对第一或前施受体的免疫应答的情况中和/或抗原流失、下调或调节的情况中的改善的功效。，下面是用于过继细胞治疗的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种治疗方法，其包括：
(a)给予对象表达第一嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和
(b)给予所述对象表达第二CAR的细胞，其不同于所述第一CAR，并且该细胞不表达第一CAR。
2.一种治疗方法，所述方法包括向对象给予细胞，其中，所述细胞不表达第一嵌合抗原受体(CAR)但表达第二CAR，其中：
所述对象先前已接受表达第一CAR的细胞的给予；
所述第一CAR特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和所述第二CAR特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原或与所述对象中的疾病或病症相关联的不同抗原。
3.如权利要求2所述的方法，其中，在给予表达第二CAR的细胞之前，给予所述对象表达第一CAR的细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在给予表达第二CAR的细胞时或给予表达第二CAR的细胞之前即刻：
所述对象显示对第一CAR具有特异性的可检测的体液和/或细胞介导的免疫应答；
所述疾病或病症顽固地存在于所述对象中；和/或
所述疾病或病症已在所述对象中复发。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：
表达第一CAR的细胞的给予和表达第二CAR的细胞的给予之间的时间是至少约28天、至少约35天、至少约42天、至少约49天，和/或至少约60天。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述第一CAR包含所述第二CAR中不存在的至少一个免疫反应性表位。
7.如权利要求6所述的方法，其中：
所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个B细胞表位；和/或
所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个T细胞表位。
8.如权利要求1和4-7中任一项所述的方法，其中：
在(a)中的所述给予之前，所述对象未曾接受表达第一CAR的细胞的剂量；和/或在(b)中的所述给予之前，所述对象未曾接受表达第二CAR的细胞的剂量。
9.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中，所述对象在所述给予之前未曾接受表达第二CAR的细胞的剂量。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，第二CAR特异性地结合至与第一CAR相同的抗原。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是肿瘤。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。
13.如权利要求10所述的方法，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的相同表位。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中，第一CAR与第二CAR竞争结合至所述抗原。
15.如权利要求10-12和14中任一项所述的方法，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的不同表位。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于：
相较于由第一CAR结合的抗原，第二CAR特异性地结合至与所述疾病或病症相关联的另一抗原；或
第二CAR不特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中，第一CAR特异性地结合至与B细胞恶性肿瘤相关联的抗原，其选自CD19、CD22或CD20，且第二CAR结合至选自CD19、CD22或CD20的、与由第一CAR结合的抗原不同的，另一抗原。
18.如权利要求17所述的方法，其中，第一CAR特异性地结合至CD19且第二CAR特异性地结合至CD22。
19.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，表达第二CAR的细胞不包含特异性地结合至由第一CAR特异性结合的所述抗原的受体。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予的约30天内、约60天内或约90天内，所述对象不显示可检测的体液或细胞介导的针对第二CAR的免疫应答。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，第二CAR相较于第一CAR包含氨基酸序列中的一个或多个差异。
22.如权利要求21所述的方法，其中，
所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生可检测的免疫应答所针对的第一CAR的区域相比，至少一个氨基酸序列差异；和/或所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生的可检测的免疫应答所针对的第一CAR的各区域相比，至少一个氨基酸序列差异。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其还包括，在给予表达第二CAR的细胞之前，检测所述对象中CAR特异性免疫应答的存在。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述检测包括鉴定所述对象显示特异性免疫应答所针对的第一CAR的至少一个区域。
25.如权利要求24所述的方法，其中，与所述免疫应答特异性针对的第一CAR的所述区域相比，第二CAR包含一个或多个氨基酸序列差异。
26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中，第一CAR的所述区域包含选自下组的一种或多种CAR部分中的区域：scFv部分、接头部分、非所述对象内源性的氨基酸序列、源自与所述对象不同物种的序列，和/或两个CAR结构域之间的接合部分；和/或，其中第一CAR的所述区域是在位于两个结构域之间的接合部分的各一侧包含氨基酸的接合区域。
27.如权利要求26所述的方法，其中：
所述区域包含所述scFv部分内的框架区(FR)，
所述区域包含重链FR序列
所述区域包含重链CDR序列，
所述区域包含轻链FR序列，和/或
所述区域包含轻链CDR序列。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述区域包含接合区域，其中，所述接合区域包含紧邻接合第一CAR的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端的至多15个连续的氨基酸，和/或紧邻所述接合部分的N末端的至多15个连续的氨基酸，和，任选地还包含所述接合部分。
29.如权利要求28所述的方法，其中：
第一结构域和/或第二结构域包含天然或内源性人类蛋白质的结构域，或与天然或内源性人类蛋白质的结构域或其功能部分具有100％相同性的结构域，其中，所述天然或内源性人类蛋白质任选地被待治疗的对象表达；和/或
第一结构域和/或第二结构域包含胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或胞内信号转导结构域，其胞内信号转导结构域任选地是共刺激信号转导结构域或活化性胞质信号转导结构域。
30.如权利要求29所述的方法，其中，第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中，或不存在于单一天然或内源性人类蛋白质或多肽中。
31.如权利要求29或权利要求30所述的方法，其中，第一结构域和第二结构域分别是或包含，胞外配体结合结构域和铰链结构域、铰链结构域和跨膜结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号转导结构域、以及胞内共刺激信号转导结构域和活化性胞质信号转导结构域，其可包括所述结构域的功能部分。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中，第一结构域是或包含跨膜结构域或其功能部分，且第二结构域是或包含共刺激信号转导结构域或其功能部分。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其功能部分，并且，所述共刺激信号转导结构域是4-1BB信号转导结构域或其功能部分。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中，第二CAR包含：
与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和/或与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；
与第一结构域序列相同的结构域，和与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；或
与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和与第二结构域序列相同的结构域，其中，相较于包含经修饰的接合区域的部分中的第一CAR的第一结构域和第二结构域之一或两者，所述存在于第二CAR中的结构域之一或两者包含至少一个或多个氨基酸序列差异。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其特征在于：
第一CAR包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域，其一起包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:5至少95％相同的氨基酸序列的其变体或功能部分，并且还包含所述接合区域；和
第二CAR包含相较于第一CAR经修饰的序列，所述修饰在包含残基13和42之间或15和40之间的序列的部分中包含至少一个氨基酸序列差异，参考SEQ ID NO:5所示编号。
36.如权利要求21-35中任一项所述的方法，其中，第二CAR相较于第一CAR包含不多于
20个氨基酸的序列差异，或，第二CAR与第一CAR包含至少95％氨基酸序列相同性。
37.如权利要求21-36中任一项所述的方法，其中，包含所述一个或多个序列差异至少之一的第二CAR的区域：
包含较少的8-15个氨基酸部分，相较于第一CAR的对应区域，其对人白细胞抗原(HLA)分子具有小于1000nM的IC50的结合亲和性；或
对人白细胞抗原(HLA)分子具有的结合亲和性低于具有所述参比嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对于相同HLA分子具有的结合亲和性；或
具有所述区域内的至少一个肽片段的结合亲和性，或者具有所述区域中8-15个氨基酸部分的序列的全部肽片段对于人白细胞抗原(HLA)分子具有减少的平均结合亲和性，相较于第一CAR的对应区域。
38.如权利要求21-37中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予之后，所述对象中产生对于第二CAR的对应区域的减少的可检测的免疫应答，其中，相较于在给予所述对象第一CAR之后在所述对象中产生的免疫应答所针对的第一CAR的所述区域，第二CAR的对应区域包含至少一个氨基酸序列差异。
39.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中：
第一CAR包含CD28跨膜结构域或其功能部分和4-1BB共刺激信号转导结构域或其功能部分；和
第二CAR包含与第一CAR中的所述结构域之一或两者不同的跨膜结构域和共刺激信号转导结构域。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，第二CAR包含与第一CAR的对应区域氨基酸序列相同的至少一个区域。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述第一CAR的对应区域是在表达第二CAR的细胞的给予之时所述对象对其不显示可检测的体液或细胞介导的免疫应答的区域。
42.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中，所述第一CAR的对应区域包含选自下组的CAR部分中的区域：共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、转导或表达标志物、所述宿主内源性的序列，和/或源自与所述宿主相同的物种的抗体结构域。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予之后，所述对象中，表达CAR的细胞的最大数量、表达CAR的细胞随时间的曲线下面积(AUC)，和/或可检测的表达CAR的细胞的持续时间，大于，通过包含替代性的给药方案的方法所实现的情况，所述替代性的给药方案包含进行表达第一CAR的细胞的给予，随后进行表达第一CAR的细胞的第二给予，所述第二给予在与表达第二CAR的细胞的给予相同的时间点进行。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于：
所述方法导致所述对象的血液中表达CAR的细胞的最大浓度或数量为至少等于或约10个表达CAR的细胞/微升，至少50％的外周血单核细胞(PBMC)的总数，至少约1x105个表达CAR的细胞，或至少1000或至少2000或至少3000或至少4000或至少5000个拷贝的编码CAR的DNA/微克DNA；和/或
在表达第二CAR的细胞的给予的起始之后的第30天、第60天或第90天，所述对象的血液或血清中可检测到表达CAR的细胞；和/或
在表达第二CAR的细胞的给予的起始之后的第30天、第60天或第90天，所述对象的血液包含至少20％的表达CAR的细胞、至少10个表达CAR的细胞/微升或至少1x104个表达CAR的细胞。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中，所述表达第一CAR的细胞的剂量和/或所述表达第二CAR的细胞的剂量独立地包含一定量的细胞，该量足以减小所述对象中的疾病或病症的负荷。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中，表达第一CAR的细胞的给予和/或表达第二CAR的细胞的给予发挥减小所述对象中的疾病或病症的负荷的作用，由此治疗所述疾病或病症。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是T细胞。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述T细胞对于所述对象是自体的。
49.包含表达第二嵌合抗原受体(CAR)的细胞的组合物在制备治疗先前用表达第一嵌合抗原受体(CAR)的细胞治疗过的对象的疾病或病症的药物中的应用，其中：
第一CAR特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和
第二CAR特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原或与所述疾病或病症相关联的不同抗原。
50.一种组合物，其包含表达第二嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其用于治疗先前用第一嵌合受体(CAR)治疗过的对象中的疾病或病症，其中：
第一CAR特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和
第二CAR特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原或与所述疾病或病症相关联的不同抗原。
51.如权利要求49所述的应用或如权利要求50所述的组合物，其中，所述应用用于对象，所述对象：
显示对第一CAR具有特异性的可检测的体液和/或细胞介导的免疫应答；
其中，在表达第一CAR的细胞的给予之后，所述疾病或病症顽固地存在于所述对象中；
和/或
其中，在表达第一CAR的细胞的给予之后，所述疾病或病症已在所述对象中复发。
52.如权利要求49-51中任一项所述的应用或组合物，其中，所述组合物用于在表达第一CAR的细胞的给予之后至少约28天、至少约35天、至少约42天、至少约49天，和/或至少约60天。
53.如权利要求49-52中任一项所述的应用或组合物，其中，所述第一CAR包含所述第二CAR中不存在的至少一个免疫反应性表位。
54.如权利要求53所述的应用或组合物，其中：
所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个B细胞表位；和/或
所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个T细胞表位。
55.如权利要求49-54中任一项所述的应用或组合物，其中，所述对象在所述应用之前未曾接受表达第二CAR的细胞的剂量。
56.如权利要求49-55中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR特异性地结合至与第一CAR相同的抗原。
57.如权利要求49-56中任一项所述的组合物或应用，其中，所述疾病或病症是肿瘤。
58.如权利要求49-57中任一项所述的组合物或应用，其中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。
59.如权利要求56-58中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的相同表位。
60.如权利要求56-59中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR与第二CAR竞争结合至所述抗原。
61.如权利要求56-58和60中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的不同表位。
62.如权利要求49-55中任一项所述的应用或组合物，其中：
相较于由第一CAR结合的抗原，第二CAR特异性地结合至与所述疾病或病症相关联的另一抗原；或
第二CAR不特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原。
63.如权利要求58-62中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR特异性地结合至与B细胞恶性肿瘤相关联的抗原，其选自CD19、CD22或CD20，且第二CAR结合至选自CD19、CD22或CD20的、与由第一CAR结合的抗原不同的，另一抗原。
64.如权利要求63所述的应用或组合物，其中，第一CAR特异性地结合至CD19且第二CAR特异性地结合至CD22。
65.如权利要求49-55中任一项所述的应用或组合物，其中，表达第二CAR的细胞不包含特异性地结合至由第一CAR特异性结合的所述抗原的受体。
66.如权利要求49-65中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR的应用在其给予所述对象约30天内、约60天内，或约90天内，不导致可检测的体液或细胞介导的针对第二CAR的免疫应答。
67.如权利要求49-66中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR相较于第一CAR包含氨基酸序列中的一个或多个差异。
68.如权利要求67所述的应用或组合物，其中
所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生可检测的免疫应答所针对的第一CAR的区域相比，至少一个氨基酸序列差异；和/或所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生的可检测的免疫应答所针对的第一CAR的各区域相比，至少一个氨基酸序列差异。
69.如权利要求49-68中任一项所述的应用或组合物，其中，所述对象是其中已在所述对象中检测到针对第一CAR的CAR特异性免疫应答的对象。
70.如权利要求69所述的应用或组合物，其中，所述检测包括鉴定所述对象显示特异性免疫应答所针对的第一CAR的至少一个区域。
71.如权利要求70所述的应用或组合物，其中，与所述免疫应答特异性针对的第一CAR的所述区域相比，第二CAR包含一个或多个氨基酸序列差异。
72.如权利要求68-71中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR的所述区域包含选自下组的一种或多种CAR部分中的区域：scFv部分、接头部分、非所述对象内源性的氨基酸序列、源自与所述对象不同物种的序列，和/或两个CAR结构域之间的接合部分；和/或，其中第一CAR的所述区域是在位于两个结构域之间的接合部分的各一侧包含氨基酸的接合区域。
73.如权利要求72所述的应用或组合物，其中：
所述区域包含所述scFv部分内的框架区(FR)，
所述区域包含重链FR序列
所述区域包含重链CDR序列，
所述区域包含轻链FR序列，和/或
所述区域包含轻链CDR序列。
74.如权利要求72所述的应用或组合物，其中，所述区域包含接合区域，其中，所述接合区域包含紧邻接合第一CAR的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端的至多15个连续的氨基酸，和/或紧邻所述接合部分的N末端的至多15个连续的氨基酸，和，任选地还包含所述接合部分。
75.如权利要求74所述的应用或组合物，其中：
第一结构域和/或第二结构域包含天然或内源性人类蛋白质的结构域，或与天然或内源性人类蛋白质的结构域或其功能部分具有100％相同性的结构域，其中，所述天然或内源性人类蛋白质任选地被待治疗的对象表达；和/或
第一结构域和/或第二结构域包含胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或胞内信号转导结构域，其胞内信号转导结构域任选地是共刺激信号转导结构域或活化性胞质信号转导结构域。
76.如权利要求74或权利要求75所述的应用或组合物，其中，第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中，或不存在于单一天然或内源性人类蛋白质或多肽中。
77.如权利要求74-76中任一项所述的应用或组合物，其中，第一结构域和第二结构域分别是或包含，胞外配体结合结构域和铰链结构域、铰链结构域和跨膜结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号转导结构域、以及胞内共刺激信号转导结构域和活化性胞质信号转导结构域，其可包括所述结构域的功能部分。
78.如权利要求74-77中任一项所述的应用或组合物，其中，第一结构域是或包含跨膜结构域或其功能部分，且第二结构域是或包含共刺激信号转导结构域或其功能部分。
79.如权利要求78所述的应用或组合物，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其功能部分，并且，所述共刺激信号转导结构域是4-1BB信号转导结构域或其功能部分。
80.如权利要求74-79中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR包含：
与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和/或与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；
与第一结构域序列相同的结构域，和与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；或
与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和与第二结构域序列相同的结构域，其中，相较于包含经修饰的接合区域的部分中的第一CAR的第一结构域和第二结构域之一或两者，所述存在于第二CAR中的结构域之一或两者包含至少一个或多个氨基酸序列差异。
81.如权利要求78-80中任一项所述的应用或组合物，其中：
第一CAR包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域，其一起包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:5至少95％相同的氨基酸序列的其变体或功能部分，并且还包含所述接合区域；和
第二CAR包含相较于第一CAR经修饰的序列，所述修饰在包含残基13和42之间或15和40之间的序列的部分中包含至少一个氨基酸序列差异，参考SEQ ID NO:5所示编号。
82.如权利要求67-81中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR相较于第一CAR包含不多于20个氨基酸的序列差异，或，第二CAR与第一CAR包含至少95％氨基酸序列相同性。
83.如权利要求67-82中任一项所述的应用或组合物，其中，包含所述一个或多个序列差异至少之一的第二CAR的区域：
包含较少的8-15个氨基酸部分，相较于第一CAR的对应区域，其对人白细胞抗原(HLA)分子具有小于1000nM的IC50的结合亲和性；或
对人白细胞抗原(HLA)分子具有的结合亲和性低于具有所述参比嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对于相同HLA分子具有的结合亲和性；或
具有所述区域内的至少一个肽片段的结合亲和性，或者具有所述区域中8-15个氨基酸部分的序列的全部肽片段对于人白细胞抗原(HLA)分子具有减少的平均结合亲和性，相较于第一CAR的对应区域。
84.如权利要求67-83中任一项所述的应用或组合物，其中，所述第二CAR的应用发挥减小所述对象中产生的针对第二CAR的对应区域的可检测的免疫应答的作用，其中，相较于在给予所述对象第一CAR之后所述对象中产生的免疫应答产生所针对的第一CAR中的所述区域，所述第二CAR的对应区域包含至少一个氨基酸序列差异。
85.如权利要求49-70中任一项所述的应用或组合物，其中：
第一CAR包含CD28跨膜结构域或其功能部分和4-1BB共刺激信号转导结构域或其功能部分；和
第二CAR包含与第一CAR中的所述结构域之一或两者不同的跨膜结构域和共刺激信号转导结构域。
86.如权利要求49-85中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR包含与第一CAR的对应区域氨基酸序列相同的至少一个区域。
87.如权利要求86所述的应用或组合物，其中，所述第一CAR的对应区域是在表达第二CAR的细胞的给予之时所述对象对其不显示可检测的体液或细胞介导的免疫应答的区域。
88.如权利要求86或权利要求87所述的应用或组合物，其中，所述第一CAR的对应区域包含选自下组的CAR部分中的区域：共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、转导或表达标志物、所述宿主内源性的序列，和/或源自与所述宿主相同的物种的抗体结构域。
用于过继细胞治疗的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请权利要求2014年12月3日提交的，名为“用于过继细胞治疗的方法和组合物(Methods and Compositions for Adoptive Cell Therapy)”的美国临时申请号62/087,224的优先权，以引用其全文的方式将其内容纳入本文。
[0004] 本申请与电子格式的 序列表一同 提交。所提供的 序列表名称为735042001240SeqList.txt，创建于2015年12月3日，其文件大小为65,266字节。该序列表的电子格式的信息通过引用其全文纳入本文。
技术领域
[0005] 本发明涉及过继细胞治疗，其包括给予多个剂量的表达遗传工程改造的(重组)受体的细胞，例如，通过多个给予步骤和/或通过给予已接受前施(先前)给予的对象。一般而言，与某不同给予步骤相关地给予的细胞表达不同受体。所述重组受体可以包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)和/或其它转基因受体，例如转基因T细胞受体(TCR)。所述方法的特征提供多项益处，例如改善的功效，例如，归因于被治疗的对象与给予的表达靶向疾病相关联的抗原的受体的细胞的接触增加。表达与第一给予或前施给予中的细胞所表达的受体不同的受体的细胞的后施(后续)给予能改善功效。例如，这能使与所述细胞的接触被减少的风险最小化，与所述细胞的接触被减少可能归因于所述对象中的特异性抗-受体免疫应答，和/或，允许在抗原缺失和/或下调或由第一或前施受体靶向的抗原或表位的修饰的情况中的有效靶向。
背景技术
[0006] 各种方法可用于使用工程改造的表达重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)的细胞的过继细胞治疗。需要改进的方法，例如，以改善所述治疗的功效，例如，通过增加所述对象与给予的细胞的接触。需要此类方法，例如，改善给予的细胞的扩增和/或持久性，提供治疗难治或复发对象的能力，和/或减小毒性风险或其它不希望的后果的方法。提供满足此类需求的方法、组合物、和制品。
发明内容
[0007] 提供了向对象给予细胞的方法，例如过继细胞治疗，例如，在癌症和其它疾病、病症或紊乱的治疗中给予，以及用于所述方法的细胞、组合物和制品。所述细胞一般表达一种或多种重组受体，例如嵌合抗原受体(CAR)、其它抗原受体和/或其它嵌合受体。在一些实施方式中，所述方法增加所述对象与给予的细胞的接触，例如通过改善给予的细胞的扩增和/或持久性，提供治疗难治或复发对象和/或显示靶向的抗原或其表位的缺失、下调或改变(modification)的对象的能力。在一些实施方式中，相较于其它细胞治疗方法，所述方法减小毒性风险或其它不希望的后果。
[0008] 在一些实施方式中，提供了治疗方法，其通过如下方式进行：向对象给予细胞，其中所述细胞表达第二(或后施)受体，例如第二(或后施)嵌合抗原受体(CAR)或转基因TCR，其中，所述对象先前已接受表达第一(或前施)受体(例如第一(或前施)CAR或TCR)的细胞的给予或剂量。第二或后施受体一般不同于第一或前施受体。在一些实施方式中，所述方法还包括在给予表达第二或后施受体的细胞之前给予表达第一或前施受体的细胞。例如，在一些实施方式中，所述方法通过如下方式进行：(a)给予所述对象表达第一或前施受体(例如，第一或前施CAR)的细胞，和(b)给予所述对象表达第一或前施受体(例如，CAR)的细胞；和(b)给予所述对象表达第二或后施受体(例如，CAR)的细胞。
[0009] 在一些实施方式中，所述表达第二或后施受体(例如，CAR)的细胞不表达第一或前施受体(例如，CAR)。在一些实施方式中，第一(或前施)和/或第二(或后施)受体是抗原受体，例如CAR或转基因TCR。在一些此类实施方式中，第一或前施受体(例如，CAR)特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症或紊乱相关联的抗原。在一些实施方式中，第二或后施受体(例如，CAR)特异性地结合至被第一或前施受体特异性地结合的抗原。在一些实施方式中，第一或前施受体(例如，CAR)和第二或后施受体(例如，CAR)，特异性地结合至所述抗原的相同表位。在一些实施方式中，第一或前施受体与第二或后施受体竞争性地结合至所述抗原，反之亦然。在一些实施方式中，第一或前施受体和第二或后施受体特异性地结合至所述抗原的不同表位或部分。
[0010] 在一些实施方式中，第二或后施受体特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症或紊乱相关联的不同抗原。例如，在一些实施方式中，被第一受体识别或结合的抗原是CD19，并且被第二或后施受体特异性结合或识别的抗原是B-细胞特异性或B-细胞相关联的抗原(或与B细胞疾病(例如，B细胞恶性肿瘤)相关联或对其具有特异性的抗原)，其不同于CD19，例如CD22或CD20。
[0011] 在一些实施方式中，第二或后施受体(例如，CAR)不特异性地结合至被第一或前施受体(例如，CAR)特异性地结合的抗原。在一些实施方式中，表达第二或后施受体的细胞不包括特异性地结合至被第一或前施受体特异性地结合的抗原的受体。
[0012] 在一些实施方式中，表达第二或后施受体的细胞的给予之时、之前和/或之前即刻，所述对象显示对第一或前施受体具有特异性的可检测的体液和/或细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，所述对象在表达第二或后施受体的细胞的给予(例如(b)中的给予)的约30天内、约60天内或约90天内，不显示针对第二或后施受体(例如，CAR)的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。
[0013] 在一些实施方式中，在表达第二或后施受体的细胞的给予之时、之前和/或之前即刻，所述疾病或病症顽固地存在于所述对象中；和/或所述疾病或病症已在所述对象中复发。
[0014] 在一些实施方式中，在表达第二或后施受体的细胞的给予之时、之前和/或之前即刻，所述对象显示被第一或前施受体特异性地结合的抗原的下调、缺失或改变。
[0015] 在一些实施方式中，表达第一或前施受体的细胞的给予和表达第二或后施受体的细胞的给予之间的时间是至少约28天；至少约35天；至少约42天；至少约49天；或至少约60天。在一些实施方式中，所述时间是至少约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26，或27天，例如至少14天或至少21天。
[0016] 在一些实施方式中，第一或前施受体(例如，CAR)包括至少一个免疫反应性表位，该表位不存在于第二或后施受体(例如，CAR)中。在一些实施方式中，所述至少一个免疫反应性表位包括至少一个B细胞表位或被体液免疫系统识别的表位；和/或包括至少一个T细胞表位或被细胞介导的应答识别的表位，例如被细胞毒性和/或辅助性T细胞识别的表位。
[0017] 在一些实施方式中，所述对象在(a)中的给予之前未曾接受表达第一或前施受体的细胞的剂量；和/或在(b)中的给予之前或在所述方法起始之前未曾接受表达第二或后施受体的细胞的剂量。
[0018] 在一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤。在一些实施方式中，其是感染性疾病或与感染性疾病相关联。在一些实施方式中，其是自身免疫疾病或紊乱或与自身免疫疾病或紊乱相关联。
[0019] 第二或后施受体(例如，第二或后施CAR)相较于第一或前施受体(例如，第一或前施CAR)一般包括氨基酸序列中的一个或多个差异。在一些实施方式中，所述一个或多个差异包括，相较于第一或前施受体(例如，CAR)的某一区域的至少一个氨基酸序列差异，其中该区域是这样的区域：在(a)中的给予或者表达第一或前施受体(例如，CAR)的细胞的所述前施给予之后，所述对象中针对该区域产生可检测的免疫应答。在一些实施方式中，所述一个或多个差异包括，相较于第一或前施受体的各个区域的至少一个氨基酸序列差异，其中所述区域是这样的区域：在(a)中的给予或所述前施给予之后，所述对象中针对所述区域产生可检测的免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答与所述方法相关联地被检测到。
[0020] 在一些实施方式中，所述方法还包括，在给予表达第二或后施受体的细胞之前或在(b)中的给予之前，检测所述对象中的受体特异性(例如，CAR特异性)免疫应答的存在。在一些实施方式中，所述检测包括鉴定至少第一或前施受体(例如，CAR)的某一区域，所述对象针对该区域显示特异性免疫应答，例如特异性抗体或细胞介导的免疫应答。
[0021] 在一些实施方式中，相较于所述第一或前施受体(例如，CAR)的区域，第二或后施受体(例如，CAR)包含一个或多个氨基酸序列差异，其中，针对该区域，所述对象中的免疫应答，例如所述对象中的可检测的免疫应答，是特异性的。在一些此类实施方式中，第一或前施受体的所述区域是或包括两个内源性序列或结构域之间的接合部分(junction)。在一些实施方式中，其是或包括选自下组的一种或多种CAR部分内的区域：scFv部分、接头部分、非所述对象内源性的氨基酸序列、源自与所述对象不同物种的序列，和/或两个CAR结构域之间的接合部分。在一些实施方式中，其是或包括所述scFv部分内的框架区(FR)、重链FR序列、重链CDR序列、轻链FR序列，和/或轻链CDR序列。
[0022] 在一些实施方式中，所述后施或第二受体(例如，CAR)包括至少一个这样的区域，该区域与第一或前施受体(例如，CAR)的对应区域具有相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一或前施受体(例如，CAR)的对应区域是这样的区域：所述对象针对该区域不显示可检测的体液或细胞介导的免疫应答，例如，在表达第二受体的细胞的给予之前或之时。在一些实施方式中，其是或包括内源性序列。在一些实施方式中，其是或包括选自下组的CAR部分内的区域：共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、转导或表达标志物、所述宿主内源性的序列，和/或源自与所述宿主相同的物种的抗体结构域。
[0023] 在一些实施方式中，相较于其它方法，所述方法导致所述对象与细胞的接触的增加或增强。在一些实施方式中，表达第二或后施受体的细胞的给予之后，所述对象中的表达CAR的细胞的最大数量、表达CAR的细胞随时间的曲线下面积(AUC)，和/或可检测的表达CAR的细胞的持续时间高于通过采用替代性给药方案的方法实现的情况，所述采用替代性给药方案的方法涉及表达第一或前施受体的细胞的给予，例如，(a)中的给予，和表达第一或前施受体的细胞的第二或后施给予，其与本文提供的方法中表达后施或第二受体的给予(例如，如(b)中的给予)以相同时间点和/或在其它情况中以相同条件进行。
[0024] 在一些实施方式中，所述方法导致所述对象的血液中的表达受体(例如，表达CAR)的细胞的如下最大浓度或数量：每微升至少是或约10个表达受体(例如，表达CAR)的细胞，5
外周血液单核细胞(PBMC)的总数量的至少50％，至少约1x10个表达CAR的细胞，或者，每微克DNA至少1000、2000、3000、4000，或5000拷贝的CAR编码DNA。在一些实施方式中，在表达第二或后施受体的细胞的给予(例如，(b)中的给予)的起始之后的第30天、第60天或第90天，表达受体(例如，表达CAR)的细胞在所述对象的血液或血清中是可检测的；和/或所述对象的血液包含至少20％的受体表达型(例如，CAR表达型)细胞，每微升至少10个表达受体(例如，表达CAR)的细胞，或者，至少1x104个表达受体(例如，表达CAR)的细胞。
外周血液单核细胞(PBMC)的总数量的至少50％，至少约1x10个表达CAR的细胞，或者，每微克DNA至少1000、2000、3000、4000，或5000拷贝的CAR编码DNA。在一些实施方式中，在表达第二或后施受体的细胞的给予(例如，(b)中的给予)的起始之后的第30天、第60天或第90天，表达受体(例如，表达CAR)的细胞在所述对象的血液或血清中是可检测的；和/或所述对象的血液包含至少20％的受体表达型(例如，CAR表达型)细胞，每微升至少10个表达受体(例如，表达CAR)的细胞，或者，至少1x104个表达受体(例如，表达CAR)的细胞。
[0025] 在一些实施方式中，任何上述实施方式均可涉及多个后施给予。例如，在一些实施方式中，所述方法以重复的方式进行，其中包括细胞的多次给予，所述细胞各自表达另一种后施受体(例如，表达第三、第四、第五、第六等等受体的细胞的给予，其就某种程度而言各自不同于第一或前施受体)。
[0027] 图1显示示例性铬释放试验的结果，所述试验检测在给予抗-CD19的表达CAR的细胞之后，人类对象中的CAR表达型细胞特异性的溶细胞免疫应答的存在。显示在存在表达CAR(“CD19-CAR”)和非表达CAR(“模拟”)的情况下，用所述表达CAR的细胞输注前(左图)和输注后(右图)，包含源自的所述对象的外周血液单核细胞(PBMC)的混合淋巴细胞培养物的结果。“E/T”＝效应物与靶细胞之比。
[0028] 图2显示来自示例性ELISpot分析的结果，该分析确认对于代表示例性人类对象中的CAR的特定区域的某些重叠的肽的免疫应答。以“pep”标记的数字代表沿CAR序列的长度的多种的重叠的肽，其中对应区域在该图表上方指示。
[0029] 图3显示嵌合受体的示例性区域的肽结合至HLA-A2:01的预期的结合亲和性的表位亲和性的图，包括具有氨基酸序列CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF(SEQ ID NO:6)的示例性接合区域的一系列重叠8聚体-14聚体肽，其中残基1-15对应于示例性CD28跨膜结构域，而残基16-30对应于示例性4-1BB共刺激结构域。该图还描述具有氨基酸序列
CYSLLVTVAFIIFWNNVKRGRKKLLYIFKQPF(SEQ ID NO:13)的变体接合区域的一系列重叠8聚
体-14聚体肽的预期的结合亲和性，包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的插入的天冬酰胺残基。
CYSLLVTVAFIIFWNNVKRGRKKLLYIFKQPF(SEQ ID NO:13)的变体接合区域的一系列重叠8聚
体-14聚体肽的预期的结合亲和性，包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的插入的天冬酰胺残基。
[0030] 图4A和图4B描述分别对HLA I类和HLA II类等位基因的基于算法的T细胞表位预测，显示根据该群中个体HLA等位基因的频率加权的沿具有小于50nm的预期IC50的序列长度的各位置的数据集中的序列的总数。
[0031] 图5描述对于一系列变体肽的HLA I类和HLA II类等位基因的基于算法的T细胞表位预测。分数如实施例2中所述确定并加权。三角形和点虚线指示I类加权的分数。圆形和实线指示II类加权的分数。
[0032] 图6描述SEQ ID NO:5的示例性CD28-4-1BB序列的氨基酸序列。对应于CD28跨膜结构域的氨基酸由带箭头的实线指示，指示开始和终末位置；示例性4-1BB共刺激结构域的氨基酸由带箭头的短划线指示，指示开始和终末位置；示例性接合区域的氨基酸由带箭头的点虚线和短划线指示，指示开始和终末位置，并且以斜体显示。紧侧接接合位点的两个氨基酸由框指示。在一些实施方式中，靶向供于修饰的示例性氨基酸，包括K28、R31和L34，以粗体和下划线显示。4-1BB介导的TRAF-结合和信号转导中可能涉及的酸性残基区域以双下划线指示。
具体实施方式
[0033] I.用表达重组受体的细胞治疗的方法
[0034] 提供了用于细胞治疗，例如，用于治疗各种疾病和病症(例如肿瘤)的方法、组合物和制品。所述方法涉及，给予对象工程改造的细胞，所述细胞表达重组分子，通常是经设计以识别和/或特异性地结合至与所述疾病或病症相关联的分子的重组受体和/或促进具体疗效。所述结合可导致应答，例如靶向所述分子的免疫应答。重组受体可以包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)和/或其它转基因受体，例如转基因抗原受体，包括转基因T细胞受体(TCR)。
[0035] 具体地，所述方法涉及所述细胞的多个给予，或将细胞给予已接受前施(先前)给予或剂量的对象。通常，在第一或前施给予中(例如，第一或前施剂量中)给予的细胞不同于在一个或多个第二或后施给予或剂量中给予的那些。通常，细胞至少部分地在它们表达不同重组分子(例如，不同重组受体)的方面有所不同。在一些实施方式中，第二或后施给予或剂量中的细胞不表达由第一剂量或给予中的那些表达的受体。在一些实施方式中，所述细胞表达与第一给予或剂量不同的受体。因此，在一些实施方式中，所述方法涉及将第二(和/或第三、第四、第五等)剂量的细胞给予已接受第一剂量的对象，和/或，向所述对象给予第一和第二(和/或第三、第四、第五等)剂量，其中在第二剂量中给予的细胞表达与由第一剂量中给予的细胞表达的受体不同的受体。所述方法可以重复的方式进行。
[0036] 在一些方面中，所提供的实施方式是基于本文观察到的对象对所给予的表达重组受体的细胞的暴露增加(例如，随时间增加的细胞数或持续时间)可以改善过继细胞治疗中的功效和治疗结果。在多个临床试验中向患有各种CD19表达型癌症的对象给予不同的CD19-靶向的表达CAR的T细胞之后进行的初步分析显示更高和/或更长的与表达CAR的细胞的暴露程度与治疗结果之间存在相关性。
[0037] 这些结果包括患者的生存和缓解，甚至在具有严重或显著肿瘤负荷的个体中。不过，接触可被针对由给予的细胞表达的重组受体的宿主免疫应答而受到限制，其可能会过早地消除所述细胞。一旦所述宿主免疫应答发展，不论是获得的还是先天的，通过给予表达相同重组受体的细胞的后续剂量来试图增加接触或向对象提供再治疗可能是不具可行性或无效的。一旦已针对所述受体发展所述免疫应答，表达相同受体或具有相似免疫原性表位的受体的细胞的第二或后施剂量的给予可能会导致所述细胞在它们有机会扩增和/或坚持到有效或显著程度之前就被快速消除。提供了解决这些难题的实施方式。
[0038] 在一些实施方式中，通过提供表达不同于由第一或前施剂量表达的第一或前施受体的第二(和/或其它后施)受体(例如，CAR)的第二(和/或其它后施)剂量的细胞，所提供的方法解决了归因于针对第一或前施受体的宿主免疫应答的接触减少的问题。具体地，因为第二或后施剂量的细胞不表达与第一或前施剂量的细胞表达的受体相同的受体，所述对象加强对第二或后施剂量的细胞上存在的分子具有特异性的免疫应答的风险减小。
[0039] 在一些方面中，提供的实施方式基于对于免疫治疗(例如，过继细胞免疫治疗)的情况下的抗原缺失、突变、调节和/或下调的观察。例如，已在已给予CD19靶向治疗，包括抗CD19 CAR表达型T细胞，的某些对象中观察到CD19阴性疾病。在一些实施方式中，所提供的方法提供抗原下调或缺失或调节方面的益处。例如，给予表达第二或后施受体的细胞，所述第二或后施受体特异性地结合至与由第一或前施受体靶向的抗原或表位不同的抗原—其中所述对象经历或显示所述表位或抗原的缺失或调节—能允许所述疾病或病症的持续治
疗和/或改善的功效。在一些实施方式中，所述不同抗原是对某疾病或病症具有特异性或与之相关联的另一抗原，其中第一抗原也对相同的疾病具有特异性或与之相关联。在一些实施方式中，它是第一抗原的变体，例如在所述对象中表达的剪接变体或突变形式，例如，在治疗介入过程中或在治疗介入之后。因此，本文提供的某些方法和组合物的益处还包括提供对于经历抗原缺失、下调或调节(削弱了第一治疗方案有效性)的对象的持续、有效治疗的能力。
疗和/或改善的功效。在一些实施方式中，所述不同抗原是对某疾病或病症具有特异性或与之相关联的另一抗原，其中第一抗原也对相同的疾病具有特异性或与之相关联。在一些实施方式中，它是第一抗原的变体，例如在所述对象中表达的剪接变体或突变形式，例如，在治疗介入过程中或在治疗介入之后。因此，本文提供的某些方法和组合物的益处还包括提供对于经历抗原缺失、下调或调节(削弱了第一治疗方案有效性)的对象的持续、有效治疗的能力。
[0040] 在一些实施方式中，在第一或前施给予之后，例如，在第二或后施给予之时或之前即刻，所述对象显示针对第一或前施受体的免疫应答，从而进一步给予表达第一受体的细胞或具有相似免疫原性的方法可能并不有效。在一些实施方式中，在给予表达第二受体的细胞之后，所述对象不显示针对第二受体的免疫应答或具体类型或程度的免疫应答，或在某时间段内(例如给予那些细胞的约60天内)不显示所述应答。免疫应答的类型可以是可检测的免疫应答、体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，检测在第一或前施给予之后的免疫应答的存在或不存在，从而可以指示设计第二或后施受体中相较于第一或前施受体存在哪些差异。所述检测可包括鉴定所述对象对其显示特异性免疫应答的第一受体或其它情况中的前施受体(例如，CAR)的至少一个区域。此类鉴定的区域可在第二受体或在其它情况中后施受体(例如，第二给予中选择的在一个或多个区域中不同的受体)中不同。
[0041] 具体地，第二分子，例如，第二受体(例如，第二CAR)，一般与第一受体(例如第一CAR)在某些程度上，例如，在氨基酸序列和/或免疫学表位上不同。因此，第一或前施受体一般包括不存在于第二或后施受体中的至少一个免疫反应性表位，例如至少一个B细胞表位和/或至少一个T细胞表位，其可被向其给予所述细胞的对象的免疫系统识别。在具体实施方式中，相较于第一或前施受体，第二(或后施)受体(例如，CAR)包括氨基酸序列中的一个或多个差异。
[0042] 所述差异可包括，相较于第一或前施受体的区域(其中，在第一或前施给予之后，所述对象中显示对该第一或前施受体的可检测的免疫应答)的至少一个差异，例如，对应于第一或前施受体中的所述区域的第二或后施受体中的区域中的差异。包括这样的一个或多个差异的区域可包括：抗原-结合部分，例如scFv部分，包括scFv中的一个或多个框架区(FR)，或可变区部分，例如FR1、FR2、FR3，例如，VH的FR1、FR2、FR3，重链和/或轻链可变区部分、接头部分、铰链部分、两个CAR结构域之间的接合部分、转导或表达标志物，和/或非内源性的CAR中的氨基酸序列，例如，所述序列不同于宿主的内源性分子中存在的序列，例如在天然情况下在单一氨基酸序列中彼此不天然相关的两个结构域之间的接合区域，例如，嵌合受体或抗体/抗体片段中的两个内源性序列之间的接合部分。
[0043] 尽管相较于第一受体或其它情况中的前施受体，第二或其它后施受体中一般存在一个或多个差异，但所述受体还可包括具有相似性的区域，例如，具有氨基酸序列相同性的区域。在一些实施方式中，所述具有相同性的区域是所述对象在第一或前施给予之后不显示或不可能显示针对它们的免疫应答的那些。所述区域可包括共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、CDR，和/或转导或表达标志物内的区域。如果scFv和/或可变区在所述不同受体中不同，则可以是：相应的scFv或可变区源自相同物种(例如，小鼠或人)、源自不同物种，和/或其组合。
[0044] 在一些实施方式中，所注意到的差异仅仅是这样的差异或实质上或基本上仅仅是这样的差异：第一剂量或给予的细胞中的重组分子(例如，受体)相较于第二剂量或给予的差异。在一些实施方式中，除了受体中的差异和/或其它注意到的差异以外，在前施和后施给予中给予的细胞和/或细胞群是相同的或基本上或实质上相同的。在一些实施方式中，表达可检测表面水平的一个或多个标志物的细胞的比率在某一给予与后续给予中是相同或相似的。在一些实施方式中，不同剂量或给予中，细胞的群和/或亚群的百分比是相同的或实质上或基本上相同的。所述不同剂量可包含相同百分比的T细胞、CD8+和/或CD4+T细胞、具有具体谱系或活化状态或经历的T细胞，例如效应、原初和/或记忆T细胞的相对百分比，和/或其亚群，例如TCM、TEM、TSCM细胞，和/或所述细胞可源自相同对象、样品、组织和/或体液(fluid)或区室(compartment)。在一些实施方式中，用于工程改造(例如，通过用编码重组受体的载体进行转导)第一剂量的细胞的细胞的相同组合物的另一部分被用于工程改造第二给予的细胞。在一些实施方式中，在第二给予之前，保存所述组合物，例如，通过冻存保存。
[0045] 在一些实施方式中，所述剂量以具体的量和/或根据具体时机控制(timing)参数给予。在一些实施方式中，表达第二(或第三，第四，第五等)受体的细胞的第二或其它情况中的后施剂量在，例如在第一或其它前施剂量之后是或约或至少是或约28天或35天已发展针对第一或其它前施剂量中的受体的免疫应答、已有机会发展该免疫应答，和/或已检测到该免疫应答，或在其它情况中经证实存在该免疫应答的时候给予。
[0046] 后施剂量可用于复发后的再治疗，和/或用于防止靶向疾病或紊乱的复发，和/或用于解决或防止第一或前施剂量之后对于表达靶向所述疾病或病症的重组受体的细胞或感兴趣的抗原的接触减少。例如，在一些实施方式中，后施剂量在检测到所述对象或其器官或体液中的所述细胞或所述细胞的总体或相对数量的持久性或扩增下降时或之后给予。因此，在一些实施方式中，在第一或其它前施剂量和第二或其它后施剂量之间的时间度量、检测或评估这些参数中的一个或多个，并且基于所述评估的结果来制定关于给予后施剂量的时机控制或决定。例如，在所述表达受体的细胞的数量或浓度低于所需水平或已下降至低于某最大百分比或其它度量的浓度或数量时，可给予第二剂量。
[0047] 重组受体(例如，CAR)或转基因TCR，一般特异性地结合至这样的一个或多个抗原，所述一个或多个抗原由所述对象中的疾病或病症和/或其细胞或组织表达，与其相关联，和/或对其具有特异性。所述疾病可包括肿瘤、癌症、其它增殖性疾病、自身免疫疾病或紊乱，和/或感染原或疾病。在一些实施方式中，第一(或其它前施)和第二(或其它后施)受体，尽管不同，但能特异性地结合至相同的所述抗原。所述结合可以是结合至相似或相同表位。在一些实施方式中，一种受体与另一种受体竞争结合至抗原。在一些实施方式中，所述结合是针对完全不同的表位，其不与其它受体竞争和/或结合至完全不同的抗原。就此而言，在一些实施方式中，所述方法可有利于治疗这样的对象，他们的疾病或病症已变得对靶向具体表位或抗原的治疗具有抗性，例如归因于靶标下调或该疾病或病症或其细胞的突变和/或经历抗原流失。例如，在一些实施方式中，被第一受体识别或结合的抗原是CD19，并且被第二或后施受体特异性结合或识别的抗原是B-细胞特异性或B-细胞相关联的抗原(或与B
细胞疾病(例如，B细胞恶性肿瘤)相关联或对其具有特异性的抗原)，其不同于CD19，例如CD22或CD20。
细胞疾病(例如，B细胞恶性肿瘤)相关联或对其具有特异性的抗原)，其不同于CD19，例如CD22或CD20。
[0048] 因此，通过提供靶向相似但不同的疾病相关联的表位或抗原的能力，所述方法在一些实施方式中不仅增加所述对象中工程改造的细胞的总体持久性，而且通过允许所述细胞和/或治疗形式甚至在原始靶标下调或突变的情况下依然发挥作用，来改善功效。在一些实施方式中，第二受体结合至相同疾病中的相同抗原和不同抗原，和/或所述细胞包含多种受体，其各自结合至不同抗原或表位，其中一种或多种可与被第一受体识别的那些不同或相同。在一些实施方式中，第二或后施受体结合至变体，例如，不同剪接变体或被第一受体识别的抗原的经修饰的形式。
[0049] 在一些实施方式中，所述不同的受体具有这样的一个或多个结构域(例如抗原-结合结构域，例如，sFvs和/或嵌合受体的其它结构域，例如，其它CAR结构域)：所述结构域具有相同物种中的来源的序列和/或所述结构域具有不同物种中的来源的序列。例如，在一些实施方式中，所述不同受体包含源自相同物种的两种不同结合结构域，例如两种小鼠源性的scFv结构域或具有源自小鼠的框架区(FR)序列的两种scFv结构域，例如分别源自FMC63和SJ25C1的那些。在其它实施方式中，所述不同受体包含针对源自不同物种的相同或不同抗原的两种不同结合结构域，例如第一受体具有源自鼠序列的scFv或其它结合结构域，例如FMC63或SJ25C1，而另一受体具有全部或部分源自另一物种的结构域，例如人或人源化的序列，例如结合至相同抗原，例如，结合至相同或相似或不同表位，或结合至不同抗原的序列。
[0050] 在一些实施方式中，所述受体是这样的受体，该受体不是抗原受体，例如一对结合伴侣之一和/或其变体，其另一个伴侣在疾病或病症或其细胞或组织中特定地表达，和/或其表达与所述疾病或病症相关联。在一些实施方式中，所述受体是嵌合受体。在一些实施方式中，所述嵌合受体包含胞外结合部分，其与所述结合伴侣特异性地相互作用，并且包含，例如，跨膜和/或胞内信号转导结构域，其能够增强一种或多种免疫刺激性信号，例如活化性和/或共刺激结构域，例如存在于某些嵌合抗原受体中的那些。
[0051] 在一些实施方式中，所提供的方法用于对所述对象中疾病或紊乱的长期或连续的治疗或管控，其涉及工程改造的细胞的第一、第二、第三和/或多个额外的后施给予，其中所述剂量的一个或多个包括表达重组受体的细胞，所述重组受体与其它一个或多个剂量中的那些不同，但靶向所述对象中的相同疾病或病症，例如不同受体靶向相同或不同疾病特异性或疾病相关的抗原的相同或不同表位。所述长期或慢性的治疗或管控在一些实施方式中是重复的过程，其中监控所述对象的免疫原性和/或所述细胞的接触、存在、持久性、数量和/或百分比的下降，并且在检测到关于第一或前施受体或细胞的功效缺失或其风险的具体指标时或情况下引入下一个后施给予(例如，下一个后施受体)。在一些实施方式中，各后施给予在检测到功效缺失的风险的一个或多个指标后起始，例如所述对象中对于前施剂量中的细胞的减少的持久性、扩增或接触、免疫应答特异性、复发、抗性和/或下调或靶标抗原中的变化。
[0052] 采用第二嵌合受体的给药的示例性方法
[0053] 在一些实施方式中，所述方法包括给予第二嵌合受体至已对第一嵌合受体发展免疫应答和/或可能对第一嵌合受体具有免疫原性的对象。在一些实施方式中，第一嵌合受体包含免疫原性的第一和第二结构域的接合区域(junction region)。在一些实施方式中，所述免疫原性的区域包括一个或多个肽表位(也称为T细胞表位)。在一些情况中，包含跨越两个结构域的接合部分的潜在的肽表位的接合区域可以是免疫原性的，并且在将包含所述接合区域的嵌合受体给予对象之后能导致产生免疫应答。在一些实施方式中，所述接合区域可包括多个个体重叠肽片段，所述肽片段具有约8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续序列，其紧邻接合嵌合受体的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端，和/或具有约8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续序列，其紧邻所述接合部分的N末端，所述肽片段各自可包含或跨越所述两个结构域的接合部分。因此，在一些情况中，该接合区域可包含多个潜在的肽表位，其可显示针对HLA分子的结合亲和性和/或能够诱导免疫应答。
[0054] 在一些实施方式中，能鉴定嵌合受体的免疫原性的区域，例如接合区域。在一些实施方式中，所述免疫原性的区域可通过其结合至MHC分子的能力或通过其在某些条件下引发免疫应答的能力来被鉴定。在一些实施方式中，可采用算法或通过计算机的其它方法(如下所述)来评估嵌合受体的重叠肽，例如重叠8聚体-20聚体肽，例如9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体或15聚体的MHC结合。在一些实施方式中，嵌合受体可经评估以确定其是否是免疫原性的，通过评估给予了该嵌合受体的对象中的免疫应答，例如给予了用所述嵌合受体(例如CAR)遗传工程改造的细胞的对象。评估免疫应答的示例性方法如下所述。
[0055] 在一些实施方式中，所述至少一个肽表位能够结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子，例如I类或II类蛋白，其为包含多态性肽结合位点或结合槽的分子，所述结合位点或结合槽在一些情况中能与多肽(包括由细胞机制加工的肽)的肽片段复合。在一些实施方式中，所述肽表位能够结合至MHC分子，该MHC分子是人MHC分子。在一些实施方式中，所述MHC分子是人白细胞抗原(HLA)分子。在一些实施方式中，所述至少一个肽表位显示对于HLA分子(例如HLA I类分子或HLA II类分子)的结合亲和性(例如IC50)。在一些实施方式中，参比嵌合受体的接合区域包含显示小于1000nM，小于500nM或小于50nM的结合亲和性的肽表位。
[0056] 在一些实施方式中，参比嵌合受体的接合区域的至少一个或多个肽表位是MHC II类表位。在一些实施方式中，结合至MHC II类分子的肽的长度可以是8-20个氨基酸，包括10-17个氨基酸的长度。在一些实施方式中，结合至MHC II类分子的肽的长度可超过20个氨基酸。在一些实施方式中，所述肽处于沿MHC II肽-结合槽的伸长构象中。在一些实施方式中，所述MHC II肽-结合槽是两端开放的。在一些实施方式中，所述肽至少部分被与沿所述肽-结合槽的保守残基接触的主链原子原位固定。在一些实施方式中，所述MHC II类等位基因可以是已知存在于对象，例如人类对象中的任何等位基因。在一些实施方式中，所述MHC等位基因可以是但不限于，DR1、DR3、DR4、DR7、DR52、DQ1、DQ2、DQ4、DQ8和DP1。在一些实施方式中，所述MHC II类等位基因可以是示于表1B的任何基因。在一些实施方式中，所述MHC II类等位基因是HLA-DRB1*0101、HLA-DRB*0301、HLA-DRB*0701、HLA-DRB*0401、HLA-DQB1*
0201。
0201。
[0057] 在一些实施方式中，所述参比嵌合受体的接合区域的至少一个肽表位是MHC I类表位。在一些实施方式中，结合至MHC I类分子的肽的长度可以是7-15个氨基酸。在一些实施方式中，结合至MHC I类分子的肽的长度可以是8-13个氨基酸。在一些实施方式中，所述肽的结合在其两端通过该肽主链中的原子与所有MHC I类分子的肽-结合槽中的变体位点
之间的接触而稳定。在一些实施方式中，在所述槽的两端同时存在变体位点，其结合所述肽的氨基和羧基末端。在一些实施方式中，肽长度的变化可通过肽主链中的扭结(kink)进行调整适应。在一些实施方式中，所述扭结包括脯氨酸或甘氨酸残基，其可允许柔性。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因可以是已知存在于对象，例如人类对象中的任何等位基因。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因是HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A28、HLA-A31、HLA-A33、HLA-A34、HLA-B7、HLA-B45或HLA-Cw8等位基因。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因可以是示于表1A的任何基因，其包括最常见的MHC I类等位基因
(Solberg等，(2008)HumImmunol.2008年7月；69(7)：443-6)。在一些实施方式中，所述HLA I类等位基因是HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01或HLA-B*08:01。
之间的接触而稳定。在一些实施方式中，在所述槽的两端同时存在变体位点，其结合所述肽的氨基和羧基末端。在一些实施方式中，肽长度的变化可通过肽主链中的扭结(kink)进行调整适应。在一些实施方式中，所述扭结包括脯氨酸或甘氨酸残基，其可允许柔性。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因可以是已知存在于对象，例如人类对象中的任何等位基因。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因是HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A28、HLA-A31、HLA-A33、HLA-A34、HLA-B7、HLA-B45或HLA-Cw8等位基因。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因可以是示于表1A的任何基因，其包括最常见的MHC I类等位基因
(Solberg等，(2008)HumImmunol.2008年7月；69(7)：443-6)。在一些实施方式中，所述HLA I类等位基因是HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01或HLA-B*08:01。
[0058] 在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因是HLA-A2等位基因，其在一些群体中由该群体的约50％表达。在一些实施方式中，所述HLA-A2等位基因可以是HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206，或*0207基因产物。在一些情况中，不同群体之间的亚型的频率可能存在差异。例如，在一些实施方式中，HLA-A2阳性白种人群体中超过95％是HLA-A*0201，而在华人群体中，该频率据报道是约23％HLA-A*0201、45％HLA-A*0207、8％HLA-A*0206和23％HLA-A*0203。在一些实施方式中，所述MHC分子是HLA-A*0201。
[0059] 在一些实施方式中，第二嵌合受体是变体嵌合受体，其包含相较于参比嵌合受体(其可以是第一嵌合受体)的接合区域经修饰的接合区域，其中位于紧邻接合部分(其接合参比嵌合受体的第一结构域和第二结构域)的C末端的位置8-24的氨基酸(例如8-15氨基酸或8-13氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多氨基酸)的一个或多个氨基酸残基，和/或位于紧邻该接合部分的N末端的位置8-24氨基酸(例如8-15氨基酸或8-13氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的一个或多个氨基酸残基是经修饰的，例如通过插入、缺失或氨基酸替代修饰。在一些实施方式中，相较于所述参比嵌合受体中的接合区域，所述变体嵌合受体在经修饰的接合区域包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸差异或修饰。
[0060] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参比嵌合受体的第一结构域具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域，和/或包含与所述参比嵌合受体的第二结构域具有至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参比嵌合受体的第一结构域序列相同的结构域，并且包含与所述参比嵌合受体的第二结构域具有至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参比嵌合受体的第一结构域具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域，并且包含与所述参比嵌合受体的第二结构域序列相同的结构域。在一些实施方式中，相较于所述参比嵌合受体的第一结构域和/或第二结构域，在包含经修饰的接合区域的部分中，所述变体嵌合受体中存在的结构域的至少之一或两者是经修饰的。
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参比嵌合受体的第一结构域序列相同的结构域，并且包含与所述参比嵌合受体的第二结构域具有至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参比嵌合受体的第一结构域具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域，并且包含与所述参比嵌合受体的第二结构域序列相同的结构域。在一些实施方式中，相较于所述参比嵌合受体的第一结构域和/或第二结构域，在包含经修饰的接合区域的部分中，所述变体嵌合受体中存在的结构域的至少之一或两者是经修饰的。
[0061] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体与所述参比嵌合受体具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。在一些实施方式中，相较于参比嵌合受体，所述变体嵌合受体包含至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸差异或修饰(例如氨基酸插入、缺失或替代)。
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸差异或修饰(例如氨基酸插入、缺失或替代)。
[0062] 在一些实施方式中，所述参比嵌合受体的第一和/或第二结构域(例如参比CAR)是天然内源性人类蛋白质的结构域或与天然或内源性蛋白质的结构域或其功能部分具有100％相同性的结构域。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域不存在于单一天然或内源性人类蛋白质或多肽中。
[0063] 在一些实施方式中，第一和/或第二结构域是或包含胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域，或胞内信号转导结构域或其功能部分。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域是或包含共刺激信号转导结构域，例如CD28、4-1BB，或ICOS共刺激信号转导结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域是或包含活化性胞质信号转导结构域，例如是或包括T细胞受体(TCR)组分的结构域和/或包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的结构域。在一些情况中，活化性胞质结构域是或包含CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号转导部分的胞质信号转导结构域。
[0064] 在一些实施方式中，所述参比嵌合受体是CAR。在一些实施方式中，所述嵌合受体，例如CAR，包含(从其N末端至C末端的顺序)：胞外配体-结合结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域是或包括活化性信号转导结构域(例如TCR的组分和/或包含ITAM的组分，例如CD3-ζ信号转导结构域)。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域是或包括共刺激信号转导结构域(例如CD28、4-1BB或ICOS信号转导结构域)。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域仅包含共刺激信号转导结构域或活化性信号转导结构域之一，或以任意顺序同时包含这两个结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域同时包含共刺激信号转导结构域和活化性信号转导结构域。
[0065] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体可包含(从其N末端到C末端的顺序)：胞外配体-结合结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域，其任选地可包括共刺激信号转导结构域(例如CD28、4-1BB或ICOS)和/或活化性信号转导结构域(例如TCR的组分和/或包含ITAM的组分，例如CD3-ζ信号转导结构域)，各自单独地或以任何顺序作为胞内信号转导结构域的部分，其中变体嵌合受体在所述接合部分的任一侧(N末端和/或C末端)的8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续的部分内的一个或多个氨基酸残基处包含修饰。
[0066] 在一些实施方式中，参比嵌合受体的特征可以是下文第III分部中所描述的任一种。在一些实施方式中，变体嵌合受体的特征还可是如下文第III分部中描述的任一种，不同之处在于所述变体嵌合受体在所述的经修饰的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)。
[0067] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，该经修饰的接合区域在所述参比嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参比嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含胞外配体结合结构域或其部分，该第二结构域是或包含铰链结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
[0068] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参比嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参比嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含铰链结构域或其部分，而第二结构域是或包含跨膜结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
[0069] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参比嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参比嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含跨膜结构域或其部分，而第二结构域是或包含共刺激信号转导结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
[0070] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参比嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参比嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含共刺激信号转导结构域或其部分，而第二结构域是或包含活化性胞质信号转导结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
[0071] 在一些实施方式中，所述参比嵌合受体的第一结构域是或包含跨膜结构域或其部分。在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括源自下述部分的那些(即包含下述部分的至少跨膜区域)：T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154和/或包含其功能变体(例如基本保留其结构部分)的跨膜区域。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是源自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，例如，CD8α或其功能变体。在一些实施方式中，所述参比嵌合受体的第二结构域是或包含共刺激信号转导结构域，其直接连接或接合至所述跨膜结构域。在一些实施方式中，所述共刺激信号转导结构域是或包含CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS的信号转导结构域。
[0072] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参比嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参比嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含CD28跨膜结构域或其部分，而第二结构域是或包含4-1BB共刺激信号转导结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。在一些实施方式中，所述CD28跨膜结构域是或包含示于SEQ ID NO:2、103或104的氨基酸序列，或是其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:2、103或104显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的序列。在一些实施方式中，所述4-
1BB信号转导结构域是或包含示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或是其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:3显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的序列。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域一起包含或具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其功能部分或变
体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:5显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述参比嵌合受体的第一结构域和第二结构域一起具有或包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
1BB信号转导结构域是或包含示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或是其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:3显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的序列。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域一起包含或具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其功能部分或变
体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:5显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述参比嵌合受体的第一结构域和第二结构域一起具有或包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0073] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，该经修饰的接合区域与SEQ ID NO:137具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:137具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性且包括修饰。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含与SEQ ID NO:5具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:5具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％或96％的序列相同性的氨基酸序列，且包括修饰。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域包含示于SEQ ID NO:138-157中任一项的氨基酸序列，包含与SEQ ID NO:138-157中所示任一项氨基酸序列显示至少85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含与SEQ ID NO:5具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:5具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％或96％的序列相同性的氨基酸序列，且包括修饰。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域包含示于SEQ ID NO:138-157中任一项的氨基酸序列，包含与SEQ ID NO:138-157中所示任一项氨基酸序列显示至少85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
[0074] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述跨膜结构域(例如所述CD28跨膜结构域)中的疏水氨基酸残基处或位置或疏水部分中不包含修饰。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述跨膜结构域(例如所述CD28跨膜结构域)中的疏水氨基酸残基处或位置
或疏水部分中包含一个或多个修饰。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰是或包含所述疏水氨基酸被另一不同疏水氨基酸残基取代的修饰。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰不是或不包含位于所述跨膜结构域中的疏水氨基酸残基处或位置或疏水部分内的，不是被另一疏水氨基酸残基取代，的修饰。
或疏水部分中包含一个或多个修饰。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰是或包含所述疏水氨基酸被另一不同疏水氨基酸残基取代的修饰。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰不是或不包含位于所述跨膜结构域中的疏水氨基酸残基处或位置或疏水部分内的，不是被另一疏水氨基酸残基取代，的修饰。
[0075] 在一些情况中，跨膜结构域包含与膜的脂双层相互作用的一个或多个色氨酸残基。在一些情况中，所述一个或多个色氨酸残基可位于脂-水界面附近。在一些情况中，所述一个或多个色氨酸残基锚着或有助于锚着跨膜结构域至所述膜内。参见例如de Jesus和
Allen，Biochim Biophys Acta.2013年2月；1828(2)：864-76。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述跨膜结构域(例如所述CD28跨膜结构域)中的色氨酸之一或两者处不包含
修饰。在一些实施方式中，所述嵌合受体在参考SEQ ID NO:5编号的对应于位置2和/或位置
26处的氨基酸位置(其各自对应于所述参比嵌合受体中的色氨酸)不包含修饰。
Allen，Biochim Biophys Acta.2013年2月；1828(2)：864-76。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述跨膜结构域(例如所述CD28跨膜结构域)中的色氨酸之一或两者处不包含
修饰。在一些实施方式中，所述嵌合受体在参考SEQ ID NO:5编号的对应于位置2和/或位置
26处的氨基酸位置(其各自对应于所述参比嵌合受体中的色氨酸)不包含修饰。
[0076] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体中的对应于参比嵌合受体的跨膜结构域的结构域具有实质上疏水的亲水性(hydropathy)分布和/或具有大于1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2或更大的总平均亲水性(GRAVY)值。
[0077] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述共刺激信号转导结构域的信号转导相关或必需的氨基酸残基处或位置，例如，在4-1BB信号转导相关或必需的氨基酸残基处或位置，不包含修饰。一般而言，共刺激信号转导涉及与TRAF分子的相互作用。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在与用于结合至TRAF分子的结合基序相互作用或是该结合基序的部分的氨基酸残基处或位置不包含修饰。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在包含基序(P/S/A/T)X(Q/E)E的参比嵌合受体的共刺激信号转导结构域中的氨基酸残基处或位置不包含修饰。在一些实施方式中，所述TRAF分子是TRAF 1、TRAF2和/或TRAF3。在一些实施方式中，与参比嵌合受体的共刺激信号转导结构域相对应的变体嵌合受体中的结构域能够诱导TRAF的活化或细胞定位和/或能够诱导TRAF介导的信号转导。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在对应于49-52的位置处包含氨基酸TTQE和/或在对应于残基60-63的位置处包含氨基酸PEEE，其各自参考SEQ ID NO:5所示编号。
[0078] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在残基13和42之间或氨基酸残基15和40之间的部分内包含一个或多个氨基酸修饰，参考SEQ ID NO:5所示编号。
[0079] 在一些实施方式中，所述修饰是或包括一个或多个氨基酸残基的插入。在一些实施方式中，所述一个或多个插入位于毗邻所述结构域之间的接合部分的氨基酸残基之间。在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸插入位于氨基酸残基27和28之间，参考SEQ ID NO:5所示编号。在一些实施方式中，所述一个或多个插入可包括至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的插入。在一些实施方式中，所述插入具有1、2、3、4，或5个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述插入是针对任何氨基酸残基的插入。在一些实施方式中，所述插入是天冬酰胺(N)的插入。
10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的插入。在一些实施方式中，所述插入具有1、2、3、4，或5个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述插入是针对任何氨基酸残基的插入。在一些实施方式中，所述插入是天冬酰胺(N)的插入。
[0080] 在一些实施方式中，所述修饰是或包括对应于残基28、31或34的残基处的一个或多个氨基酸替代，参考SEQ ID NO:5所示编号。在一些实施方式中，所述氨基酸替代可以是针对任何其它氨基酸的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸替代是针对如下氨基酸残基的替代：亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或组氨酸(H)。在一些实施方式中，所述氨基酸替代是或对应于如下一个或多个：K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R31A、R31H、R31L、R31N、L34A和L34S，参考SEQ ID NO:5所示编号。
[0081] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，其相较于参比嵌合受体的接合区域具有两个或更多个，例如多至2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸修饰。在一些实施方式中，所述氨基酸替代是或对应于选自下组的氨基酸替代：K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S。
[0082] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域具有示于SEQ ID NO:138-157中任一项的氨基酸序列，包含与SEQ ID NO:138-157中所示任一项氨基酸序列显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
[0083] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含SEQ ID NO:114-134中任一项所示的氨基酸，包含与SEQ ID NO:114-134中所示任一项氨基酸序列显示至少85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
[0084] 在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，从而所述区域的肽片段显示对于人白细胞抗原(HLA)的较低结合亲和性和/或所述区域显示减少的免疫原性，包括在给予对象之后。
[0085] 在一些实施方式中，具有经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段具有对人白细胞抗原(HLA)分子具有的结合亲和性低于具有参比嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对于相同HLA分子的结合亲和性。在一些实施方式中，所述参比嵌合受体的接合区域的对应部分的肽片段具有小于1000nM、小于500nM或小于50nM的结合亲和性。
[0086] 在一些实施方式中，经修饰的接合区域中的全部8-15个氨基酸片段，或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段，对于人HLA分子的平均结合亲和性，低于参比嵌合受体的接合区域内的全部8-15个氨基酸片段或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段的平均结合亲和性。在一些实施方式中，所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过2倍、超过5倍、超过10倍、超过25倍、超过50倍或超过100倍。
[0087] 在一些实施方式中，对人白细胞抗原(HLA)具有小于1000nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，相较于具有对相同HLA具有相同接合亲和性的参比嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，是减少的。在一些实施方式中，对人白细胞抗原(HLA)具有小于500nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，相较于具有对相同HLA具有相同接合亲和性的参比嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，是减少的。在一些实施方式中，对人白细胞抗原(HLA)具有小于50nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，相较于具有对相同HLA具有相同接合亲和性的参比嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，是减少
的。
的。
[0088] 在一些实施方式中，所述结合亲和性可通过实验或通过算法确定。在一些实施方式中，对于MHC的肽结合亲和性可通过计算，例如通过采用基于定量结合亲和性模型(Lafuente和Reche(2009)Current Pharmaceutical Design,15:3209-3220)的算法来确
定。在一些实施方式中，所述结合亲和性可在体外试验中确定。
定。在一些实施方式中，所述结合亲和性可在体外试验中确定。
[0089] 在一些实施方式中，确定肽对MHC分子的结合亲和性涉及放射性或荧光竞争结合试验。参见，例如Ettinger等，J.Immunol.160:2365(1998)。在一些实施方式中，所述竞争试验产生不同肽的结合亲和性的比较。一些MHC结合研究采用来自EBV转化的细胞系的去污剂稳定的I类分子(参见，例如Sette,A.等，MolImmunol,31(11):813-22(1994)。在一些实施方式中，所述竞争性试验涉及天然加载的MHC，并且感兴趣的MHC分子可从去污剂裂解物中的其它MHC分子纯化出来或可用于与其它MHC分子混合。在一些实施方式中，可鉴定带放射性标记的肽，其具有对于在研MHC分子的高亲和性。在一些实施方式中，随后通过额外的“测试”肽与该高亲和性的带放射性标记的肽竞争的能力来确定它们对于在研MHC分子的亲和性。
[0090] 在一些实施方式中，确定肽亲和性可涉及重建试验，例如采用“T2”细胞，其中表达合适MHC等位基因的细胞通过在pH 2-3孵育一段较短时间被“剥离”原始结合肽。在一些实施方式中，为了确定推定的MHC-结合肽对于相同MHC等位基因的结合亲和性，剥离的MHC单体可与推定的MHC-结合肽、β2-微球蛋白和构象依赖性单克隆抗体在溶液中合并。在一些实施方式中，用或不用的标记(例如，直接用带标记的单克隆抗体标记或用荧光标记的二抗标记)后的测试结合肽孵育的细胞之间测定的荧光强度差异可用于确定测试肽的结合。
[0091] 在一些实施方式中，对于MHC(例如HLA)分子的结合亲和性用IC50代表，其为结合试验中的肽浓度，在该浓度下观察到参比肽的结合的50％抑制。在一些情况中，此类试验可在其中IC50值约为KD值(即，限制HLA蛋白和带标记的肽浓度)的条件下进行。在一些实施方式中，结合可相对于参比肽表示。
[0092] 在一些实施方式中，结合亲和性可采用计算机模拟方法预测。采用算法或通过计算机的其它方法的用于预测对于MHC结合的结合亲和性的示例性计算机模拟方法是本领域中已知的，参见例如，Marsh等，《HLA资料手册》(The HLA Factsbook)(学术出版社(Academic Press)，2000)。在一些实施方式中，算法可用于预测感兴趣的肽是否应该结合至给定的MHC分子。参见例如，Southwood等，J.Immunol.160:3363(1998)；Honeyman等，Nat.Biotechnol.16:966-969(1998)；Breisie等，Bioinformatics 14:121-131(1998)，以及“SYFPEITHI”算法(Hans-Georg Rammensee等，Immunogenetics(1999)50:213-219)，Zhang等，PLoS ONE7(2):e30483.doi:10.1371/journal.pone.0030483，免疫表位和分析资源(IEDB)(Peters B等，PLoS Biology 3:379(2005))，和“BIMAS”算法(Parker,K.C.，M.A.Bednarek和J.E.Coligan.J.Immunol.152:163(1994)。
[0093] 在一些实施方式中，算法预测工具，包括可获自IEDB的那些，采用利用ANN的一种或多种预测法(Nielsen等.(2003)Protein Sci.,12:1007-1017和Lundegaard等.(2008)NAR,36:W509-512)，SMM(Peters和Sette(2005)BMC Bioinformatics,6:132)和comblib
(Sidney等.(2008)Immunome Res.4:2)，或Consensus工具(参见Kim等(2012)，免疫表位数据库分析资源，NAR，联合任何前述的预测法)。
(Sidney等.(2008)Immunome Res.4:2)，或Consensus工具(参见Kim等(2012)，免疫表位数据库分析资源，NAR，联合任何前述的预测法)。
[0094] 在一些实施方式中，抗原处理的预测可采用变幻虫切割的算法(PaProC)来完成。参见Kuttler等，J.Mol.Biol.298(2000),417-429和Nussbaum等，Immunogenetics 53
(2001),87-94。
(2001),87-94。
[0095] 在一些实施方式中，相较于参比嵌合受体，其可以是第一嵌合受体，所述变体嵌合受体，其可以是第二嵌合受体，显示可检测的免疫应答的减小。在一些实施方式中，所述免疫应答是体液免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答是细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答减少大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍或更多。在一些实施方式中，所述免疫应答是体外评估的。在一些实施方式中，所述免疫应答是在给予嵌合受体至对象之后，例如给予表达嵌合受体的细胞之后体内评估的。在一些实施方式中，如下所述评估对于嵌合受体的宿主免疫应答。
[0096] II.过继细胞治疗中给予细胞。
[0097] 本文提供的方法一般涉及将表达重组分子例如重组受体(例如CAR)、其它嵌合受体或其它抗原受体(例如转基因TCR)的细胞的多个剂量给予具有疾病或病症的对象，所述疾病或病症例如，其组分被所述重组分子(例如受体)特异性地识别和/或治疗的疾病或病症。给予一般实现疾病或病症的一种或多种症状中的改善和/或治疗或预防疾病或病症或其症状。
[0098] 本文中所用的“对象”是哺乳动物，例如人或其它动物，并且通常是人。在一些实施方式中，所述对象在一个或多个所述给予或剂量之前已用靶向所述疾病或病症的治疗剂治疗。在一些方面中，对象对于其他治疗剂是或变得难治性的或非响应性的。在一些实施方式中，所述对象尚未变成难治或非响应性，但预防性地进行表达第二或后施受体的细胞的给予，例如，以防止所述对象变得难治或对治疗具有抗性。
[0099] 在一些实施方式中，所述对象在一个或多个所述给予进行时或之前即刻已具有迁延性疾病或复发疾病。例如，疾病可能已在采用另一治疗介入法(包括化疗、辐照，和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT)治疗之后复发或变得对所述治疗呈难治性。所述疾病或病症可能在第二给予之前或在第二给予之时已复发或变得对第一给予或剂量的细胞呈难治性。在一些实施方式中，所述给予有效治疗所述对象，不论所述对象已变得对另一治疗具有抗性，例如不是过继细胞治疗的其它治疗，或过继细胞治疗，例如表达不同受体的细胞的第一给予。
[0100] 在一些实施方式中，对象对其他治疗剂或细胞给予有响应性并且用所述治疗剂或给予治疗降低了疾病负荷。在一些方面中，所述对象初始响应所述治疗剂或给予，但随时间显示疾病或病症的复发，例如，在细胞治疗或第二剂量的给予时或给予进行时。在一些实施方式中，对象还没有复发。在一些这类实施方式中，所述对象经测定具有复发风险，例如处于复发高风险中，并且由此预防性地给予细胞，例如，以减小复发可能性或预防复发。
[0101] 在一些实施方式中，对象还没有接受用另一种治疗剂的在先治疗。在一些实施方式中，对象在给予第一剂量之前没有接受表达受体(例如CAR)的细胞的剂量和/或没有接受表达CAR或由该细胞表达的其他受体或表达靶向相同分子或抗原的任何重组受体的细胞的剂量。在一些实施方式中，在给予第一剂量之前，对象没有接受第一剂量的表达受体的细胞的剂量。在其它实施方式中，给予第一和/或第二给予的细胞的多个剂量。
[0102] 所述疾病、病症和紊乱包括肿瘤，包括实体肿瘤、血液恶性肿瘤，和黑素瘤，并包括局部和转移性肿瘤，感染性疾病，例如病毒或其它病原体，例如，HIV，HCV，HBV，CMV、HPV的感染，和寄生性疾病，以及自身免疫和炎性疾病。在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤，癌症，恶性肿瘤，赘生物，或其它增殖性疾病或病症。所述疾病包括但不限于：白血病、淋巴瘤、例如、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、ALL、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治滤泡性淋巴瘤淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、包括黑素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、尤文肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤，和/或间皮瘤。
[0103] 在一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤，并且所述对象在给予第一剂量之前有大肿瘤负荷，如大实体瘤或大量或大体积的疾病相关的，例如，肿瘤细胞。在一些方面中，对象具有大量的转移癌和/或广泛的转移癌定位。在一些方面中，对象中的肿瘤负荷低并且对象有较少的转移癌。在一些实施方式中，剂量的大小或时间由对象中的初始疾病负荷决定。例如，然而在一些方面中，所述对象可在第一剂量中给予相对低数量的细胞，在较低疾病负荷的情况中，所述剂量可以更高。
[0104] 在一些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于，病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方式中，所述疾病或病症是自体免疫或炎性疾病或病症，例如关节炎，例如类风湿性关节炎(RA)，I型糖尿病，系统性红斑狼疮(SLE)，炎性肠病，牛皮癣，硬皮病，自身免疫性甲状腺疾病，格雷夫斯病，克罗恩病多发性硬化，哮喘和/与移植相关的疾病或病症。
[0105] 在一些实施方式中，与所述疾病或紊乱相关的抗原选择自下组：孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和肝炎B表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2，和MAGE A3、CE7、维尔姆斯瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A1(CCNA1)和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其它病原体表达的分子。
[0106] 本文中所用的术语“治疗”(及其语法变化形式例如“治疗的”和“治疗性”)指完全或部分减轻或减少疾病或病症或紊乱或与其相关的症状、不利作用或结果或表型。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，和减轻或改善预后。该术语不一定表示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果具有效果。
[0107] 本文中所用的“延迟疾病的发展"表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、遏制和/或拖延所述疾病(例如癌症)的发展。该延迟可具有不同的时间长度，这取决于疾病史和/或待治疗的个体。本领域技术人员应明了，实际上，充分或显著的延迟可涵盖预防(对于未发展所述疾病的个体而言)。例如，晚期癌症，例如转移的发展，可被延迟。
[0108] 本文中所用的“预防”包括对于疾病在倾向于发展疾病但尚未被诊断患病的对象中的发生或复发提供预防方法。在一些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
[0109] 本文中所用的“遏制”功能或活性意指，在与其它情况下的相同(除感兴趣病症或参数)病症相比时或者相较于另一病症，功能或活性的减少。例如，与没有细胞下的肿瘤生长速率相比，遏制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
[0110] 试剂，例如，药物制剂、细胞或组合物，在给予情况下的“有效量”，指某一个量，其在一定剂量/量下且作用必要的时间长度时，有效于实现所需结果，例如治疗或预防结果。
[0111] 试剂，例如，药物制剂或细胞的“治疗有效量”，指某一个量，其在剂量上和必需时程上，有效于实现所需治疗结果，例如疾病、病症或紊乱的治疗，和/或该治疗的药物动力学或药代动力学效果。治疗有效量可根据多种因素变化，例如，疾病状态、年龄、性别，和对象体重，以及给予的细胞群。在一些实施方式中，所提供的方法涉及给予有效量(例如，治疗有效量)的所述细胞和/或组合物。
[0112] “预防有效量”指，某一个量，其对于一定剂量和必要时程而言，有效于实现所需预防结果。通常而言(但不一定)，由于预防剂量在疾病的早期或之前用于对象，预防有效量将小于治疗有效量。在较低肿瘤负荷的情况中，在一些方面中，预防有效量将高于治疗有效量。
[0113] 用于给予用于过继细胞治疗的细胞的方法是已知的，并可与本文提供的方法和组合物联用。例如，过继T细胞治疗方法描述于，例如，Gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin
Oncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等.(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；
Tsukahara等.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等.(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
Oncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等.(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；
Tsukahara等.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等.(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
[0114] 在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继T细胞治疗，通过如下方式进行：自体转移，其中，所述细胞经分离和/或在其它情况中从接受所述细胞治疗的对象或从源自此类对象的样品制备。因此，在一些方面中，所述细胞源自需要治疗和所述细胞的对象(例如，患者)，其在分离和处理之后给予同一对象。
[0115] 在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继T细胞治疗，通过如下方式进行：同种异体转移，其中，所述细胞分离和/或在其它情况中从对象制备，该对象与待接受或最终接受所述细胞治疗的对象(例如，第一对象)不同。在此类实施方式中，然后将所述细胞给予相同物种的不同对象，例如，第二对象。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相同或相似的。在一些实施方式中，所述第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超类型。
[0116] 所述细胞可通过任何合适的方式给予，例如，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼底注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、反间隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、巩膜上腔注射、球后注射、眼周注射或球周递送。在一些实施方式中，它们通过胃肠外、肺内的和鼻内，以及如果希望局部治疗，病灶内给予。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸内、颅内或皮下给予。在一些实施方式中，通过单次推注给予细胞来给予给定剂量。在一些实施方式中，通过多次推注给予细胞，例如，在不超过3天的时间上，或通过连续输注给予细胞来给予。
[0117] 对于预防或治疗疾病，合适剂量可取决于待治疗的疾病类型，重组受体或细胞类型，疾病的严重程度和疾病病程、该细胞是否给予用于预防性或治疗性目的、先前治疗、对象的临床史和对所述细胞的响应，以及主治医师的判断。在一些实施方式中，所述组合物和细胞适合在一个时间点或以一系列治疗来给予对象。
[0118] 在一些实施方式中，所述细胞作为联合治疗的部分给予，例如，与另一治疗性介入，例如抗体或经工程改造的细胞或受体或其它试剂，例如细胞毒性或治疗剂，同时或依次地，以任何顺序给予。因此，在一些实施方式中，细胞与一种或多种其它治疗剂共同给予，或与另一治疗介入联合，同时或以任何顺序依次进行。在一些情况中，所述细胞与另一治疗在足够接近的时间共同给予，从而所述细胞群增强一种或多种其它治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，所述细胞在一种或多种其它治疗剂之前给予。在一些实施方式中，所述细胞在一种或多种其它治疗剂之后给予。在一些实施方式中，一种或多种其他试剂包括细胞因子，如IL-2或其它细胞因子，例如，以增强持久性。
[0119] 在一些实施方式中，该方法包括在剂量给予之前给予化疗剂，例如，调节化疗剂，例如，以降低肿瘤负荷。
[0120] 一旦向对象(例如，人)给予细胞，在一些方面中，通过多种已知方法中的任一种来测量工程改造的细胞群的生物活性。用以评估的参数包括：工程改造的或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，Kochenderfer等，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，也可通过测定某些细胞因子，例如CD 107a，IFNγ，IL-2和TNF的表达和/或分泌，来测量细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减少，来检测。在一些方面，评估细胞的毒性后果、持久性和/或增殖，和/或存在或不存在宿主免疫应答。
[0121] 在某些实施方式中，工程改造的细胞以任何数量的方式修饰，从而增加其治疗或预防性功效。例如，通过所述群表达的工程改造的CAR或TCR可通过接头直接或间接连接靶向部分。连接化合物，例如，将CAR或TCR连接至靶向部分的实践是本领域已知的。参见例如，Wadwa等,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)，和美国专利5,087,616。
[0122] III.由细胞表达的重组受体
[0123] 所述细胞一般表达重组受体。由不同剂量的细胞表达的受体通常，至少部分，彼此不同。所述受体可包括抗原受体，例如功能性非TCR抗原受体，包括嵌合抗原受体(CAR)和其它抗原结合受体如转基因T细胞受体(TCR)。所述受体还可包括其它嵌合受体，例如结合至具体配体的受体和具有与CAR中存在的那些相似的跨膜和/或胞内信号转导结构域的受体。
[0124] 示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，包括例如，在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,
592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,
446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所述的那些，和/或Sadelain等，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4):
e61338；Turtle等，Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等，Cancer,2012年
3月18(2):160-75中所述的那些。在一些方面中，所述抗原受体包括美国专利号7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的示例包括前述公开文本中所述的任何情况，例如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/
0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282、Kochenderfer等,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等.(2012)J.Immunother.35(9):
689-701和Brentjens等,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见国际专利申请号
WO2014031687、美国专利号8,339,645、7,446,179、7,446,190和8,389,282，和美国申请公开号US 2013/0149337。所述嵌合受体包括嵌合抗原受体(CAR)。嵌合受体，例如CAR通常包括细胞外抗原结合结构域，例如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。
592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,
446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所述的那些，和/或Sadelain等，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4):
e61338；Turtle等，Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等，Cancer,2012年
3月18(2):160-75中所述的那些。在一些方面中，所述抗原受体包括美国专利号7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的示例包括前述公开文本中所述的任何情况，例如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/
0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282、Kochenderfer等,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等.(2012)J.Immunother.35(9):
689-701和Brentjens等,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见国际专利申请号
WO2014031687、美国专利号8,339,645、7,446,179、7,446,190和8,389,282，和美国申请公开号US 2013/0149337。所述嵌合受体包括嵌合抗原受体(CAR)。嵌合受体，例如CAR通常包括细胞外抗原结合结构域，例如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。
[0125] 在一些实施方式中，一种或多种结合结构域，例如，所述抗体，例如，抗体片段、重组受体的部分，还包括免疫球蛋白恒定区的至少部分，例如铰链区，例如，IgG4铰链区，和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方式中，所述恒定区或部分是人IgG的，例如IgG4或IgG1的。在一些方面中，恒定区的部分作为抗原-识别部分，例如，scFv，和跨膜结构域之间的间隔物区域。所述间隔物可具有这样的长度，相较于该间隔物不存在的情况，该长度在抗原结合之后提供增加细胞响应性。示例性间隔物，例如，铰链区，包括描述于国际专利申请公开号WO2014031687中的那些。在一些实例中，间隔物长度为或约为12个氨基酸或长度不超过12个氨基酸。示例性的间隔物包括具有如下长度的那些：至少约10-229个氨基酸、约10-200个氨基酸、约10-175个氨基酸、约10-150个氨基酸、约10-125个氨基酸、约10-100个氨基酸、约10-75个氨基酸、约10-50个氨基酸、约10-40个氨基酸、约10-30个氨基酸、约10-20个氨基酸或约10-15个氨基酸，并且包括上述所列范围的任何端点之间的整数。在一些实施方式中，间隔物区具有约12个氨基酸或更短，约119个氨基酸或更短或约229个氨基酸或更短。示例性间隔物包括单独IgG4铰链，连接至CH2和CH3结构域的IgG4铰链或连接至CH3结构域的IgG4铰链。示例性的间隔物包括但不限于，描述于如下文献的那些：Hudecek等.(2013)
Clin.Cancer Res.,19:3153,国际专利申请公开号WO2014031687，美国专利号8,822,647或公开申请号US2014/0271635。
Clin.Cancer Res.,19:3153,国际专利申请公开号WO2014031687，美国专利号8,822,647或公开申请号US2014/0271635。
[0126] 在一些实施方式中，所述恒定区或部分是人IgG的，例如IgG4或IgG1的。在一些实施方式中，所述间隔物具有序列ESKYGPPCPPCP(示于SEQ ID NO:1)，并且由示于SEQ ID NO:158的序列编码。在一些实施方式中，所述间隔物具有示于SEQ ID NO:107的序列。在一些实施方式中，所述间隔物具有示于SEQ ID NO:108的序列。在一些实施方式中，所述恒定区或部分是IgD的。在一些实施方式中，所述间隔物具有示于SEQ ID NO:109的序列。在一些实施方式中，所述间隔物具有与SEQ ID NO:1、107、108或109显示至少85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
[0127] 该抗原识别结构域一般连接至一个或多个胞内信号转导组分，例如，通过抗原受体复合物(例如TCR复合物)模拟活化的信号转导组分，和/或通过另一细胞表面受体的信号。在一些实施方式中，该信号可以是免疫刺激性的和/或共刺激的。在一些实施方式中，其可以是抑制性的，例如，免疫抑制性的。因此，在一些实施方式中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号转导结构域连接。在一些实施方式中，所述跨膜结构域融合至所述胞外结构域。在一个实施方式中，使用天然关联受体(例如CAR)中的结构域之一的跨膜结构域。在一些情况中，所述跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免所述结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
[0128] 在一些实施方式中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，在一些方面中，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154，和/或跨膜区包含其功能变体(例如基本保留其结构部分(例如，跨膜结构部分)、性质的那些)的那些(即，包含至少它们的跨膜区域)。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是源自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，例如，CD8α或其功能变体。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面中，所述合成跨膜结构域主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三聚体将出现在合成的跨膜结构域的各末端。在一些实施方式中，所述连接通过接头、间隔物和/或跨膜结构域发生。
[0129] 所述胞内信号转导结构域包括模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体联合共刺激受体的信号，和/或通过单独共刺激受体的信号的那些。在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽接头，例如，长度为2-10个氨基酸的接头，例如包含甘氨酸和丝氨酸，例如，甘氨酸-丝氨酸双联体的接头，并在CAR的胞质信号转导结构域和跨膜结构域之间形成连接。
[0130] 所述受体(例如，CAR)，一般包括至少一种的一个或多个胞内信号转导部分。在一些实施方式中，所述受体包括TCR复合物的胞内组分，例如介导T-细胞活化和细胞毒性的TCR CD3+链，例如，CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接到一个或多个细胞信号转导模块。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号转导结构域，和/或其它CD跨膜结构域。在一些实施方式中，所述受体，例如，CAR，还包括一种或多种其它分子的部分，例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面中，CAR或其它嵌合受体包括CD3ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
[0131] 在一些实施方式中，在CAR或其它嵌合受体结合时，受体的细胞质结构域或细胞内信号转导结构域激活免疫细胞的正常效应功能或应答中的至少一种，例如经工程改造以表达CAR的T细胞。例如，在一些情况中，CAR诱导T细胞的功能，例如溶细胞活性或辅助性T细胞活性，例如细胞因子或其它因子的分泌。在一些实施方式中，采用抗原受体部分或共刺激分子的胞内信号转导结构域的截短部分来替代完整免疫刺激链，例如，如果其转导效应物功能信号的话。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面，还包括天然情况下存在的共受体的那些与这些受体一致作用以在抗原受体接合后启动信号转导。
[0132] 在天然TCR的情况中，完全活化一般不仅需要通过TCR的信号转导，而且需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，用于产生第二或共刺激信号的组分也包括在所述CAR中。在其他实施方式中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面中，其他CAR在同一细胞中表达并且提供用于生成第二或共刺激信号的组分。
[0133] 在一些方面中，T细胞活化描述为通过两类胞质信号转导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性第一活化的那些(第一胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号转导序列)。在一些方面中，所述CAR包括此类信号转导组分之一或两者。
[0134] 在一些方面中，所述CAR包括源自在天然情况中促进TCR复合物的主要活化的信号转导分子或结构域的主要胞质信号转导序列。以刺激方式作用的第一胞质信号转导序列可包含信号转导基序，其已知是免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM。ITAM的实例包括第一胞质信号转导序列，其包括源自如下的那些：CD3ζ链、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b，和CD66d。在一些实施方式中，CAR中的胞质信号转导分子包含胞质信号转导结构域，其部分或源自CD3ζ的序列。
[0135] 在一些实施方式中，所述CAR包括共刺激受体的跨膜部分和/或信号转导结构域，例如CD28、4-1BB、OX40、DAP10，和ICOS。在一些方面中，同一CAR同时包括活化和共刺激部分。
[0136] 在一些实施方式中，激活结构域包括在一个CAR内，而共刺激组分由存在于相同细胞上的识别另一种抗原的另一CAR提供。在一些实施方式中，所述CAR包括活化或刺激CAR、共刺激CAR，其均表达在同一细胞上(参见WO2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或活化CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方式中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，例如识别除了与疾病或病症相关和/或特异性的CAR，由此通过所述疾病靶向CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其配体结合而减少或抑制，例如减少脱靶效应。
[0137] 在一些实施方式中，所述重组受体的胞内信号转导部分，例如CAR，包含CD3ζ胞内结构域和共刺激信号转导区。在某些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含CD28跨膜和信号转导结构域，其连接至CD3(例如，CD3-ζ)胞内结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域，其连接至CD3ζ胞内结构域。
[0138] 在一些实施方式中，所述CAR涵盖一个或多个，例如，两个或更多个，共刺激结构域和活化结构域，例如，胞质部分中的初始活化结构域。示例性的CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的胞内部分。
[0139] 在一些实施方式中，所述CAR或其它抗原受体还包括标志物，例如细胞表面标志物，其可用于确定所述细胞用于表达所述受体的转导或工程改造，例如细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，标记物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如tEGFR)的全部或部分(例如截短形式)。在一些实施方式中，编码所述标志物的核酸经操作性地连接至编码接头序列(例如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸。例如，标志物，和任选地，接头序列，可以是公开的专利申请号WO2014031687中描述的任意种。例如，所述标志物可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，例如T2A可切割接头序列。
用于截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含示于SEQ ID NO:111的氨基酸序列，或与
SEQ ID NO:111显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO:110有至少85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列。
用于截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含示于SEQ ID NO:111的氨基酸序列，或与
SEQ ID NO:111显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO:110有至少85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列。
[0140] 在一些实施方式中，所述标志物是分子，例如，细胞表面蛋白质，其非天然见于T细胞上的或非天然见于T细胞表面或其部分。
[0141] 在一些实施方式中，所述分子是非自体分子，例如，非自体蛋白质，即，不被待向其过继转移所述细胞的宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质。
[0142] 在一些实施方式中，所述标志物无治疗性功能和/或除了用作遗传工程改造的标志物(例如，用于选择成功地工程改造的细胞)之外没有任何作用。在其它实施方式中，所述标志物可以是治疗性分子或在其它情况中发挥一些所需效果的分子，例如用于待在体内遇到的细胞的配体，例如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或抑制所述细胞在过继转移和遇到配体之后的响应。
[0143] 在一些情况中，CAR被称为第一、第二和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这样的信号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(例如CD28或CD137)的细胞内信号转导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
[0144] 在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括包含抗原-结合结构域，例如抗体或抗原-结合抗体片段，例如scFv或Fv，的胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的胞外部分和细胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，所述抗体或片段包括scFv，且所述胞内结构域包含ITAM。在一些方面中，所述胞内信号转导结构域包括CD3-ζ链的ζ链的信号转导结构域。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括跨膜结构域，其连接胞外结构域和胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。在一些实施方式中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。胞外结构域和跨膜结构域可直接或间接相连。在一些实施方式中，所述胞外结构域和跨膜通过间隔物，例如本文所述的任何间隔物连接。在一些实施方式中，所述受体包含作为跨膜结构域的衍生来源的分子的胞外部分，例如CD28胞外部分。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含源自T细胞共刺激分子或其功能变体的胞内结构域，例如在跨膜结构域和胞内信号转导结构域之间。在一些方面中，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
[0145] 例如，在一些实施方式中，CAR含有抗体，例如抗体片段，是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有CD28的信号转导部分或功能性变体的细胞内信号转导结构域，和CD3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些实施方式中，CAR含有抗体，例如抗体片段，是包含或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有4-1BB的信号转导部分或功能变体的细胞内信号转导结构域，以及CD3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些所述实施方式中，所述受体还包括间隔物，其包含Ig分子(例如人Ig分子)的部分，例如Ig铰链，例如IgG4铰链，例如仅铰链间隔物。
[0146] 在一些实施方式中，所述重组受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包括人CD28(例如登录号P01747.1)或其变体的跨膜结构域，例如包含示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的跨膜结构域，或与SEQ ID NO:2显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列；在一些实施方式中，包含重组受体的部分的跨膜-结构域包含示于SEQ ID NO:104的氨基酸序列，或与其具有至少是或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
[0147] 在一些实施方式中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面中，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
[0148] 在一些实施方式中，所述重组受体(例如CAR)的胞内信号转导部分包含人CD28或其功能变体或部分的胞内共刺激信号转导结构域，例如在原始CD28蛋白的位置186-187处具有LL-GG取代的结构域。例如，胞内信号转导结构域可包含示于SEQ ID NO:112或113的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:112或113显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述胞内结构域包含4-1BB(例如(登录号Q07011.1)或功能变体或其部分的胞内共刺激信号转导结构域，例如示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3显示至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述胞内结构域包含4-1BB(例如(登录号Q07011.1)或功能变体或其部分的胞内共刺激信号转导结构域，例如示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3显示至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
[0149] 在一些实施方式中，所述重组受体(例如CAR)的胞内信号转导结构域包含人CD3ζ刺激信号转导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号:P20963.2)同种型3的112AA胞质结构域，或CD3ζ信号转导结构域，其描述于美国专利号:7,446,190或美国专利号8,911,993。例如，在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域包含如SEQ ID NO:4、105或159所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:4、105或159有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的氨基酸序列。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的氨基酸序列。
[0150] 在一些方面中，所述间隔物仅包含IgG的铰链区，例如仅IgG4或IgG1的铰链，例如仅示于SEQ ID NO:1的间隔物铰链。在其它实施方式中，所述间隔物是或包含Ig铰链，例如，IgG4源性的铰链，其任选地连接至CH2和/或CH3结构域。在一些实施方式中，所述间隔物是Ig铰链，例如，IgG4铰链，其连接至CH2和CH3结构域，例如示于SEQ ID NO:108。在一些实施方式中，所述间隔物是Ig铰链，例如，IgG4铰链，其仅连接至CH3结构域，例如示于SEQ ID NO:107。在一些实施方式中，所述间隔物是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其它柔性接头，例如已知柔性接头。
[0151] 例如，在一些实施方式中，CAR包括抗体，例如抗体片段，包括scFv，间隔物，例如含有免疫球蛋白分子的一部分的间隔物，例如铰链区和/或一个或多个重链分子恒定区，例如含有Ig-铰链的间隔物，含有全部或部分CD28衍生的跨膜结构域的跨膜结构域，CD28衍生的细胞内信号结构域和CD3ζ信号转导结构域。在一些实施方式中，CAR包括抗体或片段，例如scFv，间隔物，例如任何含有Ig-铰链的间隔物，CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB衍生的细胞内信号转导结构域和CD3ζ衍生信号转导结构域。
[0152] 在一些实施方式中，编码所述CAR构建体的核酸分子还包括编码T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列的序列，例如，在编码CAR的序列的下游。在一些实施方式中，所述序列编码SEQ ID NO:110所示的T2A核糖体跳跃元件，或与SEQ ID NO:110显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，还可产生表达抗原受体(例如CAR)的T细胞以表达截短EGFR(EGFRt)作为非免疫原性的选择表位(例如通过引入编码被T2A核糖体开关隔开的CAR和EGFRt的构建体，以从相同构建体表达两种蛋白质)，其随后可被用作标志物以检测所述细胞(参见例如美国专利号8,802,374)。在一些实施方式中，所述序列编码SEQ ID NO:
111所示的tEGFR序列，或与SEQ ID NO:111显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
111所示的tEGFR序列，或与SEQ ID NO:111显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
[0153] 术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。包括提供的受体和其他多肽(例如接头或肽)的多肽可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面中，所述多肽可包含对原始或天然序列进行的修饰，只要该蛋白质保留所需活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变或者可以是意外的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或PCR扩增所致的误差。
[0154] 由以各种剂量给予对象的细胞表达的重组受体(例如CAR)通常识别或特异性结合被治疗的疾病或病症或细胞所表达的、与之相关的和/或特异性的分子。在特异性结合分子例如抗原时，受体通常将免疫刺激信号(例如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方式中，第一剂量中的细胞表达特异性结合由疾病或病症的细胞或组织表达的抗原或与疾病或病症相关的抗原的受体(例如CAR)。
[0155] 在一些实施方式中，后施剂量中的细胞表达特异性结合由疾病或病症的细胞或组织表达的抗原或与疾病或病症相关的抗原的受体(例如CAR)。在一些方面中，由通过第二剂量的细胞表达的受体特异性地结合至与第一剂量的受体所结合的抗原相同的抗原，或与第一剂量的受体竞争结合。在其它实施方式中，第二剂量的细胞表达的受体特异性地结合至与第一剂量的受体所结合抗原的不同的抗原。
[0156] 因此，在一些实施方式中，第二受体(例如，第二CAR)在某些程度上与第一受体(例如第一CAR)不同，例如，在氨基酸序列和/或免疫学表位方面。例如，在一些方面中，第一剂量中给予的细胞表达的受体(例如CAR)包含不被后施剂量的细胞表达的至少一个免疫反应性表位。在一些实施方式中，第二剂量的细胞表达的受体(例如，CAR)不包含第一剂量的细胞表达的免疫反应性表位。示例性免疫反应性表位包括B细胞表位和T细胞表位，其可被向其给予所述细胞的对象的免疫系统识别。
[0157] 因此，在一些实施方式中，后施剂量的CAR的一种或多种组分不同于第一剂量的CAR。在一些实施方式中，相较于第一或前施受体，第二(或后施)受体(例如，CAR)包括氨基酸序列中的一个或多个差异。例如，在一些方面中，相较于第一剂量的细胞表达的CAR，后施剂量的细胞表达的CAR包含不同scFv、不同信号转导结构域和/或不同接合部分。在一些实施方式中，第一和/或第二受体或非宿主内源性的其它分子的序列，例如，不以宿主中天然存在的分子的形式存在。所述非内源性的序列的示例有跨越嵌合分子(例如CAR)中的非天然相关联的或融合的结构域的接合部分的序列。在一些实施方式中，后施剂量的细胞表达的CAR包含与第一剂量不同的共刺激、刺激性、跨膜和/或其它结构域。
[0158] 所述差异可包括，相较于第一或前施受体的区域(其中，在第一或前施给予之后，所述对象中显示对该第一或前施受体的可检测的免疫应答)的至少一个差异，例如，对应于第一或前施受体中的所述区域的第二或后施受体中的区域中的差异。包括所述一个或多个差异的区域可包括抗原-结合部分，例如scFv部分，包括scFv或可变区部分(例如重链和/或轻链可变区部分)的框架区，接头部分，铰链部分，两个CAR结构域之间的接合部分，和/或转导或表达标志物。
[0159] 在一些实施方式中，第一或其它前施和第二或其它后施受体可包括具有相似性的区域，例如，具有氨基酸序列相同性的区域。例如，在一些实施方式中，由后施剂量的细胞表达的CAR包含与由第一剂量的细胞表达的CAR相同的scFv，相同的信号转导结构域和/或相同的接合区域。在一些实施方式中，其还包含与第一剂量相同的共刺激、刺激、跨膜和/或其它结构域。
[0160] 在一些方面中，所述具有相同性的区域是所述对象在第一或前施给予之后不显示或不可能显示针对它们的免疫应答的那些。所述区域可包括共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、CDR，和/或转导或表达标志物内的区域。
[0161] 在一些方面中，第二受体(例如，第二CAR)的抗原-结合结构域，例如抗体或其抗体片段和/或结构域，例如，轻链和/或重链可变区，例如，scFv，源自与第一受体(例如，第一CAR)的那些不同的物种。可衍生所述结构域或片段的示例性物种包括人和非人物种，例如小鼠。例如，在一些实施方式中，第一或前施CAR的scFv源自小鼠抗体或具有鼠源性部分的抗体，例如FMC63或SJ25C1scFv，而第二或后施CAR的scFv源自人抗体或抗体片段，反之亦然。
[0162] 在一些实施方式中，第一CAR的抗原-结合结构域，例如，抗体部分或片段，例如，scFv，和第二CAR的那些源自相同物种。在一些此类实施方式中，第一和第二受体的结构域源自相同物种但包含序列中的一个或多个差异。在一些方面中，第一CAR的scFv源自小鼠序列，例如，FMC63，而第二CAR的scFv源自不同小鼠序列，例如，SJ25C1，反之亦然。
[0163] 在一些方面中，第二剂量的受体(例如，CAR)与第一剂量的受体(例如，CAR)包含相同抗原结合结构域，例如，抗体片段或部分，例如，scFv。在一些实施方式中，相较于第一或前施剂量的CAR，所述后施或第二受体包含一个或多个不同接合区域。
[0164] 在一些此类实施方式中，相较于其中第二CAR包含与第一剂量的细胞相同的一个或多个结合部分的方法和/或其中第二CAR包含第一剂量的受体中存在的一种或多种非内
源性序列的方法，表达第二或后施CAR的细胞的给予导致第二或后施剂量的细胞的减少的消除。
源性序列的方法，表达第二或后施CAR的细胞的给予导致第二或后施剂量的细胞的减少的消除。
[0165] 在一些方面中，第一和第二受体靶向相同抗原。在一些实施方式中，第一和第二受体靶标所述抗原的相同表位。例如，在一些实施方式中，第一和第二受体靶向相同或重叠表位和/或彼此竞争结合至该抗原，但源自不同物种，例如分别源自小鼠和人。在其它实施方式中，第一和第二受体靶向相同抗原上的不同表位。
[0166] 在一些实施方式中，第二分子，例如，受体(例如，CAR)，不包括包含在第一分子中的一个或多个免疫原性的部分；在一些实施方式中，第二受体不包含第一受体(或通过特定试验认为具有免疫原性的部分)中的任何免疫原性的部分。在一些此类实施方式中，第二受体(例如，CAR)，是具体选择和/或设计的，从而其不包括第一受体中所含的一个或多个免疫原性的部分和/或不包含被视作(例如，在具体对象中)具有免疫原性的部分和/或(例如，在被治疗的对象中)已检测到针对其的特异性免疫应答的部分。在一些方面中，第一受体(例如，CAR)的一个或多个免疫原性部分已被一个或多个不同序列替代。
[0167] 在一些实施方式中，例如，其中所述对象已变得对由第一受体或分子靶向所述抗原或其它结合伴侣的治疗具有抗性，和/或，其中所述抗原或结合伴侣在所述对象或疾病组织(例如，肿瘤)中下调或突变或已经下调或突变的实施方式中，第二剂量的受体(例如，CAR)经设计或选择以靶向与第一剂量的受体靶向的抗原不同的抗原。在一些方面中，第二剂量(即表达第二分子，例如，第二受体的细胞)的给予所实现的所述对象中疾病负荷(例如，肿瘤负荷)的减小大于相同细胞、表达相同受体的细胞和/或包含表达靶向相同抗原的受体的细胞的后施剂量的给予。
[0168] 就此而言，在一些实施方式中，所述方法可有利于治疗这样的对象，他们的疾病或病症已变得对靶向具体表位或抗原或其它疾病靶标的治疗具有抗性，例如归因于该疾病或病症或其细胞的下调或突变。因此，通过提供靶向相似但不同疾病相关联的表位或疾病的能力，所述方法在一些实施方式中不仅通过增加所述对象对表达所述受体或其它重组分子的暴露(例如，通过所述工程改造的细胞在所述对象中增加的扩增或持久性)，而且通过允许所述细胞甚至在原始靶标下调或突变的情况下发挥功能，来改善功效。
[0169] IV.对给予的细胞的宿主免疫应答
[0170] 在一些实施方式中，过继细胞治疗的功效可能会受所述对象中对于给予的细胞和/或构建体的免疫应答的限制。本文中观察到，甚至在具有B细胞恶性肿瘤的某些对象(其通常免疫力低下)中，仍能检测到对于过继细胞治疗中给予的细胞表达的受体的区域具有特异性的免疫应答。并且，在一些情况中，对象中可能会出现被细胞治疗靶向的疾病特异性或疾病相关联的抗原的流失、下调和/或调节，这可能会影响靶向该抗原或表位的治疗功效。例如，在已采用抗CD19免疫疗法治疗的某些对象中观察到CD19-阴性疾病。在一些实施方式中，所提供的方法在一个或多个所述情况中提供改善的功效。
[0171] 在本文提供的方法的一些实施方式中，一个或多个所述剂量或给予，例如，表达第二受体的细胞的后施剂量或给予，在所述对象中存在、可检测到或可检测到高于某水平免疫应答(例如，对于第一重组受体和/或细胞的适应性或特异性免疫应答)时给予。对重组分子的特异性免疫应答的存在或程度可与受体的免疫原性(例如由细胞表达的CAR或转基因TCR)和/或对象与其接触的时间有关。例如，在一些实施方式中，在对象首次接触表达第一受体的细胞之后的是或约28天、是或约35天或是或约42天，检测到针对该受体的免疫应答，例如针对该受体的特异性体液和/或细胞介导的免疫应答。因此，在一些实施方式中，不表达由第一剂量的细胞表达的受体的表达后施剂量的受体的细胞在针对第一或前施剂量的
第一重组受体或细胞的免疫应答、适应性或特异性免疫应答、可检测的免疫应答，和/或记忆应答已在所述对象中发展之后给予。就此而言，相较于其中后施剂量的细胞表达的受体与第一剂量表达的受体相同的其它方法，后施剂量的细胞在所述对象中扩增和/或持续的能力得到改善。在一些实施方式中，第二或后施剂量在一定时间点给予：至少或大于是或约
28天、35天，或42天。在一些实施方式中，其在是或约或至少是或约14或21天给予。
第一重组受体或细胞的免疫应答、适应性或特异性免疫应答、可检测的免疫应答，和/或记忆应答已在所述对象中发展之后给予。就此而言，相较于其中后施剂量的细胞表达的受体与第一剂量表达的受体相同的其它方法，后施剂量的细胞在所述对象中扩增和/或持续的能力得到改善。在一些实施方式中，第二或后施剂量在一定时间点给予：至少或大于是或约
28天、35天，或42天。在一些实施方式中，其在是或约或至少是或约14或21天给予。
[0172] 该方法可以包括检测这种免疫应答或其指示物的存在或不存在或水平，例如，在给予第一或第二的剂量之后和给予后施或下一个后施剂量之前。
[0173] 在一些实施方式中，何时和/或是否给予后施剂量的决定取决于对象是否表现出这样的免疫应答或其可检测的读数，例如对细胞或重组受体特异的可检测的特异性或适应性宿主免疫应答，例如由第一剂量的细胞表达的CAR，和/或是否在某一水平上检测到这样的反应。在一些实施方式中，在检测到这样的反应的情况下，向对象给予后施剂量。
[0174] 通常，在对象表现出针对受体(例如由第一剂量的细胞表达的CAR)的特异性或适应性(例如体液或细胞介导的)免疫应答时，或者表现出在可检测水平或高于可接受水平的这种反应或指示物时给予后施剂量。在一些方面中，在后施剂量给予时，所述对象显示针对由第一剂量的细胞表达的受体(例如，CAR)的体液或细胞介导的免疫应答。
[0175] 在一些实施方式中，宿主免疫应答是或包含体液免疫应答。体液免疫应答可以由对于对象的血清、其他体液和/或器官或组织中的细胞或由其表达的受体特异性的抗体的存在来指示。在一些实施方式中，存在特定同种型的此类抗体，例如IgM或IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4；在一些实施方式中，它们包括IgE。
[0176] 在一些实施方式中，免疫应答是或包含细胞介导组分。细胞介导的反应可以通过细胞，例如T细胞，例如辅助性或细胞毒性T细胞的存在来表示，其通过T细胞受体特异性识别细胞或重组受体的一个或多个表位。
[0177] 在一些实施方式中，免疫应答是初级免疫应答；在一些方面，免疫应答是记忆应答。
[0178] 在上述实施方式的任何一个中，可检测的免疫应答是指通过用于评估对特定抗原和细胞的特异性免疫应答的许多已知方法中的任何一种可检测到的量。例如，在一些实施方式中，通过在对象的血清上进行ELISpot、ELISA或基于细胞的抗体检测方法(例如，通过流式细胞术)以检测特异性结合和/或中和存在于细胞上的抗原，例如结合重组受体的表位，例如CAR的抗体的存在来检测特定类型的免疫应答。在一些这样的测定中，确定检测到的抗体的同种型并且可以指示应答的类型和/或应答是否是记忆应答。
[0179] 在一些实施方式中，通过用于检测特异性结合并诱导响应于重组受体中的表位的CD8+T细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定，和/或混合淋巴细胞反应，使用细胞，例如表达重组受体的辐照细胞作为刺激细胞的可检测的特异性免疫应答。
[0180] 在一些方面，可检测的免疫应答是通过这种方法检测的高于或显著高于对照样品(例如未涂覆的孔或涂覆有对照肽或未表达重组受体的细胞)的水平，和/或在用表达重组受体的细胞治疗之前基于来自对象的预处理血清或血液样品检测的水平的免疫应答。
[0181] 在一些方面，例如，在给予第一剂量或一个或多个后施剂量之后，检测或测量这种宿主免疫应答和/或其数量、程度或度的存在或不存在。
[0182] 体液免疫应答可以通过许多众所周知的用于检测针对特定抗原或细胞特异性的抗体的测定来检测，包括结合测定、免疫测定且包括基于细胞的测定。测定可包括设计用于评估抗体的特定功能的存在或不存在的那些，例如在结合抗原时进行特定效应功能的能
力，例如中和抗体测定。在一些实施方式中，使用基于细胞的测定法，例如通过将来自对象的治疗前和治疗后细胞与表达重组受体的细胞(和对照细胞)孵育来检测体液免疫应答(例如抗原特异性抗体，例如中和抗体)的结果并检测抗原特异性结合和/或其他结果，例如中和结果，例如通过流式细胞术或酶测定法。在一些实施方式中，ELISA和/或ELISpot测定法用于检测和定量对重组受体(例如CAR)特异性的抗体，以及使用已知技术(例如使用代表受体部分的各个肽)对表位进行作图。参见例如，Berger等.Blood.2006年3月；107(6):2294-
2302,Berger等.J Virol.2001年1月75(2):799-808，Riddell等.Nature Medicine.1996年
2月2(2):216-223，Berger等.Blood.2005年2月105(4):1640-1647，Jensen等.Biol Blood Marrow Transplant.2010年9月；16(9):1245–1256。在一些实施方式中，例如通过使用对特定同种型(例如人同种型)特异性的检测抗体来评估所检测抗体的同种型。
力，例如中和抗体测定。在一些实施方式中，使用基于细胞的测定法，例如通过将来自对象的治疗前和治疗后细胞与表达重组受体的细胞(和对照细胞)孵育来检测体液免疫应答(例如抗原特异性抗体，例如中和抗体)的结果并检测抗原特异性结合和/或其他结果，例如中和结果，例如通过流式细胞术或酶测定法。在一些实施方式中，ELISA和/或ELISpot测定法用于检测和定量对重组受体(例如CAR)特异性的抗体，以及使用已知技术(例如使用代表受体部分的各个肽)对表位进行作图。参见例如，Berger等.Blood.2006年3月；107(6):2294-
2302,Berger等.J Virol.2001年1月75(2):799-808，Riddell等.Nature Medicine.1996年
2月2(2):216-223，Berger等.Blood.2005年2月105(4):1640-1647，Jensen等.Biol Blood Marrow Transplant.2010年9月；16(9):1245–1256。在一些实施方式中，例如通过使用对特定同种型(例如人同种型)特异性的检测抗体来评估所检测抗体的同种型。
[0183] 可以使用多种众所周知的技术中的任何一种检测和/或测量对细胞和/或受体的基于细胞或细胞的免疫应答。这样的技术可包括用于检测CD8+T细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定，其特异性结合并诱导响应于所给予的重组受体例如CAR和/或细胞中的表位的细胞毒性。在一些实施方式中，所述测定是混合淋巴细胞反应，例如使用来自血液或其它器官或组织作为应答细胞的PBMC或其它宿主衍生细胞的那些，以及诱导表达重组受体的细
胞，例如表达CAR，作为刺激细胞的辐射的T细胞。刺激细胞通常是自体的，并且可以是与给予对象的细胞相同的细胞，并且可以被辐射。非转导细胞或未表达感兴趣转基因的细胞可用作阴性对照，代替对照样品中的刺激细胞。同样，来自治疗前时间点或其他对象的应答细胞样品可用于对照样品。在一些方面，这样的测定评估宿主细胞执行一种或多种效应功能(例如，抗原特异性细胞裂解)的能力，例如使用铬释放测定来检测存在于对象中的特异性识别所给予的细胞上或其中存在的抗原的细胞毒性T细胞，并诱导细胞毒性反应。在一些实施方式中，外周血细胞(例如PBMC)在给予细胞之前和之后从对象获得，并且各自用于使用经修饰以表达重组受体的自体T细胞的测定法，例如细胞裂解测定法，其通常被辐射。特异性裂解表明存在受体特异性细胞介导的免疫应答。可以使用代表重组受体部分的肽的组图组进行表位作图。参见例如，Berger等.Blood.2006年3月；107(6):2294-2302,Berger等.J Virol.2001年1月75(2):799-808，Riddell等.Nature Medicine.1996年2月2(2):216-223，Berger等.Blood.2005年2月105(4):1640-1647，Lamers,Blood 2011 117:72-82。HLA四聚体结合测定可用于对抗原特异性T细胞进行计数。在一些方面，使用淋巴增生性测定(LPA)和/或评估分泌的细胞因子的测定，如ELISA和/或细胞内染色和通过流式细胞术评估的测定法用于检测转基因特异性CD4+T细胞。
胞，例如表达CAR，作为刺激细胞的辐射的T细胞。刺激细胞通常是自体的，并且可以是与给予对象的细胞相同的细胞，并且可以被辐射。非转导细胞或未表达感兴趣转基因的细胞可用作阴性对照，代替对照样品中的刺激细胞。同样，来自治疗前时间点或其他对象的应答细胞样品可用于对照样品。在一些方面，这样的测定评估宿主细胞执行一种或多种效应功能(例如，抗原特异性细胞裂解)的能力，例如使用铬释放测定来检测存在于对象中的特异性识别所给予的细胞上或其中存在的抗原的细胞毒性T细胞，并诱导细胞毒性反应。在一些实施方式中，外周血细胞(例如PBMC)在给予细胞之前和之后从对象获得，并且各自用于使用经修饰以表达重组受体的自体T细胞的测定法，例如细胞裂解测定法，其通常被辐射。特异性裂解表明存在受体特异性细胞介导的免疫应答。可以使用代表重组受体部分的肽的组图组进行表位作图。参见例如，Berger等.Blood.2006年3月；107(6):2294-2302,Berger等.J Virol.2001年1月75(2):799-808，Riddell等.Nature Medicine.1996年2月2(2):216-223，Berger等.Blood.2005年2月105(4):1640-1647，Lamers,Blood 2011 117:72-82。HLA四聚体结合测定可用于对抗原特异性T细胞进行计数。在一些方面，使用淋巴增生性测定(LPA)和/或评估分泌的细胞因子的测定，如ELISA和/或细胞内染色和通过流式细胞术评估的测定法用于检测转基因特异性CD4+T细胞。
[0184] 在一些实施方式中，评估所述对象中针对所述细胞或受体的特异性免疫应答的存在或不存在，例如，通过本文所述的任何试验，例如，表位作图。在一些方面中，确定第一受体中的免疫原性表位和/或区域，例如，所述对象中在第一给予之后已对其发展免疫应答或可能已对其发展免疫应答的第一受体中的免疫原性表位和/或区域，从而选择不包含所述免疫原性表位或区域的第二受体和/或在此类区域中包含氨基酸差异的第二受体。
[0185] 在一些实施方式中，检测在第一或前施给予之后的免疫应答的存在或不存在，从而指示设计第二或后施受体中相较于第一或前施受体存在哪些差异。所述检测可包括鉴定所述对象对其显示特异性免疫应答的第一受体或在其它情况中前施受体(例如，CAR)的至少一个区域。
[0186] 因此，在一些实施方式中，第二剂量的细胞基于它们表达的受体选择。在一些实施方式中，第二剂量包含表达这样的受体(例如，CAR)的细胞，所述受体不包含所述对象在第一或前施剂量的给予之后已对其发展免疫应答的特定免疫反应性表位和/或不包含被确定具有免疫原性的任何所述免疫反应性表位或任何所述表位。在一些方面中，可给予对象第二或后施剂量的细胞，所述细胞表达的受体与第一剂量的细胞表达的受体在确定具有免疫原性的一个或多个区域中不同。因此，在一些实施方式中，对于待在第二(或其它后施)剂量中给予的表达受体的细胞的选择是患者特异性的。
[0187] 在一些实施方式中，包含表达与由第一剂量的细胞表达的受体不同的受体(例如CAR)的细胞的第二剂量的给予不引发针对第一剂量的受体具有特异性的可检测的体液或
细胞介导的免疫应答。在一些方面中，第二剂量不引发针对由第二剂量的细胞表达的受体的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。
细胞介导的免疫应答。在一些方面中，第二剂量不引发针对由第二剂量的细胞表达的受体的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。
[0188] 因此，在一些实施方式中，所述对象在给予表达第二受体的细胞之后，不显示针对第二受体的免疫应答，例如可检测的免疫应答，例如，体液或细胞介导的免疫应答，或在某一段时间内，例如给予那些细胞的约60天内，不显示所述应答。
[0189] 在一些实施方式中，该方法防止针对由第二剂量的细胞表达的受体的抗体的诱导或降低其水平。相较于其中给予表达与第一剂量的细胞表达的受体相同的受体的细胞的后施剂量的方法，例如，抗-受体(例如抗CAR)抗体的抗体效价，例如，通过ELISA在所述对象的血清中检测的抗-受体(例如抗CAR)抗体的抗体效价，在后施剂量的给予之后下降。因此，在一些实施方式中，该方法通过增加对象暴露于所给予的细胞来提高功效，其通过预防或减少否则会清除或预防所给予的细胞增殖的宿主免疫应答。
[0190] V.给药
[0191] 所述方法一般设计以改善过继细胞治疗的功效，例如通过提供所述对象与所述细胞(例如，随时间)增加的接触。所述方法涉及给予第一剂量，一般之后给予第二和/或一个或多个额外的后施剂量，其中在某些不同剂量之间的特定时间范围内给予。
[0192] 在过继细胞治疗的情况下，给予给定的“剂量”包括以单一组合物和/或单次不间断给药，例如以单次注射或连续输注给予给定量或数量的细胞，并且还包括在不超过3天特定时间段内，以分开剂量，在多个单独组合物或输注物中提供，给予给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，剂量是在单个时间点给予或开始的指定数量的细胞的单次或连续给予。然而，在一些情况下，剂量在不超过三天的时间段内进行多次注射或输注，例如每天一次持续三天或两天，或通过在一天时间内的多次输注。
[0193] 因此，在一些方面，细胞以单一药物组合物给予。
[0194] 在一些实施方式中，细胞以总体含有单一剂量的所述细胞的多个组合物给予。
[0195] 术语“分开剂量(split dose)”是指分开的剂量，使其在超过一天的时间以超过一次输注给药。这种类型的给药包括在本方法中，并且被认为是单一剂量。分开剂量输注的时间不多于三天。
[0196] 因此，所述剂量中的一个或多个在一些方面中可以分开剂量方式给予。例如，在一些实施方式中，可在2天或3天内向对象给予该剂量。分开给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量，并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方式中，该剂量的33％可以在第一天给予，而在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。在一些实施方式中，分开剂量扩展不超过3天。
[0197] 在一些实施方式中，给予多个剂量，在一些方面中采用与第一和第二剂量之间的时机控制相关的那些相同的时机控制准则，例如，通过给予第一和多个后施剂量，其中各后施剂量在第一或前施剂量给予之后的大于约28天的时间点给予。
[0198] 如本文所用，“第一剂量”用于描述在给予后施或第二剂量之前给定剂量的时机控制。该术语并不一定意味着对象之前从未接受过一定剂量的细胞治疗，或者对象之前还没有接受表达相同或不同重组受体或靶向相同或不同抗原的相同细胞的剂量。例如，在一些实施方式中，本文中所用的第一剂量代表对该对象进行第二或更大的细胞输注。
[0199] 如本文所用，“第二剂量”用于描述在给予前施剂量(例如，第一剂量)之后给定剂量的时机控制。该术语不一定表示所述对象之间仅接受过一个剂量的细胞治疗或所述对象之前仅接受过数个剂量的表达相同重组受体或靶向相同抗原的细胞。在一些实施方式中，多个剂量在第一和第二剂量之间给予，和/或在第一剂量之前或在第二剂量之后给予。例如，可给予第一剂量的细胞(或表达第一剂量的受体的细胞)的多个剂量，随后给予第二剂量的细胞或受体的多个剂量。术语第一和第二仅用于描述时间上彼此不同的剂量。
[0200] 述及前施剂量，例如第一剂量，术语“后施剂量”指在前施(例如，第一)剂量之后对同一对象给予的剂量。在一些方面中，所述后施剂量是第二、第三、第四等剂量。术语“后施”和具体数值(例如，“第二”)在描述剂量时均不表示其中不存在介于中间的剂量。
[0201] 在一些实施方式中，可给予所述对象表达与第一剂量相同的受体(例如，CAR)的一个或多个连续剂量。
[0202] 关于前施剂量，例如第一剂量，术语“连续剂量”是指在在先的，例如，第一剂量之后期间没有向对象给予任何间插剂量的情况下给予受试者的剂量。尽管如此，该术语不包括在单次分开剂量内包含的一系列输注或注射中的第二，第三和/或其他注射或输注。因此，除非另有说明，否则在一天、两天或三天内的第二输注不被认为是本文所用的“连续”剂量。相似地，在分开剂量内的多个剂量系列中的第二，第三和其他的剂量也不被认为是“连续”剂量意义内容中的“间插”剂量。因此，除非另有说明，即使在对象在第一剂量开始之后接受第二或后施注射或输注，在第一或前施剂量开始之后，在超过3天的一定时间段给予的剂量被认为是“连续”剂量只要在第一或前施剂量开始后的三天时间内开始第二或后施注射或输注。
[0203] 因此，除非另有说明，否则在多达3天的时间段内将相同细胞的多次给予视为单一剂量，并且在初始给药后3天内给予细胞不被认为是连续剂量，并且不被认为是以确定第二剂量是否与第一剂量“连续”为目的的间插剂量。在一些
[0204] 在一些实施方式中，给予多个连续剂量。所述多个连续剂量可以，例如，采用与第一和第一连续剂量之间的时机控制特定的那些相同的时机控制准则给予，例如通过给予第一和多个连续剂量，其中各连续剂量在第一或紧邻的前施剂量的给予之后大于约14且小于约28天(例如，约21天)的一段时间内给予。在一些实施方式中，关于第一剂量，连续剂量各自包括与第一剂量中给予的那些相同的细胞，和/或与第一剂量中表达的那些相同的重组受体。在一些此类实施方式中，所述一个或多个连续剂量的给予之后，给予第二剂量，并且在一些情况中，给予额外的一个或多个连续剂量。
[0205] 因此，在一些方面中，可给予所述对象多个剂量的表达相同受体的细胞。在一些实施方式中，包含表达第一受体的细胞的多个连续剂量，可在表达不同受体的细胞的后施给予之前，例如，在第二剂量的给予之前，向所述对象给予，在一些实施方式中，其之后也可以是连续给予第二剂量的细胞。在一些方面中，可给予所述对象表达第二(或第三、第四、第五等)受体的细胞的多个连续剂量。
[0206] 在一些实施方式中，例如，在多个临床试验的的情况下，可向对象给予表达第一临床试验中在研受体的细胞的第一剂量和表达第二临床试验中在研受体的细胞的第二(或其它后施)剂量。
[0207] 在一些实施方式中，所提供的方法用于对所述对象中的疾病或紊乱的长期或连续治疗或管控，其涉及工程改造的细胞的第一、第二、第三和/或多个额外的后施给予，所述工程改造的细胞各自表达靶向所述对象中相同疾病或病症的不同重组受体。所述长期治疗或管控可涉及重复的过程，其中监控所述对象，并且在检测到功效丧失或其风险时引入下一个后施给予(例如，下一个后施受体)。在一些实施方式中，各后施给予在检测到功效缺失的风险的一个或多个指标后起始，例如所述对象中对于前施剂量中的细胞的减少的持久性、扩增或接触、免疫应答特异性、复发、抗性和/或下调或靶标抗原中的变化。
[0208] 在一些实施方式中，例如，在检测到所述细胞的持久性或扩增或所述细胞的数量减小时，给予所述后施剂量用于复发后的再治疗，和/或防止靶向的疾病或紊乱的复发，和/或解决或防止第一剂量后与表达重组受体的细胞的接触减少。因此，在一些实施方式中，在第一或其它前施剂量和第二或其它后施剂量之间的时间度量、检测或评估这些参数中的一个或多个，并且基于所述评估的结果来制定关于给予后施剂量的时机控制或决定。例如，在所述表达受体的细胞的数量或浓度低于所需水平或已下降至低于某最大百分比或其它度量的浓度或数量时，可给予第二剂量。
[0209] 剂量的量或大小
[0210] 在一些实施方式中，第一或后施剂量包含一定数量的细胞、一定数量的重组受体(例如，CAR)表达型细胞，一定数量的T细胞或一定数量的外周血单核细胞(PBMC)，该数量为约105至约106这类细胞/千克对象体重，和/或一定数量的此类细胞，该数量不超过约105或约106个此类细胞/千克对象体重。例如，在一些实施方式中，第一或后施剂量包括小于或不超过或约1×105，等于或约2×105，等于或约5×105，或等于或约1×106个此类细胞/千克对象体重。在一些实施方式中，第一剂量包括等于或约1×105，等于或约2×105，等于或约5×105，或等于或约1×106的这类细胞/千克对象体重，或在任何两个上述值之间的范围内的值。在具体实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如CAR)表达型细胞的数量。
在其他实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在其他实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。
[0211] 在一些实施方式中，例如，在对象是人的情况下，第一或后施剂量包括小于约1×8 6
10个总重组受体(例如CAR)表达型细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在约1×10至1×108个此类细胞，例如2x106、5x106、1x107、5x107或1x108或全部此类细胞，或任何两个前述值之间的范围。
10个总重组受体(例如CAR)表达型细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在约1×10至1×108个此类细胞，例如2x106、5x106、1x107、5x107或1x108或全部此类细胞，或任何两个前述值之间的范围。
[0212] 在一些实施方式中，例如，第一或后施剂量包括小于约1×108个总重组受体(例如2 6 8
CAR)表达型细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)/m对象，例如，在约1×10至1×10个此
类细胞/m2对象，例如2x106、5x106、1x107、5x107、或1x108或全部此类细胞/m2对象，或任何两个前述值之间的范围。
CAR)表达型细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)/m对象，例如，在约1×10至1×10个此
类细胞/m2对象，例如2x106、5x106、1x107、5x107、或1x108或全部此类细胞/m2对象，或任何两个前述值之间的范围。
[0213] 在某些实施方式中，第一或后施剂量中的细胞、重组受体(例如，CAR)表达细胞、T6
细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量大于约1×10个此类细胞/千克对象体重，例如、2×
106、3×106、5×106、1×107、5×107、1×108、1×109，或1×1010个此类细胞/千克体重，和/或
1×108或1×109、1×1010个此类细胞/m2对象或总数，或任何两个前述值之间的范围。
细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量大于约1×10个此类细胞/千克对象体重，例如、2×
106、3×106、5×106、1×107、5×107、1×108、1×109，或1×1010个此类细胞/千克体重，和/或
1×108或1×109、1×1010个此类细胞/m2对象或总数，或任何两个前述值之间的范围。
[0214] 在一些实施方式中，以后施剂量给予的细胞数量与本文的任何实施方式中在第一剂量中给予的细胞数量相同或相似，例如小于或不超过等于或约1×105，等于或约2×105，等于或约5×105，或等于或约1×106个此类细胞/千克对象体重。在一些实施方式中，后施剂量含有等于或约1×105，等于或约2×105，等于或约5×105，或等于或约1×106的这类细胞/千克对象体重，或在任何两个上述值之间的范围内的值。在一些实施方式中，所述值指的是表达重组受体的细胞的数量；在其它实施方式中，它们指的是给予的T细胞或PBMC或总细胞的数量。在一些方面，后施剂量大于第一剂量。例如，在一些实施方式中，后施剂量含有超过约1×106个细胞、重组受体(例如CAR)表达型细胞、T细胞和/或PBMC/千克对象体重，例如约3x106、5x106、1x107、1x108或1x109个此类细胞/千克对象体重。在一些实施方式中，后施剂量的量或大小足以减少疾病负荷或其指标，和/或疾病或病症的一种或多种症状。在一些实施方式中，第二(或其它后施)剂量具有有效改善对象生存的大小，例如，改善对象存活，例如，诱导对象存活、无复发存活或无事件存活持续至少6个月或至少1、2、3、4或5年。在一些实施方式中，以后施剂量给予每对象体重的细胞、重组受体(例如CAR)表达的细胞、T细胞和/或PBMC的数量和/或此类细胞的数量为第一剂量中给予的数量至少2倍、5倍、10倍、50倍或100倍或更多。在一些实施方式中，与给予第一剂量或第二(或其它后施)剂量之前即刻相比，在后施剂量后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负荷或体积减少至少等于或约50％、60％、70％、80％、90％或更多。
[0215] 在其他实施方式中，以后施剂量给予的细胞的数量低于在第一剂量中给予的细胞的数量。
[0216] 在一些实施方式中，在第一剂量之后给予多个后施剂量，使得在给予第二(或其它后施)剂量后给予额外的剂量。在一些方面，以另外的后施剂量(即，第三、第四、第五等)给予对象的细胞数量与第一剂量、第二剂量和/或其它后施剂量相同或相似。在一些实施方式中，额外剂量大于前施剂量。
[0217] 在一些方面，基于一个或多个标准来确定第一和/或后施剂量的大小，例如对象对在先治疗的反应，例如，化疗，对象的疾病负荷，例如肿瘤负荷，体积，大小或度，程度，或转移类型，阶段和/或对象发生毒性后果的可能性或发生率，例如CRS，巨噬细胞活化综合征，肿瘤溶解综合征，神经毒性和/或针对给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答。
[0218] 在一些方面，第一和/或后施剂量的大小由对象中疾病或病症的负荷决定。例如，在一些方面，基于在给予第一剂量之前即刻存在于对象中的肿瘤负荷来确定以第一剂量给予的细胞的数量。在一些实施方式中，第一和/或后施剂量的大小与疾病负荷成反比。在一些方面，如在疾病负荷较大的情况下，对象被给予少量细胞，例如小于约1×106个细胞/千克对象体重。在其它实施方式中，如在疾病负荷较低的情况下，对象被给予较大量的细胞，6
例如大于约1×10个细胞/千克对象体重。
例如大于约1×10个细胞/千克对象体重。
[0219] 在一些方面，基于在给予第一剂量之前即刻存在于对象中的肿瘤负荷来确定以后施剂量给予的细胞的数量。在一些实施方式中，例如如果第一剂量已减小疾病负荷或已实现低于具体阈值量或水平，例如，高于该阈值量或水平是存在增加的毒性风险结果，那么后6
施剂量是大剂量，例如超过1x10 细胞(例如，总细胞、受体表达型细胞、T细胞或PBMC)/千克体重，和/或大于第一剂量。在其他方面，以后施剂量给予的细胞数量低，例如，小于约1×
106，例如，与第一剂量相同或更低，其中第一剂量在很小程度上降低了肿瘤负荷，或者其中第一剂量未导致肿瘤负荷的可检测的降低。
施剂量是大剂量，例如超过1x10 细胞(例如，总细胞、受体表达型细胞、T细胞或PBMC)/千克体重，和/或大于第一剂量。在其他方面，以后施剂量给予的细胞数量低，例如，小于约1×
106，例如，与第一剂量相同或更低，其中第一剂量在很小程度上降低了肿瘤负荷，或者其中第一剂量未导致肿瘤负荷的可检测的降低。
[0220] 在一些实施方式中，在第一剂量中给予的细胞的数量低于在给予的其它方法中(例如其中给予单一大剂量的细胞，例如，以在免疫应答发展之前给予细胞，的那些方法中)所给予的细胞的数量。因此，在一些实施方式中，相较于涉及给予较大剂量的其它方法，所述方法减小毒性或毒性后果。
[0221] 在一些实施方式中，第一剂量包括不引起或降低毒性或毒性后果的可能性的量的细胞，例如细胞因子释放综合征(CRS)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、持续三天或更多天的至少38摄氏度或约38摄氏度的发热，CRP血浆水平至少等于或约20mg/dL，和/或神经毒性。在一些方面，基于在给予细胞后对象将显示毒性或毒性后果(例如CRS，sCRS和/或CRS相关结果)的可能性来确定在第一剂量中给予的细胞的数量。例如，在一些实施方式中，基于肿瘤负荷预测对象中发展毒性后果的可能性。在一些实施方式中，该方法包括在给予剂量之前检测或评估毒性后果和/或疾病负荷。
[0222] 在一些实施方式中，在发生细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征或肿瘤溶解综合征或神经毒性的临床风险不存在或已过去或在第一次给药后已经消退时，给予第二(或其它后施)剂量，如在这种事件通常已经消退和/或不太可能发生的关键窗口之后，例如在60％、70％、80％、90％或95％的具有特定疾病或病症的对象中。
[0223] 剂量的时机控制
[0224] 在一些方面，从第一剂量开始到后施剂量开始测量第二或后施剂量的时间控制。在其它实施方式中，后施剂量的时间控制是从第一剂量完成，或从给予第一剂量的中位日起，例如，在本文所述的分开剂量的情况下，其中超过1天，例如2天或3天给予剂量。
[0225] 在一些实施方式中，是否给予表达与由第一剂量的细胞表达的受体不同的受体(例如CAR)的细胞的后施剂量，基于所述对象对第一剂量的细胞或由其表达的重组受体的免疫应答或可检测的免疫应答的存在或程度来决定。在一些方面，包含表达与第一剂量的细胞不同的受体的细胞的后施剂量将会给予具有可检测的宿主适应性免疫应答或已经建
立或达到一定水平、阶段或程度的免疫应答的对象。
立或达到一定水平、阶段或程度的免疫应答的对象。
[0226] 在一些实施方式中，在表达第一受体(例如，CAR)的细胞的第二给予可能会或预期会被宿主免疫系统消除时给予第二(或其它后施)剂量。可通过检测第一剂量的给予之后所述对象中的受体特异性免疫应答来确定发展免疫应答的可能性，如本文所述。
[0227] 例如，在一些实施方式中，可在第一(或其它前施)剂量之后且在第二(或其它后施)剂量之前测试对象，以确定第一剂量之后所述对象中是否有可检测的免疫应答。在一些此类实施方式中，对于第一剂量的免疫应答的检测可触发对于给予第二剂量的需求。
[0228] 在一些方面中，可如本文所述测试来自所述对象的样品以确定在第一或前施剂量之后，所述对象中是否存在接触的减少或低于所需接触，例如，小于某数量或浓度的细胞，如本文所述。在一些方面中，对于所述对象与细胞接触的减少的检测可触发对于给予第二剂量的需求。
[0229] 在一些实施方式中，在对象的疾病或病症在对第一剂量或前施剂量的应答中的疾病负荷降低后没有复发时给予后施剂量。在一些实施方式中，减轻疾病负荷由一个或多个因子的降低来指示，所述因子例如对象或其体液或器官或组织中的疾病细胞的负荷或数量、肿瘤的质量或体积、转移的程度或度。如果在对初始治疗或给药作出反应的因子减少之后，该因子随后增加，则该因子被认为已复发。
[0230] 在一些实施方式中，在疾病已复发时给予第二剂量。在一些实施方式中，复发是一般或一个或多个因子，或在疾病负荷中。在一些方面，在对象、疾病负担或其因子与在第一次或在先给药之后测量或达到的最低点相比复发，但仍然低于第一次剂量之前即刻时给予后施剂量。在一些实施方式中，在疾病负荷或其指示因子未发生变化时，例如，当已阻止疾病负荷增加时，给予对象后施剂量。
[0231] 在一些实施方式中，在宿主适应性免疫应答被检测到、已建立、或已达到一定水平、程度或阶段时给予后施剂量。在一些方面，在对象的记忆免疫应答发展之后给予后施剂量。
[0232] 在一些方面，给予第一剂量与给予后施剂量之间的时间为约28至约35天，约29至约35天，或大于约35天。在一些实施方式中，第二剂量在第一剂量给予之后超过约28天的时间点给予。在一些方面中，第一和后施剂量之间的时间是约28天。
[0233] 在一些实施方式中，额外的一个或多个剂量，例如后施剂量，在给予第二剂量之后给予。在一些方面中，所述额外的一个或多个剂量在给予前施剂量之后至少约28天给予。在一些实施方式中，在前施剂量之后小于约28天的时间不给予剂量。
[0234] 在一些方面中，本发明方法的益处在于，它们允许在超出其它方法可能给予包含表达第一剂量的受体的细胞的第二剂量的时间范围的时间点给予表达受体的细胞，例如，在检测到针对第一剂量的细胞的免疫应答之后。
[0235] 在一些实施方式中，所述方法相较于其它方法减小毒性或毒性后果，例如，通过允许在第一剂量之后的毒性后果已被清除之后进行第二给予，例如，其可以在表达第一受体的细胞的第二给予将被针对第一受体的免疫应答清除的时间点进行。
[0236] 在一些方面中，所述方法允许在复发已出现的时间点给予第二剂量，例如，当所述对象已初始地响应治疗但发展出复发时，例如，在表达第一受体的细胞的第二给予将被针对第一受体的免疫应答清除的时间点。
[0237] 在一些实施方式中，例如其中给予所述对象表达由第一剂量的细胞表达的受体的一个或多个连续剂量，所述连续剂量可分开约14、约15、约21、约27，或约28天。在一些方面中，所述连续剂量在前施剂量之后21天给予。在一些实施方式中，所述连续剂量在前施剂量的给予之后14和28天之间给予。
[0238] 在任何实施方式中，在一些情况下，该方法包括给予第一剂量或前施剂量和后施剂量，并且在其他情况下包括向先前已接受过第一剂量或前施剂量的对象给予后施剂量，该对象已经之前接受了第一剂量或前施剂量，但不包括给予第一剂量或前施剂量本身。因此，在某些情况下，该方法涉及给予巩固治疗，例如通过对先前已经接受重组受体表达型(例如CAR表达)细胞的剂量的对象给予巩固后施剂量。
[0239] 在一些实施方式中，与给予第一或前施剂量或第二或后施剂量之前即刻相比，在后施剂量后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负荷或体积减少至少等于或约50％、60％、70％、80％、90％或更多。
[0240] VI.细胞暴露和持久性
[0241] 在一些实施方案中，所提供的方法增加受试者对所施用细胞的暴露(例如，随时间增加的细胞数量或持续时间)和/或改善过继细胞疗法中的功效和治疗结果。在一些方面，该方法的优点在于，与其他方法相比，表达重组受体的细胞(例如，表达CAR的细胞)的暴露程度更大和/或更长程度地改善治疗结果。这些结果可包括患者的生存和缓解，甚至在具有严重肿瘤负荷的个体中。
[0242] 在一些实施方式中，检测在第一剂量和/或后施剂量之后在对象中表达重组受体的细胞(例如，表达CAR的细胞)的存在和/或量。在一些方面，使用定量PCR(qPCR)来评估在对象的血液或血清或器官或组织(例如疾病部位)中表达重组受体的细胞(例如，表达CAR的细胞)的量。在一些方面，持续性被定量为每微克DNA中编码受体，例如CAR的DNA或质粒的拷贝，或作为每微升样品例如，血液或血清的受体表达，例如CAR表达细胞的数量，或每微升样品的外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数。
[0243] 在一些实施方式中，在给予第二(或其它后施)剂量之后或至少在第4、14、15、27或28天，在对象中检测到细胞。在一些方面，在或者至少在给予第二(或其它后施)剂量后2、4或6周，或者3、6或12、18或24、或30或36个月，或者1、2、3、4、5或更多年检测到细胞。
[0244] 在一些实施方式中，通过所述方法，在后施剂量的给予之后，表达受体(例如，CAR)的细胞在所述对象中的持久性，大于通过替代性方法实现的情况，例如涉及给予单一剂量或给予表达与第一(或其它前施)剂量的细胞表达的受体相同的受体(例如CAR)的后施剂量的细胞的那些。
[0245] 在一些实施方式中，在给予第二剂量之后，表达重组受体(例如，表达CAR)的细胞在所述对象中的持久性和/或增殖和/或存在大于通过采用替代性给药方案的方法实现的情况，例如涉及给予单一剂量的表达受体的细胞的方法或涉及第二剂量或多个剂量的表达由第一剂量的细胞表达的受体相同的受体的细胞的方法。
[0246] 可以根据对象暴露的细胞的最大数目，高于特定数量或百分比的可检测细胞的持续时间，随时间的细胞数曲线下面积和/或其组合以及其指标来表示例如指示细胞数、增殖和/或持续性的接触。与特定样品，例如血液或血清中的核酸或DNA的总量相比，可以使用已知的方法例如qPCR来评估这样的结果，以检测编码重组受体的核酸的拷贝数，和/或通常使用对受体特异性的抗体来检测表达受体的细胞的流式细胞术测定法。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，例如能够结合和/或中和和/或诱导针对疾病或病症或表达被受体识别的抗原的细胞的应答(例如，细胞毒性应答)。
[0247] 在一些方面，对象对细胞的增加的暴露包括增加细胞的增殖。在一些实施方式中，在给予第一剂量和/或给予后施剂量后，受体-(例如CAR-)表达细胞在对象中增殖。在一些方面中，所述方法导致的细胞的增殖大于其它方法，例如涉及给予单一剂量的细胞或一个或多个后施剂量的表达与第一剂量相同受体的细胞的那些。
[0248] 在一些方面，该方法导致所给予的细胞的高体内增殖，例如通过流式细胞术测量。在一些方面，检测到高峰比例的细胞。例如，在一些实施方式中，在第一或后施给予之后，在对象的血液或疾病部位或其白细胞部分(例如PBMC部分或T细胞部分)中处于峰值或最大水平时，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约
70％，至少约80％，或至少约90％的细胞表达重组受体，例如CAR。
70％，至少约80％，或至少约90％的细胞表达重组受体，例如CAR。
[0249] 在一些实施方式中，该方法导致在对象的血液或血清或其他体液或器官或组织中至少100、500、1000、1500、2000、5000、10000或15000个拷贝的或编码受体的核酸的最大浓度，例如每微克DNA的CAR，或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的受体表达，例如CAR表达的细胞/外周血单核细胞(PBMC)总数、单核细胞总数、T细胞总数或总微升数。在一些实施方式中，表达受体的细胞被检测为对象血液中总PBMC的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，和/或在该水平在第一或后施给药后持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、24、36、48、或52周，或者这种给药后持续1、2、3、4或5年或更多年。
11、12、24、36、48、或52周，或者这种给药后持续1、2、3、4或5年或更多年。
[0250] 在一些方面，该方法导致例如，在对象的血清中编码重组受体，例如CAR的核酸的拷贝每微克DNA增加至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍。
[0251] 在一些实施方式中，表达受体的细胞可在对象的血液或血清中检测到，例如通过指定的方法，例如qPCR或基于流式细胞术的检测方法，给予第一剂量后或在给予第二(或其它后施)剂量后至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60或更多天，或者在给予第一剂量或一个或多个后施剂量之后持续至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多周。
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多周。
[0252] 在一些方面，至少约1×102，至少约1×103，至少约1×104，至少约1×105，或至少约1×106或至少约5×106或至少约1×107或至少约5×107或至少约1×108重组受体表达型，例如，表达CAR的细胞，和/或每微升至少10、25、50、100、200、300、400、或500、或1000个表达受体的细胞，例如每微升至少10个，可检测或存在于对象或其流体、组织或其隔室中，例如在血液中，例如外周血或其疾病部位。在一些实施方式中，在给予第一剂量后或给予后施剂量后，细胞数量或浓度在对象中可检测持续至少约20天、至少约40天、或至少约60天、或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年。这样的细胞数可以通过基于流式细胞术或基于定量PCR的方法检测，并使用已知方法外推至总细胞数。参见，例如Brentjens等，Sci Transl Med.2013 5(177),Park等，Molecular Therapy 15(4):825–833(2007),
Savoldo等，JCI 121(5):1822-1826(2011),Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4):e61338,
Davila等，Oncoimmunology1(9):1577-1583(2012),Lamers,Blood 2011 117:72-82,
Jensen等，Biol Blood Marrow Transplant 2010年9月；16(9):1245–1256,Brentjens等，Blood 2011118(18):4817-4828。
Savoldo等，JCI 121(5):1822-1826(2011),Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4):e61338,
Davila等，Oncoimmunology1(9):1577-1583(2012),Lamers,Blood 2011 117:72-82,
Jensen等，Biol Blood Marrow Transplant 2010年9月；16(9):1245–1256,Brentjens等，Blood 2011118(18):4817-4828。
[0253] 在一些方面，通过免疫组织化学、PCR和/或流式细胞术测量，每100个细胞中编码重组受体的核酸的拷贝数，例如载体拷贝数，例如在外周血或骨髓或其他隔室中，位至少0.01、至少0.1、至少1、或至少10，在给予细胞，例如，在第一或一个或多个后施剂量后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、或至少约6周，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年时。在一些实施方式中，每微克基因组DNA中表达受体，例如，CAR的载体的拷贝数，在给予第一剂量或后施剂量的受体表达，例如，CAR表达细胞后约1周、约2周、约3周或至少约4周时，或这种给药后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月，或至少2或3年时，为至少100、至少1000、至少5000、或至少10000、或至少15000、或至少20000。
[0254] 在一些方面，由细胞表达的受体，例如CAR，可以通过定量PCR(qPCR)或通过流式细胞术检测在对象，其血液和/或其疾病部位中检测，在给予细胞后，例如在开始给予第一剂量或第二剂量或后施剂量后至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年或超过3年时。
[0255] 在一些实施方式中，在给予第一剂量后随着时间变化的对象在体液、组织或器官(例如血液)中的表达受体(例如CAR)的细胞的浓度的曲线下的面积(AUC)相比其中向对象给予单一剂量的细胞或多个剂量的表达相同受体的细胞的替代给药方案所达到的面积更
大。
大。
[0256] 在一些方面中，在给予后施剂量后随着时间变化的对象在体液、组织或器官(例如血液)中的表达受体(例如CAR)的细胞的浓度的曲线下的面积(AUC)比通过其中对象以单一剂量给予第一剂量或多个剂量的表达相同受体的细胞的替代给药方案所达到的面积更大。
[0257] VII.疾病负荷
[0258] 所述多个剂量的给予通常降低或预防对象中疾病或病症的扩张或负荷。例如，当疾病或病症是肿瘤时，该方法通常减少肿瘤大小、体积、或转移，和/或改善与肿瘤负荷相关的预后或存活或其他症状。在一些实施方式中，第二或后施剂量的给予的时间控制与第一或前施剂量之后转基因特异性免疫应答和/或复发的发展相关。
[0259] 疾病负荷可以包括对象或对象的器官、组织或体液中的疾病数量的总数，例如肿瘤或另一位置的器官或组织，例如，其将指示转移。例如，在某些血液恶性肿瘤的情况下，可以在血液或骨髓中检测和/或定量肿瘤细胞。在一些实施方式中，疾病负荷可包括，肿瘤质量和/或转移的数量或程度。
[0260] 在一些实施方式中，两个或更多个剂量的给予能发挥减小疾病负荷的作用。在一些方面，所述多个剂量的给予可以防止疾病负荷的增加，并且这可以通过疾病负荷无变化来证明。
[0261] 在一些方面，在给予第一剂量后疾病或病症仍然存在和/或给予第一剂量不足以消除对象中的疾病或病症。
[0262] 在一些方面，与第一剂量之前的时间相比，或在紧随第二剂量之前的时间相比，第二剂量的给药减少了疾病负荷。在一些方面，例如在复发的情况下，与给予第一剂量后的疾病负荷的峰值水平相比，给予第二剂量实现了疾病负荷的降低。
[0263] 在一些实施方式中，相较于采用替代性的给药方案(例如，其中所述对象接受单一剂量的细胞或多个剂量的表达相同受体(例如，CAR)的细胞的方法)所观察到的减小，所述方法将疾病或病症的负荷，例如，肿瘤细胞的数量、肿瘤大小、患者存活或无事件存活时长，减少更大程度和/或保持更长时间。在一些实施方式中，相较于通过给予第二剂量的表达相同受体(例如，CAR)的细胞将会实现的情况而言，在第二剂量之后，疾病负荷减少更大程度或保持更长时间。
[0264] 在一些实施方式中，检测、评估或测量对象中疾病或病症的负荷。在一些方面，通过检测对象中，或对象的器官、组织或体液例如血液或血清，中的疾病或疾病相关细胞，例如肿瘤细胞的总数可以检测疾病负荷。在一些实施方式中，疾病负荷，例如，通过测量实体瘤的质量和/或转移的数量或程度来评估肿瘤负荷。在一些方面，评估对象的生存期，在一定时间段内的存活，存活范围，无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方式中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方式中，指定疾病或病症负荷的量度。
[0265] 在一些方面，在给予第一剂量之前，在给予第一剂量之后但在给予第二剂量之前，和/或在给予第二剂量后，测量或检测疾病负荷。在多个后施剂量的情况下，一些实施方式中的疾病负荷可以在任何后施剂量之前或之后或在给予后施剂量之间时测量。
[0266] 在一些方面，给予所述多个剂量会减小疾病负荷，例如，肿瘤负荷，例如与给予第二剂量之前即刻相比或与在第一剂量之前即刻相比，有等于或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％或100％的负荷减轻。在一些实施方式中，与给予第一剂量或第二剂量之前即刻相比，在第二剂量后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负荷或体积减少至少等于或约50％、60％、70％、80％、90％或更多。
[0267] 在一些实施方式中，通过该方法减少疾病负荷包括在形态完全缓解中的诱导，例如，通过在给予例如第一或任何后施剂量之后1个月、2个月、3个月或3个月以上评估。在一些方面，例如，通过多参数流式细胞术测量，最小残留疾病的测定是阴性的，或者最小残留疾病的水平小于约0.3％，小于约0.2％，小于约0.1％，或小于约0.05％。
[0268] 在一些实施方式中，与其他方法相比，通过该方法改善对象的无事件存活率或总体存活率。例如，在一些实施方式中，在第一剂量后6个月通过该方法治疗的对象的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、或大于约95％。在一些方面，总存活率大于约40％，大于约50％，大于约60％，大于约
70％，大于约80％，大于约90％或大于约95％。在一些实施方式中，用该方法治疗的对象表现出无事件存活，无复发生存或存活至少6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方式中，改善进展的时间，例如大于或约6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年的进展时间。
70％，大于约80％，大于约90％或大于约95％。在一些实施方式中，用该方法治疗的对象表现出无事件存活，无复发生存或存活至少6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方式中，改善进展的时间，例如大于或约6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年的进展时间。
[0269] 在一些实施方式中，通过该方法进行的治疗，与其它方法相比，复发的概率降低。例如，在一些实施方式中，第一剂量后6个月复发的概率小于约80％，小于约70％，小于约
60％，小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，或小于约10％。
60％，小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，或小于约10％。
[0270] VIII.毒性和毒性后果
[0271] 在一些实施方式中，例如，相较于以单一剂量给予细胞，给予表达与第一剂量相同的受体的细胞的后施剂量，和/或在早于本发明方法的第一和后施剂量之间的时间的时间点给予后施剂量而言，本发明方法减少或防止毒性或其后果或症状。
[0272] 给予过继T细胞疗法，如用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗可引起毒性作用或结果，如细胞因子释放综合征和神经毒性。在一些实施例中，这种作用或结果与高水平的循环细胞因子平行，这可能是观察到的毒性的基础。
[0273] 在一些方面中，通过允许给予小于其它方法(例如，其中给予单一大剂量的方法，例如，其中表达相同受体的细胞的多个较小剂量可能会被宿主免疫应答消除的方法)的第一剂量，本发明方法相较于其它方法可减小毒性或毒性后果。
[0274] 在一些实施方式中，通过允许在第一剂量给予之后超过28天给予后施剂量，例如，在已经发展针对第一受体的免疫应答的时间点给予(从而如果再次给予那么表达第一受体的细胞将被消除)，本发明方法可相较于其它方法减小毒性或毒性后果。因此，在一些方面中，所述方法相较于在所述对象有风险发展CRS的时间点给予多个剂量的方法能减小毒性。
[0275] 在一些方面，毒性结果是或相关或指示细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)。在某些情况下，CRS，例如，sCRS可以在对象的过继T细胞治疗和给予其他生物制品之后出现。参见Davila等，Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等，
Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等，N.Engl.J.Med.368,1509–1518(2013)；和Kochenderfer等，Blood 119,2709–2720(2012)；Xu等，Cancer Letters 343(2014)172-78。
Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等，N.Engl.J.Med.368,1509–1518(2013)；和Kochenderfer等，Blood 119,2709–2720(2012)；Xu等，Cancer Letters 343(2014)172-78。
[0276] CRS可以用抗炎治疗如抗IL-6治疗，例如抗-IL-6抗体，例如托珠单抗或抗生素治疗。在一些实施方式中，在第一次给药后，用这种疗法治疗对象，并且只有当该治疗后CRS相关症状减少或下降或降低至低于可接受水平时，给予后施剂量。
[0277] CRS的结果、迹象和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方式中，在特定剂量方案或给药实现或不实现给定的CRS相关的结果、迹象或症状的的情况中，可以规定特定结果、体征、和症状和/或其数量或程度。
[0278] 可以规定测量或检测各种结果的方法。
[0279] 在一些方面，在给予第一剂量之前，在给予第一剂量之后并在给予后施剂量之前，或在给予后施剂量之后，评估对象中与CRS相关的结果。在一些实施方式中，通过ELISA测量毒性后果的水平，例如，CRS相关结果，例如，CRS指示物的血清水平。
[0280] 在一些方面，毒性后果是神经毒性或与神经毒性有关。在一些实施方式中，与其它方法相比，该方法减少与神经毒性相关的症状。例如，通过其他方法治疗的对象相比，根据本发明的方法治疗的对象可能具有减少的神经毒性症状，例如肢体虚弱或麻木，丧失记忆、视力和/或智力，不可控制的强迫症和/或强迫行为，妄想，头痛，认知和行为问题，包括运动控制丧失、认知衰退和自主神经系统功能障碍以及性功能障碍等问题。
[0281] 在一些实施方式中，该方法减少与神经毒性相关的结果，包括对神经系统和/或脑的损伤，例如神经元的死亡。在某些方面，该方法降低与神经毒性相关的因子的水平，例如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基。
[0282] 在一些实施方式中，相较于单一剂量的给予、表达与第一剂量相同的受体(例如，CAR)的细胞的后施剂量的给予和/或在早于本发明方法的第一和后施剂量之间的时间的后施剂量的给予，根据本发明方法的给予对象的剂量具有减少的与神经毒性相关联的症状、后果，或因素。
[0283] IX.细胞
[0284] 细胞一般是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞，例如，源自人类对象和工程改造的那些，例如，工程改造以表达重组受体。在一些实施方式中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其他示例性的细胞包括干细胞，如专能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。细胞一般是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位，和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或隔室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况，和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。方法包括现成的方法。在一些方面中，如对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，如干细胞，如诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，并且在冷冻保存前或后将其再导入同一患者。
[0285] T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括：原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)、中心记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、或最终分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MAIT)细胞、天然产生的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞，和δ/γT细胞。
[0286] 在一些实施方式中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。
[0287] 在一些实施方式中，所述细胞包括通过遗传工程改造导入的一种或多种核酸，并，由此表达所述核酸的重组或经遗传工程改造的产物。在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，如从另一个生物体或细胞获得的样品，其例如通常不在工程改造中的细胞和/或这类细胞来源的生物体中发现。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如核酸不是自然中发现的，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。
[0288] 用于遗传工程改造的方法和载体
[0289] 还提供了用于产生表达重组受体的遗传工程改造的细胞的方法、组合物和试剂盒。遗传工程改造一般涉及将编码所述重组或经工程改造的部分的核酸导入细胞，例如，通过逆转录病毒转导、转染或转化进行。
[0290] 在一些实施方式中，基因转移通过如下方式进行：首先，刺激细胞，例如，通过将其与刺激物合并，所述刺激物诱导响应，例如增殖、存活和/或活化，例如，通过细胞因子或活化标志物的表达来检测，然后转导该活化的细胞，并且在培养物中扩增至足以供于临床应用的数量。
[0291] 在一些情况中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对对象具有毒性。因此，在一些情况中，工程改造的细胞包括，例如在过继免疫治疗中给予之后，使细胞对体内负选择易感的基因区段。例如在一些方面中，所述细胞经工程改造，从而它们可因它们所给予的对象的体内状况的变化而被消除。可负选择的表型可通过将提供对给予的试剂(例如，化合物)的敏感性的基因来产生。可负选择的基因包括：单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等，Cell II:223，I977)，其提供更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
[0292] 在一些方面中，细胞还经工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。用于引入遗传工程改造的组分，例如，抗原受体(例如，CAR)的各种方法是熟知的，并可采用本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒，例如，逆转录病毒或慢病毒，转导，转座子，和电穿孔。
[0293] 在一些实施方式中，采用重组感染性病毒颗粒将重组核酸转移进入细胞，例如，源自猿病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体。在一些实施方式中，采用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Koste等(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等.(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等.(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等,Trends Biotechnol.2011年11月；29(11):550–557。
[0294] 在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)，骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，鼠胚胎干细胞病毒(MESV)，鼠干细胞病毒(MSCV)，脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，所述逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染数种物种(包括人类)的宿主细胞。在一个实施方式中，用待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等(1991)Virology 180:849-852；Burns等(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin(1993)
Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin(1993)
Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
[0295] 慢病毒转导方法是已知的。示例性方法描述于，例如，Wang等，(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等，(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等，(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等，(2003)Blood.102(2):497-505。
[0296] 在一些实施方式中，通过电穿孔将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，
[0297] Chicaybam等，(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等.(2000)
[0298] GeneTherapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，通过转位将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Manuri等(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等，(2013)Molec Ther Nucl Acids 2，e74；和Huang等，(2009)Methods Mol Biol506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston，Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，Mol.Cell Biol.,
7:2031-2034(1987))。
7:2031-2034(1987))。
[0299] 用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是描述于，例如，国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190的那些。
[0300] 用于引入的其他核酸(例如基因)包括用以例如通过促进转移的细胞的活力和/或功能改善治疗功效的那些；用以提供遗传标志物以供选择和/或评价细胞的基因，例如以评估体内存活或定位；用以改善安全性的基因，例如，通过使细胞对体内负选择易感，如
Lupton S.D.等，Mol.and Cell Biol.，11:6(1991)；和Riddell等，Human Gene Therapy 3:
319-338(1992)所述；也参见Lupton的公开号PCT/US91/08442和PCT/US94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因
的应用。参见例如Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。
Lupton S.D.等，Mol.and Cell Biol.，11:6(1991)；和Riddell等，Human Gene Therapy 3:
319-338(1992)所述；也参见Lupton的公开号PCT/US91/08442和PCT/US94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因
的应用。参见例如Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。
[0301] 用于工程改造的细胞的制备
[0302] 在一些实施方式中，经工程改造的细胞的制备包括一种或多种培养和/或一个或多个制备步骤。用于导入编码转基因受体(例如，CAR)的核酸的细胞可从样品(例如生物样品，例如获自或源自对象的样品)分离。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有一定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗性介入的人，例如，需要过继细胞疗法的人，用于该疗法的细胞是经分离、加工和/或经工程改造的。
[0303] 因此，在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自对象的组织、体液和其它样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、遗传工程改造(例如采用病毒载体的转导)、清洗和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。
[0304] 在一些方面中，从中衍生或分离细胞的样品是血液或血液源性的样品或者，是或源自单采或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(例如，过继细胞治疗)的情况中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
[0305] 在一些方面中，第二剂量的细胞源自与第一剂量的细胞相同的清血法产物。在一些实施方式中，多个剂量，例如，第一、第二、第三等剂量的细胞源自相同清血法产物。
[0306] 在其它实施方式中，第二(或其它后施)剂量的细胞源自与第一(或其它前施)剂量的细胞来源不同的清血法产物。
[0307] 在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类，和猪。
[0308] 在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种物质的存在下经清洗、离心和/或孵育，例如，以移除不需要的组分，富集所需组分，裂解或移除对具体物质敏感的细胞。在一些实例中，细胞基于一种或多种性质，例如密度、粘附性质、尺寸、对具体组分的敏感性和/或抗性被分离。
[0309] 在一些实例中，例如，通过单采或白细胞去除术，获得来自对象循环血液的细胞。在一些方面中，所述样品包括淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、血红细胞，和/或血小板，和，在一些方面中包括与血红细胞和血小板不同的细胞。
[0310] 在一些实施方式中，从所述对象收集的血液细胞经清洗，例如，以移除血浆部分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后施处理步骤。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在一些实施方式中，清洗溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过半自动化的“流通”离心法(例如，Cobe 2991细胞处理器，百特公司(BaXter))完成。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过内切流过滤(TFF)完成。在一些实施方式中，在清洗后，所述细胞在多种生物相容缓冲液中重悬，例如，无Ca++/Mg++PBS。在某些实施方式中，移除血液细胞样品组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
[0311] 在一些实施方式中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如，通过裂解血红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心来从外周血制备血液白细胞。
[0312] 在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如，表面蛋白质、胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用基于此类标志物进行分离的任何已知方法。在一些实施方式中，所述分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，在一些方面中，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合至此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，和从尚未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离已结合所述抗体或结合伴侣的细胞。
[0313] 此类分离步骤可基于正选择，其中已结合所述试剂的细胞被保留用于进一步应用，和/或，负选择，其中尚未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞被保留。在一些实例中，两种部分均保留用于进一步应用。在一些方面中，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，从而分离最好基于通过与所需群不同的细胞表达的标志物进行。
[0314] 所述分离不需导致具体细胞群或表达具体标志物的细胞的100％的富集或移除。例如，正选择或富集具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，增加所述细胞的数量或百分数，但不需要导致不表达所述标志物的细胞完全不存在。同样地，负选择、移除或消耗具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，减少所述细胞的数量或百分数，但不需要导致所有此类细胞的完全移除。
[0315] 在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的部分进行另一分离步骤，例如后施正或负选择。在一些实例中，单一分离步骤同时消耗表达多重标志物的细胞，例如通过孵育使细胞与各自对负选择靶向的标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣孵育。同样地，可通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣孵育来对多重细胞类型进行同时正选择。
[0316] 例如，在一些方面中，T细胞的特定亚群，例如一种或多种表面标志物阳性细胞或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞，通过正或负选择技术分离。
[0317] 例如，CD3+、CD28+T细胞可以采用CD3/CD28连接的磁珠(例如， M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器)来正选择。
[0318] 在一些实施方式中，分离通过如下方式进行：通过正选择富集具体细胞群或通过负选择消耗具体细胞群。在一些实施方式中，正或负选择通过将细胞与特异性地结合至一种或多种表面标志物的一种或多种抗体或其它结合试剂孵育来完成，所述一种或多种表面标志物分别在正选择或负选择的细胞上表达(标志物+)或以相对较高水平表达(标志物高)。
[0319] 在一些实施方式中，T细胞通过对在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(例如CD14)进行负选择来从PBMC样品分离分离。在一些方面中，使用+ + + +CD4 或CD8 选择步骤来分离辅助性CD4和CD8细胞毒性T细胞。通过针对一种或多种原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标志物进行正或负选择，可将此类CD4+和CD8+群进一步分选成亚群。
[0320] 在一些实施方式中，CD8+细胞针对原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞进行进一步富集或消耗，例如通过基于与对应亚群相关联的表面抗原进行正或负选择。在一些实施方式中，进行针对中心记忆T(TCM)细胞的富集，以增加功效，例如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，在一些方面中，其在此类亚群中特别强健。参见Terakura等.(2012)Blood.1:72–82；Wang等(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方式中，+ +
将TCM-富集的CD8T细胞与CD4T细胞合并以进一步增强功效。
将TCM-富集的CD8T细胞与CD4T细胞合并以进一步增强功效。
[0321] 在实施方式中，记忆T细胞在CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚组中存在。PBMC可以针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分进行富集或消耗，例如采用抗CD8和抗CD62L抗体。
[0322] 在一些实施方式中，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、和/或CD127阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于CD45RA和/或粒酶B表达或高度表达的细胞进行负选择。在一些方面中，针对TCM细胞富集的CD8+群的分离通过如下方式进行：消耗表达CD4、CD14、CD45RA的细胞，和正选择或针对表达CD62L的细胞进行富集。一方面，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集通过如下方式进行：由基于CD4表达选择的细胞的阴性部分起始，其基于CD14和CD45RA的表达进行负选择，和基于CD62L进行正选择。在一些方面中，此类选择同时进行，且在其它方面中，此类选择以某一顺序依次进行。在一些方面中，相同的基于CD4表达的选择步骤用于制备CD8+细胞群或亚群，也用以产生CD4+细胞群或亚群，从而保留来自基于CD4分离的阳性和阴性部分，并任选地在一种或多种进一步正或负选择步骤之后，用于所述方法的后施步骤。
[0323] 在具体实例中，对PBMC样品或其它血液白细胞样品进行CD4+细胞选择，其中保留阴性和阳性部分。然后，基于CD14和CD45RA或CD19的表达对阴性部分进行负选择，并基于中心记忆T细胞特征性标志物，例如CD62L或CCR7、进行正选择，其中，所述正和负选择以某一顺序进行。
[0324] 通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助性CD4+T细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方式中，中心记忆CD4+细胞是CD62L+和+ + - -CD45RO。在一些实施方式中，效应CD4细胞是CD62L和CD45RO。
[0325] 在一个实例中，为了通过负选择对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR，和CD8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质，例如磁珠或顺磁珠，以允许分离用于正和/或负选择的细胞。例如，在一些实施方式中，所述细胞和细胞群采用免疫磁性(或亲和性磁性)分离技术分开(separated)或分离(isolated)(综述参见《分子医学方法》(Methods in Molecular Medicine)，第58卷：代谢研究方法(Metastasis Research Protocols)，第2卷：细胞体外和体内性能(Cell Behavior In Vitro and In Vivo)，第17-25页，S.A.Brooks和
U.Schumacher编 新泽西州托托华的胡玛纳出版社(Humana Press Inc.))。
U.Schumacher编 新泽西州托托华的胡玛纳出版社(Humana Press Inc.))。
[0326] 在一些方面中，使待分离的样品或细胞组合物与较小的可磁化或磁响应性材料(如磁响应性颗粒或微粒，例如顺磁珠(例如，Dynalbeads珠或MACS珠))孵育。所述磁响应性材料(例如，颗粒)一般直接或间接连接至结合伴侣(例如，抗体)，其特异性地结合至某一分子，例如，需要分离(例如需要进行负或正选择)的一种或多种细胞或细胞群上存在的表面标志物。
[0327] 在一些实施方式中，所述磁性颗粒或珠包含磁响应性材料，其结合至特异性的结合部分，例如抗体或其它结合伴侣。有多种熟知的磁响应性材料用于磁性分离方法。合适的磁性颗粒包括描述于Molday，美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中的那些，其通过引用纳入本文。胶体尺寸的颗粒，例如Owen在美国专利号4,795,698和Liberti等在美国专利号5,200,084中描述的那些，是其它示例。
[0328] 孵育一般在一定条件下进行，由此，所述抗体或结合伴侣或分子，例如二抗或其它试剂，其特异性地结合至所述抗体或结合伴侣，其连接至所述磁性颗粒或珠，特异性地结合至所述样品中的细胞上(如果)存在的细胞表面分子。
[0329] 在一些方面中，将所述样品置于磁场中，并且，具有与其连接的磁性响应或可磁化颗粒的那些细胞将被磁铁吸引，并与未标记的细胞分离。对于正选择而言，保留被磁铁吸引的细胞；对于负选择而言，保留不被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面中，在相同选择步骤中进行正和负选择的组合，其中，保留阳性和阴性部分，并进一步处理或进行进一步分离步骤。
[0330] 在某些实施方式中，所述磁响应性颗粒在一抗或其它结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中被覆。在某些实施方式中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标志物具有特异性的一抗的覆层连接至细胞。在某些实施方式中，所述细胞，而非珠，用一抗或结合伴侣标记，然后，添加细胞类型特异性的二抗或其它结合伴侣(例如，链霉亲和素)被覆的磁性颗粒。在某些实施方式中，链霉亲和素被覆的磁性颗粒与生物素化一抗或二抗联用。
[0331] 在一些实施方式中，使所述磁响应性颗粒保留连接至待经后施孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面中，保留所述颗粒连接至用于给予患者的细胞。在一些实施方式中，从所述细胞移去可磁化的或磁响应性颗粒。用于从细胞移去可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括，例如，采用竞争性非标记的抗体、和可磁化颗粒或连接至可切割接头的抗体。在一些实施方式中，所述可磁化颗粒是生物可降解的。
[0332] 在一些实施方式中，所述基于亲和性的选择通过磁性活化的细胞分选(MACS)(加利福尼亚奥本的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))进行。磁性活化的细胞分选
(MACS)系统能够高纯度选择其上连接有磁化的颗粒的细胞。在某些实施方式中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后，依次洗脱非靶标和靶标物质。即，使附接至磁化的颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未附接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以某种方式解放，从而它们可以被洗脱和回收。在某些实施方式中，所述非靶细胞带标记并从异质细胞群消耗。
(MACS)系统能够高纯度选择其上连接有磁化的颗粒的细胞。在某些实施方式中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后，依次洗脱非靶标和靶标物质。即，使附接至磁化的颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未附接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以某种方式解放，从而它们可以被洗脱和回收。在某些实施方式中，所述非靶细胞带标记并从异质细胞群消耗。
[0333] 在某些实施方式中，所述分离(isolation)或分开(separation)采用进行所述方法的分离、细胞制备、分离、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一种或多种的系统、装置或设备来进行。在一些方面中，所述系统用以在封闭或为空菌环境中进行这些步骤中的各个步骤，例如，以使错误、用户处理和/或污染最小化。在一个实例中，所述系统是国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中描述的系统。
[0334] 在一些实施方式中，所述系统或设备在整合或独立系统中，和/或以自动化的或可编程的形式，进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一个或多个，例如，全部。在一些方面中，所述系统或设备包括与所述系统或设备信息连通的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估处理、分离、工程改造和配制步骤的结果，和/或调节处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。
[0335] 在一些方面中，进行所述分离和/或其它步骤使用CliniMACS系统(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotic))进行，例如，以供在封闭和无菌系统中进行临床级别水平的细胞的自动化分离。组件可包括整合的微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵，和各种夹管阀。在一些方面中，整合的计算机控制所述仪器的所有组件，并指示所述系统以标准化的顺序进行重复的步骤。在一些方面中，所述磁性分离单元包括可移动的永久磁铁和用于所述选择柱的支持物(holder)。所述蠕动泵控制通过管组的流速，并且，与夹管阀一起，确保通过所述系统的缓冲液的受控流和细胞的连续悬液。
[0336] 在一些方面中，CliniMACS系统使用以无菌、无热源溶液的形式提供的抗体-偶联的可磁化颗粒。在一些实施方式中，在用磁性颗粒标记细胞之后，所述细胞经清洗以移除过量的颗粒。然后，将细胞制备袋连接至管组，其进一步连接至包含缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预组装的无菌管道组成，包括前置柱和分离柱，并且仅用于单一使用。在分离程序起始之后，所述系统自动化地将所述细胞样品施加至分离柱上。使带标记的细胞保留在柱中，而通过一系列清洗步骤移除未标记的细胞。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是未标记的，并且不被保留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是经标记的，并且被保留在柱中。在一些实施方式中，在移除磁场之后，从所述柱洗脱用于本文所述方法的细胞群，并收集在细胞收集袋中。
[0337] 在一些实施方式中，分离和/或其它步骤采用CliniMACS Prodigy系统(美天旎生物技术公司)进行。在一些方面中，CliniMACS Prodigy系统装配有细胞处理单元，所述细胞处理单元允许自动化清洗和通过离心分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可包括内置摄像机和图像识别软件，其通过识别来源细胞产物的肉眼可见层来确定最优选细胞分级分离终点。例如，外周血被自动化地分离成红细胞、血液白细胞和血浆层。CliniMACS
Prodigy系统还可包括整合的细胞培育腔室，其完成细胞培养方案，例如，细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9):651–660,Terakura等.(2012)Blood.1:72–82,和Wang等.(2012)J Immunother.35(9):689-701。
Prodigy系统还可包括整合的细胞培育腔室，其完成细胞培养方案，例如，细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9):651–660,Terakura等.(2012)Blood.1:72–82,和Wang等.(2012)J Immunother.35(9):689-701。
[0338] 在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过流式细胞术收集和富集(或消耗)，其中针对多重细胞表面标志物被染色的细胞携载于流体中。在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过制备规模(FACS)-分选法收集和富集(或消耗)。在某些实施方式中，本文所述的细胞群通过采用微电机系统(MEMS)芯片联合基于FACS的检测系统来收集和富集(或消耗)(参见例如，WO 2010/033140，Cho等(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等(2008)J Biophoton.1(5):355–376。在这两种情况中，细胞可以用多重标志物标记，以允许以高纯度分离明确界定的T细胞亚组。
[0339] 在一些实施方式中，所述抗体或结合伴侣用一种或多种可检测标志物标记，以促进用于正和/或负选择的分离。例如，分离可基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，将基于抗体或对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的其它结合伴侣的结合所进行的细胞分离携载于流体流中，例如通过荧光活化的细胞分选(FACS)(其包括制备规模(FACS)和/或微电机系统(MEMS)芯片)，例如，与流式细胞术检测系统联合。此类方法允许进行基于多重标志物的同时正和负选择。
[0340] 在一些实施方式中，制备方法包括：冷冻步骤，例如，在分离、孵育和/或工程改造之前或之后，冻存所述细胞。在一些实施方式中，所述冷冻和后施融化步骤移除粒细胞，并且，在某种程度上，移除细胞群中的单核细胞。在一些实施方式中，例如，在清洗步骤以移除血浆和血小板之后，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面中，可采用任何各种已知冷冻溶液和参数。一个实例涉及采用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS或其它合适的细胞冷冻培养基。然后，其用培养基1:1稀释，从而DMSO和HSA的终浓度分别是10％和4％。然后，一般以1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。
[0341] 在一些实施方式中，提供的方法包括培育、孵育、培养，和/或遗传工程改造步骤。例如，在一些实施方式中，提供了用于对消耗的细胞群和培养起始组合物进行孵育和/或工程改造的方法。
[0342] 因此，在一些实施方式中，所述细胞群在培养起始组合物中孵育。可在培养器皿，如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其它容器中进行孵育和/或工程改造。
[0343] 在一些实施方式中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、活化，和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激性试剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成在群中诱导细胞增殖、繁殖、活化，和/或存活以模拟抗原接触，和/或引发细胞用于遗传工程改造，如用于导入重组抗原受体的那些。
[0344] 所述条件可包括如下一种或多种：具体培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和经设计以活化细胞的任何其它物质。
[0345] 在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种物质，例如，配体，其能够活化TCR复合物的胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述物质开启或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号转导级联。此类物质可包括抗体，例如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如，抗CD3、抗CD28，例如，其结合至固体支持物，例如珠，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体。在一些实施方式中，刺激剂包括1L-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL浓度的IL-2。
[0346] 在一些方面中，孵育根据技术，例如授予Riddell等的美国专利号6,040,177，Klebanoff等.(2012)JImmunother.35(9):651–660，Terakura等.(2012)Blood.1:72–82和/或Wang等.(2012)JImmunother.35(9):689-701中所述的那些进行。
[0347] 在一些实施方式中，T细胞群通过如下方式扩增：添加至培养起始组合物饲养层细胞，例如非分裂型外周血单核细胞(PBMC)，(例如，从而针对待扩增的初始群中的各T淋巴细胞，所得细胞群包含至少约5、10、20或40或更多PBMC饲养层细胞)；并孵育所述培养物(例如足以扩增所述数量的T细胞的时间)。在一些方面中，所述非分裂型饲养层细胞可包括γ-辐照的PBMC饲养层细胞。在一些实施方式中，所述PBMC用约3000-3600拉德范围内的γ射线辐照以防止细胞分裂。在一些方面中，所述饲养层细胞在添加T细胞的群之前添加至培养基。
[0348] 在一些实施方式中，所述刺激条件包括适于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。任选地，孵育还可包括添加非分裂型EBV-转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养层细胞。LCL可以用约6000-10000拉德范围内的γ射线辐照。在一些方面中，LCL饲养层细胞以任何合适的量提供，例如LCL饲养层细胞与初始T淋巴细胞的比率是至少约10:1。
[0349] 在实施方式中，通过用抗原刺激天然或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，抗原特异性T细胞系或克隆可针对巨细胞病毒抗原产生，通过从感染的对象分离T细胞并采用相同抗原体外刺激细胞来进行。
[0350] X.组合物和制剂
[0351] 还提供了包括细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，如包含给定剂量或其部分的用于给药的细胞数量的单位剂型组合物。所述药物组合物和制剂一般包括一种或多种任选的药学上可接受的运载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述组合物包括至少一种其它治疗剂。
[0352] 术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含具有待给予该制剂的对象不可接受的毒性的额外成分。
[0353] “药学上可接受的运载体”指，药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对于对象无毒性。药学上可接受的运载体包括但是不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0354] 在一些方面中，运载体的选择部分由特定细胞和/或给药方法来确定。因此，存在多种合适的配方。例如，所述药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol,A.编(1980)。在所用剂量和浓度下，药学上可接受的运载体通常是对受者无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
[0355] 在一些方面中，所述组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在一些方面中，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如，《雷明顿：药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，LWW公司(Lippincott Williams&Wilkins)；第21版(2005年5月1日)。
[0356] 该制剂可包含水溶液。所述制剂或组合物还可包含多于一种活性成分，该活性成分可用于待用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选对所述细胞具有补充活性的那些，其中相应活性剂彼此不产生负面影响。这类活性成分适合以有效用于所需目的的用量联合存在。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，和/或长春新碱。
[0357] 在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量，如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象来监测治疗或预防性功效。所需剂量可以通过单药丸给予所述细胞，通过多药丸给予所述细胞或通过连续输注给予细胞来递送。
[0358] 该细胞和组合物可采用标准给予技术、制剂和/或装置给予。所述细胞的给予可以是自体同源或异源的。例如，免疫抑制细胞或祖细胞可获自一个对象，并给予相同对象或不同的相容对象。外周血衍生的免疫抑制细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射、或胃肠外给药。当给予治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫抑制细胞的药物组合物)时，其通常被配制成单位剂型的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。
[0359] 制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。本文所用的术语“胃肠外”，包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞通过静脉内，腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予对象。
[0360] 在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如，等渗水性溶液、悬液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面中可缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物多少更便于给药，尤其是通过注射。在另一方面，粘性组合物可在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物。
[0361] 可通过将所述细胞纳入溶剂中，如与合适运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等来制备无菌可注射溶液。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、和/或色素，取决于所需的给药和制备途径。在一些方面中，可查阅标准教科书来制备合适制备物。
[0362] 可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、和山梨酸确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质，如单硬脂酸铝和明胶演唱可注射药物形式的吸收。
[0363] 用于体内给药的制剂一般为无菌的。无菌可例如通过无菌滤膜过滤来容易地实现。
[0364] XI.制品
[0365] 还提供了制品，如试剂盒和装置，用于按照提供的用于过继细胞治疗的方法向对象给予细胞，并用于储存和给予该细胞和组合物。
[0366] 制品包括一个或多个容器，一般是多个容器，包装材料，和与一个或多个容器和/或包装结合或其上的标签或包装插页，一般包括向对象给予细胞的说明。
[0367] 容器一般含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。制品一般包括多个容器，各自含有单个单位剂量的细胞。单位剂量可以是以第一剂量的待给予对象的细胞的量或数量或两倍(或更多)于待以第一或后施剂量给予的细胞的数量。其可以是与给药方法相关的给予对象的细胞的最低剂量或最低可能剂量。在一些实施方式中，单位剂量是将按照本发明的方法以单位剂量给予具有热定疾病或病症的任何对象或任何对象的细胞数量或细胞最小数量。例如，在一些方面，单位剂量可包括将给予较低体重和/或较高疾病负荷的对象的细胞的最小量，如以第一剂量向给定对象给予一个或在一些情况中超过一个单位剂量并且在一个或多个后施剂量中向给定对象给予一个或超过一个单位剂量，例如，按照提供的方法。在一些实施方式中，单位剂量中的细胞数是需要以第一剂量给予特定对象，如细胞衍生的对象的表达重组受体或表达CAR的细胞的数量或细胞数。在一些实施方式中，细胞衍生自待通过本文提供的方法治疗或有此需要的对象。
[0368] 在一些实施方式中，单位剂量中的一个或多个包含表达相同受体(例如，CAR)的细胞。在一些方面中，单位剂量中的一个或多个包含表达与另一单位剂量的一个或多个不同的受体(例如，CAR)的细胞。
[0369] 在一些实施方式中，所述容器各自单独包含单位剂量的表达第一或第二或第三等受体的细胞，其包含相同或实质上相同数量的细胞。因此，在一些实施方式中，各容器包含相同或大约或基本相同数量的细胞或表达重组受体的细胞。在一些实施方式中，单位剂量包括小于约1x108、小于约5x107、小于约1x106或小于约5x105个工程改造的细胞、总细胞、T细胞、或PBMC/千克待治疗和/或细胞衍生的对象。在一些实施方式中，各单位剂量含有等于或约2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个工程改造的细胞、总细胞、T细胞、或PBMC。
[0370] 合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和柔性袋如输注袋。在特定实施方式中，容器是袋，例如，柔性袋，如适于向对象输注细胞的那些，例如，柔性塑料或PVC袋，和/或IV溶液袋。在一些实施方式中，袋是可密封和/或能够灭菌的，以提供无菌溶液以及细胞和组合物的递送。在一些实施方式中，容器，例如，袋的容积等于或约或至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、或1000ml容积，如等于或约10至等于或约100mL或者等于或约10至等于或约500mL容积。在一些实施方式中，容器，例如，袋是和/或由在一个或多个不同温度下稳定和/或提供细胞的稳定储存和/或维持的材料制成，如在低温下，例如，低于或约或等于或约-20℃、-80℃、-120℃、135℃和/或适于冷冻保存的温度，和/或其他温度，如适于冻融细胞的温度和体温，如等于或约37℃，以允许在治疗前立即冻融，例如，在对象的地点或治疗地点，例如，在床边。
[0371] 该容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。在一些实施方式中，容器具有一个或多个端口，例如，无菌浸入端口，例如，用于通过管或导管连接至一个或多个管，例如，用于静脉内或其他输注和/或用于出于从其他容器和向其他容器转移的目的连接，如细胞培养和/或储存袋或其他容器。示例性容器包括输注袋、静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可通过注射用针头穿破的塞盖的那些。
[0372] 制品还可包括包装插页或标签，其一片或多片显示使用信息和/或说明。在一些实施方式中，信息或说明显示可以或应该用于治疗特定疾病或病症的内容，和/或提供其说明。标签或包装插页可显示待用于治疗疾病或病症的制品的内容。在一些实施方式中，标签或包装插页提供了治疗对象的说明，例如，细胞已衍生的对象，通过包括给予第一和一个或多个后施剂量的细胞，例如，按照提供的方法的实施方式中的任一个的方法。在一些实施方式中，说明指定了在第一剂量中，给予一个单位剂量，例如，制品的单个单独容器的内容物，之后在指定时间点或指定时间窗内和/或检测到对象中的一个或多个因子或结果的存在或缺失或量或程度之后给予一个或多个后施剂量。
[0373] 在一些实施方式中，说明指定了通过进行第一给予和后施给予向对象给予多个单位剂量。在一些实施方式中，第一给予包括递送包含表达第一受体(例如CAR)的细胞的一个所述单位剂量至对象，并且后施给予包括给予包含表达与给予对象的第一给予相同的受体(例如CAR)的细胞的一个或多个所述单位剂量。
[0374] 在一些方面中，第一给予包括递送包含表达第一受体(例如CAR)的细胞的一个所述单位剂量至对象，并且后施给予包括给予对象包含表达不同受体(例如CAR)的细胞的一个或多个所述单位剂量。在一些实施方式中，患者接受包含表达与第一给予相同受体的细胞的第二给予还是接受包含与第一给予的细胞表达的受体不同的表达受体(例如，CAR)的细胞的第二给予可取决于本文所述方法的任何参数。例如，在一些方面中，例如，其中所述患者已发展针对第一受体的免疫应答，则可给予包含表达与第一受体不同的受体的细胞的单位剂量。
[0375] 在一些实施方式中，说明指定了第二(或其它后施)给予在第一给予之后，例如，第一给予或前施给予的起始之后的至少约28或至少约35天的时间进行。在一些实施方式中，说明指定了后施剂量在已确定所述对象显示针对第一(或其它前施)剂量的细胞表达的受体(例如，CAR)特异性的可检测的适应性宿主免疫应答的时间给予。
[0376] 在一些实施方式中，标签或包装插页或包装包含标识符，以指示从其衍生细胞的对象和/或将待给予的对象的身份。在自体移植的情况下，细胞衍生自的对象的身份与待给予细胞的对象的身份相同。因此，识别信息可以指定将细胞给予特定患者，例如细胞原始来源的细胞。这样的信息可以以条形码或其他编码标识符的形式存在于包装材料和/或标签中，或者可以指示对象的姓名和/或其他识别特征。
[0377] 在一些实施方式中，制品包括一个或多个，通常为含有包含细胞的组合物的多个容器，例如其单独的单位剂量形式，并且还包括其中包含组合物的一个或多个其他容器，其该组合物包含其他试剂，例如细胞毒性或其它治疗剂，其例如将与细胞组合，例如，同时或以任何顺序一次给予。或者或此外，所述制品还可包括包含药学上可接受的缓冲剂的另一或相同容器。其还可包括其它材料，例如其它缓冲剂、稀释剂、滤器、管、针头，和/或注射器。
[0378] 术语“包装插页”指治疗性产品的商品包装中常包括的说明书，所述说明书包含关于这类治疗性产品使用的说明、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
[0379] 除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
[0380] 如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种或一个”或“一种(个)或多种(个)”。应理解本文中所述的方面和变化形式包括：“由(这些方面和变化形式)组成”和/或“基本由(这些方面和变化形式)组成”。
[0381] 本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。这适用而无关范围的宽度。
[0382] 本文使用的术语约摂是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。本文中述及“约”值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的实施方式。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。
[0383] 本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物，包括细胞，的任何混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
[0384] 本文中所用的，称细胞或细胞群针对具体标志物呈“阳性”指，所述细胞上或细胞中具体标志物(通常是表面标志物)的可检测的存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或显著高于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
[0385] 本文中所用的，称细胞或细胞群针对具体标志物呈“阴性”指，所述细胞上或细胞中具有具体标志物，通常是表面标志物，的基本可检测的不存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
[0386] 本文所用术语“载体”指一种核酸分子，所述核酸分子能够增殖其连接的另一核酸。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，以及被导入已将其导入的宿主细胞基因组的载体。某些载体能够引导与其操作性连接的核酸的表达。所述载体在本文中称为“表达载体”。
[0387] 本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据集，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或其它情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
[0388] 本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。
[0389] XII.示例性实施方式
[0390] 提供的实施方式包括：
[0391] 1.一种治疗方法，其包括：
[0392] (a)给予对象表达第一嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和
[0393] (b)给予所述对象表达第二CAR的细胞，其不同于所述第一CAR，并且该细胞不表达第一CAR。
[0394] 2.如实施方式1所述的方法，其中，在给予表达第二CAR的细胞时或给予表达第二CAR的细胞之前即刻：
[0395] 所述对象显示对第一CAR具有特异性的可检测的体液和/或细胞介导的免疫应答；
[0396] 所述疾病或病症顽固地存在于所述对象中；和/或
[0397] 所述疾病或病症已在所述对象中复发。
[0398] 3.如实施方式1或实施方式2所述的方法，其中：
[0399] 表达第一CAR的细胞的给予和表达第二CAR的细胞的给予之间的时间是至少约28天、至少约35天、至少约42天、至少约49天，和/或至少约60天。
[0400] 4.如实施方式1-3中任一项所述的方法，其中，所述第一CAR包含所述第二CAR中不存在的至少一个免疫反应性表位。
[0401] 5.如实施方式4所述的方法，其中：
[0402] 所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个B细胞表位；和/或
[0403] 所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个T细胞表位。
[0404] 6.如实施方式1-5中任一项所述的方法，其中：
[0405] 在(a)中的所述给予之前，所述对象未曾接受表达第一CAR的细胞的剂量；和/或
[0406] 在(b)中的所述给予之前，所述对象未曾接受表达第二CAR的细胞的剂量。
[0407] 7.如实施方式1-6中任一项所述的方法，其中，第二CAR特异性地结合至与第一CAR所结合的相同的抗原。
[0408] 8.如实施方式1-7中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是肿瘤。
[0409] 9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。
[0410] 10.如实施方式9所述的方法，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的相同表位。
[0411] 11.如实施方式7-10中任一项所述的方法，其中，第一CAR与第二CAR竞争结合至所述抗原。
[0412] 12.如实施方式7-9和11中任一项所述的方法，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的不同表位。
[0413] 13.如实施方式1-12中任一项所述的方法，其中：
[0414] 相较于由第一CAR结合的抗原，第二CAR特异性地结合至与所述疾病或病症相关联的另一抗原；或
[0415] 第二CAR不特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原。
[0416] 14.如实施方式9-13中任一项所述的方法，其中，第一CAR特异性地结合至与B细胞恶性肿瘤相关联的抗原，其选自CD19、CD22或CD20，且第二CAR结合至选自CD19、CD22或CD20的、与由第一CAR结合的抗原不同的，另一抗原。
[0417] 15.如实施方式14所述的方法，其中，第一CAR特异性地结合至CD19且第二CAR特异性地结合至CD22。
[0418] 16.如实施方式1-6中任一项所述的方法，其中，表达第二CAR的细胞不包含特异性地结合至由第一CAR特异性结合的所述抗原的受体。
[0419] 17.如实施方式1-16中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予的约30天内、约60天内或约90天内，所述对象不显示可检测的体液或细胞介导的针对第二CAR的免疫应答。
[0420] 18.如实施方式1-17中任一项所述的方法，其中，第二CAR相较于第一CAR包含氨基酸序列中的一个或多个差异。
[0421] 19.如实施方式18所述的方法，其中：
[0422] 所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生可检测的免疫应答所针对的第一CAR的区域相比，至少一个氨基酸序列差异；和/或
[0423] 所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生的可检测的免疫应答所针对的第一CAR的各区域相比，至少一个氨基酸序列差异。
[0424] 20.如实施方式1-19中任一项所述的方法，其还包括，在给予表达第二CAR的细胞之前，检测所述对象中CAR特异性免疫应答的存在。
[0425] 21.如实施方式20所述的方法，其中，所述检测包括鉴定所述对象显示特异性免疫应答所针对的第一CAR的至少一个区域。
[0426] 22.如实施方式21所述的方法，其中，与所述免疫应答特异性针对的第一CAR的所述区域相比，第二CAR包含一个或多个氨基酸序列差异。
[0427] 23.如实施方式19-22中任一项所述的方法，其中，第一CAR的所述区域包含选自下组的一种或多种CAR部分中的区域：scFv部分、接头部分、非所述对象内源性的氨基酸序列、源自与所述对象不同物种的序列，和/或两个CAR结构域之间的接合部分；和/或，其中第一CAR的所述区域是在位于两个结构域之间的接合部分的各一侧包含氨基酸的接合区域。
[0428] 24.如实施方式23所述的方法，其中：
[0429] 所述区域包含所述scFv部分内的框架区(FR)，
[0430] 所述区域包含重链FR序列
[0431] 所述区域包含重链CDR序列，
[0432] 所述区域包含轻链FR序列，和/或
[0433] 所述区域包含轻链CDR序列。
[0434] 25.如实施方式24所述的方法，其中，所述区域包含接合区域，其中，所述接合区域包含紧邻接合第一CAR的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端的至多15个连续的氨基酸，和/或紧邻所述接合部分的N末端的至多15连续的氨基酸，和，任选地还包含所述接合部分。
[0435] 26.如实施方式25所述的方法，其中：
[0436] 第一结构域和/或第二结构域包含天然或内源性人类蛋白质的结构域，或与天然或内源性人类蛋白质的结构域或其功能部分具有100％相同性的结构域，其中，所述天然或内源性人类蛋白质任选地被待治疗的对象表达；和/或
[0437] 第一结构域和/或第二结构域包含胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或胞内信号转导结构域，其胞内信号转导结构域任选地是共刺激信号转导结构域或活化性胞质信号转导结构域。
[0438] 27.如实施方式26所述的方法，其中，第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中，或不存在于单一天然或内源性人类蛋白质或多肽中。
[0439] 28.如实施方式26或实施方式27所述的方法，其中，第一结构域和第二结构域分别是或包含，胞外配体结合结构域和铰链结构域、铰链结构域和跨膜结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号转导结构域、以及胞内共刺激信号转导结构域和活化性胞质信号转导结构域，其可包括所述结构域的功能部分。
[0440] 29.如实施方式26-28中任一项所述的方法，其中，第一结构域是或包含跨膜结构域或其功能部分，且第二结构域是或包含共刺激信号转导结构域或其功能部分。
[0441] 30.如实施方式29所述的方法，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其功能部分，并且，所述共刺激信号转导结构域是4-1BB信号转导结构域或其功能部分。
[0442] 31.如实施方式26-30中任一项所述的方法，其中，第二CAR包含：
[0443] 与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和/或与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；
[0444] 与第一结构域序列相同的结构域，和与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；或
[0445] 与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和与第二结构域序列相同的结构域，
[0446] 其中，相较于包含经修饰的接合区域的部分中的第一CAR的第一结构域和第二结构域之一或两者，所述存在于第二CAR中的结构域之一或两者包含至少一个或多个氨基酸序列差异。
[0447] 32.如实施方式29-31中任一项所述的方法，其中：
[0448] 第一CAR包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域，其一起包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:5至少95％相同的氨基酸序列的其变体或功能部分，并且还包含所述接合区域；和
[0449] 第二CAR包含相较于第一CAR经修饰的序列，所述修饰在包含残基13和42之间或15和40之间的序列的部分中包含至少一个氨基酸序列差异，参考SEQ ID NO:5所示编号。
[0450] 33.如实施方式18-32中任一项所述的方法，其中，第二CAR相较于第一CAR包含不多于20个氨基酸的序列差异，或，第二CAR与第一CAR包含至少95％氨基酸序列相同性。
[0451] 34.如实施方式18-33中任一项所述的方法，其中，包含所述一个或多个序列差异至少之一的第二CAR的区域：
[0452] 包含较少的8-15个氨基酸部分，相较于第一CAR的对应区域，其对人白细胞抗原(HLA)分子具有小于1000nM的IC50的结合亲和性；或
[0453] 对人白细胞抗原(HLA)分子具有的结合亲和性低于具有所述参比嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对于相同HLA分子具有的结合亲和性；或
[0454] 具有所述区域内的至少一个肽片段的结合亲和性，或者具有所述区域中8-15个氨基酸部分的序列的全部肽片段对于人白细胞抗原(HLA)分子具有减少的平均结合亲和性，相较于第一CAR的对应区域。
[0455] 35.如实施方式18-34中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予之后，所述对象中产生对于第二CAR的对应区域的减少的可检测的免疫应答，其中，相较于在给予所述对象第一CAR之后在所述对象中产生的免疫应答所针对的第一CAR的所述区域，第二CAR的对应区域包含至少一个氨基酸序列差异。
[0456] 36.如实施方式1-17中任一项所述的方法，其中：
[0457] 第一CAR包含CD28跨膜结构域或其功能部分和4-1BB共刺激信号转导结构域或其功能部分；和
[0458] 第二CAR包含与第一CAR中的所述结构域之一或两者不同的跨膜结构域和共刺激信号转导结构域。
[0459] 37.如实施方式1-36中任一项所述的方法，其中，第二CAR包含与第一CAR的对应区域氨基酸序列相同的至少一个区域。
[0460] 38.如实施方式37所述的方法，其中，所述第一CAR的对应区域是在表达第二CAR的细胞的给予之时所述对象对其不显示可检测的体液或细胞介导的免疫应答的区域。
[0461] 39.如实施方式37或实施方式38所述的方法，其中，所述第一CAR的对应区域包含选自下组的CAR部分中的区域：共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、转导或表达标志物、所述宿主内源性的序列，和/或源自与所述宿主相同的物种的抗体结构域。
[0462] 40.如实施方式1-39中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予之后，所述对象中，表达CAR的细胞的最大数量、表达CAR的细胞随时间的曲线下面积(AUC)，和/或可检测的表达CAR的细胞的持续时间，大于，通过包含替代性的给药方案的方法所实现的情况，所述替代性的给药方案包含进行表达第一CAR的细胞的给予，随后进行表达第一CAR的细胞的第二给予，所述第二给予在与表达第二CAR的细胞的给予相同的时间点进行。
[0463] 41.如实施方式1-40中任一项所述的方法，其中：
[0464] 所述方法导致所述对象的血液中表达CAR的细胞的最大浓度或数量为至少等于或5
约10个表达CAR的细胞/微升，至少50％的外周血单核细胞(PBMC)的总数，至少约1x10 个表达CAR的细胞，或至少1000或至少2000或至少3000或至少4000或至少5000个拷贝的编码CAR的DNA/微克DNA；和/或
约10个表达CAR的细胞/微升，至少50％的外周血单核细胞(PBMC)的总数，至少约1x10 个表达CAR的细胞，或至少1000或至少2000或至少3000或至少4000或至少5000个拷贝的编码CAR的DNA/微克DNA；和/或
[0465] 在表达第二CAR的细胞的给予的起始之后的第30天、第60天或第90天，所述对象的血液或血清中可检测到表达CAR的细胞；和/或
[0466] 在表达第二CAR的细胞的给予的起始之后的第30天、第60天或第90天，所述对象的血液包含至少20％的表达CAR的细胞、至少10个表达CAR的细胞/微升或至少1x104个表达CAR的细胞。
[0467] 42.如实施方式1-41中任一项所述的方法，其中，所述表达第一CAR的细胞的剂量和/或所述表达第二CAR的细胞的剂量独立地包含一定量的细胞，该量足以减小所述对象中的疾病或病症的负荷。
[0468] 43.如实施方式1-42中任一项所述的方法，其中，表达第一CAR的细胞的给予和/或表达第二CAR的细胞的给予发挥减小所述对象中的疾病或病症的负荷的作用，由此治疗所述疾病或病症。
[0469] 44.如实施方式1-43中任一项所述的方法，其中，所述细胞是T细胞。
[0470] 45.如实施方式1-44中任一项所述的方法，其中，所述T细胞对于所述对象是自体的。
[0471] 46.一种治疗方法，所述方法包括向对象给予细胞，其中，所述细胞不表达第一嵌合抗原受体(CAR)但表达第二CAR，其中：
[0472] 所述对象先前已接受表达第一CAR的细胞的给予；
[0473] 所述第一CAR特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和
[0474] 所述第二CAR特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原或与所述对象中的疾病或病症相关联的不同抗原。
[0475] 47.如实施方式46所述的方法，其中，在给予表达第二CAR的细胞之前，给予所述对象表达第一CAR的细胞。
[0476] 48.如实施方式46-47中任一项所述的方法，其中，在给予表达第二CAR的细胞时或给予表达第二CAR的细胞之前即刻：
[0477] 所述对象显示对第一CAR具有特异性的可检测的体液和/或细胞介导的免疫应答；
[0478] 所述疾病或病症顽固地存在于所述对象中；和/或
[0479] 所述疾病或病症已在所述对象中复发。
[0480] 49.如实施方式46-48中任一项所述的方法，其中：
[0481] 表达第一CAR的细胞的给予和表达第二CAR的细胞的给予之间的时间是至少约28天、至少约35天、至少约42天、至少约49天，和/或至少约60天。
[0482] 50.如实施方式46-49中任一项所述的方法，其中，所述第一CAR包含所述第二CAR中不存在的至少一个免疫反应性表位。
[0483] 51.如实施方式50所述的方法，其中：
[0484] 所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个B细胞表位；和/或
[0485] 所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个T细胞表位。
[0486] 52.如实施方式46-51中任一项所述的方法，其中，所述对象在所述给予之前未曾接受表达第二CAR的细胞的剂量。
[0487] 53.如实施方式46-52中任一项所述的方法，其中，第二CAR特异性地结合至与第一CAR相同的抗原。
[0488] 54.如实施方式46-53中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是肿瘤。
[0489] 55.如权利要求46-54中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。
[0490] 56.如实施方式53所述的方法，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的相同表位。
[0491] 57.如实施方式53-56中任一项所述的方法，其中，第一CAR与第二CAR竞争结合至所述抗原。
[0492] 58.实施方式53-55和57中任一项所述的方法，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的不同表位。
[0493] 59.如实施方式46-58中任一项所述的方法，其中：
[0494] 相较于由第一CAR结合的抗原，第二CAR特异性地结合至与所述疾病或病症相关联的另一抗原；或
[0495] 第二CAR不特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原。
[0496] 60.如实施方式55-59中任一项所述的方法，其中，第一CAR特异性地结合至与B细胞恶性肿瘤相关联的抗原，其选自CD19、CD22或CD20，且第二CAR结合至选自CD19、CD22或CD20的、与由第一CAR结合的抗原不同的，另一抗原。
[0497] 61.如实施方式60所述的方法，其中，第一CAR特异性地结合至CD19且第二CAR特异性地结合至CD22。
[0498] 62.如实施方式46-52中任一项所述的方法，其中，表达第二CAR的细胞不包含特异性地结合至由第一CAR特异性结合的所述抗原的受体。
[0499] 63.如实施方式46-62中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予的约30天内、约60天内或约90天内，所述对象不显示可检测的体液或细胞介导的针对第二CAR的免疫应答。
[0500] 64.如实施方式46-63中任一项所述的方法，其中，第二CAR相较于第一CAR包含氨基酸序列中的一个或多个差异。
[0501] 65.如实施方式64所述的方法，其中：
[0502] 所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生可检测的免疫应答所针对的第一CAR的区域相比，至少一个氨基酸序列差异；和/或
[0503] 所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生的可检测的免疫应答所针对的第一CAR的各区域相比，至少一个氨基酸序列差异。
[0504] 66.如实施方式46-65中任一项所述的方法，其还包括，在给予表达第二CAR的细胞之前，检测所述对象中CAR特异性免疫应答的存在。
[0505] 67.如实施方式66所述的方法，其中，所述检测包括鉴定所述对象显示特异性免疫应答所针对的第一CAR的至少一个区域。
[0506] 68.如实施方式67所述的方法，其中，与所述免疫应答特异性针对的第一CAR的所述区域相比，第二CAR包含一个或多个氨基酸序列差异。
[0507] 69.如实施方式65-68中任一项所述的方法，其中，第一CAR的所述区域包含选自下组的一种或多种CAR部分中的区域：scFv部分、接头部分、非所述对象内源性的氨基酸序列、源自与所述对象不同物种的序列，和/或两个CAR结构域之间的接合部分；和/或，其中第一CAR的所述区域是在位于两个结构域之间的接合部分的各一侧包含氨基酸的接合区域。
[0508] 70.如实施方式69所述的方法，其中：
[0509] 所述区域包含所述scFv部分内的框架区(FR)，
[0510] 所述区域包含重链FR序列
[0511] 所述区域包含重链CDR序列，
[0512] 所述区域包含轻链FR序列，和/或
[0513] 所述区域包含轻链CDR序列。
[0514] 71.如实施方式69所述的方法，其中，所述区域包含接合区域，其中，所述接合区域包含紧邻接合第一CAR的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端的至多15个连续的氨基酸，和/或紧邻所述接合部分的N末端的至多15连续的氨基酸，和，任选地还包含所述接合部分。
[0515] 72.如实施方式71所述的方法，其中：
[0516] 第一结构域和/或第二结构域包含天然或内源性人类蛋白质的结构域，或与天然或内源性人类蛋白质的结构域或其功能部分具有100％相同性的结构域，其中，所述天然或内源性人类蛋白质任选地被待治疗的对象表达；和/或
[0517] 第一结构域和/或第二结构域包含胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或胞内信号转导结构域，其胞内信号转导结构域任选地是共刺激信号转导结构域或活化性胞质信号转导结构域。
[0518] 73.如实施方式72所述的方法，其中，第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中，或不存在于单一天然或内源性人类蛋白质或多肽中。
[0519] 74.如实施方式72或实施方式73所述的方法，其中，第一结构域和第二结构域分别是或包含，胞外配体结合结构域和铰链结构域、铰链结构域和跨膜结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号转导结构域、以及胞内共刺激信号转导结构域和活化性胞质信号转导结构域，其可包括所述结构域的功能部分。
[0520] 75.如实施方式72-74中任一项所述的方法，其中，第一结构域是或包含跨膜结构域或其功能部分，且第二结构域是或包含共刺激信号转导结构域或其功能部分。
[0521] 76.如实施方式75所述的方法，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其功能部分，并且，所述共刺激信号转导结构域是4-1BB信号转导结构域或其功能部分。
[0522] 77.如实施方式72-76中任一项所述的方法，其中，第二CAR包含：
[0523] 与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和/或与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；
[0524] 与第一结构域序列相同的结构域，和与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；或
[0525] 与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和与第二结构域序列相同的结构域，
[0526] 其中，相较于包含经修饰的接合区域的部分中的第一CAR的第一结构域和第二结构域之一或两者，所述存在于第二CAR中的结构域之一或两者包含至少一个或多个氨基酸序列差异。
[0527] 78.如实施方式75-77中任一项所述的方法，其中：
[0528] 第一CAR包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域，其一起包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:5至少95％相同的氨基酸序列的其变体或功能部分，并且还包含所述接合区域；和
[0529] 第二CAR包含相较于第一CAR经修饰的序列，所述修饰在包含残基13和42之间或15和40之间的序列的部分中包含至少一个氨基酸序列差异，参考SEQ ID NO:5所示编号。
[0530] 79.如实施方式64-78中任一项所述的方法，其中，第二CAR相较于第一CAR包含不多于20个氨基酸的序列差异，或，第二CAR与第一CAR包含至少95％氨基酸序列相同性。
[0531] 80.如实施方式64-79中任一项所述的方法，其中，包含所述一个或多个序列差异至少之一的第二CAR的区域：
[0532] 包含较少的8-15个氨基酸部分，相较于第一CAR的对应区域，其对人白细胞抗原(HLA)分子具有小于1000nM的IC50的结合亲和性；或
[0533] 对人白细胞抗原(HLA)分子具有的结合亲和性低于具有所述参比嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对于相同HLA分子具有的结合亲和性；或
[0534] 具有所述区域内的至少一个肽片段的结合亲和性，或者具有所述区域中8-15个氨基酸部分的序列的全部肽片段对于人白细胞抗原(HLA)分子具有减少的平均结合亲和性，相较于第一CAR的对应区域。
[0535] 81.如实施方式64-80中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予之后，所述对象中产生对于第二CAR的对应区域的减少的可检测的免疫应答，其中，相较于在给予所述对象第一CAR之后在所述对象中产生的免疫应答所针对的第一CAR的所述区域，第二CAR的对应区域包含至少一个氨基酸序列差异。
[0536] 82.实施方式46-63中任一项所述的方法，其中：
[0537] 第一CAR包含CD28跨膜结构域或其功能部分和4-1BB共刺激信号转导结构域或其功能部分；和
[0538] 第二CAR包含与第一CAR中的所述结构域之一或两者不同的跨膜结构域和共刺激信号转导结构域。
[0539] 83.如实施方式46-82中任一项所述的方法，其中，第二CAR包含与第一CAR的对应区域氨基酸序列相同的至少一个区域。
[0540] 84.如实施方式83所述的方法，其中，所述第一CAR的对应区域是在表达第二CAR的细胞的给予之时所述对象对其不显示可检测的体液或细胞介导的免疫应答的区域。
[0541] 85.如实施方式83或实施方式84所述的方法，其中，所述第一CAR的对应区域包含选自下组的CAR部分中的区域：共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、转导或表达标志物、所述宿主内源性的序列，和/或源自与所述宿主相同的物种的抗体结构域。
[0542] 86.如实施方式46-85中任一项所述的方法，其中，在表达第二CAR的细胞的给予之后，所述对象中，表达CAR的细胞的最大数量、表达CAR的细胞随时间的曲线下面积(AUC)，和/或可检测的表达CAR的细胞的持续时间，大于，通过包含替代性的给药方案的方法所实现的情况，所述替代性的给药方案包含进行表达第一CAR的细胞的给予，随后进行表达第一CAR的细胞的第二给予，所述第二给予在与表达第二CAR的细胞的给予相同的时间点进行。
[0543] 87.如实施方式46-86中任一项所述的方法，其中：
[0544] 所述方法导致所述对象的血液中表达CAR的细胞的最大浓度或数量为至少等于或约10个表达CAR的细胞/微升，至少50％的外周血单核细胞(PBMC)的总数，至少约1x105个表达CAR的细胞，或至少1000或至少2000或至少3000或至少4000或至少5000个拷贝的编码CAR的DNA/微克DNA；和/或
[0545] 在表达第二CAR的细胞的给予的起始之后的第30天、第60天或第90天，所述对象的血液或血清中可检测到表达CAR的细胞；和/或
[0546] 在表达第二CAR的细胞的给予的起始之后的第30天、第60天或第90天，所述对象的血液包含至少20％的表达CAR的细胞、至少10个表达CAR的细胞/微升或至少1x104个表达CAR的细胞。
[0547] 88.如实施方式46-87中任一项所述的方法，其中，所述表达第一CAR的细胞的剂量和/或所述表达第二CAR的细胞的剂量独立地包含一定量的细胞，该量足以减小所述对象中的疾病或病症的负荷。
[0548] 89.如实施方式46-88中任一项所述的方法，其中，表达第一CAR的细胞的给予和/或表达第二CAR的细胞的给予发挥减小所述对象中的疾病或病症的负荷的作用，由此治疗所述疾病或病症。
[0549] 90.如实施方式46-89中任一项所述的方法，其中，所述细胞是T细胞。
[0550] 91.如实施方式46-90中任一项所述的方法，其中，所述T细胞对于所述对象是自体的。
[0551] 92.包含表达第二嵌合抗原受体(CAR)的细胞的组合物在制备治疗先前用表达第一嵌合抗原受体(CAR)的细胞治疗过的对象的疾病或病症的药物中的应用，其中：
[0552] 第一CAR特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和
[0553] 第二CAR特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原或与所述疾病或病症相关联的不同抗原。
[0554] 93.一种组合物，其包含表达第二嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其用于治疗先前用第一嵌合受体(CAR)治疗过的对象中的疾病或病症，其中：
[0555] 第一CAR特异性地结合至与所述对象中的疾病或病症相关联的抗原；和
[0556] 第二CAR特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原或与所述疾病或病症相关联的不同抗原。
[0557] 94.如实施方式92所述的应用或如实施方式93所述的组合物，其中，所述应用用于对象，所述对象：
[0558] 显示对第一CAR具有特异性的可检测的体液和/或细胞介导的免疫应答；
[0559] 其中，在表达第一CAR的细胞的给予之后，所述疾病或病症顽固地存在于所述对象中；和/或
[0560] 其中，在表达第一CAR的细胞的给予之后，所述疾病或病症已在所述对象中复发。
[0561] 95.如实施方式92-94中任一项所述的应用或组合物，其中，所述组合物用于
[0562] 在表达第一CAR的细胞的给予之后至少约28天、至少约35天、至少约42天、至少约49天，和/或至少约60天。
[0563] 96.如实施方式92-95中任一项所述的应用或组合物，其中，所述第一CAR包含所述第二CAR中不存在的至少一个免疫反应性表位。
[0564] 97.如实施方式96所述的应用或组合物，其中：
[0565] 所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个B细胞表位；和/或
[0566] 所述至少一个免疫反应性表位包含至少一个T细胞表位。
[0567] 98.如实施方式92-97中任一项所述的应用或组合物，其中，所述对象在所述应用之前未曾接受表达第二CAR的细胞的剂量。
[0568] 99.如实施方式92-98中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR特异性地结合至与第一CAR相同的抗原。
[0569] 100.如实施方式92-99中任一项所述的应用或组合物，其中，所述疾病或病症是肿瘤。
[0570] 101.如实施方式92-100中任一项所述的应用或组合物，其中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。
[0571] 102.如实施方式56-101中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的相同表位。
[0572] 103.如实施方式99-102中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR与第二CAR竞争结合至所述抗原。
[0573] 104.如实施方式99-101和103中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR和第二CAR特异性地结合至所述抗原的不同表位。
[0574] 105.如实施方式92-98中任一项所述的应用或组合物，其中：
[0575] 相较于由第一CAR结合的抗原，第二CAR特异性地结合至与所述疾病或病症相关联的另一抗原；或
[0576] 第二CAR不特异性地结合至由第一CAR特异性结合的抗原。
[0577] 106.如实施方式101-105中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR特异性地结合至与B细胞恶性肿瘤相关联的抗原，其选自CD19、CD22或CD20，且第二CAR结合至选自CD19、CD22或CD20的、与由第一CAR结合的抗原不同的，另一抗原。
[0578] 107.如实施方式106所述的应用或组合物，其中，第一CAR特异性地结合至CD19且第二CAR特异性地结合至CD22。
[0579] 108.如实施方式92-98中任一项所述的应用或组合物，其中，表达第二CAR的细胞不包含特异性地结合至由第一CAR特异性结合的所述抗原的受体。
[0580] 109.如实施方式92-108中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR的应用在其给予所述对象约30天内、约60天内，或约90天内，不导致可检测的体液或细胞介导的针对第二CAR的免疫应答。
[0581] 110.如实施方式92-109中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR相较于第一CAR包含氨基酸序列中的一个或多个差异。
[0582] 111.如实施方式110所述的应用或组合物，其中：
[0583] 所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生可检测的免疫应答所针对的第一CAR的区域相比，至少一个氨基酸序列差异；和/或
[0584] 所述一个或多个差异包含，与表达第一CAR的细胞的给予之后所述对象中产生的可检测的免疫应答所针对的第一CAR的各区域相比，至少一个氨基酸序列差异。
[0585] 112.如实施方式92-11中任一项所述的应用或组合物，其中，所述对象是其中已在所述对象中检测到针对第一CAR的CAR特异性免疫应答的对象。
[0586] 113.如实施方式112所述的应用或组合物，其中，所述检测包括鉴定所述对象显示特异性免疫应答所针对的第一CAR的至少一个区域。
[0587] 114.如实施方式113所述的应用或组合物，其中，与所述免疫应答特异性针对的第一CAR的所述区域相比，第二CAR包含一个或多个氨基酸序列差异。
[0588] 115.如实施方式111-114中任一项所述的应用或组合物，其中，第一CAR的所述区域包含选自下组的一种或多种CAR部分中的区域：scFv部分、接头部分、非所述对象内源性的氨基酸序列、源自与所述对象不同物种的序列，和/或两个CAR结构域之间的接合部分；和/或，其中第一CAR的所述区域是在位于两个结构域之间的接合部分的各一侧包含氨基酸的接合区域。
[0589] 116.如实施方式115所述的应用或组合物，其中：
[0590] 所述区域包含所述scFv部分内的框架区(FR)，
[0591] 所述区域包含重链FR序列
[0592] 所述区域包含重链CDR序列，
[0593] 所述区域包含轻链FR序列，和/或
[0594] 所述区域包含轻链CDR序列。
[0595] 117.如实施方式115所述的应用或组合物，其中，所述区域包含接合区域，其中，所述接合区域包含紧邻接合第一CAR的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端的至多15个连续的氨基酸，和/或紧邻所述接合部分的N末端的至多15连续的氨基酸，和，任选地还包含所述接合部分。
[0596] 118.如实施方式117所述的应用或组合物，其中：
[0597] 第一结构域和/或第二结构域包含天然或内源性人类蛋白质的结构域，或与天然或内源性人类蛋白质的结构域或其功能部分具有100％相同性的结构域，其中，所述天然或内源性人类蛋白质任选地被待治疗的对象表达；和/或
[0598] 第一结构域和/或第二结构域包含胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或胞内信号转导结构域，其胞内信号转导结构域任选地是共刺激信号转导结构域或活化性胞质信号转导结构域。
[0599] 119.如实施方式117或实施方式118所述的应用或组合物，其中，第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中，或不存在于单一天然或内源性人类蛋白质或多肽中。
[0600] 120.如实施方式117-119中任一项所述的应用或组合物，其中，第一结构域和第二结构域分别是或包含，胞外配体结合结构域和铰链结构域、铰链结构域和跨膜结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号转导结构域、以及胞内共刺激信号转导结构域和活化性胞质信号转导结构域，其可包括所述结构域的功能部分。
[0601] 121.如实施方式117-120中任一项所述的应用或组合物，其中，第一结构域是或包含跨膜结构域或其功能部分，且第二结构域是或包含共刺激信号转导结构域或其功能部分。
[0602] 122.如实施方式121所述的应用或组合物，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其功能部分，并且，所述共刺激信号转导结构域是4-1BB信号转导结构域或其功能部分。
[0603] 123.如实施方式117-122中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR包含：
[0604] 与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和/或与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；
[0605] 与第一结构域序列相同的结构域，和与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；或
[0606] 与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和与第二结构域序列相同的结构域，
[0607] 其中，相较于包含经修饰的接合区域的部分中的第一CAR的第一结构域和第二结构域之一或两者，所述存在于第二CAR中的结构域之一或两者包含至少一个或多个氨基酸序列差异。
[0608] 124.如实施方式121-132中任一项所述的应用或组合物，其中：
[0609] 第一CAR包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域，其一起包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:5至少95％相同的氨基酸序列的其变体或功能部分，并且还包含所述接合区域；和
[0610] 第二CAR包含相较于第一CAR经修饰的序列，所述修饰在包含残基13和42之间或15和40之间的序列的部分中包含至少一个氨基酸序列差异，参考SEQ ID NO:5所示编号。
[0611] 125.如实施方式110-124中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR相较于第一CAR包含不多于20个氨基酸的序列差异，或，第二CAR与第一CAR包含至少95％氨基酸序列相同性。
[0612] 126.如实施方式110-125中任一项所述的应用或组合物，其中，包含所述一个或多个序列差异至少之一的第二CAR的区域：
[0613] 包含较少的8-15个氨基酸部分，相较于第一CAR的对应区域，其对人白细胞抗原(HLA)分子具有小于1000nM的IC50的结合亲和性；或
[0614] 对人白细胞抗原(HLA)分子具有的结合亲和性低于具有所述参比嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对于相同HLA分子具有的结合亲和性；或
[0615] 具有所述区域内的至少一个肽片段的结合亲和性，或者具有所述区域中8-15个氨基酸部分的序列的全部肽片段对于人白细胞抗原(HLA)分子具有减少的平均结合亲和性，相较于第一CAR的对应区域。
[0616] 127.如实施方式110-126中任一项所述的应用或组合物，其中，所述第二CAR的应用发挥减小所述对象中产生的针对第二CAR的对应区域的可检测的免疫应答的作用，其中，相较于在给予所述对象第一CAR之后所述对象中产生的免疫应答产生所针对的第一CAR中的所述区域，所述第二CAR的对应区域包含至少一个氨基酸序列差异。
[0617] 128.如实施方式92-113中任一项所述的应用或组合物，其中：
[0618] 第一CAR包含CD28跨膜结构域或其功能部分和4-1BB共刺激信号转导结构域或其功能部分；和
[0619] 第二CAR包含与第一CAR中的所述结构域之一或两者不同的跨膜结构域和共刺激信号转导结构域。
[0620] 129.如实施方式92-128中任一项所述的应用或组合物，其中，第二CAR包含与第一CAR的对应区域氨基酸序列相同的至少一个区域。
[0621] 130.如实施方式129所述的应用或组合物，其中，所述第一CAR的对应区域是在表达第二CAR的细胞的给予之时所述对象对其不显示可检测的体液或细胞介导的免疫应答的区域。
[0622] 131.如实施方式129或实施方式130所述的应用或组合物，其中，所述第一CAR的对应区域包含选自下组的CAR部分中的区域：共刺激结构域、包含ITAM的结构域、跨膜结构域、转导或表达标志物、所述宿主内源性的序列，和/或源自与所述宿主相同的物种的抗体结构域。
[0623] XIII.实施例
[0624] 下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。
[0625] 实施例1：转基因产物特异性宿主免疫应答的分析
[0626] 治疗前和治疗后外周血液单核细胞(PBMC)样品获自患有B细胞恶性肿瘤的、用表达CD19特异性CAR的自体同源T细胞治疗的四个(4)对象。CAR包括源自鼠抗体的抗
CD19scFv、铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内信号转导结构域、CD3-ζ胞内信号转导结构域、T2A结构域，和截短的EGFR(EGFRt)部分。
CD19scFv、铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内信号转导结构域、CD3-ζ胞内信号转导结构域、T2A结构域，和截短的EGFR(EGFRt)部分。
[0627] 评估获自所述对象的输注前和输注后(第42天)PBMC，以检测特异性抗CAR免疫应答的存在或不存在，该检测基本如下列文献所述，Berger等.Blood.2006年3月；107(6):
2294-2302，Berger等.J Virol.2001年1月75(2):799-808，Riddell等.Nature
Medicine.1996年2月2(2):216-223，Berger等.Blood.2005年2月105(4):1640-1647。简言之，PBMC(响应物)用自体同源γ辐照的细胞体外刺激，所述细胞转导有由给予的细胞表达的CAR(刺激物处于1:1或2:1的响应物-刺激物比例)。然后，在铬释放试验中评估，培养物的针对自体同源51Cr标记的CAR-转导的(“CD19 CAR”)和非转导的(“模拟”)T细胞(靶标)的细胞毒性，采用多种不同的效应物-靶标(E/T)比。共同孵育之后，定量铬的释放，并且确定各样品中最大可达裂解的百分比。
2294-2302，Berger等.J Virol.2001年1月75(2):799-808，Riddell等.Nature
Medicine.1996年2月2(2):216-223，Berger等.Blood.2005年2月105(4):1640-1647。简言之，PBMC(响应物)用自体同源γ辐照的细胞体外刺激，所述细胞转导有由给予的细胞表达的CAR(刺激物处于1:1或2:1的响应物-刺激物比例)。然后，在铬释放试验中评估，培养物的针对自体同源51Cr标记的CAR-转导的(“CD19 CAR”)和非转导的(“模拟”)T细胞(靶标)的细胞毒性，采用多种不同的效应物-靶标(E/T)比。共同孵育之后，定量铬的释放，并且确定各样品中最大可达裂解的百分比。
[0628] 源自一名示例性患者的样品的结果示于图1，其说明了PBMC输注前和输注后第42天的溶细胞活性。在任何输注前PBMC-源性的培养物中没有检测到针对CAR转导的靶细胞具有特异性的溶细胞活性，但在评估的四个对象的两个中，在源自输注后PBMC样品的培养物中检测到了CAR特异性裂解活性。这些结果指示，CAR特异性免疫应答可在表达CAR的T细胞的单一输注之后发展。
[0629] 可进行表位作图以评估由特异性免疫应答识别的CAR的一个或多个区域。输注前和输注后PBMC样品在多重15聚体肽的个体池的存在下被刺激，其具有代表由给予的细胞表达的CAR的约500个氨基酸序列的全长的重叠部分(11个氨基酸重叠)的序列。细胞用抗体染色以检测CD8和CD4表面表达以及细胞因子的胞内表达。评估了二十三(23)个池，其各自包含十(10)个肽，各自并统共地包括125个个体重叠肽，其中各肽由所述池中的至少两个代表。
[0630] 该设计允许产生分析表格，以评估对个体肽具有特异性的应答，由此，在该试验中存在于多于一个被检测为命中结果的池中的肽被视为具有潜在免疫原性肽的命中。对于其中已检测到CAR特异性免疫应答的两名患者，分别鉴定了六个和三个肽命中。
[0631] 进行了数个单独ELISpot试验，其采用抗细胞因子捕获抗体以评估针对这些个体命中物中每一个的特异性免疫应答的存在或不存在(参见Berger等.(2006)；Berger等.
(2001)；Riddell等.(1996)；和Berger等.(2005)，同上)。一名患者的示例性试验的结果示于图2。在评估的两名患者中均检测到针对具有所述CAR的scFv的VH部分中的序列的肽的特异性免疫应答(一名患者中包括FR1、CDR1和FR2区域中的区域，而另一名患者中包括FR3中的区域)。对于第一名患者，还检测到针对两个重叠15聚体肽的特异性免疫应答，所述肽各自包含CAR的跨膜结构域和共刺激结构域之间的接合部分(图2中带标记的“融合位点”)。这两个重叠15聚体肽分别具有氨基酸序列AFIIFWVKRGRKKLL(SEQ ID NO:8)和
FWVKRGRKKLLYIFK(SEQ ID NO:9)。在给予具有鼠scFv、CD28跨膜和共刺激结构域和CD3ζ结构域的不同CAR之后的另一研究中，采用相似方法，对于一名对象检测针对包含抗CD19scFv的VH部分的池的免疫应答，且对于另一名对象检测包含接合部分的池中的免疫应答。
(2001)；Riddell等.(1996)；和Berger等.(2005)，同上)。一名患者的示例性试验的结果示于图2。在评估的两名患者中均检测到针对具有所述CAR的scFv的VH部分中的序列的肽的特异性免疫应答(一名患者中包括FR1、CDR1和FR2区域中的区域，而另一名患者中包括FR3中的区域)。对于第一名患者，还检测到针对两个重叠15聚体肽的特异性免疫应答，所述肽各自包含CAR的跨膜结构域和共刺激结构域之间的接合部分(图2中带标记的“融合位点”)。这两个重叠15聚体肽分别具有氨基酸序列AFIIFWVKRGRKKLL(SEQ ID NO:8)和
FWVKRGRKKLLYIFK(SEQ ID NO:9)。在给予具有鼠scFv、CD28跨膜和共刺激结构域和CD3ζ结构域的不同CAR之后的另一研究中，采用相似方法，对于一名对象检测针对包含抗CD19scFv的VH部分的池的免疫应答，且对于另一名对象检测包含接合部分的池中的免疫应答。
[0632] 通过该试验，没有检测到所述患者针对其它区域中的肽的特异性免疫应答。例如，在该试验中，没有检测到针对具有scFv的框架区或其它CDR中的序列的肽、处于共刺激或跨膜结构域的区域内但不跨越两者的接合部分的肽，或处于CAR的CD3-ζ区域或EGFRt内的肽，的特异性应答。没有检测到针对内源性序列的特异性免疫应答。
[0633] 实施例2：计算机模拟分析源自CAR的接合区域的肽与HLA I类和HLA II类的结合。
[0634] 采用可获自免疫表位数据库(Immune Epitope Databas)和分析资源(IEDB)的T细胞表位预测工具，进行计算机模拟分析，以预测MHC-结合亲和性和与针对示例性CAR序列的部分内的各一系列重叠肽序列的潜在的免疫原性相关的其它性质。该部分包括间隔物，其具有免疫球蛋白源性的铰链结构域、人CD28跨膜结构域、人4-1BB共刺激结构域，和人CD3ζ信号转导结构域。在评估的部分中，所述铰链结构域是人IgG4铰链结构域，所述CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:2所示的序列，并且所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:3所示的序列。该部分因此包含源自人序列的不同结构域之间的三个接合部分(所述接合部分可在给予人类对象之后具有针对CAR具有潜在免疫原性的代表性的位点)：所述间隔物区域和跨膜结构域之间的接合部分，所述跨膜结构域和共刺激结构域之间的接合部分，和所述共刺激结构域和胞内信号转导结构域之间的接合部分(参见图3A和3B)。
[0635] 为鉴定可能具有使它们更可能被呈递给T细胞的具体性质的序列的部分，预测沿所述部分的长度、长度为8-14个氨基酸和长度为15个氨基酸(包含9聚体结合中心)的重叠肽的结合至27个个体HLA I类等位基因和56个个体HLA II类等位基因的亲和性。这些等位基因，统共地代表存在于世界群体的大于99％中的HLA等位基因，并且它们在美国群体中的大致频率列于表1A和1B中。
[0636]
[0637]
[0638]
[0639]
[0640]
[0641] 采用可获自IEDB的基于算法的T细胞表位预测工具，来预测数据集中的各8-14氨基酸肽对于HLA I类分子结合的IC50值，采用ANN(Nielsen等.(2003)Protein Sci.,12:
1007-1017和Lundegaard等.(2008)NAR,36:W509-512)，和，在一些情况中，一个或多个额外的预测，采用SMM(Peters和Sette(2005)BMC Bioinformatics,6:132)和Comblib(Sidney
等.(2008)Immunome Res.4:2，或Consensus工具(参见Kim等(2012)免疫表位数据库分析资源(Immune epitope database analysis resource)，NAR(组合来自任何前述的预测)。对于所述数据集中的各15氨基酸肽结合至HLA II类的IC50值的预测采用NetMHCIIpan方法进行(Karosiene等.(2013)Immunogenetics 65(10):711；Nielsen等.(2008)PLoS Comput
Biol.4(7)e1000107)。对于CAR氨基酸序列的部分中的各个个体位置，确定包括所述位置并预测以低于50nm的预计IC50结合至I类或II类等位基因中的任一种的数据集中的序列的总数。图4A(HLA I类)和4B(HLA II类)，分别描述针对I类和II类等位基因的结果，显示沿所述序列长度的位置覆盖，基于确定的总数量，根据群体中个体HLA等位基因的频率进行加权。
贯穿整个评估的区域的曲线下面积(AUC)对于HLA I类结合是约1321且对于HLA II类结合
是2943。对于跨膜-共刺激结构域区域的AUC对于HLA I类结合是约931且对于HLA II类结合是2212。
1007-1017和Lundegaard等.(2008)NAR,36:W509-512)，和，在一些情况中，一个或多个额外的预测，采用SMM(Peters和Sette(2005)BMC Bioinformatics,6:132)和Comblib(Sidney
等.(2008)Immunome Res.4:2，或Consensus工具(参见Kim等(2012)免疫表位数据库分析资源(Immune epitope database analysis resource)，NAR(组合来自任何前述的预测)。对于所述数据集中的各15氨基酸肽结合至HLA II类的IC50值的预测采用NetMHCIIpan方法进行(Karosiene等.(2013)Immunogenetics 65(10):711；Nielsen等.(2008)PLoS Comput
Biol.4(7)e1000107)。对于CAR氨基酸序列的部分中的各个个体位置，确定包括所述位置并预测以低于50nm的预计IC50结合至I类或II类等位基因中的任一种的数据集中的序列的总数。图4A(HLA I类)和4B(HLA II类)，分别描述针对I类和II类等位基因的结果，显示沿所述序列长度的位置覆盖，基于确定的总数量，根据群体中个体HLA等位基因的频率进行加权。
贯穿整个评估的区域的曲线下面积(AUC)对于HLA I类结合是约1321且对于HLA II类结合
是2943。对于跨膜-共刺激结构域区域的AUC对于HLA I类结合是约931且对于HLA II类结合是2212。
[0642] 如图4A和4B中所示，通过该方法预测所述序列的某些部分包含更可能在MHC复合物中良好结合从而以表位形式呈递供于T细胞的可能的识别。对于单独HLA等位基因的结合亲和性不一定预测免疫原性。鉴于该示例性CAR中的个体结构域(例如，跨膜、共刺激)是人源性的，在给予人类对象之后，不太可能发展针对这些个体区域的单独任何一种内的表位的免疫原性应答(这与跨越彼此一般不相关联的多个区域的表位和/或包含此类区域之间
的接合部分的表位相反)。例如，甚至对于预测在MHC分子的情况下结合良好并被呈递肽而言，如果该肽整个源自内源性蛋白质，那么它可被识别为“自己”，从而可能无法诱导富有成效的免疫应答。例如，尽管某些区域完全处于在HLA-结合亲和性预测上得到高分的单一跨膜或胞质结构域之内，在实施例1中描述的结果中，没有检测到针对仅处于相似CAR序列的这些结构域之一的肽序列的免疫应答。因此，尽管关于预测的HLA-结合亲和性观察到多种不同的“热点”，但后续评估和改变着眼于不仅具有较高预测IC50值，而且还包括跨越源自两种不同蛋白质的不同结构域之间的接合部分的潜在表位的那些区域。
的接合部分的表位相反)。例如，甚至对于预测在MHC分子的情况下结合良好并被呈递肽而言，如果该肽整个源自内源性蛋白质，那么它可被识别为“自己”，从而可能无法诱导富有成效的免疫应答。例如，尽管某些区域完全处于在HLA-结合亲和性预测上得到高分的单一跨膜或胞质结构域之内，在实施例1中描述的结果中，没有检测到针对仅处于相似CAR序列的这些结构域之一的肽序列的免疫应答。因此，尽管关于预测的HLA-结合亲和性观察到多种不同的“热点”，但后续评估和改变着眼于不仅具有较高预测IC50值，而且还包括跨越源自两种不同蛋白质的不同结构域之间的接合部分的潜在表位的那些区域。
[0643] 具体地，进一步评估包括跨越示例性CAR的CD28跨膜结构域和4-1BB信号转导结构域的接合部分的一个或多个潜在的肽表位的接合区域。关于SEQ ID NO:5所示序列，其包括示例性人CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:2)和示例性人4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:3)，该评估的接合区域在跨越CD28跨膜和4-1BB共刺激结构域的接合部分的任一侧包含13个氨基酸，如下：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC RFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:5)，其中26个氨基酸的接合区域以粗体指示，且所述结构域之间的接合部分的C’和N’的两个氨基酸以下划线表示。评估的26氨基酸接合区域如SEQ ID NO:
137所示，并且对应于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的氨基酸残基15至40。
137所示，并且对应于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的氨基酸残基15至40。
[0644] 进行计算机模拟建模，以鉴定如SEQ ID NO:137所示的26氨基酸接合区域中的一个或多个氨基酸修饰(突变)，其导致肽片段被预测以高IC50值结合至I类和II类等位基因，并因此可能减小诱导针对包含该区域的CAR的免疫原性的潜力。具体地，对于对应于位置
14、17和20的氨基酸残基位置处包含一个或多个突变的接合区域的变体肽片段进行预测，其编号参考SEQ ID NO:137(其对应于：对应于位置28、31和34的氨基酸位置处的一个或多个突变，其编号参考SEQ ID NO:5)。在该示例性研究中，选择这些残基用于对于全部高亲和性表位的计算机模拟诱变和结合预测之后的进一步分析，其中，研究贯穿所述表位的全部可能的单一氨基酸替代对于预期的IC50值的影响。鉴定导致较大IC50预测结果的残基(结合下降)，其鉴定上述残基是对替代敏感的。
14、17和20的氨基酸残基位置处包含一个或多个突变的接合区域的变体肽片段进行预测，其编号参考SEQ ID NO:137(其对应于：对应于位置28、31和34的氨基酸位置处的一个或多个突变，其编号参考SEQ ID NO:5)。在该示例性研究中，选择这些残基用于对于全部高亲和性表位的计算机模拟诱变和结合预测之后的进一步分析，其中，研究贯穿所述表位的全部可能的单一氨基酸替代对于预期的IC50值的影响。鉴定导致较大IC50预测结果的残基(结合下降)，其鉴定上述残基是对替代敏感的。
[0645] 评估一系列不同变体接合区域，其各自在评估的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸替代，相较于示例性CAR序列中的非突变的接合区域。选择可能对于共刺激信号转导结构域的各跨膜区域的结构或功能破坏性较小的、所述鉴定的位置处的氨基酸替代的示例性子集。并且，由于表位重叠，选择可能能够一次影响多于一个表位的替代。具体地，个体变体接合区域包含如下修饰(氨基酸替代)：K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R32A、R31H、R31L、R31N、L34A、L34S、K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S，其编号参考SEQ ID NO:5。
[0646] 对于非变体和变体接合区域，采用可获自IEDB的T细胞表位预测工具，对I类和II类等位基因获得经加权的免疫原性分数。采用对于相应的(变体或非变体)26-氨基酸接合区域中的一系列8聚体-14聚体重叠肽(单独地对于27个HLA I类等位基因的每一个)和一系列15聚体重叠肽(单独地对于56个HLA II类等位基因的每一个)的各自的预测的IC50值来衍生分数，并基于个体HLA I类和II类等位基因的群体中相应的频率进行加权。较高的相对分数指示较高的预测结合程度。
[0647] 结果示于图5。结果显示通过修饰CAR接合区域中的氨基酸，降低该区域内的总体预测HLA I类免疫原性分数的能力。结果还证实，减小预测HLA I类结合亲和性(并因此减少预测免疫原性分数)而不导致实质上增加的针对HLA II类结合的预期免疫原性分数的能力。因此，一般而言，结果显示，可以制造跨越CAR的CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的接合部分的区域中的一个或多个氨基酸修饰，并实现对于人HLA结合的预测亲和性的总体减小，这将与在给予人类对象与具有该区域的受体等同但在该区域中包含所述修饰或修饰的组合的嵌合受体之后的免疫原性的可能性减小相一致。
[0648] 实施例3：源自CAR的接合区域的肽结合至HLA I类的计算机模拟分析和体外结合的比较。
[0649] 对某HLA I类等位基因(A*02:01，A*03:01，A*11:01和B*08:01)对于跨越CD28和4-1BB接合部分的26氨基酸的接合区域的部分内的示例性重叠9氨基酸肽序列的实际结合亲
和性进行体外评估。具体地，评估源自序列VAFIIFWVKRGRKKLL(示于SEQ ID NO:7)的一系列重叠9聚体肽，所述序列包含跨越所述结构域之间的接合部分的4-1BB共刺激结构域和CD28跨膜结构域的部分(键接合以下划线所示的两个氨基酸)。此外，还评估该部分的多个不同变体的各自的一系列重叠9聚体肽，各变体在该区域中包含一个或多个突变，如实施例2中所述。
和性进行体外评估。具体地，评估源自序列VAFIIFWVKRGRKKLL(示于SEQ ID NO:7)的一系列重叠9聚体肽，所述序列包含跨越所述结构域之间的接合部分的4-1BB共刺激结构域和CD28跨膜结构域的部分(键接合以下划线所示的两个氨基酸)。此外，还评估该部分的多个不同变体的各自的一系列重叠9聚体肽，各变体在该区域中包含一个或多个突变，如实施例2中所述。
[0650] 合成多种9聚体重叠肽，并通过MALDI-TOF质谱测试它们的纯度。然后，合成肽与重组MHC分子孵育，以采用REVEAL表位发现系统(REVEAL Epitope Discovery System)评估结合性质，这是高通量结合试验，其检测各肽能够使三元MHC-肽复合物稳定的程度(ProImmune，英国牛津)。分开测试各肽对于各HLA I类等位基因的所述能力，针对阳性对照(已知的针对相关等位基因的T细胞表位)观察到的程度标准化。结果以分数形式报告，其中，结合对于设为100％的阳性对照肽进行标准化。在该分析中，一般认为大于50的分数代表良好或高亲和性结合。
[0651] 结果与采用如实施例2中所述的计算机模拟预测方法对于相同肽:MHC复合物的结合获得的预测的结合(IC50)值做比较。因为预测的最大IC50值是约50000，所以将IC50值进行对数(log)转化，从LOG(50000)减去，并除以LOG(50000)，以获得标准化的计算机模拟分数((Log(50000)–logIC50)/Log(50000))。在该分析中，一般认为大于2.0的计算机模拟结合预测分数代表预测的良好或高亲和性结合。
[0652] 结果示于表2A(HLA-A*02:01和HLA-A*03:01)和表2B(HLA-A*11:01和HLA-B*08:01)。一般而言，计算机模拟结合预测对于实际体外结合结果具有预测性。在一些情况中，计算机模拟预测具有相对较高的结合，但在体外试验并没有观察到这样的情况。
[0653] 结果也与体外试验中检测的对于亲和性具有一般预测性的预测的结合亲和性一致。并且，结果显示通过接合区域内的修饰成功地减小了对于HLA的结合亲和性，并且，能够以某一方式修饰该序列，该方式导致重叠的潜在表位之一的较低的预期或实际结合亲和性或分数，而不增加(或同时也降低)对于包含相同残基的重叠表位中的另一个的结合亲和性或分数。在一些实施方式中，所述突变或修饰可具有特定的益处。作为结果的一个非限制性示例，修饰K29L、R31H、L34S和/或L34A，参考SEQ ID NO:5所示编号，一般导致对于至少一个HLA等位基因和/或对于所评估的区域中的至少一个肽的预测或实际结合亲和性或分数的
减少，而不导致对于另一HLA等位基因的较高结合亲和性和/或不导致对于另一肽的较高结合亲和性。
减少，而不导致对于另一HLA等位基因的较高结合亲和性和/或不导致对于另一肽的较高结合亲和性。
[0654]
[0655]
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[0667] 实施例4：源自CAR的接合区域的肽与HLA-A2:01的结合的分析
[0668] 为了鉴定可能能够诱导免疫原性应答的CAR源性肽，通过计算机模拟评估包含CAR的CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的接合部分的非变体(参比)序列中的一系列重叠肽。使用算法来预测对于常见人MHC I类分子(HLA-A2:01)的肽槽的结合亲和性，采用计算机模拟分析来预测结合亲和性。如图3所示，CAR的评估的部分具有序列CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF(示于SEQ ID NO:6)，其包含CD28跨膜结构域(示于SEQ ID NO:2)的部分和4-1BB共刺激结构域(示于SEQ ID NO:3)的部分，其中跨越所述结构域的接合部分的残基以下划线显示。计算机模拟评估SEQ ID NO:6所示序列的8-14个氨基酸的一系列140个重叠肽的预测的HLA-A2:01结合亲和性。三十五(35)个所述肽仅包含来自跨膜结构域部分的序列；35个所述肽仅包含来自共刺激结构域部分的序列，而70个所述肽具有接合或融合区域序列，其包含桥接所述结构域之间的接合部分的氨基酸残基。对于该评估，认为预测以0nM-50nM的解离常数结合至HLA-A2:01的肽片段是预测以高亲和性结合的。认为预测以51nM-1000nM的解离常数结合的肽片段是预测以低亲和性结合的。认为预测以
1000nM-5000nM的预测的亲和性结合的肽片段是预期以极低亲和性结合的。结果示于图3。
1000nM-5000nM的预测的亲和性结合的肽片段是预期以极低亲和性结合的。结果示于图3。
[0669] 如图3中所示，源自该区域中的参比序列的两个肽，其各自包含具有跨越所述结构域之间的接合部分的重叠区域的序列，被预测为显示与HLA-A2:01的低结合亲和性。具体地，具有序列FIIFWVKRGRKKLL(SEQ ID NO:10)的14聚体肽被预测以294nM的解离常数结合，而具有序列FIIFWVKRGRKKL(SEQ ID NO:11)的13聚体肽被预测以618nM的解离常数结合。这些肽各自包括实施例1中鉴定的且如SEQ ID NO:1所示的15聚体肽的部分。该序列中的较短的8聚体至12聚体肽未被预测显示结合至HLA-A2:01。预测包含氨基酸序列IIFWVKRGRKKLL(SEQ ID NO:12)的另一13聚体肽具有以预测的约3000nM解离常数的极低结合亲和性。桥接这两个结构域的接合部分的剩余的片段均未被该试验预测为显示对于HLA-A2:01的结合亲和性(全部具有远大于5000nM的预测解离常数，并且在大多数情况中高于14000nm或20000nM或更大)。在预测结合至HLA-A2:01的各肽中，两个跨越接合部分的残基(VK)本身均不被预测为锚着残基；而是，所述肽在非侧接位置包含这些残基。
[0670] 包含仅源自跨膜结构域的肽中有大致15个被预测为对HLA-A2:01具有小于5000nM的解离常数。预测包含仅来自共刺激结构域的序列的两个肽对HLA-A2:01结合具有小于
5000nM的解离常数。评估的序列中的共刺激结构域和跨膜结构域源自内源性人序列，其对于人类对象一般不太可能是免疫原性的。例如，在实施例1中描述的研究中，没有检测到针对仅处于CAR的这些结构域之一中的肽序列的特异性免疫应答。因此，评估包含跨越所述接合区域的序列的肽的变体。
5000nM的解离常数。评估的序列中的共刺激结构域和跨膜结构域源自内源性人序列，其对于人类对象一般不太可能是免疫原性的。例如，在实施例1中描述的研究中，没有检测到针对仅处于CAR的这些结构域之一中的肽序列的特异性免疫应答。因此，评估包含跨越所述接合区域的序列的肽的变体。
[0671] 为了产生预测具有针对HLA-A2:01的减少的结合亲和性和/或在具有该HLA等位基因的人类对象中的减少的免疫原性的变体肽，通过计算机模拟方式产生变体序列，其相较于SEQ ID NO:6所示的序列在接合区域中包含突变。鉴于预测包含跨越接合部分的“VK”残基(在非锚着位置)的肽将显示对于HLA-A2:01的高结合亲和性，将两个天冬酰胺残基插入CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的接合部分。该变体包含序列
CYSLLVTVAFIIFWVNNKRGRKKLLYIFKQPF(示于SEQ ID NO:13，该序列侧接通过插入以下划线显示的天冬酰胺残基而产生的接合部分)。通过相同预测方法评估SEQ ID NO:13示例性变体序列。为了评估该变体序列的预测的结合亲和性，通过如上所述的计算机模拟分析评估SEQ ID NO:13所示序列的8-14个氨基酸的一系列154个重叠片段，由此，35个肽具有仅处于跨膜部分中的序列，35个肽具有仅处于共刺激结构域部分中的序列，且84个肽包含含有桥接所述结构域的氨基酸的接合区域序列，包括所插入的天冬酰胺残基之一或两者。
CYSLLVTVAFIIFWVNNKRGRKKLLYIFKQPF(示于SEQ ID NO:13，该序列侧接通过插入以下划线显示的天冬酰胺残基而产生的接合部分)。通过相同预测方法评估SEQ ID NO:13示例性变体序列。为了评估该变体序列的预测的结合亲和性，通过如上所述的计算机模拟分析评估SEQ ID NO:13所示序列的8-14个氨基酸的一系列154个重叠片段，由此，35个肽具有仅处于跨膜部分中的序列，35个肽具有仅处于共刺激结构域部分中的序列，且84个肽包含含有桥接所述结构域的氨基酸的接合区域序列，包括所插入的天冬酰胺残基之一或两者。
[0672] 结果示于图3。可见，总体上，包含所述接合部分的变体区域内的重叠肽的HLA-A2:01结合亲和性，统共地，相较于非变体序列而言，实质上减少。具体地，先前预测为免疫原性的接合区域的部分中的肽结合至HLA-A2:01的预测解离常数显著降低了。例如，相较于分别如SEQ ID NO:10和11所示鉴定的肽而言包括改变的侧接残基的肽变体IIFWVNNKRGRKKL
(SEQ ID NO:14)和IIFWVNNKRGRKK(SEQ ID NO:15)被预测将对HLA-A2:01不会显示可检测
的结合亲和性。两个14聚体肽，FIIFWVNNKRGRKK(SEQ ID NO:11)和IFWVNNKRGRKKLL(SEQ ID NO:12)，被预测将对与该HLA的结合显示指示极低结合亲和性的解离常数，在1000nM-
5000nM范围内。包含该经修饰的接合区域序列的全部其它肽均被预测显示大于5000nM的解离常数，并且在大多数情况中，高于14000nM或20000nM或更大，因此被该评估不会预测显示对于HLA-A2:01的结合亲和性。并且，所述接合区域序列的修饰不产生预测将在共刺激或跨膜结构域区域中对HLA-A2:01具有较高结合亲和性的任何新肽。
(SEQ ID NO:14)和IIFWVNNKRGRKK(SEQ ID NO:15)被预测将对HLA-A2:01不会显示可检测
的结合亲和性。两个14聚体肽，FIIFWVNNKRGRKK(SEQ ID NO:11)和IFWVNNKRGRKKLL(SEQ ID NO:12)，被预测将对与该HLA的结合显示指示极低结合亲和性的解离常数，在1000nM-
5000nM范围内。包含该经修饰的接合区域序列的全部其它肽均被预测显示大于5000nM的解离常数，并且在大多数情况中，高于14000nM或20000nM或更大，因此被该评估不会预测显示对于HLA-A2:01的结合亲和性。并且，所述接合区域序列的修饰不产生预测将在共刺激或跨膜结构域区域中对HLA-A2:01具有较高结合亲和性的任何新肽。
[0673] 实施例5：抗-CD22 CAR表达型细胞向先前用抗-CD19 CAR治疗的对象的给予
[0674] 向具有复发/难治CD22+B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)的六名对象给予表达抗-CD22嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞。所述CAR包括人抗-CD22 scFv抗体、CD8α跨膜结构域、4-1BB胞内信号转导结构域，和CD3ζ胞内信号转导结构域。
[0675] 所有对象先前均经历过至少一种前施同种异体造血干细胞移植物，并且接受过采用多种不同的CD19导向的CAR-T细胞疗法之一的治疗。所述对象中有五名具有ALL复发，对其未检测到CD19(“CD19阴性”)，并且一名对象在其它情况中是对于前施的CD19 CAR治疗的非响应者。
[0676] 表3汇总了经治疗患者的特点。
[0677]
[0678] HCT：造血细胞移植。
[0679] 在给予所述细胞之前，患者经历自体同源白细胞除去法，以收获外周血液单核细胞(PBMC)。T细胞通过针对CD3表达的基于免疫亲和性的富集法从收获的PBMC分离，并在抗-CD3/-CD28珠的存在下培养，随后用编码抗-CD22 CAR的慢病毒载体转导。细胞培养7-10天。对象在第-4、-3和-2天接受采用25mg/m2氟达拉滨的诱导化疗，并在第-2天接受900mg/m2的
5
环磷酰胺(在第0天细胞输注)。各患者通过静脉内输注接受3x10 转导的T-细胞/受者体重(kg)的初始CAR T细胞剂量。加入的第二对象发生了3级腹泻，这符合剂量限制毒性(DLT)的标准，这导致第一剂量水平的剂量扩增以治疗总计6名对象。在该剂量中未见后施DLT。两名对象发生1级细胞因子释放综合征(CRS)，一名对象发生2级CRS，并且在两名对象中不存在CRS。
5
环磷酰胺(在第0天细胞输注)。各患者通过静脉内输注接受3x10 转导的T-细胞/受者体重(kg)的初始CAR T细胞剂量。加入的第二对象发生了3级腹泻，这符合剂量限制毒性(DLT)的标准，这导致第一剂量水平的剂量扩增以治疗总计6名对象。在该剂量中未见后施DLT。两名对象发生1级细胞因子释放综合征(CRS)，一名对象发生2级CRS，并且在两名对象中不存在CRS。
[0680] 在治疗后某时间点通过用CD22-Fc孵育细胞来测定外周血液、骨髓或脑脊液中的CAR-T细胞数量。对于其中观察到增殖的患者，在约第7天开始看到在外周血液、骨髓和脑脊液中观察到CAR-T细胞增殖的证据。最大或峰值CAR-T细胞增殖一般在输注后约第12天和约第15天之间观察到。表7列出了在该评估阶段观察到的抗-CD22 CAR-T细胞的最大或峰值百分比，以经治疗对象的各样品中的总T细胞的百分比的形式显示。临床应答在输注后第28天(+/-4天)评估。
[0681] 如表4所示，结果与一般与CAR-T细胞增殖的程度相关的应答相一致。对于显示无或低CAR-T细胞增殖的三名对象也显示了疾病进展的证据。两名其它对象具有稳定疾病，并且观察到一名完全缓解且无MRD。检测到在该对象中，流式细胞CAR持久性持续超过输注后47天，其中在输注后3个月持续缓解。结果显示在经历了先前抗-CD19 CAR治疗(并且已变得对该治疗非响应性，例如，归因于表位/抗原流失)的对象中的安全、可行且具有临床有效的抗-CD22 CAR T-细胞治疗。
[0682]
[0683] PB：外周血；CSF：脑脊液；CRS：细胞因子释放综合征；PD：进展性疾病：MRD：最小残余疾病；CR：完全缓解；SD：稳定疾病。
[0684] 本发明不局限于本文所述实施方式的范围，这些实施方式仅旨在说明本发明的单独方面，任何功能等同形式也在本发明范围内。本文所述以外的对发明模型和方法的各种改良通过以上描述和教导对本领域技术人员显而易见，所述改良同样旨在落入本发明的范围内。可以实施此类改良或其它实施方式而不偏离本发明的真实范围和精神。
[0685] 表5：序列
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