使用精氨酸耗竭剂的组合癌症免疫疗法
阅读：328发布：2020-05-18
专利汇可以提供使用精氨酸耗竭剂的组合癌症免疫疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了如ADI-PEG等用于结合 癌症免疫疗法 ，例如免疫检查点调节剂和T细胞过继性免疫疗法 治疗 各种癌症的精 氨 酸耗竭剂。还提供了相关方法、组合物、患者护理 试剂 盒 和细胞培养物。，下面是使用精氨酸耗竭剂的组合癌症免疫疗法专利的具体信息内容。
1.一种治疗有需要的受试者体内的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)将精氨酸转换为瓜氨酸的精氨酸耗竭剂；以及
(b)癌症免疫治疗剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)是ADI多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述ADI多肽是ADI-PEG20或者包括选自表A1的序列、由选自表A1的序列组成或基本上由其组成，包含将精氨酸转换为瓜氨酸的变体和片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述变体包括至少80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％等同于来自表A1的序列并且将精氨酸转换为瓜氨酸的序列。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述ADI多肽通过任选的连接基团共价键合到至少一个PEG分子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述ADI多肽共价键合到多于一个PEG分子。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述ADI多肽共价键合到约1个到约10个PEG分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述ADI多肽共价键合到约2个到约8个PEG分子。
9.根据权利要求5到8中任一项所述的方法，其中所述PEG分子是直链或支链PEG分子。
10.根据权利要求5到9中任一项所述的方法，其中所述PEG具有约1,000到约40,000道尔顿的总平均分子量。
11.根据权利要求5到9中任一项所述的方法，其中所述PEG具有约10,000到约30,000道尔顿的总平均分子量。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述PEG具有约20,000道尔顿的总平均分子量。
13.根据权利要求5到12中任一项所述的方法，其中所述连接基团是琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基、亚甲基基团或其任何组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述琥珀酰基的来源是琥珀酰亚胺琥珀酸酯。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中所述精氨酸耗竭剂是聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述ADI-PEG是ADI-PEG 20。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中(b)所述癌症免疫治疗剂选自免疫检查点调节剂、癌症疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法中的一种或多种。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是多肽，任选地抗体或其抗原结合片段或配体或小分子。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂包括：
(i)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；或者
(ii)刺激性免疫检查点分子的激动剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂特异性结合所述免疫检查点分子。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述抑制性免疫检查点分子选自以下一种或多种：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160、疱疹病毒进入介体(HVEM)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
22.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是PD-L1和/或PD-L2拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、阿特朱单抗(MPDL3280A)、阿维单抗(MSB0010718C)和度伐鲁单抗(MEDI4736)中的一种或多种，并且其中所述癌症任选地选自结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌中的一种或多种。
23.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是PD-1拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、纳武单抗、派姆单抗、PDR001和皮地利珠单抗中的一种或多种。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂是纳武单抗，并且所述癌症任选地选自霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和卵巢癌中的一种或多种。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，并且所述癌症任选地选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌和尿路上皮癌中的一种或多种。
26.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是CTLA-4拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、伊匹木单抗、曲美木单抗中的一种或多种。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌中的一种或多种。
28.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是IDO拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、吲哚莫德(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满；9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝坦中的一种或多种，并且其中所述癌症任选地选自转移性乳腺癌和脑癌，任选地多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤或恶性脑肿瘤中的一种或多种。
29.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是TDO拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、680C91和LM10中的一种或多种。
30.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是TIM-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
31.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是LAG-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子和BMS-986016中的一种或多种。
32.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是VISTA拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
33.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是BTLA、CD160和/或HVEM拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
34.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是TIGIT拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
35.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述刺激性免疫检查点分子选自OX40、CD40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)中的一种或多种。
36.根据权利要求19到20或35中任一项所述的方法，其中所述激动剂是OX40激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、OX86、Fc-OX40L和GSK3174998中的一种或多种。
37.根据权利要求19到20或35中任一项所述的方法，其中所述激动剂是CD40激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、CP-870,893、达西珠单抗、Chi Lob 7/4、ADC-1013和rhCD40L中的一种或多种，并且其中所述癌症任选地选自黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤和血液癌，任选地淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
38.根据权利要求19到20或35中任一项所述的方法，其中所述激动剂是GITR激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、INCAGN01876、DTA-1和MEDI1873中的一种或多种。
39.根据权利要求19到20或35中任一项所述的方法，其中所述激动剂是CD137激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、乌托米单抗和4-
1BB配体中的一种或多种。
40.根据权利要求19到20或35中任一项所述的方法，其中所述激动剂是CD27激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、瓦利鲁单抗和CDX-
1127(1F5)中的一种或多种。
41.根据权利要求19到20或35中任一项所述的方法，其中所述激动剂是CD28激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体和TAB08中的一种或多种。
42.根据权利要求19到20或35中任一项所述的方法，其中所述激动剂是HVEM激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体中的一种或多种。
43.根据权利要求17所述的方法，其中(b)是选自Oncophage，任选地Gardasil或Cervarix等人乳头瘤病毒HPV疫苗，任选地Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix等乙型肝炎疫苗，以及sipuleucel-T(普罗文奇)中的一种或多种的癌症疫苗，或者包括选自以下一种或多种的癌抗原：人类Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
44.根据权利要求17所述的方法，其中(b)是选自以下一种或多种的溶瘤病毒：
talimogene laherparepvec(T-VEC)、柯萨基病毒A21(CAVATAKTM)、Oncorine(H101)、pelareorep 塞内卡谷病毒(NTX-010)、塞内卡病毒SVV-001、ColoAd1、
SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401。
45.根据权利要求17所述的方法，其中(b)是选自以下一种或多种的细胞因子：干扰素(IFN)-α、IL-2、IL-12、IL-7、IL-21和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
46.根据权利要求17所述的方法，其中(b)是基于细胞的免疫疗法，其包括癌抗原特异性T细胞，任选地离体衍生的T细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌抗原特异性T细胞选自以下一种或多种：
嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及肽诱导T细胞。
48.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中(b)所述癌症免疫治疗剂选自IDO拮抗剂、CD20拮抗剂、B-Raf拮抗剂、IL-2、GM-CSF和溶瘤病毒中的一种或多种。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述IDO拮抗剂是吲哚莫德，和/或其中所述CD20激动剂是利妥昔单抗，和/或其中所述B-Raf拮抗剂是维罗非尼，和/或其中所述溶瘤病毒是talimogene laherparepvec(T-VEC)或柯萨奇病毒A21(CAVATAKTM)。
50.根据权利要求1到49中任一项所述的方法，其中(a)和(b)被单独地施用。
51.根据权利要求1到49中任一项所述的方法，其中(a)和(b)作为同一组合物的一部分被一起施用。
52.根据权利要求1到51中任一项所述的方法，其中所述癌症选自以下一种或多种：肝细胞癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌(gastric cancer)、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头颈癌，宫颈癌，睾丸癌和胃癌(stomach cancer)。
53.一种用于治疗有需要的受试者体内的癌症的过继性T细胞免疫疗法的方法，其包括：
(a)将离体衍生的T细胞(i)与精氨酸耗竭剂或(ii)在补充有瓜氨酸的无精氨酸培养基中孵育；
(b)向所述受试者施用所述离体衍生的T细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中(a)或(b)的所述离体衍生的T细胞包括癌抗原特异性T细胞。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述癌抗原特异性T细胞选自以下一种或多种：
嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及肽诱导T细胞。
56.一种在体内或离体地增加T细胞活化和/或调节T细胞(Treg)下调的方法，其包括(a)用精氨酸耗竭剂孵育T细胞，(b)在补充有瓜氨酸的无精氨酸培养基中孵育T细胞，或者(a)和(b)两者。
57.根据权利要求53到56中任一项所述的方法，其中所述精氨酸耗竭剂是ADI多肽。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述ADI多肽包括选自表A1的序列、由选自表A1的序列组成或基本上由其组成，包含具有ADI活性的其变体和片段。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述变体包括至少80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％等同于来自表A1的序列的序列。
60.根据权利要求57到59中任一项所述的方法，其中所述ADI多肽通过任选的连接基团共价键合到至少一个PEG分子。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述ADI多肽共价键合到多于一个PEG分子。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述ADI多肽共价键合到约1个到约10个PEG分子。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述ADI多肽共价键合到约2个到约8个PEG分子。
64.根据权利要求60到63中任一项所述的方法，其中所述PEG分子是直链或支链PEG分子。
65.根据权利要求60到64中任一项所述的方法，其中所述PEG具有约1,000到约40,000的总平均分子量。
66.根据权利要求63到65中任一项所述的方法，其中所述PEG具有约10,000到约30,000的总平均分子量。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述PEG具有约20,000的总平均分子量。
68.根据权利要求60到67中任一项所述的方法，其中所述连接基团是琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基、亚甲基基团或其任何组合。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述琥珀酰基的来源是琥珀酰亚胺琥珀酸酯。
70.根据权利要求53到69中任一项所述的方法，其中所述精氨酸耗竭剂是聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG)。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述ADI-PEG是ADI-PEG 20。
72.一种患者护理试剂盒，其包括：
(a)将精氨酸转换为瓜氨酸的精氨酸耗竭剂；以及
(b)癌症免疫治疗剂。
73.根据权利要求72所述的患者护理试剂盒，其中(a)和(b)在单独的组合物中。
74.根据权利要求72所述的患者护理试剂盒，其中(a)和(b)在同一组合物中。
使用精氨酸耗竭剂的组合癌症免疫疗法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年6月6日提交的美国专利申请号62/515,807、以及2016年7月5日提交的美国专利申请号62/358,479的优先权，所述申请中的每一个通过引用以其全文并入本文。
[0004] 与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且通过引用结合到本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是POLA_006_02WO_ST25.txt。该文本文件为
196KB，于2017年7月5日创建，并通过EFS-Web以电子方式提交。
196KB，于2017年7月5日创建，并通过EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
技术领域
[0006] 相关技术说明
[0007] 精氨酸用于许多代谢途径，包含调节免疫应答中涉及的代谢途径。其是精氨酸酶和iNOS的底物，精氨酸酶和iNOS是在免疫细胞调节中起重要作用的酶(参见例如，
Peranzoni等人，《免疫生物学(Immunobiology)》，2007；212:795-812；Rodriguez和Ochoa，《免疫学评论(Immunol Rev)》，2008；222:180-91；Rath等人，《免疫学前沿(Front
Immunol)》，2014年10月27号；5:532；Delage等人，《国际癌症杂志(Int J Cancer)》，2010年
6月15号；126(12):2762-72；Bronte和Zanovello等人，《自然综述：免疫学(Nat Rev
Immunol)》，2005年8月；5(8):641-54；Raber等人，《免疫学研究(Immunol Invest)》，2012；
41(6-7):614-34；以及Albina等人，《实验医学杂志(J Exp Med)》，1989年3月1号；169(3):
1021-9)。T细胞需要精氨酸来进行增殖、TCR表达和记忆的发育(同上)。
Peranzoni等人，《免疫生物学(Immunobiology)》，2007；212:795-812；Rodriguez和Ochoa，《免疫学评论(Immunol Rev)》，2008；222:180-91；Rath等人，《免疫学前沿(Front
Immunol)》，2014年10月27号；5:532；Delage等人，《国际癌症杂志(Int J Cancer)》，2010年
6月15号；126(12):2762-72；Bronte和Zanovello等人，《自然综述：免疫学(Nat Rev
Immunol)》，2005年8月；5(8):641-54；Raber等人，《免疫学研究(Immunol Invest)》，2012；
41(6-7):614-34；以及Albina等人，《实验医学杂志(J Exp Med)》，1989年3月1号；169(3):
1021-9)。T细胞需要精氨酸来进行增殖、TCR表达和记忆的发育(同上)。
[0008] 尽管已经示出精氨酸饥饿在体外阻碍活化的T细胞的增殖和细胞周期进展，但是通过添加瓜氨酸可以逆转这种作用(参见例如，Bansal等人，《JPEN：肠胃外营养与肠内营养杂志(JPEN J.Parenter.Enteral Nutr)》,2004；28,423-430；Fletcher等人，《癌症研究(Cancer Res)》，75,275–83(2015)；以及Rodriguez等人，《血液学(Blood)》，2007；109:
1568–73)。类似地，可以通过表达精氨酸酶I的巨噬细胞而不是那些产生NOS2的细胞体外诱导CD3和T细胞抑制的延时性丧失(将精氨酸转化为瓜氨酸和NO)(参见例如，Rodriguez等
人，《免疫学杂志(J Immunol)》，2003年8月1日；171(3):1232-9)。
1568–73)。类似地，可以通过表达精氨酸酶I的巨噬细胞而不是那些产生NOS2的细胞体外诱导CD3和T细胞抑制的延时性丧失(将精氨酸转化为瓜氨酸和NO)(参见例如，Rodriguez等
人，《免疫学杂志(J Immunol)》，2003年8月1日；171(3):1232-9)。
[0009] 缺乏精氨酸会诱导编码多氨基酸转运系统的RNA的增加的转录和稳定性，所述多氨基酸转运系统包含CAT-1，其增加阳离子氨基酸向细胞的转运(参见例如，Gazzola等人，《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》，1972；266:407-421；Hyatt等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》，1997；272:19951-19957；Aulak等人，《生物化学杂志》，1996；
271:29799-29806；)。在低精氨酸条件下，T细胞增加瓜氨酸摄取并上调ASS1的表达，其将瓜氨酸转化为精氨酸(参见例如，Bansal等人，2004；Fletcher等人，2015；以及Tarasenko等人，《白细胞生物学杂志(J Leukoc Biol)》，2015年2月；97(2):273-8)。因此，尽管精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸可以带来肿瘤微环境中的免疫抑制(同上)，但精氨酸转化为瓜氨酸
可能具有明显的成果。
271:29799-29806；)。在低精氨酸条件下，T细胞增加瓜氨酸摄取并上调ASS1的表达，其将瓜氨酸转化为精氨酸(参见例如，Bansal等人，2004；Fletcher等人，2015；以及Tarasenko等人，《白细胞生物学杂志(J Leukoc Biol)》，2015年2月；97(2):273-8)。因此，尽管精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸可以带来肿瘤微环境中的免疫抑制(同上)，但精氨酸转化为瓜氨酸
可能具有明显的成果。
[0010] 聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG 20)通过将精氨酸转化为瓜氨酸和氨来耗竭精氨酸的外部供应。临床上正在研究针对缺乏在将瓜氨酸转化为精氨酸中涉及的关键酶
精氨基琥珀酸合成酶-1(ASS1)的肿瘤的ADI-PEG 20。ADI-PEG 20具有良好的耐受性并且在
临床研究中显示出前景(参见例如，Qiu等人，《癌症快报(Cancer Lett)》，2015年8月1号；
364(1):1-7；Phillips等人，《癌症研究和治疗(Cancer Res Treat)》2013年12月；45(4):
251-62；Feun等人，《当今药物设计(Curr Pharm Des)》，2008；14(11):1049-57；Feun和Savarage，《调研药物专家评论(Expert Opin Investig Drugs)》，2006年7月；15(7):815-
22；Feun等人，《临床营养和代谢护理的最新观点(Curr Opin Clin Nutr Metab Care)》，
2015年1月；18(1):78-82)。已经广泛研究了ADI-PEG 20的抗肿瘤性质；然而，其对如T细胞等免疫细胞的影响在很大程度上是未知的。这提供了探索精氨酸耗竭的新免疫疗法方面的
机会。
发明内容
精氨基琥珀酸合成酶-1(ASS1)的肿瘤的ADI-PEG 20。ADI-PEG 20具有良好的耐受性并且在
临床研究中显示出前景(参见例如，Qiu等人，《癌症快报(Cancer Lett)》，2015年8月1号；
364(1):1-7；Phillips等人，《癌症研究和治疗(Cancer Res Treat)》2013年12月；45(4):
251-62；Feun等人，《当今药物设计(Curr Pharm Des)》，2008；14(11):1049-57；Feun和Savarage，《调研药物专家评论(Expert Opin Investig Drugs)》，2006年7月；15(7):815-
22；Feun等人，《临床营养和代谢护理的最新观点(Curr Opin Clin Nutr Metab Care)》，
2015年1月；18(1):78-82)。已经广泛研究了ADI-PEG 20的抗肿瘤性质；然而，其对如T细胞等免疫细胞的影响在很大程度上是未知的。这提供了探索精氨酸耗竭的新免疫疗法方面的
机会。
发明内容
[0011] 本公开的实施例涉及发现精氨酸耗竭剂(将精氨酸转换为瓜氨酸)具有意想不到的免疫调节性质。例如，示例性精氨酸耗竭剂ADI-PEG 20被示出为在体内减少缓和效应T细胞(Teff细胞)的耗竭的免疫抑制性调节T细胞(Treg细胞)，并且在体内诱导或增加到非免
疫原性肿瘤中的T细胞浸润。作为特定实例，在T细胞刺激期间进行的ADI治疗增强效应T细
胞活化(CD69的表达)，阻止T细胞上的免疫抑制性受体PD-1和CTLA-4的上调，由此减少T细
胞耗竭，并且在刺激之后减少T细胞上的PD-L1的上调。
疫原性肿瘤中的T细胞浸润。作为特定实例，在T细胞刺激期间进行的ADI治疗增强效应T细
胞活化(CD69的表达)，阻止T细胞上的免疫抑制性受体PD-1和CTLA-4的上调，由此减少T细
胞耗竭，并且在刺激之后减少T细胞上的PD-L1的上调。
[0012] 这些不期望的性质表明如ADI-PEG 20等精氨酸耗竭剂可以与其它癌症免疫疗法结合以改善所述癌症免疫疗法。得益于与精氨酸耗竭剂结合的癌症免疫疗法的特定实例包
含PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和T细胞过继性免疫疗法等。
含PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和T细胞过继性免疫疗法等。
[0013] 因此，某些实施例包含治疗有需要的受试者体内的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
[0014] (a)将精氨酸转换为瓜氨酸的精氨酸耗竭剂；以及
[0015] (b)癌症免疫治疗剂。
[0016] 在某些实施例中，(a)的精氨酸耗竭剂是ADI多肽。在某些实施例中，所述ADI多肽包括选自表A1的序列、由选自表A1的序列组成或基本上由其组成，包含将精氨酸转换为瓜
氨酸的变体和片段。在某些实施例中，所述变体包括至少80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％等同于来自表A1的序列并且将精氨酸转换为瓜氨酸的序列。
氨酸的变体和片段。在某些实施例中，所述变体包括至少80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％等同于来自表A1的序列并且将精氨酸转换为瓜氨酸的序列。
[0017] 在一些实施例中，所述ADI多肽通过任选的连接基团共价键合到至少一个PEG分子。在某些实施例中，所述ADI多肽共价键合到多于一个PEG分子。在特定实施例中，所述ADI多肽共价键合到约1个到约10个PEG分子。在某些实施例中，所述ADI多肽共价键合到约2个
到约8个PEG分子。在某些实施例中，所述PEG分子是直链或支链PEG分子。
到约8个PEG分子。在某些实施例中，所述PEG分子是直链或支链PEG分子。
[0018] 在一些实施例中，所述PEG具有约1,000到约40,000道尔顿的总平均分子量。在某些实施例中，所述PEG具有约10,000到约30,000道尔顿的总平均分子量。在特定实施例中，所述PEG具有约20,000道尔顿的总平均分子量。
[0019] 在某些实施例中，连接基团是琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基团、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基、亚甲基基团或其任何组合。在某些实施例中，所述琥珀酰基的来源是琥珀酰亚胺琥珀酸酯。
[0020] 在某些实施例中，所述精氨酸耗竭剂是聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG)。在特定示例性实施例中，所述ADI-PEG是ADI-PEG 20。
[0021] 在某些实施例中，(b)的癌症免疫治疗剂选自免疫检查点调节剂、癌症疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法中的一种或多种。在一些实施例中，所述免疫检查点调节剂是多肽，任选地抗体或其抗原结合片段或配体或小分子。
[0022] 在某些实施例中，所述免疫检查点调节剂包括：
[0023] (i)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；或者
[0024] (ii)刺激性免疫检查点分子的激动剂。
[0025] 在一些实施例中，所述免疫检查点调节剂特异性结合所述免疫检查点分子。
[0026] 在特定实施例中，所述抑制性免疫检查点分子选自以下一种或多种：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160、疱疹病毒进入介体(HVEM)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
[0027] 在一些实施例中，所述拮抗剂是PD-L1拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、阿特朱单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、阿维单抗
(avelumab)(MSB0010718C)和度伐鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)中的一种或多种，并且
其中所述癌症任选地选自结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌中的一种或多种。在某些实施例中，所述拮抗剂是PD-1拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、
PDR001和皮地利珠单抗(pidilizumab)中的一种或多种。在一些实施例中，所述PD-1拮抗剂是纳武单抗，并且所述癌症任选地选自霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和卵巢癌中的一种或多种。在某些实施例中，所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，并且所述癌症任选地选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌和尿路上皮癌中的一种或多种。
(avelumab)(MSB0010718C)和度伐鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)中的一种或多种，并且
其中所述癌症任选地选自结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌中的一种或多种。在某些实施例中，所述拮抗剂是PD-1拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、
PDR001和皮地利珠单抗(pidilizumab)中的一种或多种。在一些实施例中，所述PD-1拮抗剂是纳武单抗，并且所述癌症任选地选自霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和卵巢癌中的一种或多种。在某些实施例中，所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，并且所述癌症任选地选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌和尿路上皮癌中的一种或多种。
[0028] 在一些实施例中，所述拮抗剂是PD-L2拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0029] 在某些实施例中，所述拮抗剂是CTLA-4拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、伊匹木单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)中
的一种或多种。在特定实施例中，所述癌症选自黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌中的一种或多种。
的一种或多种。在特定实施例中，所述癌症选自黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌中的一种或多种。
[0030] 在某些实施例中，所述拮抗剂是IDO拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、吲哚莫德(indoximod)(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满(norharmane)；9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝坦
(epacadostat)中的一种或多种，并且其中所述癌症任选地选自转移性乳腺癌和脑癌，任选地多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤或恶性脑肿瘤中的一种或多种。
(epacadostat)中的一种或多种，并且其中所述癌症任选地选自转移性乳腺癌和脑癌，任选地多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤或恶性脑肿瘤中的一种或多种。
[0031] 在某些实施例中，所述拮抗剂是TDO拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、680C91和LM10中的一种或多种。
[0032] 在一些实施例中，所述拮抗剂是TIM-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0033] 在某些实施例中，所述拮抗剂是LAG-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子和BMS-986016中的一种或多种。
[0034] 在某些实施例中，所述拮抗剂是VISTA拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0035] 在某些实施例中，所述拮抗剂是BTLA拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0036] 在一些实施例中，所述拮抗剂是CD160拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0037] 在某些实施例中，所述拮抗剂是HVEM拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0038] 在某些实施例中，所述拮抗剂是TIGIT拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0039] 在一些实施例中，刺激性免疫检查点分子选自OX40、CD40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)中的一种或多种。
[0040] 在某些实施例中，所述激动剂是OX40激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、OX86、Fc-OX40L和GSK3174998中的一种或多种。
[0041] 在某些实施例中，其中所述激动剂是CD40激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、CP-870,893、达西珠单抗(dacetuzumab)、Chi Lob
7/4、ADC-1013和rhCD40L中的一种或多种，并且其中所述癌症任选地选自黑色素瘤、胰腺
癌、间皮瘤和血液癌，任选地淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
7/4、ADC-1013和rhCD40L中的一种或多种，并且其中所述癌症任选地选自黑色素瘤、胰腺
癌、间皮瘤和血液癌，任选地淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
[0042] 在某些实施例中，所述激动剂是GITR激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、INCAGN01876、DTA-1和MEDI1873中的一种或多种。
[0043] 在某些实施例中，所述激动剂是CD137激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、乌托米单抗(utomilumab)和4-1BB配体中的一种或多
种。
种。
[0044] 在特定实施例中，所述激动剂是CD27激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、瓦利鲁单抗(varlilumab)和CDX-1127(1F5)中的一种
或多种。
或多种。
[0045] 在某些实施例中，所述激动剂是CD28激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体和TAB08中的一种或多种。
[0046] 在某些实施例中，所述激动剂是CD226激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体中的一种或多种。
[0047] 在某些实施例中，所述激动剂是HVEM激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体中的一种或多种。
[0048] 在某些实施例中，(b)的癌症免疫治疗剂是选自Oncophage，任选地Gardasil或Cervarix等人乳头瘤病毒HPV疫苗，任选地Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix等乙型肝
炎疫苗，以及sipuleucel-T(普罗文奇(Provenge))中的一种或多种的癌症疫苗，或者包括
选自以下一种或多种的癌抗原：人类Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗
原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-
1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)
以及间皮素。
炎疫苗，以及sipuleucel-T(普罗文奇(Provenge))中的一种或多种的癌症疫苗，或者包括
选自以下一种或多种的癌抗原：人类Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗
原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-
1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)
以及间皮素。
[0049] 在某些实施例中，(b)的癌症免疫治疗剂是选自以下一种或多种的溶瘤病毒：talimogene laherparepvec(T-VEC)、柯萨基病毒A21(CAVATAKTM)、Oncorine(H101)、
pelareorep 塞内卡谷(Seneca Valley)病毒(NTX-010)、塞内卡病毒
(Senecavirus)SVV-001、ColoAd1、SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401。
pelareorep 塞内卡谷(Seneca Valley)病毒(NTX-010)、塞内卡病毒
(Senecavirus)SVV-001、ColoAd1、SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401。
[0050] 在一些实施例中，(b)的癌症免疫治疗剂是选自以下一种或多种的细胞因子：干扰素(IFN)-α、IL-2、IL-12、IL-7、IL-21和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
[0051] 在一些实施例中，(b)的癌症免疫治疗剂是基于细胞的免疫疗法，其包括癌抗原特异性T细胞，任选地离体衍生的T细胞。在一些实施例中，癌抗原特异性T细胞的癌症免疫治疗剂选自嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润淋巴
细胞(TIL)以及肽诱导T细胞中的一种或多种。
细胞(TIL)以及肽诱导T细胞中的一种或多种。
[0052] 在一些实施例中，(b)的癌症免疫治疗剂选自IDO拮抗剂、CD20拮抗剂、B-Raf拮抗剂、IL-2、GM-CSF和溶瘤病毒中的一种或多种。
[0053] 在一些实施例中，所述IDO拮抗剂是吲哚莫德，和/或其中所述CD20激动剂是利妥昔单抗(rituximab)，和/或其中所述B-Raf拮抗剂是维罗非尼(vemurafenib)，和/或其中所述溶瘤病毒是talimogene laherparepvec(T-VEC)或柯萨奇病毒A21(CAVATAKTM)。
[0054] 在一些实施例中，(a)的精氨酸耗竭剂和(b)的癌症免疫治疗剂被单独地施用。在一些实施例中，(a)的精氨酸耗竭剂和(b)的癌症免疫治疗剂作为同一组合物的一部分被一
起施用。
起施用。
[0055] 在一些实施例中，所述癌症选自以下一种或多种：肝细胞癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌(gastric cancer)、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头颈癌，宫颈癌，睾丸癌和胃癌(stomach cancer)。
[0056] 还包含用于治疗有需要的受试者体内的癌症的过继性T细胞免疫疗法的方法，其包括：
[0057] (a)将离体衍生的T细胞(i)与精氨酸耗竭剂或(ii)在补充有瓜氨酸的无精氨酸培养基中孵育；
[0058] (b)向所述受试者施用离体衍生的T细胞。
[0059] 在某些实施例中，(a)或(b)的离体衍生的T细胞包括癌抗原特异性T细胞。在某些实施例中，癌抗原特异性T细胞选自嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修
饰的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及肽诱导T细胞中的一种或多种。
饰的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及肽诱导T细胞中的一种或多种。
[0060] 还包含在体内或离体地增加T细胞活化和/或调节T细胞(Treg)下调的方法，其包括(a)用精氨酸耗竭剂孵育T细胞，(b)在补充有瓜氨酸的无精氨酸培养基中孵育T细胞，或
者(a)和(b)两者。
者(a)和(b)两者。
[0061] 在某些实施例中，精氨酸耗竭剂是ADI多肽。在某些实施例中，所述ADI多肽包括选自表A1的序列、由选自表A1的序列组成或基本上由其组成，包含具有ADI活性的其变体和片段。在某些实施例中，所述变体包括至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同于来自表A1的序列的序列。
[0062] 在某些实施例中，所述ADI多肽通过任选的连接基团共价键合到至少一个PEG分子。在一些实施例中，所述ADI多肽共价键合到多于一个PEG分子。在某些实施例中，所述ADI多肽共价键合到约1个到约10个PEG分子。在某些实施例中，所述ADI多肽共价键合到约2个
到约8个PEG分子。在某些实施例中，所述PEG分子是直链或支链PEG分子。在某些实施例中，所述PEG具有约1,000到约40,000的总平均分子量。在一些实施例中，所述PEG具有约10,000到约30,000的总平均分子量。在特定实施例中，所述PEG具有约20,000的总平均分子量。
到约8个PEG分子。在某些实施例中，所述PEG分子是直链或支链PEG分子。在某些实施例中，所述PEG具有约1,000到约40,000的总平均分子量。在一些实施例中，所述PEG具有约10,000到约30,000的总平均分子量。在特定实施例中，所述PEG具有约20,000的总平均分子量。
[0063] 在某些实施例中，连接基团是琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基团、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基、亚甲基基团或其任何组合。在某些实施例中，所述琥珀酰基的来源是琥珀酰亚胺琥珀酸酯。
[0064] 在某些实施例中，所述精氨酸耗竭剂是聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG)。在特定示例性实施例中，所述ADI-PEG是ADI-PEG 20。
[0066] (a)将精氨酸转换为瓜氨酸的精氨酸耗竭剂；以及
[0067] (b)癌症免疫治疗剂。
[0069] 图1A到图1C示出了ADI-PEG 20增强抗CD3/CD28诱导的T细胞活化。在存在或不存在ADI-PEG 20或mutADI-PEG 20的情况下，用抗CD3/CD28Dynabeads刺激PBMC。在24、48和72小时通过流式细胞术测定所有T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(图1C)中CD69+细胞的
百分比。
百分比。
[0070] 图2A到图2C示出了ADI-PEG 20阻断T细胞上抗CD3/CD28诱导的PD-1上调。在存在或不存在ADI-PEG 20或mutADI-PEG 20的情况下，用抗CD3/CD28Dynabeads刺激PBMC。在24、
48和72小时通过流式细胞术测定所有T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(C)中PD-1+细
胞的百分比。
48和72小时通过流式细胞术测定所有T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(C)中PD-1+细
胞的百分比。
[0071] 图3A到图3C示出了ADI-PEG 20缓和T细胞上抗CD3/CD28诱导的PD-L1上调。在存在或不存在ADI-PEG 20或mutADI-PEG 20的情况下，用抗CD3/CD28Dynabeads刺激PBMC。在24、
48、72小时通过流式细胞术测定所有T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(C)中PD-L1+细
胞的百分比。
48、72小时通过流式细胞术测定所有T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(C)中PD-L1+细
胞的百分比。
[0072] 图4A到图4C示出了ADI-PEG 20抑制T细胞上抗CD3/CD28诱导的CTLA-4上调。在存在或不存在ADI-PEG 20或mutADI-PEG 20的情况下，用抗CD3/CD28Dynabeads刺激PBMC。在
24、48和72小时通过流式细胞术测定所有T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(C)中CTLA-
4+细胞的百分比。
24、48和72小时通过流式细胞术测定所有T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(C)中CTLA-
4+细胞的百分比。
[0073] 图5A到图5C示出了ADI-PEG 20逆转抗CD3/CD28诱导的Treg累积。在存在或不存在ADI-PEG 20或mutADI-PEG 20的情况下，用抗CD3/CD28Dynabeads刺激PBMC。在24、48和72小时通过流式细胞术测定CD4+T细胞中Treg的百分比。通过CD3+CD4+CD25+FoxP3+(A)、CD3+
CD4+CD25+FoxP3+PD-L1+(B)或CD3+CD4+CD25+FoxP3+CTLA-4+(C)标记测定Treg细胞。
CD4+CD25+FoxP3+PD-L1+(B)或CD3+CD4+CD25+FoxP3+CTLA-4+(C)标记测定Treg细胞。
[0074] 图6A示出了ADI-PEG 20对植入B16-F10同系肿瘤并用载剂(PBS；对照)对比ADI-PEG 20进行治疗的C57BL/6小鼠的体重的影响，并且图6B示出了ADI-PEG 20对植入B16-F10
同系肿瘤并用载剂(PBS；对照)对比ADI-PEG 20进行治疗的C57BL/6小鼠的动态肿瘤体积的
影响。
同系肿瘤并用载剂(PBS；对照)对比ADI-PEG 20进行治疗的C57BL/6小鼠的动态肿瘤体积的
影响。
[0075] 图7示出了ADI-PEG 20治疗诱导C57BL/6小鼠的B16-F10肿瘤中的T细胞浸润。示出了在ADI-PEG 20治疗的小鼠的肿瘤切片中检测到的T细胞数量与载剂治疗的对照相比。
[0076] 图8示出了对携带CT26建立的肿瘤的雌性Balb/c小鼠施用ADI-PEG20和/或抗PD-L1mAb后的体重。数据点表示组平均体重。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
[0077] 图9示出了对携带CT26建立的肿瘤的雌性BALB/C小鼠施用ADI-PEG20和/或抗PD-L1mAb后的肿瘤体积轨迹(肿瘤生长曲线)。数据点表示组平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
[0078] 图10示出了对携带CT26建立的肿瘤的雌性BALB/C小鼠施用ADI-PEG20和/或抗PD-L1mAb后的存活曲线。当肿瘤达到3000mm3时，处死每只动物。
[0079] 图11示出了对携带B16F10建立的肿瘤的雌性C57BL/6J小鼠施用ADI-PEG 20和/或抗PD-1mAb后的体重。数据点表示组平均体重。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
[0080] 图12示出了对携带B16F10建立的肿瘤的雌性C57BL/6J小鼠施用ADI-PEG20和/或抗PD-1mAb后第13天的肿瘤体积。
具体实施方式
[0081] 除非另外定义，否则本文所使用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管与本文所描述的那些类似或等同的任何方
法、材料、组合物、试剂、细胞可以用于实践或测试本公开的主题，但描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包含但不限于专利和专利申请，均通过引用以其全文并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献都具体并单独地表明为如完全阐述
地通过引用并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也以上文对于出版物和参考文献
描述的方式通过引用以其全文并入本文。
法、材料、组合物、试剂、细胞可以用于实践或测试本公开的主题，但描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包含但不限于专利和专利申请，均通过引用以其全文并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献都具体并单独地表明为如完全阐述
地通过引用并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也以上文对于出版物和参考文献
描述的方式通过引用以其全文并入本文。
[0082] 除非特别相反地指出，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中许多方法在下文中出于说明的目的而描述。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，《最新蛋白质科学实验指南、最新分子生物学实验指南或最新免疫学实验指南(Current Protocols in Protein
Science,Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in
Immunology)》，John Wiley和Sons，纽约(N.Y.)，(2009)；Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》，第3版，Wiley和Sons，1995；Sambrook和Russell，《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，(第3版，
2001)；Maniatis等人，《分子克隆：实验手册》，(1982)；《DNA克隆：一种实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》，第I和II卷(D.Glover编辑)；《寡核苷酸合成
(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编辑，1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid
Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑，1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell
Culture)》(R.Freshney编辑，1986)；Perbal，《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)以及其它相似参考文献。
Science,Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in
Immunology)》，John Wiley和Sons，纽约(N.Y.)，(2009)；Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》，第3版，Wiley和Sons，1995；Sambrook和Russell，《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，(第3版，
2001)；Maniatis等人，《分子克隆：实验手册》，(1982)；《DNA克隆：一种实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》，第I和II卷(D.Glover编辑)；《寡核苷酸合成
(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编辑，1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid
Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑，1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell
Culture)》(R.Freshney编辑，1986)；Perbal，《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)以及其它相似参考文献。
[0083] 标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书进行，或者如本领域通常实现的或如本文所述的进行。这些和相关的技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的。除非提供具
体的定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名和实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术可以用于重组技
术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
体的定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名和实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术可以用于重组技
术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
[0084] 出于本公开的目的，以下术语定义如下。
[0085] 本文使用冠词“一个(a)”和“一种(an)”来指一个或多于一个(即，至少一个)所述冠词的语法宾语。通过举例，“元件”意指一个元件或多于一个元件。
[0086] “约”是指量、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、总量、重量或长度相对于参考量、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、总量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
[0087] “拮抗剂”是指干扰或以其它方式降低另一种药剂或分子的生理作用的生物结构或化学试剂。在一些情况下，拮抗剂特异性结合其它药剂或分子。包含全部和部分拮抗剂。
[0088] “激动剂”是指增加或增强另一种药剂或分子的生理作用的生物结构或化学试剂。在一些情况下，激动剂特异性结合其它药剂或分子。包含全部和部分激动剂。
[0089] 如本文所使用的，术语“氨基酸”旨在表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。例如，天然存在的氨基酸包含在蛋白质生物合成期间使用的20(L)-氨基酸以及其它如4-羟基脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包含本领域技术人员已知的例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等。氨基酸类似物包含天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。此类修饰可以包含例如氨基酸上的化学基团和部分的取代或置换，或通过氨基酸的
衍生化。氨基酸模拟物包含例如有机结构，其表现出功能相似的性质，如参考氨基酸的电荷和电荷间隔特征。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有位于相似分子空间中且具
有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基相同的迁移度的正电荷部分。模拟物还包含受
约束的结构，以便维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间隔和电荷相互作用。本领域技术人
员已知或可以确定哪些结构构成功能等同的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
衍生化。氨基酸模拟物包含例如有机结构，其表现出功能相似的性质，如参考氨基酸的电荷和电荷间隔特征。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有位于相似分子空间中且具
有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基相同的迁移度的正电荷部分。模拟物还包含受
约束的结构，以便维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间隔和电荷相互作用。本领域技术人
员已知或可以确定哪些结构构成功能等同的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
[0090] “生物相容的”是指通常对生物功能无害并且不会导致包含过敏原和疾病状态在内的任何程度的不可接受毒性的材料或化合物。
[0091] “编码序列”是指有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不直接有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。
[0092] 贯穿本公开内容，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括了(comprises)”和“包括着(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或一组步骤或要素但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。
[0093] “由...组成”意味着包含并限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示所列要素是必需的或强制的，并且可能不存在其它要素。“基本上由...组成”是指包含在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本公开中针对所列要素指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由...组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响
所列要素的活性或作用。
所列要素的活性或作用。
[0094] 术语“不含内毒素”或“基本上不含内毒素”通常涉及至多含有痕量(例如，对受试者没有临床不利生理作用的量)，以及优选地无法检测到的内毒素含量的内毒素。内毒素是与某些微生物，如细菌(典型地革兰氏阴性细菌)相关的毒素，尽管可能在如单核细胞增生李斯特菌等革兰氏阳性细菌中发现内毒素。最普遍的内毒素是在各种革兰氏阴性细菌的外
膜中发现的脂多糖(LPS)或脂低聚糖(LOS)，其表示这些细菌引起疾病的能力的中心致病特
征。人体中的少量内毒素可以产生发热、降低血压、激活炎症和凝血、以及其它不利的生理作用。
膜中发现的脂多糖(LPS)或脂低聚糖(LOS)，其表示这些细菌引起疾病的能力的中心致病特
征。人体中的少量内毒素可以产生发热、降低血压、激活炎症和凝血、以及其它不利的生理作用。
[0095] 因此，在药物生产中，通常需要从药物产品和/或药物容器中除去大部分或全部痕量的内毒素，因为即使少量也可能对人类产生不良影响。除热原烘箱可以用于此目的，因为通常需要超过300℃的温度来分解大多数内毒素。例如，基于如注射器或小瓶的初级包装材料，250℃的玻璃温度和30分钟的保持时间的组合通常足以实现内毒素水平的3个对数减
少。考虑除去内毒素的其它方法，包含例如如本文所述的和本领域已知的色谱法和过滤法。
少。考虑除去内毒素的其它方法，包含例如如本文所述的和本领域已知的色谱法和过滤法。
[0096] 可以使用本领域已知的常规技术检测内毒素。例如，利用来自马蹄蟹的血液的鲎变形细胞溶解物测定法是用于检测内毒素存在的非常灵敏的测定法。在此测试中，非常低
水平的LPS就可以引起鲎溶解物的可检测凝固，这是由于强大的酶促级联反应放大了该反
应。内毒素也可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量。为基本上不含内毒素，内毒素水平可以低于活性化合物的约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、
0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mg。通常，1ng脂多糖(LPS)对应于约1到
10EU。
水平的LPS就可以引起鲎溶解物的可检测凝固，这是由于强大的酶促级联反应放大了该反
应。内毒素也可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量。为基本上不含内毒素，内毒素水平可以低于活性化合物的约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、
0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mg。通常，1ng脂多糖(LPS)对应于约1到
10EU。
[0097] 多肽的“半衰期”可以指多肽相对于在施用于生物体的血清或组织时的此类活性、或相对于任何其它定义的时间点丧失其药理学、生理学或其它活性的一半所花费的时间。“半衰期”还可以指多肽的量或浓度在施用于生物体的血清或组织时相对于施用于生物体
的血清或组织中的量或浓度或相对于任何其它定义的时间点减少起始量的一半所花费的
时间。可以在血清和/或任何一种或多种选定组织中测量半衰期。
的血清或组织中的量或浓度或相对于任何其它定义的时间点减少起始量的一半所花费的
时间。可以在血清和/或任何一种或多种选定组织中测量半衰期。
[0098] 术语“调节”和“改变”包含“增加”、“增强”或“刺激”，以及“降低”或“减少”，通常相对于对照具有统计学显著或生理学显著的量或程度。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包含所有整数和其间的范围，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的增加。“降低”或“减少”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含所有整数和其间的范围)的非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的减少。本文描述了比较和“统计学显著”量的实例。
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含所有整数和其间的范围)的非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的减少。本文描述了比较和“统计学显著”量的实例。
[0099] 术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且意指不限于任何特定长度的氨基酸的聚合物。术语“酶”包含多肽或蛋白质催化剂，并且就ADI而言，其可与蛋白质、多肽或肽互换使用。所述术语包含如豆蔻酰化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或缺失等修饰。术语“多肽”或“蛋白质”意指一个或多个氨基酸链，其中每个链包括通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可以包括多个通过肽键非共价和/或共价连接且具有天然蛋白质序列的链，即，由天然存在的以及特别是非重组细胞、或基因工程或重组细胞产生的蛋白质，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个
或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括本文所述的ADI酶/蛋白质，或具有ADI蛋白质的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。在某些实施例中，多肽是由重组细胞产生的“重组”多肽，所述重组细胞包括一个或多个重组DNA分子，所述重组DNA分子通常由在细胞中无法以其它方式找到的异源多核苷酸序列或多
核苷酸序列的组合制成。
或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括本文所述的ADI酶/蛋白质，或具有ADI蛋白质的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。在某些实施例中，多肽是由重组细胞产生的“重组”多肽，所述重组细胞包括一个或多个重组DNA分子，所述重组DNA分子通常由在细胞中无法以其它方式找到的异源多核苷酸序列或多
核苷酸序列的组合制成。
[0100] 本文提及的术语“分离的”多肽或蛋白质是指受试蛋白质：(1)不含至少一些其它蛋白质，通常将使用所述至少一些其它蛋白质在自然界中发现所述受试蛋白质；(2)基本上不含来自相同来源，例如，来自相同物种的其它蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；
(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或与其天然缔合的其它物质分离；(5)不和与“分离的蛋白质”天然缔合的蛋白质部分缔合(通过共价或非共价相互作用)；(6)和不与其天然缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(7)在自然界中不存
在。这种分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，或者可以具有合成来源，或其任何组合。在某些实施例中，分离的蛋白质基本上不含在其天然环境中会发现的且会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。
(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或与其天然缔合的其它物质分离；(5)不和与“分离的蛋白质”天然缔合的蛋白质部分缔合(通过共价或非共价相互作用)；(6)和不与其天然缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(7)在自然界中不存
在。这种分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，或者可以具有合成来源，或其任何组合。在某些实施例中，分离的蛋白质基本上不含在其天然环境中会发现的且会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。
[0101] 在某些实施例中，组合物中任何给定药剂(例如，ADI、ADI-PEG)的“纯度”可以被具体定义。例如，某些组合物可以包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的药剂，包含所有小数和其间的范围，例如且绝不限制，通过高效液相色谱法(HPLC)测量的，高效液相色谱法是在生物化学和分析化学中常用的用
来分离、鉴定和定量化合物的公知形式柱色谱法。
来分离、鉴定和定量化合物的公知形式柱色谱法。
[0102] 术语“参考序列”通常是指与另一序列正在进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列都作为参考序列而包含，包含通过名称描述的那
些和在表和序列表中描述的那些。
些和在表和序列表中描述的那些。
[0103] 如本文所使用的术语“序列同一性”或例如，包括“与之50％一致的序列”是指在一个比较窗口内，在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上序列一致的程度。因此，“序列一致性百分比”可以通过以下方式计算：在所述比较窗口内比较两个经最佳比对的序列，测定在这两个序列中出现一致的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或一致的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)的位置的数目，从而得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以所述比较窗口中的位置的总数目(即，窗口大小))，并且将所述结果乘以100，得到序列一致性百分比。
用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法(美国威斯康星州麦迪逊科学大道575
号遗传学电脑集团的威斯康星州遗传学软件包7.0版本中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实施方式，或者通过检验各种所选方法中的任何方法产生的最佳比对(即，导致比较窗口内的最高百分比同源性)。还可以参考如例如由Altschul等人，《核酸研究
(NuclAcids Res)》，25:3389，1997所公开的BLAST程序家族。
用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法(美国威斯康星州麦迪逊科学大道575
号遗传学电脑集团的威斯康星州遗传学软件包7.0版本中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实施方式，或者通过检验各种所选方法中的任何方法产生的最佳比对(即，导致比较窗口内的最高百分比同源性)。还可以参考如例如由Altschul等人，《核酸研究
(NuclAcids Res)》，25:3389，1997所公开的BLAST程序家族。
[0104] 术语“溶解度”是指本文提供的药剂(例如，ADI、ADI-PEG)溶解在液体溶剂中并形成均匀溶液的性质。溶解度通常表示为浓度，是每单位体积溶剂的溶质质量(每千克溶剂的溶质克数、g/dL(100mL)、mg/ml等)、摩尔浓度、质量摩尔浓度、摩尔分数或其它类似的浓度描述。可溶解每种单位量溶剂的溶质的最大均衡量是所述溶质在包含温度、压力、pH和溶剂的性质的特定条件下在所述溶剂中的溶解度。在某些实施例中，在生理pH或其它pH，例如，pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8、或pH8.0(例如，约pH 5到pH 8)下测量溶解度。在某些实施例中，在水或如PBS或NaCl(有或无NaP)的生理缓冲液中测量溶解度。在特定实施例中，在相对较低的pH(例如，pH 6.0)和相对较高的盐(例如，500mM的NaCl和10mM的NaP)下测量溶解度。在某些实施例中，在如血液或血清的生物流体(溶剂)中测量溶解度。在某些实施例中，温度可以约为室温(例如，约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃)或约为体温(37℃)。在某些实施例中，药剂在室温或37℃下具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、
60、70、80、90或100mg/ml的溶解度。
60、70、80、90或100mg/ml的溶解度。
[0106] “基本上”或“实质上”意指几乎完全或完全，例如，某些给定量的95％、96％、97％、98％、99％、或更高。
[0107] “统计上显著”意味着结果不太可能偶然发生。统计显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。常用的显著性度量包含p值，如果零假设为真，则p值是发现事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则零假设被否定。在简单的例子中，显著性水平定义为p值为0.05或更小。
[0108] “治疗反应”是指基于一种或多种治疗剂的给药改善症状(无论是否持续)。
[0109] 如本文所使用的，受试者(例如哺乳动物，如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变个体或细胞的自然进程的任何类型的干预。治疗包含但不限于施用药物组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始后或与病原体接触后进行。还包含“预防性”治疗，其可以针对于降低所治疗的疾病或病症的进展速率、延迟所述疾病或病症的发作、或降低其发病的严
重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病症或其相关症状。
重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病症或其相关症状。
[0110] 术语“野生型”是指在群体中最常观察到的基因或基因产物(例如，多肽)，并且因此被任意地称为基因的“正常”或“野生型”形式。
[0112] 在整个本公开中，可以使用以下缩写：PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚胺酶；SS，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺；SPA，琥珀酰亚胺丙酸酯；NHS，N-羟基-琥珀酰亚胺；ASS1或ASS，精氨琥珀酸合成酶。
[0113] 精氨酸耗竭剂
[0114] 某些实施例采用一种或多种精氨酸耗竭剂。在某些情况下，精氨酸耗竭剂将精氨酸转化为瓜氨酸(和氨)，由此耗竭或减少细胞例如癌细胞和/或T细胞可用的精氨酸的供
应。
应。
[0115] 某些示例性精氨酸耗竭剂包含精氨酸脱亚胺酶(ADI)酶或多肽。在一些实施例中，ADI多肽来自人型支原体、精氨酸支原体、关节炎支原体、海豹脑支原体、猫支原体、海豹支原体、鸽支原体、衣阿华支原体、鳄鱼支原体、短吻鳄支原体、奥氏嗜热盐丝菌或牛支原体。
在一些实施例中，ADI多肽来自唾液支原体、泡沫支原体、加拿大支原体、耳支原体、猪滑液支原体、泄殖腔支原体、鹅支原体、产碱支原体、口腔支原体、惰性支原体、火鸡支原体、蜂房支原体、穿透支原体、鸡支原体、梨支原体、类人猿支原体、发酵支原体、狮咽支原体、气管支原体、模仿支原体、乳白色支原体、毛氏支原体、象支原体、肺炎支原体、龟支原体、支原体属CAG:877、或支原体属CAG:472。
在一些实施例中，ADI多肽来自唾液支原体、泡沫支原体、加拿大支原体、耳支原体、猪滑液支原体、泄殖腔支原体、鹅支原体、产碱支原体、口腔支原体、惰性支原体、火鸡支原体、蜂房支原体、穿透支原体、鸡支原体、梨支原体、类人猿支原体、发酵支原体、狮咽支原体、气管支原体、模仿支原体、乳白色支原体、毛氏支原体、象支原体、肺炎支原体、龟支原体、支原体属CAG:877、或支原体属CAG:472。
[0116] 说明性ADI多肽提供于下表A1中。
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132] 因此，在一些实施例中，ADI多肽包括、由或基本由来自表A1(SEQ ID NO:1-56)的示例性序列，或具有ADI活性的其变体或片段组成。
[0133] 某些实施例包含本文所述的参考ADI多肽序列的变体，无论是通过名称还是通过参考表或序列标识符(例如，表A1、SEQ ID NO:1-56)描述。“变体”序列是指在一个或多个取代、缺失(例如，截短)、添加和/或插入上与参考序列不同的多肽或多核苷酸序列。因此，某些变体包含本文描述的参考序列的片段。变体多肽具有生物学活性，即，其继续具有参考多肽的酶促或结合活性。此类变体可以由例如，遗传多态性和/或人为操纵产生。
[0134] 在许多情况下，生物活性变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸的取代，使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。如上所述，可以对本公开的多核苷酸和多肽的结构进行修
饰，并且仍然获得编码具有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨
基酸序列以产生本文所述的多肽的等同物或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通
常会改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
饰，并且仍然获得编码具有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨
基酸序列以产生本文所述的多肽的等同物或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通
常会改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
[0135] 例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不会明显丧失与如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的结构的相互作用结合能力。由于蛋白质的相互
作用能力和性质定义了蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸
序列取代，当然，也可以在其基础DNA编码序列中进行，并且虽然如此获得具有类似蛋白质的蛋白质属性。因此预期可以对所公开组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行
各种改变而不会明显丧失其效用。
作用能力和性质定义了蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸
序列取代，当然，也可以在其基础DNA编码序列中进行，并且虽然如此获得具有类似蛋白质的蛋白质属性。因此预期可以对所公开组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行
各种改变而不会明显丧失其效用。
[0136] 在进行这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性在本领域中公知(Kyte和Doolittle，1982，通过引用并
入本文)。可以理解的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这又定义了蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，其都被指定了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些数值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+
1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；苏氨酸(–0.7)；丝氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；组氨酸(–3.2)；谷氨酸盐(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸盐(–
3.5)；天冬酰胺(–3.5)；赖氨酸(–3.9)；以及精氨酸(–4.5)。本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸取代，并仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物学功能等同的蛋白质。在进行这种改变时，优选其亲水指数在±2以内的氨基
酸的取代，特别优选±1以内的氨基酸取代，更特别优选±0.5以内的氨基酸取代。
入本文)。可以理解的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这又定义了蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，其都被指定了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些数值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+
1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；苏氨酸(–0.7)；丝氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；组氨酸(–3.2)；谷氨酸盐(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸盐(–
3.5)；天冬酰胺(–3.5)；赖氨酸(–3.9)；以及精氨酸(–4.5)。本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸取代，并仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物学功能等同的蛋白质。在进行这种改变时，优选其亲水指数在±2以内的氨基
酸的取代，特别优选±1以内的氨基酸取代，更特别优选±0.5以内的氨基酸取代。
[0137] 本领域还应理解的是，可以基于亲水性有效地取代相似的氨基酸。美国专利4,554,101(通过引用以其全文并入本文)指出，由蛋白质相邻氨基酸的亲水性支配的其最大
局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,554,101中所详述，以下亲水性值已指定为氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+
3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-
1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上
等同的，特别是免疫学上等同的蛋白质。在这种改变时，优选其亲水性数值在±2以内的氨
基酸的取代，特别优选±1以内的氨基酸取代，更特别优选±0.5以内的氨基酸取代。
局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,554,101中所详述，以下亲水性值已指定为氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+
3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-
1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上
等同的，特别是免疫学上等同的蛋白质。在这种改变时，优选其亲水性数值在±2以内的氨
基酸的取代，特别优选±1以内的氨基酸取代，更特别优选±0.5以内的氨基酸取代。
[0138] 如上所述，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，并且包含：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0139] 可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包含赖氨酸和精氨酸；以及具有相似亲水性数值的不带电极性头部基团的氨基酸包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守变化的其它氨基酸基团包含：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。
[0140] 变体还可以或可替代地含有非保守变化。在优选的实施例中，变体多肽与天然或参考序列的不同之处在于取代、缺失或添加少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2个氨基酸，或甚至1个氨基酸。变体也可(或可替代地)通过例如，对多肽的免疫原性、二级结构、酶活性和/或亲水性质影响最小的氨基酸的缺失或添加进行修饰。
[0141] 在某些实施例中，多肽序列在长度上为约、至少约、或多至约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、
120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、
310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、
500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、
690、700、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、
860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个(包含其间的所有整数)连续的氨基酸，并且可以包括参考序列的全部或部分(参见例如，序列
表)。
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、
120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、
310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、
500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、
690、700、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、
860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个(包含其间的所有整数)连续的氨基酸，并且可以包括参考序列的全部或部分(参见例如，序列
表)。
[0142] 在某些实施例中，多肽序列由约或不超过约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、
42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、
150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、
340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、
530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、
720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、
900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个(包含其间的所有整数)连续的氨基酸组成，并且可以包括参考序列的全部或部分(参见例如，序列表)。
42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、
150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、
340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、
530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、
720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、
900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个(包含其间的所有整数)连续的氨基酸组成，并且可以包括参考序列的全部或部分(参见例如，序列表)。
[0143] 在某些实施例中，多肽序列约为10到1000、10到900、10到800、10到700、10到600、10到500、10到400、10到300、10到200、10到100、10到50、10到40、10到30、10到20、20到1000、
20到900、20到800、20到700、20到600、20到500、20到400、20到300、20到200、20到100、20到
50、20到40、20到30、50到1000、50到900、50到800、50到700、50到600、50到500、50到400、50到300、50到200、50到100、100到1000、100到900、100到800、100到700、100到600、100到500、
100到400、100到300、100到200、200到1000、200到900、200到800、200到700、200到600、200到500、200到400或200到300(包含其间的所有整数)个连续的氨基酸，并且可以包括参考序列的全部或部分。在某些实施例中，任何参考多肽的C末端或N末端区域可被截短约1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、
160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、或800或更多(包含其间的所有整数)个氨基酸，或约10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、
250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-
750、750-800或更多(包含其间的所有整数，例如，101、102、103、104、105)个氨基酸，只要截短的多肽保留参考多肽的结合特性和/或活性。通常，生物活性片段具有不少于其衍生自的生物活性参考多肽的活性的约1％、约5％、约10％、约25％或约50％。
20到900、20到800、20到700、20到600、20到500、20到400、20到300、20到200、20到100、20到
50、20到40、20到30、50到1000、50到900、50到800、50到700、50到600、50到500、50到400、50到300、50到200、50到100、100到1000、100到900、100到800、100到700、100到600、100到500、
100到400、100到300、100到200、200到1000、200到900、200到800、200到700、200到600、200到500、200到400或200到300(包含其间的所有整数)个连续的氨基酸，并且可以包括参考序列的全部或部分。在某些实施例中，任何参考多肽的C末端或N末端区域可被截短约1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、
160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、或800或更多(包含其间的所有整数)个氨基酸，或约10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、
250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-
750、750-800或更多(包含其间的所有整数，例如，101、102、103、104、105)个氨基酸，只要截短的多肽保留参考多肽的结合特性和/或活性。通常，生物活性片段具有不少于其衍生自的生物活性参考多肽的活性的约1％、约5％、约10％、约25％或约50％。
[0144] 通常，变体将显示与参考多肽序列至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相似性或序列同一性或序列同源性。此外，序列与天然或亲本序列的差异在于添加(例如，C-末端添加、N-末端添加、C-末端添加和N-末端添加两者)、缺失、截短、插入或取代了(例如，保守取代)约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、或100(包含其间的所有整数和范围)个氨基酸，但保留了亲本或参考多肽序列的特性或活性。
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、或100(包含其间的所有整数和范围)个氨基酸，但保留了亲本或参考多肽序列的特性或活性。
[0145] 在一些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在某些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少1％但小于20％、15％、10％或5％的残基。(如果此比较要求比对，则应比对序列以获得最大相似性。删除或插入或错配的“环”序列被视为差异)。
[0146] 序列之间的序列相似性或序列同一性的计算(这些术语在本文中可互换使用)如下进行。为了测定两个氨基酸序列、或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比对的目的将序列比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用
于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略)。在某些实施例中，出于比较目的比对的序列长度是参照序列长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％、以及更甚优选地70％、80％、90％、100％。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或
核苷酸占据时，则这些分子在那个位置是一致的。
于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略)。在某些实施例中，出于比较目的比对的序列长度是参照序列长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％、以及更甚优选地70％、80％、90％、100％。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或
核苷酸占据时，则这些分子在那个位置是一致的。
[0147] 两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位数量以及每个空位的长度，需要引入它们以用于两个序列的最佳比对。
[0148] 序列比较和两个序列之间百分比同一性的测定可以使用数学算法来完成。在优选的实施例中，两个氨基酸序列之间的百分比一致性可以通过已经合并在GCG软件包中的GAP
程序中的Needleman和ffunsch(《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》，48:444-453，1970)算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、
4、5或6来确定。在另一优选的实施例中，两个核苷酸序列之间的百分比同一性通过GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80以及长度权重1、2、
3、4、5或6确定。一组特别优选的参数(除非另有说明，否则应使用的参数)是Blossum 62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。
程序中的Needleman和ffunsch(《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》，48:444-453，1970)算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、
4、5或6来确定。在另一优选的实施例中，两个核苷酸序列之间的百分比同一性通过GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80以及长度权重1、2、
3、4、5或6确定。一组特别优选的参数(除非另有说明，否则应使用的参数)是Blossum 62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。
[0149] 两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比可以通过已合并在ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(Cabios)》，4:11-17，1989)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。
[0150] 本文描述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行检索，从而例如，鉴定其它家族成员或相关序列。此类检索可以使用Altschul等人，(1990，《分子生物学杂志》，215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来进行。可以用XBLAST程序(分值＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本文描述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质检索，以获得与本文描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以利用如在Altschul等人，(《核酸研究(Nucleic Acids Res)》，25:3389-3402，1997)中所描述的空位的BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
[0151] 在一些实施例中，如上所述，可以使用BLAST比对工具评估多核苷酸和/或多肽。局部比对仅由一对序列区段组成，每个序列区段中的一个序列区段被比较。对Smith-Waterman或Sellers算法的修正将找到所有不能通过扩展或修剪来改善分数的称为高分值
片段对(HSP)的片段对。BLAST比对的结果包含统计学测量，以指示仅偶然可以预期BLAST评分的可能性。
片段对(HSP)的片段对。BLAST比对的结果包含统计学测量，以指示仅偶然可以预期BLAST评分的可能性。
[0152] 原始分数S从与每个比对序列相关的空位和取代的数量计算，其中较高的相似性分数表示更显著的比对。取代分数由查询表给出(参见PAM，BLOSUM)。
[0153] 空位分数通常计算为G(空位开启罚分)和L(空位延伸罚分)之和。对于长度为n的空位，空位成本为G+Ln。空位成本G和L的选择是经验性的，但习惯上选择G(10到15)的高值，例如11，以及L(1到2)的低值，例如，1。
[0154] 比特分数S'衍生自原始比对分数S，其中已经考虑了所使用的评分系统的统计特性。比特分数相对于评分系统进行标准化，因此其可以用于比较来自不同检索的比对分数。
术语“比特分数”和“相似性分数”可互换使用。比特分数表明比对好的程度；分数越高，比对越好。
术语“比特分数”和“相似性分数”可互换使用。比特分数表明比对好的程度；分数越高，比对越好。
[0155] E值或预期值描述了具有相似分数的序列偶然出现在数据库中的可能性。E值或预期值是预测在数据库检索中偶然出现的具有等同于或优于S的分数的不同比对的数量的预
测。E值越小，比对越显著。例如，E值为e-117的比对意味着具有相似分数的序列很不可能仅偶然出现。另外，比对随机氨基酸对的预期得分要求是负的，否则长比对将倾向于具有高得分而不管与比对的区段是否相关。另外，BLAST算法使用适当的取代矩阵、核苷酸或氨基酸，并且对于空位比对，使用空位产生和延伸罚分。例如，BLAST比对和多肽序列的比较通常使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行。
测。E值越小，比对越显著。例如，E值为e-117的比对意味着具有相似分数的序列很不可能仅偶然出现。另外，比对随机氨基酸对的预期得分要求是负的，否则长比对将倾向于具有高得分而不管与比对的区段是否相关。另外，BLAST算法使用适当的取代矩阵、核苷酸或氨基酸，并且对于空位比对，使用空位产生和延伸罚分。例如，BLAST比对和多肽序列的比较通常使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行。
[0156] 在一些实施例中，从使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行的BLAST分析中报告序列相似性分数。
[0157] 在具体实施例中，本文提供的序列同一性/相似性分数是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，圣地亚哥，加利福尼亚)使用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的百分比同一性和百分比相似性；使用GAP权重8
和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，《美国科学院院报(PNAS
USA)》，89:10915-10919，1992)的氨基酸序列的百分比同一性和百分比相似性。GAP使用
Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》，48:443-453，1970)的算法来找到两个完整序列的比对，所述比对最大化匹配数并最小化空位数。
和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，《美国科学院院报(PNAS
USA)》，89:10915-10919，1992)的氨基酸序列的百分比同一性和百分比相似性。GAP使用
Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》，48:443-453，1970)的算法来找到两个完整序列的比对，所述比对最大化匹配数并最小化空位数。
[0158] 在特定实施例中，变体多肽包括可以与参考多肽序列最佳比对的氨基酸序列(参见，例如，序列表)，以产生至少约50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、
170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、
360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、
550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、
740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、
930、940、950、960、970、980、990、1000或更多(包含其间的所有整数和范围)的BLAST比特分数或序列相似性分数，其中BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1。
170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、
360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、
550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、
740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、
930、940、950、960、970、980、990、1000或更多(包含其间的所有整数和范围)的BLAST比特分数或序列相似性分数，其中BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1。
[0159] 如上所述，参考多肽可以以各种方式改变，包含氨基酸取代、缺失、截短、添加和插入。这样操作的方法是本技术领域中所公知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变来制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel，(《美国科学院院报》，82:488-492，1985)；Kunkel等人，(《酶学方法(Methods in Enzymol)》，154:367-382，1987)、美国专利号4,873,192，Watson,J.D.等人，(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》，第四版，本杰明-卡明斯公司，门洛帕克，加利福尼亚，1987)以及本文引用的参考文献。关于不影响关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人，(1978)，《蛋白质序列和结构(Atlas of Protein
Sequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)。
Sequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)。
[0160] 用于筛选通过这种修饰制备的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选具有所选性质的基因产物的cDNA文库的方法是本领域已知的。这种方法适用于快速筛选通过参考
多肽的组合诱变产生的基因文库。作为一个例子，递归总体诱变(REM)——一种增强文库中功能性突变体频率的技术，可以与筛选试验组合使用以鉴定多肽变体(Arkin和Yourvan，
《美国科学院院报》，89:7811-7815，1992；Delgrave等人，《蛋白质工程(Protein
Engineering)》，6:327-331，1993)。
多肽的组合诱变产生的基因文库。作为一个例子，递归总体诱变(REM)——一种增强文库中功能性突变体频率的技术，可以与筛选试验组合使用以鉴定多肽变体(Arkin和Yourvan，
《美国科学院院报》，89:7811-7815，1992；Delgrave等人，《蛋白质工程(Protein
Engineering)》，6:327-331，1993)。
[0161] 在一些情况下，天然ADI可以衍生自微生物，因此可以是免疫原性的和/或可以从患者的循环中快速清除的。通过修饰ADI以产生“修饰的ADI”酶可以克服此类问题。因此，某些实施例包含包括“修饰剂”的ADI酶，其实例包含但不限于大分子聚合物、蛋白质、肽、多糖和其它化合物。ADI酶和修饰剂可以通过共价键或非共价相互作用连接以形成稳定的缀合
物或稳定的组合物以实现期望的效果。在某些实施例中，修饰的ADI保留相应的未修饰的
ADI(例如，相同或相似序列)的生物活性，并且具有比相应的未修饰的ADI更长的体内半衰
期和更低的抗原性。在某些实施例中，修饰的ADI保留相应的未修饰的ADI至少30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或更多的生物活性。通常，修饰的ADI保留足以用于治疗用途的生物活性。
物或稳定的组合物以实现期望的效果。在某些实施例中，修饰的ADI保留相应的未修饰的
ADI(例如，相同或相似序列)的生物活性，并且具有比相应的未修饰的ADI更长的体内半衰
期和更低的抗原性。在某些实施例中，修饰的ADI保留相应的未修饰的ADI至少30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或更多的生物活性。通常，修饰的ADI保留足以用于治疗用途的生物活性。
[0162] 在一些实施例中，修饰剂可以是生物相容的聚合物或蛋白质或其片段，并且可以增加血液中ADI的半衰期。修饰剂可以与ADI化学偶联或在适用的情况下通过融合蛋白表达
与ADI连接。
与ADI连接。
[0163] 高分子聚合物可以包含非肽高分子聚合物，其在某些实施例中可以具有其自身的生物活性。合适的聚合物包含但不限于多烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯烷酮、多聚氨基酸、二乙烯醚和马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、多糖、聚氧乙基多醇、肝素或其片段、聚烷基乙二醇及其衍生物，聚烷基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚(乙烯基乙醚)、a,P-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺]、聚羧酸盐、聚氧乙烯-聚甲醛、聚丙烯酰吗啉、氨基化合物和氧烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧化物、乙二酸和丙二酸的共聚物、聚(1,
3-二氧戊环)乙烯和马来酰肼共聚物、聚唾液酸、环糊精等。在某些实施例中，所述聚合物是聚乙二醇。
3-二氧戊环)乙烯和马来酰肼共聚物、聚唾液酸、环糊精等。在某些实施例中，所述聚合物是聚乙二醇。
[0164] 如本文所使用的多烯醇化合物包含但不限于聚乙二醇(包含单甲氧基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等，及其衍生物，如脂质。
[0165] 聚醚化合物包含但不限于聚亚烷基二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)2O)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)。
[0166] 多聚氨基酸包含但不限于一种氨基酸的聚合物或两种或更多种氨基酸的共聚物，例如，聚丙氨酸或聚赖氨酸，或其嵌段共聚物。
[0168] 在特定实施例中，通过与蛋白质或肽偶联来修饰ADI，其中一种或多种蛋白质或肽直接或间接地与ADI连接。蛋白质可以是天然存在的蛋白质或其片段，包含但不限于如甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、a1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、Ig Fc区、白蛋白，及其片段的天然存在的人血清蛋白质或其片段。“片段”是指蛋白质上其小于整个蛋白质但保留了蛋白质的期望功能的任何部分。如本文所述的ADI可以通过共价键直
接或间接地与蛋白质连接。直接连接是指ADI的一个氨基酸通过肽键或二硫键直接与修饰
蛋白的一个氨基酸连接。间接连接是指ADI和修饰蛋白之间通过其间最初存在的化学基团
或通过生物或化学方法添加的特定化学基团，或上述连接的组合进行的连接。
接或间接地与蛋白质连接。直接连接是指ADI的一个氨基酸通过肽键或二硫键直接与修饰
蛋白的一个氨基酸连接。间接连接是指ADI和修饰蛋白之间通过其间最初存在的化学基团
或通过生物或化学方法添加的特定化学基团，或上述连接的组合进行的连接。
[0169] 在特定实施例中，通过与一个或多个PEG分子的共价连接来修饰ADI。用PEG共价修饰的ADI(有或无连接基团)在下文中可称为“ADI-PEG”。与未修饰的ADI相比，ADI-PEG保留其大部分酶活性、具有更小的免疫原性或抗原性、具有大大延长的循环半衰期，并且在肿瘤治疗中更有效。
[0170] “聚乙二醇”或“PEG”是指支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，由通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为4。“聚乙二醇”或“PEG”与数字后缀组合使用以表示其近似重均分子量。例如，PEG5,000是指总重均分子量为约5,000的PEG；PEG12,000是指总重均分子量为约12,000的PEG；以及PEG20,000是指总重均分子量为约20,000的PEG。
[0171] 在一些实施例中，PEG的总重均分子量为约1,000到约50,000；约3,000到约40,000；约5,000到约30,000；约8,000到约30,000；约11,000到约30,000；约12,000到约28,
000；约16,000到约24,000；约18,000到约22,000；或约19,000到约21,000。在一些实施例中，PEG的总重均分子量为约1,000到约50,000；约3,000到约30,000；约3,000到约20,000；
约4,000到约12,000；约4,000到约10,000；约4,000到约8,000；约4,000到约6,000；或约5,
000。在一些实施例中，PEG的总重均分子量为约20,000。通常，分子量为30,000或更多的PEG难以溶解，并且配制产品的产率可能降低。PEG可以是支链或直链。通常，增加PEG的分子量会降低ADI的免疫原性。PEG可以是支链或直链，并且在某些实施例中是直链。具有本文所述的分子量的PEG可以与ADI结合使用，并且任选地，与生物相容性连接基团结合使用。
000；约16,000到约24,000；约18,000到约22,000；或约19,000到约21,000。在一些实施例中，PEG的总重均分子量为约1,000到约50,000；约3,000到约30,000；约3,000到约20,000；
约4,000到约12,000；约4,000到约10,000；约4,000到约8,000；约4,000到约6,000；或约5,
000。在一些实施例中，PEG的总重均分子量为约20,000。通常，分子量为30,000或更多的PEG难以溶解，并且配制产品的产率可能降低。PEG可以是支链或直链。通常，增加PEG的分子量会降低ADI的免疫原性。PEG可以是支链或直链，并且在某些实施例中是直链。具有本文所述的分子量的PEG可以与ADI结合使用，并且任选地，与生物相容性连接基团结合使用。
[0172] 某些实施例使用硫醇、巯基或半胱氨酸反应性PEG。在一些实施例中，硫醇、巯基或半胱氨酸反应性PEG与一个或多个天然存在的半胱氨酸残基、一个或多个引入的半胱氨酸残基连接(例如，用(多个)半胱氨酸残基取代一个或多个野生型残基)、插入一个或多个半
胱氨酸残基或其任何组合连接(参见例如，Doherty等人，《生物共轭化学(Bioconjug
Chem)，16:1291-98，2005)。在某些实施例中，某些野生型ADI半胱氨酸残基可以首先被另一种氨基酸取代，以防止PEG聚合物与野生型半胱氨酸的连接，例如，以防止PEG破坏其它期望的生物活性。一些实施例使用一种或多种非天然半胱氨酸衍生物(例如，高半胱氨酸)而非
半胱氨酸。
胱氨酸残基或其任何组合连接(参见例如，Doherty等人，《生物共轭化学(Bioconjug
Chem)，16:1291-98，2005)。在某些实施例中，某些野生型ADI半胱氨酸残基可以首先被另一种氨基酸取代，以防止PEG聚合物与野生型半胱氨酸的连接，例如，以防止PEG破坏其它期望的生物活性。一些实施例使用一种或多种非天然半胱氨酸衍生物(例如，高半胱氨酸)而非
半胱氨酸。
[0173] 硫醇、巯基或半胱氨酸反应性PEG的非限制性实例包含甲氧基PEG马来酰亚胺(M-PEG-MAL)(例如，MW 2000、MW 5000、MW 10000、MW 20000、MW 30000、MW 40000)。M-PEG-MAL与蛋白质和肽中的半胱氨酸侧链上的硫醇基团反应，以产生稳定的3-硫代琥珀酰亚胺基醚
键。此反应具有高选择性，可在约pH 5.0到pH 6.5的温和条件下，在其它官能团存在下进
行。商业上可获得的硫醇、巯基或半胱氨酸反应性PEG分子的具体实例示于图1A到图1D中。
因此，在某些实施例中，ADI酶与本文所述的硫醇、巯基或半胱氨酸反应性PEG分子的任何一种或多种缀合。
键。此反应具有高选择性，可在约pH 5.0到pH 6.5的温和条件下，在其它官能团存在下进
行。商业上可获得的硫醇、巯基或半胱氨酸反应性PEG分子的具体实例示于图1A到图1D中。
因此，在某些实施例中，ADI酶与本文所述的硫醇、巯基或半胱氨酸反应性PEG分子的任何一种或多种缀合。
[0174] 尽管优选的实施例使用连接基团，但ADI可以与具有或不具有连接基团的修饰剂，如PEG共价键合。ADI可以通过生物相容性连接基团使用本领域已知的方法与PEG共价键合，例如，如Park等人，《抗癌研究(Anticancer Res.)》，1:373-376(1981)；以及Zaplipsky和Lee，《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用(Polyethylene Glycol Chemistry:
Biotechnical and Biomedical Applications)》，J.M.Harris编辑，普莱纽姆出版社，纽约，第21章(1992)，其公开内容通过引用以其全文并入本文。在一些情况下，ADI可以直接(即，无连接基团)，例如，通过氨基、巯基、羟基、羧基或其它基团偶联到修饰剂如PEG上。
Biotechnical and Biomedical Applications)》，J.M.Harris编辑，普莱纽姆出版社，纽约，第21章(1992)，其公开内容通过引用以其全文并入本文。在一些情况下，ADI可以直接(即，无连接基团)，例如，通过氨基、巯基、羟基、羧基或其它基团偶联到修饰剂如PEG上。
[0175] 用于将ADI共价连接至修饰剂(例如PEG)的连接基团可以是任何生物相容性连接基团。如上所述，“生物相容的”表示化合物或基团是无毒的并且可以在体外或体内使用而不会引起损伤、疾病、病症或死亡。修饰剂如PEG可以例如，通过醚键、硫醇键、酰胺键或其它键与连接基团键合。
[0176] 在一些实施例中，合适的连接基团可以具有例如约1到100个原子、1到80个原子、1到60个原子、1到40个原子、1到30个原子、1到20个原子，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子的总链长，其中链中的原子包括C、S、N、P、和/或O。在某些实施例中，连接基团是任选的，例如，PEG缀合的ADI酶不包括连接基团。在一些情况下，连接基团基团包含，例如，琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基团、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基基团及其组合。稳定连接基团的具体实例包含琥珀酰亚胺基、丙酸、羧甲基连接、醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、氨基甲酰胺、酰亚胺、脂族C-C键和硫醚。在某些实施例中，生物相容性连接基团是琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)基团。
[0177] 其它合适的连接基团包含氧羰基咪唑基(包含，例如，羰基咪唑(CDI))、硝基苯基(包含，例如，硝基苯基碳酸酯(NCP)或三氯苯基碳酸酯(TCP))、甲苯磺酸酯基、醛基、异氰酸酯基、乙烯基砜基或伯胺。在某些实施例中，连接基团衍生自SS、SPA、SCM或NHS；在某些实施例中，使用SS、SPA或NHS，并且在一些实施例中，使用SS或SPA。因此，在某些实施例中，潜在的连接基团可以由甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基戊二
酸酯(SG)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基羧甲基酯
(SCM)、甲氧基-PEG2N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基戊二酰胺和/或甲氧基-PEG
琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺形成。
酸酯(SG)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基羧甲基酯
(SCM)、甲氧基-PEG2N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基戊二酰胺和/或甲氧基-PEG
琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺形成。
[0178] 连接基团的附加实例包含但不限于以下一种或多种：—O—、—NH—、—S—、—C(O)—、C(O)—NH、NH—C(O)—NH、O—C(O)—NH、—C(S)—、—CH2—、—CH2—CH2—、—CH2—CH2—CH2—、—CH2—CH2—CH2—CH2—、—O—CH2—、—CH2—O—、—O—CH2—CH2—、—CH2—O—CH2—、—CH2—CH2—O—、—O—CH2—CH2—CH2—、—CH2—O—CH2—CH2—、—
CH2—CH2—O—CH2—、—CH2—CH2—CH2—O—、—O—CH2—CH2—CH2—C H2—、—CH2—O—CH2—CH2—CH2—、—CH2—CH2—O—CH2—CH2—、—CH2—C H2—CH2—O—CH2—、—CH2—CH2—CH2—CH2—O—、—C(O)—NH—CH2—、—C(O)—NH—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—NH—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—NH—、—C(O)—NH—CH2—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—NH—
CH2—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—、—C(O)—
NH—CH2—CH2—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—NH—CH2—CH2—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—
NH—CH2—CH2—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—
CH2—CH2—、—CH2—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—、—NH—C(O)—CH2—、—CH2—NH—C
(O)—CH2—、—CH2—CH2—NH—C(O)—CH2—、—NH—C(O)—CH2—CH2—、—CH2—NH—C
(O)—CH2—CH2、—CH2—CH2—NH—C(O)—CH2—C H2、—C(O)—NH—CH2—、—C(O)—NH—CH2—CH2—、—O—C(O)—NH—CH2—、—O—C(O)—NH—CH2—CH2—、—NH—CH2—、—NH—CH2—CH2—、—CH2—NH—CH2—、—CH2—CH2—NH—CH2—、—C(O)—CH2—、—C(O)—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—CH2—
CH2—、—CH2—CH2—C(O)—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—CH2—NH—、—CH2—
CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—CH2—NH—C(O)—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—
CH2—NH—C(O)—CH2—、二价环烷基、—N(R6)—，R6是H或选自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基组成的基团的有机基。另外，本文所述的任何连接基团部分可以进一步包含环氧乙烷低聚物链，其包括1到20个环氧乙烷单体单元
[即，-(CH2CH2O)1-20-]。即，环氧乙烷低聚物链可以在连接基团之前或之后出现，并且任选地在包括两个或更多个原子的连接基团部分的任何两个原子之间。并且，如果低聚物与聚合
物链节相邻并且仅代表聚合物链节的延伸，则低聚物链将不被认为是连接基团部分的一部
分。
CH2—CH2—O—CH2—、—CH2—CH2—CH2—O—、—O—CH2—CH2—CH2—C H2—、—CH2—O—CH2—CH2—CH2—、—CH2—CH2—O—CH2—CH2—、—CH2—C H2—CH2—O—CH2—、—CH2—CH2—CH2—CH2—O—、—C(O)—NH—CH2—、—C(O)—NH—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—NH—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—NH—、—C(O)—NH—CH2—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—NH—
CH2—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—、—C(O)—
NH—CH2—CH2—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—NH—CH2—CH2—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—
NH—CH2—CH2—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—
CH2—CH2—、—CH2—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—、—NH—C(O)—CH2—、—CH2—NH—C
(O)—CH2—、—CH2—CH2—NH—C(O)—CH2—、—NH—C(O)—CH2—CH2—、—CH2—NH—C
(O)—CH2—CH2、—CH2—CH2—NH—C(O)—CH2—C H2、—C(O)—NH—CH2—、—C(O)—NH—CH2—CH2—、—O—C(O)—NH—CH2—、—O—C(O)—NH—CH2—CH2—、—NH—CH2—、—NH—CH2—CH2—、—CH2—NH—CH2—、—CH2—CH2—NH—CH2—、—C(O)—CH2—、—C(O)—CH2—CH2—、—CH2—C(O)—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—CH2—、—CH2—CH2—C(O)—CH2—
CH2—、—CH2—CH2—C(O)—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—CH2—NH—、—CH2—
CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—CH2—NH—C(O)—、—CH2—CH2—CH2—C(O)—NH—CH2—
CH2—NH—C(O)—CH2—、二价环烷基、—N(R6)—，R6是H或选自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基组成的基团的有机基。另外，本文所述的任何连接基团部分可以进一步包含环氧乙烷低聚物链，其包括1到20个环氧乙烷单体单元
[即，-(CH2CH2O)1-20-]。即，环氧乙烷低聚物链可以在连接基团之前或之后出现，并且任选地在包括两个或更多个原子的连接基团部分的任何两个原子之间。并且，如果低聚物与聚合
物链节相邻并且仅代表聚合物链节的延伸，则低聚物链将不被认为是连接基团部分的一部
分。
[0179] 具体的示例性PEG分子和连接基团描述于下表A2中。
[0180]
[0181] 在某些实施例中，ADI酶包括一种或多种如本文(例如，在表A2中)所描述的PEG分子和/或连接基团。
[0182] PEG与ADI的连接增大了ADI的循环半衰期。通常，PEG与ADI的伯胺连接。如本领域技术人员已知的，通过蛋白质活性结构域内每个位点的作用来确定ADI上的PEG或其它修饰
剂的连接位点的选择。PEG可以连接到ADI的伯胺而基本上不损失酶活性。例如，ADI中存在的赖氨酸残基是所有可能的点，在所述点处，如本文所述的ADI可以通过如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS的生物相容性连接基团与PEG连接。作为对于本领域技术人员而言是显而易见的，PEG也可以连接到ADI上的其它位点。
剂的连接位点的选择。PEG可以连接到ADI的伯胺而基本上不损失酶活性。例如，ADI中存在的赖氨酸残基是所有可能的点，在所述点处，如本文所述的ADI可以通过如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS的生物相容性连接基团与PEG连接。作为对于本领域技术人员而言是显而易见的，PEG也可以连接到ADI上的其它位点。
[0183] 1到约30个PEG分子可以与ADI共价键合。在某些实施例中，用(即，包括)一个PEG分子修饰ADI。在一些实施例中，用多于一个的PEG分子修饰ADI。在特定的实施例中，用约1到约10、或约7到约15个PEG分子，或约2到约8或约9到约12个PEG分子修饰ADI。在一些实施例中，用约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个PEG分子修饰ADI。在特定实施例中，以每个ADI用4.5到5.5个PEG分子来修饰ADI。在一些实施例中，用5±1.5个PEG分子修饰ADI。
[0184] 在某些实施例中，ADI中约15％到约70％的伯氨基用PEG修饰，在一些实施例中精氨酸脱亚胺酶中约20％到约65％、约25％到约60％，或在某些实施例中约30％到约55％、或
45％到约50％，或在一些实施例中约50％的的伯氨基用PEG修饰。当PEG与ADI的末端共价键合时，可以期望仅使用1个PEG分子。增加ADI上PEG单元的数量会增加酶的循环半衰期。然
而，增加ADI上PEG单元的数量会降低酶的比活性。因此，鉴于本公开内容，对本领域技术人员显而易见的是，需要在两者之间实现平衡。
45％到约50％，或在一些实施例中约50％的的伯氨基用PEG修饰。当PEG与ADI的末端共价键合时，可以期望仅使用1个PEG分子。增加ADI上PEG单元的数量会增加酶的循环半衰期。然
而，增加ADI上PEG单元的数量会降低酶的比活性。因此，鉴于本公开内容，对本领域技术人员显而易见的是，需要在两者之间实现平衡。
[0185] 在一些实施例中，生物相容性连接基团的共同特征是其通过琥珀酰亚胺基团与精氨酸脱亚胺酶的伯胺连接。一旦与ADI偶联，SS-PEG具有在PEG旁边的酯键，这可以使所述位点对血清酯酶敏感，其可以从体内的ADI释放PEG。SPA-PEG和PEG2-NHS不具有酯键，因此其对血清酯酶不敏感。
[0186] 与SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG一样，与蛋白质连接的PEG可以是直链，或与PEG2-NHS一样，可以使用PEG的支链。
[0187] 在某些实施例中，与位于酶的催化区域处或附近的ADI相关的聚乙二醇化位点被修饰。在某些实施例中，短语“聚乙二醇化位点”定义为可以用聚乙二醇共价修饰的ADI的任何位点或位置。可以认为“聚乙二醇化位点”位于酶的催化区域处或附近，其中位点的聚乙二醇化使酶的催化活性显著降低。此类位点的聚乙二醇化常规上会导致酶的失活。例如，来自人型支原体的ADI在位置112具有赖氨酸，所述位置可以被认为是在酶的催化区域处或附
近。PEG在位置112与所述赖氨酸的连接可以使酶失活。此外，来自人型支原体的ADI在位置
397具有半胱氨酸，所述位置可以被认为是在酶的催化区域处或附近。在位置397的半胱氨
酸的氨基酸取代可以使酶失活。特别地，在位置397用丙氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸或酪氨酸取代半胱氨酸可导致所有可检测的酶活性的丧失。来自人型支原体的ADI还具
有位于该保守半胱氨酸附近的三个赖氨酸残基，具体地是Lys374、Lys405和Lys408。PEG与Lys374、Lys405、Lys408或其组合的连接可以使酶失活。
近。PEG在位置112与所述赖氨酸的连接可以使酶失活。此外，来自人型支原体的ADI在位置
397具有半胱氨酸，所述位置可以被认为是在酶的催化区域处或附近。在位置397的半胱氨
酸的氨基酸取代可以使酶失活。特别地，在位置397用丙氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸或酪氨酸取代半胱氨酸可导致所有可检测的酶活性的丧失。来自人型支原体的ADI还具
有位于该保守半胱氨酸附近的三个赖氨酸残基，具体地是Lys374、Lys405和Lys408。PEG与Lys374、Lys405、Lys408或其组合的连接可以使酶失活。
[0188] 应理解，衍生自其它生物体的ADI也可以具有对应于来自人型支原体的ADI的位置112的聚乙二醇化位点。此外，来自某些生物体的ADI可以具有对应于与来自人型支原体的
ADI的位置112相同的一般位置的赖氨酸残基。来自这些生物体的ADI中赖氨酸的位置是本
领域技术人员已知的，并描述于美国专利号6,635,462中。
ADI的位置112相同的一般位置的赖氨酸残基。来自这些生物体的ADI中赖氨酸的位置是本
领域技术人员已知的，并描述于美国专利号6,635,462中。
[0189] 因此，一些实施例提供在ADI的多肽链中的某些氨基酸取代。这些氨基酸取代提供了修饰的ADI，其在被修饰剂修饰，例如，在聚乙二醇化时损失较少的活性。通过在酶的催化区域处或附近消除聚乙二醇化位点或其它已知的修饰位点，可以不丧失活性而实现最佳修
饰，例如，聚乙二醇化。
饰，例如，聚乙二醇化。
[0190] 在一些实施例中，例如，如上所述，氨基酸取代使用非天然氨基酸与PEG或其它修饰剂缀合(参见例如，de Graaf等人，《生物共轭化学》，20:1281-95，2009)。因此，某些实施例包含通过一种或多种非天然氨基酸与一个或多个PEG缀合的ADI酶。在一些实施例中，非
天然氨基酸包括具有选自由以下各项组成的基团的官能团的侧链：烷基、芳基、芳基卤、乙烯基卤、烷基卤、乙酰基、酮、氮杂环丙烷、腈、硝基、卤化物、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醚、环氧化物、砜、硼酸、硼酸酯、硼烷、苯硼酸、硫醇、硒基、磺酰基，硼酸酯、硼酸盐，膦基、膦羧基、磷化氢、杂环基、氮苯基、萘基、苯甲酮、受限环如环辛炔、硫酯、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基、羧酸、α-酮羧酸、α或β不饱和酸和酰胺、乙醛酰胺和有机硅烷基团。在一些实施例中，非天然氨基酸选自由以下各项组成的基团：对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、高半胱氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、β-O-GlcNAc-L-丝氨酸、三-O-乙酰基-GalNAc-α-苏氨酸、α-GalNAc-L-苏氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸，对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦丝氨酸、膦酰酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、以及异丙基-L-苯丙氨酸。
天然氨基酸包括具有选自由以下各项组成的基团的官能团的侧链：烷基、芳基、芳基卤、乙烯基卤、烷基卤、乙酰基、酮、氮杂环丙烷、腈、硝基、卤化物、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醚、环氧化物、砜、硼酸、硼酸酯、硼烷、苯硼酸、硫醇、硒基、磺酰基，硼酸酯、硼酸盐，膦基、膦羧基、磷化氢、杂环基、氮苯基、萘基、苯甲酮、受限环如环辛炔、硫酯、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基、羧酸、α-酮羧酸、α或β不饱和酸和酰胺、乙醛酰胺和有机硅烷基团。在一些实施例中，非天然氨基酸选自由以下各项组成的基团：对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、高半胱氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、β-O-GlcNAc-L-丝氨酸、三-O-乙酰基-GalNAc-α-苏氨酸、α-GalNAc-L-苏氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸，对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦丝氨酸、膦酰酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、以及异丙基-L-苯丙氨酸。
[0191] 虽然ADI-PEG是本文所述的示例性修饰的ADI，但如本领域技术人员所认识到的，ADI可以用其它聚合物或适当的分子修饰以获得期望效果，特别是降低抗原性和增加血清
半衰期。
半衰期。
[0192] 应理解，一些实施例基于以下理解：精氨酸脱亚胺酶的某些结构特征可以在通过重组技术产生时组织或干扰正确和快速的复性。具体地，这些结构特征阻碍或阻止酶在重
组产生期间呈现活性构象。在一些实施例中，术语“活性构象”定义为允许通过未修饰或修饰的精氨酸脱亚氨酶的酶活性的三维结构。特别地，活性构象可以是催化精氨酸转化为瓜
氨酸所必需的。术语“结构特征”可以定义为由特定氨基酸或氨基酸组合产生的多肽链的任何性状、质量或性质。例如，精氨酸脱亚胺酶可能含有导致正常肽链弯曲或扭结的氨基酸，从而阻碍酶在酶复性期间呈现活性构象。特别地，来自人型支原体的精氨酸脱亚胺酶在位
置210具有脯氨酸，其可能导致肽链中的弯曲或扭结，使得在重组产生期间更难以使酶重新形成。应理解，衍生自其它生物的精氨酸脱亚胺酶也可以具有对应于来自人型支原体的精
氨酸脱亚氨酶的位置210的位点。
组产生期间呈现活性构象。在一些实施例中，术语“活性构象”定义为允许通过未修饰或修饰的精氨酸脱亚氨酶的酶活性的三维结构。特别地，活性构象可以是催化精氨酸转化为瓜
氨酸所必需的。术语“结构特征”可以定义为由特定氨基酸或氨基酸组合产生的多肽链的任何性状、质量或性质。例如，精氨酸脱亚胺酶可能含有导致正常肽链弯曲或扭结的氨基酸，从而阻碍酶在酶复性期间呈现活性构象。特别地，来自人型支原体的精氨酸脱亚胺酶在位
置210具有脯氨酸，其可能导致肽链中的弯曲或扭结，使得在重组产生期间更难以使酶重新形成。应理解，衍生自其它生物的精氨酸脱亚胺酶也可以具有对应于来自人型支原体的精
氨酸脱亚氨酶的位置210的位点。
[0193] 因此，一些实施例提供在野生型精氨酸脱亚胺酶的多肽链中的某些氨基酸取代。实例包含消除精氨酸脱亚氨酶的肽链中有问题的结构特征的取代。还包含为修饰的精氨酸
脱亚氨酶提供改进的复性的取代。这些氨基酸取代使得使用减少量的缓冲液使修饰的精氨
酸脱亚胺酶快速复性成为可能。这些氨基酸取代还可以为复性修饰的精氨酸脱亚氨酶提供
提高的产率。在一些实施例中，修饰的精氨酸脱亚胺酶在P210处具有氨基酸取代或等同残
基。如上所述，源自人型支原体的精氨酸脱亚胺酶具有位于位置210的氨基酸脯氨酸。虽然没有限制，但据信在位置210的氨基酸脯氨酸的存在导致正常多肽链中的弯曲或扭结，这增加了某些精氨酸脱亚胺酶复性(即，重折叠)的难度。位置210的脯氨酸取代使得使用减少量的缓冲液使修饰的精氨酸脱亚胺酶快速复性成为可能。位置210的脯氨酸的取代(或等同的
残基)也可以为复性修饰的精氨酸脱亚氨酶提供提高的产率。在一些实施例中，位置210的
脯氨酸(或等同的残基)被丝氨酸取代。其它取代的非限制性实例包含Pro210到Thr210、
Pro210到Arg210、Pro210到Asn210、Pro210到Gln210或Pro210到Met210。通过消除与野生型精氨酸脱亚胺酶位置210的氨基酸相关的那些结构特征，可以实现酶的最佳重折叠。
脱亚氨酶提供改进的复性的取代。这些氨基酸取代使得使用减少量的缓冲液使修饰的精氨
酸脱亚胺酶快速复性成为可能。这些氨基酸取代还可以为复性修饰的精氨酸脱亚氨酶提供
提高的产率。在一些实施例中，修饰的精氨酸脱亚胺酶在P210处具有氨基酸取代或等同残
基。如上所述，源自人型支原体的精氨酸脱亚胺酶具有位于位置210的氨基酸脯氨酸。虽然没有限制，但据信在位置210的氨基酸脯氨酸的存在导致正常多肽链中的弯曲或扭结，这增加了某些精氨酸脱亚胺酶复性(即，重折叠)的难度。位置210的脯氨酸取代使得使用减少量的缓冲液使修饰的精氨酸脱亚胺酶快速复性成为可能。位置210的脯氨酸的取代(或等同的
残基)也可以为复性修饰的精氨酸脱亚氨酶提供提高的产率。在一些实施例中，位置210的
脯氨酸(或等同的残基)被丝氨酸取代。其它取代的非限制性实例包含Pro210到Thr210、
Pro210到Arg210、Pro210到Asn210、Pro210到Gln210或Pro210到Met210。通过消除与野生型精氨酸脱亚胺酶位置210的氨基酸相关的那些结构特征，可以实现酶的最佳重折叠。
[0194] 在特定实施例中，修饰的ADI是ADI-PEG 20。ADI-PEG 20指的是在以下各项中所描述的ADI分子，例如，美国专利号6,183,738；美国专利号6,635,462；Ascierto PA等人，
(2005)，对转移性黑色素瘤患者进行聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶治疗：来自I期和II期研究的结果(Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic
melanoma:results from phase I and II studies)，《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》，
23(30):7660–7668；Izzo F等人，(2004)，对无法切除肝细胞癌患者进行聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶治疗：来自I期和II期研究的结果(Pegylated arginine deiminase treatment
of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:results from phase I/
II studies)，《临床肿瘤学杂志》，22(10):1815–1822；Holtsberg FW等人，(2002)，聚(乙二醇)(PEG)缀合的精氨酸脱亚胺酶：PEG制剂对其药理学性质的影响(Poly(ethylene
glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase:effects of PEG formulations on its
pharmacological properties)，《控制释放杂志(J Control Release)》，80(1–3):259–
271；以及Kelly等人，(2012)，《英国癌症杂志(British Journal of Cancer)》，106,324-
332。如本领域技术人员所认识到的，ADI-PEG20是衍生自人型支原体的聚乙二醇化ADI酶
(5.5±1.0键合的PEG 20,000)，其相对于野生型人型支原体ADI序列具有两个取代(K112E；
P210S)。
(2005)，对转移性黑色素瘤患者进行聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶治疗：来自I期和II期研究的结果(Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic
melanoma:results from phase I and II studies)，《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》，
23(30):7660–7668；Izzo F等人，(2004)，对无法切除肝细胞癌患者进行聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶治疗：来自I期和II期研究的结果(Pegylated arginine deiminase treatment
of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:results from phase I/
II studies)，《临床肿瘤学杂志》，22(10):1815–1822；Holtsberg FW等人，(2002)，聚(乙二醇)(PEG)缀合的精氨酸脱亚胺酶：PEG制剂对其药理学性质的影响(Poly(ethylene
glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase:effects of PEG formulations on its
pharmacological properties)，《控制释放杂志(J Control Release)》，80(1–3):259–
271；以及Kelly等人，(2012)，《英国癌症杂志(British Journal of Cancer)》，106,324-
332。如本领域技术人员所认识到的，ADI-PEG20是衍生自人型支原体的聚乙二醇化ADI酶
(5.5±1.0键合的PEG 20,000)，其相对于野生型人型支原体ADI序列具有两个取代(K112E；
P210S)。
[0195] 技术人员将理解，本文所述的各种精氨酸耗竭剂可以与本文所述的各种癌症免疫治疗剂中的任意一种或多种组合，并根据本文所述的方法或组合物的任意一种或多种使
用。
用。
[0196] 免疫治疗剂
[0197] 某些实施例采用一种或多种癌症免疫治疗剂。在某些实例中，免疫治疗剂调节受试者的免疫应答例如以增加或保持癌症相关或癌症特异性免疫应答，并且由此导致增加的
免疫细胞抑制或癌细胞的减少。示例性免疫治疗剂包含多肽、例如抗体及其抗原结合片段、配体和小肽及其混合物。免疫治疗剂还包含小分子、细胞(例如，如T细胞等免疫细胞)、各种癌症疫苗、基因治疗剂或其它基于多核苷酸的药剂，包含如溶瘤病毒等病毒剂、以及本领域已知的其它药剂。因此，在某些实施例中，癌症免疫治疗剂选自免疫检查点调节剂、癌症疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法中的一种或多种。
免疫细胞抑制或癌细胞的减少。示例性免疫治疗剂包含多肽、例如抗体及其抗原结合片段、配体和小肽及其混合物。免疫治疗剂还包含小分子、细胞(例如，如T细胞等免疫细胞)、各种癌症疫苗、基因治疗剂或其它基于多核苷酸的药剂，包含如溶瘤病毒等病毒剂、以及本领域已知的其它药剂。因此，在某些实施例中，癌症免疫治疗剂选自免疫检查点调节剂、癌症疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法中的一种或多种。
[0198] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是免疫检查点调节剂。具体实例包含一个或多个抑制性免疫检查点分子的“拮抗剂”和一个或多个刺激性免疫检查点分子的“激动剂”。通常，免疫检查点分子是免疫系统的增强信号(共刺激分子)或减弱信号的组分，所述组分的
靶向具有对癌症的治疗潜力，因为癌症细胞可以扰乱免疫检查点分子的天然功能(参见例
如，Sharma和Allison，《科学(Science)》，348:56-61,2015；Topalian等人《，癌细胞(Cancer Cell)》，27:450-461,2015；Pardoll，癌症自然评论(Nature Reviews Cancer)，12:252-
264,2012)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂(例如，拮抗剂、激动剂)“结合”或“特异性结合”一个或多个免疫检查点分子，如本文所描述的。
靶向具有对癌症的治疗潜力，因为癌症细胞可以扰乱免疫检查点分子的天然功能(参见例
如，Sharma和Allison，《科学(Science)》，348:56-61,2015；Topalian等人《，癌细胞(Cancer Cell)》，27:450-461,2015；Pardoll，癌症自然评论(Nature Reviews Cancer)，12:252-
264,2012)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂(例如，拮抗剂、激动剂)“结合”或“特异性结合”一个或多个免疫检查点分子，如本文所描述的。
[0199] 在特定实施例中，免疫检查点调节剂是多肽或肽。术语“肽”和“多肽”在本文中可互换地使用，然而，在某些实例中，术语“肽”可以指较短的多肽，例如由约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸组成的多肽，包含其间的所有整数和范围(例如，5到10、8到12、10到15)。多肽和肽可以由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸构成，如本文所描述的。抗体也作为多肽包含。
[0200] 可以使用本领域已知的方法对多肽的结合性质进行定量(参见Davies等人，《生物化学年鉴(Annual Rev.Biochem.)》，59:439-473,1990)。在一些实施例中，多肽以约或范围为约≤10-7M到约10-8M的平衡解离常数特异性结合靶分子，例如免疫检查点分子或其表
位。在一些实施例中，平衡解离常数为约或范围为约≤10-9M到≤10-10M。在某些说明性实施例中，多肽具有对本文所描述的靶标(其特异性结合所述靶标)的约、至少约或小于约
0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、
3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、
19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、40nM或50nM的亲和力(Kd)。
位。在一些实施例中，平衡解离常数为约或范围为约≤10-9M到≤10-10M。在某些说明性实施例中，多肽具有对本文所描述的靶标(其特异性结合所述靶标)的约、至少约或小于约
0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、
3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、
19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、40nM或50nM的亲和力(Kd)。
[0201] 在一些实施例中，免疫检查点调节多肽剂是抗体或“其抗原结合片段”。抗体或抗原结合片段可以是基本上任何类型。如本领域众所周知的，抗体是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个表位识别位点特异性结合靶标的免疫球蛋白分子，如免疫检查
点分子。
点分子。
[0202] 如本文所使用的，术语“抗体”不仅包含完整多克隆或单克隆抗体，还包含其片段(如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包括具有拥有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体以及包括具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰
构型。本文更加详细地描述了抗体(和其抗原结合片段)的某些特征和特性。
构型。本文更加详细地描述了抗体(和其抗原结合片段)的某些特征和特性。
[0203] 如本文所使用的术语“抗原结合片段”是指含有结合关注的抗原的免疫球蛋白重和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段。在这方面，本文所描述的抗体的抗原结合片段可以
包括来自结合靶分子的抗体的VH和VL序列的1个、2个、3个、4个、5个或所有6个CDR。
包括来自结合靶分子的抗体的VH和VL序列的1个、2个、3个、4个、5个或所有6个CDR。
[0204] 术语“抗原”是指能够由如抗体等选择性结合剂结合并且另外能够在动物中使用以产生能够结合该抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。抗原可以具有一种或多种表
位。
位。
[0205] 术语“表位”包含能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选地多肽决定簇。表位是由抗体结合的抗原的区域。在某些实施例中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中可以具有特定三维结构特性和/或特定电荷特性。表位可以关于抗原的一级结构连续或非连续。
[0206] 如果如多肽或抗体等分子与特定细胞或物质反应或缔合比其与替代细胞或物质反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更大，则所述分子被称为展现“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体结合靶标比其结合其它物质亲和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，例如大统计上显著的量，则所述抗体“特异性结合”或“有线结合”靶标。例如，特异性或优先结合特异性表位的抗体是结合该特异性表位比其结合其它表位亲
和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。通过阅读此定义还应理解，例如特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。
如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他的结合。通常，但不是必然地，提及结合是指优先结合。
和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。通过阅读此定义还应理解，例如特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。
如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他的结合。通常，但不是必然地，提及结合是指优先结合。
[0207] 免疫结合通常是指在免疫球蛋白分子与抗原之间发生的类型的非共价相互作用，例如通过说明而非限制的方式，由于静电的、离子的、亲水的和/或疏水的吸引力或排斥力、空间力、氢键结合、范德华力和其它相互作用，免疫球蛋白对所述抗原具有特异性。可以在相互作用的解离常数(Kd)方面表达免疫结合相互作用的强度或亲和力，其中更小的Kd表示
更大的亲和力。可以使用本领域众所周知的方法对所选多肽的免疫结合性质定量。一个这
种方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合
物配偶体的浓度、相互作用的亲和力并且取决于同样在两个方向上影响速率的几何参数。
因此，可以通过计算缔合和解离的浓度和实际速率来确定“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。具有Koff/Kon的速率实现消除与亲和力无关的所有参数，并且因此等于解离常数Kd。
更大的亲和力。可以使用本领域众所周知的方法对所选多肽的免疫结合性质定量。一个这
种方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合
物配偶体的浓度、相互作用的亲和力并且取决于同样在两个方向上影响速率的几何参数。
因此，可以通过计算缔合和解离的浓度和实际速率来确定“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。具有Koff/Kon的速率实现消除与亲和力无关的所有参数，并且因此等于解离常数Kd。
[0208] 抗体可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任何技术制备。参见例如，Harlow和Lane，《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社，1988。可以例如使用Kohler和Milstein，《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》，
6:511-519,1976，以及对其的改进来制备对关注的多肽具有特异性的单克隆抗体。还包含
利用如小鼠等转基因动物表达人类抗体的方法。参见例如，Neuberger等人《，自然生物技术(Nature Biotechnology)》，14:826,1996；Lonberg等人，《实验药理学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)》，113:49-101,1994；以及Lonberg等人，《免疫学国际评论(Internal Review of Immunology)》，13:65-93,1995。特定实例包含来自
的 平台(参见例如，美国专利号6,596,541)。
6:511-519,1976，以及对其的改进来制备对关注的多肽具有特异性的单克隆抗体。还包含
利用如小鼠等转基因动物表达人类抗体的方法。参见例如，Neuberger等人《，自然生物技术(Nature Biotechnology)》，14:826,1996；Lonberg等人，《实验药理学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)》，113:49-101,1994；以及Lonberg等人，《免疫学国际评论(Internal Review of Immunology)》，13:65-93,1995。特定实例包含来自
的 平台(参见例如，美国专利号6,596,541)。
[0209] 还可以通过使用噬菌体展示文库或酵母展示文库产生或鉴定抗体(参见例如，美国专利号7,244,592；Chao等人，《自然实验手册(Nature Protocols)》，1:755-768,2006)。
可用文库的非限制性实例包含克隆或合成文库，如人类组合抗体文库(HuCAL)，在所述文库中，人类抗体谱的结构多样性由七个重链和七个轻链可变区基因表示。这些基因的组合产
生主文库中的49个框架。通过在这些框架上叠加高度可变基因盒(CDR＝互补决定区)，可以复制大量人类抗体谱。还包含用编码轻链可变区、重链CDR-3的人类供体来源的片段、编码重链CDR-1中的多样性的合成DNA以及编码重链CDR-2中的多样性的合成DNA设计的人类文
库。适合使用的其它文库对本领域技术人员而言将是清楚的。
可用文库的非限制性实例包含克隆或合成文库，如人类组合抗体文库(HuCAL)，在所述文库中，人类抗体谱的结构多样性由七个重链和七个轻链可变区基因表示。这些基因的组合产
生主文库中的49个框架。通过在这些框架上叠加高度可变基因盒(CDR＝互补决定区)，可以复制大量人类抗体谱。还包含用编码轻链可变区、重链CDR-3的人类供体来源的片段、编码重链CDR-1中的多样性的合成DNA以及编码重链CDR-2中的多样性的合成DNA设计的人类文
库。适合使用的其它文库对本领域技术人员而言将是清楚的。
[0210] 在某些实施例中，如本文所描述的抗体及其抗原结合片段包含分别插入重链与轻链框架区(FR)组之间的重链和轻链CDR组，所述FR组提供对CDR的支持并且限定CDR相对于
彼此的空间关系。如本文所使用的，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个超变区。从重链或轻链的N端出发，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含六个CDR，其包括来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。包括单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。对多种抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基形成与结合的抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链
CDR3的抗原接触。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
彼此的空间关系。如本文所使用的，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个超变区。从重链或轻链的N端出发，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含六个CDR，其包括来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。包括单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。对多种抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基形成与结合的抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链
CDR3的抗原接触。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
[0211] 如本文所使用的，术语“FR组”是指框住重链或轻链V区的CDR组中的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，具体地，与CDR直接相邻的FR残基。在FR内，某些氨基酸采集和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列含有具有大约90个氨基酸残基的内部二硫化物环。当V区折叠成结合位点时，CDR被展示为形成抗原结合表面的突出的环基序。通常认识到存在FR的保守结构区，所述保守结构区将CDR环的折叠形状变成某些“规范”结构——无论精确的CDR氨基酸序列如何。进一步地，已知某些FR残基参与非共价域间接触，所述非共价域间接触使抗体重链和轻链的相互作用稳定。
[0212] 免疫球蛋白可变域的结构和位置可参考Kabat、E.A.等人，《免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第4版，美国卫生与人类服务部，1987，和其更新来确定。
[0213] 还包含“单克隆”抗体，其是指均匀抗体群，其中单克隆抗体包括表位的选择性结合中涉及的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一表位。术语“单克隆抗体”不仅包含完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包含其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体以及包括具有所需特异性的抗原结合片段(表位识别位点)和结合
表位的能力的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型。不旨在限制关于抗体的源或其形成
的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物)。术语包含整个免疫球蛋白以及以上在“抗体”定义下描述的片段等。
表位的能力的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型。不旨在限制关于抗体的源或其形成
的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物)。术语包含整个免疫球蛋白以及以上在“抗体”定义下描述的片段等。
[0214] 蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生若干片段，所述片段(F(ab)片段)中的两个各自包括包含完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以
提供若干片段，包含包括两个抗原结合位点的F(ab')2片段。可以通过对IgM以及很少的IgG或IgA免疫球蛋白分子进行的优先蛋白水解切割来产生用于根据本发明的某些实施例使用
的Fv片段。然而，更一般地使用本领域已知的重组技术衍生Fv片段。Fv片段包含非共价VH::
VL异二聚体，其包含保留许多抗原识别和天然抗体分子的结合能力的抗原结合位点。参见
Inbar等人《，美国国家科学院院刊(PNAS USA.)》，69:2659-2662,1972；Hochman等人，《生物化学(Biochem.)》，15:2706-2710,1976；以及Ehrlich等人，《生物化学》，19:4091-4096,
1980。
提供若干片段，包含包括两个抗原结合位点的F(ab')2片段。可以通过对IgM以及很少的IgG或IgA免疫球蛋白分子进行的优先蛋白水解切割来产生用于根据本发明的某些实施例使用
的Fv片段。然而，更一般地使用本领域已知的重组技术衍生Fv片段。Fv片段包含非共价VH::
VL异二聚体，其包含保留许多抗原识别和天然抗体分子的结合能力的抗原结合位点。参见
Inbar等人《，美国国家科学院院刊(PNAS USA.)》，69:2659-2662,1972；Hochman等人，《生物化学(Biochem.)》，15:2706-2710,1976；以及Ehrlich等人，《生物化学》，19:4091-4096,
1980。
[0215] 在某些实施例中，设想单链Fv或scFV抗体。例如，k体(Ill等人，《蛋白质工程(Prot.Eng.)》，10:949-57,1997)；迷你体(Martin等人，《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》，13:5305-9,1994)；双体(Holliger等人，《美国国家科学院院刊》，90:6444-8,1993)；或Janusins(Traunecker等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，10:3655-59,1991；以及
Traunecker等人，《国际癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)》，7:51-52,1992)可以使用遵循本申请关于选择具有期望特异性的抗体的教导的标准分子生物学技术来制备。
Traunecker等人，《国际癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)》，7:51-52,1992)可以使用遵循本申请关于选择具有期望特异性的抗体的教导的标准分子生物学技术来制备。
[0216] 单链Fv(sFv)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其根据含有通过肽编码连接基团连接的VH和VL编码基因的基因融合表达。Huston等人，(《美国国家科学院院刊》，85(16):
5879-5883,1988)。已经描述了多种方法来辨别用于将天然聚合但是化学分离的轻多肽链
和重多肽链从抗体V区转换成sFv分子的化学结构，所述sFv分子将折叠成基本上与抗原结
合位点的结构类似的三维结构。参见例如，授予Huston等人的美国专利号5,091,513和5,
132,405；以及授予Ladner等人的美国专利号4,946,778。
5879-5883,1988)。已经描述了多种方法来辨别用于将天然聚合但是化学分离的轻多肽链
和重多肽链从抗体V区转换成sFv分子的化学结构，所述sFv分子将折叠成基本上与抗原结
合位点的结构类似的三维结构。参见例如，授予Huston等人的美国专利号5,091,513和5,
132,405；以及授予Ladner等人的美国专利号4,946,778。
[0217] 在某些实施例中，如本文所描述的抗体采用“双体”的形式。双体是多肽的多聚体，每个多肽包括第一域和第二域，所述第一域包括免疫球蛋白轻链的结合域，所述第二域包括免疫球蛋白重链的结合域，两个域被连接(例如，通过肽连接基团)但是不能彼此缔合以
形成抗原结合位点：通过将多聚体内的一个多肽的第一域与多聚体内的另一个多肽的第二
域缔合来形成抗原结合位点(WO94/13804)。抗体的dAb片段由VH域组成(Ward等人，《自然
(Nature)》，341:544-546,1989)。双体和其它多价或多特异性片段可以通过例如基因融合构造(参见，WO94/13804；以及Holliger等人，《美国国家科学院院刊》，90:6444-6448,
1993))。
形成抗原结合位点：通过将多聚体内的一个多肽的第一域与多聚体内的另一个多肽的第二
域缔合来形成抗原结合位点(WO94/13804)。抗体的dAb片段由VH域组成(Ward等人，《自然
(Nature)》，341:544-546,1989)。双体和其它多价或多特异性片段可以通过例如基因融合构造(参见，WO94/13804；以及Holliger等人，《美国国家科学院院刊》，90:6444-6448,
1993))。
[0218] 还包含包括连接到CH3域的scFv的迷你体(参见Hu等人，《癌症研究》，56:3055-3061,1996)。还参见Ward等人，《自然》，341:544-546,1989；Bird等人，《科学》，242:423-
426,1988；Huston等人，《美国国家科学院院刊》，85:5879-5883,1988)；PCT/US92/09965；
WO94/13804；以及Reiter等人，《自然生物技术(Nature Biotech.)》，14:1239-1245,1996。
426,1988；Huston等人，《美国国家科学院院刊》，85:5879-5883,1988)；PCT/US92/09965；
WO94/13804；以及Reiter等人，《自然生物技术(Nature Biotech.)》，14:1239-1245,1996。
[0219] 当使用双特异性抗体时，这些抗体可为可以各种方法来制造的常规双特异性抗体(Holliger和Winter，《生物技术新见(Current Opinion Biotechnol.)》，4:446-449,
1993)，例如以化学方法来制备或来自杂种杂交瘤细胞，或可为以上提到的任何双特异性抗体片段。可以仅使用可变域来构建没有Fc区的双体和scFv，从而潜在地减少抗-独特型反应的影响。
1993)，例如以化学方法来制备或来自杂种杂交瘤细胞，或可为以上提到的任何双特异性抗体片段。可以仅使用可变域来构建没有Fc区的双体和scFv，从而潜在地减少抗-独特型反应的影响。
[0220] 与双特异性完整抗体形成对照，双特异性双体也可以是特别有用的，因为这些双特异性双体可以容易地构建并且表达于大肠杆菌中。可以使用噬菌体展示(WO 94/13804)
来从文库中容易地选择具有合适结合特异性的双体(和许多其它多肽，如抗体片段)。如果
双体的一个臂保持恒定，例如，具有针对抗原X的特异性，则可以产生其中另一个臂变化的文库并且选择具有合适特异性的抗体。双特异性完整抗体可以通过杵臼(knobs-into-
holes)工程化方法来产生(knobs-into-holes等人，《蛋白质工程》，9:616-621,1996)。
来从文库中容易地选择具有合适结合特异性的双体(和许多其它多肽，如抗体片段)。如果
双体的一个臂保持恒定，例如，具有针对抗原X的特异性，则可以产生其中另一个臂变化的文库并且选择具有合适特异性的抗体。双特异性完整抗体可以通过杵臼(knobs-into-
holes)工程化方法来产生(knobs-into-holes等人，《蛋白质工程》，9:616-621,1996)。
[0221] 在某些实施例中，本文所描述的抗体可以以 形式提供。 是去除了铰链区的IgG4抗体(参见GenMab Utrecht，荷兰；还参见例如，US20090226421)。此抗体技术产生具有比当前小抗体形式预期更长的治疗窗的稳定更小抗体形式。IgG4抗体被认为
是惰性的，并且因此不与免疫系统相互作用。完整人类IgG4抗体可以通过消除抗体的铰链
区进行修饰以获得具有相比于相应完整IgG4不同的稳定性质的半分子片段(GenMab、
Utrecht)。二等分IgG4分子使得仅将一个区域留在可以结合同源抗原(例如，疾病目标)的
上，并且 因此单价地仅结合靶标细胞上的一个位点。对于某些癌症细
胞表面抗原，此单价结合可能不刺激癌细胞像可以使用具有相同抗原特异性的二价抗体看
到的那样生长，并且因此 技术可以向可能难治的一些类型的癌症提供治疗选项
以便治疗常规抗体。当治疗一些形式的癌症时， 的小尺寸可能有很大好处，从而
允许分子在较大实体瘤上的更好分布并且潜在地增加疗效。
是惰性的，并且因此不与免疫系统相互作用。完整人类IgG4抗体可以通过消除抗体的铰链
区进行修饰以获得具有相比于相应完整IgG4不同的稳定性质的半分子片段(GenMab、
Utrecht)。二等分IgG4分子使得仅将一个区域留在可以结合同源抗原(例如，疾病目标)的
上，并且 因此单价地仅结合靶标细胞上的一个位点。对于某些癌症细
胞表面抗原，此单价结合可能不刺激癌细胞像可以使用具有相同抗原特异性的二价抗体看
到的那样生长，并且因此 技术可以向可能难治的一些类型的癌症提供治疗选项
以便治疗常规抗体。当治疗一些形式的癌症时， 的小尺寸可能有很大好处，从而
允许分子在较大实体瘤上的更好分布并且潜在地增加疗效。
[0222] 在某些实施例中，本文所提供的抗体可以采用纳米体的形式。迷你体由单个基因编码并且在几乎所有原核和真核宿主中有效地产生，例如，大肠杆菌(参见美国专利号6,
765,087)、霉菌(例如曲霉菌或木霉菌)和酵母菌(例如酵母、克鲁维酵母、汉逊酵母或毕赤酵母(参见美国专利号6,838,254)。生产工艺是可放大的，并且已经产生多个千克量的纳米体。可以将纳米体制成具有长保质期的即用型溶液。单克隆方法(参见WO 06/079372)是一
种基于自动化高吞吐量选择B细胞，针对期望靶标产生纳米体的专利方法。
765,087)、霉菌(例如曲霉菌或木霉菌)和酵母菌(例如酵母、克鲁维酵母、汉逊酵母或毕赤酵母(参见美国专利号6,838,254)。生产工艺是可放大的，并且已经产生多个千克量的纳米体。可以将纳米体制成具有长保质期的即用型溶液。单克隆方法(参见WO 06/079372)是一
种基于自动化高吞吐量选择B细胞，针对期望靶标产生纳米体的专利方法。
[0223] 在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。这些实施例涉及通常使用重组技术制备的嵌合分子，所述嵌合分子具有衍生自来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原
结合位点以及分子的基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构。抗原
结合位点可以包括融合到恒定域上的完整可变域或者仅接枝到可变域中的适当框架区上
的CDR。表位结合位点可以是野生型或者由一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了作为人类个体的免疫原的恒定区，但是仍然存在对外来可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio等人，《美国国家科学院院刊》，86:4220-4224,1989；Queen等人，《美国国家科学院院刊》，86:
10029-10033,1988；Riechmann等人，《自然》，332:323-327,1988)。用于人源化抗体的说明性方法包含美国专利号7,462,697中描述的方法。
结合位点以及分子的基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构。抗原
结合位点可以包括融合到恒定域上的完整可变域或者仅接枝到可变域中的适当框架区上
的CDR。表位结合位点可以是野生型或者由一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了作为人类个体的免疫原的恒定区，但是仍然存在对外来可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio等人，《美国国家科学院院刊》，86:4220-4224,1989；Queen等人，《美国国家科学院院刊》，86:
10029-10033,1988；Riechmann等人，《自然》，332:323-327,1988)。用于人源化抗体的说明性方法包含美国专利号7,462,697中描述的方法。
[0224] 另一种方法不仅着重于提供人类衍生的恒定区，还着重于修饰可变区以便将其重塑成尽可能接近人类形式。已知重链和轻链的可变区含有三个互补确定区(CDR)，所述CDR
响应于讨论的表位而变化并且确定结合能力，被四个框架区(FR)侧接，所述FR在给定物种
体内相对保守并且推定地为CDR提供支架。当关于特定表位制备非人类抗体时，可以通过将衍生自非人类抗体的CDR接枝到存在于待修饰的人类抗体中的FR上来对可变区进行“重塑”或“人源化”。对各种抗体应用此方法已经由以下各项报告：Sato等人，《癌症研究》，53:851-
856,1993；Riechmann等人，《自然》，332:323-327,1988；Verhoeyen等人《，科学》，239:1534-
1536,1988；Kettleborough等人，《蛋白质工程》，4:773-3783,1991；Maeda等人，《人类抗体杂交瘤(Human Antibodies Hybridoma)》，2:124-134,1991；Gorman等人，《美国国家科学院院刊》，88:4181-4185,1991；Tempest等人，《生物技术(Bio/Technology)》，9:266-271,
1991；Co等人，《美国国家科学院院刊》，88:2869-2873,1991；Carter等人，《美国国家科学院院刊》，89:4285-4289,1992；以及Co等人《，免疫学杂志》，148:1149-1154,1992。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有关于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，也称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR。
响应于讨论的表位而变化并且确定结合能力，被四个框架区(FR)侧接，所述FR在给定物种
体内相对保守并且推定地为CDR提供支架。当关于特定表位制备非人类抗体时，可以通过将衍生自非人类抗体的CDR接枝到存在于待修饰的人类抗体中的FR上来对可变区进行“重塑”或“人源化”。对各种抗体应用此方法已经由以下各项报告：Sato等人，《癌症研究》，53:851-
856,1993；Riechmann等人，《自然》，332:323-327,1988；Verhoeyen等人《，科学》，239:1534-
1536,1988；Kettleborough等人，《蛋白质工程》，4:773-3783,1991；Maeda等人，《人类抗体杂交瘤(Human Antibodies Hybridoma)》，2:124-134,1991；Gorman等人，《美国国家科学院院刊》，88:4181-4185,1991；Tempest等人，《生物技术(Bio/Technology)》，9:266-271,
1991；Co等人，《美国国家科学院院刊》，88:2869-2873,1991；Carter等人，《美国国家科学院院刊》，89:4285-4289,1992；以及Co等人《，免疫学杂志》，148:1149-1154,1992。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有关于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，也称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR。
[0225] 在某些实施例中，抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体包括抗体的可操作地连接或以其它方式融合到不同抗体的异源Fc部分的抗原结合片段。在某些实施例中，异源Fc域是人源。在其它实施例中，异源Fc结构域可以来自来源于亲本抗体的不同Ig类别，包含IgA(包含子类别IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包含子类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。
在进一步实施例中，异源Fc结构域可以包括来自不同Ig类别中的一种或多种的CH2和CH3结
构域。如以上关于人源化抗体所述，嵌合抗体的抗原结合片段可以仅包括本文所描述的抗
体的CDR中的一个或多个(例如，本文所描述的抗体的1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR)，或者可以包括整个可变结构域(VL、VH或两者)。
在进一步实施例中，异源Fc结构域可以包括来自不同Ig类别中的一种或多种的CH2和CH3结
构域。如以上关于人源化抗体所述，嵌合抗体的抗原结合片段可以仅包括本文所描述的抗
体的CDR中的一个或多个(例如，本文所描述的抗体的1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR)，或者可以包括整个可变结构域(VL、VH或两者)。
[0226] 在一些实施例中，药剂是或包括免疫检查点分子的“配体”，例如，天然配体。“配体”通常指形成具有靶分子(例如，生物分子)的复合物以用于生物目的并且包含“蛋白配体”的物质或分子，所述蛋白配体通常通过结合到靶分子或靶蛋白上的位点而产生信号。因此，某些药剂是天然结合免疫检查点分子并产生信号的蛋白配体。还包含“经修饰配体”，例如，融合到药代动力学修饰剂的蛋白配体，例如，衍生自免疫球蛋白的Fc结构域。
[0227] 在一些实施例中，药剂是“小分子”，所述小分子是指具有合成或生物源(生物分子)但通常不是聚合物的有机化合物。有机化合物是指一大类化学化合物，其分子含有碳，通常不包括仅含有碳酸盐、简单的碳氧化物或氰化物的化学化合物。“生物分子”通常指由活体产生的有机分子，包含如肽、多糖以及核酸等大聚合分子(生物聚合物)以及如初级次
级代谢产物、脂质、磷脂质、醣脂质、固醇、甘油脂、维生素和激素等小分子。“聚合物”通常指包括重复结构单元的大分子或高分子，所述重复结构单元通常由共价化学键连接。
级代谢产物、脂质、磷脂质、醣脂质、固醇、甘油脂、维生素和激素等小分子。“聚合物”通常指包括重复结构单元的大分子或高分子，所述重复结构单元通常由共价化学键连接。
[0228] 在某些实施例中，小分子具有约或小于约1000道尔顿到2000道尔顿的分子量，通常在约300道尔顿与700道尔顿之间，并且包含约或小于约50道尔顿、100道尔顿、150道尔
顿、200道尔顿、250道尔顿、300道尔顿、350道尔顿、400道尔顿、450道尔顿、500道尔顿、550道尔顿、500道尔顿、650道尔顿、600道尔顿、750道尔顿、700道尔顿、850道尔顿、800道尔顿、
950道尔顿、1000道尔顿或2000道尔顿。
顿、200道尔顿、250道尔顿、300道尔顿、350道尔顿、400道尔顿、450道尔顿、500道尔顿、550道尔顿、500道尔顿、650道尔顿、600道尔顿、750道尔顿、700道尔顿、850道尔顿、800道尔顿、
950道尔顿、1000道尔顿或2000道尔顿。
[0229] 某些小分子可以具有针对本文的多肽，如抗体描述的“特异性结合”特性。例如，在一些实施例中，小分子以约、至少约或小于约以下亲和力(Kd)特异性结合靶标，例如免疫检查点分子：0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、
18nM、19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、40nM或50nM。
18nM、19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、40nM或50nM。
[0230] 在一些实施例中，免疫检查点调节剂是一个或多个抑制性免疫检查点分子的拮抗剂或抑制剂。示例性抑制性免疫检查点分子包含：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3
(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
[0231] 在某些实施例中，药剂是PD-1(受体)拮抗剂或抑制剂，其靶向已经被示出为恢复肿瘤环境下的免疫功能(参见例如，Phillips等人，《国际免疫杂志(Int.Immunol.)》，27:
39-46,2015)。PD-1是属于免疫球蛋白超家族并且在T细胞和祖B细胞上表达的细胞表面受
体。PD-1与两个配体，PD-L1和PD-L2相互作用。PD-1例如通过减少或防止T细胞活化来充当抑制性免疫检查点分子，减少或防止T细胞活化进而降低自身免疫病提高自身耐受性。PD-1的抑制效果至少部分地通过促进淋巴结中的抗原特异性T细胞的细胞凋亡以及减少调节性
T细胞(抑制性T细胞)的细胞凋亡的双重机制完成。PD-1拮抗剂或抑制剂的一些实例包含特
异性结合PD-1并减少其免疫抑制活性中的一种或多种，例如其下游信号传导或其与PD-L1
的相互作用的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-1拮抗剂或抑制剂的特异性实例包含抗体
纳武单抗、派姆单抗、PDR001和皮地利珠单抗以及其抗原结合片段。
39-46,2015)。PD-1是属于免疫球蛋白超家族并且在T细胞和祖B细胞上表达的细胞表面受
体。PD-1与两个配体，PD-L1和PD-L2相互作用。PD-1例如通过减少或防止T细胞活化来充当抑制性免疫检查点分子，减少或防止T细胞活化进而降低自身免疫病提高自身耐受性。PD-1的抑制效果至少部分地通过促进淋巴结中的抗原特异性T细胞的细胞凋亡以及减少调节性
T细胞(抑制性T细胞)的细胞凋亡的双重机制完成。PD-1拮抗剂或抑制剂的一些实例包含特
异性结合PD-1并减少其免疫抑制活性中的一种或多种，例如其下游信号传导或其与PD-L1
的相互作用的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-1拮抗剂或抑制剂的特异性实例包含抗体
纳武单抗、派姆单抗、PDR001和皮地利珠单抗以及其抗原结合片段。
[0232] 在一些实施例中，药剂是PD-L1拮抗剂或抑制剂。如以上所述，PD-L1是PD-1受体的天然配体之一。PD-L1拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合PD-L1并减少其免疫抑制活性中的一种或多种，例如其结合PD-1受体的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-L1拮抗剂的特异性实例包含抗体阿特珠单抗(MPDL3280A)、阿维单抗(MSB0010718C)和度伐鲁单抗
(MEDI4736)以及其抗原结合片段。
(MEDI4736)以及其抗原结合片段。
[0233] 在一些实施例中，药剂是PD-L2拮抗剂或抑制剂。如以上所述，PD-L2是PD-1受体的天然配体之一。PD-L2拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合PD-L2并减少其免疫抑制活性中的一种或多种，例如其结合PD-1受体的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0234] 在一些实施例中，药剂是CTLA-4拮抗剂或抑制剂。CTLA4或CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)也被称为CD152(分化簇152)是例如通过当T细胞在抗原呈递细胞的表面上
结合CD80或CD86时将抑制信号传输到所述T细胞来充当抑制性免疫检查点分子的蛋白受
体。CTLA-4拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合CTLA-4的抗体或抗原结合片段或小
分子。特定实例包含抗体伊匹木单抗和曲美木单抗以及其抗原结合片段。据信伊匹木单抗
的活性中的至少一些由抑制CTLA-4的抑制因子Tregs的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
(ADCC)杀伤介导。因此，ADI下调抑制因子Tregs的能力与某些CTLA-4拮抗剂或抑制剂的能
力平行，这表明ADI可以不仅在与CTLA-4抑制剂(例如，伊匹木单抗)相同的情况下有用，还在与所述CTLA-4抑制剂组合的情况下有用。
结合CD80或CD86时将抑制信号传输到所述T细胞来充当抑制性免疫检查点分子的蛋白受
体。CTLA-4拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合CTLA-4的抗体或抗原结合片段或小
分子。特定实例包含抗体伊匹木单抗和曲美木单抗以及其抗原结合片段。据信伊匹木单抗
的活性中的至少一些由抑制CTLA-4的抑制因子Tregs的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
(ADCC)杀伤介导。因此，ADI下调抑制因子Tregs的能力与某些CTLA-4拮抗剂或抑制剂的能
力平行，这表明ADI可以不仅在与CTLA-4抑制剂(例如，伊匹木单抗)相同的情况下有用，还在与所述CTLA-4抑制剂组合的情况下有用。
[0235] 在一些实施例中，药剂是IDO拮抗剂或抑制剂或者TDO拮抗剂或抑制剂。IDO和TDO是具有免疫抑制性质的色氨酸分解代谢的酶。例如，已知IDO抑制T细胞和NK细胞，产生并活化Tregs和髓源性抑制细胞，并且促进肿瘤血管生成。IDO和TDO拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合IDO或TDO(参见例如，Platten等人，《免疫学前沿》，5:673,2014)并且减少或抑制一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。IDO拮抗剂或抑制剂的
特定实例包含印朵目德(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满；9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝坦(参见例如，Sheridan，《自然生物技术(Nature Biotechnology.)》，33:321-322,2015)。TDO拮抗剂或抑制剂的特定实例包含680C91和LM10(参见例如，Pilotte等人，《美国国家科学院院刊》，109:2497-2502,2012)。
特定实例包含印朵目德(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满；9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝坦(参见例如，Sheridan，《自然生物技术(Nature Biotechnology.)》，33:321-322,2015)。TDO拮抗剂或抑制剂的特定实例包含680C91和LM10(参见例如，Pilotte等人，《美国国家科学院院刊》，109:2497-2502,2012)。
[0236] 在一些实施例中，药剂是TIM-3拮抗剂或抑制剂。T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)在活化的人类CD4+T细胞上表达并且调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3还
通过在与细胞的配体，半乳凝素-9相互作用时触发细胞死亡来充当具有Th1/Tc1功能的负
调节因子。TIM-3有助于抑制性肿瘤微环境，并且其过表达与各种癌症的不良预后相关联
(参见例如，Li等人，《肿瘤学报(Acta Oncol.)》，54:1706-13,2015)。TIM-3拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合TIM-3并减少或抑制其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或
抗原结合片段或小分子。
通过在与细胞的配体，半乳凝素-9相互作用时触发细胞死亡来充当具有Th1/Tc1功能的负
调节因子。TIM-3有助于抑制性肿瘤微环境，并且其过表达与各种癌症的不良预后相关联
(参见例如，Li等人，《肿瘤学报(Acta Oncol.)》，54:1706-13,2015)。TIM-3拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合TIM-3并减少或抑制其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或
抗原结合片段或小分子。
[0237] 在一些实施例中，药剂是LAG-3拮抗剂或抑制剂。淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)在活化的T细胞、天然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞上表达。其以与CTLA-4和PD-1类似的方式负向调节T细胞的细胞增殖、活化和稳态(参见例如，Workman和Vignali，《欧洲免疫学杂志(European Journal of Immun.)》，33:970-9,2003；以及Workman等人，《免疫学杂志(Journal of Immun.)》，172:5450–5,2004)，并且已经报告用作Treg抑制功能(参见例如，Huang等人《，免疫(Immunity.)》，21:503-13,2004)。LAG3还使CD8+T细胞保持在致耐受性状态并且与PD-1组合以保持CD8T细胞耗尽。LAG-3拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结
合LAG-3并抑制其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。特定实
例包含抗体BMS-986016及其抗原结合片段。
合LAG-3并抑制其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。特定实
例包含抗体BMS-986016及其抗原结合片段。
[0238] 在一些实施例中，药剂是VISTA拮抗剂或抑制剂。T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)主要在造血细胞上表达并且是抑制性免疫检查点调节因子，所述抑制性免疫检查
点调节因子抑制T细胞活化，诱导Foxp3表达并且在肿瘤微环境内高度表达，在所述肿瘤微
环境内其抑制抗肿瘤T细胞应答(参见例如，Lines等人，《癌症研究》，74:1924-32,2014)。
VISTA拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合VISTA并减少其免疫抑制活性中的一种
或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
点调节因子抑制T细胞活化，诱导Foxp3表达并且在肿瘤微环境内高度表达，在所述肿瘤微
环境内其抑制抗肿瘤T细胞应答(参见例如，Lines等人，《癌症研究》，74:1924-32,2014)。
VISTA拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合VISTA并减少其免疫抑制活性中的一种
或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0239] 在一些实施例中，药剂是BTLA拮抗剂或抑制剂。B和T淋巴细胞弱化子(BTLA；CD272)表达在T细胞活化期间诱导，并且其通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)和B7细胞表面
受体家族相互作用来抑制T细胞。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的
配体，也被称为疱疹病毒进入介体(HVEM)。BTLA-HVEM复合物例如通过抑制人类CD8+癌症特异性T细胞的功能负向调节T细胞免疫应答(参见例如，Derré等人《，临床研究杂志(J Clin Invest)》，120:157–67,2009)。BTLA拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合BTLA-4并减少其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
受体家族相互作用来抑制T细胞。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的
配体，也被称为疱疹病毒进入介体(HVEM)。BTLA-HVEM复合物例如通过抑制人类CD8+癌症特异性T细胞的功能负向调节T细胞免疫应答(参见例如，Derré等人《，临床研究杂志(J Clin Invest)》，120:157–67,2009)。BTLA拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合BTLA-4并减少其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0240] 在一些实施例中，药剂是HVEM拮抗剂或抑制剂，例如特异性结合HVEM并且干扰其与BTLA或CD160的相互作用的拮抗剂或抑制剂。HVEM拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异
性结合HVEM、任选地减少HVEM/BTLA和/或HVEM/CD160相互作用并且由此减少HVEM的免疫抑
制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
性结合HVEM、任选地减少HVEM/BTLA和/或HVEM/CD160相互作用并且由此减少HVEM的免疫抑
制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0241] 在一些实施例中，药剂是CD160拮抗剂或抑制剂，例如特异性结合CD160并且干扰其与HVEM的相互作用的拮抗剂或抑制剂。CD160拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结
合CD160，任选地减少CD160/HVEM相互作用并且由此减少或抑制其免疫抑制活性中的一种
或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
合CD160，任选地减少CD160/HVEM相互作用并且由此减少或抑制其免疫抑制活性中的一种
或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0242] 在一些实施例中，药剂是TIGIT拮抗剂或抑制剂。T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)是在各种淋巴细胞的表面上发现并且例如通过Tregs抑制抗肿瘤免疫的共抑制受体
(Kurtulus等人，《临床研究杂志》，125:4053-4062,2015)。TIGIT拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合TIGIT并减少其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或
小分子(参见例如，Johnston等人，《癌症细胞》，26:923-37,2014)。
(Kurtulus等人，《临床研究杂志》，125:4053-4062,2015)。TIGIT拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合TIGIT并减少其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或
小分子(参见例如，Johnston等人，《癌症细胞》，26:923-37,2014)。
[0243] 在某些实施例中，免疫检查点调节剂是一个或多个刺激性免疫检查点分子的激动剂。示例性刺激性免疫检查点分子包含OX40、CD40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因
(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。
(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。
[0244] 在一些实施例中，药剂是OX40激动剂。OX40(CD134)促进效应T细胞和记忆T细胞的扩增并且抑制调节性T细胞的分化和活性(参见例如，Croft等人，《免疫学评论》，229:173–
91,2009)。其配体是OX40L(CD252)。由于OX40信号传导影响T细胞活化和存活，因此其在启动淋巴结中的抗肿瘤免疫应答以及在肿瘤微环境下保持抗肿瘤免疫应答方面起重要作用。
OX40激动剂的一般实例包含特异性结合OX40并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗
体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含OX86、OX-40L、Fc-OX40L、GSK3174998、MEDI0562(人源化OX40激动剂)、MEDI6469(鼠类OX4激动剂)和MEDI6383(OX40激动剂)以及
其抗原结合片段。
91,2009)。其配体是OX40L(CD252)。由于OX40信号传导影响T细胞活化和存活，因此其在启动淋巴结中的抗肿瘤免疫应答以及在肿瘤微环境下保持抗肿瘤免疫应答方面起重要作用。
OX40激动剂的一般实例包含特异性结合OX40并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗
体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含OX86、OX-40L、Fc-OX40L、GSK3174998、MEDI0562(人源化OX40激动剂)、MEDI6469(鼠类OX4激动剂)和MEDI6383(OX40激动剂)以及
其抗原结合片段。
[0245] 在一些实施例中，药剂是CD40激动剂。CD40在抗原呈递细胞(APC)和一些恶性肿瘤上表达。其配体是CD40L(CD154)。在APC上，连接导致上调共刺激分子，潜在地绕过对抗肿瘤免疫应答中的T细胞辅助的需要。CD40激动剂疗法在APC成熟和其从肿瘤到淋巴结的迁移中
起重要作用，导致提高的抗原呈递和T细胞活化。抗CD40激动剂抗体产生动物模型中的实质性应答和持久性抗癌免疫，这是至少部分地由细胞毒性T细胞介导的效果(参见例如，
Johnson等人，《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》，21:1321-1328,2015；以及
Vonderheide和Glennie，《临床癌症研究》，19:1035-43,2013)。CD40激动剂的一般实例包含特异性结合CD40并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子
或配体。特定实例包含CP-870,893、达西珠单抗、Chi Lob7/4、ADC-1013、CD40L、rhCD40L以及其抗原结合片段。
起重要作用，导致提高的抗原呈递和T细胞活化。抗CD40激动剂抗体产生动物模型中的实质性应答和持久性抗癌免疫，这是至少部分地由细胞毒性T细胞介导的效果(参见例如，
Johnson等人，《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》，21:1321-1328,2015；以及
Vonderheide和Glennie，《临床癌症研究》，19:1035-43,2013)。CD40激动剂的一般实例包含特异性结合CD40并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子
或配体。特定实例包含CP-870,893、达西珠单抗、Chi Lob7/4、ADC-1013、CD40L、rhCD40L以及其抗原结合片段。
[0246] 在一些实施例中，药剂是GITR激动剂。糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)增加T细胞扩增，抑制Tregs的抑制活性并且延长T效应细胞的存活。GITR激动剂已经被示出用于通过缺失Treg谱稳定性来促进抗肿瘤应答(参见例如，Schaer等人，《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)》，1:320–31,2013)。这些不同机制示出GITR在启动淋巴结中的免疫应答以及在保持肿瘤组织中的免疫应答方面起重要作用。配体是GITRL。GITR激动剂的一般实例包含特异性结合GITR并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原
结合片段或小分子或配体。特定实例包含GITRL、INCAGN01876、DTA-1、MEDI1873以及其抗原结合片段。
结合片段或小分子或配体。特定实例包含GITRL、INCAGN01876、DTA-1、MEDI1873以及其抗原结合片段。
[0247] 在一些实施例中，药剂是CD137激动剂。CD137(4-1BB)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，并且CD137的交联增强T细胞增殖、IL-2分泌、存活和溶细胞活性。CD137介导的信号传导还保护如CD8+T细胞等T细胞免受活化诱导的细胞死亡。CD137激动剂的一般实例
包含特异性结合CD137并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小
分子或配体。特定实例包含CD137(或4-1BB)配体(参见例如，Shao和Schwarz，《白细胞生物学杂志》，89:21-9,2011)和抗体乌托米单抗，包含其抗原结合片段。
包含特异性结合CD137并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小
分子或配体。特定实例包含CD137(或4-1BB)配体(参见例如，Shao和Schwarz，《白细胞生物学杂志》，89:21-9,2011)和抗体乌托米单抗，包含其抗原结合片段。
[0248] 在一些实施例中，药剂是CD27激动剂。刺激CD27增加初始T细胞的抗原特异性扩增并且有助于T细胞记忆和T细胞免疫的长期保持。其配体是CD70。具有激动剂抗体的人类
CD27的靶向刺激T细胞活化和抗肿瘤免疫(参见例如，Thomas等人，《肿瘤免疫学
(Oncoimmunology)》，2014；3:e27255.doi:10.4161/onci.27255；以及He等人，《免疫学杂志》，191:4174-83,2013)。CD27激动剂的一般实例包含特异性结合CD27并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD70和抗体瓦
利鲁单抗和CDX-1127(1F5)，包含其抗原结合片段。
CD27的靶向刺激T细胞活化和抗肿瘤免疫(参见例如，Thomas等人，《肿瘤免疫学
(Oncoimmunology)》，2014；3:e27255.doi:10.4161/onci.27255；以及He等人，《免疫学杂志》，191:4174-83,2013)。CD27激动剂的一般实例包含特异性结合CD27并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD70和抗体瓦
利鲁单抗和CDX-1127(1F5)，包含其抗原结合片段。
[0249] 在一些实施例中，药剂是CD28激动剂。CD28是组成型表达的CD4+T细胞和一些CD8+T细胞。其配体包含CD80和CD86，并且其刺激增加T细胞扩增。CD28激动剂的一般实例包含特异性结合CD28并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或
配体。特定实例包含CD80、CD86、抗体TAB08及其抗原结合片段。
配体。特定实例包含CD80、CD86、抗体TAB08及其抗原结合片段。
[0250] 在一些实施例中，药剂是CD226激动剂。CD226是与TIGIT共享配体的刺激受体，并且与TIGIT相反，CD226的接合增强T细胞活性(参见例如，Kurtulus等人《，临床研究杂志》，
125:4053-4062,2015；Bottino等人，《实验医学杂志》，1984:557-567,2003；以及Tahara-Hanaoka等人，《国际免疫杂志》，16:533-538,2004)。CD226激动剂的一般实例包含特异性结合CD226并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体
(例如，CD112、CD155)。
125:4053-4062,2015；Bottino等人，《实验医学杂志》，1984:557-567,2003；以及Tahara-Hanaoka等人，《国际免疫杂志》，16:533-538,2004)。CD226激动剂的一般实例包含特异性结合CD226并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体
(例如，CD112、CD155)。
[0251] 在一些实施例中，药剂是HVEM激动剂。疱疹病毒进入介体(HVEM)，也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)是TNF受体超家族的人类细胞表面受体。HVEM在包含T细胞、APC和其它免疫细胞的各种细胞上发现。不像其它受体，HVEM以高水平在静息的T细胞上表达并且在活化时被下调。已经示出HVEM信号传导在T细胞活化的早期阶段以及在淋巴
结中的肿瘤特异性淋巴细胞群的扩增期间起重要作用。HVEM激动剂的一般实例包含特异性
结合HVEM并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。
结中的肿瘤特异性淋巴细胞群的扩增期间起重要作用。HVEM激动剂的一般实例包含特异性
结合HVEM并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。
[0252] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是癌症疫苗。癌症疫苗的功效受受试者中的Tregs的活性限制，并且如ADI等精氨酸耗竭剂减少Tregs的能力(除了本文所描述的其它性
质之外)可以用于增加任何种类的癌症疫苗的功效。示例性癌症疫苗包含Oncophage，如
Gardasil或Cervarix等人乳头瘤病毒(HPV)，如Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix等乙
型肝炎疫苗，以及sipuleucel-T(普罗文奇)。在一些实施例中，癌症疫苗包括或利用一种或多种癌抗原或癌症相关抗原。示例性癌抗原包含但不限于人类Her2/neu、Her1/EGF受体
(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、
5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
质之外)可以用于增加任何种类的癌症疫苗的功效。示例性癌症疫苗包含Oncophage，如
Gardasil或Cervarix等人乳头瘤病毒(HPV)，如Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix等乙
型肝炎疫苗，以及sipuleucel-T(普罗文奇)。在一些实施例中，癌症疫苗包括或利用一种或多种癌抗原或癌症相关抗原。示例性癌抗原包含但不限于人类Her2/neu、Her1/EGF受体
(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、
5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
[0253] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是溶瘤病毒。溶瘤病毒是优先感染和杀死癌细胞的病毒。包含天然存在和人造或工程化的溶瘤病毒。类似于上文，溶瘤病毒的功效受受试者中的Tregs的活性限制，并且如ADI等精氨酸耗竭剂减少Tregs的能力(除了本文所描述的
其它性质之外)可以用于增加任何种类的溶瘤病毒的功效。大多数溶瘤病毒被工程化为肿
瘤选择性，尽管存在如呼肠孤病毒(Reovirus)和SVV-001塞内卡谷病毒等天然存在的实例。
溶瘤病毒的一般实例包含VSV、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡病毒和RIGVIR以及其工程化版本。溶瘤病毒的非限制性实例包含单纯性疱疹病毒(HSV)及其工程化版本、
talimogene laherparepvec(T-VEC)、柯萨基病毒A21(CAVATAKTM)、Oncorine(H101)、
pelareorep 塞内卡谷病毒(NTX-010)、塞内卡病毒SVV-001、ColoAd1、
SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401等等。
其它性质之外)可以用于增加任何种类的溶瘤病毒的功效。大多数溶瘤病毒被工程化为肿
瘤选择性，尽管存在如呼肠孤病毒(Reovirus)和SVV-001塞内卡谷病毒等天然存在的实例。
溶瘤病毒的一般实例包含VSV、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡病毒和RIGVIR以及其工程化版本。溶瘤病毒的非限制性实例包含单纯性疱疹病毒(HSV)及其工程化版本、
talimogene laherparepvec(T-VEC)、柯萨基病毒A21(CAVATAKTM)、Oncorine(H101)、
pelareorep 塞内卡谷病毒(NTX-010)、塞内卡病毒SVV-001、ColoAd1、
SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401等等。
[0254] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是细胞因子。示例性细胞因子包含干扰素(IFN)-α、IL-2、IL-12、IL-7、IL-21和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
[0255] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是基于细胞的免疫疗法，例如基于T细胞的过继免疫疗法。在一些实施例中，基于细胞的免疫疗法包括癌抗原特异性T细胞，任选地离体衍生的T细胞。在一些实施例中，癌抗原特异性T细胞选自嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及肽诱导T细胞中的一种或多种。
在特定实施例中，CAR修饰的T细胞靶向CD-19(参见例如，Maude等人《，血液学》，125:4017-
4023,2015)。
在特定实施例中，CAR修饰的T细胞靶向CD-19(参见例如，Maude等人《，血液学》，125:4017-
4023,2015)。
[0256] 在具体实施例中，癌症免疫治疗剂选自IDO拮抗剂、CD20拮抗剂、B-Raf拮抗剂、IL-2、GM-CSF和溶瘤病毒中的一种或多种。在特定实施例中，IDO拮抗剂是吲哚莫德，和/或CD20激动剂是利妥昔单抗，和/或B-Raf拮抗剂是维罗非尼，和/或溶瘤病毒是talimogene
laherparepvec(T-VEC)或柯萨奇病毒A21(CAVATAKTM)。
laherparepvec(T-VEC)或柯萨奇病毒A21(CAVATAKTM)。
[0257] 技术人员将理解，本文所描述的各种癌症免疫治疗剂可以与本文所描述的各种精氨酸耗竭剂中的任意一种或多种组合，并根据本文所描述的方法或组合物的任意一种或多
种使用。
种使用。
[0258] 使用方法
[0259] 如上所述，本公开的实施例涉及发现精氨酸耗竭剂具有意想不到的免疫调节性质。例如，在体外显示示例性精氨酸耗竭剂ADI-PEG 20以减少免疫抑制调节性T细胞(Treg
细胞)，否则其将最小化炎性反应，特别是抗肿瘤反应的量级和持续时间。其还被显示以在体外中和效应性T细胞(Teff细胞)的耗竭，并在体内增加T细胞的肿瘤浸润。因此，精氨酸耗竭剂如ADI可以用于增加抗肿瘤T细胞应答，例如，通过增强T细胞引发和运输到肿瘤微环境中，并从而加强其它癌症免疫疗法。
细胞)，否则其将最小化炎性反应，特别是抗肿瘤反应的量级和持续时间。其还被显示以在体外中和效应性T细胞(Teff细胞)的耗竭，并在体内增加T细胞的肿瘤浸润。因此，精氨酸耗竭剂如ADI可以用于增加抗肿瘤T细胞应答，例如，通过增强T细胞引发和运输到肿瘤微环境中，并从而加强其它癌症免疫疗法。
[0260] 因此，某些实施例包含治疗减轻有需要的受试者的癌症的症状或抑制其进展的方法，包括向受试者施用(a)将精氨酸转化为瓜氨酸的精氨酸耗竭剂；以及(b)癌症免疫治疗
剂。精氨酸耗竭剂和癌症免疫治疗剂与其组合在本文其它地方进行描述。
剂。精氨酸耗竭剂和癌症免疫治疗剂与其组合在本文其它地方进行描述。
[0261] 在一些情况下，(a)精氨酸耗竭剂和(b)癌症免疫治疗剂被单独地施用，例如在单独的组合物中和在不同时间施用。在一些实施例中，(a)精氨酸耗竭剂和(b)癌症免疫治疗
剂作为相同组合物的一部分同时施用。
剂作为相同组合物的一部分同时施用。
[0262] 在某些实施例中，施用精氨酸耗竭剂(例如，ADI、ADI-PEG、ADI-PEG 20)，例如，在受试者的肿瘤微环境中，会减少免疫抑制性调节性T细胞(Treg细胞)。在一些情况下，相对于对照，例如，对照组合物(无药剂)或对照时间点，例如，较早的时间点，Tregs减少约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。
[0263] 在某些实施例中，施用精氨酸耗竭剂(例如，ADI、ADI-PEG、ADI-PEG 20)，例如，在受试者的肿瘤微环境中，会减少或缓和效应性T细胞(Teff细胞)的耗尽。在一些情况下，相对于对照，例如，对照组合物(无药剂)或对照时间点，例如，较早的时间点，Teff细胞耗尽减少约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。
[0264] 在一些实施例中，施用精氨酸耗竭剂(例如，ADI、ADI-PEG、ADI-PEG 20)会增加T细胞的肿瘤浸润。在一些情况下，相对于对照，例如，对照组合物(无药剂)或对照时间点，例如，较早的时间点，T细胞的肿瘤浸润增加约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。可以根据本领域的常规技术测定肿瘤浸润(参见例如，实例2)。
[0265] 在一些情况下，施用精氨酸耗竭剂(例如，ADI、ADI-PEG、ADI-PEG 20)会增强效应性T细胞活化(CD69的表达)和/或降低T细胞上免疫抑制受体PD-1和CTLA-4的上调。在一些情况下，相对于对照，例如，对照组合物(无药剂)或对照时间点，例如，较早的时间点，效应性T细胞上的CD69表达增加约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。在一些情况下，相对于对照，例如，对照组合物(无药剂)或对照时间点，例如，较早的时间点，T细胞上的PD-1表达减少约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％或100％或更多。在某些情况下，相对于对照，例如，对照组合物(无药剂)或对照时间点，例如，较早的时间点，T细胞上的CTLA-4表达减少约或至少约10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。
70％、80％、90％或100％或更多。在某些情况下，相对于对照，例如，对照组合物(无药剂)或对照时间点，例如，较早的时间点，T细胞上的CTLA-4表达减少约或至少约10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。
[0266] 在一些实施例中，本文所述的组合疗法将患者的中位生存期增加4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更长时间。在某些实施例中，本文所述的组合疗法将患者的中位生存期增加1年、2年、3年或更长。在一些实施例中，本文所述的组合疗法将无病进展生存期增加2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间。在某些实施例中，本文所述的组合疗法将无病进展生存期增加1年、2年、3年或更长时间。
[0267] 在某些实施例中，施用的组合物足以使肿瘤消退，如肿瘤存活量的统计学显著降低所示，例如，肿瘤质量降低至少10％、20％、30％、40％、50％或更多，或如改变的(例如，具有统计显著性的降低)扫描尺寸所示。在某些实施例中，施用的组合足以使病情稳定。在某些实施例中，施用的组合足以使熟练的临床医生已知的特定疾病适应症症状的临床相关性
减轻。在一些实施例中，相对于单独的癌症免疫治疗剂，精氨酸耗竭剂增加、补充或以其它方式增强癌症免疫治疗剂的抗肿瘤和/或免疫刺激活性。
减轻。在一些实施例中，相对于单独的癌症免疫治疗剂，精氨酸耗竭剂增加、补充或以其它方式增强癌症免疫治疗剂的抗肿瘤和/或免疫刺激活性。
[0268] 本文所述的方法和组合物可以用于治疗任何种类的癌症。在一些实施例中，癌症选自以下各项中的一个或多个：肝细胞癌(HCC)、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤或脉络丛乳头状瘤)、多形性成胶质细胞瘤(例如，巨细胞胶质瘤或胶质肉瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(成神经管细胞瘤)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头颈癌，宫颈癌，睾丸癌和胃癌。
[0269] 某些特定组合包含精氨酸耗竭剂和PD-L1拮抗剂或抑制剂，例如，阿特朱单抗(MPDL3280A)、阿维单抗(MSB0010718C)和度伐鲁单抗(MEDI4736)，用于治疗选自结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌中的一种或多种的癌症。
[0270] 一些特定的组合包含精氨酸耗竭剂和PD-1拮抗剂，例如，纳武单抗，用于治疗选自霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和卵巢癌中的一种或多种的癌症。
[0271] 具体的特定组合包含精氨酸耗竭剂和PD-1拮抗剂，例如，派姆单抗，用于治疗选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌和癌症和尿路上皮癌的一种或多种的癌症。
[0272] 某些特定组合包含精氨酸耗竭剂和CTLA-4拮抗剂，例如，伊匹木单抗和曲美木单抗，用于治疗选自黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌中的一种或多种的癌症。
[0273] 一些特定的组合包含精氨酸耗竭剂和IDO拮抗剂，例如，吲哚莫德(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸或依帕卡朵丝坦，用于治疗选自转移性乳腺癌和脑癌、任选地多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤或恶性脑肿瘤中的一种或多种的癌症。
[0274] 某些特定组合包含精氨酸耗竭剂和细胞因子INF-α，用于治疗黑色素瘤、卡波西肉瘤和血液癌症。还包含精氨酸耗竭剂和IL-2(例如阿地白介素)的组合，用于治疗转移性肾癌或转移性黑色素瘤。
[0275] 一些特定的组合包含精氨酸耗竭剂和基于T细胞的过继免疫疗法，例如，包括靶向CD-19的CAR修饰T细胞，用于治疗如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血
病(CLL)和B细胞肿瘤的血液癌症(参见，例如，Maude等人，2015，同上；Lorentzen和
Straten，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand J Immunol)》，82:307-19，2015；以及Ramos等人，《癌症杂志(Cancer J)》，20:112–118，2014)。
病(CLL)和B细胞肿瘤的血液癌症(参见，例如，Maude等人，2015，同上；Lorentzen和
Straten，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand J Immunol)》，82:307-19，2015；以及Ramos等人，《癌症杂志(Cancer J)》，20:112–118，2014)。
[0276] 在一些实施例中，如上所述，施用精氨酸耗竭剂(例如，ADI、ADI-PEG、ADI-PEG20)会减少T细胞上免疫抑制性受体CTLA-4的上调，并下调Treg。不受任何一种理论的限制，这种活性至少部分地平行于抗-CTLA4单克隆抗体伊匹木单抗 的抗肿瘤活性。因此，精氨酸耗竭剂应当在临床情况或与针对伊匹木单抗鉴定的组合相似的组合中找到治疗
用途。具体实例包含与一种或多种IDO拮抗剂、CD20拮抗剂、B-Raf拮抗剂、IL-2、GM-CSF以及溶瘤病毒组合施用精氨酸耗竭剂。在特定实施例中，IDO拮抗剂是吲哚莫德，CD20激动剂是利妥昔单抗，B-Raf拮抗剂是维罗非尼，和/或溶瘤病毒是talimogene laherparepvec(T-
VEC)或柯萨奇病毒A21(CAVATAKTM)。
用途。具体实例包含与一种或多种IDO拮抗剂、CD20拮抗剂、B-Raf拮抗剂、IL-2、GM-CSF以及溶瘤病毒组合施用精氨酸耗竭剂。在特定实施例中，IDO拮抗剂是吲哚莫德，CD20激动剂是利妥昔单抗，B-Raf拮抗剂是维罗非尼，和/或溶瘤病毒是talimogene laherparepvec(T-
VEC)或柯萨奇病毒A21(CAVATAKTM)。
[0277] 治疗癌症的方法可以与其它治疗方式组合。例如，本文所述的组合疗法可以在其它治疗性干预之前、期间或之后施用于受试者，包含对症护理、放射疗法、手术、移植、激素疗法、光动力疗法、抗生素疗法或其任何组合。对症护理包含施用皮质类固醇，以减轻脑水肿、头痛、认知功能障碍和呕吐，以及施用抗惊厥药，以减少癫痫发作。放射治疗包含全脑照射、分次放射治疗和放射外科治疗，如立体定向放射外科治疗，其可以进一步与传统手术相结合。
[0278] 用于鉴定具有本文所述的一种或多种疾病或病症的受试者的方法是本领域已知的。
[0279] 对于体内用途，例如，用于治疗人类疾病或测试，本文所述的药剂通常在给药前掺入一种或多种药物或治疗组合物中。在一些情况下，药物或治疗组合物包括一种或多种本文所述的药剂与生理学上可接受的载剂或赋形剂的组合。
[0280] 为了制备药物组合物，将有效或期望的一种或多种药剂与本领域技术人员已知的任何药物载剂或赋形剂混合，以适合于特定药剂和/或给药方式。药物载剂可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬浮液可以包含，例如，无菌稀释剂(如水)、盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水；PBS)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂(如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)
和螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内给药(例如，通过IV输注)，合适的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物的增稠剂和增溶剂的溶液。
和螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内给药(例如，通过IV输注)，合适的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物的增稠剂和增溶剂的溶液。
[0281] 以纯粹形式或在合适的药物组合物中施用本文所述的药剂可以通过任何可接受的药剂施用方式进行，以用于类似的用途。药物组合物可以通过将含有药剂的组合物与适
当的生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂混合来制备，并且可以配制成固体、半-固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体和气雾剂。此外，其它药物活性成分(包含本文其它地方描述的其它小分子)和/或合适的赋形剂，如可以但不必存在于组合物中的盐、缓冲剂和稳定剂。
当的生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂混合来制备，并且可以配制成固体、半-固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体和气雾剂。此外，其它药物活性成分(包含本文其它地方描述的其它小分子)和/或合适的赋形剂，如可以但不必存在于组合物中的盐、缓冲剂和稳定剂。
[0282] 可以通过各种不同途径实现给药，包含口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮内、肌肉内、皮下或局部给药。优选的给药方式取决于待治疗或预防的病症的性质。具体实施例包含通过IV输注给药。
[0283] 载剂可以包含，例如，药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，这些药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下，对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒。生理学上可接受的载剂通常是含水pH缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包含如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；
如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离TM TM
子，如钠；和/或如聚山梨醇酯20(TWEEN )聚乙二醇(PEG)和泊咯沙姆(PLURONICS )等的非
离子表面活性剂。
如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离TM TM
子，如钠；和/或如聚山梨醇酯20(TWEEN )聚乙二醇(PEG)和泊咯沙姆(PLURONICS )等的非
离子表面活性剂。
[0284] 在一些实施例中，一种或多种药剂可以例如，通过凝聚技术或通过界面聚合包入制备的微胶囊中(例如：分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲
酯)(methylmethacylate)微胶囊。这类技术公开在雷明顿药物科学(Remington's
Pharmaceutical Sciences)第16版，Oslo A.编辑，(1980)。颗粒或脂质体可以进一步包括其它治疗剂或诊断剂。
酯)(methylmethacylate)微胶囊。这类技术公开在雷明顿药物科学(Remington's
Pharmaceutical Sciences)第16版，Oslo A.编辑，(1980)。颗粒或脂质体可以进一步包括其它治疗剂或诊断剂。
[0285] 精确的剂量和治疗持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过在本领域已知的模型系统中测试组合物并从中推断。也可以进行受
控的临床试验。剂量也可以随着要缓解的病症的严重程度而变化。通常配制和施用药物组
合物以发挥治疗有用的效果，同时使不希望的副作用最小化。所述组合物可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量而每隔一段时间施用。对于任何特定受试者，可根据个体需要
随时间调整特定剂量方案。
控的临床试验。剂量也可以随着要缓解的病症的严重程度而变化。通常配制和施用药物组
合物以发挥治疗有用的效果，同时使不希望的副作用最小化。所述组合物可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量而每隔一段时间施用。对于任何特定受试者，可根据个体需要
随时间调整特定剂量方案。
[0286] 因此，施用这些和相关药物组合物的典型途径包含但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内。本文所使用的术语肠胃外包含皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。配制根据本发明某些实施例的药物组合物，以便在将组合物施用于患者时使其中含有的活性成分是生物可利用的。将施用于受试者或患者的组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位，并且本文所述的气雾剂形式的药剂的容器可以容纳多个剂量单位。制备这种剂型的实际方法对于本领
域技术人员来说是已知的、或者是显而易见的；例如，参见《雷明顿：药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy》，第20版(费城医药科学学院，2000)。待施用的组合物通常含有治疗有效量的本文所述的药剂，用于治疗关注疾病或病症。
域技术人员来说是已知的、或者是显而易见的；例如，参见《雷明顿：药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy》，第20版(费城医药科学学院，2000)。待施用的组合物通常含有治疗有效量的本文所述的药剂，用于治疗关注疾病或病症。
[0287] 药物组合物可以是固体或液体的形式。在一个实施例中，载剂是颗粒状的，因此组合物是例如，片剂或粉末形式。载剂可以是液体，而组合物是例如，口服油、可注射液体或气雾剂，其可用于例如，吸入给药。当用于口服给药时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半-固体、半-液体、悬浮液和凝胶形式包含在本文所述的为固体或液体的形式中。
[0288] 作为用于口服给药的固体组合物，可以将药物组合物配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄片等。这种固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。此外，可能存在以下一种或多种：羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶的粘合剂；如淀粉、乳糖或糊精的赋形剂，如海藻酸、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠，玉米淀粉等的崩解剂；如硬脂酸镁或氢化蓖麻油的润滑剂；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品等调味剂；以及着色剂。当药物组合物为胶囊形式时，例如，明胶胶囊，除了上述类型的物质外，所述药物还可以含有如聚乙二醇或油的液体载剂。
[0289] 药物组合物可以是液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服给药或通过注射给药。当用于口服给药时，除本发明化合物外，优选的组合物还含有一种或多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
[0290] 液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液或其它类似形式，可以包含一种或多种以下佐剂：如注射用水、盐水溶液、优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠的无菌稀释剂、如可用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶
中。生理盐水是优选佐剂。可注射药物组合物优选地是无菌的。
中。生理盐水是优选佐剂。可注射药物组合物优选地是无菌的。
[0291] 用于肠胃外或口服给药的液体药物组合物应含有一定量的药剂，以便获得合适的剂量。通常，该量为组合物中关注药剂的至少0.01％。当用于口服给药时，该量可以变化为组合物重量的0.1％到约70％。某些口服药物组合物含有约4％到约75％的感兴趣药剂。在
某些实施例中，制备根据本发明的药物组合物和制剂，使得肠胃外剂量单位在稀释前含有
感兴趣药剂重量的0.01％到10％。
某些实施例中，制备根据本发明的药物组合物和制剂，使得肠胃外剂量单位在稀释前含有
感兴趣药剂重量的0.01％到10％。
[0292] 药物组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载剂可以适当地包括溶液、乳剂、乳膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下中的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、如水和醇的稀释剂、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部给药的药物组合物中。如果用于透皮给药，则所述组合物可以包含透皮贴剂或离子电渗疗法装置。
[0293] 药物组合物可以用于例如，栓剂形式的直肠给药，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠给药的组合物可以含有油性基质作为合适的无刺激性赋形剂。此类碱包含但不限
于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
[0294] 药物组合物可以包含各种材料，这些材料改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可以包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性
的，并且可以选自例如，糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。可替代地，可以将活性成分包裹在明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可以包含结合药剂的组分，从而有助于化合物的递
送。可以以这种能力起作用的合适组分包含单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂
质体。
的，并且可以选自例如，糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。可替代地，可以将活性成分包裹在明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可以包含结合药剂的组分，从而有助于化合物的递
送。可以以这种能力起作用的合适组分包含单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂
质体。
[0295] 药物组合物可以基本上由剂量单位组成，其可以作为气雾剂给药。术语气雾剂用于表示从胶体性质到由加压包装组成的系统的各种系统。可以通过液化或压缩气体或通过
分配活性成分的合适泵系统进行递送。气雾剂可以以单相、双-相或三-相系统递送，以递送活性成分。气雾剂的递送包含必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，这些一起可以形成试剂盒。本领域普通技术人员无需过多实验即可确定优选的气雾剂。
分配活性成分的合适泵系统进行递送。气雾剂可以以单相、双-相或三-相系统递送，以递送活性成分。气雾剂的递送包含必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，这些一起可以形成试剂盒。本领域普通技术人员无需过多实验即可确定优选的气雾剂。
[0296] 本文所述的组合物可以用载剂制备，所述载剂保护药剂不会从身体中快速消除，如定时释放制剂或包衣。此类载体包含控释制剂，如但不限于植入物和微囊化递送系统，和可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸以及本领域普通技术人员已知的其它物质。
[0297] 药物组合物可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，用于通过注射给药的药物组合物可以包括一种或多种盐、缓冲剂和/或稳定剂，并与无菌蒸馏水一起形成溶液。可以加入表面活性剂以促进均相溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与药剂非共价相互作用的
化合物，以促进药剂在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮。
化合物，以促进药剂在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮。
[0298] 组合物可以以治疗有效量给药，其将根据多种因素而变化，包含所用的特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；给药方式和时间；排泄率；药物组合；特定疾病或病症的严重程度；以及受试者正在接受的治疗。在一些情况下，治疗有效日剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即，约0.07mg)到约100mg/kg(即，约7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.01mg/kg(即，约0.7mg)到约50mg/kg(即，约3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约
1mg/kg(即，约70mg)到约25mg/kg(即，约1.75g)。
1mg/kg(即，约70mg)到约25mg/kg(即，约1.75g)。
[0299] 在一些实施例中，包括ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)的组合物具有约5到约9、约6到约8、或约6.5到约7.5的pH。在一些实施例中，包括ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)的组合物具有约6.8±1.0的pH。
[0300] 在一些实施例中，包括ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)的组合物中的游离PEG为1％到10％。在一些实施例中，游离PEG小于总PEG的7％、小于总PEG的6％、小于总PEG的5％、小于总PEG的4％、小于总PEG的3％、小于总PEG的2％或小于总PEG的1％。在某些实施例中，包括ADI-PEG(例如，ADI-PEG 20)的组合物中的未修饰ADI小于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、
0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或小于0.1％。通常，包括ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG
20)的组合物具有小于或等于约4％、3％、2％、1.5％、1％或0.5％的总杂质。在一些实施例中，内毒素限度满足USP中陈述的要求，即，≤50EU/mL。
0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或小于0.1％。通常，包括ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG
20)的组合物具有小于或等于约4％、3％、2％、1.5％、1％或0.5％的总杂质。在一些实施例中，内毒素限度满足USP中陈述的要求，即，≤50EU/mL。
[0301] 在一些实施例中，包括ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)的组合物中的游离巯基大于约90％。在一些实施例中，包括ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)的组合物中的游离巯基为约91％、约92％、约93％、约94％或约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
[0302] 在一些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约0.1μM或0.5μM到约15μM、或约1μM到约12μM、约1μM到约10μM、约1.5μM到约9μM、约1.5μM到约8μM或约1.5μM到约7μM的Km。在某些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约1.0μM到约10μM或约1.5μM到约6.5μM的Km。在一些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约、至少约、或小于约0.1μM、约0.5μM、约1.0μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、或约7μM、或约8μM、或约9μM、或约10μM的Km。
[0303] 在一些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有从约0.5秒-1到-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1约80秒 、或约0.5秒 到约70秒 、或约0.5秒 到约60秒 、或约0.5秒 到约50秒 、或约0.5秒-1到约40秒-1、或约0.5秒-1到约30秒-1、或约0.5秒-1到约20秒-1、或约0.5秒-1到约15秒-1、或从0.5秒-1到约80秒-1、或约1秒-1到约80秒-1、或约5秒-1到约80秒-1、或约10秒-1到约80秒-1、或约20秒-1到约80秒-1、或约30秒-1到约80秒-1、或约40秒-1到约80秒-1、或约50秒-1到约
80秒-1、或约60秒-1到约80秒-1、或约70秒-1到约80秒-1、或约1秒-1到约12秒-1、约1秒-1到约10秒-1、约1.5秒-1到约9秒-1、约2秒-1到约8秒-1或约2.5秒-1到约7秒-1的Kcat。在某些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约2.5秒-1到约7.5秒-1的Kcat。在一些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约或至少约2.5秒-1、约3秒-1、约
3.5秒-1、约4秒-1、约4.5秒-1、约5秒-1、约5.5秒-1、约6秒-1、约6.5秒-1、约7秒-1、约7.5秒-1或约
8秒-1、约10秒-1、约15秒-1、约20秒-1、约25秒-1、约30秒-1、约35秒-1、约40秒-1、约45秒-1、约50-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
秒 、约55秒 、约60秒 、约65秒 、约70秒 、约75秒 、约80秒 、约85秒 、约90秒 、约95秒-1、或约100秒-1的Kcat。
80秒-1、或约60秒-1到约80秒-1、或约70秒-1到约80秒-1、或约1秒-1到约12秒-1、约1秒-1到约10秒-1、约1.5秒-1到约9秒-1、约2秒-1到约8秒-1或约2.5秒-1到约7秒-1的Kcat。在某些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约2.5秒-1到约7.5秒-1的Kcat。在一些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约或至少约2.5秒-1、约3秒-1、约
3.5秒-1、约4秒-1、约4.5秒-1、约5秒-1、约5.5秒-1、约6秒-1、约6.5秒-1、约7秒-1、约7.5秒-1或约
8秒-1、约10秒-1、约15秒-1、约20秒-1、约25秒-1、约30秒-1、约35秒-1、约40秒-1、约45秒-1、约50-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
秒 、约55秒 、约60秒 、约65秒 、约70秒 、约75秒 、约80秒 、约85秒 、约90秒 、约95秒-1、或约100秒-1的Kcat。
[0304] 在一些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约5mS/cm到约20mS/cm、或约5mS/cm到约15mS/cm、约7mS/cm到约15mS/cm、约9mS/cm到约15mS/cm或约
10mS/cm到约15mS/cm的导电率(在本领域中也称为电导系数)。在一些实施例中，组合物中
的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约9mS/cm、约10mS/cm、约11mS/cm、约12mS/cm、约
13mS/cm、约14mS/cm、或约15mS/cm的导电率。在某些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约13mS/cm±1.0mS/cm的导电率。
10mS/cm到约15mS/cm的导电率(在本领域中也称为电导系数)。在一些实施例中，组合物中
的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约9mS/cm、约10mS/cm、约11mS/cm、约12mS/cm、约
13mS/cm、约14mS/cm、或约15mS/cm的导电率。在某些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约13mS/cm±1.0mS/cm的导电率。
[0305] 在一些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约50mOsm/kg到约500mOsm/kg、约100mOsm/kg到约400mOsm/kg、约150mOsm/kg到约350mOsm/kg、约
200mOsm/kg到约350mOsm/kg、或约250mOsm/kg到约350mOsm/kg的渗透度。在某些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约300±30mOsm/kg的渗透度。
200mOsm/kg到约350mOsm/kg、或约250mOsm/kg到约350mOsm/kg的渗透度。在某些实施例中，组合物中的ADI(例如，ADI-PEG、ADI-PEG 20)具有约300±30mOsm/kg的渗透度。
[0306] 在某些实施例中，蛋白质浓度为约8到约15mg/mL。在某些实施例中，蛋白质浓度为约8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14或15mg/mL。
[0307] 在一些实施例中，ADI(例如，ADI-PEG，ADI-PEG 20)的酶比活为约5.0到90IU/mg或约5到55I Iu/mg，其中1IU定义为在37℃下在一分钟内将一μmol精氨酸转化为μmol瓜氨酸和1μmol氨的酶量，并且效能为100±20IU/mL。在某些实施例中，酶比活为约5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、
17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、
27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95或
100±2.0IU/mg。
17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、
27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95或
100±2.0IU/mg。
[0308] 本文所述的组合疗法可以包含施用单一药物剂型，其包含精氨酸耗竭剂和免疫治疗剂(任选地具有一种或多种附加活性剂)，以及在其自身单独的药物剂型中施用包括精氨
酸耗竭剂和癌症免疫治疗剂的组合物。例如，如本文所述的精氨酸耗竭剂和癌症免疫治疗
剂可以以如片剂或胶囊的单个口服剂量组合物一起施用于患者，或者以单独的口服剂型施
用每种药剂。类似地，如本文所述的精氨酸耗竭剂和癌症免疫治疗剂可以在单个肠胃外剂
量组合物中一起施用于患者，如在盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液中，或者每种药
剂以单独的肠胃外剂型施用。作为另一实例，对于基于细胞的疗法，精氨酸耗竭剂可以在施用前与细胞混合，作为单独组合物的一部分施用，或与组合物一起施用。当使用单独的剂量制剂时，组合物可以基本上同时施用，即同时施用，或分开交错施用，即，依次和以任何顺序施用；联合治疗应理解为包含所有这些方案。
酸耗竭剂和癌症免疫治疗剂的组合物。例如，如本文所述的精氨酸耗竭剂和癌症免疫治疗
剂可以以如片剂或胶囊的单个口服剂量组合物一起施用于患者，或者以单独的口服剂型施
用每种药剂。类似地，如本文所述的精氨酸耗竭剂和癌症免疫治疗剂可以在单个肠胃外剂
量组合物中一起施用于患者，如在盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液中，或者每种药
剂以单独的肠胃外剂型施用。作为另一实例，对于基于细胞的疗法，精氨酸耗竭剂可以在施用前与细胞混合，作为单独组合物的一部分施用，或与组合物一起施用。当使用单独的剂量制剂时，组合物可以基本上同时施用，即同时施用，或分开交错施用，即，依次和以任何顺序施用；联合治疗应理解为包含所有这些方案。
[0309] 还包含精氨酸耗竭剂的体外或离体用途以及本文所述的相关实施例。通常，精氨酸耗竭可以用于例如，增加组织培养研究中的体外T细胞活化和/或Treg下调或作为基于T
细胞的免疫疗法的引物。因此，某些实施例涉及在体外或离体增加T细胞活化和/或Treg下
调的方法，包括将T细胞与一种或多种精氨酸耗竭剂一起孵育或接触，其在本文别处描述。
还包含在体外或离体增加T细胞活化和/或Treg下调的方法，包括在补充有瓜氨酸的无精氨
酸培养基中孵育T细胞。在某些实施例中，T细胞是原代T细胞，例如，从受试者或患者分离或获得。
细胞的免疫疗法的引物。因此，某些实施例涉及在体外或离体增加T细胞活化和/或Treg下
调的方法，包括将T细胞与一种或多种精氨酸耗竭剂一起孵育或接触，其在本文别处描述。
还包含在体外或离体增加T细胞活化和/或Treg下调的方法，包括在补充有瓜氨酸的无精氨
酸培养基中孵育T细胞。在某些实施例中，T细胞是原代T细胞，例如，从受试者或患者分离或获得。
[0310] 具体实施例涉及用于治疗有需要的受试者的癌症的过继性T细胞免疫疗法的方法，其包括ADI-PEG20(a)将离体衍生的T细胞(i)与精氨酸耗竭ADI-PEG20剂或(ii)在补充
有瓜氨酸的无精氨酸培养基中孵育；以及(b)将离体衍生的T细胞施用于受试者。参见例如，June，《临床研究杂志(J Clin Invest)》，117:1466-1476，2007；以及Rosenberg和Restifo，《科学(Science)》，348:62-68，2015，关于过继性T细胞免疫疗法的描述。在一些情况下，离体衍生的T细胞从待治疗的受试者获得。在某些实施例中，精氨酸耗竭增强了过继转移T细
胞的功效。
有瓜氨酸的无精氨酸培养基中孵育；以及(b)将离体衍生的T细胞施用于受试者。参见例如，June，《临床研究杂志(J Clin Invest)》，117:1466-1476，2007；以及Rosenberg和Restifo，《科学(Science)》，348:62-68，2015，关于过继性T细胞免疫疗法的描述。在一些情况下，离体衍生的T细胞从待治疗的受试者获得。在某些实施例中，精氨酸耗竭增强了过继转移T细
胞的功效。
[0311] 示例性精氨酸耗竭剂在本文别处描述。不含精氨酸的培养基和瓜氨酸补充剂是可商购的(参见例如，赛默飞世尔科技)。在一些情况下，不含精氨酸的培养基包括约0.01到
100mM，或约、至少约、或不超过约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100mM的瓜氨酸。
100mM，或约、至少约、或不超过约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100mM的瓜氨酸。
[0312] 与上述类似，通过过继性T细胞免疫疗法与精氨酸耗竭相结合治疗的示例性癌症包含肝细胞癌(HCC)、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤或脉络丛乳头状瘤)、多形性成胶质细胞瘤(例如，巨细胞胶质瘤或胶质肉瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(成神经管细胞瘤)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头颈癌，宫颈癌，睾丸癌和胃癌。
[0313] 在一些实施例中，T细胞(例如，离体衍生的T细胞)包括癌抗原特异性T细胞。在暴露于精氨酸耗竭之前、期间和/或之后(例如，与精氨酸耗竭剂接触、在补充有瓜氨酸的无精氨酸培养基中孵育)，可以扩增、富集、改造或以其它方式制备癌抗原特异性T细胞。在某些情况下，待治疗的癌症与癌抗原结合，即，癌抗原特异性T细胞靶向或富集至少一种已知的与待治疗的癌症相关的抗原。在一些实施例中，癌抗原选自CD19、人类Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-
1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程式死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶-3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素的一种或多种。在一些情况下，癌抗原特异性T细胞选自嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(例如，靶向癌抗原)和T细胞受体(TCR)修饰T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及肽诱导T细胞中的一种或多种。
1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程式死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶-3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素的一种或多种。在一些情况下，癌抗原特异性T细胞选自嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(例如，靶向癌抗原)和T细胞受体(TCR)修饰T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及肽诱导T细胞中的一种或多种。
[0314] 还包含患者护理试剂盒，其包括(a)一种或多种将精氨酸转化为瓜氨酸的精氨酸耗竭剂；和一种或多种癌症免疫治疗剂。在某些试剂盒中，(a)和(b)在单独的组合物中。在某些试剂盒中，(a)和(b)在同一组合物。
[0315] 本文的试剂盒还可以包含一种或多种附加的治疗剂或适合于或期望用于所治疗适应症或用于期望诊断应用的其它组分。本文的试剂盒还可以包含一个或多个注射器或促
进预期递送模式所需或期望的其它组分(例如，支架、可植入的贮库等)。
进预期递送模式所需或期望的其它组分(例如，支架、可植入的贮库等)。
[0316] 本说明书中引用的所有出版物，专利申请和授权专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或授权专利被具体且单独地指示通过引用并入一样。
[0317] 尽管以上发明已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细的描述，对于本领域普通技术人员而言在本发明的传授内容的启发下应该容易清楚的是，
在不偏离随附权利要求书的精神或范围下可以对其进行某些改变和变更。以下实例以说明
的方式而非限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本
相似结果的各种非关键参数。
在不偏离随附权利要求书的精神或范围下可以对其进行某些改变和变更。以下实例以说明
的方式而非限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本
相似结果的各种非关键参数。
[0318] 实例
[0319] 实例1
[0320] ADI-PEG 20调节经刺激的T细胞而非静息T细胞
[0321] 对ADI PEG-20对T细胞的影响进行了测试，如下所述。
[0322] 试剂.ADI PEG-20是由人型支原体克隆而来的重组蛋白，在大肠杆菌中产生，并且用20,000MWPEG进行PEG化(见例如，Feun和Savaraj，《调研药物专家评论》，2006年7月；15(7):815-22；Holtsberg等人，《控制释放杂志》，2002年4月23日；80(1-3):259-71；以及Bomalaski等人，《Preclinica》(2003年)，第1卷，第284-293页)。使用C397A取代来产生失活的ADI PEG-20突变体(mutADI)。
[0323] 从AllCells购买经冷冻的健康供体PBMC。在三个重复实验中对来自两个不同供体的PBMC进行测试。对PBMC进行解冻、洗涤并且使其静置过夜(18小时)。次日收集细胞，使其重悬浮于补充有Glutamax的AIM-V培养基中，并且对其进行计数。将细胞浓度调整为每mL
2x106个细胞，并且在6孔板的每个孔中添加2mL细胞。在存在或不存在CD3/CD28Dynabeads
或PHA的情况下，用0、0.8、4或20nM的ADI-PEG 20来处理PBMC。CD3/CD28Dynabeads是根据制造商说明来制备的。在处理24、48和72小时之后对细胞进行分析。
2x106个细胞，并且在6孔板的每个孔中添加2mL细胞。在存在或不存在CD3/CD28Dynabeads
或PHA的情况下，用0、0.8、4或20nM的ADI-PEG 20来处理PBMC。CD3/CD28Dynabeads是根据制造商说明来制备的。在处理24、48和72小时之后对细胞进行分析。
[0324] 流式细胞术分析.在流式细胞术分析之前，从样本中去除Dynabeads。在人Fc阻断中阻断细胞，用存活/死亡(Live/Dead)可固定近IR染色剂来将细胞染色，随后通过适当的
抗体溶液混合物来进行染色。对于效应T细胞(Teff)分析，抗体混合物包括：CD3-PE-Cy7、CD8-FITC、CD4-PerCP-Cy5.5、CD69-APC和CD274-PE、CD279-PE或CD152-PE。对于对调节性T细胞(Treg)的分析，抗体混合物包括CD3-PE-Cy7、CD4-PerCP-Cy5.5、CD25-APC和CD127-PE、CD274-PE、CD279-PE或CD152-PE。在洗涤表面染色样品之后，立即通过流式细胞术分析用
Teff抗体混合物染色的样品，同时用人Foxp3缓冲液套装来对用Treg抗体混合物染色的样
品进行透性化处理并且用FoxP3-FITC抗体对所述样品进行细胞内染色。在Guava EasyCyte
8HT(密理博(Millipore))上针对每个样品获取50,000个事件。用InCyte软件(密理博)执行
数据获取和分析。使用AbC总抗体补偿微珠试剂盒和ArC胺反应性微珠试剂盒来产生单染色
荧光团对照，且并在细胞仪上执行光谱重叠补偿。
抗体溶液混合物来进行染色。对于效应T细胞(Teff)分析，抗体混合物包括：CD3-PE-Cy7、CD8-FITC、CD4-PerCP-Cy5.5、CD69-APC和CD274-PE、CD279-PE或CD152-PE。对于对调节性T细胞(Treg)的分析，抗体混合物包括CD3-PE-Cy7、CD4-PerCP-Cy5.5、CD25-APC和CD127-PE、CD274-PE、CD279-PE或CD152-PE。在洗涤表面染色样品之后，立即通过流式细胞术分析用
Teff抗体混合物染色的样品，同时用人Foxp3缓冲液套装来对用Treg抗体混合物染色的样
品进行透性化处理并且用FoxP3-FITC抗体对所述样品进行细胞内染色。在Guava EasyCyte
8HT(密理博(Millipore))上针对每个样品获取50,000个事件。用InCyte软件(密理博)执行
数据获取和分析。使用AbC总抗体补偿微珠试剂盒和ArC胺反应性微珠试剂盒来产生单染色
荧光团对照，且并在细胞仪上执行光谱重叠补偿。
[0325] 门控策略.通过FSC-H对FSC-A曲线图确定单一细胞门(singlet gate)。使用荧光扣除(fluorescent minus one，FMO)对照来建立其它分析门。基于存活/死亡可固定近IR染色剂在活细胞上对单一细胞进行门控，并且对单一细胞和活细胞进行进一步分析以确定
CD3T细胞标记物的存在。在CD3+活细胞和单一细胞内建立CD4+门和CD8+门，然后对这些群
体中的每一个进行分析以确定其他标记物CD69、CD274、CD279和CD152的存在。对于Treg分析，对单一和存活CD3+CD4+细胞进行分析以确定CD25、FoxP3、CD127、CD274、CD279和CD152标记物的存在。
CD3T细胞标记物的存在。在CD3+活细胞和单一细胞内建立CD4+门和CD8+门，然后对这些群
体中的每一个进行分析以确定其他标记物CD69、CD274、CD279和CD152的存在。对于Treg分析，对单一和存活CD3+CD4+细胞进行分析以确定CD25、FoxP3、CD127、CD274、CD279和CD152标记物的存在。
[0326] 实验概述.使PBMC静置过夜，并且在存在或不存在CD3/CD28微珠或PHA的情况下用0、0.8、4或20nM ADI-PEG 20对其进行处理24、48或72小时。为了控制PEG 20的任何潜在影响并且验证ADI-PEG 20的观察到的治疗结果是由ADI活性介导的，将20nM灭活的ADI突变体
(mutADI)的效果作为对照(具有C397A取代的其用20K PEG进行PEG化的ADI)进行评估。
(mutADI)的效果作为对照(具有C397A取代的其用20K PEG进行PEG化的ADI)进行评估。
[0327] 在完成孵育之后，收集细胞，对其进行染色以表达表面标记物，并且使用流式细胞术、通过免疫细胞表型分析对其进行分析。用来自两个不同供体的PBMC进行三个独立实验，并且所获得的结果在实验重复之间是一致的，在图1到图5中示出了代表性的数据。
[0328] 虽然在静置条件下对T细胞无影响，但是在用抗CD3/CD28微珠(图1到图5)或PHA(数据未示出)进行刺激期间进行的ADI-PEG 20治疗导致T细胞的调节，详情如下。在任何实验条件下，非功能性mutADI-PEG 20不对T细胞进行调节。
[0329] 结果.ADI-PEG 20促进刺激诱导的T细胞活化，其表现为CD69表达。在24小时刺激之后T细胞上的CD69上调由ADI-PEG 20以浓度相关的方式增强。此外，在48小时和72小时时间点，虽然在存在ADI-PEG 20的情况下，CD69水平消退(如预期那样)，但是经刺激的T细胞在存在ADI-PEG 20的情况下维持高CD69水平。
[0330] 0.8nM剂量的ADI-PEG 20在24小时和48小时时间点效果不明显，并且在72小时时诱导CD69表达的适度增加，这一定是耗费了足够的时间来将临界量的精氨酸转化为瓜氨
酸。4nM和20nM剂量两者均显著增强CD69表达(在约80％的T细胞中诱导所述表达)，其中
20nM剂量的效果略大于4nM剂量；100nM的ADI-PEG 20与在20nM具有相同的效果(数据未示
出)。
酸。4nM和20nM剂量两者均显著增强CD69表达(在约80％的T细胞中诱导所述表达)，其中
20nM剂量的效果略大于4nM剂量；100nM的ADI-PEG 20与在20nM具有相同的效果(数据未示
出)。
[0331] 在CD4+和CD8+T细胞上，表面CD69的ADI-PEG 20剂量相关增强明显。在图1中示出了代表性数据。
[0332] ADI-PEG 20还减缓了T细胞耗竭。通过用4nM或20nM ADI-PEG 20进行治疗来防止刺激后48小时和72小时时在T细胞上对PD-1的诱导(见图2)。在PBMC刺激期间存在ADI-PEG
20时，T细胞中PD-1水平仍较低，其类似于静置状态下的水平。
20时，T细胞中PD-1水平仍较低，其类似于静置状态下的水平。
[0333] 对T细胞亚群上的CTLA-4表达的分析揭示，4nM和20nM剂量的ADI-PEG 20也显著降低了刺激后CD4+和CD8+细胞上的CTLA-4上调，而20nM mutADI-PEG 20或0.8nM ADI-PEG 20
对CTLA-4水平的影响不明显(见图3)。
对CTLA-4水平的影响不明显(见图3)。
[0334] 在用在48小时时可在几乎所有T细胞上检测到的表面PD-L1来进行的抗CD3/CD28微珠(或PHA)刺激后，T细胞上的PD-L1表面水平显著上调。4nM或20nM(而不是0.8nM)ADI-
PEG 20的存在在一定程度上减缓了这种诱导，但PD-L1+T细胞的百分比仍远高于未经刺激
的对照中的百分比。相比于CD4+细胞中，PD-L1+活化T细胞的ADI-PEG 20介导的减少在CD8+细胞中更为明显(见图4)。
PEG 20的存在在一定程度上减缓了这种诱导，但PD-L1+T细胞的百分比仍远高于未经刺激
的对照中的百分比。相比于CD4+细胞中，PD-L1+活化T细胞的ADI-PEG 20介导的减少在CD8+细胞中更为明显(见图4)。
[0335] ADI-PEG 20下调调节性T细胞(Treg)。CD3/CD28微珠刺激诱导CD3+CD4+CD25+FoxP3+Treg，并且ADI-PEG 20以浓度相关方式颠倒这种效果(见图5)。4nM和20nM剂量的
ADI-PEG 20在所有三个测试时间点显著降低Treg水平，其中20nM剂量产生较大的效果并且
使Treg水平为在未经刺激的PBMC中发现的水平。
ADI-PEG 20在所有三个测试时间点显著降低Treg水平，其中20nM剂量产生较大的效果并且
使Treg水平为在未经刺激的PBMC中发现的水平。
[0336] 与T细胞活化数据(CD69水平)相似，0.8nM ADI-PEG 20在24小时和48小时时间点对Treg细胞没有影响，但在72小时时对其进行调节。用抗CD3/CD28微珠刺激的且用0.8nM
ADI-PEG 20治疗的PBMC样品中的CD4+细胞中的Treg百分比从48小时到72小时时间点下降
约2倍，而在未治疗或mutADI-PEG 20治疗的对照中，所述百分比仅略有下降。这表明ADI-
PEG 20不仅防止Treg细胞的积累，而且颠倒所述积累。
ADI-PEG 20治疗的PBMC样品中的CD4+细胞中的Treg百分比从48小时到72小时时间点下降
约2倍，而在未治疗或mutADI-PEG 20治疗的对照中，所述百分比仅略有下降。这表明ADI-
PEG 20不仅防止Treg细胞的积累，而且颠倒所述积累。
[0337] 进一步分析Treg细胞以确定其对PD-L1和CTLA-4标记物的表达。ADI-PEG 20对表达PD-L1+(大多数为Treg细胞)或CTLA-4+的Treg细胞的剂量相关效果与使用所有Treg细胞
(CD3+CD4+CD25+FoxP3+)观察到的效果类似。无论是否包含对CD127-细胞的门控，这些结果都类似(几乎所有CD3+CD4+CD25+FoxP3+均为CD127-，数据未示出)。
(CD3+CD4+CD25+FoxP3+)观察到的效果类似。无论是否包含对CD127-细胞的门控，这些结果都类似(几乎所有CD3+CD4+CD25+FoxP3+均为CD127-，数据未示出)。
[0338] 实例2
[0339] ADI-PEG 20诱导T细胞浸润并且在B16-F10同基因小鼠黑色素瘤模型中显示出有明显的抑制作用疗效
[0340] 为了评估ADI-PEG 20对体内T细胞活性的疗效和影响，使C57BL/6小鼠植入有B16-F10黑色素瘤细胞(5×105个B16-F10细胞在0.1ml PBS中皮下植入到C57BL/6小鼠右侧)并
用试验剂对其进行治疗。
用试验剂对其进行治疗。
[0341] 为了实现疗效，将动物随机分为三组，每组八只小鼠(n＝8)。在肿瘤接种之后第一天开始治疗。第1组中的每只小鼠通过每3天一次、共4次进行腹腔内注射来接收0.5ml载剂(PBS)。第2组中的每只小鼠通过每6天一次、共2次进行肌肉内注射来以40μl接收18mg/
m2ADI-PEG20。第3组中每只小鼠通过每3天一次、共4次进行腹腔内注射来以0.25ml接收
36mg/m2ADI-PEG20。每周三次测量肿瘤大小，直到每组的平均肿瘤体积达到3500mm3到
4000mm3，并且使用以下公式以mm3为单位来表示肿瘤体积：V＝0.536a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。在此时期期间，每周三次测量和记录体重。将结果表示为平均值±
S.E.M，如前所述。图6A示出了ADI-PEG 20对接种小鼠的体重的影响，图6B示出了ADI-PEG
20对动态肿瘤体积的影响。这些结果表明，ADI-PEG 20随时间的推移明显减小了肿瘤体积。
m2ADI-PEG20。第3组中每只小鼠通过每3天一次、共4次进行腹腔内注射来以0.25ml接收
36mg/m2ADI-PEG20。每周三次测量肿瘤大小，直到每组的平均肿瘤体积达到3500mm3到
4000mm3，并且使用以下公式以mm3为单位来表示肿瘤体积：V＝0.536a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。在此时期期间，每周三次测量和记录体重。将结果表示为平均值±
S.E.M，如前所述。图6A示出了ADI-PEG 20对接种小鼠的体重的影响，图6B示出了ADI-PEG
20对动态肿瘤体积的影响。这些结果表明，ADI-PEG 20随时间的推移明显减小了肿瘤体积。
[0342] 对于肿瘤T细胞浸润分析，将动物随机分为两组：对照组4只小鼠，以及ADI-PEG20治疗组6只小鼠。在肿瘤植入之后第1天和第7天给予治疗。向对照动物肌肉内注射媒剂
(PBS)，并且向试验组中的小鼠肌肉内注射36mg/m2的ADI-PEG 20，两者均以40μl的体积。
(PBS)，并且向试验组中的小鼠肌肉内注射36mg/m2的ADI-PEG 20，两者均以40μl的体积。
[0343] 在肿瘤植入之后第14天将动物安乐死，并且去除肿瘤，在4％的多聚甲醛溶液中保存至少24小时，并且进行石蜡包埋以供免疫组织化学(IHC)分析。用抗CD3mAb将肿瘤切片染色以检查T细胞的存在。对每只动物的肿瘤的三个切片进行染色，并且在源自同一肿瘤的切片之间，T细胞浸润水平类似。
[0344] 在用ADI-PEG 20治疗的六只动物中有五只在其肿瘤中具有大量T细胞存在(见图7)，从而表明ADI-PEG 20诱导通过T细胞使肿瘤浸润到非免疫原性B16-F10肿瘤中。仅来自
一只ADI-PEG 20治疗的动物的肿瘤切片具有非常少的浸润T细胞，这类似于在来自对照未
治疗的小鼠的肿瘤切片中观察到的水平。
一只ADI-PEG 20治疗的动物的肿瘤切片具有非常少的浸润T细胞，这类似于在来自对照未
治疗的小鼠的肿瘤切片中观察到的水平。
[0345] 实例3
[0346] ADI-PEG20和小鼠特异性PD-1和PD-L1抗体在同基因小鼠模型中的抗肿瘤疗效。
[0347] 在两个不同的小鼠结直肠癌模型中对ADI-PEG组合PD-1和PD-L1抗体的疗效进行测试。
[0348] CT26小鼠结直肠癌模型.在0.1ml PBS中，在Balb/c小鼠右侧对小鼠皮下接种CT26肿瘤细胞(2x 105)以供肿瘤发展。基于肿瘤大小对动物随机分组，并且在平均肿瘤大小达
3
到81mm时开始治疗，以进行疗效研究。
3
到81mm时开始治疗，以进行疗效研究。
[0349] 通过肌肉内注射(i.m.)施用ADI-PEG20，并且腹腔内施用(i.p.)小鼠特异性抗PD-L1抗体。
[0350] 图9和表E1(下文)示出了ADI-PEG20、PD-L1抑制剂以及组合疗法对荷瘤小鼠的肿瘤体积的影响。
[0351]
[0352] 在治疗后第11天，对照组的平均肿瘤体积达到1,347mm3。10mg/kg剂量的BioXcell-mPD-L1治疗呈现明显的抗肿瘤活性，平均肿瘤大小达到1,033mm3(T/C值＝77％，TGI值＝25％，并且p＝0.889，相对于载剂组)。12mg/kg剂量的ADI-PEG20治疗呈现中等的抗肿瘤活性；平均肿瘤大小为667mm3(T/C值＝50％，TGI值＝54％，并且p＝0.113，相对于载剂组)。ADI-PEG20与BioXcell-mPD-L1组合也显示出明显的抗肿瘤活性；平均肿瘤大小为
469mm3(T/C值＝35％)；TGI值＝69％，并且p＝0.018)。
469mm3(T/C值＝35％)；TGI值＝69％，并且p＝0.018)。
[0353] 图10和表E2(下文)示出了ADI-PEG20、PD-L1抑制剂和组合疗法对荷瘤小鼠的存活的影响。
[0354]
[0355] PBS治疗的对照小鼠的寿命范围为14天到21天，其中MST为15.5天。ADI-PEG20(12mg/kg)治疗产生29.5天的MST，与对照组相比，这表示90％的ILS(p＝0.003)。所述剂量的BioXcell-mPD-L1(10mg/kg)治疗产生27.5天的MST(ILS＝77％，p＝0.052)。ADI-PEG20与BioXcell-mPD-L1组合呈现32天的MST(ILS＝106％，p＝0.0002)。
[0356] B16F10小鼠结直肠癌模型.在0.1ml PBS(含有0.05ml基质胶)中，在雌性C57BL/6J小鼠的右侧皮下接种B16F10肿瘤细胞(2x105)以供肿瘤发展。基于体重将动物随机分组，并且在细胞接种之后第一天开始治疗。
[0357] 通过肌肉内注射(i.m.)施用ADI-PEG20，并且腹腔内施用(i.p.)小鼠特异性抗PD-1抗体。
[0358] 图12示出了ADI-PEG20、PD-1抑制剂和组合疗法对荷瘤小鼠的存活的影响。在治疗开始后第13天，对照组的平均肿瘤大小达到2,157mm3。抗PD-1mAb(10mg/kg)治疗的小鼠的
平均肿瘤大小达到1,078mm3(T/C值＝50％；TGI值＝50％，并且p<0.001，相对于载剂组)。
12mg/kg剂量的ADI-PEG 20治疗产生抗肿瘤活性；平均肿瘤大小为1,466mm3(T/C值＝68％；
TGI值＝32％，并且p＝0.003，相对于载剂组)。ADI-PEG 20与抗PD-1mAb组合产生显著的抗肿瘤活性；平均肿瘤大小为1,002mm3(T/C值＝46％；TGI值＝54％，并且p<0.001)。
平均肿瘤大小达到1,078mm3(T/C值＝50％；TGI值＝50％，并且p<0.001，相对于载剂组)。
12mg/kg剂量的ADI-PEG 20治疗产生抗肿瘤活性；平均肿瘤大小为1,466mm3(T/C值＝68％；
TGI值＝32％，并且p＝0.003，相对于载剂组)。ADI-PEG 20与抗PD-1mAb组合产生显著的抗肿瘤活性；平均肿瘤大小为1,002mm3(T/C值＝46％；TGI值＝54％，并且p<0.001)。
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