寡克隆肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养和应用
阅读：218发布：2020-05-22
专利汇可以提供寡克隆肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及寡克隆肝癌 肿瘤 浸润淋巴细胞的培养和应用，揭示了一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的寡克隆培养方法，从肝癌组织中选择性扩增抗瘤活性强的TIL细胞群，并应用于肝癌的免疫过继 治疗 。，下面是寡克隆肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养和应用专利的具体信息内容。
1.一种肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)从肝癌离体组织样本中，获取肿瘤与正常组织交界位置内外2mm范围的组织；
(2)培养步骤(1)的组织，培养基中加入IL-2，促进淋巴细胞生长、渗出和增殖，获得肝癌肿瘤浸润淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，IL-2在培养基中的终浓度为
6000±1000IU/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的培养基是RPMI 1640培养基，其中还含有：25±5mmol/L HEPES、100±20U/ml青霉素、100±20U/ml链霉素、-5
2±0.4mmol/L谷氨酰胺、(5.5±1)×10 mol/L β-巯基乙醇、10±2%人AB血清。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)的组织置于24孔板于增湿的37℃、5%CO2环境中培养。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在培养过程中，每周更换一半培养基。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物中，Treg细胞所占比例低于10%。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物中，IFN-γ浓度高于280pg/mL。
8.权利要求1-7任一所述的方法制备的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物。
9.权利要求8所述的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物的用途，用于制备免疫过继治疗肝癌的药物。
10.一种用于制备含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
IL-2；和RPMI 1640培养基，其中还含有：25±5mmol/L HEPES、100±20U/ml青霉素、-5
100±20U/ml链霉素、2±0.4mmol/L谷氨酰胺、(5.5±1)×10 mol/Lβ-巯基乙醇、10±2%人AB血清。
寡克隆肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养和应用
技术领域
背景技术
[0002] 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最多见的五大恶性肿瘤之一，而我国约占全球45%。目前，肝癌的治疗己从单一的手术切除发展到以手术为主的包括肝动脉化疗栓塞、外放射治疗、局部治疗以及免疫治疗等多模式的综合治疗阶段[1]。这些手段在有效杀伤肿瘤的同时，不可避免地给机体免疫功能带来不同程度的损伤。随着免疫学、分子生物学的飞速发展，继手术、放疗、化疗三大疗法之后，肿瘤的生物治疗己成为肿瘤治疗的第四种模式。肿瘤的生物治疗包括免疫治疗、基因治疗、干细胞治疗、诱导肿瘤细胞的分化及凋亡、抑制肿瘤新生血管治疗等，其中主要是免疫治疗[2]。肝癌病人免疫功能低下，特别是局部免疫微环境异常，导致机体免疫防御反应不能有效进行是肝癌产生免疫逃逸、容易转移复发的重要因素[3]。如何有效调节宿主免疫功能、改善肝脏局部免疫微环境以利机体抗瘤效应的发挥，是防治肝癌术后转移复发、消灭术后残瘤的重要、有效手段，是肝癌综合治疗的重要内容。
[0003] 虽然肝癌免疫研究已取得了一定进展，但对究竟肝癌细胞是如何诱导免疫耐受并逃避免疫监视的确切机制尚未充分了解。在诱导激活抗原特异的T细胞反应的同时，必须重视肝脏局部免疫微环境对激活的T细胞的抑制作用。只有这样，才能有效激发抗肿瘤免疫，产生较好的抗瘤效果。因此运用免疫手段，提高机体本身的免疫功能成为治疗肿瘤新措施，使得HCC的免疫防治研究日趋重要[4]。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)是一群浸润于肿瘤组织中，对自体肿瘤细胞有较高特异性杀伤活性的淋巴细胞。因其与肿瘤细胞密切接触而被认为是宿主对肿瘤识别的直接而特异的表现，具有高效、特异、副作用小等优点，近年来受到国内外学者特别关注[5]。肿瘤组织中浸润淋巴细胞数量和功能的变化在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的强度和总体水平。然而，新鲜提取的TIL抗瘤活性十分低下，激活TIL进行过继免疫治疗，但临床治疗效果并不理想，研究显示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态[6]。在诱发阶段调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)诱导TIL发生免疫偏倚，有的则因Treg数量显著增多使TIL几无功能，使TIL的抗瘤免疫陷入困境[7]。
[0004] 在以细胞免疫为主的肿瘤免疫过程中，Treg处于关键环节。1999年Sakaguchi+等将除去了CD25 细胞的CD4单阳性T细胞过继转移给裸鼠，结果裸鼠发生多种自身免疫+ + +
病，而将CD4CD25T细胞和CD4 单阳性T细胞共同过继转移，就不发生自身免疫病，证实+ + + +
CD4CD25T细胞能维持自身免疫耐受。随后体外研究也发现CD4CD25T细胞具有低反应+ +
性和免疫抑制功能，根据其功能将CD4CD25T细胞作为调节性T细胞[8]。它在肿瘤组织中的浸润程度代表了机体肿瘤免疫抑制反应的一个方面，在机体免疫调节中起重要作用，决定免疫反应的最终走向是激活免疫还是诱导耐受。Jone等发现用抗CD25单克隆抗体去除Treg细胞可以抑制恶性黑色素瘤的生长；这给人类肿瘤治疗提供了新的免疫疗法[9]。
Treg细胞联合其他提高肿瘤细胞免疫原性的方法可以提高肿瘤免疫。有研究小组也正在测试一种Treg细胞的阻滞剂，可以治疗恶性黑色素瘤[10]。鉴于Treg细胞在免疫学中的地位和作用，其研究和应用已成为最近肿瘤免疫和免疫治疗的热门方向，并已经取得了喜人的成绩。
病，而将CD4CD25T细胞和CD4 单阳性T细胞共同过继转移，就不发生自身免疫病，证实+ + + +
CD4CD25T细胞能维持自身免疫耐受。随后体外研究也发现CD4CD25T细胞具有低反应+ +
性和免疫抑制功能，根据其功能将CD4CD25T细胞作为调节性T细胞[8]。它在肿瘤组织中的浸润程度代表了机体肿瘤免疫抑制反应的一个方面，在机体免疫调节中起重要作用，决定免疫反应的最终走向是激活免疫还是诱导耐受。Jone等发现用抗CD25单克隆抗体去除Treg细胞可以抑制恶性黑色素瘤的生长；这给人类肿瘤治疗提供了新的免疫疗法[9]。
Treg细胞联合其他提高肿瘤细胞免疫原性的方法可以提高肿瘤免疫。有研究小组也正在测试一种Treg细胞的阻滞剂，可以治疗恶性黑色素瘤[10]。鉴于Treg细胞在免疫学中的地位和作用，其研究和应用已成为最近肿瘤免疫和免疫治疗的热门方向，并已经取得了喜人的成绩。
[0005] TIL体外激活培养可以使TIL的增殖、杀伤功能得以恢复，说明TIL的受抑或受到攻击是局部环境造成的，TIL的功能、表型变化及细胞偏倚也完全可以重塑。然而体外激活培养的方法未改变TIL在体内的受抑环境。目前常用的TIL分离方法包括利用胶原酶等消化肿瘤组织、淋巴细胞分离液及密度梯度离心分离TIL，然后在体外用人工合成的培养基(含10%人血清的RPMI1640培养液)，培养两周左右时间然后恢复患者体内进行免疫治疗[11]。具体如下：取新鲜肿瘤组织标本，去除周围正常组织和坏死组织，PBS洗3
涤，用RPMI1640培养液冲洗干净，移至无菌器皿内用手术剪将肿瘤组织剪碎至1-2mm 小块，置于消化酶的RPMI1640培养液40ml中，在室温下搅拌混匀，4℃过夜。去除未消化的
6
组织块，应用淋巴细胞分离液制成2×10/ml左右的细胞悬液，在梯度密度离心后，吸取
75%与100%分离液面之间富含TIL的白色细胞层，用Hank氏液洗涤、离心，之后进行培养扩增。另外在此方法基础上进行改进的“自体胸水上清培养TIL细胞的方法”(发明专利号：CN200410014095.9)，改用收集的癌性胸水离心后保存的上清作为培养液，体外培养TIL细胞。而另一个培养方法“一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法”(发明申请号：
CN201110028257.4)在上一发明专利的培养液中加入重组人纤维蛋白和聚类分化群3抗体，进行TIL细胞的体外扩增和培养，在收集TIL细胞前1-2天在培养液中再加入凋亡调节蛋白生存素和念蛋白-1。无论是传统还是进过改良的培养扩增的TIL回输人体，其抗肿瘤疗效差强人意，其根本原因如下：(1)胶原酶等消化肿瘤组织对TIL有损伤；(2)分离获取的TIL纯度不高；(3)对TIL的扩增无选择性，不能针对具有高抑瘤活性TIL进行扩增。
涤，用RPMI1640培养液冲洗干净，移至无菌器皿内用手术剪将肿瘤组织剪碎至1-2mm 小块，置于消化酶的RPMI1640培养液40ml中，在室温下搅拌混匀，4℃过夜。去除未消化的
6
组织块，应用淋巴细胞分离液制成2×10/ml左右的细胞悬液，在梯度密度离心后，吸取
75%与100%分离液面之间富含TIL的白色细胞层，用Hank氏液洗涤、离心，之后进行培养扩增。另外在此方法基础上进行改进的“自体胸水上清培养TIL细胞的方法”(发明专利号：CN200410014095.9)，改用收集的癌性胸水离心后保存的上清作为培养液，体外培养TIL细胞。而另一个培养方法“一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法”(发明申请号：
CN201110028257.4)在上一发明专利的培养液中加入重组人纤维蛋白和聚类分化群3抗体，进行TIL细胞的体外扩增和培养，在收集TIL细胞前1-2天在培养液中再加入凋亡调节蛋白生存素和念蛋白-1。无论是传统还是进过改良的培养扩增的TIL回输人体，其抗肿瘤疗效差强人意，其根本原因如下：(1)胶原酶等消化肿瘤组织对TIL有损伤；(2)分离获取的TIL纯度不高；(3)对TIL的扩增无选择性，不能针对具有高抑瘤活性TIL进行扩增。
[0006] 虽然目前制备扩增TIL的方法能得到大量细胞，但仍存在缺陷，例如不能选择性扩增抗瘤活性强的TIL群体等。因此，如何获得大量具有高抗瘤活性的TIL是免疫过继治疗的关键。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供寡克隆肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养和应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法，所述方法包括：
[0009] (1)从肝癌离体组织样本中，获取肿瘤与正常组织交界位置内外2mm范围的组织；
[0010] (2)培养步骤(1)的组织，培养基中加入IL-2，促进淋巴细胞生长、渗出和增殖，获得肝癌肿瘤浸润淋巴细胞。
[0011] 在一个优选例中，步骤(2)中，IL-2在培养基中的终浓度为6000±1000IU/ml。
[0012] 在另一优选例中，步骤(2)中，所述的培养基是RPMI 1640培养基(较佳地，pH7.2)，其中还含有：25±5mmol/L HEPES、100±20U/ml青霉素、100±20U/ml链霉素、-52±0.4mmol/L谷氨酰胺、(5.5±1)×10 mol/Lβ-巯基乙醇、10±2%人AB血清。
[0013] 在另一优选例中，步骤(2)中，将步骤(1)的组织置于24孔板于增湿的37℃、5%CO2环境中培养。
[0014] 在另一优选例中，在培养过程中，每周更换一半培养基。
[0015] 在另一优选例中，所述的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物中，Treg细胞所占比例低于10%。
[0016] 在另一优选例中，所述的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物中，IFN-γ浓度高于280pg/mL。
[0017] 在另一优选例中，所述方法不采用酶(如胶原酶)进行组织样本的消化。
[0018] 在本发明的另一方面，提供所述的方法制备的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物。
[0019] 在本发明的另一方面，提供所述的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物的用途，用于制备免疫过继治疗肝癌的药物。
[0021] IL-2；和RPMI 1640培养基(较佳地，pH7.2)，其中还含有：25±5mmol/L HEPES、-5100±20U/ml青霉素、100±20U/ml链霉素、2±0.4mmol/L谷氨酰胺、(5.5±1)×10 mol/Lβ-巯基乙醇、10±2%人AB血清。
[0023] 图1、肝癌患者肿瘤实质(肿瘤中心组织)与肿瘤周边组织(肿瘤与正常组织交界位置组织)Treg细胞绝对数分析。肿瘤实质内部Treg密度高于肿瘤周边组织(P=0.009)。
[0024] 图2、以肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围的组织块进行培养，不同寡克隆培养时间的肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的形态观察。A：第1天；B：第3天；C：第7天；D：第14天。
[0025] 图3、以肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围的组织块进行培养，寡克隆培养和传统培养方法的TIL进行流式分析鉴定。A：寡克隆培养法空白对照组；B：寡克隆培养法组；C：常规培养法空白对照组；D：常规培养法组。
[0026] 图4、肿瘤细胞作为靶细胞，肿瘤浸润淋巴细胞作为效应细胞，寡克隆方法培养和常规方法培养、阴性空白对照后肝癌细胞生存情况的比较。
[0027] 图5、不同寡克隆肝癌TIL之间靶细胞毒作用不同。
[0028] 图6、寡 克隆TIL连续 培养的 Treg比例变 化。右上 象限的 点代 表+ + +CD4CD25Foxp3Treg细胞。可见2周、3周、4周、5周的TIL中Treg比例逐渐下降。A：2周(Treg细胞比例5.55%)；B：3周(Treg细胞比例1.81%)；C：4周(Treg细胞比例0.44%)；D：
5周(Treg细胞比例0.23%)。
5周(Treg细胞比例0.23%)。
[0029] 图7、ELISA试剂盒定量检测肿瘤浸润淋巴细胞抗肿瘤活性，即测定不同寡克隆TIL细胞中所含Treg的比例及其与肝癌细胞共培养所释放的IFN-γ浓度。图中Treg比例的单位是“%”；IFNγ浓度单位是pg/mL。
[0030] 图8、不同寡克隆肝癌TIL之间IFN-γ分泌量不同。
[0031] 图9、含有较高比例Treg细胞的肿瘤浸润淋巴细胞分泌IFN-γ的能力较低，抗肿瘤活性差。图中的每个点代表不同寡克隆培养TIL中Treg的比例以及TIL释放IFN-γ的浓度。寡克隆TIL培养中Treg占淋巴细胞比例与TIL释放IFN-γ浓度成负相关性，相关系数为-0.650，P值＜0.001。
[0032] 图10、不同TIL治疗组免疫过继治疗H22肝癌荷瘤小鼠前后的肿瘤体积(TIL△：寡克隆TIL治疗组；TIL：常规TIL治疗组；Control：PBS液空白对照组)。
[0033] 图11、不同TIL治疗组小鼠肿瘤体积随治疗时间变化(TIL△：寡克隆TIL治疗组；TIL：常规TIL治疗组；Control：PBS液空白对照组)。
[0034] 图12、不同TIL治疗组的抑瘤率(Control：PBS液空白对照组；TIL：常规TIL治疗△组；TIL ：寡克隆TIL治疗组)。
[0035] 图13、免疫组化检测不同TIL治疗组小鼠瘤内FoxP3的表达。A：PBS液空白对照组FoxP3(+++)表达，箭头所示；B：常规TIL治疗组FoxP3(+)表达；C：寡克隆TIL治疗组FoxP3(+)表达。左：×200；右：×400。
[0036] 图14、不同TIL治疗组小鼠外周血细胞因子变化(Control：PBS液空白对照组；△
TIL：常规TIL治疗组；TIL ：寡克隆TIL治疗组)。
TIL：常规TIL治疗组；TIL ：寡克隆TIL治疗组)。
具体实施方式
[0037] 针对现有的培养方法存在的缺陷，本发明揭示了一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的寡克隆培养方法，从肝癌组织中选择性扩增抗瘤活性强的TIL细胞群，并应用于肝癌的过继免疫治疗。
[0038] 过继免疫治疗需要一个可靠稳定的TIL培养方法。寡克隆TIL培养法有着其自身的特点，来自同一肿瘤不同部位的独立寡克隆培养通常能表现出不同的增殖反应及抗原特异性抗肿瘤活性。局部T细胞的不均一性可能导致了起源于同一个肿瘤不同部位的寡克隆TIL抗肿瘤活性的差异。
[0039] 所谓寡克隆肿瘤浸润淋巴细胞是一群以少数TIL克隆扩增培养出来的一群TIL。本发明人通过在培养初期，通过在肿瘤不同部位取材，以及控制培养组织块的体积来限制培养起始时的Treg数目。提示了进行寡克隆TIL培养的取材部位应选择肿瘤与非肿瘤组织的交界区域。
[0040] 本发明的寡克隆TIL培养法，通过(1)同时进行多个来自同一肿瘤且彼此独立的寡克隆TIL培养；(2)检测每个寡克隆TIL的抗肿瘤活性；(3)进一步扩增培养抗肿瘤活性高的TIL，确定了应用肿瘤与正常组织交界位置内外2mm范围的组织，可以获得抗肿瘤活性良好的寡克隆TIL。
[0041] 因此相对于现有的培养方法，本发明具有以下优势：(1)不用通过胶原酶等消化肿瘤组织，让TIL自行游走出肿瘤组织，并且进一步增殖，分离TIL的过程对TIL无损伤；(2)由于TIL细胞是悬浮生长，通过控制培养液条件及反复传代培养，可以剔除其他杂质细胞，获得较高纯度的TIL细胞；(3)通过自体肿瘤细胞与TIL共培养，并检测TIL分泌IFN-γ情况，可以鉴别各个不同寡克隆TIL的抗肿瘤活性，进而选择性的扩增培养高抑瘤活性的寡克隆TIL。(4)培养出的TIL细胞抗肿瘤活性高，增强了免疫过继治疗功能。
[0042] 应用本发明的方法，可获得含有更低Treg比例的TIL。动物实验已表明，本发明制备的TIL细胞具有优异的抗肿瘤活性。
[0043] 本发明还提供了应用本发明的方法制备获得的含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物。所述的培养物中，Treg细胞所占比例低于10%；且IFN-γ浓度高于280pg/mL。
[0044] 基于本发明人的新发现，本发明还提供了用于制备含有肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养物的试剂盒，所述试剂盒中包括：IL-2；和RPMI 1640培养基，其中还含有：25±5mmol/L HEPES、100±20U/ml青霉素、100±20μlg/ml链霉素、2±0.4mmol/L谷氨酰-5
胺、(5.5±1)×10 mol/Lβ-巯基乙醇、10±2%人AB血清。
胺、(5.5±1)×10 mol/Lβ-巯基乙醇、10±2%人AB血清。
[0045] 在获得了离体的肿瘤与正常组织交界位置内外2mm范围的组织后，将该组织应用本发明的试剂盒中的试剂进行TIL的培养。较佳地，所述的试剂盒中还可包括说明TIL培养方法的使用说明书，以指导本领域技术人员以本发明的方法进行其他实体肿瘤(如胃癌、肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌等肿瘤)TIL培养，获得具有优异的抗肿瘤活性的TIL。
[0046] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0047] 实施例1、寡克隆肝癌浸润淋巴细胞的培养、TIL功能障碍与Treg的关系及Treg在肝癌肿瘤组织中的分布特征
[0048] 一、寡克隆培养法
[0049] 寡克隆培养法包括以下步骤：
[0050] 1、取新鲜肝癌肿瘤组织手术标本，去除周围正常组织和坏死组织，PBS洗涤3次。
[0051] 2、在肿瘤不同部位取直径约2mm的组织块，取材范围包括肿瘤中心组织和肿瘤交界区域(肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围)。
[0052] 3、在24孔板中加入2ml完全培养基，其中含有IL-2(6000IU/ml)。完全培养基(pH7.2)是RPMI 1640培养基，还包括：25mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、pH7.2、-5100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺、5.5×10 mol/Lβ-巯基乙醇、10%人AB血清组成。每孔中放入1个肿瘤组织小块，之后将24孔板置于增湿的37℃、5%CO2孵箱中，直到淋巴细胞明显生长。
[0054] 5、当孔中的细胞几乎汇合时，将其混合，传代分配到2个孔，每孔加入含IL-2(6000IU/ml)的2ml完全培养基。
[0055] 6、根据细胞生长情况分离培养物，使细胞密度维持在0.8～1.6×106个/孔，2次/周置换一半培养液。每个原始孔作为一个独立的TIL培养，与其它孔保持分开。因TIL细胞为悬浮生长的细胞，后续实验时，取悬浮有TIL细胞的培养基悬浮液即可。
[0056] 在诱发阶段调节性T细胞(Treg)诱导TIL发生免疫偏倚，有的则因Treg数量显著增多使TIL几无功能，使TIL的抗瘤免疫陷入困境。通过上述试验，本发明人确定，肝癌微环境中Treg分布具有特征性，即肿瘤实质内Treg密度高于癌旁区域组织，Treg在肝癌组织中大量分布于肿瘤间质，而在癌旁组织内分布稀少，且呈零散分布，如图1。
[0057] 因此，培养初期含有更低Treg比例的TIL增殖性和抗瘤活性更好。
[0058] 实施例2、常规培养法培养TIL(对照例)
[0059] 常规培养法培养TIL包括以下步骤：取新鲜肝癌肿瘤组织标本，去除周围正常组织和坏死组织，PBS洗涤，用RPMI1640培养液冲洗干净，移至无菌器皿内用手术剪将肿瘤组3
织剪碎至1-2mm 小块，置于消化酶的RPMI1640培养液40ml中，在室温下搅拌混匀，4℃过
6
夜。去除未消化的组织块，应用淋巴细胞分离液制成2×10/ml左右的细胞悬液，在梯度密度离心后，吸取75%与100%分离液面之间富含TIL的白色细胞层，用Hank氏液洗涤、离心，之后进行培养扩增。
织剪碎至1-2mm 小块，置于消化酶的RPMI1640培养液40ml中，在室温下搅拌混匀，4℃过
6
夜。去除未消化的组织块，应用淋巴细胞分离液制成2×10/ml左右的细胞悬液，在梯度密度离心后，吸取75%与100%分离液面之间富含TIL的白色细胞层，用Hank氏液洗涤、离心，之后进行培养扩增。
[0060] 实施例3、肿瘤浸润淋巴细胞的分离、培养和鉴定
[0061] 取肝癌肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围，如实施例1方法培养TIL，进行动态观察。在TIL培养过程中，TIL逐渐游走出肿瘤组织块，并在肿瘤组织块周围形成一个密集的淋巴细胞群。由图2可看出，培养第1天，在肿瘤块周围可见数个淋巴细胞游走出肿瘤组织；培养3天，可见较多淋巴细胞游走出肿瘤组织，分布于肿瘤组织周围；培养第7天，可见淋巴细胞密度进一步增加。培养第14天，淋巴细胞数量进一步增多，几乎汇合。随着培养时间的延长，培养板中的淋巴细胞数量不断增多。通过寡克隆培养方法所制得的肿瘤浸润6
淋巴细胞细胞密度维持在0.8～1.6×10 个/孔，并进行体外扩增培养。
淋巴细胞细胞密度维持在0.8～1.6×10 个/孔，并进行体外扩增培养。
[0062] 流式细胞仪检测发现，寡克隆培养方法培养出的肿瘤浸润淋巴细胞(以肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围的组织块进行培养)纯度较常规方法培养的高(图3)，并具有更强的抗瘤活性(图4)。
[0063] 实施例4、检测寡克隆TIL的抗肿瘤活性
[0064] 以肝癌肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围的组织块进行培养，随机选取30例培养2周的寡克隆肝癌TIL，检测对自体肝癌细胞的细胞毒作用。结果表明，寡克隆肝癌TIL对自体肝癌细胞有显著的杀伤作用，且同一培养时间下不同寡克隆肝癌TIL间的杀伤作用并不相同(图5)，有统计学意义(P＜0.01)。
[0065] 随机选取6个患者的肝癌组织(肝癌肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围)中各取2个寡克隆培养标本(共12个TIL寡克隆)进行序贯培养观察，分别于培养2w、3w、4w、5w时检测其TIL中Treg所占比例。2w和3w的TIL中Treg所占比例存在明显差异(P＜0.001)，3w和4w的TIL中Treg所占比例存在明显差异(P=0.001)，4w和5w的TIL中Treg所占比例的差别不具有统计学意义(P=0.148)，见图6。结果表明，在体外培养TIL过程中，不同培养时间的同一寡克隆TIL中Treg所占比例并不相同，Treg所占比例随培养时间的延长而下降。
[0066] 起源于同一肝癌组织不同部位的寡克隆培养TIL中，Treg所占比例各不相同；同一寡克隆培养的TIL细胞，随培养时间的延长而Treg所占比例逐渐下降。来源于同一肝癌组织不同部位的寡克隆培养TIL分泌IFN-γ的能力不同。IFN-γ主要由T细胞和NK细胞产生，是TIL激活后分泌的主要的免疫调节物之一，具有免疫协助作用。另一方面，IFN-γ的出现和分泌量的变化也预示着TIL的激活状态。因此，检测其分泌量及变化情况可很好地协助判断TIL的激活状态。
[0067] 本实施例中，同时检测30例培养2周的寡克隆肝癌TIL中的Treg细胞比例、以及与自体肝癌细胞共培养后IFN-γ的分泌量，观察到同一培养时间下不同寡克隆肝癌TIL分泌IFN-γ并不相同(图7-8)，有统计学意义(P＜0.01)。
[0068] 不同培养时间的同一寡克隆TIL中，Treg细胞所占比例也不相同。取不同寡克隆培养TIL进行Treg比例测定(流式细胞仪)，并且测定同一寡克隆培养TIL与肝癌细胞共培养后的IFN-γ释放情况。对Treg比例和IFN-γ浓度进行相关分析后结果为：寡克隆TIL培养中Treg细胞占淋巴细胞比例(横坐标)与肿瘤浸润淋巴细胞释放IFN-γ浓度(纵坐标)成负相关性，见图9。相关系数为-0.650，P＜0.001，有统计学意义。如图9所示，含有较高比例Treg细胞的肿瘤浸润淋巴细胞分泌IFN-γ的能力较低，抗肿瘤活性差。
[0069] 实施例5、过继免疫治疗H22肝癌荷瘤小鼠
[0070] 随机选取肿瘤平均直径约1.0cm的H22肝癌荷瘤小鼠(第二军医大学动物实验中心)18只，鼠龄6周，肿瘤直径约1.0cm，随机分为3组，每组6只。
[0071] 分别为对照组、常规TIL治疗组(以该H22荷瘤小鼠的肿瘤取材、以实施例2方法制备)、寡克隆(以该H22荷瘤小鼠的肿瘤与正常组织交界线内外2mm范围的组织块取材、以实施例1方法进行培养制备)治疗组，通过尾静脉注射分别给予PBS液、常规培养的TIL7
和寡克隆培养的TIL各0.3mL，TIL细胞数量为1×10，每7d 1次，共3次。注射后每隔3d
2
测量肿瘤长径(a)及短径(b)，依据公式肿瘤体积V=0.5×a×b 计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；同时测量各小鼠的体重，观察其体重变化。30d后处死小鼠，摘瘤并称瘤重，计算出不同TIL治疗组对肿瘤的抑制率。抑瘤率(%)=(对照组瘤重均值-实验组瘤重均值)/对照组瘤重均值×100%。
和寡克隆培养的TIL各0.3mL，TIL细胞数量为1×10，每7d 1次，共3次。注射后每隔3d
2
测量肿瘤长径(a)及短径(b)，依据公式肿瘤体积V=0.5×a×b 计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；同时测量各小鼠的体重，观察其体重变化。30d后处死小鼠，摘瘤并称瘤重，计算出不同TIL治疗组对肿瘤的抑制率。抑瘤率(%)=(对照组瘤重均值-实验组瘤重均值)/对照组瘤重均值×100%。
[0072] 1.TIL对小鼠肝癌移植瘤的抑制作用
[0073] 荷瘤小鼠在给予TIL治疗30d后，可观察到肿瘤的生长明显受到抑制，常规3
TIL治疗组与寡克隆TIL治疗组的肿瘤体积(图10-11)分别为(1.172±0.085)cm
3
和(0.891±0.061)cm，差异有统计学意义(P＜0.05)；瘤重分别为(1.31±0.22)g和(0.91±0.09)g，差异有统计学意义(P＜0.05)；均低于对照组肿瘤体积(1.714±0.040)
3
cm 和瘤重(2.43±0.17)g，差异均有统计学意义(P＜0.01)。
TIL治疗组与寡克隆TIL治疗组的肿瘤体积(图10-11)分别为(1.172±0.085)cm
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和(0.891±0.061)cm，差异有统计学意义(P＜0.05)；瘤重分别为(1.31±0.22)g和(0.91±0.09)g，差异有统计学意义(P＜0.05)；均低于对照组肿瘤体积(1.714±0.040)
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cm 和瘤重(2.43±0.17)g，差异均有统计学意义(P＜0.01)。
[0074] 寡克隆TIL治疗组抑瘤率(62.52±3.76)%明显高于常规TIL治 疗组(46.13±9.21)%，差异有统计学意义(P＜0.05)，如图12。
[0075] 2.免疫组化检测不同治疗组H22小鼠瘤内FoxP3的表达
[0076] Treg具有介导肿瘤免疫逃逸的功能，而FoxP3是Treg的特异性标记物。因此通过检测FoxP3的表达，可以反映TIL体内抗肿瘤免疫活性。免疫组化学检测结果显示，TIL治疗后30d，小鼠肿瘤组织内FoxP3阳性率及中～强阳性率均低于对照组(图13)，差异均有统计学意义(P＜0.01)；常规TIL治疗组肿瘤组织内FoxP3阳性率及中～强阳性率均高于寡克隆TIL治疗组(图13)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
[0077] 3.治疗后血清细胞因子表达水平变化
[0078] 外周血细胞因子含量检测结果(图14)显示，治疗后30d，常规TIL治疗组和寡克隆TIL治疗组外周血TGF-β含量分别为(241.44±56.01)pg/mL和(65.73±44.79)pg/mL，差异有统计学意义(P＜0.01)；IL-10含量分别为(166.52±59.20)pg/mL和(36.66±18.63)pg/mL，差异有统计学意义(P＜0.01)；均低于对照组(388.21±18.67)pg/mL和(290.74±65.90)pg/mL，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。常规TIL治疗组和寡克隆TIL治疗组外周血IFN-γ含量分别为(538.57±103.43)pg/mL和(876.32±114.52)pg/mL，差异有统计学意义(P＜0.01)；均高于对照组(106.66±12.93)pg/mL，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。表明通过TIL治疗，可有效提高小鼠免疫反应中Th1细胞分泌的IFN-γ，而抑制Th2细胞分泌IL-10、TGF-β。
[0079] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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