用于诱导对抗原的免疫应答的靶向多表位剂型
阅读：606发布：2020-06-26
专利汇可以提供用于诱导对抗原的免疫应答的靶向多表位剂型专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在此提供涉及MHC II结合肽的组合物和方法。在一些实施方案中，这些肽获得自或衍生自共同来源。在其他实施方案中，这些肽获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子。，下面是用于诱导对抗原的免疫应答的靶向多表位剂型专利的具体信息内容。
1.剂型，包括：
(i)抗原；
(ii)包含A-x-B的组合物；以及
(iii)药学上可接受的赋形剂；
其中x可以包含键、无键、或连接基团；
其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源。
2.剂型，包括：
(i)抗原；
(ii)包含A-x-B的组合物；以及
(iii)药学上可接受的赋形剂；
其中x可以包括键、无键、或连接基团；
其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且
其中该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
3.如权利要求2所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽和该第二MHC II结合肽获得自或衍生自共同来源。
4.如权利要求1至3中任一项所述的剂型，其中x包括连接物，该连接物包括酰胺连接物、二硫化物连接物、硫化物连接物、1，4-二取代的1，2，3-三唑连接物、硫酯连接物、酰肼连接物、亚胺连接物、硫脲连接物、脒连接物、或胺连接物。
5.如权利要求1至3中任一项所述的剂型，其中x包括连接物，该连接物包括肽序列、溶酶体蛋白酶切割位点、生物可降解聚合物、取代或未被取代的烷、烯、芳香族或杂环连接物、pH敏感的聚合物、异双功能的连接物或低聚乙二醇间隔物。
6.如权利要求1至3中任一项所述的剂型，其中x不包括连接物，并且A和B包括存在于该组合物中的混合物。
7.如权利要求1至6中任一项所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少80％一致性的肽。
8.如权利要求7所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少90％一致性的肽。
9.如权利要求1至8中任一项所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少80％一致性的肽。
10.如权利要求9所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少90％一致性的肽。
11.如权利要求1至10中任一项所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少80％一致性的肽。
12.如权利要求11所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少90％一致性的肽。
13.如权利要求1至12中任一项所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少80％一致性的肽。
14.如权利要求13所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少90％一致性的肽。
15.如权利要求1至14中任一项所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少80％一致性的肽。
16.如权利要求15所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少90％一致性的肽。
17.如权利要求1至16中任一项所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少80％一致性的肽。
18.如权利要求17所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少90％一致性的肽。
19.如权利要求1至18中任一项所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽具有范围从
5-mer至50-mer的长度。
20.如权利要求19所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽具有范围从5-mer至30-mer的长度。
21.如权利要求20所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽具有范围从6-mer至25-mer的长度。
22.如权利要求1至21中任一项所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽具有范围从
5-mer至50-mer的长度。
23.如权利要求22所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽具有范围从5-mer至30-mer的长度。
24.如权利要求23所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽具有范围从6-mer至25-mer的长度。
25.如权利要求1至24中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DP结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。
26.如权利要求25所述的剂型，其中该传染因子是细菌、原生动物或病毒。
27.如权利要求26所述的剂型，其中该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。
28.如权利要求1至24中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DP结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
29.如权利要求1至28中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DQ结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。
30.如权利要求29所述的剂型，其中该传染因子是细菌、原生动物或病毒。
31.如权利要求30所述的剂型，其中该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。
32.如权利要求1至28中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DQ结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
33.如权利要求1至32中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DR结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。
34.如权利要求33所述的剂型，其中该传染因子是细菌、原生动物或病毒。
35.如权利要求34所述的剂型，其中该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。
36.如权利要求1至32中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DR结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
37.如权利要求1至36中任一项所述的剂型，其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源，该共同来源包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。
38.如权利要求1至37中任一项所述的剂型，其中A和B包括具有不同的MHC II结合谱的肽。
39.如权利要求1至38中任一项所述的剂型，其中A、x、或B包括增加A-x-B的水溶性的序列或化学修饰，其中该序列或化学修饰包括亲水性N-和/或C-末端氨基酸、疏水性N-和/或C-末端氨基酸的添加、用以实现约7.4的pI并且在大约pH3.0下实现净正电荷的氨基酸置换、以及对重排易感的氨基酸的置换。
40.如权利要求1至39中任一项所述的剂型，其中该组合物包含：
A-x-B-y-C；以及
药学上可接受的赋形剂；
其中y可以包括连接物或无连接物；
其中C包括第三MHC II结合肽，并且该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A、B、以及C彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B和/或C获得自或衍生自共同来源。
41.如权利要求1至39中任一项所述的剂型，其中该组合物包含：
A-x-B-y-C；以及
药学上可接受的赋形剂；
其中y可以包括连接物或无连接物；
其中C包括第三MHC II结合肽，并且该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A、B、以及C彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B和/或C获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子。
42.如权利要求41所述的剂型，其中该抗原以及A和/或B和/或C获得自或衍生自共同来源。
43.如权利要求40至42中任一项所述的剂型，其中y包括连接物，该连接物包括酰胺连接物、二硫化物连接物、硫化物连接物、1，4-二取代的1，2，3-三唑连接物、硫酯连接物、酰肼连接物、亚胺连接物、硫脲连接物、脒连接物、或胺连接物。
44.如权利要求40至42中任一项所述的剂型，其中y包括连接物，该连接物包括肽序列、溶酶体蛋白酶切割位点、生物可降解聚合物、取代或未被取代的烷、烯、芳香族或杂环连接物、pH敏感的聚合物、异双功能的连接物或低聚乙二醇间隔物。
45.如权利要求40至42中任一项所述的剂型，其中y不包括连接物，并且A-x-B和C包括存在于该组合物中的混合物。
46.如权利要求40至45中任一项所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少80％一致性的肽。
47.如权利要求46所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少90％一致性的肽。
48.如权利要求40至47中任一项所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少80％一致性的肽。
49.如权利要求48所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少90％一致性的肽。
50.如权利要求40至49中任一项所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少80％一致性的肽。
51.如权利要求50所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少90％一致性的肽。
52.如权利要求40至51中任一项所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽具有范围从
5-mer至50-mer的长度。
53.如权利要求52所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽具有范围从5-mer至30-mer的长度。
54.如权利要求53所述的剂型，其中该第三MHC II结合肽具有范围从6-mer至25-mer的长度。
55.如权利要求40至54中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DP结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。
56.如权利要求55所述的剂型，其中该传染因子是细菌、原生动物或病毒。
57.如权利要求56所述的剂型，其中该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。
58.如权利要求40至54中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DP结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
59.如权利要求40至58中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DQ结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。
60.如权利要求59所述的剂型，其中该传染因子是细菌、原生动物或病毒。
61.如权利要求60所述的剂型，其中该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。
62.如权利要求40至58中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DQ结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
63.如权利要求40至62中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DR结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。
64.如权利要求63所述的剂型，其中该传染因子是细菌、原生动物或病毒。
65.如权利要求64所述的剂型，其中该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。
66.如权利要求40至62中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DR结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
67.如权利要求40至66中任一项所述的剂型，其中获得自或衍生自共同来源的该抗原以及A和/或B和/或C包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B和/或C：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。
68.如权利要求40至67中任一项所述的剂型，其中A、B以及C各自包括具有不同的MHC II结合谱的肽。
69.如权利要求40至68中任一项所述的剂型，其中A、x、B、y、或C包括增加A-x-B-y-C的水溶性的序列或化学修饰，其中该序列或化学修饰包括亲水性N-和/或C-末端氨基酸、疏水性N-和/或C-末端氨基酸的添加、用以实现大约7.4的pI并且在大约pH3.0实现净正电荷的氨基酸置换、以及对重排易感的氨基酸的置换。
70.剂型，包括：
(i)抗原；
(ii)包含A-x-B的组合物；以及
(iii)药学上可接受的赋形剂；
其中x包括连接物或无连接物；
其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽；
其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源，和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
71.剂型，包括：
(i)抗原；
(ii)包含A-x-B的组合物；以及
(iii)药学上可接受的赋形剂；
其中x包括连接物或无连接物；
其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源，和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
72.剂型，包括：
(i)抗原；
(ii)包含A-x-B的组合物；以及
(iii)药学上可接受的赋形剂；
其中x包括连接物或无连接物；
其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽；
其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源，和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
73.剂型，包括：
(i)抗原；
(ii)包含A-x-B的组合物；以及
(iii)药学上可接受的赋形剂；
其中x包括连接物，该连接物包括酰胺连接物、二硫化物连接物、硫化物连接物、1，
4-二取代的1，2，3-三唑连接物、硫酯连接物、酰肼连接物、亚胺连接物、硫脲连接物、脒连接物、或胺连接物；
其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源，和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
74.剂型，包括：
(i)抗原；
(ii)包含A-x-B的组合物；以及
(iii)药学上可接受的赋形剂；
其中x包括连接物，该连接物包括肽序列、溶酶体蛋白酶切割位点、生物可降解聚合物、取代或未被取代的烷、烯、芳香族或杂环连接物、pH敏感的聚合物、异双功能的连接物或低聚乙二醇间隔物；
其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽，
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且
其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源，和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
75.如权利要求70至74中任一项所述的剂型，其中该连接物是如在权利要求4至6中所定义的。
76.如权利要求70至75中任一项所述的剂型，其中该第一MHC II结合肽是如在权利要求7至12以及19至21的任一项中所定义的。
77.如权利要求70至76中任一项所述的剂型，其中该第二MHC II结合肽是如在权利要求13至18以及22至24的任一项中所定义的。
78.如权利要求70至77中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DP结合肽是如在权利要求25至28的任一项中所定义的。
79.如权利要求70至78中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DQ结合肽是如在权利要求29至32的任一项中所定义的。
80.如权利要求70至79中任一项所述的剂型，其中该天然HLA-DR结合肽是如在权利要求33至36的任一项中所定义的。
81.如权利要求70至80中任一项所述的剂型，其中该抗原以及A和/或B是如在权利要求37或38中所定义的。
82.如权利要求70至81中任一项所述的剂型，其中A、x、或B是如在权利要求39中所定义的。
83.剂型，包括：
如权利要求1至82中任一项所述的剂型，其中该组合物被偶联至合成纳米载体上。
84.如权利要求83所述的剂型，其中该抗原被偶联至这些合成纳米载体上。
85.如权利要求83或84所述的剂型，其中该组合物的至少一部分存在于该合成纳米载体的表面上。
86.如权利要求83至85中任一项所述的剂型，其中该组合物的至少一部分被该合成纳米载体封装。
87.如权利要求83至86中任一项所述的剂型，其中获得自或衍生自共同来源的该抗原以及A和/或B和/或C包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B和/或C：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。
88.剂型，包括：
如权利要求83所述的剂型，其中该抗原被偶联至这些合成纳米载体上。
89.如权利要求88所述的剂型，其中该组合物被偶联至这些纳米载体上。
90.如权利要求88或89所述的剂型，其中该抗原的至少一部分存在于这些纳米载体的表面上。
91.如权利要求88至90中任一项所述的剂型，其中该抗原的至少一部分被这些合成纳米载体封装。
92.剂型，包括：
包含如权利要求1至91中任一项所述的剂型的疫苗。
93.如权利要求92所述的剂型，进一步包括药学上可接受的赋形剂。
94.如权利要求92或93所述的剂型，进一步包括佐剂。
95.如权利要求92至94中任一项所述的剂型，其中该疫苗包括合成纳米载体。
96.如权利要求92至95中任一项所述的剂型，其中该疫苗包括共轭到该组合物上的载体。
97.如权利要求92至96中任一项所述的剂型，其中获得自或衍生自共同来源的该抗原以及A和/或B和/或C包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B和/或C：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。
98.包括多肽、或编码这些多肽的核酸、以及抗原的剂型；
其中这些抗原、以及这些多肽的至少一部分获得自或衍生自共同来源；并且
这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一至少75％一致性的氨基酸序列。
99.包括多肽、或编码这些多肽的核酸的剂型或组合物；
其中这些多肽获得自或衍生自共同来源；并且
这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一至少75％一致性的氨基酸序列。
100.包括多肽、或编码这些多肽的核酸的剂型或组合物；
其中这些多肽获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子；并且
这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：100-115以及119的氨基酸序列的任何之一至少75％一致性的氨基酸序列。
101.如权利要求100所述的剂型，其中这些多肽获得自或衍生自共同来源。
102.包括多肽、或编码这些多肽的核酸的剂型或组合物，其中这些多肽包括提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列。
103.如权利要求98至102中任一项所述的剂型或组合物，其中这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一至少85％一致性的氨基酸序列。
104.如权利要求103所述的剂型或组合物，其中这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一至少95％一致性的氨基酸序列。
105.如权利要求104所述的剂型或组合物，其中这些多肽的序列包括提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一的氨基酸序列。
106.剂型，包括：
如权利要求98至105中任一项所述的剂型或组合物，其中这些多肽被偶联至合成纳米载体上。
107.如权利要求106所述的剂型，进一步包括药学上可接受的赋形剂。
108.如权利要求106或107所述的剂型，其中这些多肽的至少一部分存在于这些合成纳米载体的表面上。
109.如权利要求106至108中任一项所述的剂型，其中这些多肽的至少一部分被这些合成纳米载体封装。
110.剂型，包括：
包含如权利要求98至109中任一项所述的剂型或组合物的疫苗。
111.如权利要求110所述的剂型，进一步包括药学上可接受的赋形剂。
112.如权利要求110或111所述的剂型，进一步包括一种或多种佐剂。
113.如权利要求110至112中任一项所述的剂型，其中该疫苗包括合成纳米载体。
114.如权利要求113所述的剂型，其中这些合成纳米载体被偶联至这些抗原上。
115.如权利要求110至114中任一项所述的剂型，其中该疫苗包括共轭到这些多肽上的载体。
116.方法，包括：
对受试者给予如权利要求1至115中任一项所述的剂型或组合物。
117.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于治疗或预防。
118.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于如在权利要求116中所定义的方法。
119.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于疫苗接种。
120.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于诱导、增强、抑制、指导、或重定向免疫应答的方法。
121.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于在预防和/或治疗选自以下各项的病状的方法中使用，即：癌症、传染病、代谢病、退行性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病以及免疫疾病。
122.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于在预防和/或治疗成瘾，例如对尼古丁或麻醉剂的成瘾的方法中使用。
123.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于在预防和/或治疗由于暴露于毒素、有害物质、环境毒素、或其他有害因子而导致的病状的方法中使用。
124.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于在诱导或增强T细胞增殖或细胞因子产生的方法中使用。
125.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于在包括与共轭物、或非共轭物、疫苗一起给予的预防和/或治疗方法中使用。
126.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于在预防和/或治疗正在经受用共轭物、或非共轭物、疫苗进行的治疗的受试者的方法中使用。
127.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物，用于在这样的治疗或预防方法中使用，该方法包括通过静脉内、肠胃外(例如皮下、肌内、静脉内、或皮内)、肺、舌下、口腔、鼻内、经鼻、粘膜内、经粘膜、直肠、眼、经皮、经真皮途经、或通过这些途经的组合进行给予。
128.如权利要求1至115中任一项所定义的剂型或组合物的用途，用于制造用于如在权利要求116至127的任一项中所定义的方法中使用的药物，例如疫苗。
用于诱导对抗原的免疫应答的靶向多表位剂型
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求在2010年8月23日提交的美国临时申请61/375,996在35U.S.C.§119下的权益，其全部内容通过引用结合在此。
[0003] 发明背景
[0004] 疫苗是治疗疾病的有力方式，但是大量靶标给出较差的应答。通过T细胞辅助的伴随提供，某些疫苗的活性可以增强。通过可以与MHC II形成复合体的某些肽抗原的提呈，可以诱导T细胞辅助。需要的是通过提供抗原和改进的T细胞辅助可产生改进的免疫应答的剂型，以及相关方法。
[0005] 发明概述
[0006] 在一方面，提供了包括抗原；包含A-x-B的组合物；以及药学上可接受的赋形剂的剂型；其中x可包括键、无键、或连接基团；其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源。
[0007] 在另一方面，提供了包括抗原；包含A-x-B的组合物；以及药学上可接受的赋形剂的剂型；其中x可包括键、无键、或连接基团；其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
[0008] 在一个实施方案中，该第一MHC II结合肽和该第二MHC II结合肽获得自或衍生自共同来源。
[0009] 在另一个实施方案中，x包括连接物，该连接物包括酰胺连接物、二硫化物连接物、硫化物连接物、1，4-二取代的1，2，3-三唑连接物、硫酯连接物、酰肼连接物、亚胺连接物、硫脲连接物、脒连接物、或胺连接物。在又一个实施方案中，x包括连接物，该连接物包括肽序列、溶酶体蛋白酶切割位点、生物可降解聚合物、取代或未被取代的烷、烯、芳香族或杂环连接物、pH敏感的聚合物、异双功能的连接物或低聚乙二醇间隔物。在再另一个实施方案中，x不包括连接物，并且A和B包括存在于该组合物中的混合物。
[0010] 在一个另外的实施方案中，该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少80％一致性的肽。在又另一个实施方案中，该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少90％一致性的肽。在另一个实施方案中，其中该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少80％一致性的肽。在又一个实施方案中，该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少90％一致性的肽。在一个另外的实施方案中，该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少80％一致性的肽。在又另一个实施方案中，该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少90％一致性的肽。在又一个另外的实施方案中，该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少80％一致性的肽。在另一个实施方案中，该第二MHCII结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少90％一致性的肽。在又一个实施方案中，该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少80％一致性的肽。在再另一个实施方案中，该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少90％一致性的肽。在另一个实施方案中，该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少80％一致性的肽。在又一个实施方案中，该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少90％一致性的肽。
[0011] 在一个实施方案中，该第一MHC II结合肽具有范围从5-mer至50-mer的长度。在另一个实施方案中，该第一MHC II结合肽具有范围从5-mer至30-mer的长度。在又一个实施方案中，该第一MHC II结合肽具有范围从6-mer至25-mer的长度。在一个另外的实施方案中，其中该第二MHC II结合肽具有范围从5-mer至50-mer的长度。在又一个另外的实施方案中，该第二MHC II结合肽具有范围从5-mer至30-mer的长度。在又另一个实施方案中，该第二MHC II结合肽具有范围从6-mer至25-mer的长度。
[0012] 在另一个实施方案中，该天然HLA-DP结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。在一个实施方案中，该传染因子是细菌、原生动物或病毒。在另一个实施方案中，该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。在又一个实施方案中，该传染因子是在本文其他地方，如在表1中提供的因子。
[0013] 在一个实施方案中，该天然HLA-DP结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
[0014] 在另一个实施方案中，该天然HLA-DQ结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。在一个实施方案中，该传染因子是细菌、原生动物或病毒。在又一个实施方案中，该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。在又一个实施方案中，该传染因子是在本文其他地方，如在表1中提供的因子。
[0015] 在一个另外的实施方案中，该天然HLA-DQ结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
[0016] 在又一个另外的实施方案中，该天然HLA-DR结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。在一个实施方案中，该传染因子是细菌、原生动物或病毒。在另一个实施方案中，该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLVIII、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。在又一个实施方案中，该传染因子是在本文其他地方，如在表1中提供的因子。
[0017] 在又另一个实施方案中，该天然HLA-DR结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
[0018] 在另一个实施方案中，该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源，该共同来源包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。在又一个实施方案中，A和B包括具有不同的MHC II结合谱(binding repertoire)的肽。在再另一个实施方案中，A、x、或B包括增加A-x-B的水溶性的序列或化学修饰，其中该序列或化学修饰包括亲水性N-和/或C-末端氨基酸、疏水性N-和/或C-末端氨基酸的添加、用以实现约7.4的pI并且在大约pH3.0下实现净正电荷的氨基酸置换、以及对重排易感的氨基酸的置换。
[0019] 在另一方面，该组合物包含A-x-B-y-C；以及药学上可接受的赋形剂；其中y可包括连接物或无连接物；其中C包括第三MHC II结合肽，并且该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中A、B、以及C彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B和/或C获得自或衍生自共同来源。
[0020] 在又一方面，该组合物包含A-x-B-y-C；以及药学上可接受的赋形剂；其中y可包括连接物或无连接物；其中C包括第三MHC II结合肽，并且该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中A、B、以及C彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B和/或C获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子。
[0021] 在一个实施方案中，该抗原以及A和/或B和/或C获得自或衍生自共同来源。
[0022] 在另一个实施方案中，y包括连接物，该连接物包括酰胺连接物、二硫化物连接物、硫化物连接物、1，4-二取代的1，2，3-三唑连接物、硫酯连接物、酰肼连接物、亚胺连接物、硫脲连接物、脒连接物、或胺连接物。在又一个实施方案中，y包括连接物，该连接物包括肽序列、溶酶体蛋白酶切割位点、生物可降解聚合物、取代或未被取代的烷、烯、芳香族或杂环连接物、pH敏感的聚合物、异双功能的连接物或低聚乙二醇间隔物。在又一个实施方案中，y不包括连接物，并且A-x-B和C包括存在于该组合物中的混合物。
[0023] 在一个实施方案中，该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少80％一致性的肽。在另一个实施方案中，该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少90％一致性的肽。在又一个实施方案中，该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少80％一致性的肽。在再另一个实施方案中，该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少90％一致性的肽。在一个另外的实施方案中，该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少80％一致性的肽。在又一个另外的实施方案中，该第三MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少90％一致性的肽。
[0024] 在又另一个实施方案中，该第三MHC II结合肽具有范围从5-mer至50-mer的长度。在另一个实施方案中，该第三MHC II结合肽具有范围从5-mer至30-mer的长度。在又一个实施方案中，该第三MHC II结合肽具有范围从6-mer至25-mer的长度。
[0025] 在又一个实施方案中，该天然HLA-DP结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。在一个实施方案中，该传染因子是细菌、原生动物或病毒。在另一个实施方案中，该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。在又一个实施方案中，该传染因子是在本文其他地方，如在表1中提供的因子。
[0026] 在另一个实施方案中，该天然HLA-DP结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
[0027] 在又一个实施方案中，该天然HLA-DQ结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。在一个实施方案中，该传染因子是细菌、原生动物或病毒。在另一个实施方案中，该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。在又一个实施方案中，该传染因子是在本文其他地方，如在表1中提供的因子。
[0028] 在再另一个实施方案中，该天然HLA-DQ结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
[0029] 在一个另外的实施方案中，该天然HLA-DR结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。在一个实施方案中，该传染因子是细菌、原生动物或病毒。在另一个实施方案中，该病毒是诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLVIII、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒或柯萨奇病毒。在又一个实施方案中，该传染因子是在本文其他地方，如在表1中提供的因子。
[0030] 在再另一个实施方案中，该天然HLA-DR结合肽包括肽序列，该肽序列获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒、或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。
[0031] 在一个实施方案中，获得自或衍生自共同来源的该抗原以及A和/或B和/或C包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B和/或C：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。在又一个实施方案中，A、B以及C各自包括具有不同的MHC II结合谱的肽。在又一个实施方案中，A、x、B、y、或C包括增加A-x-B-y-C的水溶性的序列或化学修饰，其中该序列或化学修饰包括亲水性N-和/或C-末端氨基酸、疏水性N-和/或C-末端氨基酸的添加、用以实现大约7.4的pI并且在大约pH3.0实现净正电荷的氨基酸置换、以及对重排易感的氨基酸的置换。
[0032] 在另一方面，提供了包括抗原；包含A-x-B的组合物；以及药学上可接受的赋形剂的剂型；其中x包括连接物或无连接物；其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽；其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
[0033] 在又另一方面，提供了包括抗原；包含A-x-B的组合物；以及药学上可接受的赋形剂的剂型；其中x包括连接物或无连接物；其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
[0034] 在再另一方面，提供了包括抗原；包含A-x-B的组合物；以及药学上可接受的赋形剂的剂型；其中x包括连接物或无连接物；其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽；其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
[0035] 在另一方面，提供了包括抗原；包含A-x-B的组合物；以及药学上可接受的赋形剂的剂型；其中x包括连接物，该连接物包括酰胺连接物、二硫化物连接物、硫化物连接物、1，4-二取代1，2，3-三唑连接物、硫酯连接物、酰肼连接物、亚胺连接物、硫脲连接物、脒连接物、或胺连接物；其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
[0036] 在又一方面，提供了包括抗原；包含A-x-B的组合物；以及药学上可接受的赋形剂的剂型；其中x包括连接物，该连接物包括肽序列、溶酶体蛋白酶切割位点、生物可降解聚合物、取代或未被取代的烷、烯、芳香族或杂环连接物、pH敏感的聚合物、异双功能的连接物或低聚乙二醇间隔物；其中A包括第一MHC II结合肽，并且该第一MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽；其中B包括第二MHC II结合肽，并且该第二MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽至少70％一致性的肽、具有与天然HLA-DQ结合肽至少70％一致性的肽、或者具有与天然HLA-DR结合肽至少70％一致性的肽，其中A和B彼此不具有100％一致性；并且其中该抗原以及A和/或B获得自或衍生自共同来源和/或该第一MHC II结合肽和/或该第二MHC II结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽。
[0037] 在所提供的任何剂型的一个实施方案中，该连接物是在此提供的任何连接物。
[0038] 在所提供的任何剂型的另一个实施方案中，该第一MHC II结合肽包括在此提供的任何MHC II结合肽(包括图中提供的任何肽)。
[0039] 在所提供的任何剂型的又一个实施方案中，该第二MHC II结合肽包括在此提供的任何MHC II结合肽(包括图中提供的任何肽)。
[0040] 在所提供的任何剂型的再另一个实施方案中，该天然HLA-DP结合肽包括在此提供的任何天然HLA-DP结合肽(包括图中提供的任何肽)。
[0041] 在所提供的任何剂型的另一个实施方案中，该天然HLA-DQ结合肽包括在此提供的任何天然HLA-DQ结合肽(包括图中提供的任何肽)。
[0042] 在所提供的任何剂型的一个另外的实施方案中，该天然HLA-DR结合肽包括在此提供的任何天然HLA-DR结合肽(包括图中提供的任何肽)。
[0043] 在所提供的任何剂型的一个实施方案中，该抗原以及A和/或B如在此任何地方所定义。在所提供的任何剂型的另一个实施方案中，A、x、或B如在此任何地方所定义。
[0044] 在所提供的任何剂型的一个实施方案中，该组合物被偶联到合成纳米载体上。在所提供的任何剂型的另一个实施方案中，该抗原被偶联到这些合成纳米载体上。在所提供的任何剂型的再另一个实施方案中，该组合物的至少一部分存在于该合成纳米载体的表面上。在所提供的任何剂型的另一个实施方案中，该组合物的至少一部分被该合成纳米载体封装。
[0045] 在所提供的任何剂型的一个实施方案中，获得自或衍生自共同来源的该抗原以及A和/或B和/或C包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B和/或C：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。
[0046] 在所提供的任何剂型的另一个实施方案中，该抗原被偶联到这些合成纳米载体上。在所提供的任何剂型的再另一个实施方案中，该组合物被偶联到这些纳米载体上。在所提供的任何剂型的又一个实施方案中，该抗原的至少一部分存在于这些纳米载体的表面上。在所提供的任何剂型的一个另外的实施方案中，该抗原的至少一部分被这些合成纳米载体封装。
[0047] 在另一方面，提供了包含所提供的任何剂型的疫苗。在一个实施方案中，该剂型进一步包括药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，该剂型进一步包括佐剂。
[0048] 在一个另外的实施方案中，该疫苗包含合成纳米载体。在另一个实施方案中，该疫苗包含共轭到该组合物上的载体。
[0049] 在另一个实施方案中，获得自或衍生自共同来源的该抗原以及A和/或B和/或C包括获得自或衍生自以下项的抗原以及A和/或B和/或C：生物的相同菌株、种、和/或属；相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型；或相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。
[0050] 在一个方面，提供了包含多肽、或编码这些多肽的核酸、以及抗原的剂型；其中这些抗原和这些多肽的至少一部分获得自或衍生自共同来源；并且这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一或与图中提出的任何序列至少75％一致性的氨基酸序列。
[0051] 在另一方面，提供了包含多肽、或编码这些多肽的核酸的剂型或组合物；其中这些多肽获得自或衍生自共同来源；并且这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一或与图中提出的任何序列至少75％一致性的氨基酸序列。在又一方面，提供了包含多肽、或编码这些多肽的核酸的剂型或组合物；
其中这些多肽获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子；并且这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：100-115以及119的氨基酸序列的任何之一或与图中提出的任何序列至少75％一致性的氨基酸序列。
其中这些多肽获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子；并且这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：100-115以及119的氨基酸序列的任何之一或与图中提出的任何序列至少75％一致性的氨基酸序列。
[0052] 在一个实施方案中，这些多肽获得自或衍生自共同来源。
[0053] 在另一个实施方案中，这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一或与图中提出的任何序列至少85％一致性的氨基酸序列。在又一个实施方案中，这些多肽的序列包括具有与提出为SEQ ID号：
1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一或与图中提出的任何序列至少
95％一致性的氨基酸序列。在再另一个实施方案中，这些多肽的序列包括被提出为SEQID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一的氨基酸序列或图中提出的任何序列。
1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一或与图中提出的任何序列至少
95％一致性的氨基酸序列。在再另一个实施方案中，这些多肽的序列包括被提出为SEQID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一的氨基酸序列或图中提出的任何序列。
[0054] 在又一方面，提供了包含多肽、或编码这些多肽的核酸的剂型或组合物；其中这些多肽包括被提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的任何之一的氨基酸序列或图中提出的任何序列。
[0055] 在另一方面，提供了包含在此提供的任何多肽(包括在图中提供的那些多肽)、或编码这些多肽的核酸的剂型或组合物。
[0056] 在另一方面，提供了包括所提供的任何剂型或组合物的剂型，其中这些多肽被偶联到合成纳米载体上。在一个实施方案中，该剂型包括药学上可接受的赋形剂。
[0057] 在所提供的任何剂型的另一个实施方案中，这些多肽的至少一部分存在于这些合成纳米载体的表面上。在所提供的任何剂型的又一个实施方案中，这些多肽的至少一部分被这些合成纳米载体封装。
[0058] 在另一方面，提供了包括含有所提供的任何剂型或组合物的疫苗的剂型。在一个实施方案中，该剂型包括药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，该剂型包括一种或多种佐剂。
[0059] 在又一个实施方案中，该疫苗包含合成纳米载体。在一个实施方案中，这些合成纳米载体被偶联到这些抗原上。在再另一个实施方案中，该疫苗包含共轭到这些多肽上的载体。
[0060] 在又另一方面，所提供的任何剂型或组合物的第一MHC II结合肽和/或第二MHC II结合肽可包括在此提供的任何多肽(包括图中提供的那些)。
[0061] 在另一方面，提供了包括对受试者给予所提供的任何剂型或组合物的方法。
[0062] 在又一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于治疗或预防。
[0063] 在再另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于所提供的任何方法。
[0064] 在另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于疫苗接种。
[0065] 在再另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于诱导、增强、抑制、指导、或重定向免疫应答的方法。
[0066] 在又一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于预防和/或治疗选自以下各项的多种病状的方法，即：癌症、传染病、代谢病、退行性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病以及免疫疾病。
[0067] 在另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于预防和/或治疗成瘾，例如对尼古丁或麻醉剂的成瘾的方法。
[0068] 在又另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于预防和/或治疗由于暴露于毒素、有害物质、环境毒素、或其他有害因子而导致的病状的方法。
[0069] 在再另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于诱导或增强T细胞增殖或细胞因子产生的方法。
[0070] 在另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于包括与共轭物、或非共轭物、疫苗一起给予的预防和/或治疗方法。
[0071] 在另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于预防和/或治疗正在经受用共轭物、或非共轭物、疫苗进行的治疗的受试者的方法。
[0072] 在又一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于这样的治疗或预防方法，该方法包括通过静脉内、肠胃外(例如皮下、肌内、静脉内、或皮内)、肺、舌下、口腔、鼻内、经鼻、粘膜内、经粘膜、直肠、眼、经皮、经真皮途经、或通过这些途经的组合进行给药。
[0073] 在另一方面，所提供的任何剂型或组合物可以用于制造用于所提供的任何方法的药物，例如疫苗。
[0075] 图1显示了针对HLA-DR人群覆盖度预测的单一的和嵌合的表位实例-欧洲。使用免疫表位数据库＊(IEDB)T细胞表位预测程序进行嵌合表位选择。对于每种肽，通过比较这些肽的得分与选自SWISSPROT数据库的五百万随机15mers的得分，产生使用三种方法(ARB、SMM_align以及Sturniolo)中的每一种的百分等级。然后这三种方法的百分等级被用来产生一致法的等级。小编号的百分等级表明高亲和力。预测的高亲和力结合(＜3最高百分位数)为粗体。对于欧洲人群(保加利亚人、克罗埃西亚人、古巴人(Eu)、捷克人、芬兰人、格鲁吉亚人、爱尔兰人、北美(Eu)、斯洛文尼亚人)，给出了等位基因分布。
[0076] 图2显示了针对HLA-DR人群覆盖度预测的单一的和嵌合的表位实例-欧洲。
[0077] 图3提供了不损失对II类的预测结合亲和力的氨基酸置换。
[0078] 图4显示了流式细胞术数据的代表性实例，这些数据显示在肽刺激的CD4+/CD45RA低/CD62L高中心记忆T细胞中的IFN-γ表达。
[0079] 图5显示了标准化为无刺激的CD4+/CD45RA中/CD62L高/IFN-γ+T细胞的中心记忆T细胞的百分数。II类肽嵌合体给出强健的CD4记忆T细胞回忆应答。以4μM的最终浓度添加肽。阴性和阳性PBMC对照分别是不进行刺激的，或分别用5种肽(5PP)的池进行刺激。在流式细胞分析之前，用CD4-FITC、CD45RA-PE、以及CD62LCy7PE将细胞染色。然后将细胞渗透、固定并用IFN-γ染色。中心记忆T细胞是CD4+/CD45RA中/CD62L高/IFN-γ+。这些显示的值是在CD4+/CD62L设门中发现的CD62L+/IFN-γ+细胞的百分数。通过减去针对每一供者的无刺激对照的值将这些值标准化。
[0080] 图6显示(20个)供者中，响应于肽呈记忆T细胞阳性的数量。如果在CD4+CD45RA低细胞群中，响应中心T细胞的值大于0.08％，那么供者被认为是阳性的。
[0081] 图7显示了流式细胞术数据的代表性实例，这些数据显示在肽特异性CD4+/CD45RA低/CD62L高中心记忆T细胞中的TNF-α和IFN-γ表达。II类肽嵌合体给出强健的树突细胞/CD4中心记忆T细胞回忆应答。通过磁珠阴性选择从PBMC中分离单核细胞，并且在IL-4和GM-CSF中生长一周来诱导树突细胞(DC)分化。从低温保存的PBMC中分离自体CD4+细胞，并且在肽存在或不存在下，与DC一起培养。检测到在中心记忆T细胞中的TNF-α和IFN-γ表达。未成熟的中心记忆T细胞表达IFN-γ/TNF-α和IL-2，定型效应记忆t细胞仅表达IL-4或IFN-γ。
[0082] 图8显示了在肽特异性CD4+/CD45RA低/CD62L高中心记忆T细胞中的IL-4、TNF-α、或IFN-γ表达的百分数。在肽存在或不存在下，在树突细胞/自体CD4T细胞共培养物中的细胞因子表达。显示通过流式细胞术收集的每75000个事件中，细胞因子阳性记忆T细胞的数量(标准化为无刺激的)。
[0083] 图9显示了在肽特异性CD4+/CD45RA低/CD62L高中心记忆T细胞中的TNF-α加上IFN-γ或TNF-α加上IL-4共表达的百分数。在肽存在或不存在下，在树突细胞/自体CD4T细胞共培养物中的细胞因子共表达。
[0084] 图10显示在CD4+/CD45RA低中的CD62L+/IFN-γ+中心记忆T细胞的百分数(4个供者)。II类肽嵌合体给出强健的CD4记忆T细胞回忆应答。中心记忆T细胞是CD4+/CD45RA低/CD62L+/IFN-γ+。这些显示的值是在CD4+/CD62L设门中发现的CD62L+/IFN-γ+细胞的百分数。
[0085] 图11显示了多种TT830pDTt变体。
[0086] 图12显示了在腺病毒AdVkDTt变体中的CD4+/CD45RA低/CD62L高中心记忆T细胞的百分数(16个供者)。修饰的AdVkDTt肽嵌合体给出强健的CD4记忆T细胞回忆应答。中心记忆T细胞是CD4+/CD45RA低/CD62L+/IFN-γ+。这些显示的值是在CD4+/CD62L设门中发现的CD62L+/IFN-γ+细胞的百分数。
[0087] 图13显示了针对流行性感冒病毒的嵌合表位，它们被选择用于高度保守的泛HLA-DR谱。
[0088] 图14显示了在嵌合的保守流行性感冒病毒表位中的CD4+/CD45RA低/CD62L高中心记忆T细胞的百分数(5个供者)。修饰的高度保守的流行性感冒病毒肽嵌合体给出强健的CD4记忆T细胞回忆应答。中心记忆T细胞是CD4+/CD45RA低/CD62L+/IFN-γ+。这些显示的值是在CD4+/CD62L设门中发现的CD62L+/IFN-γ+细胞的百分数。
[0089] 图15提供了来自针对流行性感冒病毒A的单独的II类表位的预测结合分析的实例的结果。
[0090] 图16提供了来自针对流行性感冒病毒A的嵌合表位的预测结合分析的实例的结果。
[0091] 图17显示了针对流行性感冒病毒A+B的保守的泛II类PB1(pan-Class II PB1)嵌合肽。
[0092] 图18显示了使用发明的组合物和合成纳米载体产生的抗尼古丁效价。
[0093] 图19显示了使用发明的组合物和合成纳米载体产生的抗尼古丁效价。
[0094] 图20显示了使用具有腺病毒表位的嵌合肽的CD4+/CD45RA低/CD62L高中心记忆T细胞的百分数(16个供者)。II类肽嵌合体给出强健的CD4记忆T细胞回忆应答。中心记忆T细胞是CD4+/CD45RA低/CD62L+/IFN-γ+。这些显示的值是在CD4+/CD62L设门中发现的CD62L+/IFN-γ+细胞的百分数。
[0095] 图21显示了来自针对MHC II类结合的RSV表位的IEDB分析的结果。
[0096] 图22提供了来自使用针对RSV嵌合表位的酶联免疫斑点法(Elispot)的记忆T细胞量化的结果。5个不同的供者的每1X107个细胞的斑点，标准化为无刺激对照。
[0097] 发明详细说明
[0098] 在详细说明本发明之前，应当理解本发明并不局限于具体举例说明的材料或工艺参数，因为这些当然可以变化。还应当理解在此使用的术语只是为了说明本发明的具体实施方案的目的，并不旨在限制使用可替代的术语来说明本发明。
[0100] 如在本说明书和随附的权利要求中所使用的那样，单数形式“一个(种)(a，an)”包括复数指代物，除非内容另外明确表明。例如，提及的“聚合物”包括两种或更多种这类分子的混合物或单个聚合物种类的不同分子量的混合物；提及的“合成纳米载体”包括两种或更多种这类合成载体的混合物或多个这类合成纳米载体；提及的“DNA分子”包括两种或更多种这类DNA分子的混合物或多个这类DNA分子；提及的“佐剂”包括两种或更多种这类物质的混合物或多个佐剂分子；诸如此类。
[0101] 如在此所使用，术语“包括(comprise)”或其变化，如“包括有(comprises)”或“包括着(comprising)”意在表明包括任何列举的整体(例如，特点、元件、特征、特性、方法/工艺步骤或限制)或整体的组(例如，多个特点、多个元件、多个特征、多个特性、多个方法/工艺步骤或多个限制)但是不排除任何其他整体或整体的组。因此，如在此所使用，术语“包括着”是包含性的但是不排除另外的、未列举的整体或方法/工艺步骤。
[0102] 在此处提供的任何组合物和方法的多个实施方案中，“包括着”可用“基本上由......组成(consisting essentially of)”或“由......组成(consisting of)”来替换。短语“基本上由......组成”在此用以要求限定的一个或多个整体或步骤，以及不实质上影响所要求的发明的特征或功能的那些。如在此所使用，术语“组成(consisting)”用以表明仅存在所列举的整体(例如，特点、元件、特征、特性、方法/工艺步骤或限制)或整体的组(例如，多个特点、多个元件、多个特征、多个特性、多个方法/工艺步骤或多个限制)。
[0103] 在下文将更详细地说明本发明。
[0104] A.前言
[0105] 本发明的诸位发明人已经意外地并且令人惊讶地发现，通过实践在此披露的本发明，可以克服以上提到的问题和限制。具体而言，本发明的诸位发明人意外地发现，有可能提供解决本领域的问题和限制的发明组合物、以及有关方法。
[0106] 通过在疫苗中包含II类结合记忆表位，可以有益地增强对疫苗的免疫应答，以给出更强的抗体应答。然而，II类由三个不同的基因集(HLA-DR、DP以及DQ)构成，每个集具有不同的表位结合亲和力。此外，这些基因中的每一个具有可以在人群中发现的若干等位基因，它们产生具有可变表位结合力的蛋白质，这样使得单独的T细胞表位是II类等位基因限制性的。因此表位的II类限制性引起的一个问题在于该表位具有有限的人群覆盖度。为了得到宽的人群覆盖度，必须将肽设计成混杂的并且对DP、DQ、以及DR是非选择性的。通过将肽设计成特异性针对人群中大多数已经暴露于其并且具有跨HLA II类等位基因的宽泛的活性的抗原，可以克服此问题。具有宽泛的、但是有限的活性的单独的表位包括例如针对普通疫苗的表位，如破伤风毒素(TT)和白喉毒素(DT)。此外，针对人群中大多数已经暴露于其并且对其具有活性抗体效价的天然发生的病毒或其他传染因子(如腺病毒(AdV))的表位可能具有宽的人群覆盖度。理想地，设计的肽将具有对于显性DP4等位基因(DPA1＊01/DPB1＊401和DPA1＊0103/DPB1＊0402)的高亲和力表位和/或对于在人群中具有宽泛反应性的HLA-DR或HLA-DQ等位基因的高亲和力表位。为了鉴定宽覆盖度的II类肽，在预测的HLA II类亲和力的基础上设计并且测试嵌合表位。如实例中所示，基于预测的HLA II类亲和力而设计的发明肽给出了在人类中跨多个HLA II类DP、DQ、以及DR等位基因的宽的覆盖度，并且给出了强的记忆T细胞活化。这些新的肽显示出跨若干II类等位基因的宽覆盖度，以及在产生CD4+记忆T细胞回忆应答方面的显著改进。
[0107] 此外，使用获得自或衍生自共同来源的抗原和组合物的发明剂型可以提供强健且特异性的免疫应答，该免疫应答可以活化辅助T细胞、以及细胞毒性T细胞和/或B细胞。具体而言，部分基于预测的HLA II类结合亲和力而设计的以给出在人类中跨大多数等位基因的最宽覆盖度的所列举的组合物的使用引起了产生与常规技术相比改进的免疫应答的发明剂型。协调一种或多种抗原的来源与所列举的多种组合物的来源(确切地说协调这种或这些抗原的来源与A和/或B和/或C的来源)提供了与常规技术相比在免疫应答方面的进一步改进。例如，在某些实施方案中，使用本发明的剂型可以适当增强针对特定病原体的B细胞和CD4+细胞应答。
[0108] 在其他实施方案中，有利的是选择该第一和/或第二MHC II结合肽，这样使得它包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。鉴于针对该受试者将会接收的该传染因子的多次免疫接种，这可以提供对本发明组合物的强健的记忆应答。这在实例中可见，在这些实例中注意到对获得自或衍生自RSV的第一和/或第二MHC II结合肽的强健的记忆应答。
[0109] 以下实例说明了一般发明方法、肽物理特性修饰和获得自或衍生自共同来源的发明组合物、以及这些发明组合物的各种应用的多个方面。
[0110] 现在将更详细地说明本发明。
[0111] B.定义
[0112] “佐剂”意指不构成具体的抗原，但是促进对伴随给予的抗原的免疫应答的强度和寿命的试剂。这样的佐剂可以包括但不限于：模式识别受体(例如Toll样受体、RIG-1和NOD样受体(NLR))的刺激剂、矿物盐(例如明矾，与肠道细菌(例如大肠杆菌、明尼苏达沙门菌、鼠伤寒沙门菌、或弗氏志贺菌)的单磷酰脂质(monphosphoryl lipid，MPL)A结合的明矾或分别与 (AS04)、以上提到的细菌的MPL A特异结合的明矾)、皂苷(如QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIXTM)、乳液(如MF59TM、 ISA51以及
ISA720)、AS02(QS21+角鲨烯+ )、脂质体和脂质体配制品(如AS01)、合成的或特
别制备的微颗粒和微载体(如淋病奈瑟菌(N.gonorrheae)、沙眼衣原体和其他细菌的源于细菌的外膜泡(OMV))、或壳聚糖颗粒、贮存形成剂(depot-formingagent)(如
嵌段共聚物)、特异性修饰或制备的肽(例如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白质(如细菌类毒素或毒素片段)。
ISA720)、AS02(QS21+角鲨烯+ )、脂质体和脂质体配制品(如AS01)、合成的或特
别制备的微颗粒和微载体(如淋病奈瑟菌(N.gonorrheae)、沙眼衣原体和其他细菌的源于细菌的外膜泡(OMV))、或壳聚糖颗粒、贮存形成剂(depot-formingagent)(如
嵌段共聚物)、特异性修饰或制备的肽(例如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如RC529)、或蛋白质(如细菌类毒素或毒素片段)。
[0113] 在实施方案中，佐剂包括针对模式识别受体(PRR)(包括但并不限于Toll样受体(TLR)，特别是TLR2、3、4、5、7、8、9和/或其组合)的激动剂。在其他实施方案中，佐剂包括针对Toll样受体3的激动剂、针对Toll样受体7和8的激动剂、或针对Toll样受体9的激动剂；优选地这些列举的佐剂包括咪唑喹啉，如R848；腺嘌呤衍生物，如在美国专利6,329,381(住友制药株式会社(Sumitomo Pharmaceutical Company))、Biggadike等人的美国公开专利申请2010/0075995、或坎伯斯(Campos)等人的WO2010/018132中披露的那些；免疫刺激DNA；或免疫刺激RNA。在特定的实施方案中，合成纳米载体合并作为佐剂化合物，它们是针对toll样受体(TLR)7&8的激动剂(“TLR7/8激动剂”)。有效用的是Tomai等人的美国专利6,696,076中披露的TLR7/8激动剂化合物，包括但不限于咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺、以及1，2-桥接咪唑并喹啉胺。优选的佐剂包括咪喹莫特和瑞喹莫德(也称为R848)。在特定的实施方案中，佐剂可以是DC表面分子CD40的激动剂。在某些实施方案中，为了刺激免疫性而不是耐受性，合成纳米载体合并了促进DC成熟(对于启动初始T细胞而言是需要的)以及细胞因子(如I型干扰素，它促进抗体免疫应答)的产生的佐剂。在实施方案中，佐剂还可以包括免疫刺激RNA分子(例如但并不限于dsRNA、聚I:C、聚I:C12U(可获得为 聚I:C和聚I:C12U均称为TLR3刺激剂))、和/或在以下中披露的那些：F.Heil等人，“经由Toll样受体7和8的单链RNA的种特异性识别(Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor7and8)”科学303(5663)，1526-1529(2004)；J.Vollmer等人，“通过化学修饰的核糖核苷以及寡核糖核苷酸进行的免疫调节(Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides)”WO200803343
2A2；A.Forsbach等人，“含有特异性序列基元并且靶向Toll样受体8路径的免疫刺激性寡核糖核苷酸(Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific seq uencemotif(s)and targeting the Toll-like receptor8pathway)”WO2007062107A2；
E.Uhlmann等人，“具有增强的免疫刺激活性的修饰的寡核糖核苷酸类似物(Modified oligoribonucleotide analogs with enhancedimmunostimulatory activity)” 美 国专利申请公开号US2006241076；G.Lipford等人，“免疫刺激性病毒RNA寡核苷酸以及用于治疗癌症和感染的用途(Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections)”WO2005097993A2；G.Lipford等人，“免疫刺激性含G，U寡核糖核苷酸、组合物以及筛选法(Immunostimulatory G，U-containing oligoribonucleotides，compositions，and screening methods)”WO2003086280A2。在一些实施方案中，佐剂可以是TLR-4激动剂，如细菌脂多糖(LPS)、VSV-G、和/或HMGB-1。
在一些实施方案中，佐剂可以包括TLR-5激动剂，如鞭毛蛋白、或其部分或衍生物，包括但不限于在美国专利6,130,082、6,585,980、以及7,192,725中披露的那些。在特定的实施方案中，合成纳米载体合并了针对Toll样受体(TLR)-9的配体，如包括CpGs的免疫刺激性DNA分子，它们诱导I型干扰素分泌，并且刺激T和B细胞活化从而引起增加的抗体产生和细胞毒性T细胞应答(Krieg等人，细菌RNA中的CpG基元触发直接的B
细胞活化(CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation).自然.1995.374：546-549；Chu等人，CpG寡脱氧核苷酸充当启动T辅助1(Th1)免疫的佐剂(CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper1(Th1)immunity).实验医学杂志(J.Exp.Med.)1997.186：1623-1631；Lipford等人，含CpG的合成寡核苷酸促进对蛋白质抗原的B和细胞毒性T细胞应答：新类别的疫苗佐剂
(CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen：a new class of vaccine adjuvants).欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)1997.27：2340-2344；Roman等人，免疫刺激性DNA序列充当T辅助-1促进性佐剂(Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants).自然医学(Nat.Med.)1997.3：849-854；Davis等人，CpG DNA是接种了重组乙型肝炎表面抗原的小鼠体内的特异性免疫的强力的增强剂(CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen).免疫学杂志(J.Immunol)1998.160：870-876；Lipford等人，作为免疫细胞活化剂的细菌DNA(Bacterial DNA as immune cell activator).微生物学进展(Trends Microbiol).1998.6：496-500；Krieg等人的美国专利6,207,646；Tuck等人的美国专利7,223,398；Van Nest等人的美国专利7,250,403；或Krieg等人的美国专利
7,566,703)。
2A2；A.Forsbach等人，“含有特异性序列基元并且靶向Toll样受体8路径的免疫刺激性寡核糖核苷酸(Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific seq uencemotif(s)and targeting the Toll-like receptor8pathway)”WO2007062107A2；
E.Uhlmann等人，“具有增强的免疫刺激活性的修饰的寡核糖核苷酸类似物(Modified oligoribonucleotide analogs with enhancedimmunostimulatory activity)” 美 国专利申请公开号US2006241076；G.Lipford等人，“免疫刺激性病毒RNA寡核苷酸以及用于治疗癌症和感染的用途(Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections)”WO2005097993A2；G.Lipford等人，“免疫刺激性含G，U寡核糖核苷酸、组合物以及筛选法(Immunostimulatory G，U-containing oligoribonucleotides，compositions，and screening methods)”WO2003086280A2。在一些实施方案中，佐剂可以是TLR-4激动剂，如细菌脂多糖(LPS)、VSV-G、和/或HMGB-1。
在一些实施方案中，佐剂可以包括TLR-5激动剂，如鞭毛蛋白、或其部分或衍生物，包括但不限于在美国专利6,130,082、6,585,980、以及7,192,725中披露的那些。在特定的实施方案中，合成纳米载体合并了针对Toll样受体(TLR)-9的配体，如包括CpGs的免疫刺激性DNA分子，它们诱导I型干扰素分泌，并且刺激T和B细胞活化从而引起增加的抗体产生和细胞毒性T细胞应答(Krieg等人，细菌RNA中的CpG基元触发直接的B
细胞活化(CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation).自然.1995.374：546-549；Chu等人，CpG寡脱氧核苷酸充当启动T辅助1(Th1)免疫的佐剂(CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper1(Th1)immunity).实验医学杂志(J.Exp.Med.)1997.186：1623-1631；Lipford等人，含CpG的合成寡核苷酸促进对蛋白质抗原的B和细胞毒性T细胞应答：新类别的疫苗佐剂
(CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen：a new class of vaccine adjuvants).欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)1997.27：2340-2344；Roman等人，免疫刺激性DNA序列充当T辅助-1促进性佐剂(Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants).自然医学(Nat.Med.)1997.3：849-854；Davis等人，CpG DNA是接种了重组乙型肝炎表面抗原的小鼠体内的特异性免疫的强力的增强剂(CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen).免疫学杂志(J.Immunol)1998.160：870-876；Lipford等人，作为免疫细胞活化剂的细菌DNA(Bacterial DNA as immune cell activator).微生物学进展(Trends Microbiol).1998.6：496-500；Krieg等人的美国专利6,207,646；Tuck等人的美国专利7,223,398；Van Nest等人的美国专利7,250,403；或Krieg等人的美国专利
7,566,703)。
[0114] 在一些实施方案中，佐剂可以是从坏死细胞释放的促炎刺激物(例如尿酸盐晶体)。在一些实施方案中，佐剂可以是补体级联的活化组分(例如CD21、CD35，等)。在一些实施方案中，佐剂可以是免疫复合体的活化组分。这些佐剂还包括补体受体激动剂，如结合到CD21或CD35上的分子。在一些实施方案中，该补体受体激动剂诱导了合成纳米载体的内源补体调理作用。在一些实施方案中，佐剂是细胞因子，它们是由细胞释放的小的蛋白质或生物因子(在5kD-20kD的范围内)，并且对细胞-细胞相互作用、通讯以及其他细胞的行为具有特殊作用。在一些实施方案中，该细胞因子受体激动剂是小分子、抗体、融合蛋白、或适体。
[0115] 在实施方案中，至少一部分剂量的佐剂可以偶联到合成纳米载体上，优选地，全部剂量的佐剂偶联到合成纳米载体上。在其他实施方案中，至少一部分剂量的佐剂未偶联到合成纳米载体上。在实施方案中，该剂量的佐剂包括两个或更多个类型的佐剂。例如，而没有限制，可以结合作用于不同TLR受体的佐剂。作为一个实例，在一个实施方案中，TLR7/8激动剂可以与TLR9激动剂结合。在另一个实施方案中，TLR7/8激动剂可以与TLR4激动剂结合。仍在另一个实施方案中，TLR9激动剂可以与TLR3激动剂结合。
[0116] “给予(Administering)”或“给药(administration)”意指以药理学上有用的方式向受试者提供药物。
[0117] “抗原”意指B细胞抗原或T细胞抗原。
[0118] “B细胞抗原”意指由B细胞识别并且触发B细胞中的免疫应答的任何抗原(例如被B细胞上的B细胞受体特异性识别的抗原)。在一些实施方案中，是T细胞抗原的抗原也是B细胞抗原。在其他实施方案中，T细胞抗原并不也是B细胞抗原。B细胞抗原包括但不限于：蛋白质、肽、小分子、以及碳水化合物。在一些实施方案中，B细胞抗原包括非蛋白质抗原(即不是蛋白质或肽抗原)。在一些实施方案中，B细胞抗原包括与传染因子相关的碳水化合物。在一些实施方案中，B细胞抗原包括与传染因子相关的糖蛋白或糖肽。该传染因子可以是细菌、病毒、真菌、原生动物、或寄生虫。在一些实施方案中，B细胞抗原包括免疫原性差的抗原。在一些实施方案中，B细胞抗原包括滥用的物质或其一部分。在一些实施方案中，B细胞抗原包括上瘾的物质或其一部分。上瘾的物质包括但不限于：尼古丁、麻醉剂、镇咳剂、镇静剂、以及安神剂。在一些实施方案中，B细胞抗原包括毒素，例如来自化学武器或天然来源的毒素。B细胞抗原还可以包括危险的环境因素。在一些实施方案中，B细胞抗原包括自身抗原。在其他实施方案中，B细胞抗原包括异体抗原、变应原、接触性致敏原、退行性疾病抗原、半抗原、传染病抗原、癌抗原、特应性疾病抗原、自身免疫疾病抗原、上瘾的物质、异种抗原、或代谢病酶或其酶产物。
[0119] “共同来源”意思是该抗原以及A和/或B和/或C(取决于实施方案)源于共享生物、化学和/或免疫学特征的来源。在实施方案中，共同来源可以是生物的相同菌株、种、和/或属。在其他实施方案中，共同来源可以是相同的细胞类型、组织类型、和/或器官类型。在其他实施方案中，共同来源可以是相同的多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、和/或其片段。所列举的抗原和组合物可以获得自或衍生自该共同来源。这旨在意指，例如，该抗原可以衍生自该共同来源，而与该组合物是否获得自或衍生自该共同来源无关。类似地，该抗原可以获得自该共同来源，而与该组合物是否获得自或衍生自该共同来源无关。在实施方案中，反之亦然：该组合物可以衍生自该共同来源，而与该抗原是否获得自或衍生自该共同来源无关；
并且该组合物可以获得自该共同来源，而与该抗原是否获得自或衍生自该共同来源无关。
并且该组合物可以获得自该共同来源，而与该抗原是否获得自或衍生自该共同来源无关。
[0120] “偶联(Couple)”或“被偶联(Coupled)”或“偶联了(Couples)”(诸如此类)意思是使一个实体(例如一个部分)与另一个实体化学上相关联。在一些实施方案中，偶联是共价的，这意味着该偶联是在两个实体之间存在共价键的环境下发生的。在非共价的实施方案中，通过非共价相互作用介导非共价偶联，这些非共价相互作用包括但不限于：电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主-客体相互作用、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用、磁相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或它们的组合。在实施方案中，封装是偶联的一种形式。
[0121] “衍生的”意思是取自一种来源并且经受实质性修饰。例如，其序列具有与天然肽或核酸(优选天然共有肽(consensus peptide)或核酸)仅50％一致性的肽或核酸将被称为衍生自该天然肽或核酸。然而，衍生的核酸并不旨在包括具有仅仅由于遗传密码的简并性而与天然核酸序列(优选天然共有核酸序列)不一致的序列的核酸。实质性修饰是显著影响所讨论的物质的化学或免疫学特性的修饰。如果衍生的肽和核酸相比于天然肽或核酸具有改变的化学或免疫学特性，那么所述衍生的肽和核酸还可以包括具有与天然肽或核酸序列大于50％一致性的序列的那些。这些化学或免疫学特性包括亲水性、稳定性、对MHC II的结合亲和力、以及与载体(如合成纳米载体)偶联的能力。
[0122] “剂型”意指在适合于给予受试者的介质、载体、媒介物、或装置中的药理学上和/或免疫学上具有活性的物质。
[0123] “封装”意思是将至少一部分的物质封闭在合成纳米载体内。在一些实施方案中，物质被完全封闭在合成纳米载体内。在其他实施方案中，被封装的物质的大部分或全部不暴露于合成纳米载体外的局部环境。在其他实施方案中，不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％暴露于该局部环境。封装不同于吸收，吸收是将物质的大部分或全部安置在合成纳米载体的表面上，并且使得该物质暴露于该合成纳米载体外的局部环境。
[0124] “MHC II结合肽”意指在充分的亲和力下结合到主要组织相容性复合体II类上以允许肽/MHC复合体与T细胞上的T细胞受体相互作用的肽。通过使用常规技术测量细胞因子产生和/或T细胞增殖可以确定肽/MHC复合体与T细胞上的T细胞受体的相互作用。在实施方案中，MHCII结合肽具有5000nM或更小，优选500nM或更小，并且更优选50nM或更小的用于结合到MHC II分子上的亲和力IC50值。在实施方案中，根据本发明的MHC II结合肽(明确地包括第一、第二、以及第三MHC II结合肽)具有等于或大于5-mer的长度，并且可以与蛋白质一样大。在其他实施方案中，根据本发明的MHC II结合肽(明确地包括第一、第二、以及第三MHC II结合肽)具有范围从5-mer至50-mer，优选范围从5-mer至
40-mer，更优选范围从5-mer至30-mer，并且仍更优选从6-mer至25-mer的长度。
40-mer，更优选范围从5-mer至30-mer，并且仍更优选从6-mer至25-mer的长度。
[0125] “一致性”意指在单维序列比对中相同定位的氨基酸或残基或核酸碱基的百分比。一致性是所比较的序列有多接近的度量。在一个实施方案中，可以使用BESTFIT程序确定两个序列之间的一致性。在实施方案中，列举的MHC II结合肽(例如A、B、或C)可以具有与天然HLA-DP结合肽、天然HLA-DQ结合肽、和/或天然HLA-DR结合肽至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少97％、或甚至更优选至少
99％的一致性。在实施方案中，A、B、以及C不是彼此100％一致的；并且在实施方案中，A和B不是彼此100％一致的。在实施方案中，所列举的核酸可以具有与编码天然HLA-DP结合肽、天然HLA-DQ结合肽、和/或天然HLA-DR结合肽的核酸序列、或者与编码以上肽的序列互补的核酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少97％、或甚至更优选至少99％的一致性。
99％的一致性。在实施方案中，A、B、以及C不是彼此100％一致的；并且在实施方案中，A和B不是彼此100％一致的。在实施方案中，所列举的核酸可以具有与编码天然HLA-DP结合肽、天然HLA-DQ结合肽、和/或天然HLA-DR结合肽的核酸序列、或者与编码以上肽的序列互补的核酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少97％、或甚至更优选至少99％的一致性。
[0126] “分离的核酸”意指从其原生环境中分离并且以足够的量存在以允许它的鉴定或使用的核酸。分离的核酸可以是(i)在体外通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增的；(ii)通过克隆重组生产的；(iii)如通过切割和凝胶分离进行纯化的；或(iv)通过例如化学合成的核酸。分离的核酸是通过本领域熟知的重组DNA技术可容易地操作的核酸。因此，包含在其中5′和3′限制性位点是已知的载体中或者针对它的聚合酶链式反应(PCR)引物序列已经被披露的核苷酸序列被认为是分离的，但是以其原生状态存在于它的天然宿主中的核酸序列不被认为是分离的。分离的核酸可以被实质性地纯化，但是不必要被纯化。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸是不纯的，在于在它所在的细胞中，可能只包括很小百分比的这种物质。然而，作为在此使用的术语，这样的核酸是分离的，因为通过本领域的那些普通技术人员已知的标准技术，它是容易地可操作的。在此提供的任何核酸都可以是分离的。在实施方案中，在此提供的任何抗原或肽可以按编码它们的分离的核酸或其全长互补物的形式提供。
[0127] “分离的多肽”意指从其原生环境中分离并且以足够的量存在以允许它的鉴定或使用的多肽。这意味着，例如这些多肽可以被(i)通过表达克隆选择性地产生或(ii)如通过色谱法或电泳进行纯化。分离的蛋白质或多肽可以是基本上纯的，但是不必要如此。由于在药物制剂中分离的多肽可以与药学上可接受的载体混合，按制剂的重量计多肽可能仅包括小的百分比。虽然如此，这种多肽是分离的，因为它已经从在活系统中可能与其相关的物质中分离出来，例如从其他蛋白质中分离出来。在此提供的任何肽或多肽都可以是分离的。
[0128] “连接物”意指通过单个共价键或多个共价键将两个化学组分连接在一起的部分。
[0129] “合成纳米载体的最大尺寸”意指沿着该合成纳米载体的任何轴测量的纳米载体的最大尺寸。“合成纳米载体的最小尺寸”意指沿着该合成纳米载体的任何轴测量的合成纳米载体的最小尺寸。例如，对于球形合成纳米载体，合成纳米载体的最大和最小尺寸将会是基本相同的，并且将会是它的直径的大小。类似地，对于立方形合成纳米载体，合成纳米载体的最小尺寸将会是它的高、宽或长中最小的，而合成纳米载体的最大尺寸会是它的高、宽或长中最大的。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数而言，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸是大于100nm。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数而言，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或小于5μm。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数而言，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸是等于或大于110nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、并且仍更优选等于或大于150nm。发明合成纳米载体的最大和最小尺寸的长径比可随着实施方案而改变。例如，合成纳米载体的最大与最小尺寸的长径比可从1∶1至1,000,000∶1、优选从
1∶1至100,000∶1、更优选从1∶1至1000∶1、仍更优选从1∶1至100∶1、并且再更优选从1∶1至10∶1而改变。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数而言，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或小于3μm、更优选等于或小于2μm、更优选等于或小于1μm、更优选等于或小于800nm、更优选等于或小于600nm、并且仍更优选等于或小于500nm。在优选的实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数而言，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm、并且仍更优选等于或大于150nm。通过将这些合成纳米载体悬浮在液体(通常是水性)介质中，并且使用动态光散射(DLS)(例如使用一台Brookhaven ZetaPALS仪器)获得合成纳米载体大小的测量值。例如，可将合成纳米载体的悬浮液从水性缓冲剂中稀释到纯化水中以达到大约0.01至0.1mg/mL的最终合成纳米载体悬浮液浓度。可将该稀释的悬浮液在合适的比色皿中直接制备，或转移至该比色皿中以用于DLS分析。然后可将该比色皿放置在DLS中，使之平衡至受控的温度，并且然后扫描充分的时间以在介质的粘度以及样品的折射率的适当输入的基础上获得稳定且可再现的分布。
1∶1至100,000∶1、更优选从1∶1至1000∶1、仍更优选从1∶1至100∶1、并且再更优选从1∶1至10∶1而改变。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数而言，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或小于3μm、更优选等于或小于2μm、更优选等于或小于1μm、更优选等于或小于800nm、更优选等于或小于600nm、并且仍更优选等于或小于500nm。在优选的实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数而言，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm、并且仍更优选等于或大于150nm。通过将这些合成纳米载体悬浮在液体(通常是水性)介质中，并且使用动态光散射(DLS)(例如使用一台Brookhaven ZetaPALS仪器)获得合成纳米载体大小的测量值。例如，可将合成纳米载体的悬浮液从水性缓冲剂中稀释到纯化水中以达到大约0.01至0.1mg/mL的最终合成纳米载体悬浮液浓度。可将该稀释的悬浮液在合适的比色皿中直接制备，或转移至该比色皿中以用于DLS分析。然后可将该比色皿放置在DLS中，使之平衡至受控的温度，并且然后扫描充分的时间以在介质的粘度以及样品的折射率的适当输入的基础上获得稳定且可再现的分布。
[0130] 然后报告有效直径，或分布的平均值。
[0131] “天然HLA-DP结合肽”意指获得自或衍生自自然、在充分的亲和力下特异性结合到MHC II类人白细胞抗原DP上以允许肽/HLA-DP复合体与T细胞上的T细胞受体相互作用的肽。在实施方案中，天然HLA-DP结合肽具有5000nM或更小、优选500nM或更小、并且更优选50nM或更小的用于MHC II类人白细胞抗原DP的亲和力IC50值。在实施方案中，天然HLA-DP结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。这类传染因子包括受试者已经暴露于其不止一次的那些。总体而言，已经暴露于这类传染因子的受试者是在循环的基础上，如每年、每月、每周或每天而暴露的。在一些实施方案中，受试者已经反复暴露于这样的传染因子，因为该因子在受试者的环境中是普遍的。这类传染因子包括细菌、原生动物、病毒等。受试者可能反复暴露于其的病毒包括但不限于，诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒以及柯萨奇病毒。
[0132] 受试者可能反复暴露于其的传染因子(连同相关传染病)的另外实例在以下表1中列出。应理解，这类传染因子是示例性的并且根据本发明的一些方面另外的传染因子，例如所列因子的亚系，以及未在此列出的传染因子可以是适合的，并且本发明在此方面是不受限的。
[0133] 表1
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143] 还应理解，这类传染因子不局限于专门地或主要地传染人受试者的人传染因子。受试者可以反复暴露于其的传染因子包括传染多种宿主，包括非人受试者的传染因子，或专门地或主要地传染非人受试者的传染因子。例如，这类传染因子可以是传染非人哺乳动物、脊椎动物或非脊椎动物，例如但不限于啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠)、猫、狗、农场动物(例如，牛、绵羊、山羊、猪)、鱼、青蛙、爬行动物以及其他动物的传染因子。与非人受试者相关的传染因子是本领域的普通技术人员所已知的，并且这类疾病和因子的一些非限制性实例在表1中列出。根据本发明的方面的另外的合适的因子对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的，并且本发明在此方面是不受限的。
[0144] 在一些实施方案中，天然HLA-DP结合肽包括获得自或衍生自包括但不限于以下项的病毒、细菌或酵母的肽序列：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒(EVB)、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、和/或天花病毒。使用Immune Epitope Database＊(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/)T细胞表位预测工具进行II类表位预测。计算分析在实例中或如下提供：对于每种肽，通过比较这些肽的得分与选自SWISSPROT数据库的五百万随机15mers的得分，产生使用三种方法(ARB、SMM_align以及Sturniolo)中的每一种的百分等级。然后这三种方法的百分等级被用来产生一致法的等级。
[0145] “天然HLA-DQ结合肽”意指获得自或衍生自自然、在充分的亲和力下特异性结合到MHC II类人白细胞抗原DQ上以允许肽/HLA-DQ复合体与T细胞上的T细胞受体相互作用的肽。在实施方案中，天然HLA-DQ结合肽具有5000nM或更小、优选500nM或更小、并且更优选50nM或更小的针对MHC II类人白细胞抗原DQ的亲和力IC50值。在实施方案中，天然HLA-DQ结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。这类传染因子包括受试者已经暴露于其不止一次的那些。总体而言，已经暴露于这类传染因子的受试者是在循环的基础上，如每年、每月、每周或每天而暴露的。在一些实施方案中，受试者已经反复暴露于这样的传染因子，因为该因子在受试者的环境中是普遍的。这类传染因子包括细菌、原生动物、病毒等。受试者可能反复暴露于其的病毒包括但不限于，诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒以及柯萨奇病毒。
[0146] 受试者可能反复暴露于其的另外的示例性传染因子(连同相关传染病)在以上表1中列出。应理解，这些传染因子是示例性的并且根据本发明的一些方面另外的传染因子，例如所列因子的亚系，以及未在此列出的传染因子可以是适合的，并且本发明在此方面是不受限的。
[0147] 还应理解，这类传染因子不局限于专门地或主要地传染人受试者的人传染因子。这类传染因子可以是传染多种宿主，包括非人受试者的传染因子，或专门地或主要地传染非人受试者的传染因子。例如，这类传染因子可以是传染非人哺乳动物、脊椎动物或非脊椎动物，例如但不限于啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠)、猫、狗、农场动物(例如，牛、绵羊、山羊、猪)、鱼、青蛙、爬行动物以及其他动物的传染因子。与非人受试者相关的传染因子是本领域的普通技术人员所已知的，并且这类因子的一些非限制性实例在表1中列出。根据本发明的方面的另外的合适的因子对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的，并且本发明在此方面是不受限的。
[0148] 在一些实施方案中，天然HLA-DQ结合肽包括获得自或衍生自包括但不限于以下项的病毒、细菌或酵母的肽序列：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒(EVB)、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、和/或天花病毒。使用Immune Epitope Database＊(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/)T细胞表位预测工具进行II类表位预测。计算分析在实例中或如下提供：对于每种肽，通过比较这些肽的得分与选自SWISSPROT数据库的五百万随机15mers的得分，产生使用三种方法(ARB、SMM_align以及Sturniolo)中的每一种的百分等级。然后这三种方法的百分等级被用来产生一致法的等级。
[0149] “天然LA-DR结合肽”意指获得自或衍生自自然、在充分的亲和力下特异性结合到MHC II类人白细胞抗原DR上以允许肽/HLA-DR复合体与T细胞上的T细胞受体相互作用的肽。在实施方案中，天然HLA-DR结合肽具有5000nM或更小、优选500nM或更小、并且更优选50nM或更小的针对MHC II类人白细胞抗原DR的亲和力IC50值。在实施方案中，天然HLA-DR结合肽包括获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的肽序列。这类传染因子包括受试者已经暴露于其不止一次的那些。总体而言，已经暴露于这类传染因子的受试者是在循环的基础上，如每年、每月、每周或每天而暴露的。在一些实施方案中，受试者已经反复暴露于这样的传染因子，因为该因子在受试者的环境中是普遍的。这类传染因子包括细菌、原生动物、病毒等。受试者可能反复暴露于其的病毒包括但不限于，诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒以及柯萨奇病毒。
[0150] 受试者可能反复暴露于其的另外的示例性传染因子(连同相关传染病)在以上表1中列出。应理解，这些传染因子是示例性的并且根据本发明的一些方面另外的传染因子，例如所列因子的亚系，以及未在此列出的传染因子可以是适合的，并且本发明在此方面是不受限的。
[0151] 还应理解，这类传染因子不局限于专门地或主要地传染人受试者的人传染因子。这类传染因子可以是传染多种宿主，包括非人受试者的传染因子，或专门地或主要地传染非人受试者的传染因子。例如，这类传染因子可以是传染非人哺乳动物、脊椎动物或非脊椎动物，例如但不限于啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠)、猫、狗、农场动物(例如，牛、绵羊、山羊、猪)、鱼、青蛙、爬行动物以及其他动物的传染因子。与非人受试者相关的传染因子是本领域的普通技术人员所已知的，并且这类因子的一些非限制性实例在表1中列出。根据本发明的方面的另外的合适的因子对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的，并且本发明在此方面是不受限的。
[0152] 在一些实施方案中，天然HLA-DR结合肽包括获得自或衍生自包括但不限于以下项的病毒、细菌或酵母的肽序列：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒(EVB)、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、和/或天花病毒。使用Immune Epitope Database＊(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/)T细胞表位预测工具进行II类表位预测。计算分析在实例中或如下提供：对于每种肽，通过比较这些肽的得分与选自SWISSPROT数据库的五百万随机15mers的得分，产生使用三种方法(ARB、SMM_align以及Sturniolo)中的每一种的百分等级。然后这三种方法的百分等级被用来产生一致法的等级。
[0153] “获得”意思是不经实质性修饰而取自一种来源。实质性修饰是显著影响所讨论的物质的化学或免疫学特性的修饰。例如，作为一个非限制性实例，具有与天然肽或核苷酸序列(优选天然共有肽或核苷酸序列)大于90％、优选大于95％、优选大于97％、优选大于98％、优选大于99％、优选100％一致性的序列、以及并非显著不同于该天然肽或核酸的化学和/或免疫学特性的肽或核酸将会被认为是获得自该天然肽或核苷酸序列。所获得的核酸旨在包括具有仅仅由于遗传密码的简并性而与天然共有核苷酸序列不一致的序列的核酸。这类核酸甚至具有与天然核苷酸序列(优选天然共有核苷酸序列)小于90％一致性的序列。这些化学或免疫学特性包括亲水性、稳定性、对MHC II的结合亲和力、以及与载体(如合成纳米载体)偶联的能力。
[0154] “药学上可接受的赋形剂”意指与本发明的组合物、剂型、疫苗等的配制实施方案中列举的肽一起使用的药理学上非活性的物质。药学上可接受的赋形剂包括多种本领域已知的物质，包括但不限于：糖类(如葡萄糖、乳糖等)、防腐剂(如抗微生物剂)、复原助剂(reconstitution aids)、着色剂、盐水(如磷酸盐缓冲盐水)、缓冲剂、分散剂、稳定剂、其他在此说明的赋形剂、以及其他常规已知的这类物质。
[0155] “受试者”意指动物，包括温血哺乳动物，如人类和灵长类；鸟类；家养家庭或农场动物，如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马以及猪；实验动物、如小鼠、大鼠、以及豚鼠；鱼；爬行动物；动物园和野生动物；等等。
[0156] “一种或多种合成纳米载体”意指在自然中未发现的、并且在大小上具有小于或等于5微米的至少一个尺寸的离散物体。白蛋白纳米颗粒一般被包括为合成纳米载体，然而在某些实施方案中，合成纳米载体并不包括白蛋白纳米颗粒。在实施方案中，合成纳米载体不包括壳聚糖。
[0157] 合成纳米载体可以是，但并不限于：一种或多种基于脂质的纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树枝状聚合物、巴克球纳米颗粒(buckyball)、纳米线(nanowire)、病毒样颗粒、基于肽或蛋白质的颗粒(如白蛋白纳米颗粒)和/或使用纳米材料的组合开发的纳米颗粒(如脂质-聚合物纳米颗粒)。合成纳米载体可以具有许多不同的形状，包括但不限于：球形、立方形、锥形、长方形、圆柱形、螺旋管形等等。根据本发明的合成纳米载体包括一个或多个表面。可以适合用于实践本发明的示例性的合成纳米载体包括：(1)披露在Gref等人的美国专利5,543,158中的可生物降解的纳米颗粒、(2)Saltzman等人的公开美国专利申请20060002852的聚合物纳米颗粒、(3)DeSimone等人的公开美国专利申请20090028910的光刻构建(lithographically constructed)的纳米颗粒、(4)von Andrian等人的WO2009/051837的披露内容、或(5)披露在Penades等人的公开美国专利申请2008/0145441中的纳米颗粒、(6)披露在de los Rios等人的公开美国专利申请20090226525中的蛋白纳米颗粒、(7)披露在Sebbel等人的公开美国专利申请20060222652中的病毒样颗粒、(8)披露在Bachmann等人的公开美国专利申请20060251677中的偶联核酸的病毒样颗粒、(9)披露在WO2010047839A1或WO2009106999A2中的病毒样颗粒、或(10)披露在P. Paolicelli等人的“可以高效缔合并递送病毒样颗粒的表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles)”纳米医学(Nanomedicine).5(6)：843-853(2010年)中的纳米沉淀的纳米颗粒。在实施方案中，合成的纳米载体可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的长径比。
[0158] 根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于大约100nm、优选等于或小于100nm的最小尺寸，它们不包括具有使补体活化的羟基的表面，或者可替代地包括基本由不是使补体活化的羟基的部分组成的表面。在一个优选的实施方案中，根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于大约100nm、优选地等于或小于100nm的最小尺寸，它们不包括实质上使补体活化的表面，或者可替代地包括基本由不实质上活化补体的部分组成的表面。在更优选的实施方案中，根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于大约100nm、优选地等于或小于100nm的最小尺寸，它们不包括使补体活化的表面，或者可替代地包括基本由不使补体活化的部分组成的表面。在一个实施方案中，根据本发明的合成纳米载体不包括病毒样颗粒。
[0159] “T细胞抗原”意指CD4+T细胞抗原或CD8+细胞抗原。“CD4+T细胞抗原”意指由CD4+T细胞识别并且触发CD4+T细胞中的免疫应答的任何抗原，例如经由结合到II类主要组织相容性复合体分子(MHC)上的抗原或其一部分的提呈而被CD4+T细胞上的T细胞受体特异性地识别的抗原。“CD8+T细胞抗原”意指由CD8+T细胞识别并且触发CD8+T细胞中的免疫应答的任何抗原，例如经由结合到I类主要组织相容性复合体分子(MHC)上的抗原或其一部分的提呈而被CD8+T细胞上的T细胞受体特异性地识别的抗原。在一些实施方案中，是T细胞抗原的抗原也是B细胞抗原。在其他实施方案中，T细胞抗原并不也是B细胞抗原。T细胞抗原一般是蛋白质或肽，但是也可以是其他分子，例如脂质或糖脂类。在实施方案中，根据本发明，T细胞抗原不包括所列举的组合物。
[0160] “疫苗”意指改善了对特定的病原体或疾病的免疫应答的物质的组合物。疫苗典型地含有刺激受试者的免疫系统以将特异性抗原识别为外来物质并且将它从受试者身体消除的因子。疫苗还建立免疫“记忆”，因此如果一个人再次受到激发，抗原将会被快速识别并且被应答。疫苗可以是预防性的(例如阻止由任何病原体引起的以后的感染)、或治疗性的(例如用于治疗癌症的针对肿瘤特异性抗原的疫苗)。根据本发明的疫苗可以包括一种或多种MHC II结合肽，或者编码这一种或多种MHC II结合肽的一种或多种核酸，或者与编码这一种或多种MHC II结合肽的这一种或多种核酸互补的一种或多种核酸。
[0161] C.发明肽&制造和使用它们的方法
[0162] 在实施方案中，发明组合物和有关方法包括A-x-B，其中x可以包括连接物或无连接物，A包括第一MHC II结合肽，并且B包括第二MHC II结合肽。此外，在实施方案中，发明组合物和有关方法包括A-x-B-y--C，其中x可以包括连接物或无连接物，y可以包括连接物或无连接物，A包括第一MHC II结合肽，B包括第二MHC II结合肽，并且C包括第三MHC II结合肽。
[0163] 在某些实施方案中，x、和/或y(如果y存在)，可以不包括连接物，在这种情况下，A、B、C、以及每一个的不同组合可以作为混合物存在于发明组合物中。可以作为混合物存在的这样的组合的实例包括但不限于：A和B、A和B-y-C、A-x-B和C、A和B和C、等，其中“和”用以表示键的不存在，并且“-x-”或“-y-”用以表示键的存在。这样的一种混合物方法可以用来容易地结合多种不同的MHC II结合肽，因此提供了使用的便利和/或在例如产生含有这些MHC II结合肽的残基的单个更大的分子方面的合成简单化。可以使用传统的药物混合方法配制混合物。这些包括液-液混合，其中有两种或更多种悬浮液，每一种含有一个或多个系列的肽，直接将这些悬浮液合并或经由一个或多个含有稀释剂的容器将它们混在一起。由于肽还可以按粉末的形式生产或储存，可以进行干粉末-粉末混合，因为可以在普通介质中重新悬浮两种或更多种粉末。取决于这些肽的特性和它们的相互作用潜力，可能存在赋予一种或另一种混合途径的优点。
[0164] 可以使用常规药物制造和配料技术制造这些混合物，以实现有用的剂型。适合用于实践本发明的技术可以在工业混合手册：科学与实践(Handbook of Industrial Mixing：Science and Practice)，Edward L.Paul，Victor A.Atiemo-Obeng以及Suzanne M.Kresta编辑，2004年约翰威利父子公司(John Wiley & Sons，Inc.)；以及制药学：剂型设计科学(Pharmaceutics：The Science of Dosage Form Design)，第二版.M.E.Auten编辑，2001年，Churchill Livingstone公司中找到。在实施方案中，典型的包括肽混合物的发明组合物可以包括无机或有机缓冲剂(例如磷酸、碳酸、乙酸、或柠檬酸的钠盐或钾盐)和pH调节剂(例如盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸或乙酸的盐、氨基酸和它们的盐)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如聚山梨醇20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧胆酸钠)、溶液和/或低温/冻干稳定剂(例如蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如盐类或糖类)、抗细菌剂(例如苯甲酸、苯酚、庆大霉素)、防沫剂(例如聚二甲基硅酮(polydimethylsilozone))、防腐剂(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、EDTA)、聚合物稳定剂和粘度调节剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)以及共溶剂(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。
[0165] 在实施方案中，x和/或y(如果它存在)，可以包括连接物。在实施方案中，连接物可以直接连接氨基酸-天然的或修饰的-这些氨基酸是MHC II结合肽的一部分，或者连接物可以添加原子(优选多个原子)以连接这些MHC II结合肽。由于许多原因，连接物可以是有用的，包括但不限于：合成的便利、促进化学裂解、MHC II结合肽的分离、化学反应活性位点(像二硫键)和/或蛋白酶切割位点的插入。连接物可以包括：在给予受试者时，在某些生理条件下切割的可切割连接物，以及在发明组合物所遇到的典型生理条件下切割不良的非可切割的连接物。
[0166] 在某些实施方案中，x和/或y(如果它存在)，可以包括连接物，该连接物包括酰胺连接物、二硫化物连接物、硫化物连接物、1，4-二取代1，2，3-三唑连接物、硫酯连接物、或亚胺连接物。另外的在实践本发明中有用的连接物包括：从硫醇和酸形成的硫酯连接物、从肼和酸形成的酰肼连接物、从胺和醛或酮形成的亚胺连接物、从硫醇和硫代异氰酸酯形成的硫脲连接物、从胺和亚氨酸酯形成的脒连接物、以及从胺和醛的还原氨化形成的胺连接物。在实施方案中，x和/或y(如果它存在)可以包括连接物，该连接物包括肽序列(优选包括溶酶体蛋白酶切割位点(例如组织蛋白酶切割位点)的序列)、生物可降解聚合物、取代或未被取代的烷、烯、芳香族或杂环连接物、pH敏感的聚合物、异双功能的连接物或低聚乙二醇间隔物。
[0167] 可切割连接物包括但不限于：肽序列(优选包括溶酶体蛋白酶切割位点的肽序列)、生物可降解聚合物、pH可降解聚合物、或二硫键。溶酶体蛋白酶切割位点包括已知被溶酶体蛋白酶特异性切割的肽序列，这些溶酶体蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、锌蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶(AMSH/STAMBP组织蛋白酶F、组织蛋白酶3、组织蛋白酶H、组织蛋白酶6、组织蛋白酶L、组织蛋白酶7/组织蛋白酶1、组织蛋白酶O、组织蛋白酶A、组织蛋白酶S、组织蛋白酶B、组织蛋白酶V、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶X/Z/P、组织蛋白酶D、天冬酰胺内肽酶(Legumain))。生物可降解聚合物在许多生理条件下降解，而pH可降解聚合物在低(小于生理pH)pH条件下以加速的速率降解。在某些实施方案中，连接物的肽序列包括如在SEQ ID号：116或117中提出的氨基酸序列。
[0168] pmglp(SEQ ID号：116)
[0169] skvsvr(SEQ ID号：117)
[0170] 另外的信息可以发现于以下文献中：A.Purcell等人，“重新考虑肽在疫苗设计中的用途的不止一个原因(More than one reason to rethink the use of peptides in vaccine design.)”自然评论：药物发现杂志(J.Nat Rev Drug Discov.)2007；5：404-14；R.Bei等人，“基于TAA多表位DNA的疫苗：用于癌症治疗的潜在工具(TAA polyepitope DNA-based vaccines：A potential tool for cancer therapy.)”生物医学生物技术杂志(J Biomed Biotech.)2010；102785：1-12；W.Wriggers等人，“通过肽连接物控制蛋白质功能动力(Control of protein functional dynamics by peptide linkers.)”生物聚合物(Biopolymers).2005；80(6)：736-46；J.Timmerman等人，载体蛋白共轭疫苗：改善抗体和CTL应答的“未知的环节？”(Carrier protein conjugate vaccines：the“missing link”to improved antibody and CTL responses？)”人疫苗(Hum Vaccin.)2009年3月；5(3)：
181-3’B.Law等人，“蛋白质水解：药物递送、治疗及成像中采用的生物过程(Proteolysis：
a biological process adapted in drug delivery，therapy，and imaging.)”生物共轭化学(Bioconjug Chem.)2009年9月；20(9)：1683-95。
181-3’B.Law等人，“蛋白质水解：药物递送、治疗及成像中采用的生物过程(Proteolysis：
a biological process adapted in drug delivery，therapy，and imaging.)”生物共轭化学(Bioconjug Chem.)2009年9月；20(9)：1683-95。
[0171] 酰胺连接物是在一个化学组分上的氨基与第二化学组分的羧基之间形成的连接物。可以使用具有适当保护的氨基酸或多肽的任何常规酰胺连接物形成化学作用来制造这些连接物。在一个实施方案中，可以在A和B(或者B和C，等)的总合成过程中形成列举的酰胺连接物，因此简化了x和/或y的产生。可以容易地安排这类连接化学作用以包括可切割的连接基团。
[0172] 二硫化物连接物是在例如R1-S-S-R2形式的两个硫原子之间的连接物。可以通过氧化偶联两个相同的或不同的分子(如含有硫醇取代基(-SH)的肽)，或者优选通过使用例如以下形式的预形成的连接物来形成二硫化物连接物：其中氨基和/或羧基官能团被适当保护的H2N-R1-S-S-R2-CO2H。这类连接化学作用对于会导致两个单独的记忆肽分离的还原性切割是易感的。这是有意义的，因为可能在溶酶体中发现还原环境，这是具有免疫学重要性的靶标区室。
[0173] 可以使用酰肼和醛/酮化学作用来形成连接物。制备了在第一肽链末端含有酰肼或醛/酮官能团的第一肽。制备了第二肽，在该第二肽链末端具有酰肼(如果第一肽含有醛/酮)或醛/酮(如果第一肽含有酰肼)。然后允许这两种肽反应，该反应通过腙官能团连接这两种肽。通常，由此形成的腙键在酸性条件(如在溶酶体中发现的那些条件)下是可切割的。如果希望更大的连接物的稳定性，那么可以还原腙以形成对应的稳定的(不可切割的)烷基化酰肼(类似于胺与醛或酮的还原氨化以形成对应的烷基胺)。
[0174] 可以使用多种化学作用并且可以使用多种不同的物质来形成不可切割的连接物。通常，在每个这样的不可切割的连接物在溶酶体pH条件下，稳定持续12小时以上的情况下，连接物就被认为是不可切割的。不可切割的连接物的实例包括但不限于含有以下各项的组：胺类、硫化物类、三唑类、腙类、酰胺(酯)类、以及取代的或未被取代的烷类、烯类、芳香族化合物或杂环类、聚合物类、低聚乙二醇间隔物、和/或非天然的或化学修饰的氨基酸类。以下是若干普通方法的实例。该清单决不是完整的，并且很多其他方法是可能的。
[0175] 硫化物连接物具有例如R1-S-R2的形式。可以通过硫醇的烷化、或通过将在一个分子(例如肽)上的硫醇迈克尔加成到在第二分子(例如肽)上的活化的烯、或通过将在一个分子(如肽)上的硫醇自由基加成到第二分子(如肽)上的烯来制造这样的连接物。该硫化物连接物还可以被预形成为以下物质，例如：其中氨基和/或羧基官能团被适当保护的H2N-R1-S-R2-CO2H。这一类型的连接物是抗切割的，但是可以被用来特异性连接两种适当取代的并且被保护的肽。
[0176] 三唑连接物具体地可以是具有 形式的1，2，3-三嗪，其中R1和R2可以是任何化学实体，并且通过附接在第一肽的叠氮化物1，3-偶极加成到附接在第二肽的末端炔而制成。由Sharpless等人，在应用化学，41(14)，2596，(2002)中详细说明了这一化学作用，并且通常被称为”Sharpless点击化学作用“。制备了在第一肽链末端含有叠氮化物或炔官能团的第一肽。制备了第二肽，在该第二肽链末端具有炔(如果第一肽含有叠氮化物)或叠氮化物(如果第一肽含有炔)。然后在有或没有催化剂存在下，允许这两种肽在3+2环加成作用中反应，通过1，2，3-三嗪官能团连接这两种肽。
[0177] 可以用硫“点击“化学作用来形成连接物。制备了在第一肽链末端含有硫醇或烯官能团的第一肽。制备了第二肽，在该第二肽链末端具有烯(如果第一肽含有硫醇)或硫醇(如果第一肽含有烯)。允许这两种肽在光或自由基源存在下反应，通过硫化物官能团连接这两种肽。
[0178] 可以用迈克尔加成化学作用来形成连接物。虽然许多迈克尔受体与供者对可以用于这一目的，这一方法的一个优选实例是使用硫醇作为迈克尔供者以及活化的烯作为迈克尔受体。这一化学作用不同于以上的硫点击化学作用，因为烯需要成为缺电子的，并且自由基催化不是必需的。制备了在第一肽链末端含有硫醇或烯官能团的第一肽。制备了第二肽，在该第二肽链末端具有烯(如果第一肽含有硫醇)或硫醇(如果第一肽含有烯)。允许这两种肽在酸或碱的存在下反应，通过硫化物官能团连接这两种肽。
[0179] 在实施方案中，A和B；A和C，B和C，以及A、B、和C，每一个都包括具有不同MHC II结合谱的肽。DP、DQ以及DR是由独立的基因编码的蛋白质。在一个远交人群中，存在着大量的DP、DQ以及DR的变体(等位基因)，并且每一等位基因具有不同特征的肽结合。例如，特定的天然HLA-DP结合肽可以结合一些DP等位基因而不是其他基因。肽“结合谱(binding repertoire)”指代在DP、DQ和/或DR中发现的、单独的肽将结合其的等位基因的组合。肽和/或其结合所有DP、DQ和/或DR等位基因的组合(因此在高百分比的人群中(高达并且包括100％的人群中)产生记忆回忆应答)的鉴定提供了提高疫苗效率的手段。
[0180] 在实施方案中，优选的肽序列可以是能被T细胞识别的肽或蛋白质表位的序列。优选的肽序列包括获得自或衍生自以下项的那些MHC II结合肽：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒(EVB)、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒和/或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。优选的肽序列还包括包含获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子的MHC II结合肽的那些肽序列。这类传染因子包括细菌、原生动物、病毒等。受试者可能反复暴露于其的病毒包括但不限于，诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒以及柯萨奇病毒。受试者可能反复暴露于其的其他传染因子还提供在以上表1中。
[0181] 在实施方案中，MHC II结合肽包括具有与天然HLA-DP结合肽、天然HLA-DQ结合肽、和/或天然HLA-DR结合肽至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少97％、或甚至更优选至少99％一致性的肽。这类肽可以获得自或衍生自受试者已经反复暴露于其的传染因子。这类传染因子包括细菌、原生动物、病毒等。受试者可能反复暴露于其的病毒包括但不限于，诺罗病毒、轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、内源性逆转录病毒(ERV)、指环病毒/环状病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、腺病毒(ADV)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、卡波济氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、HTLV II、HTLV III、HTLV IV、多瘤病毒MC、多瘤病毒KI、多瘤病毒WU、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、细小病毒B19、麻疹病毒以及柯萨奇病毒。受试者可能反复暴露于其的其他传染因子还提供在以上表1中。在其他实施方案中，这类肽可以获得自或衍生自以下项：破伤风杆菌、乙型肝炎病毒、人疱疹病毒、流行性感冒病毒、痘苗病毒、EB病毒(EVB)、水痘病毒、麻疹病毒、劳氏肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腮腺炎病毒、白喉棒状杆菌、人腺病毒、天花病毒和/或传染性生物，该传染性生物能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对该传染性生物的人CD4+记忆细胞。在实施方案中，选择A、B、以及C，从而提供使用在实例中概述的一般策略的最佳免疫应答。
[0182] 在某些实施方案中，出于例如加工、配制的便利的目的和/或为了改善在生物系统中的递送，可能希望的是增加MHC II结合肽的水溶性。为此，可以通过添加亲水性N-和/或C-末端氨基酸、通过添加或修饰结合位点之间的氨基酸序列、或通过进行对结合位点氨基酸的置换来实现亲水性的增加。亲水性的增加，可以例如通过较低GRAVY-总平均亲水性(Grand Average of Hydropathy，GRAVY)得分进行测量。在可行的情况下，可以影响预期修饰的设计，从而避免、或限制潜在的对结合亲和力的负面影响。
[0183] 一个潜在的修饰途经是基于邻近结合位点表位的氨基酸的非结合位点氨基酸的添加，尤其是在如果那些旁侧氨基酸会增加该肽的平均或局部亲水性的情况下。就是说，如果在它的自然延长的序列中的结合位点表位两侧是N-或C-末侧的亲水性氨基酸，则在该肽中保留那些旁侧亲水性氨基酸中的一些可以增加其水溶性。在不存在可能增加溶解度的旁侧序列的情况下，或者在希望进一步增加亲水性的情况下，可以理想地在类似于自然序列的基础上进行非自然添加。可以通过如Blosum45或PAM250矩阵的指标或通过本领域已知的其他手段来判断氨基酸类似性。例如，如果表位具有-1.0的GRAVY得分并且在N-末端处表位前面有自然氨基酸序列EASF(GRAVY＝0.075)，则肽延长以包括EASF将会降低GRAVY得分。可替代地，对所述EASF前导序列的一个或多个置换，如用S置换A、用N置换S、或用Y置换F(例如，EASY，GRAVY＝-0.95)或截短和置换(例如，NY，GRAVY＝-2.4)也会提供增加的亲水性。
[0184] 在一些情况下，可能优选的是降低肽的水溶性，例如以改善亲水性载体基质中的截留。在此类情况下，可以进行类似于以上所述的、但是降低亲水性的添加和置换。
[0185] 可能进一步有利的是在一个或多个pH值处调整净肽电荷。例如，可以在肽的pI(等电位pH)下观察到最小溶解度。在其中希望具有在pH7.4的减小的溶解度以及在pH3.0的增加的溶解度的情况中，则可以进行氨基酸序列的修饰或添加以实现7.4的pI并且在pH3.0实现显著的净正电荷。在碱性肽的情况下，添加酸性残基(如E或D或用E置换K)是可以减小pI的示例性修饰。
[0186] 还可以使用本领域已知的技术通过添加或置换氨基酸或端-修饰基团来改善肽的生物或化学稳定性。实例包括但不限于：酰胺化和乙酰化，并且还可以包括如用L或其他对重排不太易感的氨基酸替换C-末端Q(Gln)的置换。
[0187] 在实施方案中，本发明涉及包括多肽的组合物，该多肽的序列包括具有与被提出为SEQ ID号：1-46、71-98、100-115以及119的氨基酸序列的任何之一并且优选地与结合在于此的别处描述的MHC II分子的多肽至少75％一致性的氨基酸序列。
[0188] NNFTVSFWLRVPKVSASHLET(SEQ ID号：1)(21，TT317557(950-969))；
[0189] TLLYVLFEV(SEQ ID号：2)(9，AdVhex64950(913-921))；
[0190] ILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：3)(15，TT27213(830-841))；
[0191] QSIALSSLMVAQAIPLVGEL(SEQ ID号：4)(20，DT52336(331-350))；
[0192] TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET(SEQ ID号：5)(30，AdVTT950)；
[0193] TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGI(SE Q号NO：6)(24，AdVTT830)；
[0194] ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQAIPLVGEL(SEQ ID号：7)(35，TT830DT)；
[0195] QSIALSSLMVAQAIPLVGELILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：8)(35，DTTT830)；
[0196] ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：9)(27，TT830DTtrunc)；
[0197] QSIALSSLMVAQAIILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：10)(29，DTtruncTT830)；
[0198] TLLYVLFEVPMGLPILMQYIKANSKFIGI(SE Q ID号：11)(29，AdVpmglpiTT830)；
[0199] TLLYVLFEVKVSVRILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：12)(29，AdVkvsvrTT830)；
[0200] ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：13)(32，TT830pmglpDTTrunc或TT830pDTt)；
[0201] ILMQYIKANSKFIGIKVSVRQSIALSSLMVAQ(SEQ ID 号 ：14)(32，TT830kvsvrDTTrunc1)；
[0202] TLLYVLFEVQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：15)(21，AdVDTt)；
[0203] TLLYVLFEVpmglpQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：16)(26，AdVpDTt)；
[0204] TLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：17)(26，AdVkDTt)；
[0205] TLLYVLFEVpmglp NNFTVSFWLRVPKVSASHLET(SE Q ID号：18)(35，AdVpTT950)；
[0206] TLLYVLFEVkvsvr NNFTVSFWLRVPKVSASHLET(SEQ ID号：19)(35，AdVkTT950)；
[0207] ILMQYIKANSKFIGI QSIALSSLMVAQTLLYVLFEV(SEQ ID号：20)(36，TT830DTtAdV)；
[0208] TLLYVLFEV ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：21)(36，AdVTT830DTt)；
[0209] QSIALSSLMVAQAIPLV(SEQ ID号：22)(17，DTt-3)；
[0210] IDKISDVSTIVPYIGPALNI(SE Q ID号：23)(20，TT632)
[0211] QSIALSSLMVAQAIPLVIDKISDVSTIVPYIGPALNI(SEQ ID号：24)(37，DTt-3TT632)；
[0212] IDKISDVSTIVPYIGPALNIQSIALSSLMVAQAIPLV(SEQ ID号：25)(37，TT632DTt-3)；
[0213] QSIALSSLMVAQAIPLVpmglpIDKISDVSTIVPYIGPALNI(SEQ ID 号：26)(43，DTt-3pTT632)；
[0214] IDKISDVSTIVPYIGPALNIpmglpQSIALSSLMVAQAIPLV(SEQ ID 号：27)(43，TT632pDTt-3)；
[0215] YVKQNTLKLAT(SEQ ID号：28)(11，minX)；
[0216] CYPYDVPDYASLRSLVASS(SEQ ID号：29)(19，7430)；
[0217] NAELLVALENQHTI(SEQ ID号：30)(14，31201t)；
[0218] TSLYVRASGRVTVSTK(SEQ ID号：31)(16，66325)；
[0219] EKIVLLFAIVSLVKSDQICI(SEQ ID号：32)(20，ABW1)；
[0220] QILSIYSTVASSLALAIMVA(SEQ ID号：33)(20，ABW2)；
[0221] MVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSI(SE Q ID号：34)(24，ABP)；
[0222] EDLIFLARSALILRGSV(SEQ ID号：35)(17，AAT)；
[0223] CSQRSKFLLMDALKLSIED(SEQ ID号：36)(19，AAW)；
[0224] IRGFVYFVETLARSICE(SEQ ID号：37)(14，IRG)；
[0225] TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL(SEQ ID号：38)(21，TFE)；
[0226] LIFLARSALILRkvsvrNAELLVALENQHTI(SEQ ID号：39)(31，AATk3120t)；
[0227] NAELLVALENQHTIkvsvrLIFLARSALILR(SEQ ID号：40)(31，3120tkAAT)；
[0228] ILSIYSTVASSLALAIkvsvrLIFLARSALILR(SE Q ID号：41)(33，ABW2kAAT)；
[0229] LIFLARSALILRkvsvrILSIYSTVASSLALAI(SEQ ID号：42)(33，AATkABW2)；
[0230] LIFLARSALILRkvsvrCSQRSKFLLMDALKL(SEQ ID号：43)(32，AATkAAW)；
[0231] CSQRSKFLLMDALKLkvsvrLIFLARSALILR(SEQ ID号：44)(32，AAWkAAT)；
[0232] TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL IRGFVYFVETLARSICE(SEQ ID号：45)(38，TFEIRG)；或[0233] IRGFVYFVETLARSICE TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL(SEQ ID号：46)(38，IRGTFE)[0234] 可以使用多种常规技术制造根据本发明的肽，特别是MHC II结合肽。在某些实施方案中，可以使用标准方法(例如在使用Merrifield(梅里菲尔德)树脂或类似树脂的固相支持物上合成)来合成制造这些肽。这可以使用或不使用针对这样的合成的而设计机器来完成。
[0235] 在替代的实施方案中，为了表达根据本发明的肽，尤其是MHC II结合肽，可以使用重组技术。在这样的实施方案中，将编码完整肽序列(以及连接物序列，如果适用的话)的核酸克隆到表达载体中，当转染到细胞系中时，该表达载体将被转录。在实施方案中，表达载体可以包括除其他之外的质粒、逆转录病毒、或腺病毒。可以使用标准分子生物学方法，例如通过使用聚合酶链式反应来产生DNA片段，然后将其纯化并克隆到表达载体中，然后转染到细胞系中，从而分离针对该肽(和连接基团，如果存在的话)的DNA。在实践本发明中有用的另外的技术可以在约翰威利父子公司的分子生物学中的现代实验室指南2007版(Current Protocols in Molecular Biology2007by John Wiley and Sons，Inc.)；澳大利亚墨尔本的彼得·麦卡勒姆癌症研究所的Joseph Sambrook的分子克隆：实验室手册(第三版)(A Laboratory Manual(Third Edition)Joseph Sambrook，Peter MacCallum Cancer Institute，Melbourne，Australia)；David Russell，德克萨斯大学西南医学中心，达拉斯，冷泉港实验室(David Russell，University of Texas Southwestern Medical Center，Dallas，Cold Spring Harbor)中找到。
[0236] 可以使用来自不同生物的细胞，例如CHO细胞、昆虫细胞(例如，用于杆状病毒表达)、大肠杆菌等，以多种方式来完成本发明的重组肽的生产。此外，为了得到最佳蛋白质翻译，可以修饰核酸序列以包括在细胞衍生于其的生物中普遍使用的密码子。例如，SEQ ID号：1-46包括获得自或衍生自破伤风类毒素、白喉毒素、以及腺病毒肽的序列的实例，并且SEQ ID号：47-68包括基于针对人类和大肠杆菌的优选密码子使用的等价DNA序列。使用针对在特定物种中的密码子使用而优化的DNA可以允许最佳的重组蛋白质生产。使用频率数据(如从不同密码子使用记录可得的数据)可以针对在人类中的使用而优化密码子频率。一个这样的记录是密码子使用数据库。Y.Nakamura等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态。(Codon usage tabulated from the international DNA seq uence databases：status for the year2000.)”核酸研究(Nucl.Acids Res.)28，292(2000年)。
[0237] 在实施方案中，本发明的组合物包括编码在此提供的肽的核酸。这样的核酸可以编码A、B、或C、或其组合。该核酸可以是DNA或RNA，如mRNA。在实施方案中，本发明的组合物包括互补物，如全长互补物，或在此提供的任何核酸的简并(由于遗传密码的简并性)。
[0238] 在实施方案中，该核酸编码A-x-B，其中x是酰胺连接物或肽连接物，A包括第一MHC II结合肽，并且B包括第二MHC II结合肽。另外，在实施方案中，该核酸编码A-x-B-y-C，其中x是酰胺连接物或肽连接物，y是酰胺连接物或肽连接物，A包括第一MHC II结合肽，B包括第二MHC II结合肽，并且C包括第三MHC II结合肽。
[0239] 以下列出了某些感兴趣的序列。天然序列是组合物1，(C1)。基于人类密码子使用频率的最佳人类序列是组合物2，(C2)。使用序列操作成套程序：用于分析和格式化蛋白质和DNA序列的JavaScript程序(The Sequence Manipulation Suite：JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences).生物技术(Biotechniques)28：1102-1104(bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)进行转换。
[0240] TT950：NNFTVSFWLRVPKVSASHLET(SEQ ID号：1)
[0241] C1：aataattttaccgttagcttttggttgagggttcctaaagtatctgctagtcatttagaa(SEQ ID号：47)AF154828250-309
[0242] C2(人类)：
[0243] aacaacttcaccgtgagcttctggctgagagtgcccaaggtgagcgccagccacctggagacc(SEQ ID号：48)
[0244] AdV：TLLYVLFEV(SEQ ID号：2)
[0245] C1：acgcttctctatgttctgttcgaagt(SE Q ID号：49)
[0246] FJ02593120891-20917
[0247] C2(人类)：
[0248] accctgctgtacgtgctgttcgaggtg(SEQ ID号：50)
[0249] TT830：ILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：3)
[0250] C1：attttaatgcagtatataaaagcaaattctaaatttataggtata(SEQ ID号：51)[0251] X062142800-2844
[0252] C2(人类)：
[0253] Atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc(SEQ ID号：52)
[0254] DT：QSIALSSLMVAQAIPLVGEL(SEQ ID号：4)
[0255] C1：caatcgatagctttatcgtctttaatggttgctcaagctataccattggtaggagagcta(SEQ ID号：53)
[0256] FJ8582721066-1125
[0257] C2(人类)：
[0258] cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctg(SEQ ID号：54)
[0259] 嵌合表位：
[0260] AdVTT950：TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET(SEQ ID号：5)
[0261] C2(人类)：
[0262] accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaacaacttcaccgtgagcttctggctgagagtgcccaaggtgagcgccagccacctggagacc(SEQ ID号：55)
[0263] AdVTT830：TLLYVLFEVILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：6)
[0264] C2(人类)：
[0265] accctgctgtacgtgctgttcgaggtgatcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc(SEQ ID号：56)
[0266] TT830DT：ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQAIPLVGEL(SEQ ID号：7)
[0267] C2(人类)：
[0268] atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctg(SEQ ID号：57)
[0269] DT TT830：QSIALSSLMVAQAIPLVGELILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：8)
[0270] C2(人类)：
[0271] cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatccccctggtgggcgagctgatcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc(SE Q ID号：58)
[0272] TT830DTtrunc：ILMQYIKANSKFIGIQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：9)
[0273] C2(人类)：
[0274] atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag(SEQ ID号：59)
[0275] DT trunc TT830：QSIALSSLMVAQAIILMQYIKANSKFIGI(SEQID号：10)
[0276] C2(人类)：
[0277] cagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccaggccatcatcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc(SE Q ID号：60)
[0278] 预测的嵌合组织蛋白酶切割的普遍表位
[0279] AdVpmglpTT830：TLLYVLFEVPMG.LPILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：11)
[0280] C1(大肠杆菌)：
[0281] accctgctgtatgtgctgtttgaagtgccgatgggcctgccgattctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcatt(SEQ ID号：61)
[0282] C2(人类)：
[0283] accctgctgtacgtgctgttcgaggtgcccatgggcctgcccatcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc(SE Q ID号：62)
[0284] AdVkvsvrTT830：TLLYVLFEVKVS.VRILMQYIKANSKFIGI(SEQ ID号：12)
[0285] C1(大肠杆菌)：
[0286] accctgctgtatgtgctgtttgaagtgaaagtgagcgtgcgcattctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcatt(SEQ ID号：63)
[0287] C2(人类)：
[0288] accctgctgtacgtgctgttcgaggtgaaggtgagcgtgagaatcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatc(SE Q ID号：64)
[0289] TT830pmglpDTtrunc：ILMQYIKANSKFIGIPMG.LPQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：13)[0290] C1(大肠杆菌)：
[0291] attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattccgatgggcctgccgcagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag(SE Q ID号：65)
[0292] C2(人类)：
[0293] atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatccccatgggcctgccccagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag(SEQ ID号：66)
[0294] TT830kvsvrDTtrunc：ILMQYIKANSKFIGIKVS.VRQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：14)[0295] C1(大肠杆菌)：
[0296] attctgatgcagtatattaaagcgaacagcaaatttattggcattaaagtgagcgtgcgccagagcattgcgctgagcagcctgatggtggcgcag(SE Q ID号：67)
[0297] C2(人类)：
[0298] atcctgatgcagtacatcaaggccaacagcaagttcatcggcatcaaggtgagcgtgagacagagcatcgccctgagcagcctgatggtggcccag(SEQ ID号：68)
[0299] 在实施方案中，肽连接物包括溶酶体蛋白酶切割位点(例如组织蛋白酶切割位点)。在某些实施方案中，编码肽连接物的核酸序列包括被提出为SEQ ID号：69或70的核酸序列，其简并或互补物。
[0300] ccgatgggcctacca(SEQ ID号：69)
[0301] aaggtctcagtgagaac(SE Q ID号：70)
[0302] 在实施方案中，由发明核酸编码的A、B和/或C具有与天然HLA-DP、HLA-DQ、或HLA-DR结合肽至少70％一致性。在某些实施方案中，由核酸编码的A、B和/或C具有与天然HLA-DP、HLA-DQ、或HLA-DR结合肽优选至少75％、更优选至少80％、仍更优选至少85％、仍更优选至少90％、仍更优选至少95％、仍更优选至少97％、或甚至仍更优选至少99％一致性。优选地，这类肽结合MHC II类分子。
[0303] 在实施方案中，因此核酸包括具有与编码天然HLA-DP、HLA-DQ、或HLA-DR结合肽的核酸序列至少60％一致性的核酸序列。在某些实施方案中，核酸具有与编码天然HLA-DP、HLA-DQ、或HLA-DR结合肽的核酸序列优选至少65％、更优选至少70％、仍更优选至少75％、仍更优选至少80％、仍更优选至少85％、仍更优选至少90％、仍更优选至少95％、仍更优选至少97％、或甚至仍更优选至少99％的一致性。优选地，这类核酸编码结合MHC II类分子的肽。
[0304] 可 以 使 用 可 以 通 过 网 络 (ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/)获 得 的、由NCBI(Bethesda(贝塞斯达)，Maryland(马里兰)开发的不同的、公开可得的软件工具计算一致性百分数。示例性的工具包括在http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov可得的BLAST系统。可以使用MacVector序列分析软件(牛津大学分子小组)获得配对和ClustalW比对(BLOSUM30矩阵建立)连同Kyte-Doolittle亲水分析。本发明还包含以上核酸的沃森-克里克互补物(Watson-Crick complements)(包括全长互补物)。
[0305] 在此还提供的是与在此提供的任何核酸杂交的核酸。可以使用标准核酸杂交工序来鉴定具有所选择的一致性百分数的有关核酸序列。如在此所使用，术语“严紧条件”指代本领域所熟悉的参数。这类参数包括盐、温度、探针长度等。在杂交时，生成的碱基错配的量的范围可以从接近0％(“高严紧性”)至约30％(“低严紧性”)。高严紧性条件的一个实例是在65℃下在杂交缓冲液(3.5X SSC、0.02％聚蔗糖(Ficoll)、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中的杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；并且EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，例如在室温下于2X SSC中并且随后在达到68℃的温度下于0.1-0.5XSSC/0.1X SDS中，洗涤其上转移了该核酸的膜。
[0306] 在实施方案中，可以将核酸可操作地连接至启动子。可以使用原核调控区来完成在原核宿主中的表达。可以使用真核调控区来完成在真核宿主中的表达。通常，这样的区域将包括足以指导RNA合成的起始的启动子区域。在实施方案中，该核酸可以进一步包括转录和翻译调控序列，这取决于宿主的性质。转录和翻译调控信号可以获得自或衍生自病毒来源，如逆转录病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、猴病毒等等。
[0307] 在实施方案中，将核酸插入载体中，该载体能够将所希望的序列整合到宿主细胞染色体中。对于mRNA的最佳合成，可能还需要另外的元件。这些元件可以包括剪接信号、连同转录启动子、增强子、以及终止信号。
[0308] 在实施方案中，将核酸合并到在接受宿主中能够自主复制的质粒或病毒载体中。为了这一目的，可以使用多种多样的载体中的任何一种，如原核载体和真核载体。真核载体可以是病毒载体。例如，而不通过限制的方式，载体可以是痘病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体或许多逆转录病毒载体中的任何一种。病毒载体包括DNA或RNA病毒以引起插入DNA或插入RNA的表达。
[0309] 可以通过多种合适的手段中的任何一种(即转化、转染、共轭、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射法等等)将载体或其他构建体引入到适当的宿主细胞中。另外，可以直接将DNA或RNA注射到细胞中，或者在被粘附到微颗粒或纳米颗粒(例如在此提供的合成纳米载体)上以后使其推进穿过细胞膜。
[0310] D.发明剂型和有关方法
[0311] 在实践中有用的抗原和组合物可以选自有关的靶标，包括在别处说明的传染性和非传染性生物。抗原和组合物可以获得自或衍生自彼此共同的“自身”(例如，自身抗原和自身组合物)或“非自身”(例如，源于传染性生物的抗原和组合物)来源。
[0312] 应当理解，可以按任何合适的方式制造本发明的这些剂型，并且本发明绝不局限于可以使用在此说明的方法产生的剂型。适当方法的选择可能需要注意被关联的特定部分的特性。
[0313] 可以通过以下多种给予途经，包括但不限于：静脉内、肠胃外(例如皮下、肌内、静脉内、或皮内)、肺、舌下、口腔、鼻内、经鼻、粘膜内、经粘膜、直肠、眼、经皮、经真皮、或通过这些途经的组合，来给予本发明的剂型。
[0314] 在此说明的剂型和方法可以用来诱导、增强、抑制、指导、或重定向免疫应答。在此说明的剂型和方法可以用于预防和/或治疗多种病状，例如癌症、传染病、代谢病、退行性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、免疫疾病、或其他病症和/或病状。在此说明的剂型和方法还可以用于治疗成瘾，例如对尼古丁或麻醉剂的成瘾。在此说明的剂型和方法还可以用于预防和/或治疗由于暴露于毒素、有害物质、环境毒素、或其他有害因子而导致的病状。在此说明的剂型和方法还可以用来诱导或增强T细胞增殖或细胞因子产生，例如当使在此提供的剂型在体内或体外与T细胞接触时。在一个实施方案中，发明剂型可以与共轭物、或非共轭物、疫苗一起给予。
[0315] 根据本发明，剂型的剂量含有变化量的合成纳米载体和/或变化量的抗原和/或肽。本发明的剂型中存在的合成纳米载体和/或抗原和/或肽的量可以根据这些抗原和/或肽的性质、待完成的疗效、以及其他此类参数而改变。在实施方案中，可以进行剂量范围研究以建立待存在于剂型中的合成纳米载体的最佳治疗量以及抗原和/或肽的量。在实施方案中，合成纳米载体以及抗原和/或肽在剂型中是以在给予受试者时有效产生对抗原的免疫应答的量存在的。有可能在受试者中使用常规剂量范围研究和技术来确定有效产生免疫应答的量。可以在多种频率下给予发明剂型。在实施方案中，该剂型的至少一次给予足以产生药理学上相关的应答。在另外的实施方案中，利用该剂型的至少两次给予、至少三次给予、或至少四次给予来确保药理学上相关的应答。
[0316] 在实施方案中，剂型可包括混合的抗原和/或组合物。在其他实施方案中，抗原和/或组合物中的之一或两者可以偶联(共价或非共价地)到载体上。
[0317] 在实施方案中，组合物和/或抗原可以与载体肽或蛋白质、或者与彼此共价或非共价结合。有用的载体包括已知在偶联疫苗中有用的载体蛋白，包括但不限于：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素的无毒突变体、CRM197、来自B群脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白复合体、以及钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)。其他载体可以包括在别处说明的合成纳米载体、以及可能常规已知的其他载体。
[0318] 可以使用常规的共价或非共价偶联技术进行偶联。对于在共轭的或常规的疫苗中利用列举的组合物的有用技术包括但不限于通常描述在以下文献中的那些，即：MD Lairmore等人，“嵌合和多价构建体中的具有混杂T细胞表位的人T嗜淋巴细胞病毒1型肽增强免疫原性并且克服遗传限制(Human T-lymphotropic virus type1peptides in chimeric and multivalent constructs with promiscuous T-cell epitopes enhance immunogenicity and overcome genetic restriction).”病毒学杂志(J Virol).10月；69(10)：6077-89(1995年)；CW Rittershause等人，“疫苗诱导的抗体在体内抑制CETP活性并且降低动脉粥样硬化的兔模型中的主动脉病变(Vaccine-induced antibodies inhibit CETP activity in vivo and reduc eaortic lesions in a rabbit model of atherosclerosis).”动脉粥样硬化、血栓和血管生物学(Arterioscler Thromb Vasc Biol).9月；20(9)：2106-12(2000年)；MV Chengalvala等人，“通过插入来自破伤风类毒素的辅助T细胞表位增强乙型肝炎表面抗原的免疫原性(Enhanced immunogenicity of hepatitis B surface antigen by insertion of a helper T cell epitope from tetanus toxoid).”疫苗(Vaccine).3月5日；17(9-10)：1035-41(1999年)；NK Dakappagari等人，“嵌合多人表皮生长因子受体-2B细胞表位肽疫苗介导优异的抗肿瘤应答(A chimeric multi-human epidermal growth factor receptor-2B cell epitope peptide vaccine mediates superior antitumor responses).”免疫学杂志(J Immunol.)4月15日；170(8)：
4242-53(2003年)；JT Garrett等人“新型工程化的曲妥珠单抗构象表位在体外和体内展示针对HER-2/neu的抗肿瘤特性(Novel engineered trastuzumab conformational epitopes demonstrate in vitro and in vivo antitumor properties against HER-2/neu).”免疫学杂志.6月1日；178(11)：7120-31(2007年)。
4242-53(2003年)；JT Garrett等人“新型工程化的曲妥珠单抗构象表位在体外和体内展示针对HER-2/neu的抗肿瘤特性(Novel engineered trastuzumab conformational epitopes demonstrate in vitro and in vivo antitumor properties against HER-2/neu).”免疫学杂志.6月1日；178(11)：7120-31(2007年)。
[0319] 在实施方案中，该剂型可包括偶联至一种类型的载体的抗原，而组合物偶联至另一种类型的载体上。例如，抗原可以偶联至一个群体的合成纳米载体，而列举的组合物可以偶联至另一个群体的合成纳米载体。在这类实施方案中，这两个群体的合成纳米载体可以结合形成完整的剂型。在另一个实施方案中，抗原共价偶联至载体蛋白，组合物偶联至合成纳米载体，并且该偶联抗原的蛋白质和偶联组合物的合成纳米载体结合形成完整的剂型。其他此类组合同样是可能的。
[0320] 在其他实施方案中，本发明的剂型可以在媒介物中配制，包括与常规疫苗一起配制以形成可注射混合物。可以使用常规药学制造和配制技术制造这些混合物，以实现有用的剂型。适合用于实践本发明的技术可以在多个来源中找到，这些来源包括但不限于：M.F.Powell等人，疫苗设计(Vaccine Design)，1995年施普林格出版社(Springer-Verlag publ.)；或L.C.Paoletti等人编辑，疫苗：从概念到临床(Vaccines：from Concept to Clinic).用于人类使用的疫苗的开发和临床测试指导(A Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccines for Human Use)1999年CRC出版社出版。
[0321] 在实施方案中，该剂型可以包括偶联至抗原或组合物中的之一或两者的合成纳米载体。根据本发明，可以使用各种各样的合成纳米载体。在一些实施方案中，合成纳米载体是球体或扁球体。在一些实施方案中，合成纳米载体是扁平的或盘状的。在一些实施方案中，合成纳米载体是立方体或立方形的。在一些实施方案中，合成纳米载体是卵形或椭圆形的。在一些实施方案中，合成纳米载体是圆柱体、椎体、或锥形。
[0322] 在一些实施方案中，希望使用一群在大小、形状、和/或构成方面较一致的合成纳米载体，这样使得每一合成纳米载体具有类似特性。例如，基于合成纳米载体的总数而言，至少80％、至少90％、或至少95％的合成纳米载体可以具有归属在合成纳米载体的平均直径或平均尺寸的5％、10％或20％之内的最小尺寸或最大尺寸。在一些实施方案中，一群合成纳米载体就大小、形状、和/或构成而论可以是不均匀的。
[0323] 合成纳米载体可以是实心的或空心的，并且可以包括一个或多个层。在一些实施方案中，每一层相对于其他一层或多层具有独特的构成和独特的特性。为了作为实例给出，合成纳米载体可以具有核/壳结构，其中核是一层(例如聚合物核)并且壳是第二层(例如脂质双层或单层)。合成纳米载体可以包括多个不同的层。
[0324] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以可任选地包括一种或多种脂质。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括脂质体。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括脂质双层。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括脂质单层。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括微胶粒。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括核，该核包括被脂质层(例如脂质双层、脂质单层等)环绕的聚合物基质。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括被脂质层(例如脂质双层、脂质单层，等)环绕的非聚合物核(例如金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒、骨颗粒、病毒颗粒、蛋白质、核酸、碳水化合物，等)。
[0325] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括一种或多种聚合物。在一些实施方案中，这样的聚合物可被包被层(例如脂质体、脂质单层、微胶粒等)环绕。在一些实施方案中，合成纳米载体的不同元件可以与该聚合物偶联。
[0326] 在一些实施方案中，免疫特征表面、靶向部分、寡核苷酸和/或其他元件可以与聚合物基质共价缔合。在一些实施方案中，共价缔合是由连接物介导的。在一些实施方案中，免疫特征表面、靶向部分、寡核苷酸和/或其他元件可以与聚合物基质非共价缔合。例如，在一些实施方案中，免疫特征表面、靶向部分、寡核苷酸和/或其他元件可以被封装在聚合物基质内、被聚合物基质环绕、和/或被分散遍及聚合物基质。可替代地或另外地，免疫特征表面、靶向部分、寡核苷酸和/或其他元件可以通过疏水性相互作用、电荷相互作用、范德华力等与聚合物基质关联。
[0327] 各种各样的聚合物以及用于从此形成聚合物基质的方法是常规已知的。通常，聚合物基质包括一种或多种聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包括两种或更多种单体的共聚物。在序列方面，共聚物可以是随机的、嵌段的，或者包括随机序列与嵌段序列的组合。典型地，根据本发明的聚合物是有机聚合物。
[0328] 适合用于本发明的聚合物的实例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如，聚(1，3-二噁烷-2-酮))、聚酐(如聚(癸二酸酐))、聚丙基富马酸酯(polypropylfumerates)、聚酰胺(如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己酸内酯、多羟基酸(例如，聚(β-羟基链烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、以及聚胺、聚赖氨酸、聚赖氨酸-PEG共聚物、和聚(亚乙基亚胺)、聚(亚乙基亚胺)-PEG共聚物。
[0329] 在一些实施方案中，根据本发明的聚合物包括已由美国食品和药物管理局(FDA)按照21C.F.R.§177.2600批准在人体中使用的聚合物，这些聚合物包括但不限于聚酯(例如，聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己酸内酯、聚戊酸内酯、聚(1，3-二噁烷-2-酮))；聚酐(例如，聚(癸二酸酐))；聚醚(例如，聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯。
[0330] 在一些实施方案中，聚合物可以是亲水性的。例如，聚合物可以包括阴离子基团(例如磷酸根、硫酸根、羧酸根)；阳离子基团(例如季胺基团)；或极性基团(例如羟基基团、硫醇基团、胺基团)。在一些实施方案中，包括亲水性聚合物基质的合成纳米载体在该合成纳米载体内产生亲水环境。在一些实施方案中，聚合物可以是疏水性的。在一些实施方案中，包括疏水性聚合物基质的合成纳米载体在该合成纳米载体内产生疏水环境。聚合物亲水性或疏水性的选择可以影响并入(例如偶联的)合成纳米载体内的材料的性质。
[0331] 在一些实施方案中，聚合物可以用一个或多个部分和/或官能团修饰。根据本发明，可以使用多个部分或官能团。在一些实施方案中，可以用聚乙二醇(PEG)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖类的非环状聚缩醛来修饰聚合物(Papisov，2001，ACS研讨会丛刊，786：301)。可以使用Gref等人的美国专利号5543158、或Von Andrian等人的WO公开案WO2009/051837中的一般传授内容进行某些实施方案。
[0332] 在一些实施方案中，可以用脂质或脂肪酸基团修饰聚合物。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、或廿四烷酸中的一种或多种。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是棕榈烯酸、油酸、异油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、或芥酸中的一种或多种。
[0333] 在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，这些共聚物包括乳酸和乙醇酸单元(如乳酸-乙醇酸共聚物)和丙交酯-乙交酯共聚物，在此统称为“PLGA”；以及均聚物，这些均聚物包括乙醇酸单元，在此称为“PGA”，以及乳酸单元(如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯，聚-D-丙交酯、以及聚-D，L-丙交酯)，在此统称为“PLA”。在一些实施方案中，示例性的聚酯包括，例如多羟基酸；PEG共聚物和丙交酯与乙交酯的共聚物(例如PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物)，以及它们的衍生物。在一些实施方案中，聚酯包括例如聚(己内酯)、聚(己内酯)-PEG共聚物、L-丙交酯-L-赖氨酸共聚物、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]，以及它们的衍生物。
[0334] 在一些实施方案中，聚合物可以是PLGA。PLGA是生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多种形式的PLGA特征在于乳酸∶乙醇酸的比率。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸、或D，L-乳酸。可以通过改变乳酸∶乙醇酸的比率调整PLGA的降解速率。在一些实施方案中，根据本发明有待使用的PLGA特征在于大约85∶15、大约75∶25、大约60∶40、大约50∶50、大约40∶60、大约25∶75、或者大约15∶85的乳酸∶乙醇酸比率。
[0335] 在一些实施方案中，聚合物可以是一种或多种丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯、以及包括一种或多种以上聚合物的组合。该丙烯酸聚合物可以包括具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。
[0336] 在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子型聚合物。通常，阳离子型聚合物能够缩合和/或保护核酸(例如DNA、或它的衍生物)的带负电的链。含有胺的聚合物(例如聚(赖氨酸)(Zauner等人，1998，先进药物递送综述(Adv.Drug Del.Rev.)，30：97；以及Kabanov等人，1995，生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)，6：7)、聚(亚乙基亚胺)(PEI；Boussif等人，1995，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，1995，92：7297)、以及聚(酰胺胺)树枝状聚合物(Kukowska-Latallo等人，1996，美国科学院院刊，93：4897；Tang等人，1996，生物共轭化学，7：703；以及Haensler等人，1993，生物共轭化学，4：372)在生理pH下是带正电的，在多种细胞系中与核酸形成离子对，并且介导转染。在实施方案中，本发明的合成纳米载体可以不包括(或可以排除)阳离子型聚合物。
[0337] 在一些实施方案中，聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯(Putnam等人，1999，大分子，32：3658；Barrera等人，1993，美国化学会志，115：11010；Kwon等人，1989，大分子，22：3250；Lim等人，1999，美国化学会志，121：5633；以及Zhou等人，1990，大分子，23：3399)。这些聚酯的实例包括L-丙交酯-L-赖氨酸共聚物(Barrera等人，1993，美国化学会志，115：11010)、聚(丝氨酸酯)(Zhou等人，1990，大分子，23：3399)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等人，1999，大分子，32：3658；以及Lim等人，1999，美国化学会志，121：5633)、以及聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等人，1999，大分子，32：3658；以及Lim等人，1999，美国化学会志，121：5633)。
[0338] 这些和其他聚合物的特性以及用于制备它们的方法在本领域中是熟知的(参见，例如美国专利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；
5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；Wang等人，2001，美国化学会志，
123：9480；Lim等人，2001，美国化学会志，123：2460；Langer，2000，化学研究评述，33：
94；Langer，1999，控释杂志，62：7；以及Uhrich等人，1999，化学评论，99：3181)。更一般地，多种用于合成某些合适的聚合物的方法描述在聚合物科学与聚合胺和铵盐简明百科全书(Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts)，Goethals编辑，培格曼出版社，1980；Odian的聚合原理(Principles of Polymerization)，约翰威利父子公司，第四版，2004；Allcock等人的当代聚合物化学(Contemporary Polymer Chemistry)，Prentice-Hall，1981；Deming等人，1997，自然，390：
386；以及在美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446、以及6,818,732中。
5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；Wang等人，2001，美国化学会志，
123：9480；Lim等人，2001，美国化学会志，123：2460；Langer，2000，化学研究评述，33：
94；Langer，1999，控释杂志，62：7；以及Uhrich等人，1999，化学评论，99：3181)。更一般地，多种用于合成某些合适的聚合物的方法描述在聚合物科学与聚合胺和铵盐简明百科全书(Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts)，Goethals编辑，培格曼出版社，1980；Odian的聚合原理(Principles of Polymerization)，约翰威利父子公司，第四版，2004；Allcock等人的当代聚合物化学(Contemporary Polymer Chemistry)，Prentice-Hall，1981；Deming等人，1997，自然，390：
386；以及在美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446、以及6,818,732中。
[0339] 在一些实施方案中，聚合物可以是线型聚合物或支化聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是树枝状聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是基本上彼此交联的。在一些实施方案中，聚合物可以基本上不交联。在一些实施方案中，聚合物可以根据本发明进行使用而不经过交联步骤。进一步理解的是，本发明的合成纳米载体可以包括嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何以上及其他聚合物的加合物。本领域的那些技术人员将认识到，在此列出的聚合物代表根据本发明可以使用的聚合物的示例性的、而不是全面的清单。
[0340] 在一些实施方案中，合成纳米载体不包括聚合组分。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包括金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物合成纳米载体是非聚合组分的聚集体，如金属原子(例如金原子)的聚集体。
[0341] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以可任选地包括一种或多种两亲实体。在一些实施方案中，两亲实体可以促进具有增加的稳定性、改进的均匀性、或增加的粘度的合成纳米载体的产生。在一些实施方案中，两亲实体可以与脂质膜(例如脂质双层、脂质单层等)的内部表面关联。在本领域中已知的许多两亲实体可以适合用于制造根据本发明的合成纳米载体。这类两亲实体包括但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；二油烯基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)；二油烯基氧丙基三乙基铵(DOTMA)；二油酰基磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂酰基甘油(DPPG)；十六烷醇；脂肪醇(例如聚乙二醇(PEG))；聚氧乙烯-9-月桂基醚；表面活性脂肪酸(例如棕榈酸或油酸)；脂肪酸；脂肪酸甘油单酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯( 85)甘氨胆酸酯；脱水山梨糖醇单月桂酸酯( 20)；聚山梨醇酯20( 20)；聚山梨醇酯60( 60)；聚山梨醇酯65(
65)；聚山梨醇酯80( 80)；聚山梨醇酯85( 85)；聚氧乙烯单硬脂酸
酯；表面活性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脱水山梨糖醇三油酸酯)；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；双十六烷基磷酸酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰基棕榈酸酯；蓖麻油酸甘油酯；十八酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂特性的合成的和/或天然的洗涤剂；脱氧胆酸酯；环糊精；离液序列高的盐；
离子对试剂；以及它们的组合。两亲实体组分可以是不同两亲实体的混合物。本领域的那些技术人员将认识到，这是具有表面活性剂活性的物质的示例性的、而不是全面的清单。在有待根据本发明使用的合成纳米载体的产生中，可以使用任何两亲实体。
65)；聚山梨醇酯80( 80)；聚山梨醇酯85( 85)；聚氧乙烯单硬脂酸
酯；表面活性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脱水山梨糖醇三油酸酯)；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；双十六烷基磷酸酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙酰基棕榈酸酯；蓖麻油酸甘油酯；十八酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂特性的合成的和/或天然的洗涤剂；脱氧胆酸酯；环糊精；离液序列高的盐；
离子对试剂；以及它们的组合。两亲实体组分可以是不同两亲实体的混合物。本领域的那些技术人员将认识到，这是具有表面活性剂活性的物质的示例性的、而不是全面的清单。在有待根据本发明使用的合成纳米载体的产生中，可以使用任何两亲实体。
[0342] 在一些实施方案中，合成纳米载体可以可任选地包括一种或多种碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物包括单糖或二糖，包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神经氨酸。在某些实施方案中，碳水化合物是多糖，包括但不限于：支链淀粉、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基纤维素(HC)、甲基纤维素(MC)、葡聚糖、环葡聚糖、糖原、羟乙基淀粉、卡拉胶、多聚糖(glycon)、直链淀粉、壳聚糖、N，O-羧甲基壳聚糖、藻胶和海藻酸、淀粉、甲壳质、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明质酸、凝胶多糖、以及黄原胶。在实施方案中，本发明的合成纳米载体并不包括(或特异性排除)碳水化合物，如多糖。在某些实施方案中，该碳水化合物可以包括碳水化合物衍生物，如糖醇，包括但不限于：甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、以及乳糖醇。
[0343] 根据本发明的组合物可以包括与药学上可接受的赋形剂，如防腐剂、缓冲剂、盐水、或磷酸盐缓冲盐水结合的发明合成纳米载体或疫苗构建体。可以使用常规药学制造和配制技术制造该组合物，以实现有用的剂型。在一个实施方案中，将发明合成纳米载体悬浮在无菌盐水中，用于与防腐剂一起注射。在实施方案中，典型的发明组合物可以包括赋形剂，这些赋形剂包括无机或有机缓冲剂(例如磷酸、碳酸、乙酸、或柠檬酸的钠盐或钾盐)和pH调节剂(例如盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸或乙酸的盐、氨基酸和它们的盐)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如聚山梨醇20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧胆酸钠)、溶液和/或低温/冻干稳定剂(例如蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如盐类或糖类)、抗细菌剂(例如苯甲酸、苯酚、庆大霉素)、防沫剂(例如聚二甲基硅酮)、防腐剂(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、EDTA)、聚合物稳定剂和粘度调节剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)、以及共溶剂(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。
[0344] 可以使用多种方法将根据本发明的MHC II结合肽封装到合成纳米载体中，这些方法包括但不限于：C.Astete等人，“PLGA纳米载体的合成和表征(Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles)”生物材料科学杂志，聚合物版(J.Biomater. Sci.Polymer Edn)，第7卷，第3期，第247-289页(2006年)；K.Avgoustakis“聚乙二醇化的聚(丙交酯)和乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒：制备、特性以及在药物递送中的可能 应 用 (Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in Drug Delivery)”近期药物递送(Current Drug Delivery)1：321-333(2004年)；C.Reis等人，“纳米封装I.载药的聚合物纳米颗粒的制备方法(Nanoencapsulation I.Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles)”纳米医学2：8-21(2006年)。可以使用其他适合于将如肽的物质封装到合成纳米载体中的方法，包括但不限于披露在Unger的美国专利
6,632,671(10月14日，2003年)中的方法。在另一个实施方案中，MHC II结合肽可以被吸附到合成纳米载体的表面上，如在M.Singh等人，“阴离子微粒是用于来自脑膜炎奈瑟菌血清型B的重组抗原的有效递送系统(Anionic microparticles are a potent delivery system for recombinant antigens fromNeisseria meningitidis serotype B.)”药物科学杂志(J Pharm Sci.)2月；93(2)：273-82(2004年)中大体描述的。
6,632,671(10月14日，2003年)中的方法。在另一个实施方案中，MHC II结合肽可以被吸附到合成纳米载体的表面上，如在M.Singh等人，“阴离子微粒是用于来自脑膜炎奈瑟菌血清型B的重组抗原的有效递送系统(Anionic microparticles are a potent delivery system for recombinant antigens fromNeisseria meningitidis serotype B.)”药物科学杂志(J Pharm Sci.)2月；93(2)：273-82(2004年)中大体描述的。
[0345] 在实施方案中，根据本发明的剂型可以包括佐剂。在实施方案中，发明剂型可以包括可包含佐剂的疫苗。在别处说明了在实践本发明中有用的不同类型的佐剂。如在别处说明的那样，发明剂型的MHC II结合肽可以被共价地或非共价地偶联到抗原和/或佐剂上，或者它们可以与抗原和/或佐剂混合。在别处说明了用于偶联或混合物质的一般技术；这样的技术可以适用于将发明组合物的MHC II结合肽偶联到这些抗原和/或佐剂上，或者与这些肽与抗原和/或佐剂混合。对于可利用的共价共轭方法的详细说明，参见Hermanson G T“生物共轭技术(Bioconjugate Techniques)”第二版，由学术出版社出版，2008年。除共价附接之外，还可以通过吸附到预形成的载体，如合成纳米载体上，或通过在载体，如合成纳米载体形成过程中进行封装来完成偶联。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物被偶联到合成纳米载体上，这些载体又偶联到抗原和/或佐剂上。
[0346] 可以使用本领域已知的各种各样的方法来制备合成纳米载体。例如，可以通过以下方法形成合成纳米载体：纳米沉淀、使用流体通道的流动聚焦、喷雾干燥、单和双乳液溶剂挥发、溶剂萃取、相分离、研磨、微乳液工序、微加工、纳米加工、牺牲层、简单的和复杂的凝聚、以及本领域的普通技术人员熟知的其他方法。可替代地或另外地，已经描述了用于单分散的半导体、导电性的、磁性的、有机的、以及其他纳米材料的水性和有机溶剂合成(Pellegrino等人，2005，Small，1：48；Murray等人，2000，材料科学年评(Ann.Rev.Mat.Sci.)，30：545；以及Trindade等人，2001，化学材料(Chem.Mat.)，13：3843)。在文献中已经说明了另外的方法(参见，例如Doubrow编辑，“医药中的微胶囊和纳米颗 粒 (Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy)，”CRC 出 版社，Boca Raton，1992；Mathiowitz等人，1987，控释杂志，5：13；Mathiowitz等人，1987，反应性聚合物(Reactive Polymers)，6：275；以及Mathiowitz等人，1988，应用聚合物科学杂志(J.Appl.Polymer Sci.)，35：755，以及还有美国专利5578325和6007845)；
P.Paolicelli等人“可以有效缔合并递送病毒样颗粒的表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles)”.纳米医学.5(6)：843-853(2010年))。
P.Paolicelli等人“可以有效缔合并递送病毒样颗粒的表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles)”.纳米医学.5(6)：843-853(2010年))。
[0347] 可以使用多种方法如按希望的将各种材料封装到合成纳米载体中，这些方法包括但不限于：C.Astete等人，“PLGA纳米载体的合成和表征(Synthesis and characterization ofPLGA nanoparticles)”生物材料科学杂志，聚合物版(J.Biomater.Sci.Polymer Edn)，第7卷，第3期，第247-289页(2006年)；K.Avgoustakis“聚乙二醇化的聚(丙交酯)和乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒：制备、特性以及在药物递送中的可能 应 用 (Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in Drug Delivery)”近期药物递送(Current Drug Delivery)1：321-333(2004年)；C.Reis等人，“纳米封装I.载药的聚合物纳米颗粒的制备方法(NanoencapsulationI.Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles)”纳米医学2：8-21(2006年)；P.Paolicelli等人“可以有效缔合并递送病毒样颗粒的表面修饰的基于PLGA的纳米颗粒(Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles)”.纳米医学.5(6)：843-853(2010年))。可以使用其他适合于将如寡核苷酸的材料封装到合成纳米载体中的方法，包括但不限于披露在Unger的美国专利6,632,671(10月14日，2003年)中的方法。
[0348] 在某些实施方案中，通过纳米沉淀工艺或喷雾干燥来制备合成纳米载体。可以改变在制备合成纳米载体中使用的条件以产生具有希望的大小和特性(例如疏水性、亲水性、外部形态学、“粘性”、形状等)的颗粒。制备合成纳米载体的方法和使用的条件(例如溶剂、温度、浓度、空气流速等)可以取决于有待偶联到合成纳米载体上的物质和/或该聚合物基质的构成。
[0349] 如果通过以上任何方法制备的颗粒具有在希望的范围之外的大小范围，则可以例如使用筛子进行大小分类。
[0350] 应当理解可以按任何合适的方式制造本发明的这些组合物，并且本发明绝不局限于可以使用在此说明的方法产生的组合物。适当方法的选择可能需要注意被关联的特定部分的特性。
[0351] 在一些实施方案中，在无菌条件下制造发明剂型，或将其最终灭菌。这可以确保生成的剂型是无菌的并且非传染性的，因此当与有菌组合物比较时提高了安全性。这提供了有价值的安全措施，特别是当接受剂型的受试者具有免疫缺陷、正在遭受传染、和/或对传染易感时。在一些实施方案中，发明剂型可以被冻干并储存在悬浮液中或作为冻干粉末而储存，这取决于针对不丧失活性的延长时段的配制策略。
[0352] 实例
[0353] 通过参考以下实例，本发明将更易于理解，包括这些实例仅为了描述本发明的某些方面和实施方案，而不是作为限制。
[0354] 本领域的那些技术人员将理解的是，可以配置刚说明的实施方案的不同改编和修改，而不偏离本发明的范围和精神。以众多具体的模式并且根据在此描述的本发明的说明，可以由本领域的一位技术人员应用在本领域已知的其他适合的技术和方法。
[0355] 因此，应当理解的是，可以不同于如在此具体说明来实践本发明。以上描述旨在是说明性的，而不是限制性的。在回顾以上描述时，许多其他实施方案对于本领域的那些技术人员而言将是显而易见的。因此，应当参考随附的权利要求、连同赋予这样的权利要求的等同物的全范围来确定本发明的范围。
[0356] 实例1：产生通用记忆肽
[0357] 为了产生嵌合肽，使用免疫表位数据库(IEDB)(immuneepitope.org)T细胞表位预测工具进行II类表位预测。对于每种肽，该预测工具产生针对三种方法(ARB、SMM_align以及Sturniolo)中的每一种的百分等级。此等级是通过比较这些肽的得分与选自SWISSPROT数据库的五百万随机15mers的得分而产生的。然后这三种方法的百分等级的中位数被用来产生一致法的等级。使用衍生自或获得自不同来源的序列，可以产生有待使用一致法评估的肽，这些来源包括受试者已经反复暴露于其或者能够传染人类并且在传染开始之后产生特异性针对传染性生物的人CD4+记忆细胞的传染性生物。在别处已经说明了这样的传染性生物的实例。
[0358] 在一个具体的实施方案中，从破伤风毒素、白喉毒素或腺病毒中选择单独的蛋白质和肽表位，并且分析这些表位以鉴定预测的HLA-DR和HLA-DP表位。对于整个蛋白质分析，在一致等级(预测的高亲和力结合剂)，以及跨HLA-DR等位基因的宽覆盖度的基础上选择HLA-DR预测表位。另外，选择被预测是针对HLA-DP0401和DP0402的高亲和力结合剂的表位。选择针对DP的这2个等位基因是因为发现它们在北美人群中占有高百分比(大约75％)。基于来自单独的表位的结果，在某些实施方案中，产生了将给出预测的最宽覆盖度、以及高亲和力结合的嵌合肽。参见图1和图2。如在图1中所示，与只具有A或B但不是这二者的组合物相比，可以产生具有更宽的预测覆盖度和更高亲和力结合的具有A-x-B形式的组合物。
[0359] 在一些情况下，在肽的接合处插入组织蛋白酶切割位点。合成嵌合肽(GenScript(金斯瑞生物科技有限公司))并且再悬浮于水中，备用。
[0360] 虽然以上说明的具体实施方案用来生产包括HLA-DR和HLA-DP结合肽的优化组合物，相同的技术可以用来生产包括HLA-DQ结合肽的优化组合物。
[0361] 实例2：核心氨基酸序列评估
[0362] 已经通过截短分析针对核心结合表位评估了HLA-DP和HLA-DR特异性表位两者(1，2)。已经发现，对于特异性HLA-II类蛋白有选择性的核心氨基酸序列在一些表位中是共有的。这样的一个实例是已经鉴定的构成针对HLA-DP4的肽结合特异性的超型的共同核心结合结构(3)。有可能的是，这些核心氨基酸保持允许高亲和力结合的结构构型。其结果是，有可能置换具有类似化学性质的非核心区氨基酸而不抑制结合II类的能力(4)。这可以使用置换分析法并且然后使用表位结合预测程序用实验方法来显示。为了进行该分析，引入了单独的氨基酸置换，并且使用IEDB T细胞结合预测工具确定对II类的预测的亲和力结合(参见图3)。
[0363] 在这一情况下，显示了两个实例，其中在部分A，在腺病毒表位中的高达70％的置换并没有破坏用于结合DP4的亲和力。部分B展示了在破伤风类毒素表位中高达70％的置换，这些置换并不抑制其对HLADR0101或HLADR0404(是DR等位基因的代表)的预测的结合。因此，通过修饰氨基酸序列产生具有宽的HLA覆盖度的高亲和力嵌合肽并不破坏该肽结合MHC II的能力。此外，如在这一实例中所证明，通过置换氨基酸，可以实现改进的肽的预测亲和力。
[0364] 虽然以上说明的具体实施方案用来例证包括HLA-DR或HLA-DP结合肽的优化组合物，相同技术可以用来生产包括HLA-DQ结合肽的优化组合物。
[0365] 实例3：肽评估
[0366] 针对以下各项评估了包括嵌合表位肽的发明组合物：(1)回忆应答的效能；(2)针对随机人群抽样人群(N＝20)的回忆应答的频率；以及(3)在个体(N＝20)内的抗原特异性记忆T细胞的频率。
[0367] 通过在体外用肽刺激人PBMC24小时并且然后用流式细胞术分析这些细胞来评估单个表位和嵌合表位的效能。活化的CD4中心记忆T细胞具有以下表型：CD4+CD45RA低CD62L+IFN-γ+。为了估计在人群中对选择的表位的特异性回忆应答的频率，对20名外周血供者评估了细胞因子表达的诱导。
[0368] 简要地，从研究血液部门(Research Blood Components)(剑桥)获得全血。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1∶1稀释血液，并且然后将35mL覆盖在50mL管中的12mLs的菲柯尔-帕克溶液(ficoll-paque premium)(通用电气医疗集团(GE Healthcare))的顶部。在1400RPM下旋转管30分钟，并且收集过渡相PBMC，在具有10％胎牛血清(FCS)的PBS中稀释，并且在1200rpm下旋转10分钟。将细胞再悬浮在细胞冷冻介质(来自西格玛公司)中，并且立即在-80℃下冷冻过夜。为了长期储存，将细胞转移至液氮中。按所需要将细胞解冻(37℃水浴)并且再悬浮于具有10％FCS的PBS中，旋转沉降并且再悬浮于培6
养基(RPMI[cellgro])中至5X10 个细胞/mL，该培养基添加有5％热灭活的人血清(西格玛公司)1-谷氨酰胺、青霉素以及链霉素。
养基(RPMI[cellgro])中至5X10 个细胞/mL，该培养基添加有5％热灭活的人血清(西格玛公司)1-谷氨酰胺、青霉素以及链霉素。
[0369] 为了记忆T细胞回忆应答测定，在37℃5％CO2条件下，用4μM根据本发明的肽(获得自GenScript)在24孔培养板中培养细胞2小时。然后每mL的培养基添加一微升布雷菲德菌素A(Golgiplug，BD)，并且将细胞放回37℃培养箱，放置4-6小时。然后将细胞转移至低温(27℃)培养箱(5％CO2)过夜，并且然后处理以用于流式细胞术分析。通过用CD4-FITC、CD45RA-PE、CD62L-Cy7PE(BD)孵育细胞接着进行膜渗透和固定(BD)而进行活化记忆T细胞的检测。使用干扰素γ-APC单克隆(BioLegend公司)检测干扰素γ的细胞内表达。然后使用FACSCalibre流式细胞仪和Cellquest软件分析200,000-500,000个细胞。如果它们是CD4+、CD45RA中、CD62高以及IFN-γ阳性的，则这些细胞的得分为阳性。
[0370] 展示被嵌合肽活化的流式细胞术数据的一个代表性实例显示于图4中，并且所有数据的总结显示于图5中。
[0371] 数据显示：(1)与仅有的单独的肽相比，根据本发明的嵌合肽活化了更高数量的中心记忆T细胞，并且嵌合肽TT830pmglpDTt(含有组织蛋白酶切割位点)给出了最高应答。(2)与单独的肽相比，发明嵌合肽取得来自更多人的回忆应答，其中TT830pmglpDTt在20/20个供者中是阳性的(图6)。(3)与仅有它的单独的组分(TT830和DT)相比，含有组织蛋白酶切割位点的嵌合肽TT830pmglpDTt是更具有活性的，并且比相同但是没有切割位点的肽(TT830DT)更好，这提示将组织蛋白酶切割位点添加到发明嵌合肽中可以提供增强的回忆应答。(4)该数据证实了显示在图1中的T细胞表位预测分析。该分析预测的是，由T830和DT表位两者组成的嵌合肽(TT830DTt)将会提供跨宽范围的HLA-DR等位基因的最高结合亲和力，并且包含组织蛋白酶切割位点(TT830pmglpDTt)增强了该应答。与单独AdV表位相比，添加TT830或TT950至DP特异性表位AdV并没有改进阳性应答细胞的数量。
AdVTT830的高亲和力和宽覆盖度是由于在AdV和TT830接合处新表位的产生。虽然它们可以产生高亲和力的预测，新表位在免疫的个体中将不诱导记忆回忆应答。在这些表位之间包含组织蛋白酶切割位点消除了新表位。在一种情况下，插入组织蛋白酶切割位点消除了AdV表位(AdVpTT830)的活性，可能是由于证实中的改变使该表位不适合于II类结合。
AdVTT830的高亲和力和宽覆盖度是由于在AdV和TT830接合处新表位的产生。虽然它们可以产生高亲和力的预测，新表位在免疫的个体中将不诱导记忆回忆应答。在这些表位之间包含组织蛋白酶切割位点消除了新表位。在一种情况下，插入组织蛋白酶切割位点消除了AdV表位(AdVpTT830)的活性，可能是由于证实中的改变使该表位不适合于II类结合。
[0372] 实例4：测试肽活化的记忆T细胞
[0373] 当用特异性肽再活化时，早期中心记忆T细胞表达多种细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)，而定型效应记忆T细胞被认为对于TH2定型效应记忆选择性表达TL-4，而对于TH1定型效应记忆表达IFN-γ。使用树突细胞/CD4细胞共培养物的多色细胞内细胞因子分析来测试肽活化的记忆T细胞的状态。
[0374] 使用阴性选择磁珠(戴诺生物技术有限公司(Dynal))分离人外周血单核细胞，并且在GM-CSF和IL-4存在下培养1周，以便诱导分化成树突细胞。使用磁珠分离(戴诺生物技术有限公司)来分离同种异体CD4T细胞，并且在DC存在下，在存在或缺乏肽的情况下共培养。来自那个点的刺激和分析的试验计划与以上在实例2中说明的PBMC的试验计划相同。
[0375] 用肽TT830DT(SEQ.ID号：7)和TT830pDTt(TT830pmglpDTTrunc或SEQ.ID号：13)刺激导致了TNF-α和IFN-γ的增加的表达，但没有导致IL-4的增加的表达(图7和图8)。多色流式细胞术显示TT830DTt和TT830pDTt两者处理的PBMC具有肽诱导的TTNF-α和IFN-γ的共表达，但没有TNF-α和IL-4的共表达(图9)，这提示早期中心记忆细胞被活化。
[0376] 构建了一系列的嵌合肽，它们含有来自DP4特异性腺病毒表位的序列、连同来自TT和DT的HLA-DR表位，在这些表位之间具有或不具有组织蛋白酶连接物(图10)。如以上说明的那样，在37℃和5％CO2条件下，用4μM根据本发明的肽(获得自GenScript)在24孔培养板中培养细胞2小时。然后每mL的培养基添加一微升布雷菲德菌素A(Golgiplug，BD)，并且将细胞放回37℃培养箱，放置4-6小时。然后将细胞转移至低温(27℃)培养箱(5％CO2)过夜，并且然后处理以用于流式细胞术分析。通过用CD4-FITC、CD45RA-PE、CD62L-Cy7PE(BD)孵育细胞接着进行膜渗透和固定(BD)而进行活化记忆T细胞的检测。使用干扰素γ-APC单克隆(BioLegend公司)检测干扰素γ的细胞内表达。然后使用FACSCalibre流式细胞仪和Cellquest软件分析200,000-500,000个细胞。如果它们是CD4+、CD45RA中、CD62高以及IFN-γ阳性的，则这些细胞的得分为阳性。对4个供者的记忆T细胞回忆应答的分析显示，与对含有‘kvsvr’(SEQ ID号：118)组织蛋白酶切割位点的异源三聚体肽(AdVkDTt、AdVkTT950)的供者应答相比，单独的肽、和缺乏组织蛋白酶切割位点的异源二聚体肽产生了更弱的应答。此外，含有AdV、DT、以及TT表位的异源三聚体肽(TT830DTAdV)在所有4名供者中也显示了回忆应答。
[0377] 实例5：修饰MHC II结合肽以调整物理性质
[0378] 为了改变如图11中显示的肽特性，产生一系列修饰的TT830pDTt(SEQ ID号：13)序列。在别处已经描述了这些类型的修饰的通用范围和性质。修饰肽的初始目标在于：1)改进水溶性(较低GRAVY-总平均亲水性)；2)通过修饰N-和/或C-末端氨基酸改变pI；3)修饰内部连接(Cat S切割PMGLP(SEQ ID号：116))，并且修饰外部和内部连接二者；4)理解通过改变组织蛋白酶B切割或产生替代的肽断裂过程而进行的Cat S结合位点的修饰，肽在内体区室中处理的重要性。
[0379] 另外，为了改变肽的疏水性并且将pI减小至近中性pH，产生AdVkDT序列的多种变体。部分通过与在以下AdV衍生的表位的N-末端之前的自然氨基酸序列的相似性来引导到N-末端的序列添加：
[0380] AdVkDTd1EESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQK(30)，pI＝6.6-7.1(SEQ ID号：71)[0381] AdVkDTd2ESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQKE(30)，pI＝6.6-7.1(SEQ ID号：72)[0382] AdVkDTd3KESTLLYVLFEVkvsvrQSIALSSLMVAQE(30)，pI＝6.6-7.1(SEQ ID号：73)[0383] 显示了针对AdVkDT的变体(SEQ ID号：71-73)的结果(图12)。与未刺激的(NS)对照相比，在来自3个不同的供者的所有实验中，AdVkDT变体(SEQ ID号：71-73)诱导了强健的回忆应答。
[0384] 实例6：流行性感冒病毒特异性记忆肽
[0385] 作为根据本发明的特异性单病原体优化的组合物的一个实例，使用美国国家健康研究院(NIH)的Blast程序和来自blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的核苷酸数据库，结合使用免疫表位数据库(IEDB)(http://www.immuneepitope.org/)T细胞表位预测工具的II类表位预测，鉴定了在A型流行性感冒病毒、A和B型流行性感冒病毒、或A、B、以及C型流行性感冒病毒中是高度保守的泛HLA-DR表位(图13和图14)。在图15-图17中显示了单独的表位和嵌合表位的T细胞表位预测结果，并且测试了具有预测的高亲和力的嵌合表位产生记忆T细胞应答的能力。简要地：在37℃5％CO2条件下，用4μM肽在24孔培养板中将PBMC培养2小时。然后添加布雷菲德菌素A，并将细胞放回37℃培养箱中，放置4-6小时。然后将细胞转移至低温(27℃)培养箱(5％CO2)过夜，并且然后处理以用于流式细胞术分析。通过用CD4-FITC、CD45RA-PE、CD62L-Cy7PE(BD)孵育细胞来进行活化记忆T细胞的检测。然后使用FACSCalibre流式细胞仪和Cellquest软件分析200,000-500,000个细胞。如果它们是CD4+、CD45RA中、CD62高以及IFN-γ阳性的，则这些细胞的得分为阳性。
[0386] 单独的表位：
[0387] (minx)YVKQNTLKLAT(SEQ ID号：74)
[0388] 7430)CYPYDVPDYASLRSLVASS(SEQ ID号：75)
[0389] (31201t)NAELLVALENQHTI(SEQ ID号：76)
[0390] (66325)TSLYVRASGRVTVSTK(SEQ ID号：77)
[0391] (ABW1)EKIVLLFAIVSLVKSDQICI(SEQ ID号：78)
[0392] (ABW2)QILSIYSTVASSLALAIMVA(SEQ ID号：79)
[0393] (ABP)MVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSI(SE Q ID号：80)
[0394] (AAT)EDLIFLARSALILRGSV(SEQ ID号：81)
[0395] (AAW)CSQRSKFLLMDALKLSIED(SEQ ID号：82)
[0396] (IRG)IRGFVYFVETLARSICE(SEQ ID号：83)
[0397] (TFE)TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL(SEQ ID号：84)
[0398] (MMM)MMMGMFNMLSTVLGV(SEQ ID号：85)
[0399] 嵌合表位：
[0400] AATk3120tLIFLARSALILRkvsvrNAELLVALENQHTI(SEQ ID号：86)
[0401] 3120tkAATNAELLVALENQHTIkvsvrLIFLARSALILR(SEQ ID号：87)
[0402] ABW2kAATILSIYSTVASSLALAIkvsvrLIFLARSALILR(SEQ ID号：88)
[0403] AATkABW2LIFLARSALILRkvsvrILSIYSTVASSLALAI(SEQ ID号：89)
[0404] AATkAAWLIFLARSALILRkvsvrCSQRSKFLLMDALKL(SEQ ID号：90)
[0405] AAWkAATCSQRSKFLLMDALKLkvsvrLIFLARSALILR(SEQ ID号：91)
[0406] ABW9hemaEKIVLLFAIVSLVKSDQICI(SEQ ID号：92)
[0407] MMMTFEMMMGMFNMLSTVLGVTFEFTSFFYRYGFVANFSMEL(SEQ ID号：93)
[0408] TFEMMMTFEFTSFFYRYGFVANFSMELMMMGMFNMLSTVLGV(SEQ ID号：94)
[0409] TFEIRGTFEFTSFFYRYGFVANFSMEL IRGFVYFVETLARSICE(SEQ ID号：95)
[0410] IRGTFEIRGFVYFVETLARSICE TFEFTSFFYRYGFVANFSMEL(SEQ ID号：96)
[0411] MMMkIRGMMMGMFNMLSTVLGV kvsvrIRGFVYFVETLARSICE(SEQ ID号：97)
[0412] IRGkMMMIRGFVYFVETLARSICEkvsvrMMMGMFNMLSTVLGV(SEQ ID号：98)
[0413] 嵌合流行性感冒病毒肽序列显示于图13中。来自5个PBMC供者的T细胞记忆回忆应答显示于图14中。记忆T细胞回忆应答对嵌合表位AAWkAAT、AATkABW2、3120tkAAT、以及ABW2kAAT呈阳性，但是在非嵌合的H5限制的泛HLA-DR表位ABW9中不是阳性的。这些数据显示，在诱导记忆回忆应答方面，含有流行性感冒病毒特异性肽的四个发明的嵌合保守表位是活性的。
[0414] 实例7：合成纳米载体配制品(预示的)
[0415] 根据Gerster(等人的美国专利5,389,640的实例99中提供的合成，合成了瑞喹莫德(aka R848)。使用常规共轭策略制备了PLA-PEG-尼古丁共轭物。通过使用D，L-丙交酯(MW＝约15KD-18KD)的开环聚合制备PLA。通过NMR证实了PLA结构。从VWR科技公司(VWR scientific)购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，85％水解)。这些用来制备以下溶液：
[0416] 1.在二氯甲烷中的瑞喹莫德@7.5mg/mL
[0417] 2.在二氯甲烷中的PLA-PEG-尼古丁@100mg/mL
[0418] 3.在二氯甲烷中的PLA@100mg/mL
[0419] 4.在水中的肽@10mg/mL，该肽具有以下序列：ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：13)
[0420] 5.在水中的聚乙烯醇@50mg/mL。
[0421] 将溶液#1(0.4mL)、溶液#2(0.4mL)、溶液#3(0.4mL)以及溶液#4(0.1mL)合并在小的管形瓶中，并且使用一台Branson数字超声波仪250以50％振幅对该混合物进行声处理40秒。向此乳液添加溶液#5(2.0mL)并且使用该Branson数字超声波仪250以35％振幅进行声处理40秒，形成第二种乳液。将这一乳液添加至含有水(30mL)的烧杯中，并且在室温下将这一混合物搅拌2小时以形成纳米颗粒。用水(14mL)稀释一部分纳米载体分散体(1.0mL)，并且通过在一台具有截留100KD的薄膜的Amicon Ultra离心过滤装置中进行离心将其浓缩。当体积大约为250μL时，添加水(15mL)，并且使用该Amicon装置将这些颗粒再一次浓缩至大约250μL。用磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.5，15mL)以相同方式进行第二次洗涤，并且用磷酸盐缓冲盐水将最终浓缩物稀释至总体积为1.0mL。这被预期为提供具有大约2.7mg/mL浓度的最终纳米载体分散体。
[0422] 实例8：合成纳米载体配制品(预示的)
[0423] 根据Gerster(盖斯特)等人的美国专利5,389,640的实例99中提供的合成，合成了瑞喹莫德(aka R848)。制备了PLA-PEG-尼古丁共轭物。通过使用D，L-丙交酯(MW＝约15KD-18KD)的开环聚合制备PLA。通过NMR证实了PLA结构。从VWR科技公司(VWR scientific)购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，85％水解)。这些用来制备以下溶液：
[0424] 1.在二氯甲烷中的PLA-R848共轭物@100mg/mL
[0425] 2.在二氯甲烷中的PLA-PEG-尼古丁@100mg/mL
[0426] 3.在二氯甲烷中的PLA@100mg/mL
[0427] 4.在水中的肽@12mg/mL，该肽具有以下序列：
[0428] ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：5)
[0429] 5.在水中的聚乙烯醇@50mg/mL。
[0430] 将溶液#1(0.25至0.75mL)、溶液#2(0.25mL)、溶液#3(0.25至0.5mL)以及溶液#4(0.1mL)合并在小的管形瓶中，并且使用一台Branson数字超声波仪250以50％振幅将该混合物声处理40秒。向此乳液添加溶液#5(2.0mL)并且使用Branson数字超声波仪250以35％振幅进行声处理40秒，形成第二种乳液。将这一乳液添加至含有磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯中，并且在室温下搅拌这一混合物2小时以形成纳米颗粒。为了洗涤这些颗粒，将一部分纳米颗粒分散体(7.0mL)转移至离心管中，并且在5,300g旋转一小时，除去上清液，并且将团粒再悬浮在7.0mL的磷酸盐缓冲盐水中。重复该离心步骤，并且将团粒再悬浮在2.2mL的磷酸盐缓冲盐水中，以预期获得具有大约10mg/mL的最终纳米颗粒分散体。
[0431] 实例9：发明组合物至载体蛋白的共轭(预示的)
[0432] 用另外的Gly-Cys在C-末端修饰肽(SEQ ID号：5)，用于经由在C-末端Cys上的硫醇基偶联至载体蛋白(SEQ ID号：119)CRM197上。CRM197是在它的基本序列中具有氨基酸改变的白喉毒素的无毒突变体。经由单个的核酸密码子改变，用谷氨酸替换存在于该分子的氨基酸位置52处的甘氨酸。由于这一改变，该蛋白质缺乏ADP-核糖基转移酶活性并且变得无毒。它具有58,408Da的分子量。
[0433] 通过与过量的溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(密苏里州圣路易斯，西格玛化学品公司)反应将CRM197的游离氨基溴乙酰化。将CRM197(15mg)溶解在1.0M NaHCO3(pH8.4)中并且用冰冷却。将溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液(在200μL二甲基甲酰胺(DMF)中15mg)缓慢添加至CRM197溶液中，并且将该溶液在室温在黑暗中轻轻混合2小时。然后通过经由用10K MWCO薄膜的透析进行渗滤来纯化生成的溴乙酰化的(活化的)蛋白质。通过使活化的CRM197与半胱氨酸反应，之后进行氨基酸分析并且定量生成的羧甲基半胱氨酸(CMC)来确定溴乙酰化的程度。
[0434] 将溴乙酰化的CRM197溶解在pH9.0的1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，并且在氩气下在2℃-8℃保持。将在pH9.0的1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中的肽(TLLYVLFEVNNFTVSFWLRVPKVSASHLET-G-C(修饰的SEQ ID号：119))(10mg)的溶液添加至溴乙酰化的CRM197溶液中，并且在2℃-8℃搅拌该混合物15-20小时。然后在2℃-8℃用20倍摩尔过量的N-乙酰基半胱胺对剩余的溴乙酰基进行封端4-8小时。然后在室温下，通过在10K MWCO薄膜上的经由针对pH7.0的0.01M磷酸钠缓冲液/0.9％NaCl进行渗滤的渗滤作用来纯化生成的肽-CRM197共轭物。通过SDS-PAGE，通过氨基酸分析收集并且分析渗余物-肽-CRM197共轭物的蛋白质含量(Lowry(劳里)或Micro-BSA比色测定)，以及在小鼠中的免疫原性。
[0435] 实例10：发明组合物与包括抗原的常规疫苗的混合物(预示的)
[0436] 通过使用D，L-丙交酯(MW＝约15KD-18KD)的开环聚合制备PLA。通过NMR证实了PLA结构。从VWR科技公司购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，87％-89％水解)。这些用来制备以下溶液：
[0437] 1.在二氯甲烷中的PLA@100mg/mL
[0438] 2.在二氯甲烷中的PLA-PEG@100mg/mL
[0439] 3.在水溶液中的肽@10mg/mL，该肽具有SEQ ID号：91的序列
[0440] 4.在水或磷酸盐缓冲液中的聚乙烯醇@50mg/mL。
[0441] 将溶液#1(0.5至1.0mL)、溶液#2(0.25至0.5mL)、以及溶液#3(0.05至0.3mL)合并在玻璃压力管中，并且使用一台Branson数字超声波仪250以50％振幅对该混合物进行声处理40秒。向此乳液添加溶液#4(2.0至3.0mL)并且使用Branson数字超声波仪250以30％振幅进行声处理40至60秒，形成第二种乳液。将这一乳液添加至含有磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯中，并且在室温下搅拌这一混合物2小时以形成纳米载体。为了洗涤这些颗粒，将一部分纳米载体分散体(27.0至30.0mL)转移至离心管中，并且在21,000g旋转45分钟，除去上清液，并且将团粒再悬浮在30.0mL的磷酸盐缓冲盐水中。重复该离心程序并且将团粒再悬浮在8.1-9.3mL的磷酸盐缓冲盐水中。
[0442] 对悬浮的合成纳米载体的4mL等分部分进行离心以沉降这些合成纳米载体。丢弃上清液并且添加0.5mL的 三价流行性感冒病毒疫苗的悬浮液。搅动该组合疫苗以再悬浮这些纳米载体并且将生成的悬浮液在使用前在-20℃下储存。
[0443] 实例11：发明组合物至金纳米载体的偶联(预示的)
[0444] 步骤1.形成金纳米载体(AuNCs)：在装备有冷凝器的1L圆底烧瓶中，在剧烈搅拌下加热回流500mL的1mM HAuCl4的水溶液10分钟。然后向搅拌的溶液迅速添加50mL的40mM的柠檬酸三钠溶液。将生成的深酒红色溶液保持回流25-30分钟，然后停止加热，并且冷却该溶液至室温。然后通过0.8μm薄膜过滤器过滤该溶液，以给出AuNCs溶液。使用可见光谱学和透射电子显微术表征AuNCs。AuNCs直径约为20nm，它们由柠檬酸盐封端，吸收峰值在520nm。
[0445] 步骤2.至AuNCs的直接肽共轭：按以下步骤，将实例9的C-末端肽(含有C-末端半胱氨酸的SEQ ID号：5的肽)偶联至AuNCs上：将145μl的肽溶液(10μM在10mM pH9.0碳酸盐缓冲液中)添加至20nm直径的经柠檬酸盐封端的金纳米颗粒的1mL液中(1.16nM)以产生2500∶1的硫醇与金的摩尔比。在氩气下在室温搅拌该混合物1小时以允许硫醇与金纳米颗粒上的柠檬酸盐的完全交换。然后通过在12,000g离心30分钟来纯化肽-AuNCs共轭物。滗出上清液，并且将含有肽-AuNCs的团粒再悬浮于1mL的WFI水中，用于进一步分析和生物测定。
[0446] 实例12：使用实例5的修饰组合物的合成纳米载体
[0447] 根据Gerster等人的美国专利5,389,640的实例99中提供的合成，合成了瑞喹莫德(aka R848)，并且使用酰胺连接物将其共轭到PLGA上，形成了PLGA-R848。从湖岸生物材料公司(Lakeshore Biomaterials)购买PLGA(IV0.10dL/g)和PLA(IV0.21dL/g)。使用常规共轭策略制备了PLA-PEG-尼古丁共轭物。从JT Baker公司购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，87％-89％水解)。这些用来制备以下溶液：
[0448] 1.在二氯甲烷中的PLA-R848@100mg/mL
[0449] 2.在二氯甲烷中的PLA-PEG-尼古丁@100mg/mL
[0450] 3.在二氯甲烷中的PLA@100mg/mL
[0451] 4.在包括10％DMSO、50％乳酸USP和40％的水的溶液中的肽@10mg/mL，该肽具有以下序列：EESTLLYVLFEVKVSVRQSIALSSLMVAQK(SEQ ID号：71)
[0452] 5.在pH8的磷酸盐缓冲液中的聚乙烯醇@50mg/mL
[0453] 将溶液#1(0.5mL)、溶液#2(0.25mL)、以及溶液#3(0.25mL)合并，并且将溶液#4(0.25mL)添加到小容器中，并且使用一台Branson数字超声波仪250以50％振幅对该混合物进行声处理40秒。向此乳液添加溶液#5(2.0mL)。使用该Branson数字超声波仪250以30％振幅对该混合物进行声处理40秒以形成第二种乳液。然后将这一乳液添加至含有70mM pH8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的搅拌的50mL烧杯中，并且然后在室温搅拌2小时以形成合成纳米载体。
[0454] 为了洗涤这些合成纳米载体，将一部分合成纳米载体分散体(27.5mL)转移至50mL离心管中，并且在4℃在9500rpm(13,800g)旋转一小时，除去上清液，并且将团粒再悬浮在27.5mL的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。重复该基于离心的洗涤工序，并且将团粒再悬浮在8.5g的磷酸盐缓冲盐水中，以预期获得10mg/mL的标称的合成纳米载体分散体浓度。
进行实际浓度的重量分析测定，并且随后在PBS中将该浓度调整至5mg/mL。
进行实际浓度的重量分析测定，并且随后在PBS中将该浓度调整至5mg/mL。
[0455] 通过在C57BL6小鼠中的接种研究确定该合成纳米载体配制品的免疫原性。随后根据这样的计划表：在第0天初免、随后在第14和28天加强，皮下接种至裸C57BL6小鼠(每组5只小鼠)的后垫(hind pads)之中。对于每个接种，注射总100μg的纳米载体，每个后肢50μg。在第26、40、55、以及67天收集血清。对于血清，确定抗尼古丁抗体效价为EC50值。利用具有相同聚合物配方的合成纳米载体按相似的方式为对照组接种，合并已知的鼠MHC II结合肽(卵清蛋白323-339酰胺)作为阳性对照，或者不具有任何MHC II结合肽。数据显示于图18中。
[0456] 实例13：使用发明组合物的合成纳米载体
[0457] 从湖岸生物材料公司购买PLGA(5050DLG2.5A，IV0.25dL/g)。制备PLA-PEG-尼古丁共轭物。从JT Baker公司购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，87％-89％水解)。这些用来制备以下溶液：
[0458] 1.在二氯甲烷中的PLGA@100mg/mL
[0459] 2.在二氯甲烷中的PLA-PEG-尼古丁@100mg/mL
[0460] 3.在溶剂中的肽@4mg/mL，该溶剂包含在水中的10％DMSO，该肽具有以下序列：ILMQYIKANSKFIGIPMGLPQSIALSSLMVAQ(SEQ ID号：13)
[0461] 4.在pH8的磷酸盐缓冲液中的聚乙烯醇@50mg/mL
[0462] 在将溶液#3(0.25mL)添加到小容器中之前，将溶液#1(0.375mL)和溶液#3(0.125mL)合并，用0.50mL的二氯甲烷稀释，并且然后使用一台Branson数字超声波仪250以50％振幅对该混合物进行声处理40秒。向此乳液添加溶液#4(3.0mL)。使用该Branson数字超声波仪250以30％振幅对该混合物进行声处理60秒以形成第二种乳液。然后将这一乳液添加至含有70mM pH8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的搅拌的50mL烧杯中，并且然后在室温下搅拌2小时以形成合成纳米载体。
[0463] 为了洗涤这些颗粒，将一部分合成纳米载体分散体(29mL)转移至50mL离心管中，并且在4℃在21,000rcf旋转45分钟，除去上清液，并且将团粒再悬浮在29mL的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。重复该基于离心的洗涤步骤，并且然后将团粒再悬浮在4.4g的PBS中，以预期获得10mg/mL的标称的合成纳米载体分散体浓度。进行实际浓度的重量分析测定，并且随后在PBS中将该浓度调整至5mg/mL。
[0464] 通过在BALB/c小鼠中的接种研究确定这些合成纳米载体配制品的免疫原性。在注射前，即刻将合成纳米载体与鼠活性CpG佐剂的溶液-PS-1826混合。随后根据这样的计划表：在第0天初免、随后在第14和28天加强，皮下接种至裸BALB/c小鼠(每组5只小鼠)的后垫之中。对于每个接种，注射总共100μg合成纳米载体和20μgPS-1826，后肢之间等分。在第26、和40天收集血清。对于血清，确定抗尼古丁抗体效价为EC50值。利用具有类似聚合物配方的合成纳米载体按相似的方式为对照组接种，其中阳性对照合成纳米载体合并了已知的鼠MHC II结合肽(卵清蛋白323-339酰胺)，并且阴性对照纳米载体缺乏MHC II结合肽。结果显示于图19中。
[0465] 实例14：使用发明组合物的合成纳米载体(预示的)
[0466] 通过在如HBTU的偶联剂的存在下，使含有酸端基的PLGA聚合物与R848反应制备PLGA-R848，制备如下：在氩气下在室温，将PLGA(Lakeshores聚合物，MW～5000，7525DLG1A，酸值0.7mmol/g，10g，7.0mmol)与HBTU(5.3g，14mmol)在无水EtOAc(160mL)中的混合物搅拌50分钟。添加化合物R848(瑞喹莫德，2.2g，7mmol)，随后添加二异丙基乙胺(DIPEA)(5mL，28mmol)。在室温搅拌该混合物6h并且然后在50℃-55℃搅拌过夜(约16h)。
冷却之后，该混合物用EtOAc(200mL)稀释并且用饱和的NH4Cl溶液(2x40mL)、水(40mL)以及盐水(40mL)洗涤。用Na2SO4(20g)干燥该溶液并且浓缩至凝胶状残留物。然后添加异丙醇(IPA)(300mL)，并且从溶液中沉淀出聚合物共轭物。然后用IPA(4x50mL)洗涤该聚合物以除去残留试剂并且在35℃-40℃真空干燥3天，呈白色粉末(预期产量：10.26g，经GPC测定MW为5200，经HPLC测定R848负荷为12％)。
冷却之后，该混合物用EtOAc(200mL)稀释并且用饱和的NH4Cl溶液(2x40mL)、水(40mL)以及盐水(40mL)洗涤。用Na2SO4(20g)干燥该溶液并且浓缩至凝胶状残留物。然后添加异丙醇(IPA)(300mL)，并且从溶液中沉淀出聚合物共轭物。然后用IPA(4x50mL)洗涤该聚合物以除去残留试剂并且在35℃-40℃真空干燥3天，呈白色粉末(预期产量：10.26g，经GPC测定MW为5200，经HPLC测定R848负荷为12％)。
[0467] 通过在如Sn(Oct)2的催化剂的存在下dl-丙交酯与HO-PEG-叠氮化物的开环聚合制备PLA-PEG-N3聚合物，制备如下：在DCC(MW206，0.117g，0.57mmol)和NHS(MW115，0.066g，0.57mmol)存在下，用NH2-PEG3-N3(MW218.2，0.1g，0.458mmol)在无水DCM(10mL)中处理HO-PEG-CO2H(MW3500，1.33g，0.38mmol)过夜。过滤除去不可溶的副产物(DCC-尿素)之后，将溶液浓缩，并且然后用醚稀释以沉淀出聚合物HO-PEG-N3(1.17g)。干燥之后，将HO-PEG-N3(MW3700，1.17g，0.32mmol)与dl-丙交酯(从EtOAc再结晶，MW144，
6.83g，47.4mmol)和Na2SO4(10g)在100mL烧瓶中混合。将该固体混合物在45℃真空干燥过夜并且添加无水甲苯(30mL)。在氩气下将生成的悬浮液加热至110℃并且添加Sn(Oct)2(MW405，0.1mL，0.32mmol)。将该混合物回流加热18h并且冷却至室温。用DCM(50mL)稀释混合物并过滤。浓缩至油状残留物之后，添加MTBE(200mL)以沉淀出聚合物，将该聚合物用100mL的在MTBE中的10％MeOH和50mL的MTBE洗涤一次。干燥之后，获得呈白色泡沫的PLA-PEG-N3(预期产量：7.2g，经H NMR测定平均MW：23,700)。
6.83g，47.4mmol)和Na2SO4(10g)在100mL烧瓶中混合。将该固体混合物在45℃真空干燥过夜并且添加无水甲苯(30mL)。在氩气下将生成的悬浮液加热至110℃并且添加Sn(Oct)2(MW405，0.1mL，0.32mmol)。将该混合物回流加热18h并且冷却至室温。用DCM(50mL)稀释混合物并过滤。浓缩至油状残留物之后，添加MTBE(200mL)以沉淀出聚合物，将该聚合物用100mL的在MTBE中的10％MeOH和50mL的MTBE洗涤一次。干燥之后，获得呈白色泡沫的PLA-PEG-N3(预期产量：7.2g，经H NMR测定平均MW：23,700)。
[0468] 合成纳米载体(NC)由PLGA-R848、以及PLA-PEG-N3(多肽抗原的连接物)制成。将AAWkAAT(衍生自流行性感冒病毒、并且具有序列：CSQRSKFLLMDALKLkvsvrLIFLARSALILR(SEQ ID号：91)的多肽)封装在NCs中。向NC(在PBS(pH7.4缓冲剂)中9.5mg/mL，
1.85mL，含有约4.4mg(MW：25,000；0.00018mmol，1.0eq)的PLA-PEG-N3)的悬浮液中添加含有C-末端炔连接物(C-末端甘氨酸炔丙基酰胺)(在PBS中0.2-1mM)的HA多肽(蛋白质科学公司(Protein Sciences Corp.)，康涅狄格州梅里登(Meriden CT))，并伴随轻轻搅拌。将CuSO4(在H2O中100mM，0.1mL)的溶液与铜(I)配体、三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)(在H2O中200mM，0.1mL)的溶液混合并且将生成的溶液添加至NC悬浮液中。
添加氨基胍盐酸盐(在H2O中200mM，0.2mL)的溶液，随后添加抗坏血酸钠溶液(在H2O中
200mM，0.2mL)。生成的悬浮液在4℃下在黑暗中搅拌18h。然后用PBS缓冲剂(pH7.4)将该悬浮液稀释至5mL并且离心以除去上清液。用2x5mL PBS缓冲剂洗涤残留的NC团粒。然后将经过洗涤的NC-HA多肽共轭物再悬浮于2mL的PBS缓冲剂中，并且冷冻储存直至进一步的分析和生物测试。
1.85mL，含有约4.4mg(MW：25,000；0.00018mmol，1.0eq)的PLA-PEG-N3)的悬浮液中添加含有C-末端炔连接物(C-末端甘氨酸炔丙基酰胺)(在PBS中0.2-1mM)的HA多肽(蛋白质科学公司(Protein Sciences Corp.)，康涅狄格州梅里登(Meriden CT))，并伴随轻轻搅拌。将CuSO4(在H2O中100mM，0.1mL)的溶液与铜(I)配体、三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)(在H2O中200mM，0.1mL)的溶液混合并且将生成的溶液添加至NC悬浮液中。
添加氨基胍盐酸盐(在H2O中200mM，0.2mL)的溶液，随后添加抗坏血酸钠溶液(在H2O中
200mM，0.2mL)。生成的悬浮液在4℃下在黑暗中搅拌18h。然后用PBS缓冲剂(pH7.4)将该悬浮液稀释至5mL并且离心以除去上清液。用2x5mL PBS缓冲剂洗涤残留的NC团粒。然后将经过洗涤的NC-HA多肽共轭物再悬浮于2mL的PBS缓冲剂中，并且冷冻储存直至进一步的分析和生物测试。
[0469] 实例15：产生呼吸道合胞病毒(RSV)通用的记忆肽
[0470] 为了产生嵌合RSV肽，使用免疫表位数据库(IEDB)(immuneepitope.org/)进行II类表位预测。IEDB数据库于2010年修订，包括了多种算法，以及大范围的HLADP、HLADQ以及HLADR等位基因。关于计算改变和等位基因频率的信息公开(Wang等人BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)2010，11：568，biomedcentral.com/1471-2105/11/568)并说明如下：‘单个等位基因的平均单倍型和表现型频率是基于在dbMHC处可获得的数据。dbMHC数据考虑了在欧洲、北非、东北亚、南太平洋(澳洲和大洋洲)、西班牙裔北美和南美、美洲印第安、东南亚、西南亚、以及撒哈拉以南非洲人群中的患病率。DP、DRB1以及DRB3/4/5频率只考虑了β链频率，这是考虑到DRA链大部分是单型的，以及假定DRA中的差异不显著影响结合。不可获得针对DRB3/4/5等位基因的频率数据。然而，由于与DRB1等位基因的连接，这些特异性的覆盖度可以如下假定：DRB3与DR3、DR11、DR12、DR13以及DR14；DRB4与DR4、DR7以及DR9；DRB5与DR15以及DR16。每个B3/B4/B5基因座处的特异性等位基因频率是基于公开的与各种DRB1等位基因的关联，并且只假定在指示基因座处的有限变化。
[0471] 对于ARB、组合库以及SMM_align，以IC50nM为单位给出预测的输出。因此，较小编号表明较高亲和力。作为粗略的准则，IC50值＜50nM的肽被认为具有高亲和力，＜500nM是具有中间亲和力，并且＜5000nM是具有低亲和力。大多数已知的表位具有高或中间亲和力。一些表位具有低亲和力，但是没有已知的T细胞表位具有大于5000的IC50值。给出Sturniolo的预测结果作为原始得分。较高得分表明较高亲和力。对于每种肽，通过比较这些肽的得分与选自SWISSPROT数据库的五百万随机的15mers的得分，产生用于这四种方法(ARB、组合库、SMM_align以及Sturniolo)中的每一种的百分等级。小编号的百分等级表明高亲和力。然后这四种方法的中位数百分等级被用来产生一致法的等级。
[0472] 使用IEDB筛选235个RSV T细胞表位，发现了3种新型的肽，并且使用这些肽来产生嵌合肽。此外，嵌合肽的产生包括先前描述的肽(RSVG(SEQ ID号：99))(病毒学(Virology)326(2004年)220-230HLA-DP4将来自RSV G蛋白的免疫显性肽递呈至CD4T细胞(HLA-DP4presents an immunodominant peptide from the RSV G protein to CD4T cells))。
[0473] 鉴定的序列：
[0474] 注释名称SEQ亲和力来源
[0475] 1516AGFAGFYHILNNPKASL(HLADR)核蛋白(SEQ ID号：100)
[0476] 71949VWLVWLYNQIALQLKNHA(HLADR)聚合酶亚基SEQ ID号：101
[0477] L53499VSTVSTYMLTNSELLSLIND(HLADP)融合糖蛋白F10SEQ ID号：102
[0478] RSVG162-175DFHFEVFNFVPCSI(HLADP)SEQ ID号：103
[0479] 具有组织蛋白酶切割位点的嵌合序列：
[0480] AGFkVWLAGFYHILNNPKASLkvsvrVWLYNQIALQLKNHA(SEQ ID号：104)
[0481] VWLkAGFVWLYNQIALQLKNHAkvsvrAGFYHILNNPKASL(SEQ ID号：105)
[0482] AGFkVSTAGFYHILNNPKASLkvsvrVSTYMLTNSELLSLIND(SEQ ID号：106)
[0483] VSTkAGFVSTYMLTNSELLSLINDkvsvrAGFYHILNNPKASL(SEQ ID号：107)
[0484] VWLkVSTVWLYNQIALQLKNHAkvsvrVSTYMLTNSELLSLIND(SEQ ID号：108)
[0485] VSTkVWLVSTYMLTNSELLSLINDkvsvrVWLYNQIALQLKNHA(SEQ ID号：109)
[0486] RSVGkVWL DFHFEVFNFVPCSIkvsvrVWLYNQIALQLKNHA(SEQ ID号：110)
[0487] VWLkRSVGVWLYNQIALQLKNHAkvsvrDFHFEVFNFVPCSI(SEQ ID号：111)
[0488] RSVGkVSTDFHFEVFNFVPCSIkvsvrVSTYMLTNSELLSLIND(SEQ ID号：112)
[0489] VSTkRSVG VSTYMLTNSELLSLIND kvsvrDFHFEVFNFVPCSI(SEQ ID号：113)
[0490] RSVGkAGFDFHFEVFNFVPCSIkvsvrAGFYHILNNPKASL(SEQ ID号：114)
[0491] AGFkRSVGAGFYHILNNPKASLkvsvrDFHFEVFNFVPCSI(SEQ ID号：115)
[0492] 基于来自单独的表位的结果，在某些实施方案中，产生了将给出预测的最宽覆盖度、以及高亲和力结合的嵌合肽。如在图21中所示，与只具有A或B但不是这二者的组合物相比，可以产生具有更宽的预测覆盖度和更高亲和力结合的具有A-x-B形式的组合物。在肽的接合处插入组织蛋白酶切割位点。合成了嵌合肽(CSBIO)并且将其再悬浮于水中，备用。虽然以上说明的具体实施方案用来生产包括HLA-DR和HLA-DP结合肽的优化组合物，相同的技术可以用来生产包括HLA-DQ结合肽的优化组合物。
[0493] 实例16：肽评估
[0494] 针对以下各项评估了嵌合表位肽：1)回忆应答的效能；2)针对随机人群抽样人群(N＝5)的回忆应答的频率；以及3)在个体(N＝5)内的抗原特异性记忆T细胞的频率。
[0495] 已经通过在体外用肽刺激人PBMC18小时并且然后通过酶联免疫斑点法分析这些细胞来评估单个表位和嵌合表位的效能。简要地，从研究血液部门(剑桥)获得全血。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释血液，并且然后覆盖在50mL管中的菲柯尔-帕克溶液(通用电气医疗集团)的顶部。旋转管30分钟，并且收集过渡相PBMC，在具有10％胎牛血清(FCS)的PBS中稀释，并且旋转10分钟。将细胞再悬浮在细胞冷冻介质(西格玛公司)中，并且立即在-80℃冷冻过夜。为了长期储存，将细胞转移至液氮中。按所需要将细胞解冻并且再7
悬浮于10％FCS的PBS中，旋转沉降并且再悬浮于培养基(RPMI[cellgro])中至1X10 个细胞/mL，该培养基添加有10％热灭活的胎牛血清(西格玛公司)1-谷氨酰胺、青霉素以及链霉素。
悬浮于10％FCS的PBS中，旋转沉降并且再悬浮于培养基(RPMI[cellgro])中至1X10 个细胞/mL，该培养基添加有10％热灭活的胎牛血清(西格玛公司)1-谷氨酰胺、青霉素以及链霉素。
[0496] 使用干扰素γ酶联免疫斑点试剂盒(Mabtech)进行酶联免疫斑点测定。简要地，通过使用IFNγ捕捉抗体涂布96孔过滤器板，然后用含有10％FCS的完全培养基阻断以阻止非特异性结合来进行酶联免疫斑点测定。在具有或不具有10μM肽的情况下，将6
PBMC(1X10 个细胞)涂在抗体预涂布的Elispot板上。用10μg/mL PHA刺激阳性对照孔。
将Elispot板在37℃孵育18小时，随后在室温用生物素化的抗IFN-γ第二抗体涂布2小时。然后使用在乙酸盐缓冲剂中的3-氨基-9-乙基咔唑、二甲基甲酰胺、以及过氧化氢洗涤Elispot板并且显现IFN-γ斑点。IFN-γ阳性Elispot计数由外部厂商(Zelnet)评估，并且斑点的数量是按每1千万个细胞计分的。
PBMC(1X10 个细胞)涂在抗体预涂布的Elispot板上。用10μg/mL PHA刺激阳性对照孔。
将Elispot板在37℃孵育18小时，随后在室温用生物素化的抗IFN-γ第二抗体涂布2小时。然后使用在乙酸盐缓冲剂中的3-氨基-9-乙基咔唑、二甲基甲酰胺、以及过氧化氢洗涤Elispot板并且显现IFN-γ斑点。IFN-γ阳性Elispot计数由外部厂商(Zelnet)评估，并且斑点的数量是按每1千万个细胞计分的。
[0497] 数据(图22)显示RSV嵌合肽活化了高数量的中心记忆T细胞。嵌合肽VWLkAGF和VSTkAGF给出了最高的记忆T细胞应答并且证明了来自所有5个供者的回忆。
[0498] 实例17：合成纳米载体配制品(预示的)
[0499] 根据Gerster等人的美国专利5,389,640的实例99中提供的合成，合成了瑞喹莫德(aka R848)。使用常规共轭策略制备了PLA-PEG-尼古丁共轭物。通过使用D，L-丙交酯(MW＝约15KD-18KD)的开环聚合制备PLA。通过NMR证实了PLA结构。从VWR科技公司购买聚乙烯醇(Mw＝11KD-31KD，85％水解)。这些用来制备以下溶液：
[0500] 1.在二氯甲烷中的瑞喹莫德@7.5mg/mL
[0501] 2.在二氯甲烷中的PLA-PEG-尼古丁@100mg/mL
[0502] 3.在二氯甲烷中的PLA@100mg/mL
[0503] 4.在水中的肽@10mg/mL，该肽具有如SEQ ID号：100中提出的序列
[0504] 5.在水中的聚乙烯醇@50mg/mL。
[0505] 将溶液#1(0.4mL)、溶液#2(0.4mL)、溶液#3(0.4mL)以及溶液#4(0.1mL)合并在小的管形瓶中，并且使用一台Branson数字超声波仪250以50％振幅对该混合物进行声处理40秒。向此乳液添加溶液#5(2.0mL)并且使用该Branson数字超声波仪250以35％振幅进行声处理40秒，形成第二种乳液。将这一乳液添加至含有水(30mL)的烧杯中，并且在室温下将这一混合物搅拌2小时以形成纳米颗粒。用水(14mL)稀释一部分纳米载体分散体(1.0mL)，并且通过在一台具有截留100KD的薄膜的Amicon Ultra离心过滤装置中进行离心将其浓缩。当体积大约为250μL时，添加水(15mL)，并且使用该Amicon装置将这些颗粒再一次浓缩至大约250μL。用磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.5，15mL)以相同方式进行第二次洗涤，并且用磷酸盐缓冲盐水将最终浓缩物稀释至总体积为1.0mL。这被预期为提供具有大约2.7mg/mL浓度的最终纳米载体分散体。
[0506] 参考文献
[0507] 1.若干DR结合表位的截短分析(Truncation analysis of several DR binding epitopes).O′Sullivan D，Sidney J，Del Guercio MF，Colón SM，SetteA.免疫学杂志.1991年2月15日；146(4)：1240-6。
[0508] 2.腺病毒六邻体T细胞表位被大多数成人识别并且受HLA DP4-最常见的II类等位基因所限制(Adenovirus hexon T-cell epitope is recognized by most adults and is restricted by HLA DP4，the most common class II allele).Tang J，Olive M，Champagne K，Flomenberg N，Eisenlohr L，Hsu S，Flomenberg P.基因治疗(Gene Ther.)2004年9月；11(18)：1408-15。
[0509] 3.HLA-DP4-最常见的HLA II类分子定义了新的超类型的肽结合特异性 (HLA-DP4，the most freq uent HLA II molecule，defines a new supertype of peptide-binding specificity).Castelli FA，Buhot C，Sanson A，Zarour H，Pouvelle-Moratille S，Nonn C，Gahery-Ségard H，Guillet JG，Ménez A，Georges B，Maillère B.免疫学杂志.2002年12月15日；169(12)：6928-34。
[0510] 4.受HLA-DP4分子限制的CD4(+)T细胞表位的预测(Prediction of CD4(+)T cell epitopes restricted to HLA-DP4molecules).Busson M，Castelli FA，Wang Xf，Cohen WM，Charron D，Ménez A，Maillère B.免疫学方法杂志.2006年12月20日；317(1-2)：144-51。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用以癌症治疗的天花疫苗 | 2020-05-11 | 421 |
| 天花DNA疫苗及其引起免疫应答的抗原 | 2020-05-11 | 1013 |
| 用于微针疫苗贴剂的含明矾的涂层制剂 | 2020-05-23 | 380 |
| MYC的调节剂、其使用方法和鉴别调节MYC的试剂的方法 | 2020-05-18 | 320 |
| 表皮针的制作方法及其应用 | 2020-05-21 | 283 |
| 天花疫苗 | 2020-05-11 | 731 |
| 作为疫苗佐剂的神经生长因子 | 2020-05-18 | 696 |
| 用于收集、存储、呈现和分析免疫数据并且其远程站通过网络与疫苗和疾病数据库通信的系统 | 2020-05-26 | 81 |
| 在回肠和阑尾上有活性的胃肠位点特异性口服接种疫苗制剂 | 2020-05-26 | 465 |
| 疫苗组合物及其使用方法 | 2020-05-22 | 436 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈