专利汇可以提供天花疫苗专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供减毒的痘苗病毒 疫苗 ,可以用于 预防 或 治疗 患者的 天花 ,本发明还提供了获得这样的疫苗的方法。,下面是天花疫苗专利的具体信息内容。
1.减毒的痘苗病毒克隆毒株,它从生长了Dryvax的培养细胞中 分离得到,当以有效诱导人对天花病毒的防护性或治疗性免疫应答的 量施用给人时,在人体中是有效减毒的。
2.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中所述痘苗病毒具有与 Dryvax基本上相同的毒力。
3.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中所述痘苗病毒具有与 Dryvax基本上相同的免疫原性。
4.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中将所述痘苗病毒接种到 细胞培养物时,可以生成与Dryvax基本上相同或更多的痘苗病毒。
5.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中将所述痘苗病毒用限制 性核酸内切酶酶解时,具有与Dryvax基本上相同的酶解模式。
6.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中所述痘苗病毒具有与痘 苗病毒毒株ACAM1000(ATCC保藏号PTA-3321)基本上相同的毒 力。
7.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中所述痘苗病毒具有与痘 苗病毒毒株ACAM1000(ATCC保藏号PTA-3321)基本上相同的免 疫原性。
8.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中将所述痘苗病毒接种到 细胞培养物时,可以生成与痘苗病毒毒株ACAM1000(ATCC保藏 号PTA-3321)基本上相同或更多的痘苗病毒。
9.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中将所述痘苗病毒用限制 性核酸内切酶酶解时,具有与ACAM1000(ATCC保藏号PTA-3321) 基本上相同的酶解模式。
10.权利要求1的痘苗病毒克隆毒株,其中所述痘苗病毒是 ACAM1000(ATCC保藏号PTA-3321)。
11.一种药物组合物,其包含权利要求1的痘苗病毒克隆毒株 和药用载体或稀释剂。
12.权利要求11的药物组合物在通过给患者施用所述组合物而 预防或治疗天花病毒感染中的用途。
13.权利要求12的用途,其中所述药物组合物通过皮上划痕施 用给患者。
14.权利要求12的用途,其中所述药物组合物是以1×104到1 ×106蚀斑形成单位的量施用给患者的。
15.权利要求12的用途,其中所述痘苗病毒克隆毒株是 ACAM1000(ATCC保藏号PTA-3321)。
16.获得用作疫苗的减毒的痘苗病毒克隆毒株的方法,该方法 包括(i)在细胞培养物系统中繁殖Dryvax,(ii)从所述细胞培养 物系统中分离痘苗病毒克隆毒株,所述毒株具有与Dryvax或痘苗病 毒毒株ACAM1000(ATCC保藏号PTA-3321)基本上相同的毒力、 免疫原性、培养物中生长特性或者限制性核酸内切酶酶解模式。
17.权利要求16的方法,其中所述痘苗病毒的毒力通过兔子皮 肤测试来判定。
18.权利要求16的方法,其中所述痘苗病毒的毒力通过乳鼠神 经毒力测试来判定。
19.权利要求16的方法,其中所述痘苗病毒当以有效诱导人对 天花病毒的防护性或治疗性免疫应答的量施用给人时,在人体中是有 效无毒的。
20.权利要求16的方法,其中所述痘苗病毒在培养物中的生长 特性使用MRC-5细胞进行判定。
背景技术
天花病毒,作为天花的病原,是正痘病毒属的一种,正痘病毒属 还包括猴痘、牛痘和痘苗(vaccinia)病毒。这种由天花病毒主毒株(major strains)引起的疾病的特征是低感染剂量(10-100病毒颗粒),长潜伏期 (平均12天),发烧,全身症状,快速发展到脓包阶段,感染的死亡 率达到30%,幸存者会有面部伤疤。这种疾病通过呼吸途径如接触(水 滴)或可能通过气溶胶而在人与人之间传播。
天花是20世纪上半叶最重要的全球性疾病和致死因素之一。但 是,部分源于缺少动物储存宿主(reservoir),使得系统使用疫苗(活 的,减毒的痘苗病毒)病毒对天花病毒极为有效。实际上,1967到1977 年间,一场全球性的消灭天花运动使天然的天花灭绝了(Fenner等,世 界卫生组织,Geneva,p.1460,1988)。由于天花的灭绝和疫苗所带 来负面影响的风险,儿童、医务人员和军人的例行疫苗接种已经停止 了,目前只有在实验室进行痘苗和相关病毒研究的人员被免疫。因此, 世界上有相当一部分人对天花没有免疫力。余下的人对于天花的免疫 力也极为有限,因为在初次接种以后疫苗免疫力仅能保持5年而再次 接种后免疫力也不超过20年。天花的消灭和天花疫苗接种的停止使 人类在受到使用天花病毒的隐蔽袭击或生化战争中是脆弱的。上述情 况一旦发生,人群的免疫屏障将不复存在,从而引发大规模传染(Anon. (Editorail),Lancet 353:1539,1999;Henderson,Science 283:1279-1282, 1999;Henderson等,J.A.M.A.281:2127-2137,1999)。
由于根除天花存在不确定性,因此人们储存了疫苗以备急用。例 如,在美国,惠氏药厂(Wyeth Laboratories)生产的155,000疫苗瓶 (即1550万剂量)最初在美国乔治亚州(Georgia)亚特兰大市 (Atlanta)疾病控制和预防中心(CDC)控制下储存。在1999年1 月国家疫苗顾问委员会(National Vaccines Advisory Committee)的 一次会议上,CDC汇报了全国天花疫苗的储存状况。那时,在惠氏 拥有的1550万剂量中,340万剂量无法通过质量控制测试,1030万 剂量超出了上次控制测试指定的延长保质期,只剩170万剂量能满足 使用要求(LeDuc,Presentation to the National Vaccines Advisory Committee,Washington D.C.,Jan.11-12,1999)。除了供应量有限之 外,疫苗的包装都是100剂量瓶,使配给受到约束,也增加了紧急情 况时造成浪费的概率。
除了美国的库存,荷兰Bilthoven国家公共卫生研究所(National Institute of Public Health)也能提供疫苗(Lister,Elstree毒株),某 些其他国家也能提供天花疫苗,在根除天花时,一共可以提供3亿剂 量疫苗。但是类似的储存稳定性问题使实际供应减至5000万剂量以 下(Henderson,Science 283:1279-1282,1999)。
发明概述
本发明提供稳定的痘苗病毒毒株,这些毒株从繁殖有Dryvax的 培育细胞中分离得到,它们拥有的特性使它们适合作为用于人类的天 花疫苗。本发明还提供生成这些毒株和将它们用于预防天花感染和疾 病的方法。
因此,在第一方面,本发明提供经过减毒的痘苗病毒的克隆毒株, 毒株从培养有Dryvax的培育细胞中分离得到,适量用在人类身上 时,被稀释到可以接受的程度,可以有效地引导对天花病毒的防护或 治疗免疫反应。
克隆毒株例如可具有基本上与Dryvax相同的毒力和/或免疫原 性。优选地,与Dryvax相比,将痘苗病毒接种到细胞培养物时,可 以生成基本上相同或更多的痘苗病毒,以及/或者用限制性核酸内切 酶酶解时,基本上具有与Dryvax相同的酶解方式。
在合适的动物模型或者人类身上试验时,克隆毒株也具有例如与 痘苗病毒毒株ACAM1000(2001年4月19日以保藏号ATCC PTA-3321保藏,参阅以下的克隆2)基本上相同的毒力和/或免疫原 性。优选地,与痘苗病毒毒株ACAM1000相比,用这样的牛痘病毒 接种细胞培养物时,可以生成基本上相同或更多的痘苗病毒,以及/ 或者用限制性核酸内切酶酶解时,具有与痘苗病毒毒株ACAM1000 基本上相同的酶解方式。本发明包括的一种痘苗病毒的实例是 ACAM1000(ATCC保藏号PTA-3321)。
在第二方面,本发明提供含有上文和后文描述的痘苗病毒克隆毒 株的药物组合物,以及药用载体或稀释剂。
在第三发明,本发明提供通过给病人施用这样的药物组合物,预 防或治疗天花病毒感染病人的方法,以及这样的组合物为此目的的用 途,以及这样的组合物在制备药物中的用途。可以例如通过皮上划痕 给病人施用例如1×104到1×106蚀斑形成单位的此药物组合物。
在第四方面,本发明提供用作疫苗的获得经过减毒的痘苗病毒的 克隆毒株的方法。此方法包括(i)在细胞培养物中繁殖Dryvax和 (ii)从细胞培养物中分离出痘苗病毒的克隆毒株,它具有与Dryvax 或痘苗病毒毒株ACAM1000基本上相同的毒力、免疫原性、培养物 中生长特性或限制性核酸内切酶酶解方式。此方法可通过兔子的皮肤 测试或者乳鼠神经毒力测试以测试痘苗病毒的毒力。使用例如人类的 二倍体细胞(MRC-5)可以判定其培养物中生长特性。优选地,将此 方法鉴定的痘苗病毒以有效诱导人体对天花病毒的防护性或治疗性免 疫应答的量施用给人时,在人体中是无毒性的。
本发明有几个优点。例如,天花疫苗先前的生产方式是将痘苗病 毒接种到牛皮中,然后将牛皮碾碎以获得活病毒。得到的粗病毒制备 物经过最低程度的纯化之后,就用于人类接受者种痘,从而可能导致 病原体感染。而本发明从细胞培养物系统中生产疫苗,对于疫苗制造 的现代标准而言,是合格的并且经过高度纯化,从而解决了这个问题。 相对混合的病毒群体而言,使用克隆病毒(例如本发明的那些)的另 一个优点在于,这些病毒在繁殖和疫苗制造过程中,其特性不倾向于 发生变化。实际上,我们已经说明,在细胞培养物中,本发明的病毒 经过反复传代和扩增,可以维持其表型,不会受到污染,能够以适合 于大批量疫苗制造的量在细胞培养物中生产。
通过以下详细的说明书、附图和权利要求书,可以很明显看到本 发明的其他特征和优点。
附图简述
图1A-1D为一系列图形,显示了使用所示痘苗克隆、多克隆痘 苗病毒制备物或Dryvax攻击乳鼠的实验结果。图形显示了攻击后乳 鼠的存活数量和平均存活时间。
图2显示本发明的疫苗克隆的HindIII限制性酶酶解分析,与多 克隆病毒制备物和Dryvax进行了对比。
发明详述
本发明提供了经过减毒的痘苗病毒的克隆毒株,可以用于治疗天 花(即天花病毒)的接种疫苗方法。如下文所述,本发明的减毒牛痘 毒株是通过从繁殖有Dryvax的细胞培养物中分离出痘苗克隆而得到 的。本发明还提供了在天花预防中使用包含这些痘苗病毒的疫苗的方 法,以及获得这些痘苗病毒的克隆毒株的方法。
本发明中的疫苗来源于Dryvax(New York City Board of Health strain,Wyeth Laboratories),并且具有与之类似的特性,Dryvax目 前被美国食品和药物管理局(FDA)批准,由在牛皮中生成的痘苗病毒 的混合群体构成。对于接种这些疫苗的人,这些疫苗必须具有可接受 的经过减毒的毒性。接受的减毒水平可以例如类似于Dryvax(例如, 在统计学上没有显著区别),可以使用下文提及的任何体外或体内测 试方法进行判定。痘苗病毒的一个特性是亲神经性(neurotropism),或 是在中枢神经系统的细胞中进行复制的能力,该能力导致炎症(即脑 炎)。优选地,本发明的疫苗的亲神经性不大于Dryvax,在接受治 疗的病人中不会导致接种后脑炎。
本发明中的疫苗和方法将在下文中进一步描述。
适应症
本发明疫苗的主要适应症是用于在生物恐怖袭击或生物战之后, 在暴露或可能暴露于天花的人群中预防天花。本发明疫苗的的效力很 高(大于95%),此疫苗可以用于防止病毒在人和人之间的传播, 以及保护初期(primary)暴露于高剂量气溶剂和生化武器的人群。在此 主要适应症基础上,本发明疫苗可以用于例如建立新的全国天花(痘 苗)疫苗储存库,可以逐年进行疫苗生产,以在更长的时间内保证有 效疫苗的连续存储,
此疫苗并非用于常规用途,除了与痘苗、牛痘、猴痘、天花或正 痘病毒的其他成员有接触的实验室工作者外。此疫苗将在一些紧急情 况下发放,这由国家安全和公共卫生部门决定。在这样的紧急情况下, 保护个人免受天花危害,防止疾病在社会的传播,痘苗带来的潜在利 益将超过与它有关的不利后果的风险。应认识到,紧急情况下疫苗的 使用可能难以控制,患上接种后脑炎的风险很高的婴儿也接种疫苗, 并且可能忽略了对具有以下症状(例如湿疹、怀孕和免疫抑制史)的 人士使用疫苗时所需的防备和禁忌症。因为这些原因,所以有一点很 重要,那就是本发明中源于细胞培养物的疫苗的毒力不能大于目前批 准使用的产品。
由于许多事情无法精确预测,因此可能要做出决定,做好特定人 群的暴露前预防工作,包括军人、普通医务人员和所谓的“第一出动 人员”。对于这些人群,此疫苗固有的安全特性显得至关重要,通过 慎重使用所述产物,避免对可能导致不利后果的个人使用,可以提高 疫苗在这些人群中的固有的安全性。在这些情况下,主要风险是自身 接种、眼型痘苗(ocular vaccinia)和意外感染,所有这些都是自限的不 利后果。具有潜在风险因素的其他人也有小的被意外感染的风险。
当然,如果全国或全世界的情况发生变化,要求人群的其他成员 (例如儿童)或者甚至全部人群都需要接受常规接种时,本发明的疫 苗同样适用于这一目的。
施用方式和数量
本发明的疫苗是通过以下方法制备的:在细胞培养物系统中繁 殖痘苗病毒的所需毒株(例如ACAM1000毒株,ATCC Deposit No.PTA-3321,参阅下文),使用标准方法从系统纯化培养的毒株。 例如,可以在下列细胞中培养毒株:二倍体人肺成纤维细胞,例如 MRC-5细胞,初级鸡胚胎成纤维细胞或者任何其他可由本领域技术 人员确定的合适的细胞类型。可以使用任何合适的系统进行培养, 例如用Nunc Cell Factory。
可以冻干经过纯化的病毒,留待日后使用,或者立即在药物溶 液中配制。本领域已知有许多药用溶液可以用于疫苗制备,可以容 易地被本领域技术人员调节以用于本发明(见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版),A.Gennaro编,1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA.)。不过,在使用或不使用佐剂或载体 的生理溶液(例如无菌盐水或无菌缓冲盐水)中,病毒会被稀释。 任选地,药物溶液可以包含提供粘性的成分(例如甘油)和/或具有 杀菌特性的成分(例如苯酚)。疫苗的存储浓度可以是每毫升107 至109蚀斑形成单元(PFU),例如108PFU/ml。
可以通过标准方法给病人施用本发明的疫苗,例如皮上划痕。 例如,这种方法可以使用分叉的针。另外,可以通过本领域技术人 员认为合适的其他标准方式施用疫苗。例如,通过皮下或真皮内注 射,或者其他肠道外方式例如肌肉注射来施用疫苗。中等身材的成 年人施用疫苗的量可以是例如1×104到1×106蚀斑形成单位。作为 具体例子,可以使用2.5×105蚀斑形成单位。
优选在暴露于天花之前进行接种,但是也可以对已经暴露于天 花的病人进行接种,优选在暴露后的几天之内进行接种。人的一生 中可以只进行一次接种,或者可以经过一定时间例如几年(如5到 10年)之后再次进行接种,这可由本领域技术人员决定。
疫苗候选物的鉴定
本发明还包括鉴定痘苗疫苗的候选物的方法。可以通过以下方法 鉴定这些候选物:从接种了Dryvax的细胞培养物中分离克隆毒株, 使用下面描述的任何一种体外或体内方法来表征这些克隆。例如,候 选疫苗毒株可以与Dryvax比较蚀斑大小、细胞培养物中的产量(使 用例如MRC-5细胞)、兔子皮肤毒力测试、乳鼠神经毒力、猴子神 经毒力或者小鼠攻击模型中的保护。优选的候选物是毒力类似于或者 小于Dryvax,可以诱导与Dryvax类似或者更强的保护性免疫力, 并且具有与Dryvax类似或者更好的生长特性的那些。
在本发明之前,具有疫苗候选物令人满意特性的克隆毒株的分离 是无法预期的,因为痘苗长时间的传代过程导致产生变异体亚群(即 遗传群(genetic swarm)),它们具有可能不同的生物特性。而且无法 确定通过蚀斑纯化(即生物克隆)分离得到的单一变异体是否具有与 最初的混合病毒群体中的多种变异共同具有的表型特征相同的表型特 征。事实上,在本发明之前,如果出现这种情况,将会非常令人诧异。
以下进一步描述本发明疫苗的形成和临床前表征。
痘苗疫苗的形成和临床前表征
如上文所讨论的,Dryvax是FDA目前批准使用的痘苗疫苗,来 源于纽约市健康委员会(NYCBH)毒株,由Wyeth-Lederle使用小牛 淋巴方法生产,直至1982年(也见ATCC Deposit No.VR-325)。 Dryvax由活的、经过减毒的痘苗病毒组成,而不是细胞培养物产品。 我们采用痘苗病毒的天花疫苗毒株用于在人肺成纤维细胞的实验室生 长培养物中,在受控条件下进行繁殖,因此可以将现代技术用于疫苗 生产上。为了形成细胞培养物疫苗,我们需要通过终点稀释传代,将 Dryvax与潜在的外来病毒污染物分离;我们在使用和不使用克隆的 条件下达到了这个目的,这将在下文进一步说明。从Dryvax中的变 异体混合物(遗传群)中,我们筛选了一些候选疫苗。与已批准的疫 苗相比,这些疫苗在动物身上具有类似的生物特性和基因组相似性, 可以很大程度上保证这些候选物具有与最初小牛淋巴产品相同的临床 疗效。
在所采用的一个策略中,克隆了痘苗病毒,用于将病毒与源自牛 皮的可能的污染性微生物分离开。通过这一策略,分离了6个克隆。 克隆的病毒表现出不同的特征,其毒力可能大于也可能小于 Dryvax。令人诧异的是,在预期的Dryvax变异体混合物中,发现 三个克隆在动物毒力测试中表现与Dryvax类似,不同之处主要在于 细胞培养物中的生长速度。根据本发明,这些毒株中的任何一种,以 及具有类似特性的其他毒株,可以用于天花接种方法。
在另一个策略中,不克隆病毒,预期通过这种方法得到的病毒的 行为很可能象其所来源的毒株。但是令人诧异的是,我们发现不通过 克隆生成的毒株虽然在体外测试中其行为与Dryvax类似,但是与疫 苗毒株的特性不同,实际上在实验室动物测试时其毒力更强。因此, 我们将开发力量集中在具有与Dryvax疫苗毒株类似特性的克隆病毒 上。下文将详细描述我们的表征。
用Dryvax接种MRC-5细胞培养物,通过蚀斑纯化得到六个痘 苗病毒克隆。每个克隆再被克隆两次,以确保其克隆性(clonality)并 且排除污染物。也以感染倍数(MOI)每细胞0.001 PFU将Dryvax接 种于MRC-5细胞培养物中,以生成非克隆(多克隆)病毒制备物。 此病毒随后在低MOI下在MRC-5细胞中传代两次。所有六个克隆和 多克隆制备物都进行一系列与Dryvax的对比分析,比较它们的体外 和体内特性。具体地说,对每个克隆和多克隆制备物,都分析了其蚀 斑形态、MRC-5细胞中的产率、限制性核酸内切酶图谱、兔子皮肤 中痘疱的形成和小鼠的神经毒力。对克隆的一个亚组还进行了在小鼠 中诱导保护性免疫的测试。目的是为了从Dryvax合并液(pool)中选 择与Dryvax生物学相似的疫苗毒株。表1归纳了这些研究的结果。
表1七个痘苗病毒候选物的表征 测试 结果(相对于Dryvax,用于定性分析) Dry- vax 克隆 1 克隆 2 克隆 3 克隆 4 克隆 5 克隆 6 多克 隆 蚀斑大小(平 均,毫米) 0.42 0.43 0.49 0.36 0.65 0.25 0.27 0.46 MRC-5中 的产率* 4.0 13.5 7.0 10.6 15.6 4.7 1.5 7.0 RE分析 相同 相同 相同 相同 相同 相同 相同 兔子皮肤测试 高 相同 高 相同 高 相同 高 乳鼠神经毒力 高 相同 高 相同 高 相同 高 小鼠免疫原性 未测 相同 相同 相同 未测 未测 未测
*Pfu/ml×106
从这些研究可以看出,克隆2和克隆4具有的特性显示这些克隆 适合作为新的天花疫苗。克隆6也有合适的特性,但是培养物中的生 长不如克隆2和克隆4。
乳鼠神经毒力
经确定,成年小鼠不受颅内(IC)接种未改性的Dryvax的影响。 因此对乳鼠进行测试。给乳鼠(3-4日龄)注射十倍稀释的病毒,然 后测量存活时间。进行了三次实验,每次实验都以Dryvax测试结果 作为基准。我们观察到使用~-1.0log10PFU的LD50颅内接种Dryvax, 乳鼠无一例外地染上致命脑炎,平均存活时间为7天。因此确定此项 测试可以用于比较疫苗候选物和亲本Dryvax的神经毒力。表2归纳 了这些实验的结果,图1A到1D显示了此项分析中存活小鼠的数量 和平均存活时间。
表2对乳鼠的神经毒力,痘苗疫苗候选物 参数 实验 病毒 LD501 LD901 AST2 (SD) 1 Dryvax 1.68 3.03 7.78 (4.19) 多克隆 <1.3 1.94 6.09 (1.14) 克隆1 <2.3 <2.3 4.20 (1.03) 2 Dryvax 1.3 2.1 6.67 (0.71) 克隆2 1.55 2.25 6.80 (2.74) 克隆3 <1.3 <1.3 5.00 (1.16) 克隆4 2.59 3.16 6.11 (1.36) 3 Dryvax 2.4 4.15 8.64 (3.42) 克隆5 <1.3 <1.3 4.08 (1.08) 克隆6 1.57 2.47 7.73 (4.63) 1感染后第10天每0.02mL接种体50%脑内致死剂量 1感染后第10天每0.02mL接种体90%脑内致死剂量 2平均存活时间,~10-100LD50下的天数(标准差)
另外的测试可以用来测试疫苗候选物的毒力。例如,我们进行了 兔子的皮肤毒力测试。使用未传代Dryvax进行真皮内接种成功地进 行了此项测试,所述接种造成与剂量相关的痘疱伤害,表现为红斑、 硬化、某些情况下中枢神经受到伤害。作为另一个例子,可以采用猴 子神经毒力测试。在此项测试中,经过克隆的源自Dryvax的候选物 以不同的病毒剂量与Dryvax的颅内接种进行比较。
我们也开发了小鼠攻击模型用于防护性测试。在这个模型中,用 痘苗的WR毒株通过鼻内(IN)途径攻击6-8周龄的小鼠。LD50是~ 4.5Log10PFU,攻击后平均存活时间是6-7天。此项测试对于用新的 疫苗候选物进行临床防护研究是有足够说服力的。使用其他正痘病毒 (例如牛痘病毒)的类似模型也可以使用。
也测试了Dryvax和克隆2和4在小鼠中诱导抗痘苗WR攻击的 防护性免疫的能力。也测试了克隆3,以确定毒力较高的克隆是否也 诱导较高的免疫应答。使用不同剂量的每种病毒毒株免疫4周龄的小 鼠。使用分叉针通过皮上划痕将病毒接种到皮肤中,这种方法是用于 人类Dryvax接种的方法。免疫3周之后,使用6.5Log10 PFU(100 LD50)的牛痘WR通过IN途径对小鼠进行攻击。测定攻击后14天 的存活率。对于所有病毒毒株,都观察到剂量响应性的防护,所有克 隆都能至少与Dryvax一样保护小鼠。这些克隆的保护活性没有区 别。表3归纳了不同免疫剂量的平均存活时间,表4显示了50%保 护剂量(PD50)的测试结果。
表3使用100LD50痘苗WR攻击后免疫小鼠的存活时间 接种剂量 (log10 pfu/ml) 平均存活时间(天) Dryvax 克隆3 克隆2 克隆4 8 14.0 NT 14.0 NT 7 14.0 14.0 14.0 14.0 6 12.0 14.0 12.4 12.4 5 7.6 8.8 7.2 7.0 4 5.2 5.2 7.8 5.4 3 5.6 5.4 5.4 4.8 2 5.2 5.8 5.2 NT
表4 Dryvax和疫苗候选物50%防护剂量 PD50(log10pfu) Dryvax 克隆3 克隆2 克隆4 5.5 5.2 5.4 5.5
限制性核酸内切酶分析
Dryvax和每种疫苗候选物的DNA经过纯化,用HindIII限制性 核酸内切酶进行酶解,确定这些毒株中是否存在基因差异。实验没有 检测到差异,如图2中经过酶解的基因组DNA电泳分析所示。
细胞底物的选择
还研究了MRC-5细胞和初级鸡胚成纤维细胞(CEF)中Dryvax 的复制和产量,结果显示CEF细胞中的产量要低于MRC-5细胞。因 此选择MRC-5细胞作为疫苗形成研究的底物。候选物可以在CEF或 者其他细胞中进行测试,比较疫苗产量。
对MRC-5细胞扩增的生长培养基也进行了比较。Williams E培 养基、低限基本培养基(MEM,Minimal Essential Medium)和Dulbecco’s MEM的结果是一样的。补充了额外的胎牛血清(FBS)、非必需氨 基酸、维生素和丙酮酸钠的培养基相对于使用10%FBS的培养基而 言,在细胞成活或生长方面并没有优势。在合适的细胞接种密度条件 下MRC-5生长动力学是合适的。细胞培养密度为2×104细胞/cm2。 分裂的时间为3-5天,每次分裂的群体倍增为1-1.5。限定了用于病 毒生长的细胞库生成和细胞扩增的方法。结果显示,标准的胰蛋白酶 方法也适用于细胞分裂。使用细菌链霉蛋白酶的另一种方法也是可用 的,而且在生产过程中可能有助于避免出现源于动物的产品。
权利要求阐述了本发明的其他实施方案。
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