MiR－125b在急性髓细胞白血病诊断或治疗中的应用
阅读：1032发布：2020-07-07
专利汇可以提供MiR－125b在急性髓细胞白血病诊断或治疗中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了miR－125b在急性髓细胞白血病诊断或 治疗 中的应用。本发明根据miR－125b在急性髓细胞白血病初发患者的骨髓中表达 水 平远远高于其在正常骨髓中的表达水平这一性质，将miR－125b应用于对急性髓细胞白血病(AML)的早期诊断。本发明所揭示的miR－125b在AML初发及复发患者尤其是M3型中的高表达，但在 完全缓解 患者中却降低到正常水平，为miR－125b开拓了新的应用方向，即miR－125b不仅能准确预测急性髓细胞白血病(AML)的 预后 ，也可以作为治疗AML的药物靶标。，下面是MiR－125b在急性髓细胞白血病诊断或治疗中的应用专利的具体信息内容。
技术领域
本发明涉及生物医学诊断领域，具体涉及miR-125b在急性髓细 胞白血病诊断或治疗中的应用。
背景技术
自从1993年Lee等(Lee，R.C.，Feinbaum，R.L.，Ambros，V，The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antise nse complementarity to lin-14.Cell.1993.75，843-854.)在线虫中发 现第一个microRNA(miRNA)lin-4之后，许多实验室又在线虫和其 他动物以及人类中发现了大量的miRNAs。
miRNA是一类长约22个核苷酸的小分子非编码RNA，广泛存在 于动物和植物等多细胞生物中，它可以通过与靶基因mRNA的特定位 点结合，诱导该mRNA的降解或抑制该蛋白质的合成，在转录水平或 转录后水平导致基因沉默，从而参与基因的表达调控。miRNAs在细 胞分化、个体生长、发育以及疾病发生过程中发挥着重要作用。计算 机分析表明，miRNAs的数目超过编码蛋白基因的1％(Lai，E.C.，Tom ancak，P.，Williams，R.W.，et al.Computational identification of Droso phila microRNA genes.Genome Biol.2003.4，R42.)；30％以上的编码 蛋白基因可能受miRNAs的调节(Berezikov，E.，Guryev，V.，van de B elt，J.，et al.Phylogenetic shadowing and computational identificatio n of human microRNA genes.Cell.2005.120，21-24.)。小RNA分子 具有组织或时空特异性，而且小RNA与靶基因的作用存在多效性，即 同一miRNA与不同靶基因的相互作用，从而可以影响很多性状。
最近的研究表明，超过50％的miRNA基因位于与癌症相关的基 因区或者脆性位点(fragile site)(Calin，G.A.，Sevignani，C.，Dan Dumitru，C.，et al，2005.Human microRNA genes are frequently loc ated at fragile sites and genomic regions involved in cancers.Proc. Natl.Acad.Sci.2004.101，2999-3004)，这说明miRNAs可能在肿 瘤发生过程中起着至关重要的作用。同时，大量的研究表明，miRN As作为原癌基因及抑癌基因在癌症的发生和发展过程中发挥着重要 作用(He L，Thomson J M，Hemann M T，et al.A microRNA poly cistron as a potential human oncogene.Nature.2005.435：828-33； O’Donnell KA，Wentzel EA，Zeller KI，Dang CV，et al.c-Myc-reg ulated microRNAs modulate E2F1 expression.Nature.2005.435：839- 43.)。
白血病是由于髓源和淋巴源的血前体细胞分化和增殖功能失调 导致的一种血液性疾病。目前，白血病的发病率在成人中为3～4人/ 10万人到17～18人/10万人(Estey E，H.Acute myeloid leuk aemia.Lancet.2006.25；368(9550)：1894-907)。同时，有研究表明， 白血病在小儿恶性肿瘤中的发病率最高，达35％左右，被认为是14 岁以下小儿癌症中的“头号杀手”(Tracy Lightfoot.Aetiology of Ch ildhood Leukemia.Bioelectromagnetics.2005.Supplement 7：S5-S1 1.)。全世界15岁以下儿童白血病的发病率为3～4/10万人，在我国每 年约有5000左右的儿童发生白血病。它不仅给患者家庭带来巨大的痛 苦和经济负担，而且给社会带来沉重的负担。白血病最常见的类型为 急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukaemia，ALL)和急性髓 细胞白血病(acute myeloid leukaemia，AML)。根据FAB分型标准， AML共分M1-M7等7个型，即M1：未分化的原粒细胞白血病；M2： 部分分化的原粒细胞白血病；M3：急性早幼粒细胞白血病；M4：急 性粒、单核细胞白血病；M5：急性单核细胞白血病；M6：急性红血 病或红白血病；M7：急性巨核细胞白血病。AML的发病机理大多与 癌基因的融合蛋白有关，是染色体移位或倒置引起的。有关AML中 染色体的移位与倒置已经有了较多研究，常见的有t(9；11)，t(15；17)，t (8；21)以及inv(16)，在AML患者中大约占20～30％(Lee S，Chen J， Zhou G，et al.Gene expression profiles in acute myeloid leukemia with common translocations using SAGE.Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Jan 24；103(4)：1030-5)。随着联合化疗和造血干细胞移植技 术的应用，目前白血病的存活率大为改观，但治疗相关的死亡率仍然 高达20％(Cassileth，P.A.，Harrington，D.P.，Appelbaum，F.R.，et al. Chemotherapy compared with autologous or allogeneic bone marrow transplantation in the management of acute myeloid leukemia in fir- st remission.N.Engl.J.Med.1998.339，1649-1656)。尽管大多数A ML患者能够获得完全缓解，但是能够最终治愈的患者不到50％(Ar ceci，R.J.Progress and controversies in the treatment of pediatric acute myelogenous leukemia.Current Opinion in Hematology.2002. 9：353-360)。
AML是一个具有高度复发危险的白血病亚型，而且AML的预后 差。因此阐明AML发病的分子机制及寻找新的治疗靶点对提高其存 活率具有重要的意义。
miRNA是一类长约22个核苷酸的小分子非编码RNA，广泛存在 于动物和植物等多细胞生物中，它可以通过与靶基因mRNA的特定位 点结合，诱导该mRNA的降解或抑制该蛋白质的合成，在转录水平或 转录后水平导致基因沉默，从而参与基因的表达调控。miRNAs在细 胞分化、个体生长、发育以及疾病发生过程中发挥着重要作用。计算 机分析表明，miRNAs的数目超过编码蛋白基因的1％(Lai，E.C.，Tom ancak，P.，Williams，R.W.，et al.Computational identification of Droso phila microRNA genes.Genome Biol.2003.4，R42.)；30％以上的编码 蛋白基因可能受miRNAs的调节(Berezikov，E.，Guryev，V.，van de B elt，J.，et al.Phylogenetic shadowing and computational identificatio n of human microRNA genes.Cell.2005.120，21-24.)。小RNA分子 具有组织或时空特异性，而且小RNA与靶基因的作用存在多效性，即 同一miRNA与不同靶基因的相互作用，从而可以影响很多性状。
最近的研究表明，超过50％的miRNA基因位于与癌症相关的基 因区或者脆性位点(fragile site)(Calin，G.A.，Sevignani，C.，Dan Dumitru，C.，et al，2005.Human microRNA genes are frequently loc ated at fragile sites and genomic regions involved in cancers.Proc. Natl.Acad.Sci.2004.101，2999-3004)，这说明miRNAs可能在肿 瘤发生过程中起着至关重要的作用。同时，大量的研究表明，miRN As作为原癌基因及抑癌基因在癌症的发生和发展过程中发挥着重要 作用(He L，Thomson J M，Hemann M T，et al.A microRNA poly cistron as a potential human oncogene.Nature.2005.435：828-33； O’Donnell KA，Wentzel EA，Zeller KI，Dang CV，et al.c-Myc-reg ulated microRNAs modulate E2F1 expression.Nature.2005.435：839- 43.)。
白血病是由于髓源和淋巴源的血前体细胞分化和增殖功能失调 导致的一种血液性疾病。目前，白血病的发病率在成人中为3～4人/ 10万人到17～18人/10万人(Estey E，H.Acute myeloid leuk aemia.Lancet.2006.25；368(9550)：1894-907)。同时，有研究表明， 白血病在小儿恶性肿瘤中的发病率最高，达35％左右，被认为是14 岁以下小儿癌症中的“头号杀手”(Tracy Lightfoot.Aetiology of Ch ildhood Leukemia.Bioelectromagnetics.2005.Supplement 7：S5-S1 1.)。全世界15岁以下儿童白血病的发病率为3～4/10万人，在我国每 年约有5000左右的儿童发生白血病。它不仅给患者家庭带来巨大的痛 苦和经济负担，而且给社会带来沉重的负担。白血病最常见的类型为 急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukaemia，ALL)和急性髓 细胞白血病(acute myeloid leukaemia，AML)。根据FAB分型标准， AML共分M1-M7等7个型，即M1：未分化的原粒细胞白血病；M2： 部分分化的原粒细胞白血病；M3：急性早幼粒细胞白血病；M4：急 性粒、单核细胞白血病；M5：急性单核细胞白血病；M6：急性红血 病或红白血病；M7：急性巨核细胞白血病。AML的发病机理大多与 癌基因的融合蛋白有关，是染色体移位或倒置引起的。有关AML中 染色体的移位与倒置已经有了较多研究，常见的有t(9；11)，t(15；17)，t (8；21)以及inv(16)，在AML患者中大约占20～30％(Lee S，Chen J， Zhou G，et al.Gene expression profiles in acute myeloid leukemia with common translocations using SAGE.Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Jan 24；103(4)：1030-5)。随着联合化疗和造血干细胞移植技 术的应用，目前白血病的存活率大为改观，但治疗相关的死亡率仍然 高达20％(Cassileth，P.A.，Harrington，D.P.，Appelbaum，F.R.，et al. Chemotherapy compared with autologous or allogeneic bone marrow transplantation in the management of acute myeloid leukemia in fir- st remission.N.Engl.J.Med.1998.339，1649-1656)。尽管大多数A ML患者能够获得完全缓解，但是能够最终治愈的患者不到50％(Ar ceci，R.J.Progress and controversies in the treatment of pediatric acute myelogenous leukemia.Current Opinion in Hematology.2002. 9：353-360)。
AML是一个具有高度复发危险的白血病亚型，而且AML的预后 差。因此阐明AML发病的分子机制及寻找新的治疗靶点对提高其存 活率具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对AML高发病率但是现有技术对AML的 预后差等问题，提供miR-125b在AML早期诊断或治疗中的应用。
目前小儿白血病的发病率极高，其中急性髓细胞白血病AML更 是一个具有高度复发危险的白血病亚型，而现有技术依然无法做到很 好地对AML进行早期诊断，导致AML患者预后差，而大量的研究表 明，miRNAs作为原癌基因及抑癌基因在癌症的发生和发展过程中发 挥着重要作用，因此针对白血病，特别是与AML相关的小RNA进行 研究，不但可以丰富白血病的致病机理，而且也能为白血病，尤其是 AML的早期诊断以及临床治疗提供新的、有效的手段。
为了实现上述发明目的，本发明采用microRNA微阵列芯片 (microRNA microarray chip)技术对36例白血病患者骨髓中的白血病 细胞(其中AML18例，ALL18例)及7例正常对照的骨髓中的单个 核细胞的microRNA表达情况进行了分析，结果表明miR-125b在 AML中特异高表达，上调达12倍；对芯片数据的进一步分析发现 miR-125b在M3亚型中表达的上调倍数较其他亚型高。
进一步采用定量RT-PCR(real-time RT-PCR)对32例AML患者 白血病细胞中的miR-125b的表达进行检测，发现miR-125b在M1、 M2、M3、M4、M5中高表达，其中在M3中表达量最高，跟芯片结 果一致。
同时，采用real-time RT-PCR对3例M3初发患者、2例M3复 发患者以及4例完全缓解(CR)患者的miR-125b的表达水平进行检 测，结果发现miR-125b在初发以及复发患者中高表达，而在CR患 者骨髓中表达恢复至正常水平，这表明，miR-125b可以作为AML尤 其是M3的预后分子，而且miR-125b在AML中尤其是M3中可能作 为癌基因发挥作用。
综上所述，本发明可根据miRNA的表达水平对急性髓细胞白 血病(AML)进行早期诊断及预后预测。先对患者骨髓样品中的 miRNA的表达水平进行检测，然后根据检测结果与正常骨髓样品中 的miRNA表达水平进行对比，从而对患者的急性髓细胞白血病进行 早期诊断及预后预测，这里的miRNA的表达水平检测主要是针对 miR-125b表达水平的检测，其检测的判断依据是：AML患者其骨髓 样品中的miR-125b的表达水平相较于正常骨髓中miR-125b的表达水 平来说是上调的，且上调2倍以上，其中，AML中的M3型患者， 其骨髓样品中miR-125b的表达水平的上调倍数远高于其他亚型。
此外，miR-125b在AML患者尤其是M3型中的高表达，说明 miR-125b在AML中尤其是M3中可能作为癌基因发挥作用，因此可 以采用将miR-125b的反义寡核苷酸作为治疗AML的小分子药物。
与现有技术对比，本发明具有如下优点：1.本发明根据miR-125b 在急性髓细胞白血病患者的骨髓中表达水平远远高于其在正常骨髓 中的表达水平这一性质，将miR-125b应用于对急性髓细胞白血病 (AML)的早期诊断；2.本发明所揭示的miR-125b在AML初发及 复发患者尤其是M3型中的高表达，但在完全缓解患者中却降低到正 常水平，也为miR-125b开拓了新的应用方向，即miR-125b不仅能准 确预测急性髓细胞白血病(AML)的预后，而且其反义寡核苷酸还 可以作为治疗AML的药物靶标。
附图说明
图1为microRNA芯片图；
其中：A为18例ALL microRNA芯片聚类图，B为18例AML microRNA芯片聚类图。
图2为定量RT-PCR验证miR-125b在AML各亚型患者中的表达 量对比柱形图；
其中：1为M1亚型，2为M2亚型，3为M3亚型，4为M4亚 型，5为M5亚型，*为p＜0.05，**为p＜0.01；
图3为定量RT-PCR检测miR-125b在3例M3初发，2例M3复 发及4例M3完全缓解患者中的表达量对比柱形图；
其中：1为对照组(健康人)，2、3和4为M3初发患者、5和6 为M3复发患者，7、8、9和10为完全缓解患者。
目前小儿白血病的发病率极高，其中急性髓细胞白血病AML更 是一个具有高度复发危险的白血病亚型，而现有技术依然无法做到很 好地对AML进行早期诊断，导致AML患者预后差，而大量的研究表 明，miRNAs作为原癌基因及抑癌基因在癌症的发生和发展过程中发 挥着重要作用，因此针对白血病，特别是与AML相关的小RNA进行 研究，不但可以丰富白血病的致病机理，而且也能为白血病，尤其是 AML的早期诊断以及临床治疗提供新的、有效的手段。
为了实现上述发明目的，本发明采用microRNA微阵列芯片 (microRNA microarray chip)技术对36例白血病患者骨髓中的白血病 细胞(其中AML18例，ALL18例)及7例正常对照的骨髓中的单个 核细胞的microRNA表达情况进行了分析，结果表明miR-125b在 AML中特异高表达，上调达12倍；对芯片数据的进一步分析发现 miR-125b在M3亚型中表达的上调倍数较其他亚型高。
进一步采用定量RT-PCR(real-time RT-PCR)对32例AML患者 白血病细胞中的miR-125b的表达进行检测，发现miR-125b在M1、 M2、M3、M4、M5中高表达，其中在M3中表达量最高，跟芯片结 果一致。
同时，采用real-time RT-PCR对3例M3初发患者、2例M3复 发患者以及4例完全缓解(CR)患者的miR-125b的表达水平进行检 测，结果发现miR-125b在初发以及复发患者中高表达，而在CR患 者骨髓中表达恢复至正常水平，这表明，miR-125b可以作为AML尤 其是M3的预后分子，而且miR-125b在AML中尤其是M3中可能作 为癌基因发挥作用。
综上所述，本发明可根据miRNA的表达水平对急性髓细胞白 血病(AML)进行早期诊断及预后预测。先对患者骨髓样品中的 miRNA的表达水平进行检测，然后根据检测结果与正常骨髓样品中 的miRNA表达水平进行对比，从而对患者的急性髓细胞白血病进行 早期诊断及预后预测，这里的miRNA的表达水平检测主要是针对 miR-125b表达水平的检测，其检测的判断依据是：AML患者其骨髓 样品中的miR-125b的表达水平相较于正常骨髓中miR-125b的表达水 平来说是上调的，且上调2倍以上，其中，AML中的M3型患者， 其骨髓样品中miR-125b的表达水平的上调倍数远高于其他亚型。
此外，miR-125b在AML患者尤其是M3型中的高表达，说明 miR-125b在AML中尤其是M3中可能作为癌基因发挥作用，因此可 以采用将miR-125b的反义寡核苷酸作为治疗AML的小分子药物。
与现有技术对比，本发明具有如下优点：1.本发明根据miR-125b 在急性髓细胞白血病患者的骨髓中表达水平远远高于其在正常骨髓 中的表达水平这一性质，将miR-125b应用于对急性髓细胞白血病 (AML)的早期诊断；2.本发明所揭示的miR-125b在AML初发及 复发患者尤其是M3型中的高表达，但在完全缓解患者中却降低到正 常水平，也为miR-125b开拓了新的应用方向，即miR-125b不仅能准 确预测急性髓细胞白血病(AML)的预后，而且其反义寡核苷酸还 可以作为治疗AML的药物靶标。
附图说明
图1为microRNA芯片图；
其中：A为18例ALL microRNA芯片聚类图，B为18例AML microRNA芯片聚类图。
图2为定量RT-PCR验证miR-125b在AML各亚型患者中的表达 量对比柱形图；
其中：1为M1亚型，2为M2亚型，3为M3亚型，4为M4亚 型，5为M5亚型，*为p＜0.05，**为p＜0.01；
图3为定量RT-PCR检测miR-125b在3例M3初发，2例M3复 发及4例M3完全缓解患者中的表达量对比柱形图；
其中：1为对照组(健康人)，2、3和4为M3初发患者、5和6 为M3复发患者，7、8、9和10为完全缓解患者。
具体实施方式
实施例1 RNA提取
用淋巴细胞分离液分离的单个核细胞按照比例(1×107细胞加入 1ml的Trizol)加入Trizol后，用移液器反复吹打细胞，室温放置5分钟， 使细胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温放置3分钟。 4℃，12000rpm，离心15分钟。转移上清至一新的1.5ml离心管中，加 入0.5ml异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10分钟。4℃，12000rpm， 离心10分钟。弃上清，向沉淀中加入1ml的75％乙醇，4℃，7500×g， 离心5分钟.真空抽干后加入适量无RNA酶的水溶解。RNA甲醛变性胶 电泳，28S亮度约是18S的2倍。
实施例2 制备MicroRNA芯片
采用博奥生物有限公司的哺乳动物microRNA芯片V2.0。其中 包括针对人576(包含Nature杂志预测的有122个。Nature 2005，434， 338-345.)、大鼠238、小鼠358个成熟micro RNA，由于人、大鼠 和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集，一共设计了 743条探针(数据来自Sanger miRNA数据库：miRBase8.2，2006年7 月)。把这些探针用芯片点样仪SmartArrayTM(CapitalBio Corp.，Beijing， China)点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯 片上的样品还包括人的U6，tRNA作为内标；8个人工制备的30个 碱基长度RNA对应的探针作为芯片的外标(Zip5、Zip13、Zip15、 Zip21、Zip23、Zip25、Y2、Y3)，Hex作为点样阳性对照，50％DMSO 作为杂交阴性对照。
实施例3 MicroRNA芯片的检测
本实施例采用实施例2所制备的miRNA芯片进行检测。
利用实施例1所述RNA提取方法，对36例白血病患者骨髓中的 白血病细胞(其中AML18例，ALL18例)及7例正常对照的骨髓中 的单个核细胞进行总RNA的提取，然后再分别取50～100.0g总RNA 用PEG方法(Thomson，J.M.，Parker，J.，Perou，C.M.，Hammond，S.M.A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat.Methods.2004.1，47-53.)分离miRNA。
利用T4RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇 沉淀，吹干后用于芯片杂交。芯片杂交所采用的方法为本领域通用技 术：将RNA溶于16μL杂交液中(杂交液的配方为通用配方：15％ 甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt′s)，于42℃杂交过夜；杂交结 束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4min，而后 在0.2×SSC液体中室温洗4min；玻片甩干后即可用于扫描。
芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进 行扫描。
实施例4 数据分析
采用LuxScan3.0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像进 行分析。将负值信号校正到10；删除弱点和坏点：如果基因在所有 样品中的信号值都小于300，则判断为弱点；如果重复点的信号变异 系数(CV)大于0.3，则寻找离散点并用剩余点的均值替代。
数据预处理以后，再根据各张芯片的全局均值(global mean)进 行片间校正，使得各张芯片的global mean相同；最后用微阵列显著 性分析软件Significance Analysis of Microarrays(SAM，version 2.1)挑 选差异表达基因(Huiling He，Krystian Jazdzewski，Wei Li，et al.The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma.PNAS.2005. 102，19075-19080)。筛选条件为：错误发现率FDR控制在5％以内， 倍数变化不低于2倍。
分析结果表明：miR-125b在AML中特异高表达，上调达12倍； miR-125b在M3亚型中表达的上调倍数较其他亚型高。
图1为microRNA芯片图。
实施例5 定量RT-PCR检测
本实施例采用试剂盒Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit(GenePharma，Shanghai)进行microRNA的检测。
利用实施例1所述RNA提取方法，分别对32例AML患者骨髓 中的白血病细胞进行总RNA的提取，32例AML中：5例为M1亚 型；15例为M2亚型；6例为M3亚型；3例为M4亚型；3例为M5 亚型。
定量PCR的方法采用上述试剂盒的方法：分别取上述总RNA各 0.2～200ng作为模板，使用特定miRNA的逆转录引物(这里的引物是 上述试剂盒自带的)合成cDNA，以cDNA为模板，使用特异性引物 及Molecular Beacon探针(这里的特异性引物和Molecular Beacon探针 都是上述试剂盒自带的)在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩 增，并测得样品的Ct(荧光值达到设定的阈值时的循环数)值。同时 以U6snRNA作为内参，采用2-ΔΔC T的方法计算miRNA的相对表达量。
根据最后的相对表达量作图，如图2所示，发现miR-125b在 M1、M2、M3、M4、M5中均为高表达，且在M3中表达量最高，这 一结论跟实施例4的芯片检测结果一致。
实施例6 定量RT-PCR检测
本实施例采用试剂盒Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit(GenePharma，Shanghai)进行microRNA的检测。
利用实施例1所述RNA提取方法，分别对3例M3初发患者、2 例M3复发患者和4例完全缓解(CR)患者的骨髓中白血病细胞进 行总RNA的提取。
定量PCR的方法采用上述试剂盒的方法：分别取上述总RNA各 0.2～200ng作为模板，使用特定miRNA的逆转录引物(这里的引物是 上述试剂盒自带的)合成cDNA，以cDNA为模板，使用特异性引物 及Molecular Beacon探针(这里的特异性引物和Molecular Beacon探针 都是上述试剂盒自带的)在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩 增，并测得样品的Ct值。同时以U6snRNA作为内参，采用2-ΔΔC T的方 法计算miRNA的相对表达量。
根据最后的相对表达量进行作图，如图3所示，miR-125b在初 发以及复发患者中高表达，而在CR患者骨髓中表达恢复至正常水平， 这表明，miR-125b可以作为AML尤其是M3的预后分子，而且 miR-125b在AML中尤其是M3中可能作为癌基因发挥作用，因此， 可以开发针对miR-125b的反义寡核苷酸作为治疗AML的小分子药 物。
用淋巴细胞分离液分离的单个核细胞按照比例(1×107细胞加入 1ml的Trizol)加入Trizol后，用移液器反复吹打细胞，室温放置5分钟， 使细胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温放置3分钟。 4℃，12000rpm，离心15分钟。转移上清至一新的1.5ml离心管中，加 入0.5ml异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10分钟。4℃，12000rpm， 离心10分钟。弃上清，向沉淀中加入1ml的75％乙醇，4℃，7500×g， 离心5分钟.真空抽干后加入适量无RNA酶的水溶解。RNA甲醛变性胶 电泳，28S亮度约是18S的2倍。
实施例2 制备MicroRNA芯片
采用博奥生物有限公司的哺乳动物microRNA芯片V2.0。其中 包括针对人576(包含Nature杂志预测的有122个。Nature 2005，434， 338-345.)、大鼠238、小鼠358个成熟micro RNA，由于人、大鼠 和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集，一共设计了 743条探针(数据来自Sanger miRNA数据库：miRBase8.2，2006年7 月)。把这些探针用芯片点样仪SmartArrayTM(CapitalBio Corp.，Beijing， China)点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯 片上的样品还包括人的U6，tRNA作为内标；8个人工制备的30个 碱基长度RNA对应的探针作为芯片的外标(Zip5、Zip13、Zip15、 Zip21、Zip23、Zip25、Y2、Y3)，Hex作为点样阳性对照，50％DMSO 作为杂交阴性对照。
实施例3 MicroRNA芯片的检测
本实施例采用实施例2所制备的miRNA芯片进行检测。
利用实施例1所述RNA提取方法，对36例白血病患者骨髓中的 白血病细胞(其中AML18例，ALL18例)及7例正常对照的骨髓中 的单个核细胞进行总RNA的提取，然后再分别取50～100.0g总RNA 用PEG方法(Thomson，J.M.，Parker，J.，Perou，C.M.，Hammond，S.M.A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat.Methods.2004.1，47-53.)分离miRNA。
利用T4RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇 沉淀，吹干后用于芯片杂交。芯片杂交所采用的方法为本领域通用技 术：将RNA溶于16μL杂交液中(杂交液的配方为通用配方：15％ 甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt′s)，于42℃杂交过夜；杂交结 束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4min，而后 在0.2×SSC液体中室温洗4min；玻片甩干后即可用于扫描。
芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进 行扫描。
实施例4 数据分析
采用LuxScan3.0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像进 行分析。将负值信号校正到10；删除弱点和坏点：如果基因在所有 样品中的信号值都小于300，则判断为弱点；如果重复点的信号变异 系数(CV)大于0.3，则寻找离散点并用剩余点的均值替代。
数据预处理以后，再根据各张芯片的全局均值(global mean)进 行片间校正，使得各张芯片的global mean相同；最后用微阵列显著 性分析软件Significance Analysis of Microarrays(SAM，version 2.1)挑 选差异表达基因(Huiling He，Krystian Jazdzewski，Wei Li，et al.The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma.PNAS.2005. 102，19075-19080)。筛选条件为：错误发现率FDR控制在5％以内， 倍数变化不低于2倍。
分析结果表明：miR-125b在AML中特异高表达，上调达12倍； miR-125b在M3亚型中表达的上调倍数较其他亚型高。
图1为microRNA芯片图。
实施例5 定量RT-PCR检测
本实施例采用试剂盒Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit(GenePharma，Shanghai)进行microRNA的检测。
利用实施例1所述RNA提取方法，分别对32例AML患者骨髓 中的白血病细胞进行总RNA的提取，32例AML中：5例为M1亚 型；15例为M2亚型；6例为M3亚型；3例为M4亚型；3例为M5 亚型。
定量PCR的方法采用上述试剂盒的方法：分别取上述总RNA各 0.2～200ng作为模板，使用特定miRNA的逆转录引物(这里的引物是 上述试剂盒自带的)合成cDNA，以cDNA为模板，使用特异性引物 及Molecular Beacon探针(这里的特异性引物和Molecular Beacon探针 都是上述试剂盒自带的)在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩 增，并测得样品的Ct(荧光值达到设定的阈值时的循环数)值。同时 以U6snRNA作为内参，采用2-ΔΔC T的方法计算miRNA的相对表达量。
根据最后的相对表达量作图，如图2所示，发现miR-125b在 M1、M2、M3、M4、M5中均为高表达，且在M3中表达量最高，这 一结论跟实施例4的芯片检测结果一致。
实施例6 定量RT-PCR检测
本实施例采用试剂盒Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit(GenePharma，Shanghai)进行microRNA的检测。
利用实施例1所述RNA提取方法，分别对3例M3初发患者、2 例M3复发患者和4例完全缓解(CR)患者的骨髓中白血病细胞进 行总RNA的提取。
定量PCR的方法采用上述试剂盒的方法：分别取上述总RNA各 0.2～200ng作为模板，使用特定miRNA的逆转录引物(这里的引物是 上述试剂盒自带的)合成cDNA，以cDNA为模板，使用特异性引物 及Molecular Beacon探针(这里的特异性引物和Molecular Beacon探针 都是上述试剂盒自带的)在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩 增，并测得样品的Ct值。同时以U6snRNA作为内参，采用2-ΔΔC T的方 法计算miRNA的相对表达量。
根据最后的相对表达量进行作图，如图3所示，miR-125b在初 发以及复发患者中高表达，而在CR患者骨髓中表达恢复至正常水平， 这表明，miR-125b可以作为AML尤其是M3的预后分子，而且 miR-125b在AML中尤其是M3中可能作为癌基因发挥作用，因此， 可以开发针对miR-125b的反义寡核苷酸作为治疗AML的小分子药 物。
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