本发明提供的治疗脑缺血再灌注损伤的药物含有50%以上的活 性组分水飞蓟宾-卵磷脂复合物(SLC)。
水飞蓟宾(silybin)是一种黄
酮类天然抗
氧化剂,1968年由 Wagner等从菊科
植物水飞蓟中提取,对血小板聚集及血栓的形成有 很好的抑制作用,有证据表明水飞蓟宾具有抗菌、抗毒素、抗氧化和 减少自由基的作用。一般认为,核转录因子NF-κB是介入细胞因子 刺激内皮细胞表面粘附分子表达的中心转录因子。抗氧化合物能有效 地抑制NF-κB的活性,因而抑制粘附因子的表达。
细胞间粘附分子、中性粒细胞在缺血再灌注脑区的上调和浸润中 起着极其重要的作用。缺血再灌注期间ICAM-1的表达和中性粒细胞 的浸润不仅影响了局部的血液供应而且还可直接破坏脑组织结构。本 发明从水飞蓟宾-卵磷脂复合物(SLC)具有抗自由基和抗脂质过氧 化的作用来改变ICAM-1的表达和中性粒细胞浸润的原理出发,发现 了水飞蓟宾-卵磷脂复合物复合物对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
脑缺血再灌注后,ICAM-mRNA和ICAM-1
蛋白质表达明显增加, 中性粒细胞浸润数亦明显增加,脑梗塞面积扩大和组织
含水量增加。 水飞蓟宾-卵磷脂复合物复合物能下调ICAM-1的表达和抑制白细 胞的聚集,特别是减少中性粒细胞的聚集和粘附,从而减少蛋白水解 酶、溶酶体酶、氧自由基和其他效应分子的释放,使酶类和自由基引 起的链
锁反应削弱,阻止细胞膜的崩解。同时,抑制缺血再灌注损伤 时的PAF和EAA的大量释放,改善神经症状,缩小梗塞面积和减轻脑 水肿,对缺血再灌注脑损伤有一定的保护作用。
经口服
给药时,首先使本发明与常规的药用辅剂如赋形剂、润 滑剂、崩解剂等混合,将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式;经非口 服给药时,可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时, 可使用常规的制剂技术。
本发明另一方面提供制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物的方法:
称取水飞蓟宾28~60g,溶入热丙酮1250~1450ml中,得暗红 色澄明液体,45~58℃保温,加入卵磷脂47~70g,搅拌,直至溶液 澄明,约5~15min,接回流装置,边加热保温边振荡反应0.5~1.5h, 拆除回流装置,
真空浓缩至反应液体积为135~315ml,迅速加入到 正己烷2856~3686ml中,得黄色沉淀物,上层液体为黄白色乳浊液, 加压过滤,用正己烷洗涤沉淀,置于真空干燥箱中室干燥,得黄色固 体产物86~125g。
下面的
实施例可更详细地说明本发明,但不以任何形式限制本发 明。
实施例1 活性成分为SLC的治疗脑缺血再灌注损伤的药物的制备
称取水飞蓟宾(上海朝晖药厂)43g,溶入热丙酮1350ml中,得 暗红色澄明液体,55℃保温,加入卵磷脂(四川英格尔公司)68g, 搅拌,约10min,直至溶液澄明,接回流装置,边加热保温边振荡反 应1h,拆除回流装置,真空浓缩至反应液体积为270ml,迅速加入到 正己烷3150ml中,得黄色沉淀物,上层液体为黄白色乳浊液,加压 过滤,用正己烷洗涤沉淀,置于真空干燥箱中室干燥,得黄色固体产 物103g。
通过下面的试验说明本发明药物的活性。数据资料x±S表示, 应用单因素方差分析,直线回归分析处理数据,以P<0.05差异有显 著性,P<0.01差异有非常显著性。
试验实施例1 按照实施例1制得的活性成分为SLC的药物对缺血再 灌注时脑组织ICAM-1mRNA表达的影响
实验方法:
动物和分组:蒙古种沙土鼠,体重80-100克,雌雄不拘,由上 海市
生物制品研究所动物研究实验中心提供。按随机数字表,将动物 分为假手术对照组、缺血组、缺血再灌注组、SLC(制备方法见实施 例1)组和缺血再灌注
溶剂组。SLC组又分为100mg/kg组、200mg/kg 和300mg/kg三个亚组,除假手术组外,每组又设1h、3h、6h、12h、 24h5个时相点,每组5只。
脑缺血再灌注动物模型的建立:蒙古种沙土鼠再
饲料和水供应充 足条件下,饲养一周,经10%乌拉坦(1.25g/kg)
腹腔注射麻醉后, 将动物仰卧固定于解剖板上,沿颈中线切开
皮肤,分离两侧腺体及颈 肌,暴露气管及左右两侧颈动脉,将颈总动脉与神经分离,穿线备用, 同时进行气管
插管,实验室室温26±1℃,动物直肠
温度通过电热毯 维持在37±0.2℃。其中假手术组仅作手术,不结扎动脉。缺血再灌 注组用无损伤血管
夹钳夹两侧颈总动脉60min后,放开动脉夹。
ICAM-1mRNA原位杂交:制备感受态JM109大肠杆菌,将
质量转 入大肠杆菌进行扩增,裂解细菌后离心,分离纯化质粒DNA,再用Ecok I和Kpn I两种限制性内切酶双切质粒CDNA,经
电泳分离和
透析得到 高纯度DNA探针片断。用地高辛随机引物法标记CDNA探针。脑组织 做
冰冻切片进行原位杂交,24小时(45℃孵育);加地高辛
抗体后 NBI/BICP显色,封片。结果用CMIAS计算机医学
图像分析仪处理, 单位以面
密度(目标总面积/统计场总面积)表示。
脑缺血60min时,脑组织中ICAM-1mRNA明显增加,而假手术对 照组表达不明显。缺血再灌注组、溶剂组和SLC治疗组于缺血再灌注 1h ICAM-1mRNA表达明显增加,再灌注6h达高峰,以后逐渐下降, 至24h仍维持较高的表达水平。缺血前30min给予SLC 100mg/kg、 200mg/kg和400mg/kg后,缺血再灌注脑组织中ICAM-1mRNA表达 均较溶剂组下降,P<0.05和P<0.01(表1)。
表1.缺血再灌注时脑组织ICAM-1mRNA表达的变化(x±s) 组别 例数 ICAM-1mRNA表达 1h 3h 6h 12h 24h 假手术对照组 缺血组 缺血再灌注组 溶剂组 SLC A组 SLC B组 SLC C组 5 25 25 25 25 25 25 0.0010±0.0002 0.0220±0.0035 0.0360±0.0044△ 0.0242±0.0037# 0.0189±0.0028* 0.0120±0.0023* 0.0050±0.0014** 0.0814±0.0044 0.0838±0.0078△ 0.0982±0.0057# 0.0770±0.0049* 0.0710±0.0047* 0.0632±0.0067** 0.1788±0.0067 0.1928±0.0063△ 0.1808±0.0046# 0.1762±0.0084* 0.1688±0.0048* 0.1618±0.0071** 0.1230±0.0062 0.1072±0.0078△ 0.1248±0.0066# 0.1206±0.0068* 0.1132±0.0066* 0.0840±0.0053** 0.0642±0.0070 0.0780±0.0068△ 0.0664±0.0093# 0.0618±0.0032* 0.0536±0.0064* 0.0468±0.0085**
注:与缺血组比较:△P<0.01;与缺血再灌注比较:#P>0.05;与溶剂组比较:*P<0.05,**P<0.01
试验实施例2 ICAM-1蛋白质表达水平测定
动物模型制备,分组(n=10),给药方法同前。取待测脑组织, 冰冻切片用SP免疫组织化学
染色法进行,DAB显色,结果用CMIAS 计算机医学图像分析仪处理,单位以面密度表示。
脑缺血60min时,脑组织中ICAM-1蛋白表达较假手术组由0.02 ±0.017增加到0.04±0.021(P<0.05)。缺血再灌注组、溶剂组和SLC 治疗组于缺血再灌注1h时,ICAM-1蛋白表达明显增加,而且随着 再灌注时间延长呈增加趋势,至24h达高水平。缺血前30min给予 SLC 100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg后,缺血再灌注脑组织中ICAM -1mRNA表达各时相点均较溶剂组降低(P<0.05或P<0.01)。在SLC 各治疗组中,ICAM-1蛋白表达与SLC的剂量有较好的量效关系(表 2)。
表2.缺血再灌注时脑组织ICAM-1蛋白表达的变化(x±s) 组别 例数 ICAM-1蛋白表达 1h 3h 6h 12h 24h 假手术对照组 缺血组 缺血再灌注组 溶剂组 SLC A组 SLC B组 SLC C组 5 25 25 25 25 25 25 0.020±0.002 0.042±0.004 0.050±0.006△ 0.043±0.005# 0.042±0.004* 0.032±0.011* 0.015±0.011** 0.31±0.022 0.362±0.045△ 0.344±0.030# 0.236±0.034* 0.166±0.013* 0.122±0.021** 1.12±0.056 1.154±0.055△ 1.110±0.051# 0.890±0.061* 0.564±0.047* 0.344±0.032** 1.32±0.050 1.480±0.049△ 1.380±0.057# 1.014±0.061* 0.790±0.071* 0.424±0.042** 1.47±0.059 1.576±0.046△ 1.461±0.067# 1.32±0.055* 0.846±0.039* 0.540±0.074**
注:与缺血组比较:△P<0.01;与缺血再灌注比较:#P>0.05;与溶剂组比较:*P<0.05, **P<0.01
试验实施例3 SLC对缺血再灌注时脑组织中性粒细胞浸润数的影响
动物模型制备,分组(n=10),给药方法同前。中性白细胞中存 在髓过
氧化酶(Myeloperoxidase enzyme,MPO),每个细胞所含酶的 量是一定的,约占细胞干重的5%。该酶具有使过氧化氢还原的能
力, 利用这一特点可以分析酶的活力,从而定量出中性粒细胞的数目。其 原理为:
MPO+H2O2→复合物
复合物+AH2→H2O+MPO+A
利用供氢体邻联茴香胺供氢体后生成黄色化合物在440nm处有 最大吸收峰,以定量测定酶的活力,从而推导出中性粒细胞的数目。 Bradly首先在大鼠皮肤组织中应用MPO法测定了炎症反应时中性粒 细胞的的浸润情况,本研究对此法加以改进应用于测定缺血脑组织中 的MPO,观察不同情况下脑组织中中性粒细胞浸润的不同。
在缺血再灌注1h后,中性粒细胞浸润数即已开始明显增加,以 后在各时相点呈进行性增加趋势,在12h时相点达高峰,至24h无下 降趋势。SLC治疗组的变化规律类似于缺血再灌注组,但在程度上则 明显低于缺血再灌注组(P<0.05或P<0.01)(表3)。
表3.缺血再灌注时脑组织中性粒细胞浸润数的变化(x±s) 组别 例数 中性粒细胞浸润数(×104MPO单位/kg) 1h 3h 6h 12h 24h 缺血再灌注组 溶剂组 SLC C组 25 25 25 0.511±0.022 0.502±0.068△ 0.368±0.060* 0.632±0.031 0.586±0.069△ 0.476±0.043* 0.734±0.059 0.694±0.051△ 0.594±0.059* 0.838±0.049 0.778±0.062△ 0.340±0.052* 0.714±0.027 0.496±0.070△ 0.222±0.091*
注:与缺血再灌注比较:△P>0.05;与溶剂组比较:*P<0.01
试验实施例4 水飞蓟宾-卵磷脂对脑梗塞面积的影响
动物模型制备,分组(n=10),给药方法同前。每组沙土鼠随机 取5只,断头取脑,低温取右脑视交叉前后2mm做连续冠状切片,置 于2%TTC盐水缓冲液中,37℃避光孵育30min。TTC购自Sigma公司, 批号:8877。TTC染色后,可见正常脑组织被染成红色,
坏死组织不 着色。以10%福尔
马林溶液固定,在CMIAS型计算机图像分析仪上 测定脑梗塞面积,计算出脑梗塞面积百分比(梗塞面积/大脑面积× 100%)。
TTC染色后,正常脑组织为深红色,梗塞区为苍白色,分界明显。 梗塞可累及基底节及皮质区。CMIAS型分析仪上测量梗塞面积,对照 组大脑冠状切面上未见梗塞。脑缺血60min时,缺血组的脑梗塞面较 对照组明显增加;再灌注30min后,脑梗塞面积由缺血时的 17.71±1.97进一步增加到19.16±1.92(P<0.05),与溶剂组比较无 明显差异。缺血前给予SLC100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg后,脑梗 塞面积分别比溶剂组降低29.39%(P<0.05),42.29%(P<0.01)和 60.84%(P<0.01),具有较好的量效关系(表4)。
表4 SLC对沙土鼠脑梗塞面积的影响(x±s,n=10) 组别 例数(n) 平均脑梗塞面积百分比(%) 对照组 缺血组 缺血再灌注组 溶剂组 SLC100mg/kg组 SLC200mg/kg组 SLC400mg/kg组 10 10 10 10 10 10 10 0 17.71±1.97# 19.16±1.92△ 17.46±1.16 12.48±1.17* 10.11±1.58** 6.49±1.52**
注:与对照组比较:#P<0.01;与缺血组比较:△P<0.05;与溶剂组比较:*P<0.05, **P<0.01
试验实施例5 局灶性脑梗塞沙土鼠神经症状的评定
动物模型制备,分组(n=10),给药方法同前。沙土鼠手术后4h、 24h、72h动态进行神经症状评定,记录沙土鼠神经症状。0级:无明 显异常;I级:手术对侧前肢内收或屈曲;II级:除I级症状外,尚 有向健侧打圈;III级:除II级症状外,身体倒向健侧;IV级:肢体瘫 痪,不能爬行。
沙土鼠术后1h-2h苏醒,按4h、24h、72h进行神经功能评定, 对照组未见行为异常,均为0级;溶液组术后可观察到明显的行为障 碍。余各组沙土鼠神经症随时间延长于72h有不同程度的缓解,与溶 液组比较有统计学意义。SLC对大脑梗塞后沙土鼠神经功能评级的实 验结果见表5。
表5 SLC对脑梗塞沙土鼠神经功能评级的影响(x±s,n=10) 时间 组别 例数(n) 神经功能评级 0 1 2 3 4 4h 对照组 缺血组 缺血再灌注组 溶剂组 SLC100mg/kg组 SLC200mg/kg组 SLC400mg/kg组 10 10 10 10 10 10 10 10 2 3 5 5 4 3 5 4 4 3 3 2 5* 6* 6* △ △△ △△ 24h 对照组 缺血组 缺血再灌注组 溶剂组 SLC100mg/kg组 SLC200mg/kg组 SLC400mg/kg组 10 10 10 10 10 10 10 10 1 1 2 2 3 4 1 2 1 3 4 3 5 3 7 4 2 1 4* 5* 2* △ △△ △△ 72h 对照组 缺血组 缺血再灌注组 溶剂组 SLC100mg/kg组 SLC200mg/kg组 SLC400mg/kg组 10 10 10 10 10 10 10 10 2 3 4 2 2 3 3 3 3 2 4 3 2 4 3 3 2 1 1 3* 4* 2* △ △△ △△
注:与对照组比较:*P<0.001;与溶剂组比较:△P<0.05,△△P<0.01
试验实施例6 局灶性脑梗塞沙土鼠脑组织含水量的测定
动物模型制备,分组(n=10),给药方法同前。断头取脑,用精 密天平称取全脑湿重,于100℃
烤箱中
烘烤24h。称取干重。按Gotoh 方法算含水量:(湿重-干重)/湿重×100。
脑缺血60min时,脑组织中的含水量较假手术对照组的 40.68±1.86增加到61.38±1.28(P<0.01);再灌注30min后,脑组 织中的含水量升高至64.32±1.60(P<0.01);缺血前给予 SLC100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg后,脑组织含水量分别比溶剂组 降低10.23%(P<0.05),17.73%(P<0.01)和25.71%(P<0.01),且具有较 好的量效关系(表6)。
表6 SLC对MCAO沙土鼠脑含水量的影响(x±s,n=10) 组别 例数 脑含水量(%) 假手术对照组 缺血组 缺血再灌注组 溶剂组 SLC100mg/kg组 SLC200mg/kg组 SLC400mg/kg组 10 10 10 10 10 10 10 40.68±1.86 61.38±1.28# 64.32±1.60* 60.10±1.96 54.37±1.52△ 48.45±2.10△ 43.54±1.46△△
注:与对照组比较:#P<0.01;与缺血再灌注比较:*P<0.01;与溶液组比较:△P<0.05, △△P<0.01
试验结果显示:SLC具有很好的脑保护作用。SLC可通过以下途 径发挥作用的。下调ICAM-1的表达和抑制白细胞的聚集,特别是减 少中性粒细胞的聚集和粘附,从而减少蛋白水解酶、溶酶体酶、氧自 由基和其他效应分子的释放,使酶类和自由基引起的链锁反应削弱, 阻止细胞膜的崩解。抑制缺血再灌注损伤时的PAF和EAA的大量释放, 改善神经症状,缩小梗塞面积和减轻脑水肿,从而起到脑保护作用。 下面的实施例说明包含本发明提供药物的药用制剂。
制剂实施例1 注射液
本发明药物(制备方法同实施例1) 150mg
生理盐水 5ml
制剂实施例2 胶囊剂
按照本领域已知的方法制备胶囊剂,每个胶囊中含有下述成分:
本发明药物(制备方法同实施例1) 50mg
乳糖 70mg
玉米
淀粉 25mg
硬脂酸镁 1mg
合计 146mg