用于再灌注损伤的预防和/或治疗的CD31SHED激动剂
阅读：770发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于再灌注损伤的预防和/或治疗的CD31SHED激动剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 再灌注 损伤的 预防 和/或 治疗 的CD31shed激动剂。这些CD31shed激动剂是能够恢复携带称为CD31shed的截短形式的CD31的细胞中的CD31 信号 传导的肽或其肽模拟物。根据本发明的CD31shed激动剂特别保护器官免受用于治疗缺血的再灌注引起的损伤。，下面是用于再灌注损伤的预防和/或治疗的CD31SHED激动剂专利的具体信息内容。
1.一种CD31shed激动剂，其用于再灌注损伤的预防和/或治疗。
2.根据权利要求1用途的CD31shed激动剂，其中所述CD31shed激动剂是：
a)肽，其选自：
(i)由通过序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601所定义的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，
(ii)由非人哺乳动物CD31中对应于序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601的序列的3至
15个氨基酸的片段组成的肽，
(iii)由与肽(i)的序列具有至少70％同一性的序列组成的3至15个氨基酸的肽，(iv)由肽(i)、(ii)或(iii)的逆反序列组成的肽，和
(v)肽(i)、(ii)、(iii)或(iv)，其包含至少一种或者至少一种其它化学修饰，或
b)肽a)的肽模拟物。
3.根据权利要求2用途的CD31shed激动剂，其中所述肽(v)包含至少一种D-对映异构体形式的氨基酸。
4.根据权利要求2或3用途的CD31shed激动剂，其中所述肽可溶于水。
5.根据权利要求2至4中任一项用途的CD31shed激动剂，其中所述肽对肽酶具有抗性。
6.根据权利要求2至5中任一项用途的CD31shed激动剂，其中所述肽选自以下肽：序列SEQ ID NO:2的肽，序列SEQ ID NO:3的肽，序列SEQ ID NO:4的肽，序列SEQ ID NO:5的肽，由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:6的肽，序列SEQ ID NO:7的肽和由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:8的肽。
7.根据权利要求6用途的CD31shed激动剂，其中所述肽是序列SEQ ID NO:5的肽，或由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:6的肽。
8.根据权利要求1至7中任一项用途的CD31shed激动剂，其中再灌注用于治疗缺血。
9.根据权利要求8用途的CD31shed激动剂，其中缺血选自心肌梗塞、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、中风、下肢缺血、急性血容量不足引起的内脏缺血、炎症引起的缺血、排除部分动脉分支的体外循环血液固有的缺血、内脏手术和/或主动脉手术固有的缺血、冷缺血、针对器官移植的移植物的温热再灌注固有的缺血及其组合。
10.根据权利要求1至9中任一项用途的CD31shed激动剂，其中所述CD31shed激动剂在再灌注之前和/或在再灌注期间进行施用。
11.根据权利要求1至10中任一项用途的CD31shed激动剂，其中所述CD31shed激动剂静脉内施用。
12.根据权利要求1至11中任一项用途的CD31shed激动剂，其中所述CD31shed激动剂在再灌注期间连续施用。
13.根据权利要求1至12中任一项用途的CD31shed激动剂，其中所述CD31shed激动剂的首次团注作为单剂量施用，然后所述CD31shed激动剂的第二次团注连续施用。
14.根据权利要求1至13中任一项用途的CD31shed激动剂，其中所述CD31激动剂最多施用
48小时。
SHED
发明领域
[0001] 本发明涉及再灌注损伤的预防和/或治疗。
[0002] 背景
[0003] 缺血是严重限制或阻止组织血液供应、导致细胞代谢所需的氧和葡萄糖短缺的病症。缺血可能是例如由于动脉的关键狭窄的存在、由于动脉粥样硬化斑块上闭塞性血栓的形成或者由于血管的阻断(clamping)。动脉血栓形成的特征还在于闭塞下游血管的血瘀，包括动脉和静脉。缺血是危及生命的临床病症的基础过程，例如心肌梗塞、中风、肠系膜缺血或下肢缺血。在高度需氧的组织例如心脏、脑和肠中，组织的不可逆缺血性损伤很快就会发生。
[0004] 在缺血期间，线粒体逐渐不再能够通过柠檬酸循环产生ATP。它们转变为无氧糖酵解，这导致乳酸生成和细胞内介质的酸化，其导致主要的组织代谢障碍。在心肌中，这些现象导致机械收缩的抑制，其导致急性心肌衰竭。在肠系膜缺血中，它们通常与肠上皮损伤和粘液保护丧失有关，其导致血液中的细菌移位。
[0005] 延长的缺血导致对应于低灌注或未灌注组织的区域的坏死，并且可能不可逆地损害器官的功能。
[0006] 能够阻止缺血引起的组织损伤的唯一策略是再灌注。再灌注可以是机械的(例如血管成形术或旁路手术)、药理学的(用纤维蛋白溶解剂灌注)或天然的(内源性纤维蛋白溶解)。然而，尽管缺血组织的再灌注对其存活至关重要，但缺血组织中血液供应的恢复会引起额外的损伤，称为再灌注损伤。缺血器官再灌注引起的额外损伤无疑与其中细胞改变其代谢以使其自身适应不存在氧的环境中的急性氧供应有关。
[0007] 已经提出粘附分子的抑制剂(例如RhuMab CD18抗体、Hu23F2G抗体和糖蛋白rPSLG-Ig)作为候选药物。令人失望的是，所有基于使用此类分子与血运重建相结合的临床试验，都未能限制心肌梗塞的大小。
[0008] CD31由单链130-kDa糖蛋白组成，其包含六个Ig样细胞外结构域、短跨膜区段和细胞质尾。细胞质尾含有两个重要的基于酪氨酸的基序(围绕Y663和Y686)，其充当基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
[0009] 细胞内CD31 ITIM在静止条件下没有被磷酸化，因为CD31不具有固有激酶活性。CD31分子通过相互作用细胞之间的Ig样结构域1-2的反式-同嗜性连接(trans-homophilic liaison)彼此结合。这种反式-同嗜性结合需要触发膜平面上CD31分子的聚集，这进而需要顺式-同嗜性近膜(juxta-membrane)序列。然后，CD31细胞内ITIM的磷酸化成为可能，因为其ITIM可以暴露于酪氨酸激酶的活性，所述酪氨酸激酶由其他簇相关膜受体(例如T细胞受体)密切携带。细胞内ITIM的磷酸化触发细胞内含SH2的磷酸酶的募集和活化。取决于与最接近的膜受体相关的信号传导衔接子，含有SH2的磷酸酶的激活可导致信号级联的激活(例如GAB/ERK/MAPK，其驱动内皮细胞的粘附、存活和生长、淋巴细胞进入调节表型的foxp3表达和分化、驱动活性细胞-细胞脱离)或其抑制(例如JAK/STAT，其防止白细胞和血小板活化)。因此，CD31的功能因细胞类型而异。
[0010] WO2010/000741公开了假定的活化/记忆T淋巴细胞上CD31的丧失实际上是不完全的，并且是由CD31的第5个和第6个细胞外Ig样结构域之间的脱落(shedding)引起的。然后，CD31的脱落的细胞外结构域(称为“可溶性CD31”)被释放到循环中，其中它与CD31的可溶性剪接变体一起存在。在脱落后保持固定在膜上的剩余的小CD31细胞外结构域称为“CD31shed”。该文献还公开了对应于CD31细胞外结构域的近膜氨基酸的肽，其能够通过强烈的同源寡聚化桥接CD31shed来挽救CD31的生理免疫调节功能。此类肽可用于治疗血栓形成或自身免疫疾病。关于血栓形成疾病，这些肽确实直接作用于动脉粥样硬化血栓形成和动脉粥样硬化，例如通过阻止斑块生长加速、动脉剥离和动脉瘤的形成。
[0011] WO2013/190014进一步公开了在细胞外CD31的膜近端部分内的8个氨基酸的特定肽，其可用于治疗血栓形成或炎性疾病并显示更适合药物开发的物理化学性质。肽P8RI例如减少人血小板聚集和凝血酶产生，从而防止血栓形成闭塞。
[0012] 未得到治疗的血栓形成疾病例如动脉粥样硬化血栓形成或动脉粥样硬化，可能导致缺血并因此在缺血之前。狭义上讲，缺血确实不是血栓形成疾病，并且表明血液流入器官的中断，而不是其原因。
[0013] 因此，仍然需要提供用于预防和/或治疗再灌注损伤、特别是用于至少减少由再灌注引起的器官损伤的解决方案。
[0014] 发明详述
[0015] 令人惊讶的是，本发明人发现能够结合存在于细胞表面上的截短形式的CD31(本文称为CD31shed)从而触发CD31信号传导的CD31shed激动剂在涉及嗜中性粒细胞的爆炸性活化的急性病理情况例如再灌注损伤中是有用的。所述CD31shed激动剂优选为合成肽，例如由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO：6的肽P8RI。
[0016] 事实上，CD31在粒细胞表面高度表达。此外，本发明人发现，在粒细胞和内皮细胞中，CD31也在细胞活化后被切割。CD31的切割消除了其同嗜性CD31-CD31稳态功能。
[0017] 由于粒细胞是参与再灌注损伤导致的炎性组织损伤的主要细胞，这可以解释CD31shed激动剂在预防和/或治疗再灌注损伤中的治疗效果。然而，考虑到再灌注中涉及的细胞事件的复杂性，单独施用主要靶向由粒细胞介导的炎症过程(而不是相关的代谢过程)的CD31shed激动剂的治疗效果是非常令人惊讶的。
[0018] 据信CD31shed激动剂有利地不消耗或明确地抑制靶向的血液成分(在急性再灌注的情况下基本上是嗜中性粒细胞和血小板)并且允许在伤口愈合中保持它们的生理功能。
[0019] 发明人确实已经表明，在再灌注之前向患有缺血的动物单独施用CD31shed激动剂能够显著降低坏死损伤的程度。事实上，在心肌梗塞(左前冠状动脉结扎)的小鼠模型中，(在CD31敲除小鼠中)CD31的丧失增加了由再灌注引起的组织坏死和死亡(参见例如图1)。相反，与未处理的对照小鼠相比，在缺血再灌注期间施用肽P8RI能够强烈减小坏死区域的大小。
[0020] 此外，在肠系膜动脉短暂闭塞模型中，肽P8RI的施用不仅可以防止肠坏死，还可以防止细菌移位，如游离DNA水平逐渐增加的停滞、内部-消化性血红蛋白浓度的降低和血液中的LPS分泌和肠道上的粘液的组织学保守性所示。
[0021] 因此，本发明涉及用于预防和/或治疗再灌注损伤的CD31shed激动剂，其中所述CD31shed激动剂与存在于细胞表面上的CD31shed结合，所述结合导致至少一种CD31shed ITIM酪氨酸的磷酸化。
[0022] 根据本发明的CD31shed激动剂的使用使得特别能够：
[0023] -停止或减缓坏死的进展，例如在温热再灌注期间(例如在心脏、脑、肠、肾和/或肢体中)减小(特别是在缺血组织或器官中)坏死区域的大小，
[0024] -增加再灌注后器官存活的机会，
[0025] -停止或限制再灌注组织的血管病变和/或组织内出血(例如，停止或限制脑内缺血性中风的出血性转化；停止或限制(特别是在肠道中)上皮的出血性坏死)和/或[0026] -限制细菌移位(特别是在肠上皮细胞中，在再灌注期间进一步导致肠系膜缺血)，和/或
[0027] -在组织或器官移植的情况下，增加冷缺血时间和/或改善移植物的恢复。
[0028] 本发明具体涉及用于预防和/或治疗如上所定义的再灌注损伤的CD31shed激动剂，其中再灌注用于治疗缺血，所述缺血例如心肌梗塞、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、中风、下肢缺血、急性血容量不足引起的内脏缺血、炎症引起的缺血、医疗程序固有的缺血(例如排除部分动脉分支的体外循环血液固有的缺血、内脏手术和/或主动脉手术固有的缺血、冷缺血和/或针对器官移植的移植物的温热再灌注固有的缺血)及其组合。
[0029] CD31shed激动剂优选：
[0030] -在再灌注之前和/或期间使用或施用，如果可能，优选在缺血再灌注期之前和/或期间使用或施用，
[0031] -经静脉使用或施用，包括连续输注，
[0032] -在再灌注期间持续使用或施用，特别是当不能覆盖缺血时，和/或
[0033] -在短时间内例如最多48小时、更优选最多24小时使用或施用。
[0034] 本发明还涉及如上定义用途的CD31shed激动剂，其中所述CD31shed激动剂的第一剂量作为单剂量使用，优选在缺血之前(例如当缺血是医疗程序如主动脉手术和/或内脏手术、冷缺血和/或针对器官移植的移植物的温热再灌注固有的)和所述CD31shed激动剂的第二剂量被连续使用，特别是在缺血-再灌注期间。
[0035] 用于如上所定义用途的CD31shed激动剂优选是：
[0036] a)肽，其选自：
[0037] (i)由通过序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601所定义的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，
[0039] (iii)由与肽(i)的序列具有至少70％同一性的序列组成的3至15个氨基酸的肽，[0040] (iv)由肽(i)、(ii)或(iii)的逆反序列组成的肽，和
[0041] (v)肽(i)、(ii)、(iii)或(iv)，其包含至少一种或者至少一种其它化学修饰，[0042] 或
[0043] b)所述肽a)的肽模拟物。
[0044] 优选地，所述肽可溶于水和/或对肽酶具有抗性。
[0046] 在优选的实施方案中，所述肽包含至少一种人工氨基酸，所述人工氨基酸优选选自D-对映异构体氨基酸、β-甲基氨基酸、α-取代的α-氨基酸和氨基酸类似物。
[0047] 在又一个优选实施方案中，所述肽(v)包含至少一种D-对映异构体形式的氨基酸。
[0048] 用于如上定义用途的肽的实例是以下肽：序列SEQ ID NO:2的肽、序列SEQ ID NO:3的肽(也称为PepReg CD31)、序列SEQ ID NO:4的肽、序列SEQ ID NO:5的肽(也称为P8F)、由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:6的肽(也称为P8RI)、序列SEQ ID NO:7的肽和由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:8的肽。
[0049] 用于如上定义用途的优选的肽是序列SEQ ID NO:5的肽，由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:6的肽。
[0050] CD31shed激动剂
[0051] “CD31shed激动剂”在本文中是指与细胞表面上存在的CD31结合的化合物，所述结shed合导致至少一种CD31 ITIM酪氨酸的磷酸化。
[0052] ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序，Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif)由共有序列T/L/I/V/S-x-Y-x-x–L/V/I组成，其中x表示任何氨基酸。
[0053] CD31(以及CD31shed)通常包括两个ITIM。
[0054] 例如，两个人CD31 ITIM是序列VQYTEV的663 ITIM和序列TVYSEV的686 ITIM。
[0055] 在序列SEQ ID NO：1中，663 ITIM的酪氨酸位于690位，686 ITIM的酪氨酸位于713位。
[0056] 例如，两个鼠CD31 ITIM是序列VEYTEV的663 ITIM和序列TVYSEI的686 ITIM。
[0057] CD31shed激动剂与存在于细胞表面上的CD31shed的结合优选导致CD31shed的686 ITIM的至少酪氨酸的磷酸化。
[0058] 可以通过本领域技术人员熟知的任何方法评估化合物与存在于细胞表面上的CD31shed的结合。
[0059] 例如，可以通过等离子体表面共振、流式细胞术或β成像仪测量结合。
[0060] 在优选的实施方案中，如下评估化合物与存在于细胞表面上的CD31shed的结合：待测化合物或作为阴性对照的无关类似物与荧光探针(例如荧光素)结合。将化合物以连续稀释(例如1、10、100μmol)与以在含有Ca++和Mg++的盐水缓冲液(HBSS，培养基)中的106个细胞/ml的密度的CD31+细胞(例如来自细胞系，例如jurkat T细胞，或原代细胞，例如外周血T细胞)孵育。平行条件是在细胞活化剂存在下孵育(例如如果细胞是T淋巴细胞，TCR交联，如1μg/ml抗CD3e抗体+20μg/ml次级F(ab’)2片段)。通过用冷缓冲液重复洗涤步骤，在5或20分钟后停止反应。用多聚甲醛固定细胞并再次洗涤。使用流式细胞仪通过相对荧光信号检测待测化合物在各个细胞上的结合。与对照相比以及在包含细胞活化剂的条件下与静息细胞shed
相比，特定化合物的更大信号表明与CD31 的合适结合。
相比，特定化合物的更大信号表明与CD31 的合适结合。
[0061] 可以直接或间接评估至少一种CD31shed ITIM酪氨酸的磷酸化，例如通过测量被激动剂磷酸化的细胞内SH-2酪氨酸磷酸酶的磷酸化。
[0062] 可以通过本领域技术人员熟知的任何方法评估至少一种CD31shed ITIM酪氨酸和/或细胞内SH-2酪氨酸磷酸酶的磷酸化。
[0063] 例如，可以如下评估至少一种CD31shed ITIM酪氨酸的磷酸化：待测化合物与荧光探针(例如荧光素)结合。将化合物以连续稀释(1、10、100μmol)与以在含有Ca++和Mg++的盐水缓冲液(HBSS，培养基)中的106个细胞/ml的密度的CD31+细胞(例如细胞系，例如jurkat T细胞，或原代细胞，例如外周血T细胞)孵育。平行条件是在细胞活化剂存在下孵育(例如如果细胞是T淋巴细胞，TCR交联，如1μg/ml抗CD3e抗体+20μg/ml次级F(ab’)2片段)。通过用冷缓冲液重复洗涤步骤，在5或20分钟后停止反应。用多聚甲醛固定细胞，用含有甲醇的缓冲液(例如来自BD biosciences的PermBuffer III)透化并再次洗涤。使用在透化缓冲液中稀释的适当荧光抗体在4℃和黑暗中30分钟进行CD31shed ITIM酪氨酸CD31(例如pY686)或细胞内SH-2酪氨酸磷酸酶(pSHP2 Y542)的细胞内染色。然后重复洗涤细胞并在流式细胞仪上获得相对荧光信号。
[0064] CD31shed激动剂优选在体外发挥至少一种CD31shed ITIM酪氨酸和/或细胞内SH-2酪氨酸磷酸酶的磷酸化的剂量依赖性增加。
[0065] 还可以通过测量中性粒细胞、血小板和/或内皮细胞活化的抑制来间接评估至少shed一种CD31 ITIM酪氨酸的磷酸化。
[0066] 可以通过本领域技术人员熟知的任何方法评估嗜中性粒细胞、血小板和/或内皮细胞活化的抑制，例如其中在与平行条件下的刺激相同的时间加入CD31激动剂。
[0067] 例如，可以通过表面整联蛋白表达的增加来评估嗜中性粒细胞活化。 纯化的外周血中性粒细胞用重组人IL-8或TNFα预处理，然后用fMLP完全活化。30分钟后，细胞用单克隆抗体定向的表面标志物染色，例如β2整联蛋白CD11b，其在细胞活化后显著增加，并在适当的荧光通道中通过流式细胞术分析。
[0068] 可以通过CD62P(P-选择蛋白)的释放来评估血小板活化。例如，用针对CD32A(激活Fc受体)的单克隆抗体刺激源自外周静脉血的富含血小板的血浆。30分钟后，通过加入EDTA终止反应。然后将试管离心并将上清液用于可溶性CD62P测量(通过市售ELISA或基于珠子的测试)。
[0069] 可以通过VCAM-1的表达来评估内皮细胞活化。例如，将第2-3代的人原代内皮细胞(来自脐静脉或冠状动脉，均可从Promocell商购)培养到无菌盖玻片上并用TNFα刺激过夜。接下来的几天，盖玻片被固定，并且在核复染之前用针对VCAM-1(CD106)的单克隆抗体和适当的荧光标记的二抗染色，并通过荧光显微镜分析VCAM-1阳性细胞。
[0070] CD31shed激动剂优选在体外发挥中性粒细胞、血小板和/或内皮细胞活化的剂量依赖性抑制。
[0071] 在优选的实施方案中，CD31shed激动剂是肽或其肽模拟物。
[0072] 用作CD31shed激动剂的肽
[0073] 在本发明的一个实施方案中，CD31shed激动剂是肽。
[0074] 肽优选是如WO2010/000741或WO2013/190014中公开的肽。
[0075] 优选地，CD31肽是合成肽。
[0076] “合成肽”是指在活的生物内例如人体内不存在的肽。
[0078] 合成肽优选为纯化的。
[0079] 肽可以选自：
[0080] (i)由通过序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601所定义的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，
[0081] (ii)由非人哺乳动物CD31中对应于序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，
[0082] (iii)由与肽(i)的序列具有至少70％同一性的序列组成的3至15个氨基酸的肽，[0083] (iv)由肽(i)、(ii)或(iii)的逆反序列组成的肽，和
[0084] (v)肽(i)、(ii)、(iii)或(iv)，其包含至少一种或者至少一种其它化学修饰，优选至少一种D-对映异构体形式的氨基酸。
[0085] 本文中“片段”是指连续氨基酸的序列。例如片段可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的片段。
[0086] 由序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601所定义的序列是序列SEQ ID NO:12。
[0087] 因此，肽可以由序列SEQ ID NO:12的3至15个氨基酸的片段组成。
[0088] 肽也可以由非人哺乳动物CD31中对应于序列SEQ ID NO:12的序列的3至15个氨基酸的片段组成。
[0089] 非人哺乳动物CD31的非限制性实例是序列SEQ ID NO:9的鼠CD31、序列SEQ ID NO:10的牛CD31和序列SEQ ID NO:11的猪CD31。
[0090] 本领域技术人员能够容易地鉴定非人哺乳动物CD31蛋白的对应于序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601即对应于序列SEQ ID NO:12的序列，例如通过进行序列SEQ ID NO:1和所述非人哺乳动物CD31蛋白序列的序列比对，例如与序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的一个。
[0091] 用于序列比对和确定序列同一性的方法是本领域熟知的，例如使用公众可获得的计算机软件，例如BioPer1，BLAST，BLAST-2，CS-BLAST，FASTA，ALIGN，ALIGN-2，LALIGN，Jaligner，matcher或Megalign(DNASTAR)软件和比对算法，如Needleman-Wunsch和Smith-Waterman算法。
[0092] 根据本发明的CD31肽的序列优选衍生自人CD31或鼠CD31的序列。
[0093] 肽也可以是由与肽(i)的序列、即与通过序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601所定义的序列的3至15个氨基酸的片段的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％相同的序列组成的3至15个氨基酸的肽。
[0094] 与4-6个氨基酸的给定序列至少70％相同的肽序列与所述给定序列有至多一个氨基酸的不同。
[0095] 与7-9个氨基酸的给定序列至少70％相同的肽序列与所述给定序列有至多两个氨基酸的不同。
[0096] 与10-13个氨基酸的给定序列至少70％相同的肽序列与所述给定序列有至多三个氨基酸的不同。
[0097] 与14或15个氨基酸的给定序列至少70％相同的肽序列与所述给定序列有至多四个氨基酸的不同。
[0098] “与参考序列至少x％相同的序列”是指本发明肽的氨基酸序列与参考序列相同或与参考序列的不同之处在于每100个参考序列氨基酸最多100-x个氨基酸改变。换言之，为了获得具有与参考氨基酸序列至少x％相同的氨基酸序列的多肽，可以用另一个氨基酸插入、删除或取代目标序列中的多达100-x％的氨基酸残基。
[0099] 用于比较两条或更多条序列的同一性的方法是本领域熟知的。例如，Wisconsin Sequence Analysis Package 9.1版中可用的程序，例如程序BESTFIT和GAP，可用于确定两条多肽序列之间的％同一性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性”算法，找到两条序列之间最佳的单一相似区域。用于确定序列之间同一性的其他程序也是本领域已知的，例如Needle程序，其基于Needleman和Wunsch算法，描述于Needleman和Wunsch(1970)J.Mol Biol.48:443-453,例如以下多肽序列比较参数：比较矩阵：BLOSUM62,空位开放罚分：10和空位延伸罚分：0.5，末端空位罚分：假，末端空位罚分＝10，末端空位延伸罚分＝0.5；以及多核苷酸序列比较的以下参数：比较矩阵：DNAFULL；空位开放罚分：＝10，空位延伸罚分＝0.5，末端空位罚分：假，末端空位罚分＝10，末端空位延伸罚分＝0.5。
[0100] 与参考序列相比，由与参考序列“至少70％、75％、80％、85％或90％相同”的氨基酸序列组成的肽可以包含突变，例如缺失、插入和/或取代。
[0101] 在取代的情况下，取代优选对应于如下表1中所示的保守取代。在优选的实施方案中，由与参考序列至少70％、75％、80％、85％或90％相同的氨基酸序列组成的肽仅通过保守取代与参考序列不同。
[0102] 表1
[0103]
[0104] 在另一优选实施方案中，由与参考序列至少70％、75％、80％、85％或90％相同的氨基酸序列组成的肽对应于参考序列的天然存在的等位基因变体。
[0105] 在又一优选实施方案中，由与参考序列至少70％、75％、80％、85％或90％相同的氨基酸序列组成的肽对应于衍生自除参考序列之外的另一种非人哺乳动物物种的同源序列。
[0106] 在优选实施方案中，由与参考序列至少70％、75％、80％、85％或90％相同的氨基酸序列组成的肽通过保守取代与参考序列不同和/或对应于衍生自除参考序列之外的另一种非人哺乳动物物种的同源序列。
[0107] 本文中表述“由肽(i)、(ii)或(iii)的逆反序列组成的肽”是指与肽(i)、(ii)或(iii)不同的肽，其分别与肽(i)、(ii)或(iii)的序列相比，其氨基酸的顺序相反，并且由D-氨基酸而不是天然存在的L-氨基酸组成。
[0108] 氨基酸的D-对映异构体(也称为D-氨基酸)用与其相应的L-对映异构体(也称为L-氨基酸)相同的字母表示，但是为小写字母。因此，例如，精氨酸的L-对映异构体称为‘R’，而D-对映异构体称为‘r’。
[0109] 优选地，肽可溶于有机或无机溶剂中。
[0110] 在优选的实施方案中，肽可溶于水。更特别地，肽优选可溶于水和/或可溶于水性缓冲液，例如NaCl 9g/L，PBS，Tris或Tris-磷酸盐。从药理学的观点来看，在水和水性缓冲液中的溶解度是特别有利的。由于这种溶解性，肽可以溶解在水溶液中，例如浓度为等于、至少或至多1微摩尔、10微摩尔、50微摩尔、100微摩尔、500微摩尔、1mM、50mM或100mM。
[0111] 易溶于水的本发明的肽可以通过存在至少一个带电荷的氨基酸(优选精氨酸(R)和/或赖氨酸(K))来获得，其中所述带电荷的氨基酸不包含在两个疏水性残基之间。
[0112] 因此，在优选的实施方案中，根据本发明的肽包含至少一个带电荷的氨基酸，优选精氨酸和/或赖氨酸，其中所述带电荷的氨基酸不包含在两个疏水残基之间。
[0113] 在更优选的实施方案中，所述带电荷的氨基酸位于序列的N末端或C末端。
[0114] 例如，根据本发明的优选的肽的序列以基序RV(而不是例如VRV)开始。
[0115] 在优选的实施方案中，肽对肽酶、特别是真核肽酶具有抗性。
[0116] 本文中“对肽酶具有抗性”是指通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)和质谱(MS)测定，在37℃下与哺乳动物血清孵育或在活的实验动物中注射时，肽保持未消化。旨在评估肽的血清稳定性的实验室测试被很好地标准化(参见例如Jenssen和Aspmo,2008,Methods Mol Biol 494,177-186)。高度肽酶抗性肽是那些在蛋白水解酶存在下保持未消化高达其原始质量的70％和/或显示半衰期超过240分钟的肽(参见例如Kumarasinghe和Hruby,2015,In Peptide Chemistry and Drug Design,B.M.Dunn,ed.(Hoboken,New Jersey:
Wiley),pp.247-266)。
Wiley),pp.247-266)。
[0117] 肽优选对血液中存在的肽酶具有抗性，例如可溶性肽酶或细胞表面存在的肽酶。
[0118] 肽还可以包含至少一种或至少一种其他化学修饰，优选地用于改善其稳定性和/或生物利用度。
[0119] 此类化学修饰通常旨在获得这样的肽，其具有增强的肽对体内酶促降解的保护作用和/或增加的跨膜屏障的能力，从而增加其半衰期和/或维持或改善其生物活性。根据本发明，可以使用本领域已知的任何化学修饰。
[0120] 肽可以包含至少一种人工氨基酸，所述人工氨基酸优选选自D-对映异构体氨基酸、β-甲基氨基酸、α-取代的α-氨基酸和氨基酸类似物。
[0123] 本文中“氨基酸类似物”是指天然氨基酸的任何其它人工类似物。
[0124] 因此，肽可以包含至少一种D-对映异构体形式的氨基酸。例如，上述定义的肽的氨基酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个可以为D-对映异构体形式。
[0125] 在一个实施方案中，肽由D-氨基酸组成。
[0126] 肽还可以包含反向序列，即反向氨基酸链(从C末端到N末端)。肽的整个氨基酸序列是反向的，或者氨基酸序列的一部分可以是反向的。例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的连续序列可以是反向的。在本文中称为‘反向’氨基酸是指序列中连续氨基酸的反向序列。
[0127] 其它化学修饰包括但不限于：
[0128] -对肽的N末端和/或C末端的修饰，例如N末端酰化(优选乙酰化)或脱氨基，或将C末端羧基修饰为酰胺或醇基；
[0129] -在两个氨基酸之间的酰胺键处的修饰：在氮原子或连接两个氨基酸的酰胺键的α碳处的酰化(优选乙酰化)或烷基化(优选甲基化)；
[0130] -在连接两个氨基酸的酰胺键的α碳处的修饰，例如在连接两个氨基酸的酰胺键的α碳处的酰化(优选乙酰化)或烷基化(优选甲基化)；
[0131] -逆反，其中一个或多个天然存在的氨基酸(L-对映体)被相应的D-对映异构体取代，同时具有氨基酸链的反向(从C末端到N末端)；
[0132] -氮杂肽，其中一个或多个α碳被氮原子取代；和/或
[0133] -β肽，其中一个或多个氨基酸的氨基与β碳而不是α碳键合。
[0134] 肽包括通过天然过程(例如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸。这些修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量研究文献中有很好的描述。修饰可以发生在多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，应当理解，相同类型的修饰可以在相同或不同程度上存在于给定多肽的多个位点。而且，给定多肽可以含有许多类型的修饰。多肽可以由于泛素化而有支链，并且它们可以是环状的，有或无支链。环状、支链和支链环状多肽可以由天然翻译后过程产生，或者可以通过合成方法产生。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化(araidation)，黄素的共价连接，血红素部分的共价连接，核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接，脂质或脂质衍生物的共价连接，磷脂酰肌醇的共价连接，交联，环化，二硫键形成，去甲基化，共价交联形成，胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧基化，糖基化，GP'I锚形成，羟基化，碘化，甲酰化，豆蔻酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊烯化，外消旋化，硒化，硫酸化，转移-RNA介导的氨基酸添加到蛋白质如精氨酸化和泛素化。
[0135] 在本发明的优选实施方案中，肽选自：
[0136] (i)由通过序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601所定义的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，所述片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸579至581、氨基酸589至591、氨基酸599至601和/或氨基酸593至595，
[0137] (ii)由非人哺乳动物CD31中对应于序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，例如由序列SEQ ID NO:9的氨基酸568至590所定义的序列的3至15个氨基酸的片段，所述片段包含SEQ ID NO:9的氨基酸568至570、氨基酸578至580、氨基酸588至590和/或氨基酸582至584，
[0138] (iii)由与肽(i)的序列至少70％相同、优选至少75％相同、优选至少80％相同、更优选至少85％相同、又更优选至少90％相同的序列组成的3至15个氨基酸的肽，[0139] (iv)由肽(i)、(ii)或(iii)的逆反序列组成的肽，和
[0140] (v)肽(i)、(ii)、(iii)或(iv)，其包含至少一种或者至少一种其它化学修饰。
[0141] 此类肽例如具有选自以下的序列：SSTLAVRVFLAPWKK(SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:9的氨基酸576至590),STLAVRVFLAPWKK(SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:9的氨基酸577至590),TLAVRVFLAPWKK(SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:9的氨基酸578至590),LAVRVFLAPWKK(SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:9的氨基酸579至590),AVRVFLAPWKK(SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:9的氨基酸580至590),VRVFLAPWKK(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:9的氨基酸581至590),RVFLAPWKK(SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:9的氨基酸582至590),VFLAPWKK(SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:9的氨基酸583至590),FLAPWKK(SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:9的氨基酸584至590),LAPWKK(SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:9的氨基酸585至590),APWKK(SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:9的氨基酸586至590),PWKK(SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:9的氨基酸587至590),WKK(SEQ ID NO:9的氨基酸
588至590),SKILTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:1的氨基酸587至601),
KILTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:1的氨基酸588至601),ILTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:1的氨基酸589至601),LTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:1的氨基酸590至601),TVRVILAPWKK(SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:1的氨基酸591至601),
VRVILAPWKK(SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:1的氨基酸592至601),RVILAPWKK(SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:1的氨基酸593至601),VILAPWKK(SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:1的氨基酸594至
601),ILAPWKK(SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:1的氨基酸595至601),SSMRTSPRSSTLAVR(SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:9的氨基酸568至582),SSMRTSPRSSTLAV(SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:9的氨基酸568至581),SSMRTSPRSSTLA(SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:9的氨基酸568至580),SSMRTSPRSSTL(SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:9的氨基酸568至579),SSMRTSPRSST(SEQ ID NO:
35,SEQ ID NO:9的氨基酸568至578),SSMRTSPRSS(SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:9的氨基酸
568至577),SSMRTSPRS(SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:9的氨基酸568至576),SSMRTSPR(SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:9的氨基酸568至575),SSMRTSP(SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:9的氨基酸
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41,SEQ ID NO:9的氨基酸568至572),SSMR(SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:9的氨基酸568至
571),SSM(SEQ ID NO:9的氨基酸568至570),NHASSVPRSKILTVR(SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:
1的氨基酸579至593),NHASSVPRSKILTV(SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:1的氨基酸579至592),NHASSVPRSKILT(SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:1的氨基酸579至591),NHASSVPRSKIL(SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:1的氨基酸579至590),NHASSVPRSKI(SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:1的氨基酸579至589),NHASSVPRSK(SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:1的氨基酸579至588),NHASSVPRS(SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:1的氨基酸579至587),NHASSVPR(SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:1的氨基酸579至586),NHASSVP(SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:1的氨基酸579至585),NHASSV(SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:1的氨基酸579至584),NHASS(SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:1的氨基酸579至583),NHAS(SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:1的氨基酸579至582),NHA(SEQ ID NO:1的氨基酸579至581),TSPRSSTLAVRVFLA(SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:9的氨基酸572至586),SPRSSTLAVRVFL(SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:9的氨基酸573至585),PRSSTLAVRVF(SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:9的氨基酸574至584),RSSTLAVRV(SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:9的氨基酸
575至583),SSTLAVR(SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:9的氨基酸576至582),STLAV(SEQ ID NO:
60,SEQ ID NO:9的氨基酸577至581),TLA(SEQ ID NO:9的氨基酸578至580),
SVPRSKILTVRVILA(SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:1的氨基酸583至597),VPRSKILTVRVIL(SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:1的氨基酸584至596),PRSKILTVRVI(SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:1的氨基酸585至595),RSKILTVRV(SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:1的氨基酸586至594),SKILTVR(SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:1的氨基酸587至593),KILTV(SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:1的氨基酸588至592),ILT(SEQ ID NO:1的氨基酸589至591),RVF(SEQ ID NO:9的氨基酸582至
584),RVFL(SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:9的氨基酸582至585),RVFLA(SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:9的氨基酸582至586),RVFLAP(SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:9的氨基酸582至587),RVFLAPW(SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:9的氨基酸582至588),RVFLAPWK(SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:9的氨基酸582至589),RVI(SEQ ID NO:1的氨基酸593至595),RVIL(SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:1的氨基酸593至596),RVILA(SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:1的氨基酸593至597),RVILAP(SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:1的氨基酸593至598),RVILAPW(SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:1的氨基酸593至599),RVILAPWK(SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:1的氨基酸593至600)。
588至590),SKILTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:1的氨基酸587至601),
KILTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:1的氨基酸588至601),ILTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:1的氨基酸589至601),LTVRVILAPWKK(SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:1的氨基酸590至601),TVRVILAPWKK(SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:1的氨基酸591至601),
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[0142] 在本发明更优选的实施方案中，肽选自：
[0143] (i)由通过序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601所定义的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，所述片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸579至582、氨基酸588至592、氨基酸598至601和/或氨基酸593至595，
[0144] (ii)非人哺乳动物CD31中对应于序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601的序列的3至15个氨基酸的片段组成的肽，例如由序列SEQ ID NO:9的氨基酸568至590所定义的序列的3至15个氨基酸的片段，所述片段包含SEQ ID NO:9的氨基酸568至571、氨基酸578至580、氨基酸587至590和/或氨基酸582至584，
[0145] (iii)与肽(i)的序列至少70％相同、优选至少75％相同、优选至少80％相同、更优选至少85％相同、又更优选至少90％相同的序列组成的3至15个氨基酸的肽，
[0146] (iv)由肽(i)、(ii)或(iii)的逆反序列组成的肽，和
[0147] (v)肽(i)、(ii)、(iii)或(iv)，其包含至少一种或者至少一种其它化学修饰。
[0148] 在优选的实施方案中，肽是包含反向和/或至少一种非天然氨基酸例如至少一种D-氨基酸的8氨基酸片段。此类肽确实保留了原始肽的活性或甚至表现出改善的活性。在旨在用于治疗用途的肽中并入非天然氨基酸可用于增加肽的稳定性，特别是体内稳定性。
[0149] 在本发明的另一优选实施方案中，肽选自以下肽：序列SEQ ID NO:2的肽，序列SEQ ID NO:3的肽，序列SEQ ID NO:4的肽，序列SEQ ID NO:5的肽，由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:6的肽，序列SEQ ID NO:7的肽和由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:8的肽。
[0150] 更优选的肽是序列SEQ ID NO:5的肽，由D-对映异构体氨基酸组成的序列SEQ ID NO:6的肽。
[0151] 肽可以通过本领域任何熟知的方法制备，例如化学合成例如固相合成或液相合成，或基因工程。作为固相合成，例如，对应于待合成的肽的C末端的氨基酸与不溶于有机溶剂的支持物结合，并且通过交替重复反应，一个反应是其中具有其氨基基团和侧链官能团被适当保护基团保护的氨基酸从C末端到N末端依次缩合，并且一个反应是其中与树脂或肽的氨基保护基团结合的氨基酸释放，从而以这种方式延伸肽链。在合成所需肽后，将其进行去保护反应并从固相支持物上切下。对于Boc方法，这样的肽切割反应可以用氟化氢或三氟甲烷磺酸进行，而对于Fmoc方法用TFA进行。
[0152] 根据所用保护基团的类型，固相合成方法主要通过tBoc方法和Fmoc方法进行分类。通常使用的保护基团对于氨基包括tBoe(叔丁氧基羰基)，Cl-Z(2-氯苄氧基羰基)，Br-Z(2-溴苄基羰基)，Bzl(苄基)，Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)，Mbh(4,4'-二甲氧基二苯并二氢)(dimethoxydibenzhydryl))，Mtr(4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基)，Trt(三苯甲基)，Tos(甲苯磺酰基)，Z(苄氧基羰基)和Clz-Bzl(2,6-二氯苄基)；对于胍基包括NO2(硝基)和Pmc(2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基)；和对于羟基包括tBu(叔丁基))。
[0153] 或者，可以使用重组技术合成CD31肽。
[0154] 产生肽的方法可任选地包括纯化所述肽，化学修饰所述肽和/或将所述肽配制成药物组合物的步骤。
[0155] 肽模拟物
[0156] 在实施方案中，CD31shed激动剂是如上文“用作CD31shed激动剂的肽”部分中定义的肽的肽模拟物，即模拟所述肽的化合物。
[0157] “肽模拟物”是由模拟给定肽的非肽结构元件组成的化合物，从而赋予所述化合物与所述肽等同或相似的生物活性。
[0158] 肽模拟物优选可溶于有机或无机溶剂中。
[0159] 如根据本发明的肽，肽模拟物优选可溶于水。
[0160] 设计和合成给定肽的肽模拟物的方法是本领域熟知的并包括例如在Ripka和Rich(Curr.Opin.Chem.Biol.1998；2(4):441-52)中和在Patch和Barron(Curr.Opin.Chem.Biol.2002；6(6):872-7)中所述。
[0161] 如上定义的肽模拟物可以通过选自由通过使用非天然氨基酸的肽的结构修饰组成的组中的至少一种化学修饰来获得。
[0162] 药物组合物
[0163] CD31shed激动剂可以配制成药物组合物。因此，本发明考虑了药物组合物，其包含至少一种CD31shed激动剂和优选地药学上可接受的媒介物。
[0164] CD31shed激动剂如上定义，特别是在“CD31shed激动剂”、“用作CD31shed激动剂的肽”和“肽模拟物”部分中。
[0165] 包含至少一种CD31shed激动剂的药物组合物包括所有组合物，其中CD31shed激动剂的含量可有效实现预期目的，特别是预防和/或治疗再灌注损伤。
[0166] 表述“药学上可接受的”意指包括任何载体，其优选不干扰活性成分的生物活性的有效性和/或优选对施用的宿主无毒。
[0167] 药学上可接受的媒介物可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备。
[0168] 合适的药学上可接受的媒介物可以包含赋形剂和助剂，其帮助将活性化合物加工成能够药学上使用的制剂。合适的药学上可接受的媒介物描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，Easton，USA，1985)中，其是该领域的标准参考文献。可根据CD31shed激动剂的给药方式、溶解度和稳定性常规选择药学上可接受的媒介物。例如，用于静脉内给药的制剂可包括无菌水溶液，其也可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。在文献中公开了生物材料和其他聚合物用于药物递送的用途，以及用于验证特定给药方式的不同技术和模型。
[0169] 给药剂量取决于待治疗的受试者、所需效果和所选择的给药途径。应理解，给药剂量取决于接受者的年龄、性别、健康和体重、同时治疗(如果有的话)和治疗频率以及所需效果的性质。每次治疗所需的总剂量可以通过多剂量或单剂量给药。
[0170] CD31shed激动剂优选配制成液体(例如溶液、悬浮液)。
[0171] 在优选的实施方案中，药物组合物以单位剂型存在，以促进准确定量给药。术语“单位剂型”是指适合作为人受试者和其他哺乳动物的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的活性物质，经计算可产生所需的治疗效果，并与合适的药物赋形剂结合。典型的单位剂型包括预填充的、预先测量的液体组合物的安瓿或注射器。在这样的组合物中，CD31shed激动剂通常是次要组分(例如约0.1至约50％重量，或优选约1至约40％重量)，其余为各种媒介物或载体和有助于形成所需的定量给药形式的加工助剂。
[0172] 除药学上可接受的媒介物外，药物组合物还可包含少量添加剂，例如稳定剂、赋形剂、缓冲剂和/或防腐剂。
[0173] 本发明进一步提供了试剂盒，其包含药物组合物，所述药物组合物包含如上定义的CD31shed激动剂和关于给药方式的说明书。这些说明书可以是例如表示医学适应症、给药途径、剂量和/或待治疗患者组。
[0174] 缺血
[0175] 在优选的实施方案中，再灌注用于治疗缺血。
[0176] 缺血是组织血液供应的停滞、限制或阻滞。
[0177] 缺血优选选自心肌梗塞、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、中风、下肢缺血、急性血容量不足引起的内脏缺血、炎症引起的缺血、排除部分动脉分支的体外循环血液固有的缺血、内脏手术和/或主动脉手术固有的缺血、冷缺血、针对器官移植的移植物的温热再灌注固有的缺血及其组合。
[0178] 当心肌中的血流不足时发生心肌梗塞。心肌梗塞可能无症状或引起胸痛，称为心绞痛。
[0179] 大肠和小肠均可受到缺血的影响。
[0180] 大肠缺血被称为缺血性结肠炎。
[0181] 肠系膜缺血对应于小肠缺血。
[0182] 中风是脑缺血，其可能是急性或慢性的。急性缺血性中风是一种神经系统紧急情况，如果迅速治疗可能是可逆的。脑的慢性缺血可能导致一种形式的痴呆。
[0183] 下肢缺血是至少一肢缺乏血流。
[0184] 急性血容量不足引起的内脏缺血是由于在血液含量降低(例如出血后)和/或血压降低(例如由于当它发生在化脓性、细胞毒性或心源性淤塞期间时血管床突然扩张)导致血液重新分布到其他组织(脑、心脏)时缺乏内脏灌注。
[0185] 人工缺血是医疗程序固有的缺血。
[0186] 内脏和/或主动脉手术固有的缺血是由外科医生进行的血液循环停止引起的缺血，例如通过器官上游的血管的瞬时夹紧。
[0187] 一旦待移植的组织或器官从供体移除，就会发生移植物的缺血。通常将待移植的组织或器官洗涤并冷却，例如在4℃下，以减少由缺血引起的代谢损伤。冷却的组织或器官的缺血称为冷缺血。
[0188] 冷缺血是指在被移出并因此与供体的循环断开的器官中发生的缺血性损伤。
[0189] 温热再灌注表明移植的器官移植物在受体中固有的循环的重建(再灌注)。
[0190] 本文中表述“冷缺血时间”是指在血液供应减少或切断后组织或器官冷却与通过使其血液供应在体内恢复而加热的时间之间的时间。
[0191] 由炎性病症引起的缺血是例如肠缺血，其可以例如发生在克罗恩病和/或溃疡性结肠炎中。
[0192] 在本发明的一个实施方案中，再灌注与生物体液(包括血浆)中可溶性截短的CD31的增加有关，并因此与CD31-T淋巴细胞表型相关。
[0193] 如本文所用，术语“CD31-T淋巴细胞表型”可与术语“CD31shed T淋巴细胞表型”互换使用。这些术语是指当使用检测CD31的常规现有技术方法例如那些描述于Stockinger等人(Immunology,1992,75(1):53-8)、Demeure等人(Immunology,1996,88(1):110-5)、Caligiuri等人(Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(8):1659-64)或Caligiuri等人(Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(3):618-23)的方法时，在其循环T细胞上明显丧失CD31的个体的表型。在此类方法中，用于检测CD31的抗体与位于第1个至第5个细胞外Ig样结构域中的任何一个上的表位结合(参见文献US 8 951 743)。
[0194] 优选地，具有CD31-T淋巴细胞表型的个体特别地具有其为CD31shed淋巴细胞的循环T淋巴细胞的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或95％。为了计算该百分比，可以测量与CD31+ T淋巴细胞相比，T细胞衍生的截短的CD31的血浆浓度或CD31-T淋巴细胞的频率。
[0195] 待治疗的受试者
[0196] 需要治疗以预防和/或治疗再灌注损伤的受试者可以是个体或非人哺乳动物。
[0197] 术语“个体”或“患者”可互换使用并且指人。
[0198] 所述人可以为任何年龄的人，例如婴儿、儿童、青少年、成年人、老年人。
[0199] 非人哺乳动物优选是小鼠、大鼠、猫、狗、兔或灵长类动物。
[0200] 受试者优选患有缺血，通过再灌注治疗或没有通过其治疗。
[0201] 预防和/或治疗再灌注损伤
[0202] 表述“治疗再灌注损伤”在本文中是指消除或减少由再灌注引起的器官损伤和/或停止或减缓由再灌注引起的器官损伤的进展，特别是在缺血后，特别是在已经患有或未患有器官损伤的再灌注期间的受试者中。
[0203] 期望的治疗效果包括：
[0204] -停止或减缓坏死的进展，例如在温热再灌注期间(例如在心脏、脑、肠、肾和/或肢体中)减小(特别是在缺血组织或器官中)坏死区域的大小，
[0205] -增加再灌注后器官存活的机会，
[0206] -停止或减少肠上皮病变，特别是在绒毛的长度和宽度、有丝分裂指数和/或组织内出血方面，例如在再灌注进一步到肠系膜缺血期间，
[0207] -停止或减少细菌移位，特别是在血液、脾脏、肝脏和/或肠系膜神经节中，例如在再灌注进一步到肠系膜缺血期间，和/或
[0208] -组织或器官移植的情况下，增加冷缺血时间和/或改善移植物的恢复。
[0209] 通过表述“预防再灌注损伤”，其在本文中意指至少部分地预防可能经历再灌注的受试者中的器官损伤。
[0210] 期望的预防效果包括：
[0211] -(至少部分)预防坏死，
[0212] -增加再灌注后器官存活的机会，
[0213] -增加长时间缺血后进行再灌注的正面利益/风险比的时间范围/延迟，
[0214] -(至少部分)预防器官的功能(例如，防止与受损的肠上皮相关的粘液减少，心肌的收缩功能降低，脑或肢体再灌注后的运动性降低)，
[0215] -(至少部分)预防细菌移位，特别是在血液、脾脏、肝脏和/或肠系膜淋巴结中，例如在再灌注进一步到肠系膜缺血期间，和/或
[0216] -组织或器官移植的情况下，增加冷缺血时间和/或改善移植物的温热恢复。
[0217] “坏死”在本文中是指组织的一个或几个细胞的死亡。
[0218] 再灌注，特别是用于治疗缺血的再灌注，可通过机械血运重建和/或药理学再灌注获得。
[0220] 药理学再灌注可以例如包括施用至少一种纤维蛋白溶解剂和/或抗血小板/抗凝血药物和/或血管舒张药物。
[0221] 纤维蛋白溶解(血栓溶解)剂是纤维蛋白结合的纤溶酶原的活化剂；它们的作用在于将酶原纤溶酶原转化为活性酶纤溶酶，后者降解纤维蛋白。可用于临床的纤维蛋白溶解剂的非限制性实例是：生理组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)—以单链(scu-PA，尿激酶原)或双链(tcu-PA，尿激酶)形式，和细菌激活剂纤溶酶原链激酶或其与纤溶酶原的茴香酰化复合物(APSAC)。
[0222] CD31shed激动剂，其用于再灌注损伤的预防和/或治疗。
[0223] 本发明具体涉及用于再灌注损伤的预防和/或治疗的CD31shed激动剂。
[0224] 再灌注损伤的预防和/或治疗特别如上所定义。
[0225] CD31shed激动剂如上定义，特别是在“CD31shed激动剂”、“用作CD31shed激动剂的肽”和“肽模拟物”部分中。
[0226] CD31shed激动剂可以药物组合物的形式提供。所述药物组合物特别如上文“药物组合物”部分中所定义。
[0227] 本发明因此涉及用于有此需要的受试者中再灌注损伤的预防和/或治疗的如上所定义的CD31shed激动剂或药物组合物。
[0228] 有此需要的受试者如上文“待治疗的受试者”部分所定义。
[0229] 有此需要的所述受试者优选患有缺血。
[0230] 缺血如上文“缺血”部分所定义。
[0231] 因此，本发明具体涉及如上定义用途的CD31shed激动剂或药物组合物，其中再灌注用于治疗缺血。
[0232] 本发明具体涉及如上定义用途的CD31shed激动剂或药物组合物，其中所述CD31shed激动剂：
[0233] -停止或减缓坏死的进展，例如在温热再灌注期间(例如在心脏、脑、肠、肾和/或肢体中)减小(特别是在缺血组织或器官中)坏死区域的大小，
[0234] -增加再灌注后器官存活的机会，
[0235] -停止或抑制肠上皮病变，特别是在绒毛的长度和宽度、有丝分裂指数和/或组织内出血方面，例如在再灌注进一步到肠系膜缺血期间，
[0236] -停止或减少细菌移位，特别是在血液，肝脏，脾脏和/或肠系膜神经节中，例如在再灌注进一步到肠系膜缺血期间，和/或
[0237] -组织或器官移植的情况下，增加冷缺血时间和/或改善移植物的温热恢复。
[0238] CD31shed激动剂或药物组合物优选在再灌注之前和/或期间使用或施用，如果可能的话，优选在整个缺血-再灌注期间。
[0239] 在由选择性内脏和/或主动脉手术引起的缺血的情况下，CD31shed激动剂或药物组合物优选在再灌注之前和期间使用或施用，例如在缺血再灌注期间，更优选在缺血之前和在缺血再灌注期间。
[0240] 当血液循环在血管中停止时，缺血开始。例如，在人工缺血的情况下，当夹住血管时停止血液循环。
[0241] 当血液循环恢复时，再灌注开始。再灌注引起的损伤通常在48小时、优选24小时内发生。
[0242] 术语“在缺血前”或“在再灌注前”中的术语“在...之前”是指CD31shed激动剂在最多1小时之前，优选最多30分钟之前，更优选最多20分钟之前，更优选至多10分钟之前，例如10分钟之前、5分钟之前、2分钟之前或即刻之前使用或施用。
[0243] 在非预定缺血的情况下，CD31shed激动剂或药物组合物尽可能快地使用或施用，例如在再灌注之前和/或期间，优选在再灌注之前和期间。
[0244] CD31shed激动剂或药物组合物优选静脉内使用或施用。静脉内施用允许在再灌注位置，特别是在缺血区域中快速获得有效量的CD31shed激动剂，和/或通过静脉内输注维持有效量的CD31shed激动剂。
[0245] 在优选的实施方案中，在再灌注期间连续使用或施用CD31shed激动剂或药物组合物，优选在初次团注CD31shed激动剂的施用之后作为单剂量使用或施用CD31shed激动剂或药物组合物。
[0246] 例如，第一次团注CD31shed激动剂以单剂量使用或施用，然后连续使用或施用第二次团注所述CD31shed激动剂。在本发明的一个实施方案中，所述第一次团注和第二次团注可以包含相同量的CD31shed激动剂。
[0247] 作为单剂量或连续施用的团注可包含2.5至30mg CD31shed激动剂/kg受试者，优选2.5至20mg CD31shed激动剂/kg受试者，更优选2.5至10mg CD31shed激动剂/kg受试者。
[0248] CD31shed激动剂或药物组合物优选在短时间内使用或施用，例如最多48小时，更优选最多24小时。
[0249] 在移植的情况下，CD31shed激动剂或药物组合物优选在移植外植器官之前使用或施用于待治疗的受试者，即施用于接受者(然后其将导致立即、温热再灌注)。在本发明的有利实施方案中，CD31shed激动剂也在移除待移植的组织或器官之前使用或施用于供体，例如在移除组织或器官和/或在运输和/或洗涤期间连续灌注被移除的器官或组织之前5至10分钟。
[0250] 用于预防和/或治疗再灌注损伤的方法
[0251] 本发明还涉及在有此需要的受试者中预防和/或治疗再灌注损伤的方法，所述方shed法包括向所述受试者施用有效量的CD31 激动剂的步骤。
[0252] 再灌注损伤的预防和/或治疗特别如上所定义。
[0253] CD31shed激动剂如上定义，特别是在“CD31shed激动剂”、“用作CD31shed激动剂的肽”和“肽模拟物”部分中。
[0254] CD31shed激动剂可以药物组合物的形式提供。所述药物组合物特别如上文“药物组合物”部分中所定义。
[0255] 有此需要的受试者如上文“待治疗的受试者”部分所定义。
[0256] 有此需要的所述受试者优选患有缺血。
[0257] 缺血如上文“缺血”部分所定义。
[0258] 因此，本发明具体涉及如上定义的预防和/或治疗再灌注损伤的方法，其中再灌注用于治疗缺血。
[0259] “有效量”或“治疗有效量”在本文中是指足以达到能够预防和/或治疗再灌注损伤的CD31shed激动剂浓度的量。这些有效量可以由本领域技术人员常规确定。实际给药的化合物的量通常由医生根据相关情况确定，包括待治疗的病症，所选择的给药途径，给药的实际化合物，个体患者的年龄、性别、体重和反应，患者症状的严重程度等。本领域技术人员还应理解，剂量可取决于施用的CD31shed激动剂的稳定性，特别是在肽的情况下。
[0260] 有效量可根据可与CD31shed激动剂共同施用的药物或前药而变化。
[0261] 治疗有效量包括其中CD31shed激动剂的治疗有益效果比任何毒性或有害作用更有价值的量。治疗有效量还包括足以赋予益处例如临床益处的量。
[0262] CD31shed激动剂的剂量、给药方式和作用特别如上文“用于预防和/或治疗再灌注损伤的CD31shed激动剂”部分中所定义。
[0265] 附图简要说明
[0266] 图1：在不存在CD31的情况下，通过结扎冠状动脉缺血45分钟后，再灌注24小时后的存活百分比显著降低。WT:野生型小鼠(90％存活；n＝17,2只死亡)；CD31 KO:CD31敲除小鼠(45％存活,n＝9,4只死亡)。卡方检验<0.001。
[0267] 图2：P8RI(皮下注射10mg/Kg P8RI，再灌注前2分钟)对载脂蛋白E敲除小鼠(雌性，18周龄)心肌梗死风险面积和大小的影响，所述小鼠通过结扎冠状动脉经受缺血45分钟，然后再灌注24小时。该图显示了平均AAR(左心室的百分比，LV)和MI(均表示为AAR的百分比和LV的百分比)。P8RI:接受P8RI的小鼠(n＝5)；对照:接受相似体积的不含P8RI的媒介物(PBS)的小鼠(n＝5)。T-检验。
[0268] 图3：随时间(以小时计)经受缺血-再灌注的大鼠模型血浆中游离DNA的定量(以ng/ml计)。对照大鼠(上线)中游离血浆DNA水平随时间增加，而在用肽P8RI处理的大鼠(中线)中，其保持低水平且与假手术大鼠(下线)相似。MANOVA,反复测量，群体效应:F＝0.3010883,p<0.0001。
[0269] 图4：随时间(以ng/Kg/小时计)经受缺血-再灌注的大鼠模型尿中尿游离DNA的定量(以ng/ml计)。与对照(C，灰色框)相比，用肽P8RI处理的大鼠的游离血浆DNA尿率降低(空心框)。T-检验p＝0.0293。
[0270] 图5：对经受缺血-再灌注的大鼠模型随时间推移的肠腔内游离血红蛋白的定量(比率，通过总蛋白质含量标准化)。与对照(C，左栏)相比，用肽P8RI处理的大鼠中游离血红蛋白的相对量减少(右栏)。T-检验p＝0.0293。
[0271] 图6：对缺血-再灌注模型大鼠的肠粘膜中游离髓过氧化物酶MPO的定量(直接ELISA，数据表示为任意单位-光密度)。与对照(C，灰色框)相比，用肽P8RI处理的大鼠中MPO的相对量减少(空心框)。Mann Whitney U检验p<0.001。
[0272] 图7：对缺血-再灌注模型大鼠中可溶性血浆P-选择蛋白的定量分析。与对照(C，灰色框)相比，用肽P8RI处理的大鼠中P-选择蛋白的浓度(以pg/ml计)减少(空心框)。Mann Whitney U检验p<0.0173。
[0273] 图8：随时间分析的对缺血-再灌注模型大鼠中血浆MMP9的定量。与对照(C，灰色框)相比，用肽P8RI处理的大鼠中MMP9的累积浓度(不同时间点曲线下面积)减少(空心框)。Mann Whitney U检验p<0.0082。
[0274] 图9：定量在脑缺血模型中脑组织内的免疫球蛋白。显示每组小鼠的右侧/左侧Ig比率，即[右侧半球的总Ig(经受缺血-再灌注损伤)]/[左半球的总Ig(对侧，非缺血性)](P8RI：诱导缺血后90分钟用P8RI处理的小鼠；盐水：诱导缺血后90分钟用盐水溶液处理的小鼠；假手术：假手术小鼠)。
[0275] 序列简要说明
[0276] SEQ ID NO:1对应于人CD31的序列。
[0277] SEQ ID NO:2对应于衍生自人或鼠CD31的6氨基酸肽的序列LAPWKK。
[0278] SEQ ID NO:3对应于衍生自鼠CD31的10氨基酸肽的序列VRVFLAPWKK，也称为PepReg CD31。
[0279] SEQ ID NO:4对应于衍生自人CD31的10氨基酸肽的序列VRVILAPWKK。
[0280] SEQ ID NO:5对应于衍生自鼠CD31的8氨基酸肽的序列RVFLAPWK，也称为P8F。
[0281] SEQ ID NO:6对应于具有SEQ ID NO:5的反向序列并由D-氨基酸组成的8个氨基酸肽的序列kwpalfvr，也称为P8RI。
[0282] SEQ ID NO:7对应于衍生自人CD31的8氨基酸肽的序列RVILAPWK。
[0283] SEQ ID NO:8对应于具有SEQ ID NO:7的反向序列并由D-氨基酸组成的8个氨基酸肽的序列kwpalivr。
[0284] SEQ ID NO:9对应于鼠CD31的序列。
[0285] SEQ ID NO:10对应于牛CD31的序列。
[0286] SEQ ID NO:11对应于猪CD31的序列。
[0287] SEQ ID NO:12对应于序列SEQ ID NO:1的氨基酸579至601。实施例
[0288] 实施例1：CD31SHED激动剂在心肌缺血-再灌注模型中的保护效果
[0289] 材料与方法
[0290] 为了在冠状动脉粥样硬化的情况下再现缺血-再灌注损伤(因为它发生在患者中)，使用18周龄雌性载脂蛋白E敲除小鼠(N＝12/组)，所述小鼠通常在16周龄时发展为冠状动脉粥样硬化(Caligiuri et al.,Atherosclerosis.1999 Aug；145(2):301-8)。根据Michael等人描述的方法对小鼠进行左主干冠状动脉外科结扎(Am J Physiol.1995 Dec；269(6 Pt 2):H2147-54)。缺血43分钟后，小鼠通过皮下注射接受P8RI(10mg/kg)或媒介物(PBS)，2分钟后通过重新打开结扎的冠状动脉再灌注缺血区域。第二天，小鼠再次麻醉，胸部重新开放，冠状结扎重新绑扎；然后用2毫升PBS冲洗冠状动脉树，所述PBS通过左颈动脉逆行插管推如冠状动脉树，在同一个插管中注射50μl伊万蓝(3％溶于PBS)染色非缺血区域。然后将心脏迅速从胸腔取出并浸入饱和的KCl溶液中(以使心脏停止在心脏舒张期)并在PBS中冲洗。切除心房和右心室，并将左心室切成4-5个1mm厚的切片。通过将心脏切片在含有1％氯化三苯基四唑的37℃温热磷酸盐缓冲液中孵育5分钟，将缺血区域内的活心肌染成红色。拍摄每个切片，然后通过计算机辅助图像分析测量有风险的区域(AAR，通过伊万蓝负染)和坏死区域(MI，通过TTC溶液负染成红色)。
[0291] 结果
[0292] 对每个切片计算AAR，表示为左心室(LV)表面的％和坏死区域(MI，表示为AAR的百分比和LV的百分比)。图2中显示的数据表示为平均值±SEM。在P8RI和对照组中AAR相似，因此证实冠状动脉上的手术结扎对于两组以相同的方式进行。在再灌注前2分钟施用P8RI随着风险区域的百分比(AAR)或左心室的百分比(LV)显著有效减小心肌梗塞的大小(MI)。
[0293] 实施例2：CD31SHED激动剂在脑缺血-再灌注模型中的保护效果
[0294] 材料与方法
[0295] 雄性C57BL/6小鼠(8周龄，Charles River，法国)在自然呼吸下在空气-氧气混合物中用1.5％异氟烷(Forene，Abbott，德国)麻醉。
[0296] 通过将有机硅涂覆的8-0单丝引入右颈总动脉并沿着颈内动脉推进直至尖端闭塞大脑中动脉(MCA)的近端干部诱导局灶性脑缺血。通过激光多普勒血流计(PF5010，Perimed，瑞典)使用固定在右MCA区域上方的完整颅骨的柔性光纤探针监测局部脑血流。通过连接温度计的加热垫将直肠温度保持在37℃。在诱导缺血后90分钟施用治疗(P8RI 10mg/Kg体重或盐水，100μl皮下团注)。诱导缺血后2小时，取出丝以允许再灌注。
[0297] 诱导缺血后24小时，用异氟烷深度麻醉小鼠，并用盐水经心脏灌注，直至从右心房以100mmHg获得无色液体。快速除去缺血的大脑(所有血液从脑内脉管系统中冲走)，分成右半球和左半球，称重并在液氮中快速冷冻，并在80℃下储存。
[0298] 将脑样品在RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％Triton，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，50mM Tris，pH8+来自Roche的抗蛋白酶混合物)中以5μl/mg组织匀浆，以16000g离心20分钟并且将上清液等分并储存在-80℃直至分析。
[0299] 为了评估P8RI对血脑屏障通透性(缺血-再灌注诱导局部炎症的主要后果之一)的影响，测量脑组织内免疫球蛋白的量。
[0300] 通过使用市售的基于珠子的免疫测定法(ProcartaPlex Mouse Antibody Isotyping Panel,Affimetrix目录号EPX070-20815-901，遵循制造商的说明书)测量总免疫球蛋白。小鼠免疫球蛋白同种型IgG1(K和L)和IgG2a(K)在所有样品中都是容易检测到的。来自三种同种型的合并的Ig用于分析。
[0301] 结果
[0302] 结果显示在下表2和图9中。数据表示为右/左Ig比率：
[0303]
[0304] 表2：平均值和标准差
[0305]
[0306] 如图9中所示，在假手术小鼠中右/左Ig比率为约1，而在经历缺血-再灌注脑损伤的小鼠中其持续增加。值得注意的是，再灌注前30分钟给予P8RI能够显著降低右/左Ig比率，其反映出血脑屏障通透性降低。
[0307] 实施例3：CD31SHED激动剂在肠系膜缺血-再灌注模型中的保护效果
[0308] 材料与方法
[0309] 通过尿烷(urethane)I.P.麻醉大鼠。在所有实验期间，在右颈静脉中引入导管用于静脉取样、治疗施用和溶质灌注(NaCl 0.9％，10l/H/g b.w.)。在左颈内动脉中引入导管用于动脉血压监测，并在膀胱中引入另一个用于尿液收集的导管。然后进行中位剖腹手术，并在左肾静脉上方切开肠系膜上动脉的近端部分。控制肠系膜动脉的主动脉口。在夹住肠系膜动脉前5分钟和采血后(T0)开始静脉内施用肽。然后，夹住肠系膜动脉(完全闭塞)30分钟，产生肠系膜缺血。在肠系膜缺血期结束时进行血液采样(T0.5)。然后将肠系膜动脉松开并再灌注至多4小时。每小时进行新的血液采样(T1.5、2.5、3.5、4.5)。在最后一次采血后，在实验期结束时处死动物。收集尿液并每小时测量利尿(diuresis)。在处死时，对缺血性肠进行取样。挤出一个片段以测量血红蛋白含量。另一个片段固定在多聚甲醛中用于组织学。
[0310] 使用几种中间生物学标准来表征缺血-再灌注损伤并评估CD31shed激动剂肽的有益效果：血浆和尿游离DNA(Picogreen荧光插入剂，Invitrogen)，来自中性粒细胞来源，诱导中性粒细胞激活和死亡，肠内腔血红蛋白含量(酸性甲酸反应，Calbiochem试剂盒)，诱导上皮损伤，肠粘膜中的髓过氧化物酶(MPO)含量，反映中性粒细胞的局部积聚和活化，血浆可溶性p-选择蛋白和MMP9含量，反映全身中性粒细胞激活，因为p-选择蛋白通过从活化的嗜中性粒细胞(和血小板)的表面切割而释放，MMP9包含在嗜中性粒细胞的嗜天青(azurofilic)颗粒中，并在中性粒细胞脱粒后早期释放。最后，通过肠壁的组织学评估粘蛋白膜保护的程度(阿尔新蓝染色)。
[0311] 结果
[0312] 在这些实验条件下，与对照相比，P8RI灌注显著降低了大鼠血浆中血浆和尿游离DNA的进行性增加(图3和4)。P8RI灌注还能够显著降低肠腔中的血红蛋白含量(分别为129.4±47.39对比317.1±93.27μg/mg蛋白，p<0.001，见图5)，肠粘膜中中性粒细胞的积聚和活化，如通过直接ELISA检测MPO的量(图6)，在循环中释放可溶性P-选择蛋白和MMP9(图7和8)和能够保护上皮绒毛磨损、上皮脱屑和能够部分保留粘膜完整性。与其在对照大鼠中的破坏相比，P8RI的施用确实保留了大部分粘蛋白膜(数据未显示)。
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