重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法专利检索-再灌注疗法专利检索查询-专利查询网

重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法

阅读：375发布：2023-01-14

专利汇可以提供重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法，其特征是：包括：1）制备造影剂：将48g 硫酸钡溶解于80ml等比例混合的生理盐水与纯水溶液中，混匀后置于功率为25W左右的超声波破碎仪中约5分钟，再放入约50℃水浴箱中待用；2）注射造影剂3）MicroCT扫描；4）三维重建。本发明中，使用MicroCT对注射硫酸钡造影剂后的兔终板进行扫描，并使用Mimics 软件对扫描结果进行3D重建来观察兔终板内的血管芽形态学结构，使实验具有操作简单、耗时短及无危害性等优点，而且观察得到的血管三维结构清晰可见，更加易于观察和分析。，下面是重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法，其特征是：包括：
1）制备造影剂：将48g硫酸钡溶解于80ml等比例混合的生理盐水与纯水溶液中，混匀后置于功率为25W左右的超声波破碎仪中约5分钟，再放入约50℃水浴箱中待用；
2）注射造影剂
实验兔采用10%水合氯醛（1.5ml/kg）耳缘静脉注射的方法给予实施全身麻醉；确定麻醉达到一定深度后，摆好实验动物手术体位，减去腹部区域毛发；腹正中线切开腹腔，暴露肾动脉以下腹主动脉、下腔静脉及双侧髂总动脉；丝线结扎双侧髂总动脉，随后对腹主动脉进行插管并灌注肝素生理盐水（500u/100ml），下腔静脉插管予以放血，肝素生理盐水冲洗血管直至流出液清凉；之后向腹主动脉内注射造影剂（约20ml/min）直至下腔静脉内流出乳白色液体（约60ml）；注射之后，关闭腹主动脉、下腔静脉；
3）MicroCT扫描
1h后取材：每只取完整L4-5椎体，采用美国Perkin Elmer公司Quantum FX小动物CT系统进行标本扫描；选择扫描参数如下：型号：Quantum FX，电压：90KV，电流：160UA；同一组织先扫描10mm范围大小，再扫描终板中心区域5mm范围大小；将扫描得到的数据分为
10MM组和5MM组；
4）三维重建
将得到的扫描数据转化为DICOM格式文件导入Mimics 软件（15.0），根据骨质与硫酸钡造影剂的不同阈值大小分别建立终板及去掉终板骨质后的血管3D图，分别从两组实验结果的血管3D图中随机选取5个血管末端，测量其直径大小，取平均值代表末端血管直径。
2.根据权利要求1所述的重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法，其特征是：在2）注射造影剂的步骤中，确定麻醉达到一定深度的标准是：采用血管钳钳夹实验兔四肢无肌肉收缩反应，无角膜反射。
3.根据权利要求1或2所述的重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法，其特征是：
在2）注射造影剂的步骤中，动物手术体位即：仰卧位。

说明书全文

重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法，主要用于观察终板内血管芽的形态学结构。

背景技术

[0002] 椎间盘为人体内一个无血管组织，其营养物质主要依靠外1/3 纤维环及终板血管，其中后者对于髓核组织的新陈代谢尤其重要。既往研究发现终板中间部分的血管密度要远远大于外周部分，故学者提出终板中心区域是最重要的供应营养物质的区域。Kobayashi等通过注射墨汁的方法也观察到绝大多数的血管芽结构存在于终板接触髓核的中央区域，并血管周围被未成熟的成纤维细胞样细胞包围。而椎体终板内的血管芽作为一个敏感指标，其病理改变与椎间盘退变紧密相关。

[0003] 对于终板内的血管研究，目前绝大多数停留在二维层面，三维结构探索最早见于1996年Oki等的研究，但该方法制备标本过程繁琐，且中间使用的浓盐酸、有机溶剂等试剂对于人体具有不小的危险性，制备标本耗时久。

发明内容

[0004] 鉴于背景技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、实验耗时短及对实验者无危害性的重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法。

[0005] 本发明是采取如下技术方案来完成的：重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法，其特征是：包括：1）制备造影剂：将48g硫酸钡溶解于80ml等比例混合的生理盐水与纯水溶液中，混匀后置于功率为25W左右的超声波破碎仪中约5分钟，再放入约50℃水浴箱中待用；
2）注射造影剂
实验兔采用10%水合氯醛（1.5ml/kg）耳缘静脉注射的方法给予实施全身麻醉；确定麻醉达到一定深度后，摆好实验动物手术体位，减去腹部区域毛发；腹正中线切开腹腔，暴露肾动脉以下腹主动脉、下腔静脉及双侧髂总动脉；丝线结扎双侧髂总动脉，随后对腹主动脉进行插管并灌注肝素生理盐水（500u/100ml），下腔静脉插管予以放血，肝素生理盐水冲洗血管直至流出液清凉；之后向腹主动脉内注射造影剂（约20ml/min）直至下腔静脉内流出乳白色液体（约60ml）；注射之后，关闭腹主动脉、下腔静脉；
3）MicroCT扫描
1h后取材：每只取完整L4-5椎体，采用美国Perkin Elmer公司Quantum FX小动物CT系统进行标本扫描；选择扫描参数如下：型号：Quantum FX，电压：90KV，电流：160UA；同一组织先扫描10mm范围大小，再扫描终板中心区域5mm范围大小；将扫描得到的数据分为
10MM组和5MM组；
4）三维重建
将得到的扫描数据转化为DICOM格式文件导入Mimics 软件（15.0），根据骨质与硫酸钡造影剂的不同阈值大小分别建立终板及去掉终板骨质后的血管3D图，分别从两组实验结果的血管3D图中随机选取5个血管末端，测量其直径大小，取平均值代表末端血管直径。

[0006] 本发明中，使用MicroCT对注射硫酸钡造影剂后的兔终板进行扫描，并使用Mimics软件对扫描结果进行3D重建来观察兔终板内的血管芽形态学结构，使实验具有操作简单、耗时短及无危害性等优点，而且观察得到的血管三维结构清晰可见，更加易于观察和分析。附图说明

[0007] 本发明有如下附图：图1为本发明提供的从Mimics软件得到的矢状位图像（A）。

[0008] 图2为本发明提供的从Mimics软件得到的轴状位图像（B）。

[0009] 图3为本发明提供的从Mimics软件得到的10mm组终板血管俯视图。

[0010] 图4为本发明提供的从Mimics软件得到的终板血管矢状面显示图像。

[0011] 图5为本发明提供的从Mimics软件得到的终板中心髓核区域血管形状图像。

[0012] 图6为10MM组与5MM组终板内末端血管直径对比图表。

具体实施方式

[0013] 附图表示了本发明的技术方案及其实施例，下面再结合附图进一步描述其实施例的各有关细节及其工作原理。

[0014] 参照图1、图2、图3、图4、图5、图6所示，本发明提供的重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法，包括：一、实验材料选用：
6月龄日本大耳白兔（2.5~3kg）5只，温州医科大学动物实验中心提供，生产批号：
SYXK(浙)2014-0006；上海万疆硫酸钡（规格：99%，1μm）；Perkin Elmer Quantum FX 小动物CT系统；美国Sonics 超声波破碎仪。

[0015] 二、实验方法1）造影剂准备
将48g硫酸钡溶解于80ml等比例混合的生理盐水与纯水溶液中，混匀后置于功率为
25W左右的超声波破碎仪中约5分钟，再放入约50℃水浴箱中待用。

[0016] 2）注射造影剂实验兔采用10%水合氯醛（1.5ml/kg）耳缘静脉注射的方法给予实施全身麻醉。确定麻醉达到一定深度后（血管钳钳夹其四肢无肌肉收缩反应，无角膜反射）摆好实验动物手术体位（即仰卧位），减去腹部区域毛发。腹正中线切开腹腔，暴露肾动脉以下腹主动脉、下腔静脉及双侧髂总动脉。丝线结扎双侧髂总动脉，随后对腹主动脉进行插管并灌注肝素生理盐水（500u/100ml），下腔静脉插管予以放血，肝素生理盐水冲洗血管直至流出液清凉。之后向腹主动脉内注射造影剂（约20ml/min）直至下腔静脉内流出乳白色液体（约60ml）。注射之后，关闭腹主动脉、下腔静脉。

[0017] 3）MicroCT扫描1h后取材：每只取完整L4-5椎体，采用美国Perkin Elmer公司Quantum FX小动物CT系统进行标本扫描。选择扫描参数如下：型号：Quantum FX，电压：90KV，电流：160UA。同一组织先扫描10mm范围大小，再扫描终板中心区域5mm范围大小。将扫描得到的数据分为
10MM组和5MM组。

[0018] 4）三维重建将得到的扫描数据转化为DICOM格式文件导入Mimics软件（15.0）。根据骨质与硫酸钡造影剂的不同阈值大小分别建立终板及去掉终板骨质后的血管3D图。分别从两组实验结果的血管3D图中随机选取5个血管末端，测量其直径大小，取平均值代表末端血管直径。

[0019] 统计分析：采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析。所得数据采用t检验进行统计学处理；
数据以均数±标准差（ ±s）表示，双侧检验，α=0.05，P＜0.05为差异有显著性。

[0020] 三、结果结果1.MicroCT扫描结果观察：应用Mimics软件得到L4上椎体终板及椎体骨质的轴状位、冠状位和矢状位图像，其中可以明显观察到终板结构，终板与其相邻的椎体存在明显的分界区即生长板部位。终板内部存在多量的孔道结构，各孔道结构并非独立存在，邻近孔道之间互相存在有通路联系。硫酸钡血管造影明显显影于终板内的孔道结构内，轴状位图像中我们发现终板内部血管芽贯穿孔道结构，走形复杂，主要集中分布于中央区域（图1、图
2）。

[0021] 结果2.Mimics三维重建结果观察：将椎体终板内的造影结果进行3D重建，得到其3D图像，该图像参照图3。椎体终板内的血管三维结构清晰可见。终板血管10mm组俯视图可见血管在髓核部位分布密集，管径粗，并向四周的纤维环部呈放射状辐射（图3）；矢状面上可见终板将椎体与椎间盘明显分隔开，其内血管从椎体后方发出，沿终板后方向前方辐射长入，而椎间盘内并未见血管存在（图4）。更精细的5mm图像中见终板中心髓核区域的血管与外周纤维环部血管的简单襻样结构不同，髓核部分的血管形状并非单一襻样结构，而是一种庞大复杂的完全缠绕在一起的血管襻结构（图5）。
结果3.末端血管直径分析：10MM组与5MM组的末端血管直径测量结果如图6所示。
10MM组与5MM组的末端血管直径进行比较分析，差异具有统计学差异（图6）。

[0022] 椎间盘细胞的营养途径分为两个部分，1.纤维环途径：营养物质通过分布于纤维环表面（主要是外1/3纤维环区域）的血管进入纤维环外层，营养范围小。Brrodin等通过将荧光染料注射的方法发现染料主要集中于外层纤维环区域，而在髓核内并没有观察到有荧光染料的出现。2.终板途径（主要途径）：营养物质通过终板内的血管的渗透作用扩散至椎间盘，营养内层纤维环及髓核。2007年，van der werf等通过阻断羊腰椎间盘终板表明阻断终板途径可抑制血管内的溶质分子转运至髓核区，这提示终板内微血管的存在是髓核内营养物质转运的重要基础。而Rodriguez等通过观察退变的人腰椎终板结构发现随着椎间盘的退变过程，终板硬化主要在外围区，椎间盘中央区的髓核细胞却随着终板的硬化呈细胞密度增加的趋势，髓核细胞的活性明显降低。因此对于终板内血管结构的探索至关重要。

[0023] 早在二十世纪九十年代，Oki等通过血管铸型后扫描电镜扫描来观察终板内的血管形态。国内吕刚等学者使用血管灌注ABS的方法亦成功制备兔腰椎体软骨终板的血管铸型标本，并通过投射光显微镜及扫描电镜观察椎体终板内血管芽的形态学结构。两者均发现终板内血管呈树枝状分布，交织缠绕形成血管襻样结构，即血管芽。这些血管芽在内层纤维环部位分布稀疏，并血管芽形状呈简单的襻样结构，而髓核部位分布密集，呈一种膨大且复杂交织缠绕的襻样结构。该部位高渗透性可能与其血管具有较大的表面积并接触点较多有关。但在制备血管铸型标本过程中需使用到一些有机溶剂及浓盐酸等危险物品，且标本制备过程需几天时间，过程繁琐。而本实验通过MicroCT扫描注射造影剂后的兔终板结构，并使用Mimics系统对终板内血管结构进行3D重建。其中造影剂为临床常用的硫酸钡，对人体无毒副作用，而且注射完后可立即进行扫描，无需等待。具有简单、安全并快速的优点，并所得结果与前期研究一致。

[0024] 在扫描过程中我们尝试了10mm与5mm范围扫描，两者之间对于血管精度存在明显差异，5mm范围扫描可以达到最小20um精度。5mm组的平均血管直径达到了35um，10mm组的平均管径为70um，这与扫描精度有关，10mm组与5mm组均为连续扫描512层，两者之间存在不同的层距，而层距又决定了扫描精度，故两组末端血管直径测量结果显示出明显的差异。在造影剂选择上我们先后尝试了浓度约150%、100%和60%的硫酸钡造影剂，前两者在注射过程中存在较大阻力，时常因注射器压力过大导致血管破裂情况发生，而60%浓度在注射过程中仍存在一部分注射阻力，虽可完成注射过程，但并不轻松，所以本课题组将该浓度造影剂进行超声波处理后再进行注射，这样以约20ml/min的注射速率轻松完成注射过程。

[0025] 本课题组通过注射硫酸钡造影剂成功建立了终板内的血管3D图像，发现椎体终板内的血管相互交错呈树枝状形成血管襻即血管芽形态，且在髓核区域分布密集，并形态相比与内层纤维环区域更为复杂，该形态结构使得该区域血管具有较大的表面积与较多的接触点，提高了髓核区域的渗透性。本实验首次通过该方法探索终板内血管结构。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种脑缺血再灌注损伤动物模型的制作方法	2020-05-13	242
SiRNA在器官储存/再灌注溶液中的应用	2020-05-12	420
GW3965用于制备防治肾缺血再灌注损伤药物的应用	2020-05-12	300
治疗缺血再灌注损伤的化合物	2020-05-11	813
治疗和预防远端缺血-再灌注损伤	2020-05-11	573
一种用于防治脑缺血再灌注损伤的药物组合物	2020-05-13	319
一种抗缺血与再灌注损伤药物	2020-05-11	705
可再灌注塑料瓶的洗涤方法	2020-05-12	579
一种腹腔镜外科手术用气体灌注和再循环系统	2020-05-13	127
C1抑制剂在预防缺血-再灌注损伤中的应用	2020-05-13	503

重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法

重建兔椎体终板内血管3D结构的实验方法

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：